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Alexandre Schuler C C C R R R O O O M M M A A A T T T O O O G G G R R R A A A F F F I I I A A A A A A G G G Á Á Á S S S E E E A A A L L L Í Í Í Q Q Q U U U I I I D D D O O O (detectores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística) Décima Edição 2007

[apostila] cromatografia - ufpe.pdf

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Alexandre Schuler

CCCRRROOOMMMAAATTTOOOGGGRRRAAAFFFIIIAAA AAA GGGÁÁÁSSS EEE AAA LLLÍÍÍQQQUUUIIIDDDOOO

(detectores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística)

Décima Edição

2007

Alexandre Schuler Professor Adjunto 4

Departamento de Engenharia Química Universidade Federal de Pernambuco

CCCRRROOOMMMAAATTTOOOGGGRRRAAAFFFIIIAAA AAA GGGÁÁÁSSS EEE AAA LLLÍÍÍQQQUUUIIIDDDOOO

(detectores, aquisição de dados, validação e avaliação estatística)

Décima Edição

2007

Alexandre Schuler - Cromatografia

i

SUMÁRIO 1 - Introdução, 1 1.1. Histórico, 1 1.2. Classificação, 1 2 - Tipos de Processos Cromatográficos, 3 2.1. Cromatografia de adsorção, 3 2.2. Cromatografia de partição, 4 2.3. Distribuição em contracorrente, 6 2.4. Cromatografia em fase líquida, 7 2.5. Fatores que influem na separação, 8 2.6. Cromatografia em fase gasosa, 12 3 - Tratamento teórico da Cromatografia, 16 3.1. A equação de Van Deemter, 16 3.2. Fase estacionária, 16 3.3. Suporte, 17 3.4. Coluna, 18 3.5. Fase móvel, 18 4 - O Cromatógrafo, 20 4.1. O Cromatógrafo a Gás, 20 4.2. O Cromatógrafo a Líquido, 23 4.3. Detectores, 24 5 - Análise Qualitativa, 32 6 - Análise Quantitativa, 33 6.1. Introdução, 33 6.2. Medição de área, 33 6.3. Métodos de cálculo, 35 6.4. Seleção do melhor método de cálculo, 40 7. Otimização do processo analítico, 41 7.1. Parâmetros analíticos, 41

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ii

7.2. Projetando um método analítico, 43 7.3. Validação de um método analítico, 45 8. Técnicas adicionais de identificação, 52 8.1 Tempo de retenção e retenção relativa, 52 8.2. Índice de retenção, 52 8.3. Equivalência entre fases estacionárias, 53 Bibliografia, 54 Apêndice 1 (Túnel do Tempo), 55 Apêndice 2 (Características Básicas dos Detectores), 59 A2.1. Sensibilidade, 59 A2.2. Nível de ruído, 59 A2.3. Limite de Detecção, 59 A2.4. Faixa de Linearidade Dinâmica, 60 Apêndice 3 (Técnicas de introdução da amostra), 61 Apêndice 4 (Sistemas de aquisição de dados), 63 Apêndice 5 (O desenvolvimento cromatográfico), 64 Apêndice 6 (Outros detectores utilizados em Cromatografia), 66 Apêndice 7 (Estatística), 70 Apêndice 8 (Outros parâmetros cromatográficos), 100

Alexandre Schuler - Cromatografia

1 - INTRODUÇÃO 1.1. Histórico1 Cromatografia é um termo genérico, aplicado a um processo de separação físico-químico, o qual é baseado principalmente nos fenômenos de adsorção e partição. Este termo foi escolhido porque as primeiras separações foram realizadas com substâncias coloridas. Entretanto, o processo cromatográfico não é restrito a essa classe de substâncias, constituindo-se na atualidade no método mais eficiente de separação, com aplicações na Química Analítica Qualitativa e Quantitativa, para compostos orgânicos e inorgânicos, independentemente de seu estado físico. 1.2. Classificação Um processo cromatográfico envolve uma fase móvel e uma fase estacionária. A fase estacionária é um sólido ou um líquido (Figura 1.1). No segundo caso, este fica impregnado em um sólido (suporte) e o fenômeno mais atuante é a partição. No primeiro caso, tem predominância a adsorção. Assim, pode-se classificar a Cromatografia em dois tipos gerais: Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.

Figura 1.1 - O Processo Cromatográfico. A Fase Móvel transporta a amostra através da Fase Estacionária. A velocidade média das partículas da amostra depende da sua natureza. Desse modo, cada componente atingirá o final da coluna em um instante diferente.

A fase móvel pode ser um líquido ou um gás. No primeiro caso, denomina-se o processo de Cromatografia em Fase Líquida e no segundo caso de Cromatografia em Fase Gasosa, ou simplesmente Cromatografia a Líquido e Cromatografia a Gás. A Cromatografia pode ainda ser classificada em função da técnica empregada: � Cromatografia em Papel

� Cromatografia em Camada Delgada

� Cromatografia em Coluna Clássica

1 É sugerida a leitura do Apêndice 1 (Túnel do Tempo), para um breve histórico do desenvolvimento da Cromatografia.

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2

� Cromatografia em Fase Gasosa

� Cromatografia em Fase Líquida de Alto Desempenho

Esta última é mais conhecida pelas iniciais de seu nome em inglês (High Performance Liquid Chromatography - HPLC) e constituem-se variantes suas as seguintes técnicas:

• Cromatografia de Permeação∗ em Gel (GPC)

• Cromatografia de Troca Iônica (IEC)

GPC (do inglês Gel Permeation Chromatography) é empregada na análise de polímeros, enquanto a IEC (do inglês Ion Exchange Chromatography) é empregada na análise de íons (cátions e ânions).

∗ Na realidade, este termo é empregado quando a fase móvel é um solvente orgânico. Quando a fase móvel é água ou

solução aquosa, emprega-se o termo Cromatografia de Filtração em Gel. O termo Cromatografia por Exclusão de Tamanho (em inglês Size Exclusion Chromatography) é mais genérico e abrange as duas técnicas.

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3

2 - TIPOS DE PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS 2.1. Cromatografia de Adsorção Adsorção é um fenômeno físico-químico através do qual um sólido (adsorvente) fixa em sua superfície um líquido ou um gás, por meio de interações como as “forças de Van Der Waals”. Chama-se coeficiente de adsorção à relação

kN

Na

a

n=

onde Na e Nn são respectivamente o número de moles adsorvidos e não adsorvidos de uma determinada substância. Compostos diferentes possuem diferentes valores de ka, estes variando com a temperatura e com a natureza do adsorvente. Se uma mistura de vários componentes é forçada a passar através de um tubo contendo um adsorvente (coluna cromatográfica), cada componente necessitará de um intervalo de tempo diferente para transpor a coluna. Esse intervalo de tempo é denominado tempo de retenção (Tr). A Figura 2.1a ilustra um processo de Cromatografia por Adsorção. A substância mais fortemente adsorvida é mais dificilmente arrastada pela Fase Móvel.

a) Cromatografia de Adsorção b) Cromatografia de Partição

Figura 2.1 - Diferença entre Cromatografia de Adsorção e Cromatografia de Partição.

2.2. Cromatografia de Partição

Se uma substância é adicionada a um recipiente contendo dois líquidos não miscíveis, ela se dissolverá parcialmente em cada solvente, de modo a ser constante a relação C1

/ C2, onde C1 e C2 são as concentrações da substância em cada um dos dois líquidos. Denomina-se coeficiente de partição à relação

Alexandre Schuler - Cromatografia

4

kC

Cp =

1

2

Se m0 é a massa total da substância e m1 é a massa dissolvida no solvente 1, é possível escrever

10

2

1

1

2

10

11

)( mm

V

V

m

VmmV

mkp

−⋅=

−=

logo:

12

101 .

VkV

Vkmm

p

p

+= (eq. 1)

Se a substância estava inicialmente dissolvida no solvente 1, m1 é a massa que permanece neste solvente após adição do solvente 2, o qual extraiu a massa (m0 - m1). Se as duas fases forem separadas (com auxílio de um funil de separação, por exemplo), a adição de outra quantidade do solvente 2 vai extrair a massa (m1 - m2), onde

12

112 .

VkV

Vkmm

p

p

+= (eq. 2)

Substituindo na eq. 2 o valor de m1 (eq. 1), fica

m2 = mo [kpV1/(V2 + kpV1)]2 (eq. 3)

É possível generalizar a eq. 3 para

mn = mo [kpV1/(V2 + kpV1)]n (eq. 4)

que dá a massa mn que permanece no solvente 1 após n extrações com o solvente 2. Dá-se ao processo aqui descrito o nome de extração. Por outro lado, tratando-se de uma mistura de, por exemplo, 2 componentes (A e B), com pBpA k k ≠ , um dos componentes ficará preferencialmente no solvente 1 e o outro no solvente 2. Assim sendo, à medida que n cresce, cada fase ficará mais rica (mais pura) em um dos componentes. No caso anterior (extração), a porção de líquido 1 era sempre a mesma, renovando-se apenas o líquido 2. Agora, ambos são renovados. O Esquema 2.1, onde o líquido 1 é o superior, ilustra o processo, que pode ser visualizado a nível “molecular” na Figura 2.1.b. No exemplo, kA é maior que kB. Isto significa que o líquido 1 vai se enriquecendo de A e o líquido 2,

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5

relativamente, vai se enriquecendo de B, a cada etapa do processo. Os números da esquerda, em cada quadrícula 1, indicam a fração de A e os da direita indicam a fração de B. Do mesmo modo, os números superiores indicam a fração de A e de B no líquido 1 e os inferiores indicam a fração de A e de B no líquido 2. No exemplo, foi utilizada uma mistura com quantidades iguais de A e de B, cujos coeficientes de partição valem, respectivamente, 3/1 e 1/3. A partir dos valores de mAn e mBn, pode-se calcular a composição da mistura (ou o grau de pureza de cada componente) em cada solvente, após n etapas (n partições) 2.

Esquema 2.1 - Distribuição (partição) de duas substâncias (A e B), em dois líquidos (1 e 2) imiscíveis. Algumas frações se juntam por terem mesma composição.

A partição, como entendida neste segundo exemplo, descreve o processo cromatográfico. O número de “equilíbrios” (etapas) que ocorrem dentro de uma coluna (n) é conhecido como o “número de pratos teóricos”, prato teórico sendo um ponto de equilíbrio (entre uma fase e outra). A distância entre dois pontos de equilíbrio consecutivos chama-se “altura equivalente a um prato teórico” (H). Os parâmetros n e H serão novamente discutidos mais adiante. Observe-se, neste exemplo, que partindo de uma mistura contendo 50% de A e 50% de B, obtém-se, respectivamente, nas etapas 1, 2 e 3, os seguintes percentuais (em

1 Cada quadrícula corresponde a um frasco de extração (ex.: funil de separação). 2 No exemplo apresentado no esquema 2.1, as massas correspondentes a A e B, respectivamente, no solvente 1 do frasco

superior da ETAPA 3, são 0,422 g e 0,016 g, que correspondem a 96,35% de A e 3,65% de B.

ETAPA 1 ETAPA 2 ETAPA 3

27/64

1/64

9/64 3/64

9/16 1/16

3/16 3/16

A B

1 3/4 1/4

9/32 3/32

etc

2 1/4 3/4

3/32 9/32

3/16 3/16

1/16 9/16

3/64 9/64

1/64 27/64

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6

massa) de A, nas frações superiores (solvente 1): 75%, 90% e 96,4%. Como o coeficiente de partição de B é o inverso do coeficiente de partição de A, os correspondentes percentuais de B (nas frações inferiores, solvente 2) serão exatamente os mesmos. É possível inclusive calcular quantas etapas serão necessárias para obter-se, por exemplo, uma pureza igual ou maior a 99%, bastando aplicar a eq. 4. No caso, encontra-se n = 5. IMPORTANTE! Se kB também for maior que a unidade, a perda de B será muito grande e também a purificação de A será muito demorada (exigirá maior número de etapas). 2.3. Distribuição em contracorrente O procedimento descrito a seguir é um exemplo típico de extração líquido-líquido. Na seção anterior foi demonstrado que uma substância inicialmente dissolvida em um líquido 1 pode ser extraída por um líquido 2, desde que os dois líquidos sejam imiscíveis. Trata-se de uma operação que é feita manualmente, com auxílio de um funil de separação, e que pode ser repetida até a exaustão (literalmente!). O instrumento de Craig (ver Apêndice 1) é constituído de um conjunto de um grande número de tubos de distribuição de Craig, cada um contendo uma porção constante do líquido mais denso (em azul escuro na Figura 2.2), a um nível tal que não passe para a câmara D através de C. Os diversos tubos são fixados, na mesma posição, a um eixo (perpendicular ao papel, na figura). Adiciona-se então a amostra (contendo, por exemplo, duas substâncias, como exemplificado na seção anterior) e o líquido menos denso (em azul claro) ao primeiro tubo da seqüência (identificado com o no 1), estando os tubos na posição mostrada em (a). Por rotação desse eixo (cerca de 45o), num movimento de vai-e-vem, promove-se agitação da mistura (como se faria com um funil de separação) e em seguida deixa-se em repouso por alguns instantes, para separarem-se de novo as duas fases. Finalmente, gira-se 90o, de modo a colocar os tubos na posição (b). Nessa posição, o líquido menos denso flui através de C para a câmara D. Após alguns instantes, retorna-se à posição (a), quando então o líquido menos denso, através de E, passa para B do tubo seguinte, atingindo a câmara A. Então, começa outro ciclo. A fração Fm,n do soluto contido no m-ésimo tubo depois de n transferências é dada pela seguinte expansão binomial, onde kp é o coeficiente de distribuição, V1 é o volume do líquido menos denso e V2 é o volume do líquido mais denso:

1

2

np

mp

nm,V

V

1) k(

k

m)!-(nm!

n! F ⋅

+⋅=

. 2.4. Cromatografia em Fase Líquida O exemplo mais simples de cromatografia a líquido é a separação em uma camada delgada de sílica-gel depositada sobre uma placa de vidro (Cromatografia em Camada Delgada). A Figura 2.3 ilustra o processo.

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Figura 2.2 – Esquema do Aparelho de Craig para distribuição em contracorrente. O líquido ascende (por capilaridade) e arrasta seletivamente os componentes de uma mistura binária (A e B) colocada em 1 (ponto de aplicação). Quando o solvente se aproxima da outra extremidade da placa (2), esta é removida da cuba que contém o solvente e na qual estava parcialmente mergulhada, na posição vertical e a um nível abaixo do ponto de aplicação. As razões de frente, RfA = d1 / d3 e RfB = d2 / d3 são características de cada substância, dependendo da natureza da fase móvel e da fase estacionária. A Cromatografia em Camada Delgada é a mais empregada em Análise Qualitativa ou semi-Quantitativa. Em virtude da pequena quantidade de amostra utilizada, é menos indicada para fins preparativos, quando então se emprega a Cromatografia em Coluna Clássica. Neste segundo tipo de processo, a fase estacionária é colocada em um tubo de vidro (coluna cromatográfica) colocado na posição vertical. A coluna é dotada de uma torneira na extremidade inferior (Fig. 2.4), que é utilizada para controlar a vazão da fase móvel, que desce por gravidade.

Fig. 2.3 - Cromatografia em Camada Delgada. Neste exemplo, a amostra contém dois componentes, A e B, que são identificados pelos respectivos valores de Rf, por comparação com padrões puros. A figura da capa é uma reprodução fotográfica de uma CCD revelada1 com luz UV.

A necessidade de se controlar a vazão da fase móvel e a temperatura da coluna, além da

impossibilidade (naquela época - anos 50) de se bombear um líquido com fluxo constante e contínuo, levaram os projetistas a abandonar essa técnica, passando a utilizar um gás como fase móvel (1952).

