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Apostila de Parasitologia Protozoários - Helmintos Professora Especialista: Rose Felipe 2009

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Apostila de Parasitologia Protozoários - Helmintos

Professora Especialista: Rose Felipe

2009

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Parasitologia - Introdução

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I) EXAME DIRETO

EXAME MACROSCÓPICO DE PREPARAÇÕES A FRESCO

O diagnóstico é realizado pela observação microscópica dos oocistos entre lâminas e lamínulas. O

exame direto a fresco é realizado diretamente das fezes diarreicas, ou após a diluição das fezes

pastosas, em solução salina a 0,85% (1:5). Examinar com objetiva de imersão. A microscopia de

contraste de fase facilita a observação dos parasitas.

Observações: O oocisto no exame direto aparece maior que aqueles observados nos esfregaços

fixados e corados. Os oocistos apresentam-se como elemento esféricos de 5 a 6 µm de diâmetro,

com membrana externa fina, com um citoplasma finalmente granulado, e com mancha negra

proeminente, central ou lateral, quer representa os corpos residuais. Os quatro esporozoítos livres

aparecem como pequenas manchas dispostas na periferia em forma de "C". O núcleo é visto no

centro do organismo (GARCIA et al., 1983; LEMETEIL, 1987; MEHLHORN, 1988).

2) Método de Faust e cols: centrífugo - flutuação

1) Princípio do teste

A pesquisa de cistos nas fezes pode ser realizada por diferentes métodos. O método de Faust

está baseado na centrifugação e na flutuação em uma solução de Sulfato de zinco. Uma alíquota

de fezes é filtrada e posteriormente centrifugada. O sobrenadante é colocado numa solução de

Sulfato de zinco e centrifugado. O material a examinar é retirado da parte superficial, tratado com

solução de lugol e observado ao microscópio.

2) Aplicação clínica

A principal aplicação do método de Faust é a pesquisa de cistos de protozoários, destacando-se a

pesquisa de cistos de Iodameba bütschlii, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Endolimax

nana. Outros cistos de protozoários, ovos e larvas de helmintos podem ser pesquisados.

3) Reagentes

3.1 – Lugol

1 g de Iodo é macerada com 2 g de Iodeto de potássio. Medir 200 mL de água Tipo I. Adicionar

lentamente pequena quantidade desta água com homogeneização constante. Quando houver

solubilização total, adicionar o volume restante desta água. Armazenar em um frasco de vidro

âmbar e rotular. Transferir 20 mL para um frasco conta-gotas âmbar, o qual será usado no dia-

a-dia.

3.2 – Sulfato de zinco a 33 %

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Preparar uma solução em água Tipo I de modo produzir uma solução de Sulfato de zinco a 33 %

com densidade 1.180 g/L. Habitualmente a solução de Sulfato de zinco a 33 % apresenta

densidade 1.180 g/L, mas a densidade deve ser medida e corrigida conforme necessário.

4) Outros insumos

4.1 – Borrel ou frasco de vidro.

4.2 – Funil de plástico pequeno.

4.3 – Palito de sorvete

4.4 – Tubo cônico de plástico.

4.5 – Caneta para marcar tubo.

4.6 – Gaze tipo queijo ou tamiz metálico de 80 a 100 malhas/cm2.

4.7 – Estante.

4.8 – Lâmina de vidro.

4.9 – Lamínula de vidro.

4.10 – Alça de inoculação ou pipeta Pasteur.

5) Equipamentos

5.1 – Centrífuga.

5.2 – Microscópio.

6) Procedimento detalhado

OBS: Para executar este procedimento é indispensável o uso de luvas, máscara e avental.

1 – Preparar uma suspensão 1:10 de fezes em água Tipo II num frasco do tipo Borrel,

identificado com o número de registro do paciente.

2 – Adaptar a gaze ao funil de vidro.

3 – Identificar um tubo cônico com o número de registro do paciente.

4 - Filtrar a suspensão para este tubo cônico.

5 – Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto.

6 – Desprezar o sobrenadante.

7 – Adicionar 3 mL de água Tipo II e misturar.

8 – Repetir os itens 5, 6 e 7 mais duas vezes.

9 – No último sedimento, adicionar 3 mL de solução de Sulfato de zinco.

10 – Agitar e completar o volume do tubo com o Sulfato de zinco.

11 – Centrifugar a 2500 rpm por 1 minuto.

12 – Aspirar a película superior.

