SRIES EM BIOTECNOLOGIA
volume I
Tecnologia de Bioprocessos
P 436 t Pereira Jr., Nei. (editor-autor) Tecnologia de
bioprocessos / Nei Pereira Jr., Elba Pinto da Silva Bon, Maria
Antonieta Ferrara. Rio de Janeiro: Escola de Qumica/UFRJ, 2008. 62
p.: il. (Sries em Biotecnologia, v. 1) ISBN 978-85-903967-2-7
Inclui bibliografia. 1. Bioprocessos. 2. Tecnologia. 3.
Bioprodutos. I. Bon, Elba Pinto da Silva. II. Ferrara, Maria
Antonieta. III. Ttulo. IV. Srie. CDD 600
Biblioteca Nacional
2
BREVE NOTA BIBLIOGRFICA SOBRE OS AUTORESNei Pereira Jr Professor
Titular do Departamento de Engenharia Bioqumica da Escola de Qumica
da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Possui os ttulos
de Engenheiro Qumico (EQ-UFRJ, 1977); MSc em Tecnologia de
Processos Bioqumicos (EQ-UFRJ, 1982) e PhD em Biotecnologia (The
University of Manchester, UK, 1991). Desde 1991, vem liderando
projetos de Pesquisa & Desenvolvimento & Inovao nos
Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos da UFRJ, onde j
orientou 65 teses (43 MSc e 22 DSc). Coordena as seguintes linhas
de pesquisa: Biotecnologia de Lignocelulsicos; Processos com
Microrganismos Recombinantes; Biotecnologia Ambiental;
Floculao/Imobilizao de Clulas e Enzimas; Tecnologia da Produo de
Antibiticos; Produo de Alimentos Funcionais; Gesto Tecnolgica e
Tratamento/Minimizao de Resduos e Efluentes Industriais.
Atualmente, orienta 05 estudantes de mestrado e 08 de doutorado. J
publicou mais de 200 trabalhos (artigos em peridicos indexados e
trabalhos em eventos cientficos) e 07 patentes, uma delas
relacionada produo de bioetanol de bagao de cana-de-acar via
hidrlise enzimtica de celulose, trabalho realizado para a PETROBRAS
que resultou na patente de nmero 1000 da empresa. Tambm desenvolve
trabalhos cooperativos com instituies de ensino e pesquisa
nacionais e internacionais, bem como com empresas. bolsista do CNPq
(Produtividade em Pesquisa) e da FAPERJ (Cientista do nosso Estado)
em reconhecimento as suas contribuies ao desenvolvimento da cincia
e tecnologia nacionais, assim como na formao de recursos humanos
altamente capacitados. Ele foi recentemente agraciado com os
seguintes prmios: PETROBRAS Inventor 2005, 2006 e 2007; Tese Ouro
(2006), concedido pela Escola de Qumica por ter atingido a orientao
de 50 teses em seu Programa de Ps-graduao e o prmio nacional da
Associao Brasileira da Indstria Qumica (ABIQUIM) - Pesquisador de
Destaque 2006. Elba Pinto da Silva Bon Professora Associada do
Departamento de Bioqumica do Instituto de Qumica da Universidade
Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). graduada em Cincias Biolgicas
(UERJ, 1970), com Mestrado em Bioqumica (UFRJ, 1974) e em
Engenharia Bioqumica (UMIST-UK, 1987), Doutorado em Engenharia
Bioqumica (UMIST-UK, 1991) e Ps-Doutorado no Departamento de
Biologia do Massachusetts Institute of Technology (MIT, Cambridge,
USA, 1995). a coordenadora do Laboratrio de Tecnologia Enzimtica do
IQ/UFRJ, onde atua nas reas de Microbiologia Aplicada, Biocatlise e
Regulao do Metabolismo por Nitrognio, com nfase a produo e uso de
enzimas industriais e especiais e regulao da expresso gnica. J
orientou 27 teses (15 MSc e 12 DSc) e atualmente, orienta 03
estudantes de mestrado e 02 de doutorado. Coordena projetos de
pesquisa desenvolvidos em colaborao com o Instituto Nacional de
Tecnologia MCT e a Fundao Oswaldo Cruz - MS. J coordenou ou
coordena projetos de pesquisa com colaborao internacional com
Portugal, Alemanha e Sucia. coordenadora cientfica e coordenadora
setorial da rea de Produo de Celulases do Projeto Bioetanol. Atua
tambm na rea de polticas de Cincia e Tecnologia tendo estruturado e
organizao muitas edies do evento ENZITEC. Participa das atividades
do Frum de Biotecnologia do Governo Federal, como contratada pelo
CGEE na rea de Enzimas Industriais e Especiais. Maria Antonieta
Ferrara Pesquisadora do Instituto de Tecnologia em Frmacos de
FarManguinhos / Fundao Oswaldo Cruz. Possui graduao em Qumica
(IQ/UFRJ, 1974), Mestrado (EQ/UFRJ, 1988) e Doutorado (EQ/UFRJ,
2004) em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos. Tem
experincia nas reas de Microbiologia, com nfase em Bioprocessos e
de Tecnologia Enzimtica, atuando principalmente nos seguintes
temas: produo de enzimas, produo de metablitos microbianos
bioativos, produo de protenas heterlogas por Pichia pastoris,
bioconverso, enzimas teraputicas, fungos endofticos e pr-tratamento
e hidrlise enzimtica de biomassa vegetal.
3
APRESENTAOA Biotecnologia Moderna oferece inovadoras
possibilidades para a produo de substncias qumicas e processos mais
limpos. Em seu cerne est o princpio de se trabalhar em harmonia com
o mundo natural. A Biotecnologia tem solues para atender humanidade
em suas mais diferentes necessidades (alimentos, energia,
medicamentos), bem como suplantar tecnologias que poluem a biosfera
ou que contribuam para a depleo de fontes finitas. No entanto, a
indstria, a comunidade cientfica e o governo necessitam trabalhar
em conjunto para que o Brasil possa lanar mo plenamente do
potencial da Biotecnologia, a fim de alcanar sua sustentabilidade
industrial/econmica/ ambiental e permitir que o pas siga a sua
vocao natural para essa rea. neste contexto, que lanamos a primeira
verso das Sries em Biotecnologia com a inteno de disponibilizar
material instrucional a estudantes que tencionem atuar
profissionalmente nesta importante rea. Esta primeira edio
apresenta conceitos e fundamentos necessrios para uma melhor
compreenso das diferentes etapas que compem a Tecnologia de
Bioprocessos, com o objetivo de fornecer aos estudantes uma viso
global e integrada desta temtica, imprescindvel quando se pretende
transformar conhecimento em realidade produtiva. No entanto, de
carter introdutrio e cunho aplicado, no tem a pretenso de ser uma
apresentao exaustiva sobre o assunto. Na realidade, so notas de
aulas que temos a inteno de transformar em sries didticas, de forma
a colocar o estudante em contato com os problemas e desafios da
Biotecnologia, quer seja na rea acadmica ou no setor industrial.
Esperamos que o contedo desta edio proporcione aos leitores uma
viso abrangente da rea para conhecimento e reflexes. Estamos
convictos da importncia da Biotecnologia para o Brasil, pois ela
concilia o desenvolvimento tecnolgico com a preservao ambiental.
Somos conscientes de que o meio ambiente brasileiro representa um
ativo de valor incalculvel e contribui decisivamente para a
representatividade brasileira no cenrio internacional. Para isto
registramos nosso firme propsito e compromisso de contribuir
efetivamente na formao de massa crtica capacitada para atuar nesta
importante rea, permitindo a insero desses profissionais em um
mercado cada vez mais competitivo e regulador em termos de produtos
e processos. Os Autores4
NDICE
Tpico 1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e Aplicaes
Biotecnologia de Bactrias Biotecnologia de Leveduras e Fungos
Filamentosos Tecnologia do DNA Recombinante 2. Bioprocessos 3.
Agente Biolgico: Caractersticas 4. Nutrio dos Microrganismos Fontes
de Energia Fontes de Carbono Fontes de Nitrognio Fontes de Minerais
Fatores de crescimento 5. Matrias-Primas Glicdicas 6. Meio de
Cultivo Otimizao do meio de cultivo Formulao de meio de cultivo com
base na composio centesimal de microrganismos 7. Esterilizao de
Meios e Equipamentos 8. Biorreator 9. Modos de Operao de
Bioprocessos Quanto conduo Quanto ao desenvolvimento do agente
microbiano Quanto ao suprimento de oxignio 10. Processos de Separao
e Purificao de Produto 11. Extrapolao de Escala 12. Tratamento
Biolgico de Resduos e Efluentes 13. Consideraes Gerais 14.