1 Ver Seção 4.1.d.

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Figura 2.4

Cromatografia em Coluna

O ponto A’ indica o nível da fase estacionária e o ponto A indica o nível da fase móvel. A diferença (A’ – A) deve ser mínima, para evitar a diluição do material a ser cromatografado, o que resultaria em zonas (na Fig. 2.4, as faixas 1, 2 e 3) mais largas. Ao se fazer a eluição (passagem da fase móvel), os componentes afastam-se do ponto de aplicação (topo da coluna) a uma distância d tal que d/l = Rf (l é o comprimento da coluna), obtendo-se assim uma coluna desenvolvida. A partir daí, continuando-se a eluição, cada componente pode ser coletado isoladamente, quando atingir o final da coluna. Denomina-se Volume de Retenção (Vr) o volume de fase móvel necessário para a eluição completa de um componente. Desse modo, tem-se Vr = V1 / Rf, onde V1 é o volume ocupado pela fase móvel dentro da coluna. Finalmente, pode ser calculado o volume total de solvente necessário para a eluição completa de todos os componentes da amostra, que é essencialmente igual ao Vr do componente que sai por último (menor Rf). No Apêndice 4, são discutidos mais detalhes sobre o desenvolvimento da coluna.

2.5. Fatores que influem na separação Independentemente do processo envolvido na separação cromatográfica (adsorção ou partição), esta é função de uma série de fatores, a saber:

Natureza da fase estacionária Vazão da fase móvel Concentração da fase estacionária Temperatura Natureza da fase móvel Granulometria e geometria do suporte

A polaridade da fase estacionária é um fator importante a se considerar. Em princípio, quando se tem uma fase estacionária não polar, os diversos componentes da amostra eluem1 na ordem crescente de seus pontos de ebulição (Figura 2.5) e o processo assemelha-se bastante a uma destilação. Quando a fase estacionária apresenta alguma polaridade, essa ordem de eluição em função do ponto de ebulição fica alterada (Figura 2.6) e só é obedecida quando os componentes apresentam polaridade de mesma ordem de grandeza (componentes A-C e D-G da Figura 2.7). Em alguns casos, a diferença de polaridade pode ser equilibrada com a diferença de ponto de ebulição, fazendo com que dois componentes distintos eluam juntos (Figura 2.8). Nesses casos, outros fatores podem auxiliar na separação, como a ponte de hidrogênio entre os componentes D-G e a FE (Figura 2.7). A concentração da fase estacionária líquida também influi na separação, como pode ser observado na Figura 2.9. Aliás, com o uso, é normal diminuir a concentração, por arraste pela fase móvel, mesmo à temperatura ambiente, de modo que colunas com fase estacionária líquida possuem um tempo de vida útil finito. Este tempo de vida pode ser bastante 1 Eluição é o de transporte do analito promovido pela fase móvel ao longo de todo o sistema cromatográfico (placa ou coluna).

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curto, na medida em que a temperatura da análise se aproxima da temperatura limite, que por definição situa-se a 150oC abaixo da temperatura de ebulição da fase estacionária. Essa perda de fase estacionária também acontece em HPLC, apesar de quase nunca se aquecer a coluna, porque a imiscibilidade entre fase estacionária e fase móvel (agora um líquido) não é infinita. Atualmente, têm sido desenvolvidas fases quimicamente ligadas (ver Seção 3.2 - Fase Estacionária; p. 15).

FE: Esqualano (hidrocarboneto de baixíssima polaridade)

A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC)

FE: TCEP (tris cianoetoxipropano)

B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)

Figura 2.5 – Separação em função da diferença no ponto de ebulição

Figura 2.6 - Efeito da polaridade sobre a separação cromatográfica

Figura 2.7 – Efeito da ponte de hidrogênio sobre a separação cromatográfica (Dados da coluna: Fase estacionária diglicerol, 6 metros). Outro fator importante, principalmente em HPLC, é a polaridade da fase móvel. Aliás, esse é o principal recurso para implementar uma separação (ver Gradiente de Polaridade, na Seção 4.2; p. 24). Também a vazão da fase móvel é muito importante na separação. A Figura 2.10 ilustra a situação, que foi alvo de um estudo semi-teórico realizado por van Deemter (Capítulo 3). A temperatura (a que está submetida a coluna) é outro fator determinante na separação, particularmente em CFG, conforme resume o quadro anexo à Figura 2.11. Finalmente, a granulometria da fase estacionária sólida (ou do suporte sólido da fase estacionária líquida), conforme mostrado na Tabela 2.1, também influi na separação.

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FE: Apiezon (um hidrocarboneto)

A ⇒ Benzeno (ponto de ebulição = 80,2oC) B ⇒ ciclo-Hexano (ponto de ebulição = 81,0oC)

Figura 2.8 - Uma separação mal-sucedida

Tabela 2.1 - Efeito da granulometria do suporte ou da FE sólida sobre a separação cromatográfica

malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min) 60-80 4300 0,93 20

80-100 4600 0,87 20 100-120 5700 0,70 24

Dimensões da coluna: Diâmetro externo = 1/8”; comprimento = 4 m.

Figura 2.9 – Efeito da concentração da fase estacionária sobre

a separação cromatográfica.

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onde: V1 < V2 < V3 < V4 Figura 2.10 - Efeito da vazão da fase móvel sobre a separação

cromatográfica.

Figura 2.11 - Efeito da temperatura sobre a separação cromatográfica.

O quadro apresentado a seguir sumariza a relação entre o efeito da temperatura sobre o tempo de retenção e o tipo de processo. No primeiro caso (adsorção; cromatografia gás-sólido), um aumento na temperatura da análise diminui o poder de adsorção (diminui a afinidade com a fase estacionária) e aumenta a solubilidade na fase móvel. Logo, diminui o tempo de retenção. No segundo caso, pelas mesmas razões, também ocorre diminuição do tempo de

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12

retenção. No terceiro caso (partição; cromatografia gás-líquido), a afinidade com ambas as fases aumenta, mas a solubilidade na fase gasosa (móvel) aumenta mais rapidamente que na fase líquida (estacionária). Conseqüentemente, em termos relativos, a afinidade com a fase móvel aumenta, acarretando também uma diminuição no tempo de retenção. No último caso, entretanto, o aumento na solubilidade em ambas as fases é de mesma ordem de grandeza, de modo que eventuais variações no tempo de retenção são, via de regra, imperceptíveis.

TIPO FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA EFEITO SOBRE TR

G S DIMINUI ADSORÇÃO L S DIMINUI G L DIMINUI

PARTIÇÃO L L NÃO ALTERA

2.6. Cromatografia em Fase Gasosa (CFG) Na Cromatografia a Gás empregam-se colunas bem mais longas que aquelas usadas em Cromatografia a Líquido. O princípio é o mesmo, mas a força motora é a pressão do gás e não a força da gravidade, de modo que as colunas normalmente são dobradas em espiral, a fim de ocupar menos espaço dentro do cromatógrafo. A Fig. 2.12 esquematiza um cromatógrafo a gás e a Fig. 2.13 apresenta a fotografia de um cromatógrafo a gás moderno. A amostra (gás, líquido ou sólido em solução) é injetada (ver Apêndice 2), com auxílio de uma microseringa ou válvula apropriada, no Injetor, que também é o Vaporizador (V) e os seus vapores são arrastados para o interior da coluna pela fase móvel (gás de arraste). Na saída da coluna, a amostra passa pelo Detector (D), que envia um sinal para o Registrador (R). Como será visto adiante (Detectores, p. 24), este sinal é proporcional à quantidade de cada componente, o que permitirá uma análise quantitativa. Vale acrescentar que a Cromatografia a Gás é talvez o método de análise mais preciso. O sinal eletrônico captado pelo registrador é transformado num movimento da pena do mesmo. Como o papel de registro está em movimento, obtém-se um gráfico (Fig. 2.14) denominado cromatograma.

Fig. 2.12 – Esquema de um cromatógrafo a Figura 2.13 – Cromatógrafo a gás.

Alexandre Schuler - Cromatografia

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gás

Fig. 2.14 - Cromatograma de uma amostra com dois componentes.

As áreas A1 e A2 sob as duas curvas do cromatograma da Fig. 2.14 são proporcionais às quantidades dos dois componentes na mistura. Distância de Retenção (Dr) é a distância, no papel, entre o ponto registrado no momento da injeção (Início) e o ponto correspondente ao máximo de cada curva (pico). Dr varia com a velocidade do papel (z), mas o tempo de retenção (tr = Dr/z) é uma característica da substância que varia com a vazão da fase móvel, a natureza e a concentração da fase estacionária e com a temperatura. Por isso, o cromatógrafo possui controladores de vazão da fase móvel e da temperatura do forno da coluna. A coluna (e conseqüentemente a fase estacionária) pode ser substituída, até encontrar-se a coluna ideal para uma dada amostra. Além disso, existe uma vazão ideal para cada coluna, independentemente da natureza da amostra (ver Fig. 2.15). Assim sendo, a temperatura da coluna é o principal recurso disponível para obter-se um máximo de separação entre os diversos componentes da amostra. Outro parâmetro usado em CFG é a Retenção Relativa (RR), que é também usado na identificação:

1

2

1

2

1

2

Dr

Dr =

Vr

Vr =

tr

tr = RR

Essas relações são equivalentes, desde que Vr2 = F.tr e F e z são constantes (F = vazão da fase móvel).

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Fig. 2.15 - Relação entre F e n ou H. Fi é a Vazão Ideal (os parâmetros A, B e C são descritos na

Seção 3.1, eq. 5). Obs.: Experimentalmente determina-se H por medição da distância de retenção e aplicação das equações abaixo, onde l é o comprimento da coluna e L é a largura do pico na base. A Figura 2.16 ilustra o procedimento. O parâmetro n mede a eficiência de uma coluna cromatográfica (ver Capítulo 3).

n = (4Dr/L)2 e H = l/n,

Figura 2.16 - Procedimento para determinação do

número de pratos teóricos. As duas grandezas devem ser medidas em milímetros (ou em minutos ou segundos).

n = (4Dr/L)2

O Apêndice 8 discute outros parâmetros importantes relacionados com a separação.

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3 - TRATAMENTO TEÓRICO DA CFG 3.1. a equação de Van Deemter Van Deemter estabeleceu uma equação empírica (eq. 6) que relaciona as diversas variáveis da Cromatografia a Gás com H (altura equivalente a um prato teórico). Como H é igual a l/n e n mede a eficiência do processo, buscam-se condições em que o valor de H é mínimo:

(eq. 5)

λ = Parâmetro adimensional que mede as irregularidades no empacotamento da coluna. dp = Diâmetro médio das partículas do suporte. Dg = Coeficiente de difusão da amostra na fase móvel.

γ = Fator de correção para a tortuosidade dos canais entre partículas. K’ = k.Nl /Ng ; k = coeficiente de partição. N = Fração de fase estacionária (l) ou da fase móvel (g) dentro da coluna. df = Espessura efetiva do filme líquido (película de fase estacionária na superfície do suporte). Dl = Coeficiente de difusão da amostra na fase estacionária. v = Velocidade linear da fase móvel.

A equação de Van Deemter pode ser escrita sob a forma geral da equação 7, que é a equação de uma hipérbole (Fig. 2.15).

H = A + B/v + C.v (eq. 7)

Como pode ser visto na eq. 6, o modo de empacotamento, o dimensionamento do suporte e o coeficiente de difusão da amostra em cada fase são fatores que devem ser seriamente considerados, quando é projetada uma coluna. Temperatura é talvez o fator mais importante, embora não apareça explicitamente na eq. 6. É que K’ e D são altamente dependentes da temperatura. Realmente, observa-se na prática que esta é a variável que mais influi na resolução, em Cromatografia a Gás, variando drasticamente a retenção relativa. De um modo geral, o tempo de retenção depende da natureza da fase estacionária, da temperatura de operação e da vazão da fase móvel. 3.2. Fase estacionária A fase estacionária é um sólido (Cromatografia de Adsorção) altamente poroso (mais de 150 m2/g), ou, mais comumente, um líquido (Cromatografia de Partição). No segundo caso, o líquido é depositado sobre um sólido (suporte), que será discutido mais adiante.

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Interações entre dipolos, polaridade e pontes de hidrogênio são os principais fatores, na fase estacionária, que determinam a separação cromatográfica. Esses fatores são dependentes da temperatura, daí também a necessidade de um controle dessa variável. Os Cromatogramas 3.1.a e 3.1.b ilustram a influência da polaridade e da ponte de hidrogênio sobre a separação. Em ambos, como são usadas fases estacionárias polares, os picos aparecem na ordem crescente de polaridade dos componentes. Mas, no Cromatograma 3.1.b, como a fase estacionária (diglicerol) interage com o etanol (ponte de hidrogênio), o tempo de retenção deste é bastante aumentado (ver também Seção 2.5; p. 8). Alto ponto de ebulição e inércia química e catalítica (em relação à amostra, à fase móvel e ao material de que é constituído o tubo da coluna) são os principais requisitos para uma fase estacionária. Em relação a ponto de ebulição (PE) deve ser lembrado que a temperatura limite para operação com uma dada coluna é 1500C abaixo do PE da fase estacionária. Acima dessa temperatura, a perda por volatilização é excessiva. Em anos recentes tem sido utilizada a FQL (Fase Quimicamente Ligada), onde a FE une-se ao suporte mediante uma reação química. As fases estacionárias mais freqüentemente utilizadas, com um amplo espectro de aplicações, são polímeros derivados de silício, as polisiloxanas (ou siliconas), como a SE-30, por exemplo. Outra fase também bastante utilizada é o polietilenoglicol (ex.: Carbowax 20M). 3.3. Suporte O suporte tem a função de fixar dentro da coluna a fase estacionária. É necessário que o suporte seja quimicamente e também cataliticamente inerte. O material a ser empregado também não pode exibir área superficial maior que 50 m2/g, alta porosidade, nem grande poder de adsorção. Centros ativos (ácidos ou básicos) podem provocar modificações estruturais na amostra, devendo ser removidos. Terras diatomáceas, graças à sua baixa capacidade de adsorção e à sua baixa porosidade, são ainda bastante empregadas como suporte. Um excelente suporte à base de diatomácea é comercializado com um nome constituído da palavra Chromosorb seguida de uma ou mais letras (ex.: Chr WHP). Atualmente, têm sido desenvolvidos materiais sintéticos, copolímeros do etilvinilbenzeno com divinilbenzeno. Outros monômeros, como cianovinilbenzeno, também são empregados, para modificar a polaridade da FE. A depender do processo de fabricação, esses polímeros também podem ser empregados como fase estacionária (Ex.: Porapak Q, Chromosorb 101, etc). Permitem um bom empacotamento, graças à uniformidade na granulometria e na própria geometria das partículas. Também a porosidade pode ser controlada na fabricação.

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Figura 3.1 - Ausência (a) e presença (b) de ponte de hidrogênio entre FE e etanol

3.4. Coluna O material de que é constituída a coluna (tubo) pode ser aço inox 316, alumínio, níquel, vidro ou teflon. Quando não se conhece o material a ser analisado, dá-se preferência às colunas de vidro (trata-se de um vidro especialmente tratado, para remover centros ácidos de sua superfície) ou de teflon, sendo que esta última tem emprego mais restrito, devido à sensibilidade ao calor e à pressão. As colunas são classificadas quanto ao diâmetro externo: - Coluna microanalítica (capilar) ......... 0,05 a 0,53 mm - Coluna analítica .................................. 1/8”, 3/16” e 1/4” - Coluna semipreparativa ..................... 3/8”, 1/2” e 5/8” - Coluna preparativa .............................. 5, 7 e 10 cm As colunas analíticas mais comumente empregadas possuem 2–3 m de comprimento, com 1.000–10.000 pratos teóricos. Colunas capilares são bem mais longas. As primeiras capilares fabricadas possuíam mais de 100 m. Com o avanço da tecnologia, o comprimento atual situa-se entre 20–60 m, embora com cerca de 100.000 pratos teóricos. Tem-se notícia de uma coluna capilar com cerca de 1600 m de comprimento e 1 milhão de pratos teóricos. Geralmente as colunas capilares são construídas com sílica fundida, recoberta externamente por uma película de poliimida. O suporte é a própria parede interna da coluna, onde a fase estacionária líquida é depositada com uma espessura uniforme. A espessura do filme líquido varia entre 0,1 µm e 5 µm. As colunas capilares recebem denominações diferentes, em função do diâmetro interno:

Microbore: 0,05 mm e 0,10 mm Minibore: 0,18 mm Midibore: 0,25 mm e 0,32 mm Megabore: 0,45 mm e 0,53 mm

As colunas capilares “megabore” são mais simples de instalar, reúnem as qualidades das colunas analíticas (injeção de volumes maiores) e das capilares (resolução mais alta). As colunas usadas em CLAD (seção 4.2, p. 22) são bem mais curtas (10–40 cm) e os diâmetros encontrados mais comumente no comércio especializado variam entre 3–7 mm.