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13 – Identificar a lâmina de vidro com o número de registro do paciente.

13 – Colocar 1 gota na lâmina de vidro.

14 – Colocar 1 gota de lugol na lâmina de vidro.

15 – Homogeneizar.

16 – Colocar a lâminula de vidro.

17 – Observar no microscópio, inicialmente com pequeno aumento.

18 – Registrar o resultado na Planilha de exame

7) Leitura

1 – A riqueza de cistos pode ser verificada com pequeno aumento do microscópio.

2 – As características de cada espécie são observadas com grande aumento ou imersão.

3 – Observar: o número de nucléolos dos cistos, a sua estrutura, a distribuição, a coloração e o aspecto

do glicogênio neles contido.

8) Limitações do método

1 – Amostra do paciente contendo poucos cistos pode fornecer resultado falso negativos.

2 – A incapacidade do observador em identificar as características morfológicas das

diferentes espécies poderá causar resultados enganosos.

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III) Técnica de Coloração por Hematoxilina Férrica

A hematoxilina férrica utilizando fezes preservadas é sem dúvida, o método que maior segurança

oferece na identificação e no diagnóstico da E. histolytica.

Os trofozoítas apresentam uma cor cinza-azulada, diferenciando-se de estruturas de tonalidades

escuras. Seu tamanho varia entre 15 a 60 micra.

O citoplasma é distinto e observa-se uma nítida diferenciação entre o ectoplasma e o

endoplasma, principalmente se a forma observada estava emitindo pseudópodes quando da sua

fixação. O ectoplasma apresenta-se hialino com uma coloração cinza-clara, diferenciando-se do

endoplasma, que se apresenta granuloso e mais intensamente corado. No seu interior pode-se

observar uma ou mais hemácias coradas de negro, evidenciadas nitidamente por um halo claro em

toda sua parte externa. O núcleo geralmente não é central, permanecendo em local afastado da

emissão dos pseudópodes, corando suas estruturas em negro. O cariossoma geralmente é central,

mais corado, os grânulos de cromatina são escuros e distribuídos uniformemente no interior da

membrana nuclear.

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A forma pré-cistica é geralmente esférica, podendo apresentar-se oval, corando em azul-

acinzentado e não apresentando diferenciação entre o ectoplasma e o endoplasma. O vacúolo

ocupa 2/3 do parasito, que é o vacúolo de glicogênio, pouco corado. Os corpos cromatóides, corados

em negro, se apresentam como um ou dois bastonetes de tamanhos diferentes. O núcleo se

apresenta um pouco maior na forma pré-cistica. O cariosoma é grande, de aspecto geralmente

uniforme.

Já nos cistos pode-se observar uma nítida membrana cística corada em negro e o citoplasma se

apresenta em uma cor cinza-azulada contendo um vacúolo de glicogênio grande e não corado. Os

corpos cromatóides, mais freqüentes nos cistos imaturos, coram em negro e apresentam-se em

quantidades variáveis, porém dificilmente são observados nos cistos tetranucleados. Outros

protozoários de interesse nos exames de fezes são: E. coli, E. hartmani, Endolimax nana,

Iodamoeba butschlii, Isospora belli, Balantidium coli. Pode usar para pesquisa de Trichomonas

vaginalis (secreção vaginal e uretral)

Procedimento Prático

I) Material para análise: fezes diarréicas obtidas por purgantes (30 gramas de

sulfato de sódio dissolvidos em água). Evacuação deve ser feita no laboratório

II) Fezes muito pastosas ou endurecidas devem ser colocadas em fixador de

preferência o de Schaudinn (veneno).

III) Utilizar lamínulas limpas e desengorduradas presas a um suporte de borracha

para facilitar a manipulação (figura 1).

IV) Com uma pázinha de sorvete espalhar as fezes fazendo um esfregaço e após

emergir ema placa de Petri contendo o fixador de Schaudinn.

V) Passar esta preparação pelos seguintes líquidos:

1- Álcool iodado - 1 minuto

2- Álcool a 95% - 1 minuto

3- Água corrente para lavagem – 1 minuto dentro da cuba

4- Mordente (alumínio de ferro) – 3 minutos

5- Água corrente - 1 minuto dentro da cuba

6- Solução de Hematoxilina férrica – 5 minutos

7- Água corrente - 1 minuto dentro da cuba

8- Diferenciador (alumínio de ferro) até que o esfr egaço adquira uma

transparência adequada. (muita experiência): momento crucial

9- Água corrente - 2 minutos dentro da cuba.

