DEPARTAMENTO DE POSGRADOS

“DETERMINACIÓN DE CLEMBUTEROL EN MÚSCULO E

HÍGADO BOVINO EN LA PROVINCIA DE MANABÍ Y SU

EVALUACIÓN RESPECTO A LOS LÍMITES MÁXIMOS

PERMITIDOS.”

MAGÍSTER EN GESTIÓN DE LA CALIDAD Y SEGURIDAD ALIMENTARIA

Autora:

Wania Fernanda Espinoza Molina

Director:

Luis Alejandro Ramos Guerrero

Co-Director:

Paul Ernesto Vargas Jentzsch

Cuenca, Ecuador

2015

Espinoza Molina II

DEDICATORIA

Esta investigación va dedicada a mi hijo Marcelo Israel Barrera Espinoza, quien ha sido mi

inspiración, apoyo y razón principal, quien con su existencia llena de amor, alegría, ternura,

comprensión y compromiso con su mami, fue mi pilar fundamental de entendimiento ante la

misión que me había planteado de desarrollar esta investigación como aporte importante para

mi país y de esta manera su luz me sirvió para seguir avanzando en mi desarrollo personal,

profesional y como ser humano con visión y energía encaminada por ti hijo mío para velar por

su seguridad alimentaria con este breve aporte.

Dedico así también esta investigación con todo mi corazón a mi madre María Teresa Molina

Cruz, quien con sus sabios consejos y escucha, nunca dejó de dudar de las capacidades de

su hija y me apoyó en todo momento entendiéndome, escuchándome, incentivándome a

surgir y salir adelante firme y con convicción.

Padre mío en tu ausencia física te dedico mi pequeño aporte de investigación, sé que desde

nuestro cielo estarás orgulloso de cada pasito que doy,

La excelencia, el trabajo, el don de gente, la perseverancia, la visión y convicción la herede

de ustedes padres míos.

A mis hermanas Vilma, Paola, Erika, por sus consejos, preocupación, energía y oraciones.

A mis sobrinos Carito, Dome, Karla, Juan Daniel, Emilia, Rafaela, Nicolás, Daniel, Josué, por

su cariño y acompañamiento a mi hijo en mi ausencia.

A mi gente linda de AGROCALIDAD, de manera especial a mis amigos profesionales de la

vida: Dr. Luis Ramos, Paul Vargas, Rommel Betancourt, Diego Vizcaíno, quienes me

apoyaron en primera instancia con los recursos necesarios para poder desarrollar mi proyecto.

Dedicado de manera total a mi país que merece mucho compromiso de todos quienes somos

actores de esta sociedad con derechos a una seguridad, calidad y por ende una soberanía

alimentaria.

Espinoza Molina III

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mi hijo, mi vida entera, mi razón de ser, por su comprensión todo este tiempo de

haberme compartido parte de su tiempo familiar para poder realizar mi investigación.

Gracias infinitas a mi madre Tere, por su ejemplo de lucha por nuestros ideales, por el ejemplo

de emprendimiento, valentía y amor incondicional.

A mis hermanas y familia por su apoyo ilimitado todo este tiempo distante de ustedes.

A mi padre Marcelo (+), quien es mi motivación como ser humano con convicción, valores,

perseverancia y responsabilidad, gracias papi por tu gran ejemplo.

A mi familia Espinoza Prado, por su apoyo y compañía, de manera especial a mi tío Leonardo

y primo Santiago

A mis grandes amigos Álvaro L, Jenny C, Nahir D, Jenny B, Carolina C, César S (+), JCI

Cuenca, quienes con su cariño y energía positiva ayudaron a que mantuviera mi ritmo en base

a las distintas circunstancias vividas.

A mi gran escuela de trabajo AGROCALIDAD, gracias por su apoyo total. Gracias Ing. Diego

Vizcaíno por su apertura y confianza en mi proyecto y mi persona.

De manera especial a la COORDINACIÓN GENERAL DE LABORATORIOS DE

AGROCALIDAD, donde se desarrolló mi trabajo de investigación, por el aporte de recursos

humano, económico e intelectual, para que este proyecto sea posible.

A mi gran amigo y hermano Luis Ramos Guerrero, “Doc”, gracias infinitas por confiar en mí,

por apoyarme, por ser el gestor para que todo esto se dé hasta el final y por ser mi Director

de tesis, por su preocupación, dedicación y sabios consejos y enseñanzas.

A mi gran amigo hermano Paul Vargas J, por tu excelente labor como mi codirector del

proyecto de investigación de maestría, por tu apoyo técnico, moral todo este tiempo ha sido

valioso, me has enseñado mucho, infinitas gracias.

Amigo Rommel Betancourt, gracias por su compromiso total, por su escucha a mi propuesta

y creer en que esta idea inicial aportaría mucho en la inocuidad de un país, de nuestro país.

A mi compañera y amiga, Margoth Barrionuevo, por su entregada labor con la enseñanza de

la técnica de ELISA.

A mi gran equipo de trabajo: Rommel Betancourt, Diego Andino, Paulette Andrade, Paul

Vargas, Coordinación de Manabí, Coordinación de Inocuidad de Alimentos, Coordinación de

Sanidad Animal, Coordinación de Registros, Laboratorio de Contaminantes Pecuarios,

Laboratorio de Diagnóstico Animal, Laboratorio de Contaminantes Agrícolas, Laboratorio de

Biología Molecular, Departamento Administrativo Financiero, Comunicación.

Espinoza Molina IV

A mis compañeros de trabajo y amigos quienes se convirtieron en mi familia, mi compañía en

todo este tiempo. A mis amigas(os) Rosita, Evelyn, Lore, Patricia, Ana, Erika, Gaby, Paulette,

Silvana, Jacqueline, Carla, Liz, Margoth, Catalina, Daniela, Jessica, Jessandra, Alicia, Diego

Andino, Juan Pablo, Euclides, Wladimir, Marlon, Lenin, Alexander, Juan Carlos, Alexander T,

Jorge I, Ernesto, Kathy P, Janeth, Mónica, Cristina, gracias por todo su apoyo y cariño todo

este tiempo, por llegar a ser mi compañía, apoyo, familia.

A Pablo Jaramillo – Gerente Comercial de la empresa Inventagri, proveedores de Kits de

ELISA, por el apoyo en la adquisición y donación de Kits ELISA Clembuterol, a Mark

MacBeath – Gerente Comercial de Biooscientific y a Kyle Smith – Desarrollo Químico

II/Consultor Técnico Biooscientific, por su apoyo capacitación y desarrollo en la técnica de

ELISA para músculo e hígado, por la donación de un lector de ELISA para el desarrollo de

esta investigación.

A Fernando Gualpa, Gerente de investigación y desarrollo para la Corporación World Survey

Service, por su apoyo en la enseñanza del manejo, acondicionamiento del equipo

UPLC/MS/MS.

Espinoza Molina V

RESUMEN

El presente trabajo evalúa la presencia del β-adrenérgico clembuterol, en productos pecuarios

bovinos, como una medida encaminada a la prevención de riesgos en la salud humana por su

consumo. Se aplicaron técnicas analíticas inmunológicas como el ensayo por

inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y cromatográficas-espectrométricas

(UPLC/MS/MS), en matrices de hígado y músculo bovino. La investigación se desarrolló con

un muestreo aleatorio en 10 mataderos de la provincia con el mayor hato ganadero del país,

Manabí. Se evaluaron un total de 48 submuestras de hígado y 48 de músculo. Para el análisis

de los resultados se consideran los límites máximos de residuos veterinarios LMRV,

establecidos en el Codex Alimentarius y en la normativa de la Unión Europea. Como resultado

se determinó un alto porcentaje de muestras con presencia de clembuterol superior a los

LMRV. También, se evaluó el desempeño de los dos métodos implementados. Los resultados

sugieren la implementación de un plan de control del uso fraudulento del compuesto para la

engorda animales bovinos en el Ecuador.

PALABRAS CLAVE

Clembuterol, hígado bovino, músculo bovino, ELISA, UPLC/MS/MS, LMRV.

ABSTRACT

The present study evaluates the presence of β-adrenergic clenbuterol in bovine cattle

products, as a measure aimed at the prevention of risks to human health due to its

consumption. Analytical techniques were applied like the Linked ImmunoSorbent Assay

(ELISA) and cromatographic- spectroscopic (UPLC/MS/MS), in matrices of liver and bovine

muscle. The research was carried out with a random sampling in 10 slaughterhouses of the

province with the largest cattle herd of the country, Manabí. A total of 48 liver and 48 muscle

subsamples were evaluated. For the analysis of the results, the maximum residue limits, VMRL

established in the Codex Alimentarius and in the European Union regulations are considered.

As a result, a high percentage of samples with a higher clenbuterol presence than VMRLV

were determined. Also, the performance of the two methods implemented has been evaluated.

The results suggest the implementation of a control plan for the fraudulent use of the

compound for fattening bovine animals in Ecuador.

KEYWORDS

Clenbuterol, bovine liver, bovine muscle, ELISA, UPLC/MS/MS, VRML.

Espinoza Molina VI

Espinoza Molina VII

ÍNDICE DE CONTENIDOS

DEDICATORIA .................................................................................................................... ii

AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................... iii

RESUMEN ........................................................................................................................... v

PALABRAS CLAVE .......................................................................................................... v

ABSTRACT ......................................................................................................................... vi

KEYWORDS .................................................................................................................... vi

ÍNDICE DE CONTENIDOS .................................................................................................. vii

ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................................... ix

ÍNDICE DE TABLAS ........................................................................................................... xi

ÍNDICE DE ANEXOS .........................................................................................................xiii

CAPÍTULO 1. INTRODUCCION ...................................................................................... 1

1.1. Objetivo General ..................................................................................... ..............4

1.2. Objetivos Específicos .............................................................................. ..............4

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................... 5

2.1. Tipo de investigación .............................................................................. ..............5

2.2. Localización y descripción del sitio de investigación...............................................5

2.3. Población bovina y delimitación del muestreo .......................................... ..............5

2.4. Consentimiento Institucional.................................................................... ..............8

2.5. Descripción del trabajo de campo............................................................ ..............8

2.5.1. Fase I: Recopilación de Información bibliográfica ...........................................9

2.5.2. Fase II: Muestreo y diagnóstico preliminar .....................................................9

2.5.3. Fase III: Plan de Muestreo .............................................................................9

2.5.3.1. Procedimiento de muestreo ..................................................................... 10

2.5.3.2. Toma de muestras y distribución del muestreo......................................... 11

2.5.4. Fase IV: Métodos de Análisis en Laboratorio. ............................ ..................13

2.5.4.1. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e hígado

bovino): Método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) ................ 14

Principio .................................................................................................................. 14

Sensibilidad del Método (Límite de Detección) ......................................................... 15

Equipos y Materiales ................................................................................................ 15

Herramientas ........................................................................................................... 15

Espinoza Molina VIII

Reactivos y Estándares ........................................................................................... 15

Preparación de soluciones y/o reactivos ................................................................... 15

Consideraciones para el ensayo .............................................................................. 16

Preparación de la muestra ....................................................................................... 16

Procedimiento de extracción .................................................................................... 16

Procedimiento del ensayo ELISA ............................................................................. 17

Cálculo de las concentraciones ................................................................................ 18

2.5.4.2. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e hígado

bovino): Método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en

tándem UPLC/MS/MS ................................................................................................. 18

Principio .................................................................................................................. 19

Sensibilidad del Método (Límite de Detección y Cuantificación) ............................... 20

Equipos y Materiales ................................................................................................ 20

Reactivos y Estándares ........................................................................................... 21

Preparación de soluciones y/o reactivos ................................................................... 21

Condiciones del Cromatógrafo líquido ...................................................................... 22

Condiciones del espectrómetro de masas ................................................................ 22

Preparación de la muestra ....................................................................................... 22

Procedimiento del ensayo UPLC/MS/MS ................................................................. 22

Seteo de masas en el equipo UPLC/MS/MS............................................................. 23

CAPÍTULO 3. RESULTADOS ........................................................................................ 26

3.1. Resultados obtenidos con el Método ELISA ........................................................ 26

3.1.1. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA ............. 26

3.1.2. Resultados de submuestras de higado bovino con Método ELISA ............... 29

3.2. Resultados Cuantitativos obtenidos con el Método UPLC/MS/MS ........................ 34

3.3. Comportamiento estadístico de los resultados ..................................................... 37

3.3.1. Distribución de los datos ............................................................ 37

3.3.2. Comparación mediante t de student para muestras emparejadas................. 40

3.3.2.1. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,

resultados de análisis de hígado .............................................................................. 40

3.3.2.2. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados de

análisis de Hígado ................................................................................................... 41

3.3.2.3. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,

Espinoza Molina IX

resultados de análisis de Músculo ............................................................................ 43

3.3.2.4. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados de

análisis de Músculo .................................................................................................. 45

3.4. Análisis cualitativos de los Métodos ELISA y UPLC/MS/MS en relación a la

normativa vigente. .......................................................................................................... 46

3.4.1. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Codex

Alimentarius ................................................................................................................ 54

3.4.2. Resultados obtenidos con el método UPLC/MS/MS en relación al Codex

Alimentarius ................................................................................................................ 55

3.4.3. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council

Regulation (EEC) N°2377/90 ....................................................................................... 57

3.4.4. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al Council

Regulation (EEC) N°2377/90 ....................................................................................... 58

3.4.5. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council

Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ............................................................................... 60

3.4.6. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al Council

Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ............................................................................... 61

3.4.7. Relación de los métodos aplicados para la detección de clembuterol en

bovinos................................................................................................ 63

CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN ............................................................................................ 68

4.1. Resultados cuantitativos del análisis de músculo e hígado mediante el método

ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................................... 68

4.2. Resultados cualitativos del Análisis de Músculo e Hígado mediante el método

ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................................... 70

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES .................................................................................... 73

CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES ........................................................................... 76

BIBLIOGRAFIA .................................................................................................................. 77

ANEXOS ............................................................................................................................ 80

Espinoza Molina IX

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Imagen Optimizada de Clembuterol ......................................................................1

Figura 2. Población bovina del Ecuador por provincia, periodo 2014. ...................................7

Figura 3. ELISA competitivo............................................................................................... 14

Figura 4. Ejemplo de curva de calibración para la determinación de clembuterol ................ 18

Figura 5. Fuente de ionización de electrospray .................................................................. 19

Figura 6. Monitorización de reacción múltiple .................................................................... 20

Figura 7. Curva de calibración Método ELISA submuestras de músculo bovino.................. 27

Figura 8. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA ..................... 29

Figura 9. Curva de calibración Método ELISA submuestras de higado bovino .................... 30

Figura 10. Resultado de submuestras de higado bovino con Método ELISA ....................... 32

Figura 11. Resultado de la lectura de submuestras de músculo con Método ELISA ............ 33

Figura 12. Cromatograma TIC de la solución estándar de clembuterol de 2.0 ug/L ............. 34

Figura 13. Curva de Calibración determinación de Clembuterol en el rango de 0,125 a 8.0

ug/L por UPLC-MS-MS ....................................................................................................... 35

Figura 14. Resultado de la lectura de submuestra de músculo en espectrómetro de masas

método UPLC/MS/MS ........................................................................................................ 37

Figura 15. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método

ELISA ................................................................................................................................ 38

Figura 16. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método

UPLC/MS/MS ..................................................................................................................... 38

Figura 17. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método

ELISA ................................................................................................................................ 39

Figura 18. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método

UPLC/MS/MS ..................................................................................................................... 40

Figura 19. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de hígado con Método

ELISA y UPLC/MS/MS ....................................................................................................... 42

Figura 20. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado

con Método ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................... 43

Figura 21. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de Músculo con

Método ELISA y UPLC/MS/MS ........................................................................................... 45

Figura 22. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado

con Método ELISA y UPLC/MS/MS .................................................................................... 46

Figura 23. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,

Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014 .................................................................... 54

Figura 24. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014 .................................................................... 55

Figura 25. Resultado del análisis de clembuterol en tejido de músculo, Método

UPLC/MS/MS. Normativa Codex CAC - 2014 ..................................................................... 56

Espinoza Molina X

Figura 27. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,

Método ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90 ........................................57

Figura 28. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en hígado, Método

ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90.....................................................58

Figura 29. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90 .............................59

Figura 30. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90 .............................59

Figura 31. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,

Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ................................60

Figura 32. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996) ................................61

Figura 33. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996).....................62

Figura 34. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 Abril 1996).....................62

Figura 35. Resultados comparativos entre tejido analizado por Método ELISA en función de

la norma de referencia. .......................................................................................................66

Figura 36. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en

función de la norma de referencia. ......................................................................................67

Espinoza Molina XI

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Población bovina y ponderación de la muestra por provincia en base a datos

correspondientes al periodo 2014 .........................................................................................6

Tabla 2. Ubicación de mataderos de faenamiento bovino a muestrear en la Provincia de

Manabí .................................................................................................................................7

Tabla 3. Matrices de tejido bovino y métodos a implementar para la determinación de

clembuterol ..........................................................................................................................8

Tabla 4. Mínimo de muestras necesarias para detectar residuos no conformes en un lote. 12

Tabla 5. Distribución de la muestra en la provincia de Manabí en base al periodo 2014 ...... 12

Tabla 6. Planificación del muestreo en los mataderos de la provincia de Manabí según

horario de faena bovina ...................................................................................................... 13

Tabla 7. Seteo de las masas de clembuterol ...................................................................... 24

Tabla 8. Gradiente de solventes aplicado en el método cromatográfico. ............................. 24

Tabla 9. Resultados de soluciones estándar de clembuterol para análisis de muestras de

Músculo - Método ELISA .................................................................................................... 26

Tabla 10. Resultados de clembuterol en submuestras de músculo Método ELISA .............. 27

Tabla 11. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado Método ELISA ................ 29

Tabla 12. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado_Método ELISA ............... 30

Tabla 13. Resultados clembuterol en submuestras de hígado y músculo bovinos_Método

UPLC/MS/MS ..................................................................................................................... 35

Tabla 14. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de

hígado ................................................................................................................................ 41

Tabla 15. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de

Músculo. ............................................................................................................................ 44

Tabla 16. Límites Máximos de Residuos Veterinarios en matriz músculo e hígado bovino

establecido en normativas internacionales .......................................................................... 46

Tabla 17. Tabulación de resultados de análisis en muestras de músculo, según método

ELISA y UPLC/MS/MS ....................................................................................................... 48

Tabla 18. Resumen análisis en muestras de músculo, según método ELISA y

UPLC/MS/MS, con relación a la normativa legal ................................................................. 50

Tabla 19. Tabulación de resultados de análisis en muestras de hígado, según método

ELISA y UPLC/MS/MS ....................................................................................................... 51

Tabla 20. Resumen análisis en muestras de hígado, según método ELISA y UPLC/MS/MS,

con relación a la normativa legal ......................................................................................... 53

Tabla 21. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y

UPLC/MS/MS en muestras de músculo, en relación a la normativa legal vigente. ............... 63

Tabla 22. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y

UPLC/MS/MS en muestras de hígado, en relación a la normativa legal vigente................... 64

Tabla 23. Resultados comparativos por tejido analizado con Método ELISA en función de la

norma de referencia. .......................................................................................................... 65

Espinoza Molina XII

Tabla 24. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en

función de la norma de referencia. ......................................................................................66

Espinoza Molina

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Plan de muestreo para el estudio de residuos de medicamentos veterinarios

(anabólicos) a Nivel Nacional.............................................................................................. 80

Anexo 2. Autorización desarrollo de tesis maestría “Evaluación de clembuterol en productos

pecuarios bovinos .............................................................................................................. 93

Anexo 3. Reunión coordinación proyecto de análisis residuos veterinarios ......................... 94

Anexo 4. Planificación muestreo en mataderos de Manabí................................................. 95

Anexo 5. Oficio dirección de tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina .......... 95

Anexo 6. Oficio co-dirección como investigador del Proyecto Prometeo y Agrocalidad de la

tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina ...................................................... 96

Anexo 7. Formato Orden de trabajo de las muestras del proyecto “Evaluación de

clembuterol en productos pecuarios bovinos de la provincia de Manabí .............................. 97

Anexo 8. Formato Registro de toma de muestras ............................................................... 98

Anexo 9. Formato registro de análisis de ELISA ................................................................. 99

Anexo 10. Informe de cumplimiento de comisión para la toma de muestras en la provincia

de Manabí. ....................................................................................................................... 100

Anexo 11. Informe de comisión de servicios institucionales para la toma de muestras de

productos pecuarios bovinos en la provincia de Manabí .................................................... 103

Anexo 12. Capacitación Método de ELISA para clembuterol y demostración .................... 103

Anexo 13. Certificado de formación completa sobre el Método de ELISA para clembuterol.