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3.5. Fase móvel Em CFG, a fase móvel é um gás inerte, devendo apresentar-se bastante puro1, principalmente quando se tratar da análise de traços. Os gases mais empregados são H2, N2, He, Ar e Ne, podendo também ser utilizados outros, em casos especiais. Na escolha da fase móvel (ou gás de arraste), devem ser considerados os seguintes fatores:

- Disponibilidade/custo. - Eficiência na separação. - Efeito sobre o tempo de análise.

- Segurança. - Efeito sobre o sistema de detecção.

OBSERVAÇÃO:

1 - A equação de Van Deemter simplificada (eq. 7), aplicada aos gases N2 e H2, apresenta os seguintes coeficientes (amostra: Propano), com uma dada coluna:

Ha = 0,1 + 0,07/v + 0,05v (N2) Hb = 0,1 + 0,28/v + 0,05v (H2) Esses dados comprovam a influência da natureza do gás de arraste sobre a eficiência.

2 - A velocidade relativa de eluição aumenta na ordem H2 < N2 < He < Ar, fato que demonstra a influência da natureza do gás de arraste sobre o tempo de análise.

A Tabela 3.1 resume a aplicação dos critérios acima mencionados, para seleção da fase móvel em função do detector empregado. Tabela 3.1 - Gases mais recomendados para CFG, por tipo de detector.

TIPO DE DETECTOR GASES MAIS USADOS

(Ordem de prioridade) Condutividade Térmica H2 > He >> N2 Ionização por Chama N2 > Ne > He

Captura Eletrônica N2 > He Em Cromatografia a Líquido empregam-se como Fase Móvel principalmente água deionizada, metanol, acetonitrila, etc. A seleção depende do detector a ser empregado e a fase móvel deve ser imiscível com a fase estacionária liquida. Em vez de água deionizada, é

1 A pureza dos gases empregados em cromatografia é dada de uma forma codificada. Por exemplo, a pureza do hidrogênio empregado em detectores de ionização de chama é 4.5, que corresponde a 99,995 (o número 4 indica a quantidade de noves).

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aconselhável empregar uma água de maior pureza, como a produzida em um equipamento da Millipore (Milli-Q). Um outro detalhe muito importante é que a fase móvel, além de ser de alta pureza, deve ser filtrada em filtros especiais com diâmetro de poros de no máximo 0,45 µm. Além disso, a fase móvel também deve ser desgaseificada (ver página 24), para evitar que ocorram problemas como picos falsos, alto ruído, cavitação na bomba e até quebra do pistão.

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4 - O CROMATÓGRAFO 4.1. O Cromatógrafo a Gás A Fig. 2.12 (p. 13) representa esquematicamente um Cromatógrafo a Gás. É possível agora descrever mais detalhadamente o instrumento. a) Controles de Temperatura O cromatógrafo dispõe de termostatos para controle independente do aquecimento dos três principais setores: câmara de vaporização (é o próprio injetor), forno da coluna e bloco do detector. O aquecimento da coluna, promovido por uma resistência elétrica localizada na base do forno, é homogeneizado por um ventilador, que pode permanecer ligado após o final do aquecimento, de modo a acelerar o resfriamento. Nesse caso, o compartimento do forno deve permanecer aberto, exceto nos equipamentos que possuam dispositivo de resfriamento automático.

Figura 4.1 - Fluxímetro de bolha Figura 4.2 - Divisor de fluxo para coletor b) Controles Pneumáticos Os cromatógrafos a gás normalmente possuem uma válvula controladora de pressão e outra para ajuste da vazão da fase móvel. Idênticos sistemas existem para o controle da vazão dos gases auxiliares (ver seção 4.3.2.b; p. 25). A vazão é medida com o auxílio de um fluxímetro de bolha, ou bolhômetro (Fig. 4.1). A “pêra” (parte inferior) contém uma solução de sabão líquido. Comprimindo-se a “pêra”, o nível do líquido sobe e o gás forma uma bolha que ascende pelo tubo. Para se determinar a vazão, é suficiente marcar com um cronômetro o tempo gasto para a bolha percorrer os 20 mL do tubo. Na atualidade, existem no mercado alguns equipamentos totalmente microprocessados, tornando obsoletos esses acessórios. c) Coletor de Frações O coletor de frações é um acessório utilizado em Cromatografia preparativa. O material efluente da coluna pode passar por um divisor de fluxo (Fig. 4.2), de modo que uma parte é desviada para o coletor, onde cada componente, isoladamente, é condensado. Colunas de

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maiores dimensões permitem a injeção de uma maior quantidade de amostra, permitindo assim a produção de pequenas quantidades de um material com alta pureza (maior que 99,9999%), que pode ser empregado como padrão, por exemplo. d) Detectores Nos primórdios da Cromatografia, a visualização dos diversos componentes da amostra era possível porque os mesmos eram coloridos (daí o nome da técnica). Os primeiros pesquisadores que trabalharam com substâncias incolores desenvolveram vários procedimentos para torná-las coloridas. Surgiram então os reveladores. Reagentes, como o iodo, o ácido sulfúrico, a 2,4-dinitrofenil-hidrazina, entre vários outros, que borrifados sobre a placa desenvolvida, geram manchas coloridas (spots), permitindo assim a visualização do cromatograma. Tanto na placa quanto na coluna, iluminação com luz ultravioleta (UV) também permite a visualização das zonas ocupadas pelos componentes (evidentemente, apenas aqueles que absorvem luz UV). Para a quantificação, Tswett e seus seguidores empregavam técnicas de degradação química, que consiste em transformar o analito desconhecido em alguma substância já conhecida e em seguida desenhar a reação (ou as reações) realizada(s), do fim para o começo, para chegar à estrutura do desconhecido. A idéia de colocar um feixe de luz UV na saída da coluna e aproveitar a relação matemática associada à absorção da luz pelo analito (lei de Beer) é um exemplo do desenvolvimento de detectores (dispositivos que em contato com o analito geram um sinal que é registrado e quantificado). O momento da detecção também é registrado (tempo de retenção), de modo que os detectores modernos fazem simultaneamente a identificação e a quantificação da amostra. Por ser necessário um estudo mais detalhado, esses detectores serão discutidos mais adiante (Seção 4.3). e) Eletrômetro O eletrômetro é um amplificador de sinal. Este módulo pode ser controlado a qualquer instante, de modo que um sinal fraco (componente menor) pode ser ampliado independentemente dos outros, enquanto que um sinal muito forte (componente maior) pode ser atenuado o suficiente para que seu pico fique contido no papel do registrador. Os cromatogramas as Figuras 4.3 e 4.4 ilustram, respectivamente, a relação real de áreas e outro registro da mesma amostra, com ampliação do primeiro sinal e atenuação do terceiro, ou mais exatamente, atenuação menor para o primeiro e atenuação maior para o terceiro, em relação à atenuação do segundo. Logicamente, as áreas medidas no segundo cromatograma, multiplicadas pelos respectivos fatores de atenuação, fornecem os valores reais das áreas relativas.

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Figura 4.3 - Mesma atenuação Figura 4.4 - Atenuações diferentes

f) Registrador O registrador é um instrumento acessório, que transforma o sinal emitido pelo detector e amplificado pelo eletrômetro, em um sinal mecânico. Na extremidade do sistema mecânico existe uma caneta (pena) e a magnitude de seu deslocamento, acima da linha de base, é proporcional à quantidade do componente na amostra. Como o papel está em movimento, obtém-se uma curva (cromatograma), onde a distância do início da análise (ponto de injeção) ao máximo de cada pico é a distância de retenção (Dr). Dividindo Dr por z (velocidade do papel), obtém-se o tempo de retenção, Tr. Idealmente, com separação completa e condições ótimas (incluindo seleção perfeita da fase estacionária), obtém-se uma curva simétrica. Este equipamento está em desuso. No Apêndice 3 são discutidas outras técnicas de aquisição de dados. g) Programador Linear de Temperatura Às vezes numa mesma amostra existem alguns componentes que eluem rapidamente e já bastante próximos entre si nas condições de análise (componentes 1, 2 e 3 da Figura 4.5), enquanto que outros apresentam um tempo de retenção excessivamente alto com uma separação desnecessariamente alta (componentes 4 e 5 da Figura 4.5). Para reduzir o tempo de análise e obter um pico mais agudo para os últimos componentes (o que inclusive diminuiria o erro na determinação de Dr e melhoraria o Limite de Detecção1), a opção de empregar uma temperatura mais alta acarretaria uma diminuição na já pequena retenção relativa dos primeiros componentes. Em situações como essa, pode-se aplicar um gradiente de temperatura, com o auxílio de um Programador Linear de Temperatura (PLT). A velocidade de aquecimento pode ser controlada, sendo possível também promover um aquecimento isotérmico em algumas regiões. Em operações desse tipo deve-se indicar no cromatograma a temperatura inicial (Ti), a temperatura final (Tf), que não deve diferir da temperatura de ebulição da fase estacionária em menos de 1500C, e a velocidade de aquecimento, para que o cromatograma possa ser reproduzido posteriormente (Figura 4.6).

1 Ver Apêndice 2.

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Figura 4.5 - Análise Isotérmica. 1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3 (1,54 min), 4 (3,2 min) e 5 (4,1 min).

Figura 4.6 - Análise com PLT. 1 (1,25 min), 2 (1,43 min), 3 (1,54 min), 4 (2,9 min) e 5 (3,3 min).

4.2. O Cromatógrafo a Líquido O cromatógrafo a líquido, mais comumente conhecido pela sigla inglesa da técnica, HPLC (High Performance Liquid Chromatography; em português: Cromatografia Líquida de Alto Desempenho), é um instrumento mais simples que o cromatógrafo a gás nos seguintes aspectos (ver Figura 4.3a):

a) só possui um canal analítico, enquanto CG’s podem ter até quatro canais; b) é modulado, isto é, o sistema de bombeamento e o detector são independentes, o

que facilita a substituição de detectores; c) opera geralmente à temperatura ambiente;

A Figura 4.7b é um diagrama em blocos de um CL típico. Cada bloco é descrito a seguir:

Figura 4.7a – Cromatógrafo a Líquido (HPLC). Figura 4.7b - Diagrama em blocos de um HPLC.

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a) Reservatório de Fase Móvel A Fase Móvel (um líquido puro ou uma mistura de composição definida) deve ser filtrada em membranas com 0,46 µm de diâmetro de poros e desgaseificada (ver próximo item). b) Sistema de desgaseificação A Fase Móvel deve ser desgaseificada, para evitar a formação de bolhas, as quais podem provocar cavitação (com conseqüente dano à bomba) ou gerar picos falsos, ao passarem pela célula do detector. São conhecidas várias técnicas de desgaseificação: - aquecimento com agitação; - borbulhamento de gás hélio; - ultra-som; - vácuo c) Bomba O bombeamento da Fase Móvel é realizado por uma bomba controlada por um microprocessador, o qual pode alterar a velocidade de sucção (para evitar vaporização de fase móvel mais volátil) e a vazão (importante quando a análise é realizada com Gradiente de Polaridade, em cujo caso há necessidade de uma segunda bomba; ver mais adiante). d) Válvula de injeção A amostra é sempre introduzida com auxílio de uma válvula, porquanto a pressão de trabalho raramente é menor que 20 atmosferas (Apêndice 2). e) Coluna As colunas empregadas em CL são retas, uma vez que seu comprimento raramente ultrapassa 30 cm, ocupando, portanto, muito pouco espaço no equipamento. f) Detector Os detectores utilizados em CL serão descritos na próxima seção. g) Sistema de aquisição de dados. Os sistemas de aquisição de dados empregados em CL são os mesmos empregados em CG, ou seja, registradores, integradores ou microcomputadores (Apêndice 3).

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Gradiente de Polaridade Quando o CL dispõe de apenas uma bomba, é evidente que a fase móvel tem uma composição constante, do início ao fim da análise. Nessa situação, a polaridade da mesma também é constante. Diz-se então que o processo é isocrático. Quando se dispõe de duas bombas (ou mais), é possível variar a composição da fase móvel, colocando-se em cada reservatório um líquido de polaridade diferente. O microprocessador altera a vazão de cada linha de líquido, de modo que a partir do ponto de confluência a vazão seja constante. Nesse caso, diz-se que o processo ocorre com gradiente de polaridade. Substituindo-se temperatura por polaridade, podem ser utilizados os cromatogramas das Figuras 4.5 e 4.6 (página 23) como ilustração de um processo isocrático de um processo com gradiente de polaridade, respectivamente. 4.3. Detectores

4.3.1. Generalidades Os detectores mais empregados são do tipo diferencial. A sua resposta (R), dada pelas áreas relativas dos picos, é proporcional à concentração de cada componente (detectores de condutividade térmica) ou à velocidade de fluxo de massa do componente (detectores de ionização):

R = K .C R = K .dm

dt1 2

Dentre os detectores dos tipos descritos acima, destacam-se, pelo maior uso, os seguintes: detector de condutividade térmica (DCT), detector de ionização por chama (DIC) e detector de índice de refração (DIR), embora existam outros, de mais restrita aplicação. A escolha do detector é importante e depende do material a ser analisado. As principais características dos detectores, que devem ser consideradas quando da seleção do detector mais apropriado, são as seguintes (ver Apêndice 1, p 56):

- Sensibilidade - Nível de ruído - Resposta (Sinal)

- Faixa de linearidade dinâmica - Custo/vida útil - Universalidade

- Especificidade / Seletividade - Limite de Detecção (relação

sinal/ruído).

4.3.2. Detectores empregados em Cromatografia a Gás a) Detector de Condutividade Térmica (DCT)

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O sistema de detecção por diferença de condutividade térmica consiste de dois pares filamentos (células para amostra e células de referência), os quais fazem parte de uma ponte de Wheatstone (Figuras 4.8a e 4.8b). O filamento pode ser de platina, níquel, tungstênio ou ligas de tungstênio, como W/Re, normalmente coberto de ouro, para aumentar a resistência à corrosão. Faz-se passar corrente pelos filamentos e estes perdem calor para o gás de arraste. No momento em que a amostra atingir a célula correspondente, o filamento perderá calor para a solução (gás de arraste + amostra). Como a solução possui condutividade térmica diferente da fase móvel pura, a temperatura do filamento é alterada, o mesmo ocorrendo com a sua resistência elétrica. Essa variação na resistência é medida pela ponte. Note-se que quanto maior for a concentração do material analisado, maior será a variação na corrente e portanto maior será o sinal (R = K.C). A sensibilidade de um detector de condutividade térmica pode ser avaliada pela equação: (eq. 8)

onde: S = sensibilidade (mV.cm3/mg) K = constante da célula I = intensidade de corrente (mA) R = resistência do filamento (Ohm)

λg = condutividade térmica do gás de arraste (cal/cm.s) λs = condutividade térmica da substância (cal/cm.s) Tf = temperatura do filamento (oC) Tb = temperatura do bloco (oC)

IMPORTANTE ! Se as células do detector contiverem ar atmosférico no momento em que o circuito for energizado ocorrerá queima do filamento. Portanto, deve-se primeiro fazer circular o gás de arraste.

Figura 4.8.a - Bloco do Detector de Condutividade Térmica.