10- Álcool absoluto – 2 minutos.

8

11- Álcool a 95% - 2 minutos

12- Álcool creosoto - 2 minutos

13- Creosoto de Faia - 2 minutos

14- Montar com bálsamo do Canadá: sobre uma lâmina limpa e desengordurada colocar

uma gota de bálsamo, e sem deixar bolhas de ar, colocar a preparação com o

esfregaço voltado para baixo, sobre o mesmo.

A preparação poderá ser colocada em estufa a 37º C para a secagem do bálsamo do

Canadá, limpando-se o excesso com auxílio de xilol e papel de filtro. Examinar com

objetiva de imersão e ocular 5x ou 10x.

Entamoeba histolytica

Giardia lamblia

cisto

Trofozoíto

cisto

Trofozoíto

Entamoeba coli (trofozoíto e cisto)

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Desenhos das Lâminas

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Protozoários sanguíneos

Preparação do esfregaço sanguíneo e coloração – Mét odo de GIEMSA:

(diagnóstico do tripanosomas, dos plasmódios, das l eishmanias e Toxoplasma).

I) Preparo de esfregaço sanguíneo

A) Sangue com EDTA

B) Preparam-se esfregaços finos tocando uma lâmina limpa, desengordurada,

em uma pequena gota de sangue, de modo que fique próximo de uma

extrimidade da lâmina. Uma segunda lâmina espalhadora (lâmina de

extensão) é segurada pelas bordas, em ângulo de 30 graus sobre a lâmina

que tem o material e recuada sobre a gota fazendo que se espalhe ao longo

da borda da lâmina espalhadora. Com suavidez e rapidez, empurre a lâmina

espalhadora para frente, de modo que o sangue se espalhe e corra em

camada plana.

C) Deixe secar ao ar e core conforme a descrição.

II) Procedimento de coloração

A) Identificação do Trypanosoma cruzi – hemoflagelado

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Objetivos da aula: reconhecer as seguintes formas evolutivas: tripomastigotas,

amatigostas e epimastigotas de T. cruzi.

1) Tripomastigotas

• Examinar lâmina de esfregaço sanguíneo corado pelo método Giemsa

(visualizar o parasito entre as hemáceas).

• Descrever a posição do cinestoplasto, posição do núcleo, membrana

ondulante e flagelo.

B) Identificação de Leishmania spp.

Objetivos da aula: reconhecer as seguintes formas evolutivas: promastigotas e

amastigotas de Leishamnia ssp.

1) Promastigotas

• As promastigotas de Leishmania ssp são encontradas no trato intestinal do

mosquisto Flebotomíneo (mosquito palha), mas também podem ser encontrados em

culturas in vitro

• Descrever a posição do cinestoplasto, posição do núcleo e flagelo.

2) Amastigotas

Epimastigota de T.cruzi

Amastigota de T. cruzi

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• As amastigotas serão encontradas em células do sistema fagocitário, presentes

no sangue circulante ou nos órgãos de indivíduos infectados.

• Examinar lâminas obtidas de amstigotas obtidas em linfonodo.

• Descrever a posição do cinestoplasto, posição do núcleo e flagelo.

D) Identificação de Plasmódios ( Plasmodium sp)

Objetivos da aula: reconhecimento das formas sanguíneas dos palsmódios

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D) Identificação de Toxoplasma gondii.

Objetivos da aula: reconhecimento dos principais estágios parasitários de gondii, diferenciando

estágios encontrados na fase aguda (taquizoítos) da fase crônica (bradizoítos em cistos

teciduais).

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Desenhos das Lâminas

Bradizoíto

Taquizoítos

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Schistosoma mansoni

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Desenhos das Lâminas

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Método de Lutz ou de Hoffmann (sedimentação espontâ nea)

Princípio do método:

Método baseado na sedimentação espontânea, específico para a pesquisa de ovos de Schistosoma

mansoni, porém é altamente eficiente e amplamente utilizado para a pesquisa de todos os parasitos.

Material necessário:

1. Cálice de decantação

2. Peneira

3. Gaze dobrada em 4

4. Água corrente ou destilada

5. Espátula de madeira (tipo abaixador de língua)

6. Lâmina e lamínula

Tomar cerca de 2 g de fezes recém emitidas, dissolvê-las no próprio recipiente de coleta (frasco padrão

para coleta de amostra) utilizando um pouco de água. Transferir o material dissolvido para um cálice de

decantação fazendo filtrar em peneira contendo gaze em 4. Completar até ¾ do volume de água e

deixar repousar em superfície firme e livre de vibrações por no mínimo 2 horas.