............................................................................................................................................. 106

Anexo 14.. Seteo de masas clembuterol en el equipo UPLC/MS/MS ................................ 106

Anexo 15. Laboratorio de contaminantes productos pecuarios, análisis de clembuterol por el

método de ELISA. (Recepción de muestras, codificación, extracción de la porción analítica)

............................................................................................................................................. 108

Anexo 16. Figuras de participación en formación y desarrollo del método ELISA

clembuterol, impartida por la empresa Biooscientific – Inventagri. ..................................... 109

Anexo 17. Figuras del proceso de análisis por el método cromatográfico UPLC/MS/MS

(Preparación de estándares, recepción, codificación, preparación, extracción de las muestras

de hígado y músculo, previo a la inyección en el equipo) .................................................. 110

Anexo 18. Figuras Acondicionamiento del equipo (gradiente) ........................................... 111

Espinoza Molina 1

Wania Fernanda Espinoza Molina

Trabajo de Graduación

Luis Alejandro Ramos Guerrero

Mayo, 2018

“Determinación de clembuterol en músculo e hígado bovino en la provincia de

Manabí y su evaluación respecto a los límites máximos permitidos.”

CAPÍTULO 1. INTRODUCCION

Uno de los principales retos a nivel mundial es satisfacer la creciente demanda de alimentos.

Asimismo, el crecimiento demográfico obliga a buscar métodos y alternativas que permitan

obtener mayores rendimientos en la producción de alimentos. Los productos bovinos no

escapan a esta tendencia y la industria ganadera ha implementado métodos para cubrir la

demanda, tanto en cantidad como en calidad, a través de manejos genéticos, adelantos

tecnológicos y farmacológicos, mismos que permitieron mejoras y una producción más

eficiente. Sin embargo, se ha determinado que existen productos veterinarios de riesgo como

es el caso del clembuterol, sustancia que está catalogada como un anabolizante del grupo de

los β-agonistas adrenérgicos (López Hernández, y otros, 2011), y cuyo uso está autorizado

en varios países como medicamento para problemas respiratorios en humanos, así como

también para uso veterinario en equinos.

Figura 1. Imagen Optimizada de Clembuterol

Fuente: Wania Espinoza

Espinoza Molina 2

El clembuterol, cuya estructura química se muestra en la Figura 1, causa efectos en la salud

humana al ser utilizado en dosis no terapéuticas. Dependiendo de la cantidad ingerida de este

fármaco, diversos efectos pueden manifestarse en los pacientes incluyendo taquicardias,

tembladera, vómitos, cefalea, rubor facial, ansiedad, hipertensión, dolor muscular y, en casos

extremos, se pueden presentar intoxicaciones severas y hasta la muerte. (López Hernández,

y otros, 2011).

Se ha determinado que el clembuterol aplicado a bovinos permite la ganancia de masa

muscular y esto genera beneficios económicos para los productores. Esta ganancia de masa

muscular sucede en virtud de la acción lipolítica de disminución de la grasa e incremento de

la carne magra (Smith & Paulson, 1997) y, por ende, se tendría el incremento de peso de los

animales. Hay reportes que dan cuenta de que el clembuterol se ha utilizado en Europa y

América de manera ilegal por parte de ciertos productores de ganado, y esto ha significado

un peligro para la salud pública. En este sentido varios casos de intoxicación se han

relacionado con productos cárnicos contaminados con residuos de clembuterol (Smith &

Paulson, 1997).

La administración vía oral del clembuterol en bovinos, en una dosis de 3 mg/kg, tiende a

causar efecto en el animal a partir de las 48 horas, y los residuos del anabólico se observan

principalmente en la orina en un 41,5%, el 3% se elimina a través de las heces y el resto se

manifiesta en los tejidos y esqueleto (Smith & Paulson, 1997). El tiempo de efecto residual del

clembuterol estimada en bovinos es de 18 horas a partir de la excreción urinaria. (Smith, 1998)

A nivel internacional, se tienen varios reportes sobre problemas en la salud de la población,

asociados a la aplicación ilegal de adrenérgicos agonistas en el ganado. En México, en el

período 2002 a 2006, se registraron 192 reportes de intoxicaciones por clembuterol con un

total de 1300 casos que ventajosamente no han resultado en defunciones, sin embargo,

fueron motivo de enorme preocupación en aquel país (Domínguez, y otros, 2009-2010). El

alimento consumido en la mayoría de aquellos casos fue el hígado de res y las reacciones

fueron observadas dentro de un período de 30 minutos a 6 horas posteriores a la ingesta.

Entre los síntomas que presentaron los pacientes afectados se destacaron palpitaciones,

náuseas, ansiedad, angustia y malestar general, con una duración promedio de 40 horas

(Domínguez, y otros, 2009-2010).

Considerando que Ecuador fue declarado país libre de fiebre aftosa en el año 2015, ésta

temática adquiere aún más relevancia, pues importantes mercados internacionales se abren

a la exportación de carne bovina producida en el país. Es previsible que países que muestren

interés en importar carne ecuatoriana, impongan estrictos y exigentes estándares de calidad

e inocuidad alimentaria, en los que se incluirían límites muy bajos de residuos de fármacos

y/o productos de uso veterinario.

Espinoza Molina 3

Actualmente, Ecuador está comprometido con el levantamiento de información sobre el uso

de medicamentos veterinarios y otros fármacos, y no se puede descartar el posible uso en la

ganadería de ciertos fármacos que en otros países están prohibidos y han causado problemas

graves. En caso de no llegar a cumplir con esos criterios de calidad e inocuidad, la carne

bovina ecuatoriana tendría una nueva barrera que impediría su exportación, por lo que, es

indispensable desarrollar estudios como los que se presentan en este trabajo.

En este contexto, se hace necesario contar con información sobre la presencia (o ausencia)

de residuos de fármacos en productos cárnicos bovinos para que de esta manera las

instituciones nacionales de control y los productores puedan encarar estrategias para corregir

posibles malas prácticas en la producción y asegurar la calidad e inocuidad de los productos

tanto para consumo interno como para exportación.

Por lo antes mencionado es que esta investigación pretende direccionar al levantamiento de

información sobre la presencia de clembuterol en músculo e hígado de res. Se sospecha que

este anabólico estaría siendo aplicado en bovinos, pero la falta de datos de análisis de

residuos de este anabólico en productos cárnicos no permite establecer si esta problemática

existe. Esta investigación incluye el análisis de clembuterol en muestras de carne e hígado de

bovinos en la provincia con el hato más grande del país, es decir Manabí. Los valores de

concentración de clembuterol son comparados con Límites Máximos de Residuos Veterinarios

(LMRV) establecidos en el Codex Alimentarius. Se espera que los datos generados permitan

hacer un diagnóstico del sistema de producción de carne bovina y que sirvan de base para

encarar acciones que permitan la mejora de la inocuidad de los productos cárnicos que se

producen en el país.

En el Capítulo 2, se describe los materiales y métodos utilizados en la investigación, así como

las unidades y cantidades de muestras. También se describen los métodos analíticos

considerados para la determinación de residuos de clembuterol en los tejidos objetos de

estudio: músculos e hígado. Los métodos analíticos usados en esta investigación son el

método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas, ELISA (del inglés “Enzyme- Linked

Immunosorbent Assay”) y cromatografía líquida UPLC/MS/MS (del inglés “Ultra Performance

Liquid Chromatography) acoplada a espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Los

métodos analíticos mencionados fueron usados para la detección y cuantificación de

clembuterol en muestras colectadas en la provincia de Manabí, considerando que esta

provincia representa el 18,13% del hato bovino nacional.

En el Capítulo 3 se describen los resultados de los análisis de muestras de músculo e hígado

obtenidos usando los métodos de ELISA y UPLC/MS//MS. Debido a que las muestras fueron

analizadas con dos métodos, es posible realizar una comparación entre métodos.

En el Capítulo 4 se presenta la discusión de los resultados obtenidos. Se realiza la evaluación

del contenido de clembuterol en las muestras. Asimismo, se realiza un contraste

Espinoza Molina 4

de estos resultados con aspectos establecidos por organismos internacionales sobre el uso

de anabólicos en la ganadería. Adicionalmente se incluye un análisis legal asociado a las

garantías de la salud humana en la República del Ecuador.

1.1. Objetivo General

Determinar clembuterol en músculo e hígado bovino en la provincia de Manabí y su evaluación

respecto a los límites máximos permitidos

1.2. Objetivos Específicos

- Desarrollar métodos apropiados para la detección del anabólico clembuterol en productos

pecuarios bovinos.

- Proporcionar las herramientas para asegurar la calidad e inocuidad de los productos

pecuarios bovinos desde el inicio de la cadena de producción primaria, mediante la valoración

de la presencia de residuos de clembuterol.

- Disponer de información estadística sobre la presencia de clembuterol en el país para la

toma de acciones pertinentes

Espinoza Molina 5

CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Tipo de investigación.

La presente investigación es de tipo analítica en la que se realiza la generación de resultados

(concentración de clembuterol) y una comparación de variables tanto en los tipos de muestra

(músculo e hígado) y los métodos aplicados (ELISA y UPLC/MS/MS).

2.2. Localización y descripción del sitio de investigación.

La provincia de Manabí fue seleccionada para efectos de esta investigación, debido a que

tiene el mayor hato bovino en la República del Ecuador (Ver Tabla 1 y Figura 2). Las muestras

de carne e hígado para el análisis de clembuterol en productos pecuarios bovinos fueron

obtenidas de diez mataderos en la provincia de Manabí (Ver Tabla 2). Esta investigación fue

realizada en colaboración con la Coordinación General de Inocuidad de Alimentos, la

Coordinación General de Laboratorios, la Coordinación de Registros Agropecuarios y la

Coordinación General de Sanidad Animal, de la Agencia Ecuatoriana de Aseguramiento de la

Calidad del Agro (AGROCALIDAD), la misma que tiene presencia en las diferentes provincias

del país. Las muestras se analizaron en los laboratorios de AGROCALIDAD, ubicados en

Tumbaco – Cantón Quito, Provincia de Pichincha.

2.3. Población bovina y delimitación del muestreo

La población bovina considerada dentro de la investigación son toretes, toros y vacas, las

mismas que para su análisis se definen como UM (unidades de muestreo). El número de

muestras se determinó en base a la información suministrada por las Coordinaciones de

Sanidad Animal y de Inocuidad de Alimentos y que constan en el “Plan de Muestreo para el

Estudio de Residuos de Medicamentos Veterinarios (Anabólicos) a Nivel Nacional”,

documento paralelo desarrollado para fines de esta investigación (ANEXO 1). Aspectos

relacionados al muestreo en la provincia considerada en este estudio (Manabí) fueron

recabados de dicho documento.

Espinoza Molina 6

Tabla 1. Población bovina y ponderación de la muestra por provincia en base a datos correspondientes al periodo 2014

POBLACIÓN BOVINA DEL ECUADOR EN EL PERIODO 2014

PROVINCIA TORETES TOROS VACAS POBLACIÓN BOVINA TOTAL

PONDERACIÓN POR

PROVINCIA

MATADEROS ACTIVOS

MANABI 124022 26364 327411 477797 18,13% 28

ESMERALDAS 87212 10534 112219 209965 7,97% 8

PICHINCHA 40476 25019 144115 209610 7,95% 14

GUAYAS 38933 10804 117140 166877 6,33% 20

COTOPAXI 38159 27860 78081 144100 5,47% 9

STO. DOMINGO 49004 11974 77452 138430 5,25% 4

CHIMBORAZO 23312 23324 85790 132426 5,02% 4

LOJA 32676 15590 73564 121830 4,62% 16

MORONA SANTIAGO

22787 23800 69186 115773 4,39% 6

AZUAY 18010 18247 75764 112021 4,25% 8

EL ORO 29839 8985 63259 102083 3,87% 19

BOLIVAR 24502 14868 52758 92128 3,50% 4

ZAMORA CHINCHIPE

25263 19619 46414 91296 3,46% 6

CAÑAR 10520 11005 68843 90368 3,43% 3

CARCHI 9569 8995 57943 76507 2,90% 4

TUNGURAHUA 12733 14831 48277 75841 2,88% 7

IMBABURA 19840 15852 28508 64200 2,44% 10

LOS RIOS 16941 3983 40141 61065 2,32% 9

SUCUMBIOS 19436 5253 28730 53419 2,03% 5

NAPO 11003 6666 16547 34216 1,30% 3

ORELLANA 13064 3547 16983 33594 1,27% 2

PASTAZA 6652 5145 11322 23119 0,88% 8

STA. ELENA 1557 634 7134 9325 0,35% 1

TOTAL 675510 312899 164758 1

2635990 100,00% 198

Fuente: Wania Espinoza Adaptado de la Base Sifae y movilización 2014. Coordinación General de Sanidad Animal AGROCALIDAD.

Espinoza Molina 7

Figura 2. Población bovina del Ecuador por provincia, periodo 2014.

Fuente: Wania Espinoza M, Adaptado de la Base Sifae y movilización 2014. Coordinación General de Sanidad Animal AGROCALIDAD

Tabla 2. Ubicación de mataderos de faenamiento bovino a muestrear en la Provincia de Manabí

No. DE

MATADERO

CANTÓN

ESPECIE ANIMAL

CLASE DE BOVINO A

MUESTREAR

% CORRESPONDIENTE AL HATO BOVINO

NACIONAL

1 PORTOVIEJO

BOVINO

TORETES, TOROS Y VACAS

18,13

2 CALCETA

3 MANTA

4 CHONE

5 SANTA ANA

6 TOSAGUA

7 JPIJAPA

8 EL CARMEN

9 CAMPOZANO

10 ROCAFUERTE

Fuente: Wania Espinoza M. Adaptado de la Coordinación General de Inocuidad

AGROCALIDAD.

ESMERALDAS, 8%

Manabí, 18%

PICHINCHA, 8%

NAPO, 1%

ORELLANA, 1%

PASTAZA, 1%

STA. ELENA, 0%

GUAYAS, 6%

LOS RIOS, 2%

SUCUMBIOS, 2%

Otros, 16%

IMBABURA, 2% COTOPAXI, 5%

CARCHI, 3%

TUNGURAHUA, 3%

STO. DOMINGO, 5%

CAÑAR, 3%

CHIMBORAZO, 5%

EL ORO, 4%

BOLIVAR, 3%

ZAMORA CHINCHIPE, 3%

LOJA, 5%

AZUAY, 4% MORONA SANTIAGO, 4%

POBLACIÓN BOVINA DEL ECUADOR PERIODO 2014

Espinoza Molina 8

Las muestras correspondieron a tejido bovino (músculo e hígado). Para la etapa analítica se

aplicaron métodos basados en cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en

tándem (UPLC/MS/MS) y ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) (ver Tabla

3). La última es una técnica de tipo “screening” que permite la detección y la estimación de

concentraciones del clembuterol en muestras de músculo y/o hígado de una manera rápida y

con un menor costo.

Tabla 3. Matrices de tejido bovino y métodos a implementar para la determinación de

clembuterol.

MATRIZ BOVINA

(SUBMUESTRA)

MÉTODO POR APLICAR Cantidad por

muestrear en

campo

(aprox.)

Porción analítica

según el método

(laboratorio)*

SCREENING CONFIRMATORIO

Músculo (pecho) ELISA Ensayo

colorimétrico

competitivo

UPLC/MSMS 500g 1g ELISA

5g UPLC/MS/MS

Hígado ELISA Ensayo

colorimétrico

competitivo

UPLC/MSMS 400g 1g ELISA

5g UPLC-MSMS

Fuente: Wania Espinoza M. Adaptado de CODEX GL 33, Cuadro 3. Carne de res y aves;

descripción de las muestras primarias y tamaño mínimo de las muestras de laboratorio.

Nota: Las cantidades de muestra indicadas para los diferentes métodos se especifican en el

Manual MaxSignal® ELISA clembuterol y CLG-AGON1.01. United States Department of

Agriculture. Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health Science.