Referncias Bibliogrficas Recomendadas
Pgina 7 10 12 14 18 21 23 23 23 24 24 25 25 27 29 31
33 35 41 41 45 47 50 50 53 57 58
5
TECNOLOGIA DE BIOPROCESSOSNei Pereira Jr.1; Elba Pinto da Silva
Bon2& Maria Antonieta Ferrara31
Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos Escola de Qumica
- CT/UFRJ [email protected] 2 Laboratrio de Tecnologia Enzimtica
Instituto de Qumica CCMN/UFRJ 3 Instituto de Tecnologia em Frmacos
Farmanguinhos/FIOCRUZ
1. A Biotecnologia Microbiana: Conceitos e AplicaesOs vrios
conceitos da Biotecnologia se referem ao uso de clulas ou sistemas
bioqumicos em processos de produo de bens ou de prestao de servios
(Tabela 1). Neste contexto, a Biotecnologia tem papel destacado,
sob o ponto de vista histrico e tecnolgico, visto que os primeiros
processos industriais basearam-se na ao de microrganismos e a
grande maioria daqueles consagrados utiliza microrganismos nativos
ou modificados geneticamente. A Biotecnologia apresenta carter
inter e multidisciplinar, necessitando aqueles que militam nesta
rea de conhecimentos fundamentais em Bioqumica, Gentica,
Microbiologia Aplicada e Engenharia Bioqumica, a fim de se ter uma
maior compreenso sobre a atividade do biocatalisador e buscar suas
melhores condies de desempenho em biorreator (otimizao). Outras
ferramentas como a Modelagem e a Simulao, bem como o Controle e a
Instrumentao so peas-chaves na otimizao de Bioprocessos. Trata-se
de uma rea muito extensa, conforme exemplificado a seguir, para
processos, produtos e servios: diferentes microrganismos so
utilizados para a produo de substncias de interesse comercial,
como: antibiticos, cidos orgnicos, solventes, enzimas e
biocombustveis por processos fermentativos. O produto pode ser
ainda o prprio microrganismo, como a produo de levedura de
panificao e inoculantes agrcolas, ou as clulas microbianas podem
ser utilizadas em processos de biotransformao, como por exemplo,
para a produo de esterides, aromas e fragrncias. Alm da produo de
bens de consumo, os microrganismos so tambm utilizados em processos
de tratamento de resduos e efluentes urbanos e industriais, na
recuperao de metais, tais como cobre, chumbo e urnio, ou em
processos de biorremediao de solos contaminados. Os principais
produtos da Biotecnologia podem ser agrupados de acordo com o seu
uso, em produtos da indstria farmacutica (antibiticos, hormnios,
vacinas, vitaminas e protenas teraputicas humanas), da indstria de
alimentos (aminocidos, flavorizantes, polissacardeos e gomas
xantana) e da indstria qumica (etanol, acetona, butanol, glicerol,
cido lctico, cido ctrico, polisteres, inseticidas microbianos).
Como as enzimas microbianas so utilizadas em diferentes segmentos
industriais, no conveniente classific-las de acordo com a sua
aplicao. Em decorrncia das vrias aplicaes de seus produtos, a
Biotecnologia insere-se em uma gama de segmentos industriais
(Figura 1).6
Tabela1: Definies de Biotecnologia. DEFINIO Conjunto de
processos microbianos e outros processos bioqumicos desenvolvidos
em escala industrial Uso de organismos vivos para produzir produtos
benficos para a espcie humana Integrao de cincias naturais e de
cincias da engenharia visando aplicao de organismos, clulas,
derivados celulares e anlogos moleculares para produtos e servios
toda tecnologia de processo ou produto que lance mo, em pelo menos
uma de suas etapas, da ao de microrganismos, clulas animais ou
vegetais, ou de substncias produzidas por estes agentes biolgicos,
sendo caracterizada por sua multidisciplinaridade Conjunto de
tecnologias habilitadoras (enabling technologies), que possuem em
comum o uso de clulas ou molculas biolgicas para aplicaes na produo
de bens e servios, em reas como sade humana & animal,
agricultura, energia e meio ambiente REFERNCIA Stenesh (1989)
Glazer & Nikaido (1995)
Smith-Doerr et al. (1997)
Rehn & Reed (1993)
Marx (1989)
agropecurio qumico txtil
veterinrio
BIOTECNOLOGIA
ambiental
alimentcio mdico-farmacutico
energtico
Figura 1: Insero da Biotecnologia em diferentes setores
produtivos.7
Todos os microrganismos produzem uma variedade muito grande de
enzimas intracelulares em pequenas quantidades, para a catlise das
suas reaes metablicas. As enzimas, tambm denominadas de
biocatalisadores, so catalisadores proticos com caractersticas
particulares pela sua alta eficincia em condies fisiolgicas e alta
especificidade, sendo inclusive capazes de catalisar reaes
estereoespecficas. Este potencial cataltico utilizado
industrialmente no s nos clssicos processos fermentativos, mas
tambm em processos de biotransformaes microbianas para a catlise de
reaes qumicas de difcil ocorrncia e de grande importncia na
indstria farmacutica. Um exemplo tpico refere-se produo de
esterides utilizando-se Rhizopus nigricans. O fungo , inicialmente,
cultivado em biorreatores em condies otimizadas para se atingir
altas concentraes celulares. Finda a fase de crescimento celular, o
substrato a ser transformado, a progesterona, adicionado ao
biorreator e, aps um perodo de incubao determinado, o produto da
biotransformao, a 11hidroprogesterona, extrado com solvente
orgnico. Este composto pode ser subseqentemente transformado, por
via qumica, para a produo industrial de um outro esteride, a
cortisona (Madigan et al., 2000 e Atlas, 1997). Enquanto nas
biotransformaes os sistemas enzimticos de interesse no so extrados
das clulas, a catlise enzimtica industrial usa enzimas microbianas
excretadas ou extradas de microrganismos e com diferentes graus de
purificao. As enzimas microbianas excretadas so produzidas em
maiores quantidades do que as intracelulares e tm a funo principal
de degradar macromolculas presentes no meio ambiente, como a
celulose, o amido, a lignina e protenas, para que seus componentes
possam ser absorvidos como nutrientes pelos microrganismos. As
enzimas so utilizadas em muitos segmentos industriais, como o de
alimentos e bebidas, de detergentes, txtil, couro, celulose e
papel, qumica fina, medicamentos e cosmticos e, ainda, em
metodologia analtica e em biologia molecular. Amilases, glicose
oxidase, pectinases, invertase, renina, naraginase, lipases,
proteases, celulases e peroxidases so os biocatalisadores mais
utilizados (Atlas, 1997 e Bon & Pereira Jr., 1999). Enzimas so
tambm empregadas como medicamento, como por exemplo, a asparaginase
utilizada no tratamento de leucemia. O mercado mundial de
biocatalisadores, atualmente avaliado, em US$ 1,5 bilhes tem
previses de crescimento continuado em resposta s demandas por
processos industriais com menor impacto ambiental e menor consumo
energtico e tambm por produtos de melhor qualidade (Godfrey, 2003).
O desenvolvimento da Biotecnologia tem importncia mpar para o
Brasil, devido ao seu baixo impacto ambiental, sendo possvel
conciliar o desenvolvimento industrial com a preservao de
ecossistemas. Sabemos que o Brasil apresenta uma das maiores
biodiversidades do planeta e que seu territrio possui recursos
hdricos correspondentes a 12% da gua doce do planeta, incluindo o
Aqfero Guarani, que o maior do mundo. So esses os recursos naturais
mais importantes para a humanidade a partir deste sculo,
representando um ativo de valor incalculvel. Essas riquezas,
patrimnio da sociedade brasileira, devem ser preservadas da poluio
ambiental provocada por prticas inadequadas de diferentes setores
industriais e agro-industriais. O equilbrio natural dos
ecossistemas, to antigo quanto a vida na Terra, pode ser
considerado como uma importante rea da Biotecnologia Microbiana. Os
microrganismos habitam praticamente todos os ambientes terrestres,
sendo8
transportados por correntes de ar para a atmosfera e de
continente para continente. Esses seres microscpios tambm habitam
todos os ambientes marinhos, das superfcies aquticas ao fundo dos
oceanos. Por causa desta caracterstica de crescimento nos mais
variados ambientes, os microrganismos, atravs de suas vias
metablicas intracelulares e de molculas bioativas excretadas para o
meio externo, atuam na manuteno do ciclo biolgico de elementos
qumicos, no controle populacional, na descontaminao de ambientes
aquticos e terrestres e na disponibilizao de nutrientes para
diferentes formas de vida. Estas tarefas gigantescas, inestimveis e
insubstituveis no so facilmente perceptveis, correndo o risco de no
serem adequadamente protegidas. Embora a ao antropognica venha
interferindo de forma negativa no modus operandi dos ecossistemas
e, portanto, no seu equilbrio, as populaes microbianas que habitam
o nosso planeta continuam alicerando a manuteno da vida na Terra. O
fantstico potencial metablico envolvido na sntese e degradao das
mais variadas estruturas qumicas por bactrias, fungos, algas e
protozorios est distribudo em microrganismos com caractersticas
fisiolgicas muitas vezes peculiares. As bactrias, por exemplo, so
encontradas nos mais diferentes climas e microambientes do planeta,
alguns considerados inspitos. Bactrias haloflicas vivem em
ambientes aquticos com alto teor salino, como o Mar Morto, as
termoflicas, em fontes termais, em temperaturas entre 800C e 1000C
e as baroflicas se adaptaram s enormes presses das profundezas do
mar. Adicionalmente, algumas bactrias so parasitas de tecidos
animais e vegetais e algumas vivem em consrcio com outros
microrganismos, plantas e animais.