)T - (T .)(

. KI = S bfg

s - g2

λ

λλ

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Figura 4.8b- Diagrama Eletrônico do DCT

b) Detector de Ionização por Chama (DIC)

A Figura 4.9 representa o circuito eletrônico de um DIC. Rv é uma resistência variável, cujo valor depende do número de partículas entre os eletrodos. O efluente da coluna, ao passar entre os eletrodos, é ionizado. Nos DIC, a fonte de ionização é a chama resultante da combustão de hidrogênio com ar (gases auxiliares). A corrente contínua gerada pela fonte (fonte CC, Fig 4.9.b) é transportada do polarizador para o coletor (Fig 4.9.a) por impurezas existentes na fase móvel ou por partículas de fase estacionária líquida arrastada pela fase móvel, por exemplo. No amplificador existe outra fonte de corrente, sendo esta variável e de sentido contrário, permitindo assim zerar a corrente resultante no circuito. Quando um componente da amostra atinge o detector, caso possua átomos de carbono e átomos de hidrogênio, entrará em combustão, sendo ionizado. Com a ionização, aumenta a corrente de saída do coletor, o que irá gerar uma tensão (∆V), a qual é ampliada pelo amplificador eletrométrico e enviada ao registrador/integrador. Evidentemente, a sensibilidade do detector dependerá da facilidade relativa de ionização de cada componente da amostra.

Fig. 4.9.a- Estrutura física de um DIC

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c) Detector de Captura Eletrônica (DCE) Embora possuindo circuito semelhante ao de um DIC, o DCE, ao contrário daquele, mede a queda de corrente quando da passagem de amostra pelos eletrodos (Rv). Uma fonte de 3H-1 ou de 63Ni ioniza as moléculas do gás de arraste (N2), liberando os elétrons responsáveis pela corrente (corrente de fundo). Se uma substância capaz de absorver esses elétrons passar pelo detector, haverá uma queda na corrente, resultando num sinal que também será amplificado e enviado ao registrador. Aqui, a sensibilidade do detector depende da capacidade de absorção de elétrons por parte dos diversos componentes da amostra.

Fig. 4.9.b- Circuito eletrônico de um DIC / DCE

d) Propriedades dos detectores A Tabela 4.1 é auto-explicativa e sumariza as principais propriedades dos detectores, auxiliando no trabalho de seleção do detector mais apropriado para uma análise. O Apêndice 5 descreve outros detectores de uso menos extensivo, como o DNP e o DFC. Tabela 4.1 - Propriedades dos principais tipos de detectores empregados em CFG.

PROPRIEDADES DCT DIC DNP DCE Limite de detecção 1 ppm 100 ppb 0,1 ppb 0,1 ppb Faixa de linearidade 104 107 104 102 Vazão da fase móvel 1-103 mL/min 1-200 mL/min 10-100 mL/min 10-100 mL/min Quant. típica de amostra 1 - 40 µL 0,05 – 5 µL 1 - 5 µL 1 - 5 µL Compostos Detectados todos orgânicos nitrogenados e fosforados halogenados Áreas de aplicação uso geral orgânicos resíduos de pesticidas resíduos de pesticidas

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4.3.3. Detectores empregados em CLAD Os detectores mais empregados em Cromatografia a Líquido de Alto Desempenho (CLAD), embora existam outros tipos de detectores são: a) Detectores de índice de refração À semelhança do detector de condutividade térmica, o detector de índice de refração é o mais antigo, menos sensível e o único universal, dentre os detectores empregados em CLAD. Baseando-se na diferença de índice de refração entre a fase móvel e cada componente da amostra, conhecem-se dois tipos de detectores IR: • Os detectores tipo deflexão utilizam como elemento ativo um diodo capaz de gerar uma corrente

contínua cuja intensidade é proporcional ao ângulo de incidência da luz que atravessa a célula (Figura 4.10). Ao passar pela célula analítica uma substância com índice de refração diferente daquele da fase móvel, haverá uma alteração no ângulo de incidência, resultando numa variação na intensidade de corrente, que é proporcional à concentração dessa substância na célula e conseqüentemente também proporcional à sua concentração na amostra.

Figura 4.10 - Detector de Índice de Refração tipo deflexão. • Os detectores tipo Fresnel baseiam-se no fato da luz incidente sobre o sistema mostrado na Fig.

4.7 ser fracionada em dois feixes: uma parte da luz é refletida e a outra parte é refratada. De acordo com a Lei de Fresnel, a relação entre essas duas frações é função do índice de refração. Assim, ao passar uma substância (transportada pela fase móvel) pela célula, altera-se o índice de refração e, portanto, o percentual de luz refratada. Utilizando-se como fotodetector um diodo sensível à intensidade de luz, a corrente gerada por este será alterada de um modo proporcional à concentração dessa substância na amostra.

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b) Detectores de UV-VIS Os detectores de ultravioleta-visível (UV-VIS) baseiam-se na Lei de Lambert-Beer, que estabelece uma relação linear entre Absorbância e Concentração:

A = ε . l . c

onde l é o caminho ótico (distância percorrida pela luz dentro da solução; espessura da célula). A constante de proporcionalidade εεεε denomina-se absortividade. A absorbância, por sua vez, é proporcional à transmitância, fração de luz transmitida. Quando o conteúdo da célula (Fig. 4.11) é transparente à radiação empregada (UV ou VIS), a transmitância é 100 % e evidentemente a absorbância é ZERO. Entretanto, quando chega à célula uma substância que absorva essa luz, o sistema de detecção mede a diferença em intensidade, gerando o cromatograma correspondente. Os instrumentos mais comuns (e mais baratos) utilizam como fonte de radiação uma lâmpada de mercúrio, cuja radiação é monocromática (discreta), com comprimento de onda de 254 nm. Esses instrumentos, portanto, operam com um comprimento de onda fixo (e único). A Fig. 4.12 representa um diagrama esquemático desse tipo de instrumento. Como a região útil da radiação UV varia de 190 nm a 370 nm, é de se esperar que mesmos os compostos que absorvem luz UV não venham a ser detectados em um detector do tipo fixo, ou que sejam detectados com baixa sensibilidade. Para se conseguir uma varredura em toda a região UV, é primordial, evidentemente, que a fonte de radiação possa emitir luz com todos os comprimentos de onda da faixa de interesse (fonte não monocromática, ou contínua). Para tanto, emprega-se a lâmpada de deutério. Nesse caso, o instrumento (UV variável) necessita de um dispositivo que selecione um determinado comprimento de onda, de modo a irradiar a amostra com uma luz monocromática. Esse dispositivo chama-se “monocromador”. A seleção do comprimento de onda pode ser manual (UV ajustável). Nesse caso, comporta-se como um UV fixo, embora possa ser selecionado qualquer comprimento de onda dentro da região UV. Existe um outro tipo de equipamento (UV de varredura), no qual a alteração do comprimento de onda é automática, indo de um ao outro extremo da região UV, num intervalo de tempo muito menor que o tempo de residência da amostra na célula analítica. Com esse equipamento, substâncias que absorvam em comprimentos de onda bem diferentes podem ser detectadas em uma única corrida. Também existem equipamentos que operam na região visível (400-750 nm), que empregam uma lâmpada de tungstênio, cuja radiação também é contínua. Finalmente, existem equipamentos que operam em ambas as faixas (UV-VIS).

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Figura 4.11 - Detector de Índice de Refração tipo Fresnel.

Figura 4.12 - Detector de Ultravioleta fixo

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5 - ANÁLISE QUALITATIVA O tempo de retenção (Tr) é uma característica físico-química e como tal permite que se faça análise qualitativa, desde que se disponha de um padrão. Na falta do padrão, é necessário coletar cada componente isoladamente e identificá-lo por outros métodos analíticos; espectrometria, por exemplo. Atualmente, são comercializados cromatógrafos (a gás e a líquido) cujo detector é um espectrômetro de massas. Quando uma amostra é submetida à análise, é preciso fornecer ao analista alguns dados a respeito da mesma: - Origem (de síntese, natural, etc?); - Componentes prováveis (espécie, número); - Composição quantitativa provável; - Solubilidade; - Faixa de ponto de ebulição (amostra líquida); - Outros dados relacionados com as variáveis do processo. Quanto maior for o número de informações, mais rapidamente o analista encontrará as condições ideais de análise. Como existe apenas uma vazão ideal para cada coluna, resta ao analista procurar a coluna e a temperatura (ou programação de temperatura) ideais. Existem outros modos de efetuar a identificação, os quais serão estudados mais adiante (Capítulo 8).

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6 - ANÁLISE QUANTITATIVA 6.1. Introdução Para se determinar a composição de uma mistura (Análise Quantitativa) é necessário medir as áreas relativas dos picos de todos os componentes. Entretanto, nem sempre o número de picos é igual ao número de componentes, pois além da probabilidade de ocorrer superposição, alguns componentes poderão não ser detectados, o tempo de análise poderá ser inferior ao tempo de retenção de um componente menos volátil, etc. O uso de uma referência (padrão) permite, contudo, determinar a percentagem de um dado componente, mesmo que não apareçam os picos dos outros componentes. Antes de se efetuar o cálculo da composição, entretanto, é preciso fazer as correções das áreas, pois a relação das áreas de dois componentes quase sempre é diferente da relação entre as suas massas (composição em massa). Isto porque a sensibilidade (Resposta) de um detector a duas diferentes substâncias normalmente é diferente. Analisando a eq. 8 (p. 25) é verificado que além de outros fatores, a sensibilidade dos detectores de condutividade térmica depende da diferença λg - λs. Como λs varia de substância para substância, podemos dizer que uma mistura binária qualquer contendo 50% de cada componente muito provavelmente terá uma relação de áreas diferente da unidade. Com os detectores de ionização por chama (e também com os de captura de elétrons) existe esse mesmo problema, pois a facilidade de se ionizar (ou de capturar elétrons) varia de substância para substância. Aliás, essa afirmação vale para qualquer outro tipo de detector, inclusive aqueles empregados em Cromatografia a Líquido. Assim sendo, vale a pena repetir, é necessário primeiro determinar os fatores de resposta para as áreas e só depois efetuar o cálculo da composição. 6.2. Medição de Área A área de um pico pode ser medida por vários métodos, a saber:

a) Com auxílio de um planímetro. b) Por pesagem (recorta-se cada pico e pesa-se em balança analítica). c) Com auxílio de um integrador:

� de disco (eletromecânico) � eletrônico

d) Determinação gráfica:

i) S = h.L (triangulação) ii) ii) S = h.L’ (meia-altura),

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onde h é a altura do pico, medida desde a linha de base até o ápice do mesmo, L é a largura na base (distância entre os pontos em que a linha de base é interceptada pelas tangentes traçadas nos dois ramos da curva) e L’ é a largura do pico na metade de sua altura, como se vê na Figura 6.1. A unidade de medida dessas grandezas deve ser o milímetro. O planímetro é um dispositivo mecânico, articulado. Na medida em que se percorre o perímetro do pico, um ponteiro percorre uma escala. A leitura ao final do perímetro é a área do pico. O traçado do integrador de disco é mostrado abaixo do pico, na fig. 6.1. O uso de um integrador permite determinar a área com um erro da ordem de 0,1%. Entretanto, os erros dos outros métodos, em torno de 0,5 - 1%, é bastante aceitável para a maioria das finalidades. Dado o alto custo dos integradores, principalmente os eletrônicos, muitos Laboratórios ainda utilizam o método gráfico. Atualmente, encontram-se no mercado várias versões de softwares (com a respectiva interface), que substituem com muitas vantagens (inclusive de custo) os integradores eletrônicos. A utilização do planímetro exige habilidade do operador, de modo que o erro poderá ser bem maior que 1% (a precisão normalmente é baixa). O método de pesagem, por sua vez, é pouco empregado em virtude de exigir a destruição do cromatograma. Dentre os métodos gráficos (i e ii), o da meia altura (ii) é recomendado para os picos cuja linha de base não está bem definida e também por causa da imprecisão no traçado das tangentes. Entretanto, a medição de uma largura L’ (da ordem de 5 mm) muitas vezes acarreta um erro da mesma magnitude do erro da medida de L (triangulação), de modo que os dois métodos, em geral, podem ser considerados igualmente precisos (ou imprecisos). A experiência indicará, em cada ocasião, qual método deverá ser empregado. Se os picos não estão completamente separados, a ponto de não se poder medir a largura L’, utiliza-se o método i (S = h.L), medindo-se L do seguinte modo (Fig. 6.2): 1) Traçar, como na Fig. 6.1, a tangente do pico; mas só as mostradas na fig. 6.2; 2) A partir do ponto A (Fig. 6.2), traçar uma vertical até cortar a linha de base; 3) L1 e L2 são as bases dos dois picos da Fig. 6.2 e as suas áreas são h1L1 e h2L2.

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Fig. 6.1 - Método gráfico para determinação de áreas relativas em cromatografia.

OBS.: Essa técnica pode ser empregada também nos casos em que A fica abaixo de L’ e é denominada CORREÇÃO VERTICAL. Se o primeiro pico for muito menor que o segundo (Fig. 6.3), o procedimento é exatamente igual. Por outro lado, na situação inversa, a medição da área do segundo pico é feita como mostrado na Fig. 6.4. Essa segunda técnica chama-se CORREÇÃO TANGENCIAL. Se houver um outro pico sobre a cauda do primeiro e o ponto A estiver acima da tangente, procede-se a uma correção vertical entre os dois pequenos.

Figura 6.2 - Correção vertical Figura 6.3 - Correção vertical Fig. 6.4 - Correção horizontal 6.3. Métodos de Cálculo Os métodos de cálculo descritos a seguir já incluem a correção da área. a) Normalização de área A seguinte relação é válida para um cromatograma dessa mistura:

CA

A. 100i =

i

iΣ (eq. 9)

onde Ai é a área do pico de um componente qualquer e ΣAi a soma de todas as áreas. Evidentemente, é necessário que todos os componentes sejam detectados. Melhor seria que suas áreas fossem de mesma ordem de grandeza, pois em caso contrário, pode haver erro de exatidão

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maior que o aceitável. Além disso, é essencial que o detector seja igualmente sensível a todos os componentes da amostra, senão haverá fatalmente um erro de exatidão proporcional à diferença de sensibilidade. Exemplificando: numa amostra com dois componentes (50% de cada), se o detector apresentar para o componente A o dobro da sensibilidade apresentada em relação ao componente B, o resultado, aplicando a eq. 9, será: 33,3% de B e 66,7% de A. Das três restrições apresentadas acima, a mais difícil de ser atendida é a terceira. Assim, a equação 9 deve ser empregada com bastante cautela, ou apenas como uma primeira aproximação à solução do problema. Em seu lugar, pode ser empregada a eq. 10, onde Fi é um número que gera áreas (ditas corrigidas) que seriam obtidas caso o detector fosse igualmente sensível a todos os componentes da amostra.

C = A

A. 100i

c

c

i

iΣ (eq. 10)

onde Aci é a área corrigida de um componente qualquer e é calculada com auxílio da eq. 11:

Aci = Ai.Fi (eq. 11)

e Fi é calculado experimentalmente a partir do cromatograma de uma mistura sintética (solução padrão) contendo todos os componentes da amostra real:

Fi = Ci/Ai (eq. 12)

onde Ci é a concentração de um componente qualquer e Ai sua respectiva área. Quando todos os componentes de uma mistura pertencem a uma mesma função química, os fatores de correção (também denominados fatores de conversão - pois convertem a área em concentração ou massa - ou fatores de resposta) são praticamente iguais. Assim, admitindo-se que F1 = F2 = ... = Fn = F, pode-se fazer F = 1 e a equação 10 simplifica-se, transformando-se na eq. 9. O caso geral (eq. 10) é conhecido como Normalização de Área com Fator de Resposta (Norm %) e o caso particular (eq. 9) como Normalização de Área sem Fator de Resposta, ou simplesmente Área %. b) Padronização Interna Para a determinação da composição de uma amostra pelo método da Normalização de Área, é necessário que todos os seus vários componentes sejam detectados (a

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eq. 10 exige que sejam calculadas todas as áreas: ΣAci). Entretanto, não é fácil ter certeza absoluta de que todos os componentes foram realmente detectados. Além disso, se apenas um único componente interessa ao analista, a sua determinação a partir de uma amostra com muitos componentes traria dois outros agravantes:

i) Todo trabalho de medição e cálculo dos picos de interesse. ii) A probabilidade maior de um outro componente ter o mesmo tempo de

retenção do componente de interesse. Para resolver o problema (ii) o analista poderia usar um detector que se possível só detectasse o componente de interesse. Mas, como resolver o problema inicial? A resposta a essas questões está na adição à amostra de uma substância nova, com as seguintes características: - Solúvel na amostra. - Detectável. - Possuir tr diferente de qualquer componente detectável. - Não reagir com a amostra. Essa substância é denominada padrão interno. Seja uma solução padrão contendo todas as substâncias de interesse e o padrão interno (Pi), cujas concentrações e áreas sejam respectivamente: Ai e Ci - um componente qualquer de interesse. APi e CPi - o padrão interno. O procedimento experimental pode ser descrito do seguinte modo:

a) prepara-se uma solução padrão (como no método Norm%), mas contendo apenas os componentes de interesse (sol. A);

b) em seguida, prepara-se uma outra solução, onde o soluto será o padrão interno (ou uma solução de concentração conhecida) e o solvente será a sol. A (sol. B);

c) com cada amostra, segue-se o procedimento do item anterior, substituindo-se a sol. A pela amostra (sol. C).

d) finalmente, injeta-se igual volume das soluções B e C.