2.4. Consentimiento Institucional.

El Director Ejecutivo de AGROCALIDAD y sus Coordinaciones participantes, una vez

informados sobre la propuesta de la investigación planteada mostraron su consentimiento

para la puesta en marcha de esta como componente importante del Plan de Contaminantes

Pecuarios del proceso de Inocuidad de Alimentos de la institución. (Memorando MAGAP-DSL-

AGROCALIDAD-2014-001919-M, del 03 de octubre de 2014, Memorando MAGAP-DSL-

AGROCALIDAD-2014-001920-M, del 03 de octubre de 2014, (Ver Anexos 2, 3)

2.5. Descripción del trabajo de campo.

Esta investigación se realizó en cuatro fases:

Fase I: Recopilación de información bibliográfica

Fase II: Muestreo y diagnóstico preliminar

Fase III: Plan de muestreo

Fase IV: Implementación metodologías y análisis de muestras

Espinoza Molina 9

2.5.1. Fase I: Recopilación de Información bibliográfica

Para esta fase se recopiló información bibliográfica y bases de datos de la autoridad Sanitaria

Nacional (AGROCALIDAD), donde se consideraron variables de población animal bovino

(toretes, toros y vacas), existente en el país para poder establecer el tamaño de la muestra.

Asimismo, se recopiló información bibliográfica sobre los métodos analíticos para la

determinación del analito en estudio y la normativa legal vigente. Se seleccionaron los

métodos analíticos más apropiados considerando criterios de equipamiento e insumos

disponibles, los límites de cuantificación y detección, y la menor complejidad de los ensayos.

2.5.2. Fase II: Muestreo y diagnóstico preliminar

Se realizó un muestreo preliminar completamente al azar en los mataderos de las provincias

de Tungurahua, Pichincha y Santo Domingo de los Tsáchilas, con la finalidad de determinar

la presencia o ausencia de clembuterol en hígado y músculo bovino y de esta manera

determinar preliminarmente la frecuencia, la misma que permitirá preparar el plan de muestro

final acorde a la problemática local. Para esto se implementó y utilizó el método de ELISA

semicuantitativo.

La cantidad de muestras y de lugares a muestrear estuvieron basados en la cercanía al

laboratorio y a criterios técnicos establecidos en el método de muestreo recomendado por el

CODEX en CAC/GL 33, 1999. Así como en la información de los sistemas de Fiebre Aftosa

de Ecuador (SIFAE), Sistema de Información Geográfica y Agropecuaria (SIGAGRO), matriz

estado de mataderos, matriz frecuencia y días de faena, correspondientes al periodo 2014 de

AGROCALIDAD. Con esta información se desarrolló un plan de muestreo para el estudio de

residuos de medicamentos veterinarios (anabólicos) a nivel nacional.

2.5.3. Fase III: Plan de Muestreo

En la investigación se consideró inicialmente un alcance nacional y se desarrolló un plan de

muestreo para el estudio de residuos de medicamentos veterinarios (en este caso anabólicos)

a nivel país. Se tomó como referencia el método de muestreo recomendado del Codex

Alimentarius CAC/GL 33 (1999), así como también la información de los sistemas SIFAE y

SIGAGRO. Adicionalmente, se consideró la información disponible en AGROCALIDAD sobre

el estado de los mataderos en el país y aspectos relacionados a su funcionamiento (por

ejemplo, frecuencia y días de faena), correspondientes al periodo 2014. Asimismo, se

consideraron los resultados del muestreo y diagnóstico realizado preliminarmente.

Espinoza Molina 10

En este plan de muestreo resultó que Manabí es la provincia con el mayor número de

muestras y, por lo tanto, la más representativa en cantidad del país. De igual manera se realizó

un estudio de costos del estudio y se decidió finalmente establecer el alcance del estudio a

Manabí. Para cumplir con los criterios de representatividad del estudio se realizó el muestreo

en 10 mataderos de la mencionada provincia (Ver Tabla 2).

2.5.3.1. Procedimiento de muestreo

Para fines del muestreo y actividades que se le relacionen se presentan a continuación

algunas definiciones aplicadas en el muestreo.

Población:

La población bovina que fue considerada en la investigación incluyó toretes, toros y vacas,

las mismas que para su tratamiento vienen a ser las unidades o muestras, esto basándonos

en el documento “Plan de Muestreo para el Estudio de Residuos de Medicamentos

Veterinarios (Anabólicos) a Nivel Nacional” desarrollado para fines de esta investigación

(ANEXO 1)

Muestra:

Una o más unidades seleccionadas (animales bovinos) entre una población de unidades, o

una porción de material seleccionada entre una cantidad mayor de material. (Códex

Alimentarius, 1999)

Muestreo:

Procedimiento empleado para extraer y constituir una muestra. Se realizará basada en el

protocolo de toma y envío de muestras del manual de AGROCALIDAD. Este protocolo

especificará la metodología, los instrumentos y demás necesidades para la toma,

conservación y envío de muestras, así también el técnico encargado de realizar el muestreo.

Tamaño de la muestra:

Número de unidades, o cantidad de material, que constituyen la muestra.

Unidad:

La parte discreta más pequeña de un lote que deberá extraerse para formar la totalidad o

parte de una muestra. También se la puede considerar para fines de esta investigación como

submuestra.

Animales grandes o partes u órganos de estos. Una unidad estará formada por una porción,

o la totalidad, de una parte, u órgano determinado. Las partes u órganos podrán cortarse para

formar unidades.

Espinoza Molina 11

En el estudio hace referencia a la porción de un tejido de hígado y músculo a ser extraído.

Unidad de muestreo (UM):

Conjuntos no solapados de la población que cubren la población completa. (Sheaffer,

Mendenhall, & Lyman R., 2007)

En el caso de la investigación haría referencia a los mataderos.

Procedimiento en las UM (matadero):

En cada unidad de muestreo, se debe seleccionar unidades al azar, con una frecuencia de

muestreo según la cantidad de animales existentes en el matadero al momento de la visita.

Las unidades deben marcarse de manera que permitan realizar el seguimiento durante el

proceso de faena hasta la toma de la muestra.

Unidad de Producción Agropecuaria (UPA):

Es una extensión de tierra dedicada total o parcialmente a la producción agropecuaria, la cual

reúne las siguientes características:

Una unidad económica, en el sentido de que desarrolla una actividad económica agropecuaria

bajo una dirección o gerencia única, independientemente de su forma de tenencia y de su

ubicación geográfica; compartiendo los mismos medios de producción en toda su extensión.

Para el caso de estudio aplicado a la presente investigación se definirá a la UPA como el

predio.

2.5.3.2. Toma de muestras y distribución del muestreo:

Se calculó el tamaño de la muestra a analizar a nivel nacional aplicando principalmente los

criterios recomendado por el Codex Alimentarius en CAC/GL 33 (1999). Fue considerado el

total de la población bovina adulta (vacas, toros y toretes) existentes a nivel nacional en el

periodo 2014, esto de acuerdo con los datos de AGROCALIDAD.

El muestreo se contempló en la provincia de Manabí, la misma que con el 18,13% es la

provincia con mayor hato bovino del país y que corresponde a una población total de 477.797

bovinos, considerada para efectos de la investigación.

Se aplicó a la metodología una probabilidad del 99% de detección y un 10% de incidencia de

los residuos no conformes en la UM (derivados del estudio preliminar). Estos parámetros

preestablecidos fueron usados para hacer el cálculo de número total de bovinos a

muestrearse en la provincia de Manabí, aplicando la ecuación 1.

𝑛 = 𝑛0

1+(𝑛0−1)/𝑁 (Ec.1)

Espinoza Molina 12

10 22 29 44

Donde, n es el número mínimo de muestras primarias a tomarse, no es el número de muestras

indicado en la Tabla 4, y N es el número de unidades en el UM que puede constituir una

muestra. Considerando valores de 44 y 477797 para no y N, respectivamente, se obtiene un

número de 44 bovinos a muestrearse. Por supuesto, este número de bovinos debe ser

repartido entre los mataderos más importantes de Manabí con la finalidad de dar un mayor

peso específico a los mataderos con mayor número de sacrificios. Se consideró, además,

colectar un 10% adicional de muestras en previsión a posibles fallos en la logística o análisis;

es decir un total de 48 muestras.

Tabla 4. Mínimo de muestras necesarias para detectar residuos no conformes en un lote.

Número de muestras primarias seleccionadas al azar necesario para una probabilidad determinada de detectar una muestra no conforme por lo menos en un lote de carne de reses y aves, para una incidencia dada de residuos no conformes en el lote.

Incidencia de los residuos no conformes en el lote %

Número mínimo de muestras (no) necesarias para detectar residuos

no conformes con una probabilidad del:

90% 95% 99% 90 1 - 2 80 - 2 3 70 2 3 4 60 3 4 5 50 4 5 7 40 5 6 9 35 6 7 11 30 7 9 13 25 9 11 17 20 11 14 21

15 15 19 29

5 45 59 90 1 231 299 459

0,5 460 598 919

0,1 2302 2995 4603

Fuente: Cuadro N°2. Códex Alimentarius, CAC/GL 33 Métodos de muestreo recomendados para la determinación de residuos de plaguicidas a efectos del cumplimiento de los LMR (1999)

La distribución del muestreo se ha considerado en base a la población total de bovinos adultos

(vacas, toros y toretes) correspondientes al periodo 2014 (ver Tabla 5). Como se mencionó

antes, al total de muestras calculadas a ser recolectadas (44) se adicionó 10% en previsión a

posibles fallos en la logística o análisis.

Tabla 5. Distribución de la muestra en la provincia de Manabí en base al periodo 2014

POBLACION BOVINA

Total unidades

a considerar

Tamaño de la

muestra

10% adicional

por error

posible en

procesamiento

de muestras

Mataderos

activos

Mataderos

para

considerar

en el

muestreo

TORETES TOROS VACAS

124022 26364 327411 477797 44 4 28 10

Fuente: Anexo 1

Espinoza Molina 13

Se escogieron 10 de los 28 mataderos, considerando su representatividad y mayor flujo de

sacrificios mensuales. Asimismo, se consideró su localización geográfica

Para la toma de muestras en varios cantones de la provincia de Manabí, se coordinó con el

personal técnico de AGROCALIDAD, considerando los horarios de faena bovina de los

mataderos. (Ver Tabla 6 y Anexo 4)

Tabla 6. Planificación del muestreo en los mataderos de la provincia de Manabí según horario

de faena bovina.

CANTÓN

PARROQUIA

LUGAR

NÚMERO DE

ANIMALES/ MES

PONDERACIÓN

POR MATADERO

MANABÍ

No. MUESTRAS

POR TOMAR/ CAMAL

HORARIOS DE FAENA

A LA FECHA

BOLIVAR

CALCETA

Camal

Municipal – Calceta

200

4,6%

2

Junín Lunes y Martes 23:00 (3 bovinos)

CHONE

CHONE

Chone - Camal

Municipal de Chone

300

6,9%

3

Lunes a

viernes 22:00

EL CARMEN

EL CARMEN

Camal

Municipal El Carmen

524

12,1%

5

Lunes,

martes, jueves, viernes 14:00

JIPIJAPA

JIPIJAPA

Jipijapa - Camal

Municipal de Jipijapa

250

5,8%

3

Lunes a jueves 2:00

MANTA

SAN JUAN DE

MANTA

San Juan de

Manta - COGAMANTA S.A.

1327

30,6%

13

Lunes a viernes 15:00

PAJAN

CAMPOZANO

Canal

Parroquial de Campozano

130

3,0%

1

Lunes a viernes 2:00 a 5:00

PORTOVIEJO

PORTOVIEJO

Camal Municipal de Portoviejo

1100

25,4%

11

Lunes a sábado 17:00 (30 diarios)

ROCAFUERTE

ROCAFUERTE

Camal Municipal de Rocafuerte

180

4,2%

2

Viernes 8:00 / sábado

16:30

SANTA ANA

SANTA ANA

Camal

Municipal de Santa Ana

135

3,1%

1

Lunes a

Viernes 17:00 (1 res)

TOSAGUA

TOSAGUA

Camal Municipal de Tosagua

190

4,4%

2

Martes a sábado 1:00

TOTAL: 4336 100% 44

2.5.4. Fase IV: Métodos de Análisis en Laboratorio.

Los métodos aplicados para el análisis de clembuterol en las matrices de músculo e hígado

fueron los de ELISA y UPLC/MS/MS

Espinoza Molina 14

2.5.4.1. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e

hígado bovino): Método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas

(ELISA).

Principio

El método ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima,

de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como

enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima

e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno- anticuerpo

quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un

substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o

cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro (lector de ELISA) Ver

Figura 3.

Figura 3. ELISA competitivo

Fuente: Imagen modificada. Adaptado de DocSlide.documents.tips/Down

load/link/monografia-de-elisa.html

Espinoza Molina 15

Sensibilidad del Método (Límite de Detección)

Para músculo e hígado bovino, el límite de detección reportado en el kit es de 0,10 µg/kg (o

ppb).

Equipos y Materiales

Lector de ELISA Bioo Scientific (filtro primario 450 nm; filtro diferencial 630 nm)

Incubadora

Homogeneizador de tejido

Evaporador de N2 Thermo Scientific TS-18822

Mezclador (vortex) - velocidad variable

Tubos cónicos de 15 ml

Micropipetas de 10, 20, 100 y 1000 µl

Micropipetas multicanal

Placas de micro titulación

Herramientas

Tijeras para cortar carne

Overoles impermeables

Guantes

Pinzas

Reactivos y Estándares

Control negativo 1,8 ml

Soluciones clembuterol HRP Conjugad 7 ml

20X Sample Buffer 10 ml

Solución de lavado 20X 28 ml

Stop Buffer 20 ml

Sustrato TMB 12 ml

10X PBS 25 ml

Equilibrio Buffer I 10 ml

Equilibrio Buffer II (polvo) 62 g

Acetonitrilo

Estándares de clembuterol* 1,8ml

* (0,05 ng/ml, 0,15 ng/ml, 0,50 ng/ml, 1.5 ng/ml, 4,5 ng/ml, 10 ng/ml)

Preparación de soluciones y/o reactivos

Preparación del buffer de extracción de muestra 1X: Combinar 1 volumen del buffer de

extracción de muestra 20X con 19 volúmenes de agua destilada y mezclar bien.

Preparación de la solución PBS 1X: Combinar 1 volumen de la solución PBS 10X con 9

volúmenes de agua destilada y mezclar bien

Espinoza Molina 16

Preparación del Buffer de balanceo de muestra 1X: Agregar 10 ml del Buffer de balanceo de

muestra I y 62 g del Buffer de balanceo de muestra II (polvo) a una botella plástica de 250 ml.

Adicionar 190 ml de agua destilada a la botella, mezclar bien y obtener una solución

homogénea.

Consideraciones para el ensayo

Todos los reactivos deben ser llevados a temperatura ambiente antes de su uso (1-2 horas a

20-25°C). Las soluciones deben ser preparadas en el momento del ensayo ELISA.

Todos los reactantes deben ser mezclados mediante una suave inversión o movimiento en

remolino antes del uso.

Preparar los volúmenes que serán necesarios para el número de pocillos que serán usados.

No retornar los reactantes a los recipientes originales.

Preparación de la solución de lavado 1X: Combinar 1 volumen de solución de lavado 20X con

19 volúmenes de agua destilada y mezclar bien. Preparar el volumen total de solución de

lavado 1X, pues este buffer es estable por todo el tiempo de vida del kit. Siempre se debe

evitar contaminar el buffer con otros reactivos o puntas de pipeta.

Preparación de la muestra

Asegúrese que las muestras sean almacenadas apropiadamente. En general, las muestras

deben ser refrigeradas entre 2 y -4°C por no más de 1-2 días. El congelamiento a una

temperatura mínima de -20°C es necesario cuando el almacenamiento es por mayores

tiempos. Antes de su uso, las muestras pueden ser descongeladas a temperatura ambiente

(20-25°C) o en el refrigerador.

Procedimiento de extracción

Remover la grasa y las venas del músculo o el hígado. Homogeneizar el músculo o el hígado

hasta lograr una consistencia de puré, esto usando un homogeneizador de tejido.

Pesar 1 g (± 0.05 g) de la muestra homogeneizada en un tubo cónico de 15 ml.

Adicionar 2.0 ml del Buffer de extracción de muestra 1X al tubo. Colocar la tapa al tubo y

agitar manualmente para asegurar que toda la muestra esté sumergida en el buffer.

Incubar la muestra por 20 minutos a 40°C.

Adicionar al tubo cuidadosamente 3.0 ml de acetonitrilo y 2.5 ml del Buffer de balanceo de

muestra 1X. Sólo para muestra de hígado, se adiciona 100 µl del Buffer de extracción de

hígado. Mezclar vigorosamente con ayuda del vortex a máxima velocidad por 3 minutos o

realizar el mezclado con vortex "multitubos" por 10 minutos.

Centrifugar la muestra por 10 minutos a 4000 RCF.

Cuidadosa y lentamente, transferir 1.2 ml (2 porciones de 600 µl) de la capa superior de

acetonitrilo a un nuevo tubo de 15 ml. Si la capa superior de acetonitrilo no es

Espinoza Molina 17

suficientemente clara, se debe asegurar de utilizar la fuerza centrífuga apropiada. Re

centrifugar la muestra por 10 minutos a máxima velocidad.

Usando un evaporador de N2, secar la muestra completamente hasta lograr que solo un

residuo blanco quede en el fondo del tubo. Para facilitar el proceso, colocar el tubo con la

muestra en contacto con calor (50°C) durante el secado. Tener cuidado de evaporar muy

rápido y evitar pérdidas en la aguja o hacia la atmósfera. Iniciar el proceso de evaporación

usando nitrógeno con baja presión.

Adicionar al residuo seco 1.6 ml (± 0,1 ml) de hexano. Tapar el tubo y dar suaves golpes

contra una superficie dura. Agitar con el vortex por 30 segundos.

Adicionar 800 µl de PBS 1X. Agitar con el vortex por 3 minutos.

Centrifugar la muestra por 5 minutos a 4000 RCF.

Descartar la fase superior de hexano o transferir 500 µl o menos de la fase acuosa inferior a

un tubo de 1.5 ml. Evitar transferir cualquier residuo de hexano al nuevo tubo, pues esto puede

resultar en imprecisiones en el ensayo ELISA.

Usar 100 µl de la capa acuosa inferior para el ensayo. El factor de dilución es 2.

Procedimiento del ensayo ELISA

Adicionar 100 µl de cada estándar de clembuterol, por duplicado, en diferentes pocillos.

Adicionar los estándares a la placa solo en el orden de menor concentración a mayor

concentración.

Adicional 100 µl de cada muestra en diferentes pocillos. Realizar un duplicado por lo menos

cada 10 muestras.

Adicionar 50 µl del conjugado clembuterol-HRP a cada pocillo. Mezclar el contenido de la

placa por 1 minuto.

Incubar la placa por 45 minutos a temperatura ambiente (20-25°C).

Eliminar exhaustivamente la solución de los pocillos y descartar el líquido. Lavar la placa 3

veces con 250 µl de solución de lavado 1X. Después del último lavado, invertir la placa y secar

mediante golpecitos sobre pedazos de papel absorbente. El siguiente paso debe realizarse

inmediatamente después del lavado.