Biotecnologia de BactriasEmbora as bactrias sejam mais
conhecidas como microrganismos patognicos, a grande maioria
inofensiva e inclusive benfica a outros seres vivos. Como exemplo,
a tarefa fundamental da fixao do nitrognio atmosfrico molecular
levada a efeito por bactrias dos gneros Rhizobium, Bradyrhizobium e
Frankia, que vivem em associaes simbiticas com plantas leguminosas,
como o feijo e a soja. Estas bactrias, que so encontradas no solo,
infectam naturalmente plantas hospedeiras formando ndulos nas razes
onde proliferam. Este mecanismo natural de infeco tem sido
utilizado, h quase cem anos, para aumentar a fertilidade do solo
atravs da sua inoculao com bactrias fixadoras de nitrognio
produzidas industrialmente por processos fermentativos (Glazer
& Nikaido, 1995). So tambm de grande importncia biotecnolgica
cepas selvagens ou modificadas geneticamente de bactrias dos gneros
Corynebacterium, Bacillus e Microbacterium pela capacidade de
excretar produtos do seu metabolismo primrio, como aminocidos. A
constatao de que Corynebacterium glutamicum era capaz de produzir
grandes quantidades de cido glutmico, quando crescida em glicose,
reportada em 1957, resultou na seleo e desenvolvimento de bactrias
para a produo de acido L-glutmico, L-arginina, L-isoleucina,
Lhistidina, L-leucina, L-lisina, L-ornitina, L-fenilalanina,
L-prolina, L-treonina, Ltriptofano e L-tirosina, alm de vitaminas e
nucleotdeos. Fermentaes com concentraes de L-tirosina e
L-fenilalanina em torno de 25g/L esto descritas na literatura
(Piepersberg, 1993). A produo anual de aminocidos utilizados na
indstria de alimentos estimada em 530 toneladas (Madigan et al.,
2000).9
Ainda entre as bactrias, encontramos os estreptomicetos, que
tambm apresentam o genoma organizado em um nico cromossomo
circular. Os estreptomicetos, que so aerbios, vivem no solo e
multiplicam-se formando filamentos ramificados, tm grande
importncia biotecnolgica por produzirem compostos com diferentes
atividades biolgicas. Assim, esses microrganismos sintetizam
molculas que atuam como antibiticos, antitumorais,
imunomoduladores, antiinflamatrios, vasoconstritores e
vasodilatadores, alm de terem aplicao no tratamento da diabete e
como herbicidas. Algumas foram ainda identificadas como inibidores
enzimticos. Estes compostos, que apresentam baixa massa molecular,
so excretados em condies de metabolismo secundrio, isto , aps a
fase de crescimento celular, j tendo sido identificados mais de
10.000 substncias diferentes (Piepersberg, 1993). Os antibiticos,
substncias que mesmo em baixas concentraes inibem o crescimento de
microrganismos patognicos, so os representantes mais conhecidos
deste grupo. Considerando o seu mercado, avaliado em 8 bilhes de
dlares (Glazer & Nikaido, 1995), os antibiticos so os produtos
mais importantes da biotecnologia microbiana, excetuando-se bebidas
alcolicas e queijos. O primeiro depoimento oficial sobre a ao do
antibitico penicilina foi feito por Alexander Fleming em 1928,
quando relatou a eficincia do filtrado de uma cultura do fungo
Penicillium notatum como um teraputico local em uma infeco
provocada por Staphylococcus. O grande sucesso dos antibiticos no
tratamento de infeces bacterianas em comparao aos quimioterpicos,
que comearam a ser disponibilizados na mesma poca, deveu-se sua
eficincia em comparao apresentada por drogas como as sulfas. Assim,
enquanto concentraes inibitrias mnimas (CIMs) de sulfonamidas nos
pacientes esto na faixa de 10 a 100 g/mL, o antibitico penicilina
mata bactrias sensveis como Streptococcus pneumoniae com CMIs em
torno de 0,01 g/mL (Glazer & Nikaido, 1995). Os antibiticos
podem ser classificados quanto ao espectro de atividade,
antifngicos, antibacterianos, antivirais, antiprotozorios e
antitumorais; quanto a seu mecanismo de ao, interferindo na sntese
da parede celular, na sntese de cidos nuclicos, na sntese de
protenas e nas funes da membrana citoplasmtica; e quanto sua
estrutura qumica, lactonas macrocclicos, quinonas e relacionados,
derivados de aminocidos e peptdicos, entre outras estruturas. A
grande maioria dos antibiticos com importncia comercial produzida
por fungos ou bactrias. Dentre os bacterianos, a maior variedade em
estruturas e o maior nmero de antibiticos so encontrados na classe
Actinomycetales, especialmente no gnero Streptomyces. Uma relao de
alguns antibiticos produzidos por Streptomyces est apresentada na
tabela 2. Segundo o Index ABIQUIF 2002, publicado pela Associao
Brasileira da Indstria Farmoqumica, so produzidos no Brasil apenas
nove antibiticos, a saber: Ampicilina, Anfotericina B, Cefalexina,
Cefalotina, Ceftadizina, Eritromicina, Nistatina, Oxacilina e
Penicilina G, de um elenco de trinta e nove considerados essenciais
segundo a edio de 2002 da Relao Nacional de Medicamentos Essenciais
publicada pelo Ministrio da Sade. Entre os antibiticos produzidos
no Brasil, trs (Cefalexina, Cefalotina e Ceftazidna) so produzidos
pela empresa multinacional Eli Lilly do Brasil Ltda e seis
(Ampicilina, Anfotericina B, Eritromicina, Nistatina, Oxaciclina e
Penicilina G), por outra multinacional, o10
Grupo Prodotti. Esta relao no inclui a paromomicina, fundamental
para o tratamento de doenas negligenciadas de grande ocorrncia no
Brasil, como a leishmaniose e a tuberculose. O Brasil no produz e
nem importa paromomicina, no estando esta droga disponvel no
mercado nacional. Considerando o acima exposto, o abastecimento de
antibiticos para uso humano no Brasil depende integralmente de
companhias farmacuticas internacionais. Em relao produo de
antibiticos para uso animal, o pas encontra-se em posio mais
confortvel, pois existem empresas brasileiras, como a Valle, ativas
no setor. Tabela 2: Antibiticos produzidos por microrganismos do
gnero Streptomyces Antibitico Aminosidina Cicloheximida Cicloserina
Cloranfenicol Eritromicina Espectinomicina Estreptomicina
Kanamicina Lincomicina Neomicina Nistatina Ribostamicina
Tetraciclina Microrganismo Streptomyces rimosus Streptomyces
griseus Streptomyces orchidaceus Streptomyces venezuelae
Streptomyces erithreus Streptomyces spectabilis Streptomyces
griseus Streptomyces kanamyceticus Streptomyces lincolnnensis
Streptomyces fradiae Streptomyces noursei Streptomyces
ribosidificus Streptomyces rimosus
Fonte: Madigan et al. (2000) e Vandamme (1984)
Biotecnologia de Leveduras e Fungos FilamentososHistoricamente,
o potencial metablico dos microrganismos inseriu-se naturalmente em
aspectos fundamentais da vida humana. Assim, fungos unicelulares,
as leveduras, apresentam peculiaridades metablicas que permitiram o
seu uso de forma emprica na produo do po e do vinho, alimentos
simblicos na histria da humanidade. Os antigos egpcios, no preparo
do seu po, mantinham a massa, uma simples mistura de farinha e gua,
aquecida at a formao de bolhas, indicativo, hoje sabemos, da
liberao de CO2 em conseqncia da sua fermentao (Panek, 1993). Assim,
a contaminao natural, no apenas da massa do po, mas tambm de uvas e
gros de cevada, com a levedura Saccharomyces cerevisiae e a sua
subseqente fermentao originaram o vinho e a cerveja que at os dias
de hoje fazem parte dos nossos hbitos alimentares. As fermentaes
industriais com leveduras contribuem atualmente de forma
significativa para a economia de vrios pases. So produzidas por ano
centenas de toneladas de leveduras utilizadas para a produo de po,
vinho, cerveja, bebidas destiladas, cidra, saqu e licores. Um outro
importante produto industrial derivado de S. cerevisiae, cujas
clulas so ricas em protenas, cidos nuclicos, vitaminas e sais
minerais e apresentam nveis negligenciveis de triglicerdeos, o
extrato de levedura que tem11
importantes aplicaes na indstria alimentcia e na de fermentaes
industriais, servindo como componente do meio de fermentao. Outras
leveduras dos gneros Torulopsis e Candida, sendo capazes de crescer
em melao ou em licor sulftico, subprodutos da fabricao de acar e da
indstria de papel, respectivamente, so utilizadas para o tratamento
destes resduos industriais. A biomassa microbiana formada pode ser,
subseqentemente, utilizada como fonte de protena para alimentao
animal. Considerando ainda o potencial biotecnolgico das leveduras,
microrganismos dos gneros Saccharomyces, Kluyveromyces e Candida so
capazes de fermentar diferentes acares a etanol. de particular
importncia para o Brasil a produo de lcool combustvel por fermentao
da sacarose do caldo da cana-de-acar por S. cerevisiae, tendo em
vista ser o pas, juntamente com os Estados Unidos, os maiores
produtores mundiais de etanol combustvel. Adicionalmente, o etanol
est sendo cada vez mais valorizado internacionalmente como
combustvel lquido, em comparao gasolina, derivada do petrleo. Sendo
produzido a partir de recursos renovveis, no contribui para o
efeito estufa e suas conseqncias, como as grandes modificaes
climticas que esto afetando negativamente a Terra. Para a produo
deste biocombustvel, podem ser utilizadas matrias primas sacarneas
(aucaradas), amilceas e lignocelulsicas, cujas caractersticas esto
descritas a seguir. Vale ressaltar, entretanto, que bactrias como
Zymomonas mobilis podem ser tambm utilizadas em processos
fermentativos de produo de etanol. A diversidade microbiana dos
fungos muito grande, estimando-se um nmero de espcies entre 100.000
e 250.000. Os fungos destacam-se pela sua capacidade de atacar
tecidos vegetais atravs da secreo de enzimas que degradam
biopolmeros tais como polissacardeos, lignina e protenas. familiar
a todos ns a colonizao de troncos de rvores em decomposio por
diferentes espcies de fungos. Este grupo de microrganismos,
semelhana dos estreptomicetos, tambm produz, em condies de
metabolismo secundrio, uma variedade de molculas orgnicas de
pequena massa molecular com diferentes atividades biolgicas, como a
antibitica. A comercializao de produtos teraputicos microbianos
iniciou-se h mais de 50 anos com a penicilina. O uso de manipulaes
genticas, basicamente tcnicas de mutao associadas otimizao do
processo fermentativo, incluindo o desenvolvimento de meios,
permitiram a melhoria do processo de produo do antibitico, cuja
concentrao passou de 0,06 para 26 g/L (Buckland & Lilly, 1993).
