Aplicações de Bioinformática(Epigenética)

Daniel Guariz Pinheiro

Tópicos

Abordagens Análise após sequenciamento com bissulfito Comparação de Genomas Análise de Expressão Gênica Diferencial Alelo

Específica Análise de Perfis de Metilação e Predição de

Classes Banco de Dados

MethDB

Análise após o sequenciamento com bissulfito

Tratamento com bissulfito - Conversão de Citosinas não metiladas para Uracila.

Análise dos dados : Manual x Automatizada

Ferramentas Computacionais :

MethTools

BIQ Analyzer Alinhamento Global : ClustalW

CGCCGCTGCCGCTCGGTGGCCGGGCCGGGCGCCTCCACCCCCCTCGCAGTCATGTGCCTGTGTTGTTGTTGTTTGGTGGTTGGGTTGGGCGTTTTTATTTTTTTTGTAGTTATGTGTTTG

MethTools

Coleção de ferramentas computacionais específicas para o processo de comparação que geram saídas gráficas que permitem:

Identificar padrões de metilação Analisar a densidade dos padrões de

metilação Identificar possíveis motivos para metilação Estimar os erros sistemáticos do experimento

http://genome.imb-jena.de/methtools/

Padrões de Metilação

• Lollipops

Densidade dos Padrões de Metilação

• Gráfico de Densidade

Motivos para Metilação

• Logos– O consenso geral das seqüências– A ordem de predominância de um resíduo em cada posição– A freqüência relativa de cada um dos resíduos em cada posição– A quantidade de informação em cada uma das posições na

seqüência– Localização significante

Estimativa de erros sistemáticosdo experimento

Estimativa feita a partir do número de trocas de bases diferentes das de C para T.

BIQ Analyzer

Programa interativo que automatiza o processo de análise de metilação por seqüênciamento com bissulfito.

O BIQ Analyzer pode auxiliar nos seguintes processos:

Importação dos dados do sequenciador Alinhamento das seqüências Identificação de seqüências críticas Gera estatísticas básicas Produz diagramas úteis

http://biq-analyzer.bioinf.mpi-inf.mpg.de/

Diagrama (BIQ Analyzer)

Controle de Qualidade (BIQ Analyzer)

Tipos de erros freqüentes e soluções:

Conversão incompleta No caso de vertebrados é utilizado o critério da taxa de

conversão.

Seqüências clones É utilizado um método heurístico para detecção de

clones.

Erros no sequenciamento Sugere a exclusão das seqüências com baixa identidade.

Comparação de Genomas

Domínios de Imprinting-- Região 11p15 (Hs) - Cromossomo 7 (Mm)

Regiões Conservadas (não exônicas)-- 74% Regiões ricas em GC ou -Ilhas CpG.

Genes Metilados- Associados a ilhas CpG (2 ou mais)

Certos padrões de regulação gênica e dos elementos regulatórios correspondentes estão freqüentemente conservados entre as espécies.

Envolve o alinhamento de regiões genômicas ortólogas.

Onyango, P. et al. (2000)

PipMaker

PIP (Percent Identity Plot ) - gráfico com a porcentagem de identidade entre as regiões ao longo das seqüências.

http://bio.cse.psu.edu/pipmaker/

Alinhamento Local- BLASTZIdentificação de Repeats- RepeatMaskerPredição Gênica- GenscanMapeamento de

Transcritos- Matches com ESTsMapeamento de Ilhas

CpG- Gardiner-Garden e

FrommerSchwartz et al. (2000)

Análise de Expressão Gênica Diferencial Alelo Específica

UniGene – ESTs (Expressed Sequence Tags) SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)

Biblioteca de EST  ↔ Indivíduo

EST LibraryOnly allele A

was foundAlleles A and B

were foundOnly allele Bwas found

Individual genotyping

Population allele freq

Z-statistics

Baye’s inference

AA or AB AB BB or AB

QA = PAA + 0.5PAB ; QB = 1-QA ; QAB = 2QAQB

Cálculo da diferença entre PAB e QAB

PAB tende a ser menor que QAB para gene metilados

Estimados PAA, PAB e PBB para a população

Expressão Gênica Diferencial Alelo Específica

19312 SNPs 194 mais

significantes 4 genes conhecidos

com imprinting

Análise de Perfis de Metilação e Predição de Classes

Objetivo Extrair informação dos dados e identificar sua implicação

biológica em determinado fenótipo. Auxiliar no diagnóstico e/ou prognóstico de uma doença (AML e

ALL).

Estratégia Baseada em certos padrões de metilação do DNA que

estão correlacionados com determinados parâmetros fenotípicos.

Utilizar uma análise baseada em microarrays. Utilizar sistemas de Aprendizado de Máquina

SVM (Support Vector Machine)

Análise de Metilação Baseada em Microarrays

CGCG CGCGm

Bissulfito

UGUG CGCGm

PCR

TGTG CGCG

Sondas (oligonucleotídeos)

ACAC GCGC

ALL x AML

• AML – Leucemia Mielóide Aguda– 17 amostras (tecidos e linhagem

celulares)

• ALL – Leucemia Linfoblástica Aguda– 8 amostras (tecidos e linhagens

celulares)

• 81 sítios CpG (região promotora, exons ou introns)

• Genes : ELK1, CSNK2B, 1-myc, CD63, CDC25A, TUBB2, CD1A, CDK4, n-myc, AR e c-MOS

• Vetor de atributos para cada amostra:– Razão : log CG/TG para os 81 sítios

20 Sítios CpG para os genesELK1 e AR (cromossomo X)

Sistema de Aprendizado de Máquina Supervisionado

Vetor de atributos X = {xi : xi є Rn} , i = 1,...,n

Número de atributos n = 81

Vetor de classes Y = {yj : yj є {ALL,AML}}, j = 1,...,m Número de exemplos que serão treinados m

Conjunto de treinamento {X, Y}

Performance de Generalização Estimada a partir da quantidade de erros de

classificação na fase de testes

Support Vector Machine

• Objetivo: encontrar uma função discriminante (f) capaz de capturar as propriedades essenciais da distribuição dos dados e evitar o super ajustamento aos dados de treinamento.

• SVM - discriminante linear ( f : Rn →{ALL,AML}) – separar os dados do conjunto de treinamento– maximizar a distância da margem do hiperplano

Redução de Dimensionalidade

• Critérios avaliados – Fisher– Golub– t-test– PCA– Backward Elimination

• Método Avaliação– Cross-validation

(repetido 50 vezes)• 8 Partições

– 7 treinamento– 1 teste

SVM (ALL / AML)

• Critério de Fisher – CSNK2B CpG2

(eixo-x)– CDK4 CpG3

(eixo-y)

Banco de Dados (MethDB)

MethDB (setembro, 2002) 6667 experimentos

46 espécies, 160 tecidos e 72 fenótipos Tipos de dados

Descrições dos experimentos Padrões e perfis de metilação

Padrão de metilação : seqüência 5 mucleotídeos (incluindo a 5mC)

Perfil de metilação : representação da metilação ao longo das seqüências (lollipops)

Conteúdo de metilação total Quantidade de 5mC em uma amostra de DNA.

http://www.methdb.de/