Adicionar 100 µl del substrato TMB. Incubar la placa por 15 minutos a temperatura ambiente

(20-25°C). Controlar el tiempo de reacción inmediatamente después de adicionar el substrato.

Mezclar la placa por 1 minuto. No devolver substrato al recipiente original para evitar cualquier

posible contaminación. Si el substrato muestra coloración, es un indicativo de deterioro y debe

ser descartado. Es recomendable cubrir la placa durante la incubación.

Espinoza Molina 18

Después de la incubación, adicionar 100 µl de buffer de parado de reacción para detener la

reacción enzimática.

Leer la placa lo antes posible después de la adición del buffer de parado de reacción. La

lectura se debe realizar con un filtro primario de 450 nm y un filtro diferencial de 630 nm. Antes

de medir, limpiar la parte baja de la placa con un paño libre de pelusa, para asegurar que no

se tengan interferencias de humedad o huellas digitales en las lecturas.

Cálculo de las concentraciones

Se prepara una curva de calibración graficando la absorbancia relativa media (%) de cada

estándar respecto de su concentración en ng/ml en una curva logarítmica, tal como se muestra

en la Figura 4. La absorbancia relativa es el cociente entre la absorbancia del estándar (o la

muestra) y la absorbancia del estándar cero. Para expresar este valor en porcentaje, se

multiplica por 100.

Figura 4. Ejemplo de curva de calibración para la determinación de clembuterol

Fuente: Manual MaxSignal® ELISA Clembuterol

Se usan los valores de absorbancia relativa media de cada muestra para calcular su

correspondiente concentración de Clembuterol expresado en ng/ml, así como también un

complemento en Excel (MaxSignal® ESA AnalysisProgram) para obtener los resultados en

µg/kg.

2.5.4.2. Procedimiento para el análisis de clembuterol en tejido (músculo e

hígado bovino): Método de cromatografía líquida acoplada a espectrometría de

masas en tándem UPLC/MS/MS

Espinoza Molina 19

Principio

El método cromatográfico UPLC-MS-MS combina las ventajas de la separación de los

compuestos mediante cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC, por sus siglas en

inglés) y la capacidad de detección selectiva y confirmación de la identidad molecular del

espectrómetro de masas.

El método cromatográfico consiste en la separación de los componentes de la solución que

se inyecta al cromatógrafo, mediante diferencias entre las propiedades fisicoquímicas de las

sustancias y la interacción entre la fase móvil (solventes) y la fase estacionaria (materiales

especiales).

El método de detección debe ser capaz de detectar selectivamente la salida de los diferentes

compuestos separados en la columna cromatográfica. Para esto existen diferentes tipos de

detectores, pero uno de los más confiables es el detector en base a espectrometría de masas.

La espectrometría de masas es una técnica analítica que identifica a los compuestos en base

a su relación masa/carga y a la abundancia de los iones generados en el proceso. Para que

se pueda desarrollar esta técnica es necesario que los compuestos constituyentes de una

muestra formen iones (se ionicen) y para eso existen diferentes métodos tales como la

ionización electrónica (EI), química (CI), de electrospray (ESI), química a presión atmosférica

(APCI), fotoionización a presión atmosférica (APPI), ionización multimodo (MMI), por láser

(MALDI), por plasma acoplado inductivamente (ICP).

El modo de ionización utilizado en este trabajo corresponde al de electrospray (ESI), el mismo

que tiene una buena cobertura de polaridad y de pesos moleculares de los analitos, además

de corresponder a una técnica de ionización suave, lo que permite disponer de información

de los iones moleculares, lo que es básico para la identificación y cuantificación.

En ESI el eluyente (solvente y muestra separada) que sale de la columna cromatográfica es

nebulizado a presión atmosférica en presencia de un campo electrostático fuerte y un gas de

secado calentado. Las gotas de eluyente formadas en la nebulización son reducidas de

tamaño por el gas caliente hasta que se genera una explosión de tipo Coulombica. (Ver Figura

5).

Figura 5. Fuente de ionización de electrospray.

Fuente: Guía Agylent: Espectrometría de masas, fundamentos y teoría

Espinoza Molina 20

En una etapa posterior los iones ingresan al analizador de iones, que existen de distintos

tipos, y que en el presente trabajo correspondió a un triple cuadrupolo. En esta configuración

realmente existen dos cuadrupolos en donde se separan los iones por sus diferentes

relaciones masa/carga y entre los dos el tercero corresponde a una celda de colisión en donde

se realiza una segunda generación de iones. (Ver Figura 6).

Figura 6. Monitorización de reacción múltiple.

Fuente: Guía Agylent: Espectrometría de masas, fundamentos y teoría

Finalmente, los iones que han paso por este proceso llegan al detector para ser identificados

por sistemas capaces de detectar partículas cargadas como los multiplicadores de electrones.

Tomando en consideración que los sistemas de espectrometría de masas son complejos, los

mismo vienen asociados a softwares que permiten el completo manejo de estos y el

procesamiento de los datos.

Sensibilidad del Método (Límite de Detección y Cuantificación)

La cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC) y la cromatografía gaseosa (GC) son

tradicionalmente los sistemas de elección de los analistas cuando se requieren resultados

sensibles, confiables y con una variabilidad mínima. Los valores del método para el límite de

detección (LOD) y de cuantificación (LOQ) son 0,125 µg/Kg y 0,25 µg/Kg respectivamente.

Equipos y Materiales

Cromatógrafo líquido de ultra desempeño acoplado a espectrómetro de masas en

tándem. UPLC/MS/MS Waters, modelo Xevo TQ-S.

Equipo de concentración por paso de nitrógeno

Centrífuga Eppendorf 5804R

Mezclador (vortex) - velocidad variable

Balanza - sensibilidad 0.01 g

Balanza analítica - sensibilidad 0.0001 g

Espinoza Molina 21

Agitador horizontal

Molino de cuchillas GRINDOMIX GM200 marca Retsch

Licuadora

Tubos de centrífuga - 50 ml, con tapa

Micropipetas - ajustables, 10 - 5000 µl

Varillas de vidrio - 10 mm de diámetro por 10 cm de largo, redondeadas a ambos

lados

Matraces volumétricos - 1000, 100, 10 y 5 ml, ámbar

Filtro de nylon 0.45 µm

Cajas Petri - desechables de poliestireno

Escalpelos

Guantes resistentes a cortes

Reactivos y Estándares

Metanol - grado HPLC/MS

Acetonitrilo - grado HPLC/MS

Isopropanol - grado HPLC/MS

Cloruro de sodio, NaCl - grado reactivo

Sulfato de sodio, Na2SO4 - anhidro, grado reactivo

Sulfato de magnesio, MgSO4 - anhidro, mínimo 99.5% de pureza

Agua - desionizada, grado HPLC

Ácido fórmico - pureza 98 - 100%.

Carne e hígado libre de drogas.

Estándar clembuterol-HCl 98% pureza, marca Dr. Ehrenstorfer, lote N°41002

Estándar Metoprolol tartrate 99,5% pureza, marca Dr. Ehrenstorfer, lote N°20120

Preparación de soluciones y/o reactivos

Solución "stock" de clembuterol ~25 µg/ml (en metanol):

Pesar ~2.5 mg de clembuterol en un matraz volumétrico ámbar de 100 ml, diluir y enrazar

con metanol. Registrar la masa con 0,1 mg y calcular la concentración exacta. Este

estándar es estable por 2 meses bajo refrigeración a 2 - 8°C.

Solución "stock" de metoprolol 10 µg/ml (en metanol):

Solución intermedia A de clembuterol 250 ng/ml

Solución intermedia B de clembuterol 50 ng/ml (en metanol)

Espinoza Molina 22

Condiciones del Cromatógrafo líquido

Sistema del cromatógrafo líquido: ACUITY UPLC

Tiempo de corrida: 7,0 min

Columna: Acquity UPLC HSS T3, 1,8µm, 2,1 x 100 mm

Temperatura de la columna: 30°C

Temperatura del inyector: 10°C

Volumen del inyector: 5 µl

Tasa de flujo: 0,4 mL / min

Fase móvil:

A1: 0,1% (v/v) Solución acuosa de ácido fórmico

B1: 0,1% (v/v) Acetonitrilo

Condiciones del espectrómetro de masas

Sistema Masas: Xevo TQ-S MS

Modo de ionización: ESI+

Voltaje de la capilaridad: 3.5 kv

Voltaje del cono: 30 V

Temperatura de la fuente: 150 °C

Temperatura de Desolvatación : 550 °C

Gas de desolvatación: 900 L/H

Flujo del gas de colisión: 0,19 mL/min

Preparación de la muestra

Los residuos de clembuterol se extraen de las muestras de músculo e hígado con una mezcla

de acetonitrilo e isopropanol. Las sales cloruro de sodio, sulfato de sodio y sulfato de

magnesio son usados para precipitar las proteínas y deshidratar la solución. Este extracto es

evaporado, reconstituido en agua, filtrado y analizado por UPLC/MS/MS.

Procedimiento del ensayo UPLC/MS/MS

Extracción de muestras de hígado y músculo:

Pesar 5 +/- 0,1 mg de hígado o músculo en un tubo de centrífuga desechable de 50ml.

Incluido el control positivo y negativo.

Espinoza Molina 23

Adicionar 4ml de acetonitrilo y 1ml de isopropanol. Para el hígado y músculo congelado

tapar y agitar en el vortex por 2 minutos. Para músculo homogenizado sin congelar, agitar

en el vortex por 30 segundos.

Añadir 1,2 g de NaCl y agitar por 2 minutos

Añadir 4g Na2SO4 y 0,5g de MgSO4. Agitar por 2 minutos.

Nota: este es un punto de parada adecuado. La muestra puede ser almacenada durante la

noche a 2-8 °C

Centrifugar las muestras alrededor de 5 minutos

Filtrar el extracto:

usando una jeringa de 3ml y un filtro de nylon de 0,45 µm

Pipetear 1ml de extracto en un tubo de 12x75 mm

Evaporar a sequedad con nitrógeno

Añadir 0,8 ml de agua destilada tipo I, en el tubo y vortex por 30 segundos y filtrar

usando la jeringa de 3ml y el filtro de nylon.

Proceder con el seteo de masas y lectura en el equipo.

Fuente: Método United States Department of Agriculture. (07 de 02 de 2012).

Seteo de masas en el equipo UPLC/MS/MS

Para el seteo de masas (identificación de Ion molecular y productos iónicos que caracterizan

el analito); se hace uso del software Intelligent Star del equipo, el mismo que permite la

identificación del compuesto de interés (ion molecular) y al menos dos productos iónicos

(iones provenientes del fraccionamiento de la masa del compuesto) mediante un proceso de

infusión directa al detector de una solución estándar de clembuterol, de manera que el sistema

realiza una aplicación automática de parámetros electrónicos para caracterizar el analito. El

detalle de los parámetros se expone en la Tabla 7.

Espinoza Molina 24

Tabla 7. Seteo de las masas de clembuterol

Nombre del

Compuesto

Fórmula

Ion

precursor

(m/z)

Hijos

(m/z)

Dwell (s)

Cono

Voltaje

Energía

Colisión

(Ev)

Clembuterol

C12H18N2Cl2O

277,11

131,96 0,025 24 28

167,88 0,025 24 28

Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD.

Una vez seteada la masa del clembuterol el equipo está listo para analizar las muestras de

hígado y músculo. Las condiciones aplicadas para la separación cromatográfica del

Clembuterol (temperatura, tiempo, gradiente de solventes, flujo, curva), se realiza en modo

de gradiente de acuerdo con lo indicado en la Tabla 8.

Tabla 8. Gradiente de solventes aplicado en el método cromatográfico.

Tiempo (min) Flujo (mL/min) A1% B1% Curva

Inicial 0,4 95 5 Inicial

1,2 0,4 95 5 1

2,5 0,4 59 41 6

3,5 0,4 59 41 1

3,7 0,4 0 100 6

4,8 0,4 0 100 1

5 0,4 95 5 6

Fase móvil A. 0,1% (v/v) Solución acuosa de ácido fórmico

Fase móvil B. 0,1% (v/v) Ácido fórmico en acetonitrilo

Fuente: Yiping Re & Jinchuan Yang; Waters Corporation.

Curva de Calibración y Cálculos

La cuantificación de una sustancia mediante un método cromatográfico involucra el desarrollo

de una curva de calibración, la misma que es construida relacionando la concentración de

diferentes soluciones estándares de clembuterol, con la respuesta que genera el

espectrómetro de masas al detector al ion molecular y iones hijos de la molécula de

clembuterol.

En este método se utilizaron soluciones estándar de clembuterol de 0,125; 0,25; 0,50; 1,0;

2,0; 4,0; y 8, 0 ug/L de clembuterol. Para la generación de la respuesta instrumental se

monitorearon los iones 277,11 m/z, 131,96 m/z y 167,88 m/z.

Espinoza Molina 25

Los cálculos se realizan utilizando la curva que mejor relaciona a los valores de concentración

con la respuesta instrumental (ver Figura X). El coeficiente de correlación obtenido en la curva

de calibración de 0,9944 indica una correlación adecuada en el rango en el que se evaluaron

las muestras (0,125 a 8,0 ug/L).

Espinoza Molina 26

CAPÍTULO 3. RESULTADOS

El muestreo realizado en los mataderos de la provincia de Manabí permitió la recolección de

muestras de 48 animales (unidades), es decir, 48 submuestras de hígado y 48 submuestras

de músculo (96 en total). El análisis de las submuestras de hígado y músculo mediante el

método de ensayo por inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el método basado en

cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS)

permitió la detección y la estimación de concentraciones del clembuterol en dichas muestras

de manera semicuantitativo para el método de barrido ELISA y de manera cuantitativa para

la determinación con el método UPLC/MS/MS.

Las submuestras de hígado y músculo fueron obtenidas en 10 mataderos en la provincia de

Manabí. Estos mataderos, de acuerdo con los datos proporcionados por AGROCALIDAD para

el año 2014, tienen el mayor número animales faenados en la provincia. Es importante

recordar que la provincia de Manabí representa el 18,13% de la producción bovina de la

República del Ecuador.

3.1. Resultados obtenidos con el Método ELISA

A continuación, se resumen los resultados obtenidos tras la aplicación del protocolo de

análisis con el método ELISA.

3.1.1. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA

El análisis de los estándares de clembuterol aplicando el protocolo del método ELISA arrojó

los resultados presentados en la Tabla 9:

Tabla 9. Resultados de soluciones estándar de clembuterol para análisis de muestras de

Músculo - Método ELISA

STD. NO.

STD CLEMBUTEROL (ppb)

LN Conc.

OD 450-1

(Absorbancia)

B/B0*

(Absorbanci

a Relativa)

Std1 0,000 2,736 1,000

Std2 0,050 -2,996 2,379 0,870

Std3 0,150 -1,897 1,746 0,638

Std4 0,500 -0,693 1,328 0,485

Std5 1,500 0,405 0,644 0,235

Std6 4,500 1,504 0,293 0,107

Nota: *B/B0 = absorbancia del estándar (o de la muestra) / absorbancia del estándar cero.

Fuente: Step 5: STANDARDS CONCENTRATION VALUES, BIOO MaxSignal® ELISA

Analysis Program in Excel (with BIOO Specified Standards)

Espinoza Molina 27

En función de los resultados obtenidos, se procedió a realizar la regresión logarítmica de los

datos obtenidos (Ver Figura 7):

Figura 7. Curva de calibración Método ELISA submuestras de músculo bovino

Fuente: Wania Espinoza

La Tabla 10 resume los resultados de la lectura de las submuestras de músculo bovino a

través del Método ELISA.

Tabla 10. Resultados de clembuterol en submuestras de músculo Método ELISA

No.

Individuo

No.

MUESTRA

OD-1

(Absorbancia)

B/B0

(Absorbancia

Relativa)

Resultados Muestras

(ppb Clembuterol ug/kg)

1 151865 1,418 0,578 0,422

2 151871 1,477 0,540 0,626

3 151877 1,363 0,498 0,799

4 151880 1,419 0,519 0,709

5 151883 1,248 0,456 1,022

6 151892 1,413 0,516 0,718

7 151895 1,423 0,520 0,703

8 151904 1,558 0,569 0,526

9 151907 1,409 0,515 0,724

10 151910 2,096 0,766 0,166

11 151913 1,514 0,553 0,578

12 151916 1,358 0,496 0,808

Concentración Clembuterol (ppb)

10,000 1,000 0,100

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

0,010

y = -0,17ln(x) + 0,3418 R² = 0,9906

90%

80%

CURVA DE CALIBRACION DETERMINACION CLEMBUTEROL EN MUSCULO- METODO ELISA

100% A

bsorb

ancia

Rela

tiva *100

Espinoza Molina 28

No.

Individuo

No.

MUESTRA

OD-1

(Absorbancia)

B/B0

(Absorbancia

Relativa)

Resultados Muestras

(ppb Clembuterol ug/kg)

13 151919 1,627 0,595 0,454

14 151922 1,437 0,525 0,682

15 151925 1,446 0,529 0,669

16 151928 1,530 0,559 0,559

17 151931 1,490 0,545 0,609

18 151934 1,467 0,536 0,639

19 151937 1,603 0,586 0,478

20 151940 1,560 0,570 0,524

21 151943 1,568 0,573 0,515

22 151946 1,338 0,489 0,843

23 151949 1,998 0,730 0,205

24 151952 1,635 0,598 0,446

25 151955 1,639 0,599 0,442

26 151958 1,464 0,535 0,643

27 151967 0,862 0,315 2,339

28 151970 1,727 0,631 0,366

29 151973 1,332 0,487 0,854

30 151976 1,590 0,581 0,491

31 151979 1,155 0,422 1,248

32 151982 2,087 0,763 0,169

33 151985 1,603 0,586 0,478

34 151988 1,489 0,544 0,610

35 151991 1,449 0,530 0,664

36 151994 1,526 0,558 0,563

37 151997 1,657 0,606 0,425

38 152000 1,49 0,545 0,609

39 152003 1,56 0,570 0,524

40 152006 1,578 0,577 0,504

41 152009 1,222 0,447 1,081

42 152012 1,544 0,564 0,542

43 152015 1,725 0,630 0,368

44 152024 1,695 0,620 0,392

45 152027 1,769 0,647 0,335

46 152030 0,947 0,472 0,000

47 152033 1,013 0,505 0,000

48 152036 1,000 0,498 0,000

En la Figura 8 se muestran los resultados de las submuestras de músculo bovino en

relación con la curva de calibración calculada para los estándares de clembuterol.