Inicialmente empregados apenas como agentes antibacterianos, os
produtos do metabolismo secundrio de fungos apresentam hoje em dia
uma gama bastante diversificada de aplicaes, incluindo inclusive o
uso como imunossupressores em terapias sofisticadas para pacientes
transplantados (Pearce, 1997), conforme mostrado na Tabela 3. Este
avano relaciona-se, em parte, ao atual entendimento da etiologia
bioqumica e gentica de muitas doenas, o que tornou possvel buscar
substncias com ao direcionada para alvos especficos no metabolismo
celular. Dentre os antibiticos fngicos, apenas dez so produzidos
comercialmente e somente penicilinas, cefalosporinas,
griseofulvinas e os cidos clavulnico e fusdico so clinicamente
importantes.12
Tabela 3: Medicamentos produzidos com metablitos fngicos e
microrganismos produtores. PRODUTOS FNGICOS BIOATIVOS
APLICAOAnalgsico
PRODUTOPaxisterol Crisospermina Cefalosporina Penicilina
Sorrentanona Equinocandina cido zaragzico
FUNGOPenicillium sp. Apiocrea chrysosperma Cephalosporium
Penicillium, Aspergillus Penicillium chrysogenun Aspergillus
nidulans Mycelia sterilia, Leptodontidium elatius, Sporomiella
intermedia Phoma sp. Penicillium griseofurvum Penicilium
brevicompactum Penicillium citrinum Aspergillus terreus
Pestalotiopsis microspora Cladosporium cladosporioides Sporothrix
sp Penicillium multicolor Claviceps purprea Paecilomyces carneus
Tolypocladium inflatum Trichoderma polysporum Stachybotrys sp.
Pestalotiopsis sp. Aspergillus terreus Crucibilum sp.
Antibacteriano
Antifngico
Esqualestatinas Griseofulvina Compactina Mevilonina
Dihidromevilonina Taxol Calfostina C KS 501, KS 502
Controlador da sntese de Colesterol
Antitumoral
Antiviral Estimulador da contrao uterina Imunomodulador
Imunossupressor Tratamento de problemas cardiovasculares Profiltico
em odontologia Tratamento de diabetes Fonte: Pearce (1997)
Isocromofilonas Alcalides Ergo FR-901235 Ciclosporina A
Estachibocinas RES 1214-1/2 Mutastena Salfredinas
Tecnologia do DNA RecombinanteA Biotecnologia pode ser dividida
em dois perodos principais: o primeiro anterior ao uso de da
tecnologia do DNA recombinante e o segundo aps a sua implantao em
1982, a partir dos experimentos realizados em 1973 por Herbert
Boyer, Stanley Cohen e seus colaboradores. Enquanto at esta data as
bactrias podiam produzir apenas substncias codificadas no seu
prprio genoma, a partir da clulas de bactria modificadas
geneticamente por tcnicas de Biologia Molecular passaram a produzir
substncias codificadas por genes animais e vegetais. Assim, a
aprovao para uso clnico de insulina humana produzida pela bactria
Escherichia coli, h mais de vinte e cinco anos, definiu a
engenharia gentica como um instrumento poderoso para a modificao de
microrganismos, de forma a transform-los em unidades de produo de
compostos de interesse. O efeito da tecnologia do DNA recombinante
pode ser mais facilmente visualizado13
comparando-se o perfil dos principais produtos comercializados
antes e aps 1982. At essa data, o mercado mundial de produtos
dependentes de Biotecnologia concentrava-se em bebidas alcolicas,
queijos, antibiticos, etanol combustvel, xaropes com alto contedo
de frutose, aminocidos, levedura de panificao, esterides,
vitaminas, cido ctrico, enzimas, vacinas e gomas polissacardicas.
Assim, de um mercado total de cerca de 78 bilhes de dlares, 80%
relacionavam-se indstria de alimentos (Glazer & Nikaido, 1995).
Embora esta predominncia seja uma realidade at os dias de hoje,
muitos processos de produo passaram a usar microrganismos
modificados por tcnicas da Biologia Molecular com ganhos em
rendimento e/ou produtividade. O perfil dos produtos da
Biotecnologia Microbiana tambm sofreu uma modificao marcante aps
1982 devido ao aparecimento no mercado de uma sucesso de protenas e
peptdeos teraputicos, como o hormnio do crescimento humano,
interferons, fatores de coagulao, eritropoietina e soro albumina,
entre outros, produzidos por processos fermentativos. Como a obteno
e purificao destas protenas e peptdeos, em quantidades relevantes,
a partir de tecidos humanos ou animais era muito difcil, os genes
humanos que codificam para estes compostos foram clonados em E.
coli e estes agentes teraputicos passaram a ser produzidos em
grandes quantidades. A produo destas protenas teraputicas, por
processo fermentativo, depende inteiramente da tecnologia do DNA
recombinante. Embora os processos pioneiros de produo de protenas
heterlogas tenham utilizado E. coli, o posterior desenvolvimento de
tcnicas de Biologia Molecular para leveduras, baseadas em parte nos
protocolos utilizados para bactrias, permitiu a sua insero nestes
processos de produo. So considerados marcos da Biologia Molecular
de leveduras os trabalhos de Hinnen, Hicks e Fink, Transformation
of yeast e de Beggs Transformation of yeast by a replicating hybrid
plasmid, ambos publicados em 1978. A partir da, as leveduras
Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, consideradas como GRAS
(Generally Regarded as Safe) pelo Food and Drug Administration dos
EUA, tm sido empregadas na produo de protenas heterlogas,
competindo atualmente com as bactrias pela liderana nesta rea. As
vantagens apresentadas pelas leveduras relacionam-se com a sua
capacidade de realizar modificaes ps-traducionais, como
glicosilaes, que no apenas contribuem para que as protenas
heterlogas adquiram a conformao correta, como tambm para a sua
estabilidade, prolongando a meia vida enquanto agente teraputico.
Alm disso, diferentemente das bactrias, que precisam ser rompidas
para a obteno da protena de interesse, as clulas de levedura so
capazes de secretar as protenas recombinantes, facilitando as
etapas subseqentes de purificao. Assim, a partir da comercializao
em 1986 pela companhia Merck, da vacina para uso humano Recombivax
contra hepatite B, vrias outras protenas teraputicas heterlogas
produzidas por S. cerevisiae, como a insulina, produzida pela
Novo-Nordisk, passaram a ser comercializadas. O uso da tecnologia
do DNA recombinante em leveduras para a produo de protenas
teraputicas uma rea em franca expanso, sendo atualmente estudado
tambm em Kluveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe,
Schwanniomyces occidentalis e Yarrowia lipolytica. Neste contexto,
tm se destacado as leveduras metilotrficas facultativas Candida
boidinii, Hansenula polymorpha, Pichia methanolica e principalmente
Pichia pastoris (Walker, 1998).14
Como a P. pastoris pode ser facilmente manipulada para produzir
protenas intracelulares ou excretadas em altos nveis, mais de 400
protenas, da endostatina humana protena da seda de aranhas, foram
expressas nesta levedura, que tambm capaz de processar a protena
heterloga de forma semelhante de eucariotos superiores, realizando
reaes de glicosilao, protelise e formao de pontes de enxofre. Os
altos nveis de produo de protenas heterlogas devem-se utilizao do
promotor do gene da lcool oxidase I (AOX1), eficiente e
especificamente regulado, para ativar a expresso do gene de
interesse. O promotor do gene AOX1 fortemente reprimido em clulas
crescendo em glicose ou na maioria das outras fontes de carbono,
mas aumenta a expresso do gene de interesse em torno de 1.000 vezes
quando as clulas so transferidas para metanol. Adicionalmente, como
P. pastoris uma levedura que preferencialmente respira em lugar de
fermentar, no produz etanol e cido actico, cuja toxicidade no meio
de cultivo impede fermentaes com altas densidades celulares,
desejveis para aumentar a concentrao da protena de interesse.
Fermentaes com Pichia podem resultar em concentraes de protena
heterloga que variam de 15 mg/L, no caso da antitrombina III
humana, at 5 g/L para o caso da gelatina sinttica, passando, por
exemplo, por valores de 1,5 g/L para a insulina humana (Cereghino
et al., 2002). Embora a maioria das enzimas industriais seja
extracelular e produzida por fungos e bactrias, a tecnologia do DNA
recombinante vem recebendo uma ateno crescente para a produo de
biocatalisadores, tendo especial importncia a expresso heterloga em
leveduras metilotrficas dos gneros Pichia, Candida e Hansenula.
Muitos genes que codificam para a sntese de enzimas humanas
(glutamato descarboxilase e h-lipase), vegetais (glicolato oxidase
de espinafre e malato desidrogenase de melo) e microbianas
(dipeptil-peptidase, glicose-oxidase e fitase de Aspergillus,
glicoamilase de Rhizopus, 1,2-manosiltransferase, adenilato
quinase, invertase e catalase de Saccharomyces), j foram expressas
nestas leveduras, indicando a possibilidade de uma acentuada
diversificao do uso industrial de biocatalisadores. Abrindo ainda
mais o leque de possibilidades do uso de enzimas, existem
biocatalisadores produzidas por microrganismos extremoflicos do
grupo Archea, que so naturalmente estveis em condies extremas de
temperatura, pH e salinidade. Devido sua atividade nestas condies,
o potencial industrial das extremozimas muito grande. A Taq
polimerase de Thermus aquaticus e Puf polimerase de Pyrococcus
furiosus apresentam atividade 950C e 1000C, respectivamente, sendo
utilizadas nos procedimentos de PCR (polymerase chain reaction)
(Atlas, 1997; Gellissen, 2000 e Stetter, 1999). A Tabela 4 fornece
outros exemplos de substncias produzidas por espcies microbianas
naturalmente ocorrentes e recombinantes, agentes dos processos de
biotransformao.
15
Tabela 4: Espcies microbianas usadas na manufatura de produtos
comerciais.
Produtos qumicos industriais Saccharomyces cerevisiae etanol (de
sacarose e glicose) Kluyveromyces fragilis etanol (de lactose)
Clostridium acetobulylicum acetona e butanol Aspergillus niger cido
ctrico Amino cidos e nucleotdeos flavorizantes Corynebacterium
glutamicum L-lisina Corynebacterium glutamicum Vitaminas Ashbya
gossypii Eremothecium ashbyii Pseudomonas denitrificans
Propionibacterium shermanii Enzimas Aspergillus oryzae Aspergillus
niger Trichoderma reesii Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces
fragilis Candida lipolytica Asperillus niger Bacillus sp.