Observe-se que a concentração do padrão interno é a mesma, nas soluções B e C. Assim, nos dois cromatogramas deve ser encontrada a mesma área, para o padrão interno, posto que a massa injetada foi a mesma (ver p. 57 – Linearidade). Caso essas áreas sejam

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diferentes, conclui-se de imediato que os volumes injetados não foram exatamente iguais. Como o operador deve estar operando na região linear (senão estaria cometendo um erro grosseiro), é válida a relação:

Api/A’pi = V/V’ (eq. 13) onde Api e A’pi são, respectivamente, a área do pico do padrão interno na solução padrão (sol. B) e na amostra (sol. C); V e V’ são, também respectivamente, o volume injetado do padrão e o volume injetado da amostra. A metodologia acima exigia que V e V’ fossem iguais. Entretanto, pode ter havido algum erro na medição desses volumes e o que se pretende é exatamente eliminá-lo. É claro que outras fontes de erro foram introduzidas (preparação das soluções B e C). Entretanto, com o uso de uma boa técnica de preparação dessas soluções, o erro global pode ser bastante diminuído. As relações Ci /Ai = Fi e CPi /APi = FPi dão a resposta do detector para qualquer componente, inclusive Pi. Numa mesma solução, a relação Fi / FPi é constante. Logo:

(Ci/Ai) . (Api/Cpi) = K (eq. 14)

A adição do padrão interno a uma amostra de concentração desconhecida, resulta em uma solução para a qual são válidas as mesmas relações acima:

(C’i/A’i) . (A’pi/Cpi) = K (eq. 15)

Dividindo-se a eq. 15 pela eq. 14 e considerando a eq. 12, obtém-se:

C’i = A’i . Fi . (Api/A’pi) (eq. 16)

OBS.: A precisão desse método, bem como a do método “a”, independe do erro de injeção, mas a precisão de ambos depende do erro na preparação dos padrões. c) Padronização externa Mais prático que o método anterior e não necessitando também da detecção de todos os componentes da amostra, o método do padrão externo, entretanto, depende do volume injetado, de modo que sua precisão é influenciada pelo erro de injeção. Substituindo-se na equação 16 Api/A’pi por V/V’ (da eq. 13), tem-se:

C’i = A’i . Fi . (V/V’) (eq. 17)

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Se o erro do operador na medição do volume injetado (mensurável) for considerado aceitável, pode-se considerar que a relação V/V’ é igual à unidade. Nesse caso, a equação 16 pode ser simplificada, resultando na eq. 18:

C’i = A’i . Fi (eq. 18)

OBS.: 1. Os valores de Fi, obtidos num determinado laboratório, podem ser tabelados, ou

fornecidos a um computador (integrador/processador), para agilização das análises. Devido a alterações na sensibilidade do detector (variação na relação de fluxo dos gases auxiliares no DIC, corrosão, decaimento natural na fonte radioativa do DCE, etc.), os valores de Fi devem ser recalculados periodicamente. O analista deverá determinar experimentalmente a periodicidade.

2. O método do padrão externo (regra de três simples) é uma simplificação do método do padrão interno (regra de três composta), onde se faz Vip = Via , onde Vip é o volume injetado de solução padrão e Via é o volume injetado da amostra. Portanto, a precisão deste método de cálculo depende da perícia do analista na medição do volume a ser injetado.

d) Técnica para fechar uma análise Muitas vezes é necessário fazer duas injeções. Isso acontece quando uma única coluna não consegue separar todos os componentes e/ou um único detector não detecta todas as substâncias. Considere-se o método de Normalização de Área e uma situação em que um dos componentes aparece isolado nos dois cromatogramas. Como nas duas injeções o volume não foi exatamente o mesmo, haveria um erro grosseiro se as diversas áreas dos dois cromatogramas fossem somadas diretamente. No exemplo a seguir, a amostra possui cinco componentes, sendo que os componentes (1), (2) e (4) são quantificados no cromatograma A. Observa-se que (2) aparece nos dois cromatogramas. Teoricamente as suas áreas, nos dois cromatogramas (Aa2 e Ab2) seriam iguais. Na prática, geralmente encontra-se A Aa b2 2≠ . Qualquer uma das áreas é correta, de modo que A ou B pode ser tomada como referência, indiferentemente. Tomando o cromatograma A como referência, tem-se:

A

A

a

b

2

2

= K (para corrigir as áreas no cromatograma B)

A . F + A . F + A . K. F + A . F + A . F . K = Aa1 1 a 2 2 b 3 3 a 4 4 b5 5 ci∑ (eq. 20)

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onde Aci é qualquer termo do 1o membro da eq. 20. A concentração de qualquer componente é calculada a partir dessa equação. 6.4. Seleção do melhor método de cálculo Para se decidir sobre o melhor método de cálculo para uma dada amostra, basta responder às questões apresentadas no Esquema 6.1.

Esquema 6.1 - Critérios para seleção do melhor método de cálculo.

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7 - OTIMIZAÇÃO DO PROCESSO ANALÍTICO 7.1. Parâmetros analíticos Conforme foi visto ao longo dos capítulos anteriores, muitos fatores influem no processo cromatográfico. Essa influência não é aleatória, podendo portanto ser controlada pelo operador, com o objetivo de otimizar o processo de separação. A Tabela 7.1 mostra a importância do correto dimensionamento de uma coluna cromatográfica, enquanto que a Tabela 7.2 mostra a influência do volume injetado sobre L (largura do pico na base; ver Fig. 2.16, p. 15), n e H (ver Fig. 2.15, p. 14). O Gráfico 7.1 mostra a relação entre C e nmax (�) e entre C e Hmin(�), onde C é a concentração da fase estacionária. O

Gráfico 7.2 mostra como esses parâmetros (n e H) variam com o comprimento da coluna (l). A temperatura (T) modifica o tempo de retenção (tr). A variação do tr com T não é linear. A relação

∆tr / ∆T depende do composto em estudo e da faixa de temperatura empregada. A Tabela 7.3, o Gráfico 7.3 e os Cromatogramas 7.1.a,b e 7.2.a,b,c evidenciam essas afirmações. Finalmente, a Tabela 7.4 mostra que nmax, Hmin e Fo (vazão ideal) dependem inclusive da granulometria do suporte. Tabela 7.1 - Efeito do comprimento da coluna e da concentração da FE sobre a eficiência.

Coluna * Vazão Ideal

l (m) C (%) m (g) Fo

(mL/min) n x 10-3 H (mm)

1 2 4 9

16 4 4 4 4

10 10 10 10 10 1 2 5

20

0,13 0,24 0,57 1,24 2,15 0,05 0,12 0,26 1,18

30+5 20+5 28+5 21+5 38+5 18+5 26+5 34+5 37+5

0,8 1,4 4,3 8,0

16,0 1,9 2,0 2,7 3,3

1,25 1,43 0,93 1,13 1,00 2,11 2,00 1,48 1,21

(*) a) Fase estacionária: Apiezon L; DE = 1/8”; DI = 2,04 mm; Suporte: Chromosorb P; 60-80 mesh

b) l = comprimento da coluna; C = conc. da FE; m = massa da FE na coluna.

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Tabela 7.2 - Efeito do volume injetado sobre L, n e H.

Volume (µL) L (mm) n H (mm) 0,5 1,0 1,5 2,0

7 9

11 12

15.800 9760 6800 5270

1,01 1,64 2,35 3,03

Tabela 7.3 - Efeito da temperatura sobre o tempo de retenção

Composto 70oC 100oC 130oC 160oC n-pentano 1,60 1,17 0,85 0,68 n-hexano 3,29 1,93 1,23 0,77 n-heptano 7,38 3,65 1,92 1,35 n-octano 18,88 7,08 3,25 2,00

A partir dessas informações é possível estabelecer, por exemplo, para uma coluna com 1/8” de diâmetro externo (coluna analítica), que: ♦ Para uma mesma FE, mesmo suporte e mesma granulometria, nmax é função linear de l. ♦ O valor de nmax aumenta, quando diminui a granulometria do suporte. ♦ O valor de nmax varia com C, sendo máximo quando C = 12 %, para suporte com faixa de

granulometria de 60-80 mesh ( ≡ malhas por polegada linear; equivale a um diâmetro de partícula de 175-230 mm).

♦ A faixa de vazão ideal não varia com a temperatura.

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♦ O tempo de retenção diminui de maneira não linear com o aumento da temperatura; a relação ∆tr / ∆T varia com a natureza do composto e o intervalo de temperatura considerado.

7.2. Projetando um método analítico Para se projetar um novo método analítico por cromatografia, são necessárias várias avaliações, relacionadas a seguir: ♦ Seleção do tipo de cromatógrafo (a gás ou a líquido); ♦ Seleção do detector, em função dos compostos a serem analisados e de suas concentrações; ♦ Parâmetros de funcionamento do detector; ♦ Seleção da coluna:

• natureza da Fase Estacionária (e sua granulometria, caso seja sólida); • dimensões da coluna (comprimento e diâmetro); • concentração da Fase Estacionária (FE), natureza e granulometria do suporte, no caso

de FE líquida; ♦ Seleção da temperatura (ou programação de temperatura) para a coluna, no caso de CFG; ♦ Seleção do Gradiente de Polaridade, se necessário, no caso de CFL (HPLC); ♦ Determinação do Limite de Detecção (LD) e da Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD); ♦ Determinação dos Fatores de Resposta; ♦ Determinação das demais condições de análise: volume injetado, técnica de injeção,

atenuação (se não dispuser de sistema de integração), temperatura do vaporizador (em CFG) e do detector e vazão da fase móvel (ou gradiente);

♦ Concentração dos componentes na solução padrão, natureza do solvente empregado e técnicas de amostragem e de preparação da amostra e da solução padrão;

♦ Método de cálculo utilizado; ♦ Número mínimo de determinações em paralelo e erro máximo (reprodutibilidade); ♦ Avaliação do erro estatístico global, associado às diversas operações (preparação de

soluções, técnica de amostragem, técnica de injeção e medição de área); expressão do resultado final;

Observações:

a) na seleção do detector, verificar se o material a ser analisado é detectável por ele e se o seu Limite de Detecção é compatível com a faixa de concentração de interesse (ver, por exemplo, a Tabela 4.1 na p. 28);

b) na avaliação dos erros estatísticos, considerar todas as operações envolvidas, tais como pesagem, medição de volume, diluição, técnicas de amostragem e de injeção, etc;

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c) para cálculos estatísticos, utilizar o Apêndice 6 (ver Seção 7.3); d) em relação aos diversos métodos de cálculo, lembrar que:

Método Preparação do Padrão

Preparação da Amostra

Injeção Componentes não detectados

Altura(1)

Área % Não Não Não Sim Sim Norm % Sim Não Não Sim Sim P. Ext. Sim Não Sim Não Não(2) P. Int. Sim Sim Não Não Não(2)

Sim significa “é fonte de erro”; Não significa “não é fonte de erro”. (1) como medida da “área”; (2) dentro de uma faixa mais ou menos estreita de concentração.

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Tabela 7.4 – Efeito da granulometria do suporte sobre a eficiência

Malha/polegada nmáx Hmín Fo (mL/min) 60-80 4300 0,93 20

80-100 4600 0,87 20 100-120 5700 0,70 24

D.E. = 1/8”; l = 4 m; C = 10 %

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7.3. Validação de um método analítico 7.3.1. Objetivo A identificação por Cromatografia (a gás ou a líquido) é feita por comparação dos tempos de retenção, para uma dada substância, entre uma solução padrão e a amostra. Entretanto, é sabido que num determinado sistema cromatográfico (Fase Móvel, Fase Estacionária e Detector), mesmo empregando-se como fluxo da Fase Móvel aquele considerado ideal (de acordo com os experimentos de van Deemter), não é nula a probabilidade de outro componente da amostra apresentar o mesmo tempo de retenção que o da substância de interesse. Validar um método analítico consiste em garantir que nas condições analíticas, a substância-problema e apenas ela apresenta aquele tempo de retenção. Evidentemente um método validado deve ser operacionalizado através de um manual (Norma), o qual determina condições padronizadas que garantam a sua repetibilidade/reprodutibilidade. Deve ser enfatizado que um determinado método analítico validado para um determinado tipo de amostra não é necessariamente válido para outro tipo de amostra (ex.: dosagem de um princípio ativo existente em um determinado medicamento versus a mesma determinação nas vísceras do cadáver de uma suposta vítima de superdosagem), posto que outro tipo de amostra pode conter outras substâncias também passíveis de ser detectadas no mesmo tempo de retenção do analito e que não tenham sido incluídas na pesquisa de validação. 7.3.2. Conceitos Com o objetivo de garantir uma correta compreensão deste texto, são apresentados a seguir os termos técnicos aqui empregados, com suas respectivas definições.

Nome notação descrição

Analito Substância-problema. Amostra Qualquer material, independentemente de sua

origem, que contenha o analito. Padrão O analito, comercializado com alta pureza. United States Pharmacopea USP Farmacopéia Americana. Fonte de consulta. Concentração c Concentração do analito (ou do padrão). Solução Estoque SE Solução do padrão a alta concentração (pode

ser guardada por alguns meses, dependendo da natureza da substância).

Solução Intermediária SI Solução do padrão, necessária para se chegar à Solução de Trabalho.

Solução de Trabalho ST Solução do padrão com concentração

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semelhante ao que se espera da amostra. Faixa de Linearidade FL Intervalo de concentração em que existe

relação linear com a área do pico. Curva de Calibração Curva construída com os dados da Faixa de

Trabalho. Coeficiente de Correlação r Parâmetro que mede a precisão com que a Curva de

Calibração relaciona as áreas com as respectivas concentrações. É usado para avaliar o fim da região linear na construção da FL.

Faixa de Trabalho FT Intervalo contido na FL, compreendendo as concentrações usuais da amostra.

Limite de Detecção do Equipamento

LDE Concentração mínima detectável do analito no extrato injetado.

Limite de Detecção da Amostra

LDA Concentração mínima detectável do analito na amostra.

Limite Efetivo LE Concentração mínima do analito que corresponde a um erro máximo aceitável.

Seletividade α Capacidade de separar a substância-problema dos demais componentes da amostra.

Resolução Rs Mede a seletividade. Precisão Avalia a repetibi l idade ou a

reprodutibilidade de um método analítico, por medida da 1a ou da 2a estimativa do desvio-padrão (Apêndice 6).

Exatidão Grau de fidelidade com que o resultado exprime o valor real da concentração do analito. Avaliado com auxílio do teste t1 (de Student), por comparação com uma solução padrão (Apêndice 6).

Recuperação Nos casos em que se faz uma extração, é necessário determinar o percentual de extração e sua repetibilidade. Recomenda-se que a solução padrão seja submetida à mesma operação.