Espinoza Molina 29

Figura 8. Resultados de submuestras de músculo bovino con Método ELISA

Fuente: Wania Espinoza

3.1.2. Resultados de submuestras de hígado bovino con método ELISA

El análisis de los estándares de clembuterol para las submuestras de hígado, aplicando el

protocolo del método ELISA arrojó los resultados presentados en la Tabla 11.

Tabla 11. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado Método ELISA

STD. NO.

STD

CLEMBUTEROL

(ppb)

LN Conc.

OD 450-1

(Absorbancia)

B/B0*

(Absorbancia

Relativa)

Std1 0,000 2,007 1,000

Std2 0,050 -2,996 0,503 0,251

Std3 0,150 -1,897 -0,298 -0,148

Std4 0,500 -0,690 -0,793 -0,395

Std5 1,500 0,410 -1,336 -0,666

Std6 4,500 1,500 -1,738 -0,866

Nota: *B/B0 = absorbancia del estándar (o de la muestra) / absorbancia del estándar cero.

Logarítmica (STD. NO.) ELISA MUSCULO STD. NO.

Concentración clembuterol (ppb)

10,00 1,00 0,10

0%

0,01

4,50

10%

1,50

50%

40% 0,50

30%

20%

0,15

70%

60%

y = -0,17ln(x) + 0,3418 R² = 0,9906 0,05

100%

90%

80%

RESULTADOS CLEMBUTEROL EN MUSCULO- METODO ELISA

Absorb

ancia

Rela

tiva *

100

Espinoza Molina 30

En función de los resultados obtenidos, se procedió a realizar la regresión logarítmica de los

datos obtenidos para los estándares (Ver Figura 9):

Figura 9. Curva de calibración Método ELISA submuestras de hígado bovino

Fuente: Wania Espinoza

La Tabla 12 resume los resultados de la lectura de las submuestras de hígado bovino a

través del Método ELISA.

Tabla 12. Resultados de clembuterol en submuestras de hígado Método ELISA

No.

Individuo

No.

MUESTRA

OD-1

(Absorbancia)

B/B0

(Absorbancia

Relativa)

Resultados Muestras

(ppb Clembuterol)

1 151864 0,205 0,102 0,141

2 151870 0,622 0,310 0,000

3 151876 0,625 0,311 0,000

4 151879 0,718 0,358 0,000

5 151882 0,905 0,451 0,000

6 151891 0,355 0,177 0,103

7 151894 0,636 0,317 0,000

8 151903 0,750 0,374 0,000

9 151906 0,836 0,417 0,000

10 151909 0,625 0,311 0,000

11 151912 0,720 0,359 0,000

Concentración de Clembuterol (ppb)

10,000 1,000 0,100 0,010

y = -0,243ln(x) - 0,5438 R² = 0,985

80%

60%

40%

20%

0%

-20%

-40%

-60%

-80%

-100%

CURVA DE CALIBRACION DETERMINACION CLEMBUTEROL EN HIGADO- METODO ELISA

100%

Absorb

ancia

Rela

tiva *

100

Espinoza Molina 31

12 151915 0,713 0,355 0,000

13 151918 1,017 0,507 0,000

14 151921 0,629 0,313 0,000

15 151924 0,694 0,346 0,000

16 151927 0,800 0,399 0,000

17 151930 -1,459 -0,727 4,248

18 151933 0,510 0,254 0,000

19 151936 0,726 0,362 0,000

20 151939 0,727 0,362 0,000

21 151942 0,154 0,077 0,156

22 151945 0,730 0,364 0,000

23 151948 0,747 0,372 0,000

24 151951 0,971 0,484 0,000

25 151954 0,922 0,459 0,000

26 151957 1,039 0,518 0,000

27 151966 0,770 0,384 0,000

28 151969 0,938 0,467 0,000

29 151972 1,034 0,515 0,000

30 151975 0,931 0,464 0,000

31 151978 0,567 0,283 0,000

32 151981 0,938 0,467 0,000

33 151984 0,487 0,243 0,079

34 151987 0,908 0,452 0,000

35 151990 0,940 0,468 0,000

36 151993 0,339 0,169 0,107

37 151996 0,155 0,077 0,156

38 151999 0,214 0,107 0,138

39 152002 0,710 0,354 0,000

40 152005 0,501 0,250 0,077

41 152008 0,988 0,492 0,000

42 152011 0,981 0,489 0,000

43 152014 0,583 0,290 0,000

44 152023 0,875 0,436 0,000

45 152026 -1,589 -0,792 5,544

46 152029 0,753 0,375 0,000

47 152032 0,672 0,335 0,000

48 152035 0,454 0,226 0,085

Fuente: Coordinación General de Laboratorios - AGROCALIDAD

En la Figura 10 se muestran los resultados de las submuestras de hígado bovino en relación

con la curva de calibración calculada para los estándares de clembuterol.

Espinoza Molina 32

Figura 10. Resultado de submuestras de hígado bovino con Método ELISA

Fuente: Wania Espinoza.

En la Figura 11, podemos observar los resultados de las submuestras de músculo con el

Método de ELISA, en base al programa MaxSignal® ELISA Clembuterol Analysis Program

in Excel.

Logarítmica (STD) ELISA HIGADO STD

Concentración de Clembuterol (ppb) -100%

1,500

-60%

-80%

0,500

-40%

0,150

100,000 10,000 1,000 0,100

0%

0,010

-20%

0,050

60%

40%

20%

y = -0,243ln(x) - 0,5438 R² = 0,985

100%

80%

Resultados Submuestras Higado Método ELISA

Absorb

ancia

Rela

tiva *

100

Espinoza Molina 33

Figura 11. Resultado de la lectura de submuestras de músculo con Método ELISA

Fuente: MaxSignal® ELISA Clembuterol Analysis Program in Excel

Espinoza Molina 34

3.2. Resultados Cuantitativos obtenidos con el Método UPLC/MS/MS

El protocolo del Método UPLC/MS/MS fue aplicado para la lectura de 48 submuestras de

hígado y 48 submuestras de músculo bovino, para la cuantificación se obtuvieron los

cromatogramas TIC para las soluciones estándar (ver Figura 12) y se generó la curva de

calibración mostrado en las Figura 13. Los resultados de la cuantificación de clembuterol en

las muestras se resumen en la Tabla 13. Los Resultados de las submuestras de músculo en

el espectrómetro de masas se puede observar en la Figura 14.

Figura 12. Cromatograma TIC de la solución estándar de clembuterol de 2.0 ug/L

Agonistas 004 2015 009 Smooth(SG,2x1)

Std 2.00 ug/L Std 2.00 ug/L

100

Clenbuterol

F2:MRM of 2 channels,ES+

277.11 > 131.96

3.274e+005

%

0 min

Agonistas 004 2015 009 Smooth(SG,2x1)

Std 2.00 ug/L Std 2.00 ug/L

100

Clenbuterol

F2: MRM of 2 channels, ES+

277.11 > 167.88

1.772e+005

%

0

0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40 1.50 1.60 1.70

min

Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD

Similares gráficos se obtuvieron para las soluciones estándar de las demás concentraciones

Espinoza Molina 35

Figura 13. Curva de Calibración determinación de Clembuterol en el rango de 0,125 a 8.0

ug/L por UPLC-MS-MS

Compound name: Clenbuterol

Correlation coefficient: r = 0.999432, r^2 = 0.998865

Calibration curve: 3416.52 * x + 3980.48

Response type: External Std, Area

Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans : None

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD

Tabla 13. Resultados clembuterol en submuestras de hígado y músculo bovinos_Método

UPLC/MS/MS.

Conc

No.

Individuo

CÓDIGO

SUBMUESTRA

HÍGADO

RESULTADO

SUBMUESTRA

HÍGADO

clembuterol (μg/kg)

LOD: 0,125 ug/Kg

LOQ: 0,250 ug/Kg

CÓDIGO

SUBMUESTRA

MÚSCULO

RESULTADO

SUBMUESTRA

MÚSCULO

clembuterol (μg/kg)

LOD: 0,125 ug/Kg

LOQ: 0,250 ug/Kg

1 151864 0,680 151865 0,310

2 151870 0,650 151871 0,440

3 151876 < LOQ 151877 0,810

4 151879 < LOQ 151880 0,690

5 151882 < LOQ 151883 0,640

6 151891 0,270 151892 0,370

7 151894 0,400 151895 0,790

8 151903 < LOD 151904 0,530

9 151906 < LOD 151907 0,530

10 151909 0,560 151910 0,370

Res

pons

e

Espinoza Molina 36

No.

Individuo

CÓDIGO

SUBMUESTRA

HÍGADO

RESULTADO

SUBMUESTRA

HÍGADO

clembuterol (μg/kg)

LOD: 0,125 ug/Kg

LOQ: 0,250 ug/Kg

CÓDIGO

SUBMUESTRA

MÚSCULO

RESULTADO

SUBMUESTRA

MÚSCULO

clembuterol (μg/kg)

LOD: 0,125 ug/Kg

LOQ: 0,250 ug/Kg

11 151912 0,420 151913 0,670

12 151915 < LOD 151916 0,550

13 151918 < LOD 151919 0,760

14 151921 0,290 151922 0,680

15 151924 < LOD 151925 0,670

16 151927 0,260 151928 0,350

17 151930 < LOQ 151931 0,640

18 151933 < LOD 151934 0,680

19 151936 < LOD 151937 0,840

20 151939 < LOD 151940 0,600

21 151942 < LOD 151943 0,580

22 151945 < LOD 151946 0,660

23 151948 < LOD 151949 0,610

24 151951 0,330 151952 0,640

25 151954 < LOQ 151955 0,640

26 151957 < LOD 151958 0,400

27 151966 < LOQ 151967 < LOD

28 151969 < LOD 151970 < LOD

29 151972 < LOD 151973 < LOD

30 151975 < LOD 151976 < LOD

31 151978 < LOD 151979 0,570

32 151981 < LOD 151982 0,290

33 151984 < LOD 151985 < LOD

34 151987 < LOD 151988 < LOD

35 151990 < LOD 151991 0,250

36 151993 < LOD 151994 0,600

37 151996 < LOD 151997 < LOD

38 151999 < LOD 152000 < LOD

39 152002 < LOD 152003 < LOD

40 152005 < LOD 152006 0,820

41 152008 < LOD 152009 < LOD

42 152011 < LOD 152012 0,570

43 152014 < LOD 152015 0,590

44 152023 < LOD 152024 0,600

45 152026 < LOD 152027 0,700

46 152029 < LOD 152030 0,250

47 152032 < LOD 152033 0,500

48 152035 < LOD 152036 0,450

Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD.

Espinoza Molina 37

Figura 14. Resultado de la lectura de submuestra de músculo en espectrómetro de masas

método UPLC/MS/MS

Fuente: Coordinación General de Laboratorios AGROCALIDAD

3.3. Comportamiento estadístico de los resultados

3.3.1. Distribución de los datos

Los datos cuantitativos descritos en las Tablas 12 y 13 han sido analizados de manera que

se pueda observar su distribución mediante Histograma de Frecuencias. Para el análisis se

ha utilizado el programa Minitab ® 17.1.0.

La Figura 15 presenta los resultados obtenidos del análisis de hígado con el Método ELISA.

La distribución observada presenta dos individuos con resultados aislados en relación con el

universo de muestras.

En la Figura 16 se observa la distribución de la frecuencia de resultados analizados en hígado

mediante el Método UPLC/MS/MS. Se han graficado 9 de los 48 individuos debido a que los

resultados del método han presentado dentro de la zona gris generada por la sensibilidad del

mismo, es decir por debajo del límite de cuantificación (<LOQ; 0,250

µg/Kg) o por debajo del límite de detección (<LOD; 0,125 µg/Kg). Estos datos, mismos que

son propios de las condiciones trabajadas en el equipo, no pueden ser asumidos de manera

cuantitativa por lo que el programa los descarta en el análisis estadístico.

Espinoza Molina 38

Figura 15. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método

ELISA

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

Figura 16. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de hígado con Método

UPLC/MS/MS

Media 0,2582

Desv.Est.

0,9857

Histograma de Frecuencia de Resultados Hígado-Método

ELISA Nor

mal

Histograma de Frecuencia de Resultados Hígado-Método

UPLC/MS/MS

Normal Media 0,4289

H-UPLC Fre

cue

nci

a

Fre

cue

nci

a

Espinoza Molina 39

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

La Figura 17 presenta los resultados obtenidos del análisis de músculo con el Método ELISA.

La distribución observada presenta un individuo con resultado aislado en relación con el

universo de muestras.

En la Figura 18 se observa la distribución de la frecuencia de resultados analizados en

músculo mediante el Método UPLC/MS/MS. Se presentan 38 de los 48 individuos, debido a

que los resultados del método presentaron resultados dentro de la zona gris generada por la

sensibilidad del mismo, correspondientes a valores menores que el LOD y LOQ de 0,125

µg/Kg y 0,250 µg/Kg, respectivamente. Estos datos, mismos que son propios de las

condiciones del método instrumental, no pueden ser asumidos de manera cuantitativa por lo

que se los descarta en el análisis estadístico.

Figura 17. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método

ELISA

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

Histograma de Frecuencia de Resultados en Músculo - Método ELISA Normal

Media

Desv.Est. 0,3637

N 48

M-ELISA

Fre

cue

nci

a

Espinoza Molina 40

Figura 18. Histograma de frecuencias de resultados de análisis de músculo con Método UPLC/MS/MS

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

3.3.2. Comparación mediante t de student para muestras emparejadas

Para el análisis de la prueba t de student para muestras relacionadas se ha aplicado el análisis

a través de Microsoft Excel y a través de Minitab ® 17.1.0

3.3.2.1. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,

resultados de análisis de hígado

La Tabla 14 muestra los resultados obtenidos en Microsoft Excel mediante el complemento

herramientas para análisis de datos, aplicado a los resultados del análisis de muestras de

hígado bovino con el método ELISA y UPLC/MS/MS.

M-UPLC

38

Histograma de Frecuencia de Resultados en Músculo - Método UPLC/MS/MS

Normal

Media 0,5695

Fre

cue

nci

a

Espinoza Molina 41

Tabla 14. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de hígado

ELISA UPLC/MS/MS

Media 0,0669 0,4289

Varianza 0,0012 0,0266

Observaciones 9 9

Coeficiente de correlación de Pearson 0,4403

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 8

Estadístico t -7,1815

P(T<=t) una cola 4,7071E-05

Valor crítico de t (una cola) 1,8595

P(T<=t) dos colas 9,4142E-05

Valor crítico de t (dos colas) 2,3060

3.3.2.2. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados

de análisis de Hígado

El Asistente de Minitab utiliza el método de Welch, que no presupone ni requiere que las dos

muestras tengan varianzas iguales. Según indica el programa, existen estudios de que la

prueba se desarrolla adecuadamente con varianzas desiguales, incluso cuando los tamaños

de las muestras no son iguales.

Las Figuras 19 y 20 presentan el diagnóstico preliminar del programa y el análisis de t respecto

a la distribución de los datos. Se resaltan los datos atípicos que se presentan fuera de los

rangos de la media de las muestras. Así también presenta la probabilidad de detectar una

diferencia de los resultados de una misma muestra analizada con los diferentes métodos.

Espinoza Molina 42

Figura 19. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de hígado con Método

ELISA y UPLC/MS/MS

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

En el caso del método ELISA se observan picos en los resultados del individuo 17 y 45

respectivamente. Se estableció por este método que las medias de los métodos no son

significativamente diferentes. Esto podría deberse a que el tamaño de la muestra

UPLC/MS/MS es demasiado pequeño (9 individuos) debido a los resultados no cuantitativos

que recaen en la zona gris del método

Espinoza Molina 43

Figura 20. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado

con Método ELISA y UPLC/MS/MS

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

De acuerdo con los tamaños de las muestras, las desviaciones estándares y α, existe una

probabilidad de 90% de detectar una diferencia de 0,50258. Debido a que el tamaño de la

muestra de hígado UPLC/MS/MS es menor que 15, la normalidad puede ser un problema. Si

los datos no están distribuidos normalmente, el valor p puede ser inexacto con muestras

pequeñas. Dado que la normalidad no se puede verificar de forma confiable con muestras

pequeñas, esta prueba comparativa se descarta.

3.3.2.3. Prueba t student para muestras emparejadas en Microsoft Excel,

resultados de análisis de Músculo

La Tabla 15 muestra los resultados obtenidos en Microsoft Excel mediante el complemento

herramientas para análisis de datos, aplicado a los resultados del análisis de muestras de

músculo bovino con el método ELISA y UPLC/MS/MS.

Espinoza Molina 44

Tabla 15. Prueba t para medias de dos muestras emparejadas, resultados de análisis de Músculo.

ELISA UPLC/MS/MS

Media 0,5765 0,584

Varianza 0,0498 0,0236

Observaciones 35 35

Coeficiente de correlación de Pearson 0,19156

Diferencia hipotética de las medias 0

Grados de libertad 34

Estadístico t -0,1798

P(T<=t) una cola 0,4292

Valor crítico de t (una cola) 1,6909

P(T<=t) dos colas 0,8584

Valor crítico de t (dos colas) 2,0322

Espinoza Molina 45

3.3.2.4. Prueba t student para muestras emparejadas en Minitab, resultados

de análisis de Músculo

El Asistente de Minitab utiliza el método de Welch, que no presupone ni requiere que las dos

muestras tengan varianzas iguales. Según indica el programa, existen estudios de que la

prueba se desarrolla adecuadamente con varianzas desiguales, incluso cuando los tamaños

de las muestras no son iguales.

Las Figuras 21 y 22 presentan el diagnóstico preliminar del programa y el análisis de t respecto

a la distribución de los datos. Se resaltan los datos atípicos que se presentan fuera de los

rangos de la media de las muestras. Así también presenta la probabilidad de detectar una

diferencia de los resultados de una misma muestra analizada con los dos métodos.

El análisis con la prueba t determinó que las medias obtenidas en los métodos no son

diferentes. Se determinó que existe un 90% de probabilidad de encontrar una diferencia de

hasta 0,1923 entre los métodos. Se observa que el método UPLC/MS/MS presenta diez casos

dentro de la zona gris en la que no se puede determinar su valor cuantitativo.

Figura 21. Diagnóstico de resultados y valores atípicos en el análisis de Músculo con Método ELISA y UPLC/MS/MS

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

Espinoza Molina 46

Figura 22. Prueba t de dos muestras relacionadas para resultados de análisis de hígado

con Método ELISA y UPLC/MS/MS

Fuente: Wania Espinoza mediante uso de programa Minitab ® 17.1.0.