Polissacardeos Leuconostoc mesenteroides Xantomonas campestris
Vacinas Corynebacterium diphtheriae Saccharomyces cerevisiae
recombinante Produtos farmacuticos Penicillium chrysogenum
Cephalosporium acremonium Streptomyces sp. cido 5 inosnico e cido 5
guanilnico riboflavina riboflavina vitamina B12 vitamina B12
amilases glucoamilase celulases invertase lactase lipase pectinases
e proteases proteases dextrana goma xantana difiteria hepatite
B
Bacillus brevis Bacillus licheniformis Bacillus polymyxa
Rhizopus nigricans Arthrobacter simplex Escherichia coli
recombinante Saccharomyces cerevisiae recombinante16
penicilinas cefalosporinas anfotericina B; kanamicinas;
neomicinas, estreptomicinas, tetraciclinas; cido clavulnico etc.
gramicidina S bacitracina polimixina B transformao de esterides
transformao de esterides insulina; hormnios de crescimento,
interferons insulina
2. BioprocessosOs processos levados a cabo por agentes biolgicos
so denominados de Bioprocessos e definidos como um conjunto de
operaes que efetuam o tratamento da matria-prima/resduo, o preparo
dos meios, a esterilizao (quando o processo demandar) e a
transformao do substrato em produto(s) por rota bioqumica, seguida
de processos de separao e purificao de produto(s). So consideradas
expresses sinonmias: processos fermentativos com microrganismos
naturalmente ocorrentes ou recombinantes, processos biotecnolgicos,
processos com clulas animais ou vegetais, processos enzimticos ou
os tratamentos biolgicos de resduos e efluentes. A distino entre
Bioprocessos e Processos Qumicos est calcada na natureza dos
catalisadores utilizados em suas reaes. Os Bioprocessos so
conduzidos mediante ao de agentes biolgicos, sendo, portanto, as
transformaes catalisadas enzimaticamente. A Tabela 5 mostra as
principais caractersticas de Bioprocessos e as compara com as dos
Processos Qumicos. Bioprocessos conduzidos por microrganismos,
tradicionalmente conhecidos como processos fermentativos, so
importantes fontes de produtos biolgicos usados nas indstrias
farmacutica, qumica e alimentcia. Na ltima dcada observou-se um
aumento expressivo na quantidade de bioprodutos comerciais,
especialmente metablitos secundrios e protenas teraputicas
produzidas com tecnologia de DNA recombinante. Verificaram-se,
ainda, significativas mudanas na configurao de biorreatores,
visando melhoria de seu desempenho e assegurar operaes com maior
segurana. Tabela 5: Bioprocessos versus Processos Qumicos.
Bioprocessos Decorrentes de atividade biolgica Catalisadores de
alta especificidade Condies brandas de T, P e pH Maiores volumes
Podem requerer esterilidade Processos Qumicos Decorrentes de reaes
qumicas Catalisadores no especficos Condies drsticas de T, P e pH
Menores volumes No requerem esterilidade
Em que pesem as complexidades e particularidades dos
Bioprocessos, podemos dividi-los em trs estgios (Figura 2). A etapa
que antecede a transformao denominada de montante (upstream),
seguida da etapa de transformao propriamente dita e, finalmente, a
etapa de jusante (downstream). H autores que incluem a transformao
na etapa de montante. No entanto, por envolverem diferentes
procedimentos, somos pela diviso de um Bioprocesso em trs etapas e
no em duas.17
Tratamento da matria-prima Preparo de meio; Esterilizao upstream
process
BIORREATORFenmenos qumicos
Meio de cultivoFenmenos fsicos Agente biolgico: clulas
microbianas, animais, vegetais ou enzimas
Fenmenos biolgicos
CONDIES AMBIENTAIS TIMAS
Separao de clulas Separao/purificao de produto downstream
process
Figura 2: Etapas fundamentais de um tpico Bioprocesso. A Figura
3 apresenta um esquema geral de um Bioprocesso tpico, ressaltando
que a forma de conduo do bioprocesso, a configurao do biorreator,
assim como a definio das etapas de recuperao do produto tambm se
constituem em aspectos importantes para se garantir sucesso na
operao destes processos. Estas etapas sero descritas posteriormente
com maiores detalhes. Atualmente, nfase dada ao desenvolvimento de
Bioprocessos que no sejam apenas cost/effective, mas que tambm
atendam s exigncias crescentes de confiabilidade e
reprodutibilidade, o que vem aumentando a necessidade de melhoria
no monitoramento e controle de tais processos. Algumas transformaes
microbianas, analogamente s reaes qumicas, atingem rendimentos
prximos ao mximo estequiomtrico (produtos do metabolismo primrio),
embora apresentando taxas globais de produo baixas. Outras, como as
do metabolismo secundrio, resultam em baixos valores de rendimento
e produtividade, havendo um enorme campo para avanos em ambos os
casos. Os progressos sero alcanados atravs de uma maior compreenso
sobre a fisiologia celular e da interao da clula com o ambiente
qumico e fsico no biorreator. esta combinao, este binmio: clula (ou
enzima)/meio ambiente (ou condies reacionais), que define o xito de
um Bioprocesso.18
TRATAMENTO DA MATRIA PRIMA
PREPARO DO MEIO
EFLUENTE/ RESDUO
TRATAMENTO/ APROVEITAMENTO
ESTERILIZAO
BIORREATOR DE PRODUOMEIO ISENTO DE CLULAS
BIORREATOR DE PROPAGAO
SEPARAO DE CLULAS
INOCULAO FILTRAO DO AR BIOMASSA BANCO DE CLULAS AERAO ROMPIMENTO
CELULAR BIOMOLCULA COM ALTO GRAU DE PUREZA BIOMOLCULA COM ALTO GRAU
DE PUREZA PURIFICAO DA BIOMOLCULA EXTRACELULAR
PURIFICAO DA BIOMOLCULA INTRACELULAR
EFLUENTE/ RESDUO
TRATAMENTO / APROVEITAMENTO
EFLUENTE/ RESDUO
Figura 3: Esquema simplificado de um tpico Bioprocesso. Mais
recentemente, o escopo da tecnologia de processos fermentativos
ampliouse para incluir o cultivo de clulas animais. O cultivo
destes agentes biolgicos pode ser adaptado a uma cultura em
suspenso e, portanto, uma abordagem similar aplicada ao
desenvolvimento/melhoramento de processos fermentativos
tradicionais pode ser adotada ao cultivo de clulas animais.
Ressalta-se, no entanto, que o fato das clulas animais serem
maiores e mais frgeis do que clulas microbianas e mais exigentes
impem que tais processos devam ser desenvolvidos e conduzidos com
grande conhecimento sobre a fisiologia e morfologia destes agentes
biolgicos, bem como sobre as caractersticas hidrodinmicas do meio,
condies de aerao no biorreator e suas relaes com a atividade e
viabilidade celular.19
A seguir abordar-se-o os principais aspectos de um bioprocesso,
descrevendo caractersticas do agente biolgico, matrias-primas,
preparo do(s) meio(s), biorreator(es) e separao e purificao de
produto(s).
3. Agente Biolgico: CaractersticasO agente biolgico deve ser
selecionado, quando se tenciona transferir o bioprocesso para a
escala industrial, em funo das seguintes propriedades: elevada
atividade, ou seja, ser capaz de converter rapidamente o substrato
em produto com altos rendimentos, conduzindo a altos valores de
produtividade; estabilidade sob condies ambientais extremas
(elevada presso osmtica do meio, elevada temperatura, elevada fora
inica), devendo, ainda, ser tolerante e resistente a substncias
txicas, que podem ser geradas no processo de tratamento da
matria-prima ou encontradas em resduos e efluentes. Tcnicas da
Biologia Molecular aplicada1 e da Engenharia Metablica2 vm sendo
utilizadas para se maximizar essas propriedades desejveis em um
agente biolgico. importante ressaltar, que estas tcnicas devem ser
empregadas, quando necessrias, para maximizar o potencial produtor
dos agentes biolgicos responsveis pelas transformaes. A histria da
produo de penicilina um clssico exemplo do impacto de manipulaes
genticas associadas ao desenvolvimento de meios para melhoria do
processo. A combinao de tcnicas de mutao com otimizao do processo
fermentativo, resultou em um aumento no rendimento em penicilina da
ordem de trs vezes em magnitude (de 0,06 a 26 g/L). Portanto,
conhecer as caractersticas/propriedades desses biocatalisadores
(bem como melhor-las) levar a inmeras vantagens no desenvolvimento
de Bioprocessos industriais. Quando Bioprocessos so realizados por
clulas vivas, uma vez definido o produto ou a atividade de
interesse, a prxima etapa deve envolver uma pesquisa na literatura
para identificar agentes biolgicos portadores da caracterstica
desejada ou com potencial de possu-la, seguida da aquisio de
linhagens arquivadas em colees de cultura e/ou pelo seu isolamento
de amostras naturais, seguido de procedimentos de seleo e
melhoramento de linhagens produtoras. No cultivo de clulas
microbianas, animais e vegetais em laboratrio necessrio, para se
conhecer suas caractersticas/propriedades, determinar seu
crescimento, bem como monitorar suas converses. Uma variedade de
nutrientes utilizada para os fins acima referidos, incluindo-se
fonte de carbono, nitrognio, enxofre, fsforo, oxignio, vitaminas e
sais minerais. Esses agentes biolgicos, particularmente
microrganismos utilizados em processos industriais, devem ser
adequadamente preservados e conservados
1
Biologia Molecular aplicada: Ramo da Biologia que estuda a
origem, transformao e interao dos genes e seus produtos de expresso
no indivduo, populao ou espcie, possibilitando o controle a nvel
gentico, a construo de agentes biolgicos timos e combinaes timas
clula-biorreator.