Repetitividade Mede a dispersão dos resultados obtidos por repetição da análise, num mesmo Laboratório, com o mesmo equipamento e mesmo analista. Ver Precisão.

Reprodutibilidade Mede a dispersão dos resultados obtidos por repetição da análise, em diferentes Laboratórios,

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diferentes equipamentos ou diferentes analistas. Usa o teste F (Apêndice 6).

Consistência Mede a influência sobre a repetibilidade, das diversas operações constantes do método.

Robustez Mede a influência sobre a Reprodutibilidade, das diversas operações constantes do método.

7.3.3. Procedimento

a) Seletividade / Identificação A principal fase do trabalho é aquela em que é testada a confiabilidade da identificação. Isso inclui a determinação do tempo de retenção de toda e qualquer substância que possa eventualmente existir na amostra, quais sejam: ♦ Impurezas de síntese (no caso de produtos naturais, esse trabalho poderá ser bastante penoso); ♦ Impurezas de degradação (essas informações podem ser obtidas de estudos shelf-life); ♦ Excipientes, conservantes, aditivos e outros princípios ativos constantes da formulação (no

caso de associações); Deve ser lembrado que a identificação pura e simples por cromatografia (método não validado) não tem valor científico. Assim, o ideal, o recomendado mesmo, é associar à técnica cromatográfica, a técnica de Espectrometria de Massas. Essa associação pode ser manual, através da separação física, por coleta na saída da coluna, seguida da obtenção do espectro de massas. A identificação pode ser ainda complementada com auxílio de outra técnica analítica, como a Espectrometria de Ressonância Magnética Nuclear, Espectrofotometria no Ultravioleta-Visível ou a Espectrofotometria no Infravermelho. Atualmente existem cromatógrafos (CFG ou HPLC) acoplados a um espectrômetro de massas, o qual substitui o detector tradicional do cromatógrafo. Embora os exemplos aqui apresentados sejam típicos da indústria farmacêutica, os diversos procedimentos são igualmente aplicáveis a qualquer outro tipo de amostra. De um modo geral, produtos de síntese (de uso farmacêutico ou não) podem ter seu método analítico validado sem auxílio da espectrometria (embora seu emprego dê maior credibilidade à validação). Por outro lado, qualquer outro material (inclusive de uso farmacêutico) exige a associação de métodos espectrométricos.

Já se sabe que a eficiência (n) de uma coluna é diretamente proporcional ao tempo de retenção. Portanto, quanto maior for o tempo de eluição, maior será a sua eficiência. Assim, a seletividade (Apêndice 8) ou a retenção relativa (RR; p. 14) podem ser empregadas como medida da eficiência. Entretanto, esse critério é algo insatisfatório, posto que colunas com diferentes eficiências podem apresentar mesmos fatores de separação, conforme pode ser visto

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na Figura 7.1.a,b. Por isso, em vez da seletividade, emprega-se a resolução (Rs), como medida efetiva da capacidade de separação:

Rs = 2(tr2 – tr1)/(L1 + L2)

A resolução é igual à diferença entre os tempos de retenção dividida pela média das larguras na base (Figura 2.14, p. 14). Entretanto, quanto maior o tempo de retenção, maior será a difusão longitudinal, a qual provoca alargamento dos picos. É óbvio que a resolução diminui com o alargamento do pico. Portanto, é desejável que a análise não seja muito demorada. A resolução também diminui se a cauda, resultante de uma interação excessiva com a fase estacionária, é bastante pronunciada (Figura 7.2). Essa deformação do pico deve ser considerada quando da seleção da coluna. Chama-se fator de deformação ou fator de assimetria (TF, do inglês tailing factor) a relação:

TF = BC

AB

onde a distância BD é igual a 10 % da altura do pico ( DE ). Alguns especialistas1 acreditam que o TF máximo admissível é 3.

Figura 7.1 – Resolução a) baixa; b) alta Figura 7.2 – Pico com cauda (deformação) 1 A Farmacopéia Americana (USP) mede o segmento AC a 5% da altura do pico, calcula TF dividindo AC por duas vezes AB e estabelece 2 como TFmax.

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b) Detalhamento da Metodologia A metodologia analítica inclui todos os parâmetros explicitados na Seção 7.2 (p. 43). c) Avaliação estatística Para realização dos testes estatísticos, sugere-se que qualquer operação (preparação da solução padrão, tomada de alíquotas, etc) seja realizada em triplicata (ou mais) e que cada solução obtida seja injetada pelo menos cinco vezes. Nesses casos, deve ser empregada a 2a estimativa do desvio-padrão (sR; Apêndice 6). A 1a estimativa (s) só deve ser empregada em conjuntos de dados com mais de 10 itens. d) Exemplo A seguir, é apresentado um exemplo, para ilustrar toda a operação. Para este exemplo, foi selecionada a aspirina, que é comercializada em várias formas, sendo selecionado como amostra o comprimido. A aspirina (ácido acetilsalicílico) é produzida industrialmente a partir do ácido salicílico:

Desse modo, é de se esperar que o precursor (AS) seja um contaminante comum no produto (AAS). Conseqüentemente, o AS é uma das substâncias que devem ter seu tempo de retenção medido, para verificar se coincide ou não com o do AAS. Uma vez completada a etapa de identificação (vale repetir: confirmação de que nada que eventualmente possa estar presente na amostra apresente o mesmo tempo de retenção do AAS), parte-se para as avaliações estatísticas.

i. Condições analíticas: ♦ Cromatógrafo a líquido modelo CG 480E, com detector de ultravioleta CG 437B. ♦ Comprimento de onda: 254 nm. ♦ Coluna: RP-18, 250 mm X 4,6 mm, 10 µm; temperatura ambiente. ♦ Fase Móvel: H2O:Metanol:Ácido Acético (52,5:46:1,5); 1,5 mL/min (isocrático).

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Preparação das soluções padrão (para AAS e AS): A solução estoque foi de 500 mg/100 mL. As demais soluções foram de 200 mg/100 mL, 100 mg/100 mL, 20 mg/100 mL, 10 mg/100 mL e 5 mg/100 mL. Preparação da amostra: A partir de 5 comprimidos pulverizados em almofariz, foi tomada uma alíquota pesando 55 mg (10% do peso médio de um comprimido). O material foi dissolvido em 10 mL da fase móvel, com auxílio de ultra-som e em seguida filtrado (0,46 µm). Injeção da amostra: válvula Rheodyne, com loop de 20 µL.

ii. Faixa de Linearidade e Limite de Detecção As soluções padrão foram injetadas em triplicata, sendo que a mais diluída foi injetada dez vezes. A partir das médias das áreas obtidas, foram construídas as respectivas Faixas de Linearidade (Gráficos 7.4 e 7.5), onde se evidencia que as massas injetadas conforme prescrito em Preparação da amostra permanecem dentro da região linear. O ruído (medido com atenuação mínima necessária para uma altura não inferior a 5 mm) foi de 7 mm, o que por comparação com a média das alturas dos picos das dez injeções da solução mais diluída resultou em um Limite de Detecção (para AAS e AS), da ordem de 0,3 mg/100 mL.

0 500 1000 1500 2000

0,0

2,0x102

4,0x102

6,0x102

8,0x102

r = 0,99996

Áre

a do

pic

o

Concentração (mg/L)

0 100 200 300 400 5000

100

200

300

400

r = 0,99999

Áre

a do

pic

o

Concentração (mg/L)

Gráfico 7.4 – FLD do AAS. Gráfico 7.5 – FLD do AS.

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iii. Precisão e expressão dos resultados A partir dos dados (áreas) das dez injeções da solução mais diluída referida no item ii acima, pode ser calculado o erro analítico (de repetibilidade) e a partir deste (no exemplo, foi 1,2%), determinar a forma correta de expressão do resultado (forma esta válida para ambos os compostos):

Re = X ± 0,01 mg/L

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8 – TÉCNICAS ADICIONAIS DE IDENTIFICAÇÃO

A identificação de substâncias efluentes de uma coluna cromatográfica é normalmente realizada por simples comparação dos seus tempos de retenção com os tempos de retenção de padrões puros, conforme descrito no Capítulo 5. Entretanto, existem outros procedimentos de identificação também muito úteis e até mais confiáveis que aquele. Além dos dados cromatográficos (conforme será discutido a seguir), também pode ser realizada a identificação com auxílio de outros procedimentos. Dentre esses se destacam: adição de padrão (para corrigir pequenas variações no tempo de retenção que ocorre quando se usa o método absoluto), derivação (o desconhecido é transformado em outra substância, cujo tempo de retenção também é comparado com o tempo de retenção do padrão dessa outra) e técnicas espectroscópicas: ultravioleta, infravermelho, massas e ressonância magnética nuclear. Na atualidade, são conhecidas as chamadas técnicas hifenizadas. Exemplo disso é o emprego de um espectrômetro de massas acoplado a um cromatógrafo a gás (GC-MS) ou a um cromatógrafo a líquido (HPLC-MS). Nesses equipamentos, o espectrômetro substitui o detector usual e a amostra é transferida da saída da coluna para o espectrômetro sem auxílio do operador. Este, ao analisar o analito, envia uma cópia do espectro para um banco de dados, que se encarrega da identificação, por comparação com espectros de padrões. 8.1. Tempo de retenção e retenção relativa A identificação é feita tradicionalmente através da medição do tempo de retenção (tr). Entretanto, a essa forma de medição está associado um erro, decorrente de uma natural variação no tempo transcorrido entre a injeção e o acionamento do sistema de registro. Esse erro costuma ser da ordem de 2 % em relação ao tempo de retenção. É pequeno demais, na maioria das vezes. Mas há casos em que a diferença de tr entre dois componentes é dessa mesma ordem de grandeza. Em tais casos é recomendável o emprego da Retenção Relativa (RR). Um dos componentes é tomado como referência (RRr = 1) e as RR’s dos demais são calculadas com auxílio da relação:

RRb = trb/tra ,

onde trr e tri são, respectivamente, os tempos de retenção da referência e de outro componente. 8.2. Índice de retenção Outro parâmetro utilizado para identificação, o Índice de Retenção (Ir) é determinado experimentalmente a partir do cromatograma da mistura do desconhecido (i) com duas parafinas normais com n e m (geralmente m = n + 1) átomos de carbono, desde que:

D’rn < D’ri <D’rm ; onde D’r = distância de retenção corrigida

Alexandre Schuler - Cromatografia

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Em outras palavras, o(s) analito(s) deve(m) gerar pico(s) com distância de retenção maior que o da parafina CnH2n+2 e menor que o da parafina CmH2m+2.

Sabe-se que o logaritmo da distância de retenção (D’r) varia linearmente com o ponto de

ebulição ou com o número de átomos de carbono, numa série homóloga1. Por interpolação pode ser construída a relação:

n.100D logD log

D logD log100I

'rn

'rm

'rn

'ri

ri +−

−=

Nesse sistema, assume-se que o índice de retenção do hidrogênio é zero e que o índice

de retenção de qualquer parafina é igual a cem vezes o seu número de átomos de carbono:

n.100I e 00,0I rn)(Hr 2==

Padrões para determinação do Ir:

a) Como visto acima, as parafinas normais são, por definição, padrões primários, com Ir = 100n. b) Em qualquer série homóloga com mais de 5 átomos de carbono, o Ir cresce de 100

unidades para cada CH2 adicional e não é influenciado pela temperatura. Esses compostos podem, portanto, ser utilizados como padrões secundários.

8.3. Equivalência entre fases estacionárias

É conhecida a relação ∆ = ΙI Irp

rn

i i− , onde Ir

pi e Ir

ni são, respectivamente, os

índices de retenção de um composto i numa fase polar qualquer e numa fase estacionária não polar tomada como referência (geralmente esqualano), medidos a uma mesma temperatura. Essa relação permite avaliar a influência, na separação, da fase estacionária e de grupos substituintes presentes na molécula da substância considerada. McReynolds, baseado em trabalho inicial de Rohrschneider, tomou cinco compostos como referência e associou o somatório dos seus valores de ∆∆∆∆I com a polaridade da fase estacionária, chegando a classificar centenas de fases estacionárias. A Tabela 8.1 apresenta alguns exemplos (observe-se que as FE’s estão colocadas em ordem crescente de polaridade). Os valores de ∆∆∆∆I, denominados constantes de McReynolds, foram determinados a 120oC. Os valores de Ir para os cinco compostos, com a fase estacionária esqualano, são: benzeno, 653; n-butanol, 590; 2-pentanona, 627; nitropropano, 652 e piridina, 699. Por comparação entre os números

1 Série homóloga é um grupo de substâncias de uma mesma função química cuja única diferença molecular é o número de átomos de carbono da cadeia principal (ex: ácidos carboxílicos com um grupo metila no carbono alfa).

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de McReynolds de duas diferentes fases estacionárias, é possível concluir se as mesmas são equivalentes ou não. É possível também prever como melhorar uma separação, comparando-se a natureza de duas substâncias-problema com duas das cinco substâncias tomadas como referência.

Tabela 8.1 – Valores do Número de McReynolds (Σ∆I) para algumas fases estacionárias.

VALORES DE ∆∆∆∆I FASE ESTACIONÁRIA A B C D E Σ∆Σ∆Σ∆Σ∆I

Esqualano (*) 0 0 0 0 0 0 Nujol 9 5 2 6 11 33 Apiezon L 32 22 15 32 42 143 SE-30 15 53 44 64 41 217 SE-52 32 72 65 98 67 334 Hallcomid M-18 OL 89 280 143 239 165 916 QF-1 144 233 355 463 305 1500 Carbowax 20M 322 536 368 572 510 2308 Diglicerol 371 826 560 676 854 3287 DEGS 492 733 581 833 791 3430 TCEP 593 857 752 1028 915 4145

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BIBLIOGRAFIA(*) 1. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold, Holland. 1967.

2. Ciola, R. Fundamentos da Cromatografia a Gás. Ed. Edgard Blücher Ltda., São Paulo, 1985.

3. Ciola, R. Tópicos em Cromatografia a Líquido. Inst. Científicos C. G. Ltda., São Paulo, 1984.

4. Hadden, N. e Col. Basic Liquid Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1971.

5. McNair, H. e Bonelli, E. Basic Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1968.

6. Basics of Liquid Chromatography. Spectra-Physics, Cal. USA, 1977.

7. Fundamentals of Gas Analysis by Gas Chromatography. Varian Aerograph, Cal. USA, 1977.

8. Schuler, A. Caderno de Práticas de Cromatografia. Depto. Eng. Química/UFPE, 1994.

9. Randerath, K. Thin-Layer Chromatography. Verlag Chemie – Academic Press, USA, 1968.

10. Lederer, E. e Lederer, M. Chromatography. Elsevier Publishing Co., London, GB, 1953.

11. Heftmann, E. Chromatography. Van Nostrand Reinhold Co., New York, USA, 1967.

12. Treybal, R. E. Liquid Extraction. McGraw-Hill Book Company, Inc., New York, USA, 1951.

13. Wilcox, Melissa J., Lab South America, Guide 1999/2000, GB, p. 19-22.

(*) A Literatura aqui apresentada serviu de base para a elaboração deste texto e é recomendada àqueles que pretendem se aprofundar na matéria.

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APÊNDICE 1 Túnel do Tempo A intenção deste texto é apresentar uma seqüência cronológica dos fatos mais importantes que marcaram o desenvolvimento da técnica cromatográfica, até os tempos atuais. Mais do que apresentar uma lista exaustiva, pretende-se tão somente dar ao leitor uma compreensão geral da história da Cromatografia. Reza a lenda que um pesquisador, trabalhando em seu laboratório com uma solução contendo uma mistura de corantes, acidentalmente molhou sua vestimenta. Para sua surpresa, no lugar de uma mancha mais ou menos circular e de cor uniforme (igual à da solução), surgiram círculos concêntricos, cada um com uma cor diferente das demais, como na figura abaixo. De algum modo esse fato teria ficado registrado, tendo servido de sugestão para Tswett (ver adiante) resolver seu problema analítico. Isso teria acontecido no século XIX.