3.4. Análisis cualitativos de los Métodos ELISA y UPLC/MS/MS en relación a la

normativa vigente.

En función de los resultados cuantitativos se procedió a comparar con los límites máximos de

residuos veterinarios (LMRV) permitidos en tejidos de músculo e hígado bovinos, establecidos

en normativas internacionales (Ver Tabla 16).

Tabla 16. Límites Máximos de Residuos Veterinarios en matriz músculo e hígado bovino establecido en normativas internacionales.

NORMA DE REFERENCIA LMRV

MATRIZ MÚSCULO

LMRV

MATRIZ HÍGADO

CODEX CAC – 2014 0,2 µg/kg 0,6 µg/kg

COUNCIL REGULATION

(EEC) N°2377/90 0,1 µg/kg 0,5 µg/kg

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (29 Abril 1996) Ausencia Ausencia

Espinoza Molina 47

Acorde a la sensibilidad de los métodos aplicados se determinó el cumplimiento e

incumplimiento de las muestras en relación a dichas normativas, en función de los LMRV y

los límites de detección y cuantificación (LOD y LOQ respectivamente).

Las Tablas 17, 18, 19 y 20, presentan los resultados cualitativos obtenidos por cada individuo

y el criterio de rechazo por presencia de clembuterol en la muestra analizada, conforme la

aplicación y sensibilidad de los métodos de ELISA y UPLC/MS/MS, comparados con los

límites máximos de residuos veterinarios LMRV permitidos en tejidos de músculo e hígado

bovinos.

En la Tablas 21 y 22 se resume la correlación entre los resultados obtenidos mediante los

métodos de ELISA y UPLC/MS/MS, comparados con los límites máximos de residuos

veterinarios LMRV.

Espinoza Molina 48

Tabla 17. Tabulación de resultados de análisis en muestras de músculo, según método ELISA y UPLC/MS/MS

No.

Individuo

CODIGO

SUBMUESTRA

MÚSCULO

CODEX CAC -

2014 (MÚSCULO)

LMRV=0,2 µg/kg

– ELISA

COUNCIL

REGULATION

(EEC) N°2377/90,

(MÚSCULO)

LMRV=0,1 μg/kg -

ELISA

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(MÚSCULO) - ELISA

CODEX CAC -

2014

(MÚSCULO)

LMRV=0,2 µg/kg

UPLC/MS/MS

COUNCIL

REGULATION

(EEC) N°2377/90,

(MUSCULO)

LMRV=0,1 μg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(MÚSCULO) -

UPLC/MS/MS

1 151865 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

2 151871 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

3 151877 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

4 151880 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

5 151883 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

6 151892 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

7 151895 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

8 151904 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

9 151907 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

10 151910 NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

11 151913 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

12 151916 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

13 151919 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

14 151922 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

15 151925 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

16 151928 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

17 151931 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

18 151934 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

19 151937 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

20 151940 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

21 151943 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

22 151946 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

Espinoza Molina 49

No.

Individuo

CODIGO

SUBMUESTRA

MÚSCULO

CODEX CAC -

2014 (MÚSCULO)

LMRV=0,2 µg/kg

– ELISA

COUNCIL

REGULATION

(EEC) N°2377/90,

(MÚSCULO)

LMRV=0,1 μg/kg -

ELISA

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(MÚSCULO) - ELISA

CODEX CAC -

2014

(MÚSCULO)

LMRV=0,2 µg/kg

UPLC/MS/MS

COUNCIL

REGULATION

(EEC) N°2377/90,

(MUSCULO)

LMRV=0,1 μg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(MÚSCULO) -

UPLC/MS/MS

23 151949 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

24 151952 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

25 151955 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

26 151958 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

27 151967 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

28 151970 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

29 151973 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

30 151976 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

31 151979 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

32 151982 NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

33 151985 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

34 151988 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

35 151991 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

36 151994 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

37 151997 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

38 152000 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

39 152003 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

40 152006 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

41 152009 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO ND ND

42 152012 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

43 152015 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

44 152024 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

45 152027 POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

46 152030 NEGATIVO NEGATIVO ND POSITIVO POSITIVO POSITIVO

47 152033 NEGATIVO NEGATIVO ND POSITIVO POSITIVO POSITIVO

48 152036 NEGATIVO NEGATIVO ND POSITIVO POSITIVO POSITIVO

Espinoza Molina 50

Tabla 18. Resumen del análisis en muestras de músculo, según método ELISA y UPLC/MS/MS, con relación a la normativa legal

RESULTADOS

CODEX CAC -

2014

(MÚSCULO)

LMRV=0,2

µg/kg –

ELISA

COUNCIL

REGULATION

(EEC)

N°2377/90,

(MÚSCULO)

LMRV=0,1

μg/kg - ELISA

COUNCIL

DIRECTIVE

96/23/EC

(1996)

PROHIBIDO

PRESENCIA

de β-

AGONISTAS

μg/kg

(MÚSCULO) -

ELISA

CODEX CAC -

2014

(MÚSCULO)

LMRV=0,2

µg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL

REGULATION

(EEC)

N°2377/90,

(MUSCULO)

LMRV=0,1

μg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL

DIRECTIVE

96/23/EC

(1996)

PROHIBIDO

PRESENCIA

de β-

AGONISTAS

μg/kg

(MÚSCULO) -

UPLC/MS/MS

TOTAL ANALIZADAS 48 48 48 48 48 48

NEGATIVAS 5 3 - 10 - -

POSITIVAS 43 45 45 38 38 38

NO DETERMINADAS - - 3 - 10 10

Fuente: Wania Espinoza

Espinoza Molina 51

Tabla 19. Tabulación de resultados de análisis en muestras de hígado, según método ELISA y UPLC/MS/MS.

No.

Individuo

CODIGO

SUBMUESTRA

HÍGADO

CODEX CAC -

2014 (HÍGADO)

LMRV=0,6 µg/kg

– ELISA

COUNCIL

REGULATION (EEC)

N°2377/90, (HÍGADO)

LMRV=0,5 μg/kg -

ELISA

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(HÍGADO) - ELISA

CODEX CAC -

2014 (HÍGADO)

LMRV=0,6 µg/kg

- UPLC/MS/MS

COUNCIL

REGULATION

(EEC) N°2377/90,

(HÍGADO)

LMRV=0,5 μg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(HÍGADO) - UPLC/MS/MS

1 151864 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

2 151870 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO POSITIVO

3 151876 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

4 151879 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

5 151882 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

6 151891 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

7 151894 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

8 151903 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

9 151906 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

10 151909 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO POSITIVO POSITIVO

11 151912 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

12 151915 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

13 151918 NEGATIVO NEGATIVO ND NEGATIVO NEGATIVO ND

14 151921 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

15 151924 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

16 151927 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

17 151930 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

18 151933 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

19 151936 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

20 151939 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

21 151942 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

22 151945 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

23 151948 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

24 151951 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

25 151954 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

Espinoza Molina 52

No.

Individuo

CODIGO

SUBMUESTRA

HÍGADO

CODEX CAC -

2014 (HÍGADO)

LMRV=0,6 µg/kg

– ELISA

COUNCIL

REGULATION (EEC)

N°2377/90, (HÍGADO)

LMRV=0,5 μg/kg -

ELISA

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(HÍGADO) - ELISA

CODEX CAC -

2014 (HÍGADO)

LMRV=0,6 µg/kg

- UPLC/MS/MS

COUNCIL

REGULATION

(EEC) N°2377/90,

(HÍGADO)

LMRV=0,5 μg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (1996)

PROHIBIDO PRESENCIA

de β- AGONISTAS μg/kg

(HÍGADO) - UPLC/MS/MS

26 151957 NEGATIVO NEGATIVO ND NEGATIVO NEGATIVO ND

27 151966 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO

28 151969 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

29 151972 NEGATIVO NEGATIVO ND NEGATIVO NEGATIVO ND

30 151975 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

31 151978 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

32 151981 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

33 151984 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

34 151987 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

35 151990 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

36 151993 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

37 151996 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

38 151999 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

39 152002 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

40 152005 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

41 152008 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

42 152011 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

43 152014 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

44 152023 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

45 152026 POSITIVO POSITIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

46 152029 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

47 152032 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

48 152035 NEGATIVO NEGATIVO POSITIVO NEGATIVO NEGATIVO ND

Espinoza Molina 53

Tabla 20. Resumen análisis en muestras de hígado, según método ELISA y UPLC/MS/MS, con relación a la normativa legal.

RESULTADOS

CODEX CAC -

2014

(HÍGADO)

LMRV=0,6

µg/kg –

ELISA

COUNCIL

REGULATION

(EEC)

N°2377/90,

(HÍGADO)

LMRV=0,5

μg/kg - ELISA

COUNCIL

DIRECTIVE

96/23/EC

(1996)

PROHIBIDO

PRESENCIA

de β-

AGONISTAS

μg/kg

(HÍGADO) -

ELISA

CODEX CAC -

2014

(HÍGADO)

LMRV=0,6

µg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL

REGULATION

(EEC)

N°2377/90,

(HÍGADO)

LMRV=0,5

μg/kg -

UPLC/MS/MS

COUNCIL

DIRECTIVE

96/23/EC

(1996)

PROHIBIDO

PRESENCIA

de β-

AGONISTAS

μg/kg

(HÍGADO) -

UPLC/MS/MS

TOTAL 48 48 48 48 48 48

NEGATIVAS 46 46 - 46 45 -

POSITIVAS 2 2 45 2 3 15

NO DETERMINADAS - - 3 - - 33

Fuente: Wania Espinoza

Espinoza Molina 54

3.4.1. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Codex

Alimentarius.

Una vez evaluada la presencia de clembuterol, aplicado el método de ELISA en las muestras

seleccionadas se pudo observar que las muestras dieron positivo a clembuterol, en relación

a los LMR establecidos en el Codex Alimentarius.

En las Figuras 23 y 24, se muestra el total de las 96 submuestras analizadas, incluyendo

músculos e hígado. En el caso del análisis en músculo, 90% resultó positivo a clembuterol en

músculo, aplicando el método ELISA, dándonos un valor numérico de 43 muestras; en cuanto

al 10% restante, es decir 5 muestras resultaron negativas al analito investigado.

Figura 23. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo, Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014

Fuente: Wania Espinoza

La prueba aplicada a hígados en los bovinos muestreados resultó positiva en 2 individuos del

total de 48 seleccionados, esto representa el 4%, es decir que resultaron negativas 46 de las

48 muestras seleccionadas, representando el 96% (Ver Figura 24).

RESULTADOS DE MÚSCULO VS. CODEX CAC 2014 LMRV=0.2 µg/kg MÉTODO ELISA

5; 10%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

43; 90%

Espinoza Molina 55

Figura 24. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método ELISA. Normativa Codex CAC - 2014

Fuente: Wania Espinoza

3.4.2. Resultados obtenidos con el método UPLC/MS/MS en relación al

Codex Alimentarius.

El método de UPLC/MS/MS, aplicado al músculo de los bovinos muestreados diagnosticó

positivo conforme los límites establecidos en el Codex Alimentarius, en 38 submuestras de

músculo del total de 48 muestras seleccionadas, esto representa un 79%. Resultaron

negativas 10 de las 48 muestras seleccionadas, esto representa el 21% (ver Figura 25).

En cuanto a la aplicación del método UPLC/MS/MS al tejido de hígado en bovinos

muestreados, se determinó que dos muestras resultaron positivas en relación a los límites

definidos por el Codex Alimentarius, representando el 4%. Las 46 muestras restantes, cuyo

resultado fue negativo, representan el 96% (ver Figura 26).

RESULTADOS DE HÍGADO VS. CODEX CAC - 2014

LMRV=0.6 µg/kg MÉTODO- ELISA

2; 4%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

46; 96%

Espinoza Molina 56

Figura 25. Resultado del análisis de clembuterol en tejido de músculo, Método

UPLC/MS/MS. Normativa Codex CAC - 2014

Fuente: Wania Espinoza.

Figura 26. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Codex CAC - 2014

Fuente: Wania Espinoza.

RESULTADOS MÚSCULO VS. CODEX CAC - 2014

LMRV=0.2 µg/kg MÉTODO - UPLC/MS/MS

10; 21%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

38; 79%

RESULTADOS HÍGADO VS. CODEX CAC - 2014 LMRV=0.6 µg/kg

MÉTODO - UPLC/MS/MS

2; 4%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

46; 96%

Espinoza Molina 57

3.4.3. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council

Regulation (EEC) N°2377/90

El análisis de las submuestras de músculo bovino fue comparado con el LMRV establecido

en el Council Regulation EEC N°2377/90 de la EU, de lo cual se obtiene que mediante el

Método ELISA el 94% de los resultados son positivos, es decir que se encuentran en un nivel

mayor que LMR=0,1 μg/kg (ver Figura 27). El 6% restante corresponde a tres submuestras

cuyos resultaros arrojaron un valor por debajo del LMRV establecido en la norma.

Escenario contrario se presenta en la comparación de los resultados en hígado por el método

ELISA en comparación al LMRV establecido en el Council Regulation EEC N°2377/90. El 4%

de las submuestras, es decir, 2 de las 48 analizadas obtuvieron un resultado positivo; por lo

tanto, el 96% de submuestras restantes se encontraban por debajo del límite, resultando ser

46 submuestras negativas (ver Figura 28).

Figura 27. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo, Método ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90

Fuente: Wania Espinoza

RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90 LMRV=0,1 µg/kg MÉTODO - ELISA

3; 6%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

45; 94%

Espinoza Molina 58

Figura 28. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en hígado, Método

ELISA. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90

Fuente: Wania Espinoza

3.4.4. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al

Council Regulation (EEC) N°2377/90

El método UPLC/MS/MS determinó como resultado que el 79% de las muestras, representada

por 38 individuos, obtuvo un análisis positivo a la presencia de LMRV de clembuterol en tejido

muscular (ver Figura 29). El 21% restante, no pudo determinarse debido a la sensibilidad del

método la cual establece un LOD 0,125µg/kg. Estos diez individuos al presentar una

concentración menor al LOD pudieran cumplir o no, con el LMRV determinado en la norma.

Paralelamente los resultados del análisis aplicado a las muestras de hígado, y evaluadas

mediante el método UPLC/MS/MS, determinó que el 6%, es decir 3 de las 48 submuestras

arrojaron niveles superiores a los establecidos en la Normativa Council Regulation N°2377/90;

mientras que los 45 restantes resultaron negativos, representando el 94% (ver Figura 30).

RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90

LMRV=0,5 µg/kg MÉTODO - ELISA

2; 4%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

46; 96%

Espinoza Molina 59

Figura 29. Resultados del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90

Fuente: Wania Espinoza

Figura 30. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Regulation (EEC) N°2377/90

Fuente: Wania Espinoza.

38; 79%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

NO DETERMINADOS

0; 0%

10; 21%

RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90 LMRV=0,1 µg/kg

MÉTODO - UPLC/MS/MS

RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90 LMRV=0,5 µg/kg

MÉTODO - UPLC/MS/MS

3; 6%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

45; 94%

Espinoza Molina 60

3.4.5. Resultados obtenidos con el método de ELISA en relación al Council

Directiva 96/23/EC (29 abril 1996)

Conforme la Normativa Council Directive 96/23/EC, misma que establece como requisito la

ausencia de β-agonistas en tejidos bovinos, se estableció por el método ELISA un 94% de

resultados positivos en tejido muscular, representado en 45 individuos. En 3 de las 48

muestras (6%) no es posible determinar su cumplimiento debido a la sensibilidad del método

cuyos resultados indican un contenido menor al LOD de 0,1 µg/kg (Ver Figura 31).

Figura 31. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo, Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).

Fuente: Wania Espinoza

Referenciando a esta normativa se comparó los resultados obtenidos en tejido de hígado

bovino, en el que encontramos 45 muestras negativas, es decir, el 96%. La población restante

analizada, 3 submuestras que corresponde al 4%, no pudieron ser segregados conforme el

requisito de la norma debido a que presentaron valores por debajo del LOD de 0,1 µg/kg (Ver

Figura 32).

RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)

LMRV= PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - ELISA

0; 0%3; 6%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

NO DETERMINADOS

45; 94%

Espinoza Molina 61

Figura 32. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método ELISA. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).

Fuente: Wania Espinoza

3.4.6. Resultados obtenidos con el método de UPLC/MS/MS en relación al

Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996)

El método de UPLC/MS/MS determinó la presencia del compuesto en 79% de las

submuestras, es decir en 38 de las 48 submuestras de tejido muscular analizadas. El 21%

restante representan diez muestras cuyos resultados resultaron ser indeterminados conforme

el LMR establecido en el Council Directive 96/23/EC (ver Figura 33 ).

En tanto, el comparativo del método aplicado a las submuestras en tejido de hígado bovino

obtuvo como resultado un 33% de muestras positivas, esto refiere a 16 de los 48 individuos

analizados. La proporción restante, el 67% corresponden a 32 resultados negativos en

relación de los LMR establecidos en el Council Directive 96/23/EC (ver Figura 34).

RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)

LMRV=PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - ELISA

0; 0%3; 6%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

NO DETERMINADOS

45; 94%

Espinoza Molina 62

Figura 33. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de músculo,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).

Fuente: Wania Espinoza.

Figura 34. Resultado del análisis de la presencia de clembuterol en tejido de hígado,

Método UPLC/MS/MS. Normativa Council Directive 96/23/EC (29 abril 1996).

Fuente: Wania Espinoza.

38; 79%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

NO DETERMINADOS

0; 0%

10; 21%

RESULTADOS MÚSCULO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)

LMRV=PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - UPLC/MS/MS

RESULTADOS HÍGADO VS. COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996)

LMRV= PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS MÉTODO - UPLC/MS/MS

15; 31%

TOTAL POSITIVOS SEGÚN NORMA

TOTAL NEGATIVOS SEGÚN NORMA

NO DETERMINADOS 0; 0%

33; 69%

Espinoza Molina 63

3.4.7. Relación de los métodos aplicados para la detección de clembuterol en

bovinos

Los resultados obtenidos en relación a los LMRV establecidos en el Codex Alimentarius para

el método UPLC/MS/MS y ELISA, permiten observar la prevalencia de valores positivos de la

presencia de clembuterol en músculo considerando un LMRV de 0,2 µg/kg. Referenciando a

la misma normativa, el escenario es opuesto en el análisis de tejido de hígado bovino, puesto

que se observa prevalencia de resultados negativos en ambos métodos, considerando que el

LMRV es mayor para hígado y corresponde a 0,6 µg/kg (Ver Tablas 21 y 22). Sin embargo,

se detecta clembuterol en hígado en varios casos

De igual manera, en relación a la normativa CEE N°2317/90, en músculo con un LMRV de 0,1

µg/kg, los métodos UPLC/MS/MS y ELISA, guardan estrecha relación con el analito en

investigación. Siendo mayoritariamente positivos al analizarse en músculo con un LMRV de

0,1 µg/kg y presentando una tendencia inversa en la que predominan los valores negativos

en el análisis de tejido de hígado al ser comparados con un LMRV de 0,5 µg/kg (Ver Tablas

21 a 24).