2 Engenharia Metablica: combinao de mtodos analticos e mtodos
matemticos para quantificar fluxos in vivo com o auxlio de tcnicas
da Biologia molecular, objetivando programar modificaes genticas
dirigidas a fim de melhorar propriedades celulares.
20
como cultura pura. Atravs de diferentes tcnicas possvel manter
todas as caractersticas da populao microbiana de interesse e, dessa
forma, sempre que uma nova produo iniciada a qualidade do produto
tambm mantida. Assim, a manuteno e a preservao de microrganismos so
etapas de extrema importncia para assegurar a sua viabilidade e
atividade, bem como prevenir mudanas genticas que podem levar reduo
ou perda das propriedades fenotpicas desejadas. Tcnicas de manuteno
e preservao de microrganismos incluem: repiques peridicos,
conservao em parafina, em glicerol, liofilizao, criopreservao etc.
Estas tcnicas esto amplamente descritas na literatura (ver
referncias bibliogrficas recomendadas). Aps procedimento de
inoculao, a clula desenvolve seu metabolismo, a fim de produzir
energia para suportar suas reaes biossintticas e de manuteno
energtica. As molculas-combustveis (carbohidratos, lipdios,
protenas) utilizadas pela clula contm elevado nvel de energia
qumica, devido ao seu alto grau de ordem estrutural, apresentando,
relativamente, baixa entropia. Durante o catabolismo, essas
substncias so degradadas a molculas menores, como dixido de
carbono, gua, lcoois etc. Como resultado dessa transformao, a
molcula-combustvel sofre uma perda do seu contedo de energia livre
(forma de energia capaz de realizar trabalho a temperatura e presso
constantes). A energia livre liberada durante as reaes do
catabolismo, e por isso chamadas de exoergnicas, conservada na
forma de energia qumica nas ligaes covalentes de certos compostos,
como o ATP. Os processos biossintticos (anabolismo), transporte
ativo atravs da membrana e mobilidade celular envolvem reaes
endoergnicas (carentes de energia). As clulas tm suas necessidades
atendidas atravs da energia produzida durante o catabolismo (Figura
4). Nutrientes Produtos Energia Crescimento ANABOLISMO (Biossntese)
CATABOLISMOComponentes(Degradao) Celulares
Energia Movimento, Transporte, etc.
Fonte de Energia Figura 4: Esquema simplificado do metabolismo
celular. Muitas clulas vivas necessitam de oxignio para manuteno de
seu metabolismo. Em Bioprocessos conduzidos com microrganismos
aerbios, o oxignio suprido ao biorreator, via de regra, com bolhas
de ar, atravs de um compressor, como ser visto mais adiante. J em
Bioprocessos anaerbicos, os microrganismos obtm o oxignio metablico
atravs de substncias que contm21
oxignio ligado molecularmente. Nos primeiros, o adequado
suprimento de oxignio para atender a demanda da clula imperativo,
assim como a manuteno de condies anaerbicas estritas no segundo
caso. Se essas exigncias no forem atendidas o processo encontra-se
com seu potencial limitado, podendo haver desvios no metabolismo
celular ou mesmo sua interrupo, com a conseqente perda da
viabilidade celular. Dentro da concepo de processo integrado, a
associao de determinadas caractersticas do agente biolgico (clulas
ou enzimas), bem como das particularidades do sistema reacional,
com os processos de downstream tem sido tambm uma tendncia no
desenvolvimento e melhoria da operacionalidade de Bioprocessos.
Assim, se o agente biolgico do processo for um microrganismo
portador de propriedades agregativas (floculao), poder-se-o
suprimir equipamentos onerosos de separao de clulas, e utilizar
novas configuraes de biorreatores mais compactos e menos intensivos
em energia, tornando o processo, conseqentemente, mais econmico.
Associaes de sistemas reacionais com separao simultnea de
produto(s) podem, tambm, ser desenvolvidas (imobilizao de enzimas
em suportes de colunas cromatogrficas, sistemas de fermentao
acoplados a mdulos de membrana e outros destilao a vcuo), com os
conseqentes benefcios tcnicos e econmicos para a operao e a
viabilidade dos Bioprocessos.
4. Nutrio dos MicrorganismosAs necessidades nutricionais dos
microrganismos so diversas, uma vez que estes apresentam diferenas
inerentes na sua capacidade de sintetizar os constituintes
celulares a partir de nutrientes simples. A demanda por gua, fontes
de energia, carbono, nitrognio e elementos minerais, assim como o
acesso/utilizao de oxignio, entretanto, comum a todos os
microrganismos. 4.1. Fontes de Energia: De acordo com a forma pela
qual os microrganismos assimilam energia, eles podem ser
classificados em: Fototrficos: possuem pigmentos fotossintticos que
permitem a utilizao da luz como fonte de energia. Ex.: algas e
bactrias fotossintetisantes. Quimiolitotrficos: obtm energia a
partir da oxidao de um substrato inorgnico, geralmente especfico
para o microrganismo em particular, como hidrognio, enxfre, amnia,
nitritos e sais ferrosos. Ex.: bactrias dos gneros Thiobacillus,
Nitrosomonas, Nitrobacter, Hydrogenomonas e Desulphovibrio.
Quimiorganotrficos: obtm energia a partir do catabolismo de
substratos orgnicos, acares em particular. A este grupo pertence a
grande maioria dos microrganismos utilizados industrialmente
(Madigan et al., 2000). 4.2. Fontes de Carbono: Uma clula tpica
contm cerca de 50% de sua massa seca em carbono. Este elemento
necessrio para a biossntese de diversos constituintes celulares,
como carboidratos, protenas, lipdeos, cidos nuclicos etc. A forma
de sua utilizao est intimamente relacionada quela que cada
microrganismo em particular emprega para seu suprimento de energia.
Organismos22
quimiorganotrficos satisfazem a maior parte de suas necessidades
de carbono pela incorporao de metablitos obtidos pela degradao de
substratos orgnicos, os quais tambm fornecem energia. Os
autotrficos, por outro lado, so capazes de induzir a fotlise da
gua, que permite a fixao de dixido de carbono e sua utilizao como
nica fonte de carbono. Desta forma, o potencial para utilizar
fontes de carbono para o metabolismo varia enormemente entre os
microrganismos. Desde os chamados compostos C1 (CO, CO2,
formaldedo, metanol, metilamina), at macromolculas complexas
(glicognio, amido, protenas, celulose, cidos nuclicos),
praticamente todos os compostos orgnicos da natureza podem ser
utilizados como fonte de carbono e/ou energia por microrganismos,
desde que estes possuam os sistemas enzimticos e de transporte
adequados a cada fonte. Compostos orgnicos que contm carbono e
nitrognio, tais como aminocidos e protenas, podem servir tanto como
fonte de carbono, como de nitrognio. As macromolculas so
inicialmente convertidas extracelularmente a subunidades menores,
oligmeros ou monmeros, por enzimas despolimerizantes. Caminhos
metablicos perifricos so, ento, utilizados para transformar estes
compostos em metablitos capazes de ser catabolizados por vias
metablicas centrais. Os di e oligossacardeos de baixas massas
moleculares (sacarose, maltose e outros), assim como oligopeptdeos
e oligonucleotdeos podem ser hidrolisados extracelularmente ou
primeiramente transportados para o interior da clula e ento
hidrolisados (Krmer & Sprenger, 1993). Os carboidratos so as
principais fontes de carbono e energia para os microrganismos,
sendo a glicose a mais fcil e amplamente utilizada, seguida por
frutose, manose e galactose (Gadd, 1988). 4.3. Fontes de Nitrognio:
O nitrognio um constituinte essencial s clulas, uma vez que
necessrio formao de aminocidos e cidos nuclicos. Seu teor na clula
pode atingir at 15% em massa seca. Os microrganismos apresentam
grande diversidade na assimilao de fontes de nitrognio. Muitos so
autotrficos para nitrognio, sendo capazes de utilizar nitrato,
amnio e, algumas vezes, nitrognio gasoso como nica fonte de
nitrognio. Outros, entretanto, necessitam do suprimento deste
elemento sob a forma de aminocidos ou de bases purnicas e
pirimidnicas. Os microrganismos que requerem aminocidos podem ser
nutricionalmente deficientes por incapacidade de sintetizar ou o
grupamento amino ou certos aminocidos especficos. As necessidades
do primeiro grupo podem ser supridas pelo fornecimento de qualquer
aminocido como fonte de nitrognio. Os ltimos, entretanto, requerem
a proviso dos aminocidos especficos (Rhodes & Fletcher, 1963;
Madigan et al., 2000). 4.4. Fontes de Minerais: Os microrganismos
necessitam, para suas funes estruturais e fisiolgicas, de
hidrognio, oxignio, fsforo, enxfre, potssio, clcio, magnsio, sdio,
ferro e, em alguns casos, cloro. Em adio, requerem elementos-traos,
os quais desempenham importante papel como constituintes de enzimas
e coenzimas. Estes ltimos incluem mangans, cobre, zinco, molibdnio,
cromo,23
nquel, cobalto e boro e so, em geral, necessrios em quantidades
relativamente baixas (Rhodes & Fletcher, 1963; Madigan et al.,
2000). Por sua vez, a gua essencial para a ao enzimtica, dissoluo
de materiais orgnicos e inorgnicos e como reagente em muitos
processos metablicos. Seu teor nas clulas situa-se na faixa de
70-90%. Os nutrientes inorgnicos podem agir de quatro formas no
interior da clula: entrar no metabolismo levando sntese de
compostos necessrios ao funcionamento da clula; estimular o
metabolismo como co-fator para reaes enzimticas; inibir o
metabolismo e, finalmente, contribuir para as propriedades osmticas
(Jennings, 1988). 4.5. Fatores de Crescimento: Muitos
microrganismos so incapazes de sintetizar certos aminocidos,
substncias orgnicas simples e complexas ou vitaminas, os quais so
constituintes ou precursores de enzimas e coenzimas. Essas
substncias devem ser supridas ao meio de cultura sempre que
necessrio (Rhodes & Fletcher, 1963; Madigan et al., 2000).