Em 19 de maio de 1872 nasceu em Asti, uma pequena cidade localizada no Tirol italiano. Filho de Siméon Tswett (russo) e Marie Dorroza (italiana), Mikhaïl Semenovitch Tsvet, foi registrado como de nacionalidade russa. Mikhail Tswett (grafia mais usual na literatura) mudou-se em 1875 com o pai (a mãe falecera pouco após o seu nascimento) para Lausanne e depois Genebra (Suíça), onde passou toda a sua infância e juventude, graduando-se em 1893 em botânica pela

Universidade de Genebra e doutorando-se em 1896 na mesma universidade. Nesse mesmo ano mudou-se para a Rússia, como professor de botânica em escolas privadas na cidade de São Petersburgo (Leningrado) e em 1901 mudou-se para Varsóvia (Polônia), sendo contratado pela Universidade de Varsóvia, onde trabalhou até 1915. Com a invasão alemã, durante a 1a Guerra Mundial, Tswett fugiu para a Rússia, refugiando-se em Moscou. Em 1917 tornou-se professor de botânica e Diretor do Jardim Botânico da Universidade de Jourjeff, em Dorpat (Tartu). No início de fevereiro os alemães ocuparam Jourjeff e fecharam a Universidade. Mais uma vez Tswett se mudou, dessa vez para Voronej, aonde veio a falecer, debilitado pela tuberculose, no dia 26 de junho de 1919, com 47 anos de idade. Em 1900, Tswett descobrira a razão da cor verde das plantas, isolando as clorofilas A e B, xantofilas e carotenóides amarelos, entre outros pigmentos, em uma coluna de adsorção contendo carbonato de cálcio. Éter de petróleo foi empregado como fase móvel neste trabalho. Este primeiro trabalho (de uma série de mais de cinqüenta) foi publicado em 1903, no volume 14 da revista científica Proc. Warsaw Soc. Nat. Sci., Biol. Sec. Sua obra maior foi um livro, publicado (em russo) em 1906, intitulado "Os cromófilos no mundo animal e vegetal", no qual ele descreve com detalhes seu método de separação de pigmentos. É de Tswett a seguinte definição: "Cromatografia

Mikhail Tswett

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é um método em que os componentes de uma mistura são separados numa coluna de adsorvente num sistema em fluxo". Ele deu à técnica o nome de Cromatografia, combinando as palavras gregas Khromatos (cores) e Graphos (descrever). Ele acreditava que o processo de separação, de algum modo, tinha algo a ver com a cor da substância. Segundo suas próprias palavras, "como raios de luz no espectro, os diferentes componentes de uma mistura de pigmentos, obedecendo a alguma lei, se separam numa coluna de carbonato de cálcio e podem assim ser qualitativamente e quantitativamente determinados. Eu chamo tal preparação um cromatograma, e o método correspondente o método cromatográfico". Mais tarde, antevendo toda a potencialidade de sua invenção, afirmou: "... é bastante evidente que o fenômeno de adsorção descrito não se restringe aos pigmentos vegetais, mas devemos aceitar que todos os tipos de compostos químicos, coloridos ou incolores, estão sujeitos às mesmas leis". Após sua morte, ninguém de imediato empregou a Cromatografia em suas pesquisas. Um detalhe interessante é que o nome tswett, em russo, significa cor. Alguém chegou a sugerir, como uma homenagem póstuma a Tswett, que o nome da técnica fosse tswettografia. Linha do Tempo:

1931 – Khun e Lederer repetiram o trabalho de Tswett com clorofilas, xantofilas e carotenos, rompendo o silêncio de 12 anos. Logo em seguida, Brockmann, Karrer, Winterstein e Zechmeister trouxeram suas contribuições.

1938 – Reichstein realiza a primeira análise de uma substância incolor. Para visualizar as

zonas ocupadas por substâncias incolores empregam-se reativos próprios, designados como reveladores (Figura A1.1).

Figura A1.1 – Cromatografia em Camada Delgada (diferentes formas de revelar).

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1940 – Wilson, Devault, Weiss, Glückauf, Martin e Synge1 deram início aos estudos teóricos da Cromatografia.

1941 – Martin e Synge introduziram a cromatografia de partição (com sílica gel). 1943 – Lyman C. Craig desenvolve um aparelho para extração líquido-líquido, que pode

ser considerado um precursor do cromatógrafo e cujo funcionamento, descrito adiante, auxilia no entendimento do processo cromatográfico.

1944 – Consden, Gordon e Martin inventaram a cromatografia em papel. 1947 – Boyd, Marinsky, Spedding, Tompkins e outros realizaram pesquisas que conduziriam

mais tarde à produção industrial de terras raras por cromatografia de troca iônica. 1948 – Lederer e Linstead aplicaram a cromatografia em papel a compostos inorgânicos. 1951 – Kirchner introduziu a cromatografia em camada delgada. 1952 – Martin e Synge desenvolvem a cromatografia a gás.

1956 – Sober e Peterson prepararam as primeiras celuloses para troca iônica e Lathe e

Ruthvan trabalharam com peneiras moleculares (naturais e modificadas) para medidas de peso molecular.

1964 – Moore desenvolveu a cromatografia por permeação em gel.

O aparelho de Craig

Lyman C. Craig (1906-1974), pesquisador da Universidade de Rockefeller (New York, USA), desenvolveu um equipamento, denominado Aparato de Craig, que promove a separação de misturas de substâncias através da técnica de extração líquido-líquido, conforme descrito na página 6. Esse equipamento (Figura A1.2) foi bastante utilizado em separações (inclusive preparativas), antes do advento dos modernos cromatógrafos. Craig inventou também um equipamento ainda bastante empregado em laboratórios, o evaporador rotatório, também conhecido como rotavapor.

1 Archer John Porter Martin (1910–2002) e Richard Laurence Millington Synge (1914-1994).

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Figura A1.2 – Aparato de Craig.

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APÊNDICE 2 Características básicas dos detectores 1. Sensibilidade A sensibilidade de um detector é medida pela sua Resposta, que é a magnitude do sinal recebido pelo Sistema de Aquisição de Dados (Registrador potenciométrico, Integrador ou Software), sob a forma de área do pico. Assim, quanto maior for a área do pico de uma mesma amostra, maior será a sensibilidade do detector empregado. 2. Nível de ruído O ruído é uma característica indesejável dos detectores, ou melhor, de qualquer dispositivo eletrônico. No caso do cromatógrafo, o ruído é devido a um conjunto de fatores, tais como:

- impurezas dos componentes eletrônicos - mau contato em cabos e conectores

- interferências na rede elétrica - sangramento da coluna

- defeitos em circuitos eletrônicos - contaminação na válvula de amostragem

- contaminação no septo da coluna - contaminação no detector

- vazamento de fase móvel - contaminação na coluna

Essas causas podem ser removidas, exceto a primeira, que depende não só da qualidade do produto, mas também de suas características próprias. Assim, existe um nível mínimo de ruído que não pode ser removido. Evidentemente, um pico com altura igual à do ruído não poderá ser reconhecido como tal. O ruído faz com que a linha de base não seja uma reta perfeita, mas algo parecido com o traçado mostrado na Fig. A2.1.

Fig. A2.1. Linha de base com ruído. 3. Limite de Detecção Limite de Detecção (LD), ou Quantidade Mínima Detectável (QMD), como o próprio nome o diz, é a massa mínima injetável que produza um pico que possa ser

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identificado como tal. Por definição, LD é uma massa cujo pico tenha uma altura igual ao dobro da altura média do ruído (hr, Fig. A2.1). 4. Faixa de Linearidade Dinâmica

Entende-se por Faixa de Linearidade Dinâmica (FLD) o intervalo compreendido entre a Quantidade Mínima Detectável (QMD) e a massa máxima injetável cuja Resposta ainda seja linear. A Fig. A2.2 ilustra a situação. A linha vermelha compreende a região linear. Alguns detectores, possuem uma faixa ampla (DIC), enquanto outros apresentam linearidade numa faixa bem mais estreita (DCE). Alguns operam com massas altas (DCT, DIR), enquanto outros só apresentam linearidade a altas diluições (DCE, DUV). Para se determinar a FLD de um detector, em relação a um determinado composto, é necessário preparar soluções dentro do intervalo de interesse e montar um gráfico equivalente ao apresentado na Fig. A2.2. Em seguida, o analista deve calcular o coeficiente de correlação (r; Apêndice 6) para todos os pontos e depois recalcular o coeficiente de correlação após retirar, sucessivamente, os pontos n, (n-1), (n-2), etc, até que o valor de r permaneça estável e próximo da unidade. Não tendo havido erro grosseiro na preparação das soluções, nas injeções, nem nas medições de áreas, deve-se encontrar um valor de r maior ou igual a 0,999.

Figura A2.2 – Faixa de Linearidade Dinâmica.

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APÊNDICE 3 Técnicas de introdução da amostra Tradicionalmente a amostra (sólido em solução, líquido ou gás) é introduzida com auxílio de uma microseringa (Figura A3.1). Em Cromatografia a Gás (CFG), exceto com colunas capilares ou megabore (ver abaixo), recomenda-se injetar de 3 a 5 microlitros (µL), sendo que o erro de medição é inversamente proporcional ao volume.

Figura A3.1 – Microseringa para amostras líquidas em CFG

Em se tratando de amostras gasosas, existem duas outras técnicas: seringa especial para gases (seringas gas-tight, que previnem contaminação ou diluição da amostra com ar), que é utilizada quando a amostra não está pressurizada e a válvula injetora de sete vias (Figura A3.2). Em Cromatografia a Líquido (HPLC), a amostra (líquido ou sólido em solução) é introduzida com auxílio de uma seringa numa válvula equivalente à válvula da Figura A3.2, sendo do tipo rotativo e resistente à alta pressão empregada neste tipo de equipamento. Ambas as válvulas encarregam-se de medir o volume injetado, que varia de umas poucas dezenas de microlitros (HPLC) a 1 – 2 mL (CFG). No caso de colunas capilares (ou megabore), o volume máximo injetável é muito pequeno para ser medido por uma microlitros (0,01 a 1 µL). Além disso, o diâmetro das mesmas é tão pequeno (≤ 0,53 mm) que a injeção não pode ser feita diretamente na coluna, como acontece com as colunas de maior diâmetro (CFG). Nesses casos, é necessário um injetor especial, onde a amostra, uma vez vaporizada, é dissolvida na fase móvel e esta solução sofre uma divisão (divisor pneumático), de modo que 1/100 ou uma fração ainda menor é realmente enviada para a coluna, enquanto que o restante é descartado. Na atualidade existem amostradores automáticos, programáveis, que comportam um número relativamente grande de amostras, injetando-as seqüencialmente, o que torna a rotina do laboratório menos exaustiva, além de oferecer maior precisão.

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Figura A3.2.a – Válvula de injeção de amostra gasosa (posição carga)

Figura A3.2.b – Válvula de injeção de amostra gasosa (posição injeção)

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APÊNDICE 4 Sistemas de aquisição de dados Mesmo na atualidade ainda são empregados registradores para a aquisição dos dados cromatográficos. Qualquer que seja o detector empregado (CFG ou HPLC), o sinal gerado pelo mesmo é uma tensão (corrente contínua). Trabalhando-se com registrador, obtém-se um gráfico (cromatograma), com auxílio do qual são medidos os tempos de retenção e as áreas dos diferentes picos. O tempo gasto nesse trabalho é muito grande e o erro é às vezes bastante expressivo (5 a 10 %). O integrador eletromecânico realizou uma verdadeira revolução na Cromatografia, particularmente em laboratórios de Controle de Qualidade, acelerando e aumentando bastante a precisão do trabalho analítico (erro da ordem de 0,5 %). Com o desenvolvimento da eletrônica, alguns registradores passaram a ser comercializados com um integrador eletrônico cujo registro gráfico era igual ao do integrador eletromecânico, de modo que não houve diminuição visível no erro de integração, pois a leitura continuava sendo analógica. Mas logo em seguida surgiram os verdadeiros integradores eletrônicos. Os primeiros limitavam-se a imprimir a área medida. Os cálculos eram ainda realizados pelo analista, embora com uma precisão na integração (medida da área) da ordem de 0,001 %. A Segunda geração de integradores veio complementar o trabalho. Após a integração, o equipamento, utilizando o método de cálculo previamente selecionado pelo analista, realizava a operação final, chegando a imprimir a concentração na unidade desejada. Esses equipamentos denominam-se integradores-processadores. Alguns, mais sofisticados, imprimem o cromatograma, em tempo real, utilizando os recursos de correção vertical e correção tangencial e inclusive realizando cálculos pós-análise (geralmente em BASIC), além de automatizar o acionamento de válvulas. Na realidade esses integradores de última geração são computadores dedicados. Seu alto custo, aliado a uma curta vida tecnológica, decretou o fim desses equipamentos. Na atualidade, os laboratórios de cromatografia estão substituindo os integradores por softwares bastante completos e sofisticados, que com auxílio de um microcomputador tipo PC e de uma interface, realizam o trabalho do integrador com a mesma eficiência, a um preço bem menor, além de poderem monitorar até quatro cromatógrafos de um modo totalmente independente.

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APÊNDICE 5 O desenvolvimento cromatográfico As Figuras 1.1 (p. 1) e 2.1 (p. 3) mostram, respectivamente, a distribuição das partículas sólidas (fase estacionária sólida ou suporte, no caso da fase estacionária líquida) dentro de uma coluna empacotada e o processo de separação a nível molecular (pictoricamente). Na Seção 2.2 (p. 4) é dado um pequeno tratamento matemático ao processo de separação por partição, quando então há referência a etapas ou pontos de equilíbrio. Entre as páginas 7 e 8 é oferecida uma pequena discussão a respeito do que acontece numa coluna de cromatografia clássica (fase estacionária sólida), quando se faz referência a uma coluna desenvolvida. No final da Seção 2.6, ao discutir as Figuras 2.15 (p. 14) e 2.16 (p. 15), é feita referência ao número de pratos teóricos (n), como medida da eficiência (capacidade de separação) de uma coluna cromatográfica. Finalmente, no Capítulo 3 (p. 16), é apresentada a equação de van Deemter e seus diversos parâmetros são discutidos. O processo de separação cromatográfica pode ser analisado, por analogia, como uma destilação fracionada. No projeto de uma coluna de destilação contínua, o engenheiro químico calcula em que pontos devem ser colocadas bandejas (pratos) para a retirada de frações de diferentes pontos de ebulição. Numa destilação em batelada não existem essas bandejas, mas evidentemente o cálculo é o mesmo. Como não existem pontos de remoção ao longo da coluna, tudo sai pelo topo da mesma, na ordem crescente do ponto de ebulição. O mesmo acontece com a cromatografia. A diferença é que outros fatores também interferem no processo, tornando-o mais complexo, porém também mais completo, mais eficiente. Assim, enquanto uma coluna de destilação contém cerca de 40-60 bandejas, uma coluna de cromatografia possui algumas centenas ou mesmo milhares de bandejas (pratos teóricos). Cada componente da amostra, com diferente coeficiente de partição (ou de adsorção), movimenta-se ao longo da coluna, transportado pela fase móvel, com uma velocidade média diferente: quanto maior for sua afinidade com a fase estacionária (ou menor com a fase móvel), maior será o coeficiente e, portanto, maior será seu tempo de residência (tempo de retenção) na coluna, ou seja, menor será sua velocidade média. O material eluído comporta-se como um pistão móvel, com concentração máxima nas proximidades da parte central e distribuição de concentração quase gaussiana. À medida que o tempo passa, a largura do pistão aumenta (por efeito da difusão), de modo que se o tempo de eluição for muito grande, os picos coalescem e a separação será incompleta (ver Figura 2.10, vazão V1, na página 11). Por outro lado, se o tempo for muito curto, (vazão V4 da Figura 2.10), pode ser insuficiente para permitir separação completa. Esse raciocínio levou à elaboração da equação abaixo, para o cálculo da eficiência de uma coluna cromatográfica (Fig. 2.16, p. 15):

n = (4Dr/L)2

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Pictoricamente, uma mistura de três componentes apresentaria o comportamento mostrado na Figura A5.1 e a distribuição de concentração (ou de massa) de cada componente é mostrada na Figura A5.2. Observe-se que a Figura A5.2 não é um cromatograma. A substância que sai primeiro da coluna é a primeira a atingir o detector. Do mesmo modo, a primeira porção de cada componente a atingir o detector é a da extremidade direita (na Figura). O cromatograma, por outro lado, é traçado da esquerda para a direita (neste livro). Assim, enquanto a Figura A5.2 mostra uma cauda frontal, o cromatograma correspondente mostraria uma cauda no ramo negativo (descendente) do pico de cada componente.