Tabla 21. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y UPLC/MS/MS en muestras de músculo, en relación a la normativa legal vigente.

MÉTODO ELISA

(MÚSCULO)

MÉTODO UPLC/MS/MS

(MÚSCULO)

RESULTADO

COMPARATIVO

CON LMRV

RE

SU

LT

AD

OS

CO

DE

X C

AC

- 2

01

4

LM

RV

=0

,2 µ

g/k

g

RE

SU

LT

AD

OS

CO

UN

CIL

RE

GU

LA

TIO

N (

EE

C)

N°2

377/9

0,

LM

RV

=0

,1 μ

g/k

g

RE

SU

LT

AD

OS

CO

UN

CIL

DIR

EC

TIV

E

96/2

3/E

C (

29

ab

ril

19

96

) P

RO

HIB

IDO

PR

ES

EN

CIA

de β

- A

GO

NIS

TA

S

RE

SU

LT

AD

OS

CO

DE

X C

AC

- 2

01

4

LM

RV

=0

,2 µ

g/k

g

RE

SU

LT

AD

OS

CO

UN

CIL

RE

GU

LA

TIO

N (

EE

C)

N°2

377/9

0,

(MU

SC

UL

O)

LM

R=

0,1

μg

/kg

RE

SU

LT

AD

OS

CO

UN

CIL

DIR

EC

TIV

E

96/2

3/E

C (

29

ab

ril

19

96

) P

RO

HIB

IDO

PR

ES

EN

CIA

de β

- A

GO

NIS

TA

S

TOTAL,

POSITIVAS

SEGUN

NORMATIVA

43

45

45

38

38

38

TOTAL,

NEGATIVAS

SEGUN

NORMATIVA

5

3

0

10

0

0

CUMPLIMIENTO

NO

DETERMINADO

0

0

3

0

10

10

Espinoza Molina 64

Según el consejo directivo 96/23/EC, del 29 de abril 1996, el mismo que prohíbe la presencia

de β-agonistas, se presenta un alto nivel de semejanza entre los dos métodos. De esta

manera existe predominio de valores positivos en las submuestras de músculo, sin embargo,

se determinó también que debido a la sensibilidad del método no fue posible determinar el

cumplimiento con la normativa en algunas muestras puesto que el resultado del equipo indica

un contenido por debajo del nivel de detección (LOD) en ambos métodos. En cuanto a las

submuestras de hígado, se determinó a través del método ELISA el predominio de resultados

positivos y 3 casos cuyo cumplimiento no puede ser determinado. En el caso de submuestras

de hígado analizadas con el método UPLC/MS/MS no fue posible establecer el cumplimiento

de 33 muestras, teniendo como resultado únicamente 15 individuos con contenido positivo

confirmado.

Tabla 22. Resultados de presencia de clembuterol mediante los métodos de ELISA y UPLC/MS/MS en muestras de hígado, en relación a la normativa legal vigente.

MÉTODO ELISA (HÍGADO)

MÉTODO UPLC/MS/MS

(HÍGADO)

RE

SU

LT

AD

OS

CO

DE

X

CA

C

- 20

14

LM

RV

=0

,6 µ

g/k

g

CO

UN

CIL

R

EG

UL

AT

ION

(E

EC

)

N°2

37

7/9

0 L

MR

V=

0,5

μg

/kg

CO

UN

CIL

D

IRE

CT

IVE

96

/23/E

C (2

9

ab

ril

19

96)

PR

OH

IBID

O

PR

ES

EN

CIA

de β

- A

GO

NIS

TA

S

RE

SU

LT

AD

OS

CO

DE

X

CA

C

- 20

14

LM

RV

=0

,6 µ

g/k

g

CO

UN

CIL

R

EG

UL

AT

ION

(E

EC

)

N°2

37

7/9

0,

LM

RV

=0,5

μg

/kg

CO

UN

CIL

D

IRE

CT

IVE

9

6/2

3/E

C (2

9

ab

ril

19

96)

PR

OH

IBID

O

PR

ES

EN

CIA

de β

- A

GO

NIS

TA

S

TOTAL,

POSITIVAS

SEGUN

NORMATIVA

2

2

45

2

3

15

TOTAL,

NEGATIVAS

SEGUN

NORMATIVA

46

46

0

46

45

0

CUMPLIMIENTO

NO

DETERMINADO

0

0

3

0

0

33

TOTAL

48

48

48

48

48

48

Espinoza Molina 65

Los resultados tienen similar apreciación entre los métodos aplicados para la detección de

clembuterol. Sin embargo, se puede observar que la sensibilidad del método ha sido

determinante al momento de especificar el cumplimiento de una muestra en relación a los

LMRV establecidos en las normas de referencia. De esta manera se encontraron casos cuyos

resultados arrojados por el método correspondiente se encuentran dentro de la zona gris en

la que se genera una zona de incertidumbre cuyos resultados podrían ser positivos o

negativos. Esta condición se genera cuando el LMRV establecido por la norma es inferior al

LOD del método, lo que es más frecuente en los resultados analizados con UPLC/MS/MS.

Los resultados del análisis a través del método ELISA y UPLC/MS/MS, se analizan en función

del tipo de tejido analizado (tejido muscular y tejido de hígado bovino), en las Tablas 23 y 24.

En las Figuras 35 y 36 se puede observar que tanto en el método ELISA como en el método

UPLC/MS/MS los resultados positivos predominan en el tejido muscular, mientras que en el

tejido de hígado se observa mayoría de casos negativos puesto que las normativas proponen

un LMRV mayor.

Tabla 23. Resultados comparativos por tejido analizado con Método ELISA en función de la

norma de referencia.

RESULTADO DEL MÉTODO ELISA TEJIDO SUBMUESTRA

NORMA DE REFERENCIA

HÍGADO MÚSCULO

P

OS

ITIV

O

N

EG

AT

IVO

NO

DE

TE

RM

INA

DO

P

OS

ITIV

O

N

EG

AT

IVO

NO

DE

TE

RM

INA

DO

CODEX CAC - 2014, LMRV=0,2

µg/kg hígado, 0,6 µg/kg músculo.

2

46

0

43

5

0

COUNCIL REGULATION (EEC)

N°2377/90, LMRV=0,1 μg/kg

2

46

0

45

3

0

SEGUN COUNCIL DIRECTIVE

96/23/EC (29 abril 1996)

PROHIBIDO PRESENCIA de β-

AGONISTAS (0 µg/kg)

45

0

3

45

0

3

Espinoza Molina 66

Figura 35. Resultados comparativos entre tejido analizado por Método ELISA en función de

la norma de referencia.

Fuente: Wania Espinoza.

RESULTADOS COMPARATIVOS A NORMAS DE REFERENCIA

COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996) COUNCIL REGULATION (EEC) N°2377/90

CODEX CAC - 2014

(ND)6% (ND)6 % (-)6% (+4% (+) 4%

(-)10%

(+)94% (+)94% (+)94% (+)90%

(-)96% (-)96%

Relación de resultados en relación a la normativa. Método ELISA.

HIGADO - POSITIVO HIGADO - NEGATIVO HÍGADO - ND

MUSCULO - POSITIVO MUSCULO - NEGATIVO MÚSCULO - ND

% d

e S

ub

mu

estr

as A

na

lizad

as

Espinoza Molina 67

Tabla 24. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en función de la norma de referencia.

RESULTADO DEL MÉTODO

UPLC/MS/MS

TEJIDO SUBMUESTRA

NORMA DE REFERENCIA

HÍGADO MÚSCULO

PO

SIT

IVO

NE

GA

TIV

O

NO

DE

TE

RM

INA

DO

PO

SIT

IVO

NE

GA

TIV

O

NO

DE

TE

RM

INA

DO

CODEX CAC - 2014,

LMRV=0,2 µg/kg

2

46

0

38

10

0

COUNCIL REGULATION

(EEC) N°2377/90, LMRV=0,1

μg/kg

3

45

0

38

0

10

SEGUN COUNCIL

DIRECTIVE 96/23/EC (29

Abril 1996) PROHIBIDO

PRESENCIA de β-

AGONISTAS

15

0

33

38

0

10

Figura 36. Resultados comparativos por tejido analizado con Método UPLC/MS/MS en

función de la norma de referencia.

Fuente: Wania Espinoza.

RESULTADOS COMPARATIVOS A NORMAS DE REFERENCIA

COUNCIL REGULATION (EEC) COUNCIL DIRECTIVE 96/23/EC (1996) N°2377/90

CODEX CAC - 2014

(+)6 (+)4%

(ND)21% (ND)21% (--)21

(+)31

(ND)69%

(+)79% (+)79 (+)79

(-)94%

MUSCULO - NEGATIVO MÚSCULO - ND

(-)96%

HÍGADO - ND HIGADO - NEGATIVO HIGADO - POSITIVO

MUSCULO - POSITIVO

Relación de resultados en relación a la normativa. Método UPLC/MS/MS

% d

e S

ub

mu

estr

as A

na

lizad

as

Espinoza Molina 68

CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN

El análisis de las submuestras de hígado y músculo mediante el método de ensayo por

inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el método basado en cromatografía liquida

acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS) permitió evaluar la presencia

del β-adrenérgico clembuterol, de manera cuantitativa expresado en partes por billón o ppb

(µg/Kg) y de manera cualitativa, evaluando dichos resultados con referencia a los límites

máximos de residuos veterinarios LMRV establecidos en la normativa internacional vigente.

Las etapas del muestreo, conservación de las muestras, el posterior procesamiento y la

aplicación de los protocolos de análisis descritos en el capítulo dos, para la extracción del

compuesto y análisis de las submuestras mediante los métodos planteados, fueron viables y

permitieron una correcta lectura de los resultados en los equipos proporcionados por

AGROCALIDAD.

Es necesario considerar que según Meyer y Rinke, cuando el anabólico se administra a

ganado vacuno, con niveles relativamente altos de clembuterol se pueden detectar en el

hígado (Meyer & Rinke, 1991) por el proceso de metabolismo que se realiza en este órgano.

En consecuencia, varios casos de intoxicación humana tienden a estar relacionado con el

consumo de hígado de animales tratados con estas drogas (Martínez Navarro, 1990). Cuando

se aplica el clembuterol vía oral a bovinos con las dosis 7,5 µg/Kg por 2 días y luego 3 µg/Kg

en los próximos 8 días, la presencia del anabólico en la orina del bovino puede durar hasta 12

semanas; cuando la muestra permanece en un estado de almacenamiento de +4°C y

congelación puede durar 20 semanas en el caso del hígado. Además, las muestras se pueden

almacenar a -20° y -60° C durante al menos 20 semanas, sin diferencias entre estas

temperaturas, y pueden ser sometidos 6 veces a manipulación entre congelar y descongelar

durante ese tiempo ya que no habría una pérdida o degradación significativa predecible de

clembuterol en los tejidos (Pinheiro, y otros, 2009).

Con estos antecedentes la probabilidad de detectar la presencia de clembuterol en el presente

estudio y aplicando las dos técnicas utilizadas (ELISA y UPLC-MS-MS), era alta.

4.1. Resultados cuantitativos del análisis de músculo e hígado mediante el

método ELISA y UPLC/MS/MS

La aplicación de los métodos ELISA y UPLC/MS/MS en las submuestras de hígado y músculo

permitieron medir el contenido de clembuterol (expresado en ppb) en función de los límites de

detección y cuantificación especificados para cada método. En este sentido se pudo observar

que el método ELISA presentó un mejor límite de detección teórico para la cuantificación,

debido a la baja concentración del compuesto que es capaz de detectar,

Espinoza Molina 69

(LOD: 0,1 µg/Kg). En el caso del método UPLC/MS/MS, considerando los parámetros propios

del equipo como son el límite de detección LOD:0.125 µg/Kg, el intervalo denominado como

zona gris del método ( 0.125-0.250 µg/Kg) , mismo que no permite evaluar cuantitativamente

el contenido de clembuterol y el límite de cuantificación LOQ: 0,250 µg/Kg, permitió medir el

contenido de clembuterol en las muestras cuya concentración se encontraba sobre el límite

de cuantificación LOQ: 0,250 µg/Kg y determinar la presencia del compuesto en aquellos

individuos que presentaron contenido por encima del límite de detección LOD: 0,125 µg/Kg

intervalo denominado como zona gris del método.

Esta diferencia entre los límites de detección y límite de cuantificación propios de cada método

aplicado nos permite establecer como premisa que el método ELISA puede ser considerada

como una buena herramienta alternativa para la determinación cualitativa y cuantitativa de

tipo screening y que el método UPLC-MS-MS puede ser concebido como método

confirmatorio por su alta especificidad y el cual se podría optimizar para reducir su LOQ y LOD

Las muestras de músculo analizadas mediante el método ELISA fueron mayoritariamente

superiores al límite de detección LOD. Es decir el método encontró el compuesto en

concentración mayor a 0,100 µg/Kg en 45 de las 48 muestras. En el caso del método

UPLC/MS/MS se encontró una cantidad cuantificable en 38 de las 48 muestras analizadas.

Esto representa que el método ELISA detecto un 15,5% más de casos que el método

UPLC/MS/MS.

En el caso de los resultados de las muestras de hígado, el método ELISA permitió cuantificar

45 muestras de las 48 analizadas, las cuales presentaron un contenido mayor al límite de

detección LOD: 0,100 µg/Kg. En el mismo análisis realizado con el método UPLC/MS/MS

apenas 9 de las 48 muestras arrojaron un resultado cuantitativo, es decir que presentaron

valores mayores al límite de cuantificación LOQ. Esto representa que con el ensayo ELISA se

pudieron detectar 80% más casos positivos que con el método UPLC/MS/MS con un

contenido de clembuterol superior a 0,100 µg/Kg.

Se analizó mediante histograma de frecuencias la tendencia de los resultados obtenidos del

análisis con los métodos ELISA y UPLC/MS/MS. Las submuestras de hígado analizadas con

el método ELISA presentaron resultados con una distribución anormal y se destaca la

aparición de dos puntos anómalos en relación al universo de muestras. El análisis de hígado

con el método UPLC/MS/MS presentó 9 resultados cuantitativos los cuales se consideran

insuficientes para analizar la distribución de los mismos, siendo necesario contar al menos

con quince muestras.

En el caso de los resultados de análisis de submuestras de músculo se observó que las

muestras analizadas con ELISA presentaron una distribución anormal de los datos. Se

destaca la aparición de un dato anómalo en relación al universo de muestras. En el caso de

UPLC_MSMS se observó una distribución normal, no presentando datos demasiado

dispersos y descartando aquellos valores que se atribuyen a la zona gris del método.

Espinoza Molina 70

La aplicación de la prueba t de student para medias de muestras relacionadas se realizó con

la finalidad de confirmar o descartar la hipótesis de similitud entre los métodos aplicados. En

el caso de los resultados de las submuestras de hígado no fue posible determinar si existe o

no una diferencia significativa entre las medias de los métodos, debido a que en el método

UPLC/MS/MS se disponía únicamente de 9 casos con resultados cuantitativos.

Para la prueba t de student aplicada a los resultados de las submuestras de músculo, se

determinó que no existe una diferencia significativa entre las medias de los dos métodos. El

intervalo de confianza al 95% indica que la diferencia verdadera se encuentra entre - 0,10380

y 0,12965 entre los métodos ELISA y UPLC/MS/MS.

La potencia calculada por el programa Minitab ® está en función de los tamaños de las

muestras y de las desviaciones estándar. Para detectar diferencias más pequeñas, el

programa sugiere considerar aumentar los tamaños de las muestras.

En el análisis aplicado mediante Excel a los resultados de los métodos ELISA y UPLC/MS/MS

se obtuvo un valor de P (p value) de 0,43 > α 0,05. Con lo cual se aceptaría la hipótesis nula

que indica que. De igual manera el valor de t obtenido -0,1798 < t crítico 1,6909 con lo cual

se acepta la hipótesis nula. Sin embargo, el coeficiente de correlación de Pearson de 0,1915

presenta una correlación positiva muy baja entre los resultados de ambos métodos.

4.2. Resultados cualitativos del Análisis de Músculo e Hígado mediante el método

ELISA y UPLC/MS/MS

Los resultados presentados en el Capítulo 3 permitieron establecer un panorama previo de la

problemática en la provincia de Manabí, respecto al posible uso inadecuado para la engorda

en bovinos, al haberse detectado la presencia de clembuterol en los tejidos de hígado y

músculo, en las submuestras analizadas con el método ELISA y con el método UPLC/MS/MS.

Los límites máximos de residuos veterinarios establecidos en las normativas internacionales,

al ser comparados con los resultados obtenidos permitieron evaluar la situación actual del

cumplimiento normativo a nivel de la provincia de Manabí.

De manera general, el análisis comparativo de los resultados obtenidos en tejido muscular e

hígado bovino, con los métodos ELISA y UPLC/MS/MS se detectó mayoritariamente el

residual en el tejido muscular. Este comportamiento se puede atribuir al metabolismo del

compuesto dentro del organismo del animal, siendo eliminado en mayor proporción en el

hígado mientras que los residuales dentro del músculo se mantienen por un tiempo más

prolongado. Sin embargo, dicha tendencia se presenta también debido a que en normativas

como Codex Alimentarius y Council Regulation N°2377/90 se consideran límites más

permisivos para la presencia en matriz hígado.

Espinoza Molina 71

Este comparativo se evidencia en las Figuras 31 y 32, adicionalmente se puede inferir que la

detección del anabólico en los tejidos del bovino se encontraría también en función de las vías

de administración empleadas (oral o intramuscular) y del tiempo transcurrido entre la

administración hasta la faena del animal.

Así también se puede observar en las Figuras 31 y 32 la diferencia en los niveles de detección

sobre los diferentes tejidos hígado y músculo, así como entre los diferentes métodos

aplicados. Se establece que con el método ELISA fue detectado 11% más casos positivos en

hígado y músculo que con el método UPLC/MS/MS, considerando la sensibilidad de 0,100

µg/Kg, pudiendo detectar niveles incluso menores a los establecidos en el Codex

Alimentarius.