5. Matrias-Primas GlicdicasA viabilidade tcnica, os balanos
mssicos e energticos e a economicidade so aspectos relevantes que
devem ser considerados na escolha da matria-prima. Em geral, esta
deve apresentar as seguintes caractersticas: composio adequada ao
crescimento do agente biolgico e formao do produto de interesse;
baixo custo de obteno, beneficiamento, transporte e estocagem;
elevada disponibilidade e facilidade de padronizao dos componentes;
no contribuir para dificultar os processos de separao do
produto.
Uma grande variedade de matrias-primas, geralmente provenientes
da agroindstria, utilizada como fonte(s) de
substrato/carbono/energia e outros nutrientes. De uma forma geral,
as matrias-primas para Bioprocessos podem ser agrupadas em funo da
estrutura e complexidade molecular dos substratos3. Em algumas, os
substratos encontram-se na forma polimrica, e sua hidrlise prvia
ser necessria, caso o agente biolgico no seja capaz de sintetizar
enzimas que catalisam a despolimerizao desses substratos. Assim,
estas matrias-primas podem conter: substratos solveis que podem ser
facilmente extrados e convertidos prontamente a produto(s), como
por exemplo: sacarose, glicose, frutose e lactose, de cana de acar,
beterraba, melao, soro de leite etc; polissacardeos insolveis, que
precisam de tratamento moderado para solubilizao e hidrlise, antes
da converso a produto(s) como por exemplo: amido de milho,
mandioca, trigo, cevada, batata etc; polissacardeos insolveis
altamente resistentes, que necessitam de prtratamento fsico,
seguido de hidrlise qumica ou enzimtica para produzirSubstrato o
reagente primrio do qual o produto obtido.
3
24
substratos na forma monomrica, que sero convertidos a
produto(s), como por exemplo: celulose e hemicelulose de
matrias-primas lignocelulsicas. A figura 5 apresenta a classificao
das matrias-primas em funo de seus respectivos substratos.AUCARADAS
AMILCEAS
LIGNOCELULSICAS
LACTOSE
SACAROSE
AMIDO
CELULOSE
HEMICELULOSE
GALACTOSE FRUTOSE
GLICOSE GALACTOSE
XILOSE
MANOSE
ARABINOSE
Figura 5: Principais matrias-primas glicdicas e seus substratos
correspondentes. Em determinados Bioprocessos, como a produo de
enzimas por fermentao no estado slido, pode-se prescindir de
pr-tratamentos, intensivos em energia e, consequentemente,
onerosos, j que muitos microrganismos tm a habilidade de atacar o
complexo contendo o(s) polissacardeo(s) e outras macromolculas na
sua forma ntegra, como fazem na natureza. Obviamente que, quando se
avalia a utilizao dessas matrias-primas, existem aspectos
particulares que devem ser levados em considerao, por estarem
relacionados viabilidade tcnica, a balanos mssicos e energticos e
economicidade do Bioprocesso em desenvolvimento, como mencionado
anteriomente. H que se ressaltar, que a matria-prima um dos
componentes mais relevantes nos custos de produo, havendo casos em
que pode representar at 75% dos custos totais, sendo esta uma das
razes pelo crescente interesse no aproveitamento de resduos
agro-industriais e florestais como matrias-primas para uma grande
variedade de bioconverses (Pereira Jr., 1991). O perfil das
matrias-primas tradicionalmente utilizadas nos processos
microbianos convencionais no sofreu significativas modificaes nos
ltimos cinqenta anos. A tecnologia do DNA recombinante, entretanto,
vem gradativamente aumentando a importncia de fontes de carbono
pouco utilizadas anteriormente. Como exemplo, a crescente utilizao
das leveduras metilotrficas Pichia pastoris e Hansenula polymorpha,
para a produo de enzimas recombinantes preconiza o seu crescimento
inicial em fontes de carbono menos25
repressoras como o glicerol e a induo do gene de interesse com
metanol (Cereghino & Cregg, 2000; Gelissen, 2000).
6. Meios de CultivoOs meios de propagao e produo devem conter os
nutrientes (fonte de carbono/energia/substrato, fonte de nitrognio,
co-fatores4, precursores5 e elementos traos) em concentraes tais
que resultem em atividade mxima do agente biolgico, no sendo as
condies timas para o crescimento celular, necessariamente, as
mesmas para o processo produtivo. A escolha dos nutrientes
adequados gerao do produto de interesse est relacionada atividade
metablica desenvolvida pelo agente biolgico. Nesse ponto
destaca-se, ento, a importncia das informaes obtidas sobre as
exigncias nutricionais da populao microbiana envolvida no processo.
Buscamse, ento, as fontes adequadas que possuam os componentes
necessrios ao bom desempenho da clula. Assim, h que se fortificar a
matria-prima com componentes que faltam, retirar aqueles que
inibem, de modo a permitir uma rpida e eficiente converso do
substrato em produto com o rendimento desejado. evidente que quanto
maior o atendimento s exigncias nutricionais, mais apta estar o
clula viva a responder aos estmulos externos. Conseqentemente, mais
eficiente ser a converso do produto de interesse e maior a
produtividade. Satisfazer as exigncias nutricionais das clulas ou
compor adequadamente o meio de cultivo em laboratrio, cujas
dimenses dos biorreatores so pequenas, pode ser fcil, empregando-se
nutrientes puros e caros. No entanto, para compor o meio industrial
do Bioprocesso, alguns nutrientes devero ser selecionados de acordo
com suas caractersticas no s nutricionais, mas tambm econmicas, no
podendo ser esquecidas as particularidades inerentes ao agente da
transformao, quanto ao que ser aproveitado para suas reaes
metablicas ou a algum efeito de inibio sobre essas reaes ou mesmo
sobre a sntese do produto final. A escolha da fonte de carbono
muito importante devido ao fato de a sntese de diversas biomolculas
estar sujeita represso catablica6. A glicose, por exemplo, apesar
de ser, em geral, excelente fonte para o crescimento celular, tem
sido reportada como repressora para a sntese de diversas
substncias, em particular na produo de enzimas e antibiticos
(Lambert & Meers, 1983).4 Cofatores: so componentes essenciais,
orgnicos ou inorgnicos, necessrios em pequenas quantidades para a
atividade mxima dos sistemas enzimticos. Ex: metais, vitaminas e
substncias qumicas complexas. 5
Precursor: um reagente especfico, cuja adio ao meio resulta na
incorporao de um determinado grupo estrutural molcula do produto.
No obtenvel pela reao de fermentao, tendo que ser fornecido
pr-formado. Ex: cido fenil-actico (produo de penicilina) e on
cobalto na produo de cianocobalamina (vitamina B12).
6
Represso catablica: sistema coordenado que determina preferncia
por glicose, inibindo a expresso de perons que codificam enzimas de
rotas metablicas alternativas. A represso catablica resulta da
reduo nos nveis de cAMP na clula pela presena de glicose,
ocasionando na inatividade de CAP (catabolic activator
protein).
26
Da mesma forma, a fonte de nitrognio deve ser escolhida com
bastante critrio. conhecido que fontes de nitrognio chamadas de
preferenciais, ricas ou de fcil metabolismo, como o on amnio, a
glutamina, a asparagina e a mistura de aminocidos e peptdeos
presentes na peptona e outros concentrados proticos comerciais, so
repressoras da produo de diversas enzimas. Ao contrrio, prolina e
uria, ornitina e alantoina, entre outros, denominadas fontes no
preferenciais, pobres ou de assimilao mais lenta, so fontes de
nitrognio no repressoras e, portanto, o seu uso em geral favorece a
produo de biomolculas sensveis represso por nitrognio (Adrio, 2003;
Walker, 1998; Magasanik & Kaiser, 2002). Entre as fontes de
nitrognio inorgnicas, o sulfato de amnio o sal mais utilizado
devido ao seu baixo custo, sendo tambm empregado o nitrato de sdio.