Figura A5.1 – Desenvolvimento cromatográfico de uma mistura. Figura A5.2 – Distribuição de massa.

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APÊNDICE 6 Outros detectores empregados em Cromatografia 1. Detector de Nitrogênio e Fósforo (DNP) O DNP é um detector utilizado em cromatografia a gás e foi projetado especificamente para a detecção de compostos nitrogenados (N) e fosforados (P) ao nível de traços (concentrações da ordem de ppb). Também conhecido como detector termoiônico, o DNP utiliza uma eletrônica (e o próprio hardware) equivalente ao DIC, inclusive com os mesmos gases (Nitrogênio como fase móvel e Hidrogênio e Ar Sintético como gases da chama). O polarizador contém uma pastilha alcalina e a razão de fluxos dos três gases (que é diferente para compostos nitrogenados ou fosforados) é insuficiente para produzir chama, mas o potencial elétrico estabelecido no local gera um estado de plasma, que aumenta de 14-105 a sensibilidade do detector frente a esses compostos, relativamente a outros compostos. Devido a essas características, o DNP é dito seletivo para compostos nitrogenados e fosforados, unicamente para soluções extremamente diluídas, sendo portanto ideal para a detecção de traços de pesticidas organo-nitrogenados e organo-fosforados. 2. Detector Fotométrico de Chama (DFC) O DFC é basicamente um detector de ionização por chama, no que diz respeito ao hardware. Entretanto, a detecção baseia-se na absorção da radiação emitida pelo enxofre (e também pelo fósforo e ainda outros elementos) na região visível do espectro eletromagnético. Trata-se, portanto, de um espectrofotômetro, obedecendo assim à Lei de Beer. A radiação emitida pela chama atravessa um filtro, o qual seleciona o comprimento de onda desejado (394 nm para o enxofre e 526 nm para o fósforo). Para compostos contendo um desses elementos, sua sensibilidade é da mesma ordem de grandeza do DNP, sendo, portanto, indicado para a detecção de traços (ppb) de pesticidas fosforados e sulfurados. 3. Detector de Íons Até os anos 70 a Cromatografia Instrumental apenas não era empregada na análise de íons (cátions e ânions). Posteriormente foi observado que o bombeamento em paralelo de um reagente complexante poderia transformar o íon em um derivado (na saída da coluna), colorido, o qual seria detectado num espectrofotômetro (ex.: detector UV-VIS). A separação cromatográfica de íons, não discutida neste livro, ocorre numa coluna contendo uma resina trocadora de íons apropriada, tratando-se, portanto, de uma técnica bastante antiga, mais largamente empregada na purificação de águas (deionização). O equipamento é, em última análise, um HPLC típico.

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Para evitar o trabalho de derivação, foi desenvolvido um detector específico, o detector de íons, que é, em última análise, um condutivímetro. Consta de um par de eletrodos contidos numa célula termostatizada. Aplica-se um campo elétrico entre os eletrodos. O efluente da coluna passa pela célula, variando a resistência R entre os eletrodos, de acordo com a Lei de Ohm. A condutância (L) é inversamente proporcional à resistência e é medida em Ohm-1. Essa unidade atualmente denomina-se Siemens (símbolo S). Quando a distância entre os eletrodos é de 1 cm, tem-se:

k = L/A

onde k é a condutância específica e A é a área do eletrodo. Por outro lado, a condutância equivalente (Ce) é relacionada com a condutância específica como:

Ce = 1000 k/c

onde c é a concentração do íon em equivalente-grama/L. 4. Detector de Fluorescência O Detector de Fluorescência, utilizado em HPLC, é equivalente a um Detector de Ultravioleta. A única diferença consiste na localização (ortogonal e não linear) em relação ao caminho ótico. Desse modo, é captada apenas a radiação proveniente do processo de fluorescência, característico de certas classes de compostos. Assim, substâncias que não fluorescem podem existir na amostra sem interferir na detecção. Uma importante aplicação é a análise de aminoácidos em materiais biológicos (ex.: teste do pezinho). Neste exemplo, os aminoácidos são transformados em derivados fluorescentes com o reagente AQC (carbamato de aminoquinolil-N-hidroxisuccinimidila). Nove aminoácidos podem ser analisados em aproximadamente dez minutos, em gradiente ternário, com limite de detecção menor que 10 mg/L. 5. Detector Eletroquímico O Detector Eletroquímico, também utilizado em HPLC, é basicamente uma célula eletroquímica. O analito oriundo da coluna, ao passar pela célula, é oxidado (ou reduzido) pelo potencial aplicado, gerando uma corrente elétrica que é proporcional à sua concentração. Existem dois tipos de detectores:

a) Detector coulométrico: a amostra passa através da célula. Desse modo, todo o material é oxidado (ou reduzido);

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b) Detector amperométrico: a amostra passa pela superfície do eletrodo. Assim, apenas cerca de 1% a 5% do material é realmente oxidado (ou reduzido).

Desenvolvido para detectar traços (ppb a ppt) de íons, este detector exige alta

pureza de solventes e reagentes. A água, por exemplo, deve ser deionizada, purificada em sistema Milli-Q ou equivalente e filtrada em filtros com 0,2 µm (membrana de nylon 66) e sua resistividade deve ser ao menos 18,2 MOhm.cm. O fabricante inclusive aconselha que ao sair do sistema Milli-Q a água passe em coluna com fase móvel C18 para extração.

6. Detector por Espalhamento da Luz com Evaporação

Surgiu recentemente no mercado um detector para HPLC que se apresenta como o detector ideal. Este detector, denominado Evaporative Light Scattering Detector (ELSD), emprega o fenômeno de espalhamento (ou dispersão) da luz, também conhecido como Efeito Tyndall. Embora conhecido desde 1966, quando foi descrito por pesquisadores da Union Carbide australiana, apenas em anos recentes começou a ser comercializado. A grande vantagem do ELSD é sua universalidade (como o DIR) aliada a uma alta sensibilidade (como o DUV), além de apresentar resposta proporcional à massa, não requerendo portanto a preparação de solução padrão para calibração, ou seja, não exige calibração. Os Cromatogramas abaixo ilustram bem a importância desse detector.

Cromatograma A6.1 – Análise de ácidos graxos com: a) Detector UV (215 nm) e b) ELSD.

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O detector de Índice de Refração, embora universal, apresenta baixa sensitividade e não pode trabalhar com gradiente de polaridade. O detector de Ultravioleta, embora apresente um Limite de Detecção muito mais baixo, somente detecta substâncias que absorvam luz ultravioleta. Observe-se que no Cromatograma A6.1.a aparece um pico bastante proeminente de uma impureza presente em baixíssima concentração na amostra. Devido à sua alta absortividade molar, a área do pico é bastante grande e além disso acarreta um problema de resolução entre si e o pico do componente 2. No cromatograma A6.1.b, obtido com um ELSD, esse problema desaparece totalmente, além de obter-se um sinal mais alto para o componente 3, de baixa absortividade molar. A literatura já apresenta um grande número de métodos analíticos empregando um ELSD. Pode-se acrescentar que muitas vezes, principalmente devido à baixa sensitividade do DIR, é necessário realizar-se uma derivação na amostra para que a mesma torne-se detectável por um DUV ou um detector de fluorescência, como por exemplo, no caso de aminoácidos. A derivação sempre é um transtorno, por representar um trabalho a mais e uma fonte de erro a mais.

No ELSD (Figura A6.1.) o efluente da coluna sofre três processos, nessa ordem: a)

nebulização, por um gás inerte, b) evaporação da fase móvel em uma câmara aquecida e c) detecção da luz espalhada pelas partículas remanescentes. Por esta descrição torna-se óbvia a talvez única restrição do ELSD: só detecta substâncias de mais alto ponto de ebulição que a fase móvel.

A referência 13 traz um review sobre ELSD, com 26 referências cobrindo o período de

1966 a 1998.

Figura A6.1 – Diagrama esquemático de um ELSD

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APÊNDICE 7 Estatística 1. Erro estatístico Todo trabalho experimental é dotado de erro. Trata-se aqui de dois tipos de erro: a) erro estatístico e b) erro sistemático. O erro estatístico possui características aleatórias. Pode ser avaliado e minimizado, mas nunca anulado. Apresenta um comportamento gaussiano, isto é, em um determinado número de repetições, os valores que mais se afastam da média (aritmética) ocorrem com menor freqüência e erros positivos e negativos de mesma grandeza ocorrem com igual freqüência. O erro sistemático, por outro lado, é um erro determinado, possui sinal (é positivo ou negativo). Em Cromatografia, o erro sistemático é corrigido automaticamente pelo próprio método de cálculo (Seção 6.3; p. 35). 2. Avaliação do erro estatístico Uma das maneiras de se medir o grau de dispersão de um conjunto de resultados analíticos (repetições) é o desvio padrão (s), o qual pode ser calculado com auxílio da equação 22.

s = [Σ (xi - x )2/(n – 1)]1/2 (eq. 22)

onde xi é um resultado qualquer, x é a média aritmética e n o número de repetições. Esse parâmetro é denominado primeira estimativa do desvio padrão, já que o verdadeiro desvio padrão só pode ser calculado quando n tende para infinito. Entretanto, s só pode ser empregado quando n é maior que 10. Como normalmente n é muito pequeno (3 a 5 determinações em paralelo), emprega-se em seu lugar a segunda estimativa do desvio padrão (sR):

sR = Kn R (eq. 23)

onde R é a amplitude, ou seja, a diferença entre o valor (resultado analítico) maior e o valor menor. O valor de Kn é obtido da Tabela A7.1. 3. Avaliação da exatidão Na realidade, erro de exatidão é o erro sistemático, que seria corrigido pelo próprio método analítico, conforme afirmado acima. Entretanto, o analista pode cometer erros operacionais que resultem em erro sistemático (ex.: uso de solventes contendo impurezas que

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interfiram na identificação). O erro sistemático pode ser avaliado com auxílio do teste t (de Student), que compara a concentração real de uma solução padrão, preparada com todo critério (por exemplo, preparada por um Laboratório de Referência) com a concentração do padrão empregado na calibração do equipamento. A equação seguinte é aplicada, com auxílio da Tabela A7.2:

Tabela A7.1 - Valores de Kn para cálculo de sR.

N 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Kn 0,8862 0,5908 0,4857 0,4299 0,3946 0,3698 0,3512 0,3367 0,3249

tX n

s=

− µ (eq.24)

onde X é a média aritmética das n determinações, µ é a concentração real, s é calculado de acordo com a eq. 22 (p. 66) e t é comparado com o valor tabelado (Tabela A7.2). Se o valor de tcalc for menor ou igual ao de ttab na coluna P = 95%, para o correspondente valor de n-1, o Laboratório em avaliação está correto. Tabela A7.2 - Valores de t para aplicação do teste t.

P (%) n - 1 90 95 99

1 6,314 12,706 63,657 2 2,920 4,303 9,925 3 2,353 3,182 5,841 4 2,132 2,776 4,608 5 2,015 2,571 4,032 6 1,943 2,447 3,707 7 1,895 2,365 3,499 8 1,860 2,306 3,355 9 1,833 2,262 3,250

10 1,812 2,228 3,169

4. Avaliação da reprodutibilidade

O objetivo é comparar a precisão de um Laboratório, de um analista, de um equipamento ou de um método (ou um determinado procedimento) com outro. Aplica-se o teste F, que compara a dispersão de um conjunto de dados com a de outro. Se as diferenças em precisão forem estatisticamente significativas, o valor de Fcalc será maior que o valor de Ftab

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(Tabela A7.3). Para uso da eq. 25, o maior desvio padrão é colocado no numerador, de modo a ter-se um valor de F maior que 1.

Fs

sA2

B2= (eq. 25)

Tabela A7.3 - Valores de F para aplicação do teste F

(n -1) (n - 1) PARA O MÉTODO A

de B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 161 200 216 225 230 234 237 239 241 242 2 18,5 19 19,2 19,2 19,3 19,3 19,4 19,4 19,4 19,4 3 10,1 8,6 9,9 9,1 9,0 8,9 8,8 8,8 8,8 8,8 4 7,7 6,9 6,6 6,4 6,3 6,2 6,1 6,1 6,0 6,0 5 6,6 5,8 5,4 5,2 5,1 5,0 4,9 4,8 4,8 4,8 6 6,0 5,1 4,8 4,5 4,4 4,3 4,2 4,2 4,1 4,1 7 5,6 4,7 4,4 4,1 4,0 3,9 3,6 3,7 3,6 3,6 8 5,3 4,5 4,1 3,8 3,7 3,6 3,5 3,4 3,3 3,3 9 5,1 4,3 3,9 3,6 3,5 3,4 3,3 3,2 3,1 3,1

10 5,0 4,1 3,7 3,5 3,3 3,2 3,1 3,1 3,0 3,0

5. Número ideal de repetições O número ideal de repetições (em paralelo) é calculado com aplicação das eq. 26 e 27:

∆ = t.sR

n (eq. 26) L = 100∆/µ (eq. 27)

Os dados são organizados no Quadro abaixo (os valores são exemplo fictício), para facilitar a interpretação. Na última coluna é indicada a diferença entre o valor de L atual e o da linha anterior. No momento em que a diferença (vale dizer, a diminuição na dispersão dos valores, ou ainda o aumento na precisão) fica desprezível, a critério do analista, este adota o número anterior como sendo o número ideal de repetições. 6. Expressão do resultado final Para explicitar o grau de confiabilidade em uma análise, é necessário indicar os limites de confiança. Na prática, é comum definir os limites a partir da amplitude. Assim, um resultado Re é representado como:

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Re = X + R/2 Na realidade, caso o método tenha sido submetido a uma avaliação estatística completa, emprega-se a relação:

Re X t.K .R

nn= +

n amostra A: µ = 1%

∆ L Dif.

2 0,260 26,0 - 3 0,072 7,2 18,8 4 0,046 4,6 2,6 5 0,036 3,6 1,0 6 0,030 3,0 0,6

7. Cálculo do coeficiente de correlação (r) Na Seção 10.4 (p. 56) foi solicitado o cálculo do coeficiente de correlação. Este cálculo é realizado com uso da eq. 28:

(eq. 28)

Para ordenar os cálculos, faz-se uso do quadro abaixo, onde x e y são, respectivamente, concentração e área do pico.

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Ponto no x y x.y x2 y2

1 x1 y1 x1.y1 x12 y1

2 2 x2 y2 x2.y2 x2

2 y22

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ...

... ... ... ... ... ... n xn yn xn.yn xn

2 yn2

Totais Σx Σy Σx.y Σx2 Σy2

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APÊNDICE 8 Outros parâmetros cromatográficos Além do tempo de retenção absoluto (tr) e da retenção relativa (RR) e do número de pratos teóricos (n), já estudados anteriormente, outros parâmetros são igualmente importantes para uma completa avaliação de um procedimento analítico. São eles o tempo de retenção corrigido (t’r), o fator capacidade (k’), a seletividade (α) e o número efetivo de pratos (Nef), que podem ser determinados pela adição à amostra de uma substância inerte, que não tem afinidade alguma com a fase estacionária, eluindo no volume morto da coluna (junto com a FE). A figura A8 exemplifica, apresentando também o procedimento para cálculo parâmetros. Os dados obtidos do cromatograma (to, tr e L) são inserindo nas equações abaixo, que conduzem ao cálculo desejado.

Figura A8 – Cromatograma com substância inerte.

Equações:

or'r ttt −=

o

or

t

ttk'

−=

(benzeno)r

(tolueno)r

t'

t'=α

2

ref L

t' 16N

=