Esta diferencia en el nivel de detección se atribuye a la sensibilidad expresada en el límite de

detección, la cual fuera de 0,10 µg/kg (o ppb) para el método ELISA y 0,125 µg/kg para el

método UPLC/MS/MS. El método ELISA aporta, además, entre otras ventajas, a realizar un

análisis rápido permitiendo tratar un elevado número de muestras y repeticiones en busca de

posibles resultados no conformes. Los resultados positivos deben ser confirmados por

métodos específicos en este caso el método es UPLC/MS/MS que constituye el método

confirmatorio para este tipo de evaluaciones por su especificidad.

Si comparamos los resultados de la matriz de músculo, presentado en las Figuras 18 y 20 del

método ELISA y UPLC/MS/MS con la normativa del CODEX CAC 2014, con un LMRV

permitido para uso terapéutico de 0,2 µg/Kg, se puede aseverar que en varios casos existe

presencia de clembuterol por encima de los límites permitidos por la normativa de referencia,

por lo tanto, no se cumple con las exigencias de LMRV establecidas en el Codex Alimentarius.

En el caso de hígado bovino, debido a sus límites más permisivos se encontró un

cumplimiento mayoritario en cuanto al LMRV establecido en esta normativa (Figuras 19 y 21).

Similar situación se presenta al evaluar los resultados cualitativos con la Normativa Europea

Council Regulation N°2377/90, puesto que los LMRV varían ligeramente respecto al Codex.

Con un LMRV permitido para uso terapéutico de 0,100 µg/Kg, se determinó también la

presencia de clembuterol por encima de los límites permitidos por la normativa y por lo tanto

el incumplimiento de las muestras con esta regulación según los resultados obtenidos con

ambos métodos (Figuras 22 y 24). En el caso de las muestras de hígado, con un LMRV

permitido de 0,500 µg/Kg el cumplimiento con la normativa es mayoritario.

Desde el punto de vista de las exigencias de la Unión Europea Council Directive 96/23/EC (29

abril 1996) PROHIBIDO PRESENCIA de β- AGONISTAS, estos resultados son totalmente

desfavorables en términos de cumplimiento de la normativa vigente, considerando que se

prohíbe la aplicación del clembuterol en los bovinos, debido al registro de casos de

intoxicación alimentaria tras su consumo, mismos que atentan a la salud pública.

Espinoza Molina 72

En función de los LMRV establecidos en las normativas internacionales tomadas como

referencia para el presente estudio, se observó que el método basado en cromatografía liquida

acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS) presenta una zona gris

comprendida por los límites de detección y cuantificación (LOD y LOQ) que dificulta la

segregación de casos que se encuentren cercanos a los límites de las regulaciones

internacionales. Sin embargo, es importante destacar la especificidad del método y proponer

una optimización del método con niveles de detección y cuantificación inferiores a los

utilizados, y a su vez que sean acogidas con respecto a las normativas vigentes, actividad

que se encuentra fuera del alcance de este estudio.

Espinoza Molina 73

CAPÍTULO 5. CONCLUSIONES

Se puede concluir que la población bovina de la provincia de Manabí, sometida al muestreo y

evaluación de este estudio, representa el 18,3% del movimiento ganadero en la República del

Ecuador en el 2014. En la provincia de Manabí se extrajeron 48 submuestras de hígado y 48

submuestras de músculos bovinos que fueron analizados con los métodos de ensayo por

inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) y el método basado en cromatografía liquida

acoplada a espectrometría de masas en tándem (UPLC/MS/MS). Dentro de la evaluación con

el método de ELISA el 90% de la población evaluada mostró presencia de clembuterol

superior a 0,2 µg/kg en el tejido del músculo y el 4% resultó positivo a la presencia de

clembuterol superior a 0,6 µg/kg en el tejido del hígado. ( LMRV Codex)

El análisis estadístico de resultados permitió establecer que no existe una diferencia

significativa entre las medias de los resultados del análisis de músculo bovino con los métodos

ELISA y UPLC/MS/MS. Sin embargo, el análisis con el coeficiente Poisson presentó una

correlación positiva muy baja entre los resultados. Esto puede relacionarse a la sensibilidad y

especificidad de los métodos, así como a la supresión de casos no cuantitativos en el método

UPLC/MS/MS por lo que es necesario realizar un análisis profundo con un mayor número de

casos de estudio.

El clembuterol también es posible de ser detectado en personas, dentro de las 48 horas

posteriores a la ingesta del alimento implicado, por medio de los métodos como los usados

en esta tesis, así como en muestras de animales y alimentos sospechosos. El periodo corto

de permanencia del anabólico en el organismo, en muchos casos representa una dificultad

para su detección y levantamiento de una estadística epidemiológica. En el Ecuador no existe

un registro o estudio de este tipo, por lo que, pese a determinarse la presencia del compuesto

en productos de consumo humano, no es posible dimensionar el impacto actual que

representa su uso a la salud de los consumidores.

Tras los resultados obtenidos se confirma que la problemática existe en Ecuador. No hay un

valor mínimo en la determinación del clembuterol que se pueda considerar seguro, e

idealmente no debería existir esta sustancia en el alimento a consumir al estar incluido en el

listado de referencia de las clases de sustancias dopantes y de métodos de dopaje, como

otros agentes anabolizantes BOE-A-1995-14474, 1995.

Una vez se establezca en la legislación en Ecuador la legalidad o no del uso del anabólico

clembuterol, se podrán realizar las inspecciones correspondientes en los mataderos por parte

de AGROCALIDAD, aplicando los métodos propuestos en la presente investigación (ELISA y

UPLC/MS/MS). Sin embargo, se puede realizar controles considerando lo establecido en los

LMRV del Codex al ser nuestro país signatario del mismo

Espinoza Molina 74

El límite de detección del kit para el ensayo ELISA es altamente sensible y está alineado con

los requisitos del Reglamento del Consejo de la Unión Europea N°2377/90, por tal motivo, del

total se logró determinar en las submuestras de músculo analizadas con el método ELISA un

índice de positividad de 94% (valores superiores a 0,1 µg/Kg)

Si consideramos la Directiva de Consejo 96/23 EC, el método de ELISA para determinar

clembuterol, los rangos de trabajo de este se encuentran acordes para estudios futuros y

establecer patrones de calidad e inocuidad que garanticen el consumo de carne en la

República del Ecuador. El método de UPLC/MSMS también fue evaluado como método

cuantitativo altamente selectivo y confirmatorio en contenidos superiores a 0,250 µg/kg.

En cuanto al método UPLC/MS/MS es importante considerar para futuros estudios, minimizar

la zona gris del método optimizando el método a niveles inferiores al LOQ de 0,250 µg/Kg de

manera que se incremente la sensibilidad del estudio y, por lo tanto, sea éste igualmente

aplicable para el análisis cualitativo y cuantitativo en relación a los LMRV establecidos en las

normas de referencia.

Por otra parte, SAGARPA (Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y

Alimentación de México), prohibió el uso de clembuterol como ingrediente activo y aditivo

alimentario destinado al consumo de animales, publicado en el Diario Oficial de la Federación

el 11 de octubre de 2000, puesto que su uso incrementa el riesgo hacia la salud pública y del

animal. En las Especificaciones técnicas para el control del uso de beta- agonistas en los

Animales, NOM-EM-015-ZOO-2002, manifiesta en su punto 4 “Disposiciones Generales: Con

excepción de aquellos productos beta-agonistas que cuenten con el registro y autorización de

la Secretaría para su uso o consumo por animales, queda prohibida la producción,

manufactura, fabricación, elaboración, preparación, acondicionamiento, transportación,

tráfico, comercialización, importación, suministro y/o utilización de los siguientes principios

activos como ingredientes activos, aditivos, alimenticios y/o medicamentos en formulación de

productos alimenticios destinados para consumo y uso en animales, tales como:

bromobuterol, carbuterol, cimaterol, cimbuterol, clembuterol, fenoterol, isoproterenol,

mabuterolde, mapenterol, orciprenaline, pirbuterol, ractopamina, salbutamol, terbutaline,

zilpatero.

Comparando los resultados obtenidos con referencia a la normativa mexicana, se estarían

violando los artículos 172, 173 y 174 de la Ley Federal de Sanidad Animal, en donde refiere

una sanción de cuatro a ocho años de prisión y multa de quinientas hasta tres mil veces el

salario mínimo vigente en la zona económica donde se cometió el delito (SAGARPA, 2013).

En el Ecuador el uso de clembuterol no está regulado o sancionado, sin embargo, los niveles

en productos pecuarios no deben exceder a lo estipulado por el CODEX.

Con estos resultados la Republica de Ecuador, a través de La Agencia Ecuatoriana de

Aseguramiento de la Calidad del Agro – AGROCALIDAD, como Autoridad Nacional Sanitaria,

Fitosanitaria y de Inocuidad de Alimentos tendrá una línea base para establecer

Espinoza Molina 75

criterios de control que conlleven el levantamiento de información estadística nacional y que

propicie un mejor control en el sector.

Para ello es recomendable establecer jornadas permanentes de control de los bovinos para

consumo humano en el país, y así cumplir con el marco legal descrito en La Constitución de

la República del Ecuador, en su Título II. Derechos, Capítulo segundo. Derecho del buen vivir.

Sección primera: Agua y Alimentación. Artículo 13 indica que: Las personas y colectividades

tienen derecho al acceso seguro y permanente a alimentos sanos, suficientes y nutritivos;

preferentemente producidos a nivel local y en correspondencia con sus diversas identidades

y tradiciones culturales. También se menciona que El Estado Ecuatoriano promoverá la

soberanía alimentaria. Título III. Garantías Constitucionales. Capítulo segundo. Políticas

públicas, servicios públicos y participación ciudadana. Art. 85. La formulación, ejecución,

evaluación y control de las políticas y servicios públicos que garanticen los derechos

reconocidos por la Constitución, se regularán de acuerdo con las siguientes

disposiciones:3……En la formulación, ejecución y control de las políticas públicas y servicios

públicos se garantizará la participación de las personas, comunidades, pueblos y

nacionalidades. Título VI. Régimen de desarrollo. Capítulo tercero. Soberanía Alimentaria, Art.

281: La soberanía alimentaria constituye un objetivo estratégico y una obligación del Estado

para garantizar que las personas, comunidades, pueblos y nacionalidades alcancen la

autosuficiencia de alimentos sanos y culturalmente apropiados de forma permanente. Para

ello, será responsabilidad del Estado: 7. Precautelar que los animales destinados a la

alimentación humana estén sanos y sean criados en un entorno saludable. 8. Asegurar el

desarrollo de la investigación científica y de la innovación tecnológica apropiada para

garantizar la soberanía alimentaria. El Plan Nacional del Buen Vivir, en su Objetivo 10.

Impulsar la transformación de la matriz productiva. 10,1 diversificar y generar mayor valor

agregado en la producción nacional. 10,1.e Fortalecer el marco institucional y regulatorio que

permita una gestión de la calidad en los procesos productivos y garantice los derechos de

consumidores y productores.

Espinoza Molina 76

CAPÍTULO 6. RECOMENDACIONES

Acorde a la necesidad de salvaguardar la salud pública, y basándonos en el concepto de que

la seguridad alimentaria conlleva a un buen vivir mediante la obtención de un producto inocuo,

apto para el consumo humano y promoviendo de esta manera la soberanía alimentaria de

nuestro país, es de interés nacional establecer, estandarizar y validar los métodos para

verificar y cuantificar la presencia de residuos veterinarios, como es el caso del β-agonista

Clembuterol, en productos pecuarios bovinos en el país.

Se considera necesario fortalecer y equipar los laboratorios de control a nivel nacional, así

como desarrollar e implementar las metodologías inherentes que apoyarán dicha

identificación y cuantificación de residuos veterinarios y otros, en distintas matrices (músculo,

hígado) y de esta manera poder determinar la magnitud de esta problemática a nivel país.

En virtud de asegurar el consumo saludable y de calidad de la producción nacional para la

población, se recomienda desarrollar y fortalecer las investigaciones en materia de residuos

de productos veterinarios como también de más grupos de fármacos, plaguicidas, pesticidas

y controles microbiológicos, considerando además que el Ecuador posee potencial para

exportar carne, leche y demás productos de producción primaria, así como los exigentes

controles de las autoridades extranjeras.

El uso inadecuado y fraudulento de este tipo de compuestos derivan en un severo peligro para

la salud de la población, razón por la cual deben llevarse a cabo controles permanentes por

parte de la Autoridad Nacional competente mediante la formulación y aplicación de políticas

públicas en materia de seguridad alimentaria, como resultado del desarrollo de ciencia y

tecnología promovida por la presente investigación.

Cabe recalcar la importancia de elaborar una línea base estadística con indicadores en salud

pública sobre los distintos casos de intoxicación alimentaria, en función de las investigaciones

existentes y desarrollando nuevos campos de investigación referentes al tema, permitiendo,

a las autoridades de control, actuar con planes y programas acorde a la realidad del país, que

involucren una alimentación saludable.

Desarrollar e implementar herramientas de control integral fortaleciendo a nivel de fronteras

el cerco sanitario aplicable al control de la producción primaria y de la cadena de valor,

importada o para exportación, como un sistema de alerta que a más de identificar o

diagnosticar un problema sanitario, involucre articular con entes regulatorios. De esta manera

se podrán tomar acciones que mejoren el estatus de salud pública interna del país y mejorar

la calidad e inocuidad tanto de los productos de consumo interno, como también de la

producción primaria con potencial de exportación.

Espinoza Molina 77

BIBLIOGRAFIA

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Espinoza Molina 80

ANEXOS

Anexo 1. Plan de muestreo para el estudio de residuos de medicamentos veterinarios

(anabólicos) a Nivel Nacional.

Espinoza Molina 81

Espinoza Molina 82

Espinoza Molina 83

Espinoza Molina 84

Espinoza Molina 85

Espinoza Molina 86

Espinoza Molina 87

Espinoza Molina 88

Espinoza Molina 89

Espinoza Molina 90

Espinoza Molina 91

Espinoza Molina 92

Espinoza Molina 93

Anexo 2. Autorización desarrollo de tesis maestría “Evaluación de clembuterol en productos pecuarios bovinos.

Espinoza Molina 94

Anexo 3. Reunión coordinación proyecto de análisis residuos veterinarios

Espinoza Molina 95

D

D

D

D

Anexo 4. Planificación muestreo en mataderos de Manabí

PROGRAMA

FECHA

ITINERARIO

TEMA

# MUESTRAS A TOMAR/CAMAL

PERSONAL

PARTICIPANTE TUMBACO

PERSONAL

PARTICIPANTE COORDINACIÓN MANA

BÍ

CAPACITACIÓN TEÓRICA OFICINA DE REUNIONES

DE COORDINACIÓN MANABÍ)

(

24/08/2015

14h30-16H00

CAPACITACIÓN TEÓRICA

OFICINA DE REUNIONES DE COORDINACIÓN

MANABÍ)

(

PAULETTE ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO ANDINO/ DIEGO

TECNICO DE INOCUIDA

LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL

,

ALVAREZ

PAULETTE TECNICO DE INOCUIDA

LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL

MUESTREO CAMAL

PORTOVIEJO

24/08/2015

17H00 -19H00

MUESTREO CAMAL

PORTOVIEJO

15

ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO

,

ANDINO/ DIEGO

ALVAREZ

MUESTREO CAMALES

DESTINADOS

25/08/2015

SEGÚN DISPONIBILIDA

DE FAENAMIENTO

MUESTREO CAMALES DESTINADOS (

COGAMANTASA MANTA SANTA ANA/ TOSAGUA)

/

23

PAULETTE ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO

TECNICO DE INOCUIDA

LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL

,

PAULETTE

TECNICO DE INOCUIDA LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL

MUESTREO CAMALES DESTINADOS

26/08/2015

SEGÚN DISPONIBILIDA DE FAENAMIENTO

MUESTREO CAMALES DESTINADOS ( CALCETA

)

3

ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO

,

ANDINO/ DIEGO

ALVAREZ

PAULETTE

MUESTREO CAMALES

DESTINADOS

27/08/2015

SEGÚN DISPONIBILIDA

DE FAENAMIENTO

PREPARACIÓN DE MATERIALES, MUESTRA

Y RETORNO

S

ANDRADE/ PAUL VARGAS/ WANIA ESPINOZA/ DIEGO ANDINO/ DIEGO

TECNICO DE INOCUIDA

LABORATORIO Y SANIDAD ANIMAL

,

ALVAREZ

Espinoza Molina 96

Anexo 5. Oficio dirección de tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina.

Espinoza Molina 97

Anexo 6. Oficio co-dirección como investigador del Proyecto Prometeo y Agrocalidad de la

tesis de maestría de Wania Fernanda Espinoza Molina.

Espinoza Molina 98

Anexo 7. Formato Orden de trabajo de las muestras del proyecto “Evaluación de clembuterol en productos pecuarios bovinos de la provincia de Manabí.

Espinoza Molina 99

Anexo 8. Formato Registro de toma de muestras.

Espinoza Molina 100

Anexo 9. Formato registro de análisis de ELISA

Espinoza Molina 101

Anexo 10. Informe de cumplimiento de comisión para la toma de muestras en la provincia de Manabí.

Espinoza Molina 102

Anexo 10. Informe de cumplimiento de comisión para la toma de muestras en la provincia

de Manabí. (Continuación)

Espinoza Molina 103

Anexo 11. Informe de comisión de servicios institucionales para la toma de muestras de productos pecuarios bovinos en la provincia de Manabí.

Espinoza Molina 104

Anexo 12. Capacitación Método de ELISA para clembuterol y demostración.

Espinoza Molina 105

Anexo 12. Capacitación método de ELISA para clembuterol y demostración. (Continuación)

Espinoza Molina 106

Anexo 13. Certificado de formación completa sobre el Método de ELISA para clembuterol.

Espinoza Molina 107

Anexo 14. Seteo de masas clembuterol en el equipo UPLC/MS/MS

Espinoza Molina 108

Anexo 15. Laboratorio de contaminantes productos pecuarios, análisis de clembuterol por el método de ELISA. (Recepción de muestras, codificación, extracción de la porción analítica)

Espinoza Molina 109

Anexo 16. Figuras de participación en formación y desarrollo del método ELISA clembuterol, impartida por la empresa Biooscientific – Inventagri.

Espinoza Molina 110

Anexo 17. Figuras del proceso de análisis por el método cromatográfico UPLC/MS/MS (Preparación de estándares, recepción, codificación, preparación, extracción de las muestras de hígado y músculo, previo a la inyección en el equipo)

Espinoza Molina 111

Anexo 18. Figuras Acondicionamiento del equipo (gradiente)