Adicionalmente, existe uma grande disponibilidade de fontes de
nitrognio orgnico de grande aplicao em Bioprocessos industriais,
como a uria. As principais fontes de nitrognio complexas empregadas
so: extrato de levedura (rico em vitaminas do complexo B e
aminocidos); licor da macerao do milho (subproduto da
industrializao do milho, fonte bem balanceada em carbono,
nitrognio, enxofre e sais minerais, contendo ainda vitaminas, como
riboflavina, niacina, cido pantotnico, biotina e piridoxina);
farinha de soja (resduo da indstria de produo de leo de soja, rico
em nitrognio, o qual , entretanto, mais complexo e de mais difcil
assimilao do que o nitrognio do licor da macerao do milho)
(European Comission, 2002). O valor do pH do meio de cultura
parmetro de fundamental importncia e tambm deve ser otimizado, de
forma a proporcionar um bom crescimento celular e elevados
rendimentos em produto. H que se ressaltar que quando o agente
biolgico for enzimas, ou mesmo quando estas biomolculas so os
produtos do Bioprocesso, a atividade e a estabilidade enzimticas so
fortemente dependentes da fora inica do meio, temperatura, pH e da
relao entre a concentrao de substrato e de enzima. Estas variveis
bsicas influenciam o desempenho cataltico das enzimas por afetarem
suas conformaes, estejam elas livres ou imobilizadas. Estudos devem
ser conduzidos previamente a fim de se eleger as condies timas para
a catlise enzimtica. Os meios de cultivo podem ser complexos ou
quimicamente definidos. Os meios complexos so formulados com base
em subprodutos industriais e extratos naturais, tais como: melao,
milhocina, extrato de levedura e outros. Sua composio complexa e
varivel e contm vrias fontes de cada elemento. Estes meios podem
requerer suplementao com compostos que proporcionem quantidades
adicionais de alguns elementos, tais como: N, Mg e P. Os meios
complexos so extensamente utilizados em Microbiologia bsica
(taxionomia, fiosiologia e gentica), Microbiologia de guas e de
alimentos e em Fermentaes industriais. Exemplos de componentes de
meios complexos encontram-se na Tabela 6. Os meios quimicamente
definidos so formulados com compostos puros, tais como: glicose,
sulfato de amnio, fosfato mono ou di cido de potssio etc. Sua
composio qumica conhecida e reproduzvel, contendo fontes de cada
elemento e dos nutrientes essenciais requeridos. Estes meios so
usados preferencialmente em pesquisa e desenvolvimento de
Bioprocessos. Uma classe especial de meio quimicamente definido o
meio mnimo, que se pode definir como aquele formado por uma fonte
nica de cada elemento ou componente.27
Os meios complexos so adequados em nvel industrial por serem
mais baratos e porque, em certos casos, se obtm melhores
rendimentos e produtividades volumtricas. Isto se deve a uma
variedade de molculas orgnicas, em sua constituio, que evitam que a
clula necessite sintetiz-las a partir de glicose e compostos
inorgnicos. Por outro lado, os meios quimicamente definidos
permitem um melhor controle das condies ambientais para o
crescimento e para a produo, sendo fcil excluir substncias txicas
ou inibidoras e incluir precursores e/ou indutores nos nveis
adequados. Por esta razo, certas fermentaes que requerem um
controle estrito das condies ambientais, resultam mais produtivas
quando se utilizam meios quimicamente definidos. A Tabela 7 mostra,
a ttulo de exemplo, a composio de um meio quimicamente definido
para o cultivo de clulas de Saccharomyces cerevisiae. Tabela 6:
Exemplos de componentes de meios complexos industriais. Componente
Melao Milhocina Licor sulftico Soro/permeado de soro de leite
Vinhoto Farinha de soja e pescado Extrato de levedura Origem
Indstria aucareira Subproduto do processamento de milho Efluente da
indstria de polpa e papel Subproduto do processamento de queijo
Subproduto da produo de etanol Industrializao da soja e pescado
Indstria de levedura de panificao
Tabela 7: Meio quimicamente definido para o cultivo de clulas de
S. cerevisiae. Componente Glicose (NH4)2SO4 MgSO4.7H2O KH2PO4 NaCl
FeSO4.7H2O CuSO4.5H2O ZnSO4.7H2O CaCl2 CoCl2.6 H2O Concentrao (g/L)
18,0 3,2 0,39 0,68 0,008 0,002 0,001 0,003 0,028 0,0002
6.1. Otimizao do meio de cultivoA otimizao da composio do meio
de cultivo para obter-se mximo rendimento em produto no uma tarefa
fcil. Tradicionalmente, abordagens empricas tm sido adotadas, nas
quais os efeitos de componentes individuais do meio sobre o
rendimento em biomassa e produto so investigados em frascos cnicos
agitados. As fontes de carbono so examinadas primeiramente e,
posteriormente, as fontes de nitrognio, at que todas as combinaes
dos componentes do meio sejam estudadas, atingindo-se um meio de
composio otimizada. Normalmente, compostos repressores so
descartados e aqueles que estimulam ou induzem a sntese de enzimas
so mantidos. Ressalta-se que este28
procedimento envolve um grande nmero de experimentos e demanda
um tempo muito grande para se chegar a composio otimizada do meio,
sendo os constituintes investigados individualmente e, via de
regra, negligenciados os efeitos interativos entre os mesmos. Um
procedimento alternativo pode ser utilizado na otimizao de meios em
Bioprocessos, baseado em mtodos estatsticos que permitem otimizar
as concentraes dos componentes fundamentais do meio, levando-se em
considerao o grau de inter-relao entre eles (Demain & Solomon,
1986). Aps seleo dos principais componentes do meio que afetam o
rendimento em produto e a produtividade, procede-se a combinao dos
mesmos de acordo com uma metodologia estatstica (Planejamento
Fatorial), que permite o planejamento dos experimentos. Desta
forma, os efeitos de vrios componentes podem ser determinados
simultaneamente, com um nmero relativamente pequeno de
experimentos. O Planejamento Fatorial de experimentos baseia-se no
estudo de dois parmetros do processo. So eles os fatores e os
nveis. Fatores so as variveis do processo, como por exemplo, a
temperatura de crescimento de um microrganismo ou a concentrao de
determinado nutriente em um meio de cultivo. J os nveis so as
diferentes condies pesquisadas, geralmente so utilizados nveis
superiores, inferiores e centrais. Para um melhor entendimento,
imaginemos um Planejamento experimental envolvendo a temperatura de
crescimento de determinado microrganismo e a concentrao de um
nutriente em seu meio de cultivo. Podemos estabelecer para cada
fator estudado (temperatura e concentrao) 3 nveis de estudo (Tabela
8): Tabela 8: Definio de Fatores e Nveis para o Planejamento
Experimental. Nvel Central 35C 3%
Fator Temperatura de cultivo Concentrao de nutriente
Superior 37C 5%
Inferior 33C 1%
A representao de um planejamento fatorial nk, sendo n o nmero de
nveis e k o nmero de fatores. Utilizando os dados da tabela
anterior, temos que n = 3 e k = 2, ento o planejamento fatorial em
questo ter um total de 32 experimentos, ou seja, 9 condies
experimentais diferentes. Estas condies experimentais so
representadas por uma matriz de planejamento (Tabela 9), onde cada
nvel possui sua representao numrica: o superior representado pelo
valor +1, o central pelo valor 0 e o inferior pelo valor 1. Veja
que todas as condies possveis esto descritas na Tabela 9. Os
experimentos so ento realizados, tendo sido definida previamente a
varivel de resposta, geralmente, no caso de otimizao de
Bioprocesso, a concentrao do produto ou o fator de rendimento ou,
ainda, a produtividade volumtrica ou especfica. Aps a obteno dos
resultados de cada um dos experimentos relacionados, a anlise
estatstica destes dados pode ser realizada utilizando um software
apropriado, que fornecer valores crticos dos fatores, bem como a
sua significncia e grau de interao.
29
Tabela 9: Matriz de Planejamento Experimental. Experimento1 2 3
4 5 (C) 6 7 8 9
Temperatura de crescimento+1 (37C) +1 (37C) +1 (37C) 0 (35C) 0
(35C) 0 (35C) -1 (33C) -1 (33C) -1 (33C)
Concentrao de nutrientes+1 (5%) 0 (3%) -1 (1%) +1 (5%) 0 (3%) -1
(1%) +1 (5%) 0 (3%) -1 (1%)
Observe que nesta matriz um importante fator foi ignorado: o
tempo de cultivo do microrganismo. Caso utilizssemos tambm este
fator, teramos uma nova matriz com 33 experimentos, compreendendo
27 condies experimentais diferentes. importante comentar que
rplicas so muito importantes para o Planejamento experimental, pois
permitem que analisemos o erro intrnseco ao Bioprocesso, chamado de
erro experimental. O tipo de rplica mais importante a do ponto
central de experimentos, marcado com (C) na Tabela 9. Anlises
estatsticas demonstram que a utilizao de um nmero superior a 5
rplicas para o ponto central dispensa duplicatas dos outros pontos
experimentais.
6.2.
Formulao de meio de cultivo com base na composio centesimal de
microrganismos
Conhecendo-se a composio elementar da clula (Tabela 8), pode-se
determinar a sua frmula mnima e estimar estequiometricamente suas
necessidades nutricionais. Esta composio dependente do meio em que
o microrganismo foi cultivado. Para que o processo de reproduo
celular seja possvel, os requerimentos em matria, energia e
informao devero ser atendidos, respeitando-se os princpios de
conservao de massa e energia, de forma a possibilitar a construo de
uma nova clula igual a anterior (Figura 6).
matria
CLULA
energia
CLULA produto
informao
Figura 6: Requerimentos para o crescimento/multiplicao
celular.30
A informao para a construo de uma nova clula est contida no
material gentico do microrganismo e transmitida de gerao a gerao. A
matria deve ser fornecida atravs de componentes do meio de cultivo
e a energia obtida do catabolismo da fonte de carbono e energia, de
reaes de oxidao ou de radiao solar no caso de microrganismos
fotossintticos. As clulas so representadas com base em sua composio
elementar. Composies tpicas de bactrias, leveduras e fungos
filamentosos esto apresentadas na tabela a seguir. Os elementos
quantitativamente mais importantes so: carbono, hidrognio, oxignio
e nitrognio (90-92% do total da massa celular), o que justifica a
aproximao feita na equao estequiomtrica, descrita a seguir. De
grande importncia encontra-se um segundo grupo de elementos,
compostos por: Mg, P, S, Ca, Na e K, que devem ser fornecidos como
compostos aptos metabolizao pela clula. A fonte de carbono e
energia pode ser um carboidrato ou outro composto orgnico, ou mesmo
CO2, carbonato ou bicarbonato no caso de clulas quimioautotrficas e
fotossintticas. A fonte de nitrognio pode ser amnio, aminocidos,
protenas, uria, nitrato ou nitrognio molecular, sendo as duas
primeiras as mais comuns. O restante dos elementos suprido atravs
de sais inorgnicos. Devido a deficincias genticas, certas linhagens
requerem fatores de crescimento, tais como vitaminas, aminocidos e
nucleotdeos, como mencionado anteriormente. Tabela 10: Composio
centesimal de clulas microbianas. Fonte: Bailey & Ollis (1986).
ELEMENTOS Carbono Hidrognio Oxignio Nitrognio Magnsio Fsforo
Enxofre Clcio Potssio Ferro Outros COMPOSTOS Protenas Carboidratos
Lipdios c. Nuclicos Cinzas BACTRIA 46-52 8-12 18-24 10-14 0,1-0,5
2,0-3,0 0,1-1,0 0,01-1,0 1,0-4,5 0,02-0,2