Retirar o sedimento com um canudo ou pipeta Pasteur e transferir para lâmina de vidro adicionando 2

gotas de solução de Lugol e cobrindo com lamínula. Observar ao microscópio em objetiva de 10x.

Taenia sp

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Desenhos das Lâminas

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Hymenolepis nana

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Ascaris sp

Ovo Ovo

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Desenhos das Lâminas

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FLUTUAÇÃO SIMPLES - WILLIS (flutuação em salina sat urada)

Essa técnica se baseia na propriedade que alguns ovos de helmintos apresentam de flutuarem na

superfície de uma solução de densidade elevada e de aderirem ao vidro. Este procedimento é específico

para a pesquisa de ovos de Ancilostomídeos.

1. A solução saturada de cloreto de sódio é feita adicionando aproximadamente 40g de NaCl a 100mL

de água sob aquecimento até o ponto em que o sal não se dissolva mais na água. A densidade desta

solução deve ser de aproximadamente 1,20g/mL.

2. Colocar uma quantidade de fezes (aproximadamente 2 g) coletadas de várias partes do bolo fecal em

uma pequena cuba contendo uma parte de solução saturada de cloreto de sódio, dissolver as fezes

nesta solução e acrescentar água até a borda.

3. Colocar sob a borda da cuba uma lâmina de vidro quase tocando a solução saturada e deixar de 30 a

45 minutos . Após este tempo, inverter a lâmina rapidamente e observar ao microscópio.

Ancylostoma sp

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Desenhos das Lâminas

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Rugai e cols

Barmann Moraes

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Strongyloides stercoralis

Desenhos das Lâminas

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COLETA PARA PESQUISA DE ENTEROBIUS VERMICULARIS

(TÉCNICA DA FITA ADESIVA OU SWAB PERIANAL NOTURNO)

Material necessário

1. Fita de celofane adesiva e transparente (tipo Durex)

2. Toluol (tolueno), Xilol (xileno) ou Iodo-xilol

3. Lâmina para microscopia.

Técnica

1. Colocar um pedaço de fita adesiva transparente em uma espátula de madeira tipo abaixador de língua

com a parte adesiva voltada para fora

2. Pressionar firmemente a espátula contendo a fita adesiva contra as pregas anais e perianais

3. Colar a fita adesiva em lâmina devidamente identificada

4. No momento da execução do exame, levantar cuidadosamente a fita da lâmina e pingar uma gota de

toluol ou xileno e pressionar novamente a fita contra a lâmina. A preparação ficará clara ou levemente

corada, tornando os ovos bem visíveis.

Caso o material não seja examinado imediatamente, não acrescentar o toluol.

Ovos da coleta do anal swab

Fita gomada ou anal swab

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Enterobius vermiculares

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Trichuris trichiura

Wuchereria bancrofti

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Desenhos das lâminas

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Ectoparasitos

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DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP

PROTOZOÁRIOS INTESTINAIS E CAVITÁRIOS

AMEBAS PARASITAS E COMENSAIS

Entamoeba histolytica

cisto Entamoeba histolytica

cisto (corado pelo lugol) Entamoeba histolytica

cisto

Entamoeba histolytica

trofozoíta Entamoeba histolytica

trofozoíta Entamoeba histolytica

trofozoíta

Entamoeba coli

cisto (corado pelo lugol) Entamoeba coli

cisto (corado pelo lugol) Entamoeba coli

trofozoíta Entamoeba coli

trofozoíta

Iodamoeba bütchlii

cisto Endolimax nana

cisto Endolimax nana

trofozoíta

FLAGELADOS INTESTINAIS E CAVITÁRIOS

Giardia lamblia

trofozoíta Giardia lamblia

trofozoíta Giardia lamblia

cisto Giardia lamblia

cisto Trichomonas vaginalis

CILIADOS INTESTINAIS

Balantidium coli

cisto Balantidium coli

trofozoíta Balantidium coli em corte de

intestino Balantidium coli em corte do

intestino grosso

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DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP

PROTOZOÁRIOS DO SANGUE E OUTROS TECIDOS

Plasmodium falciparum

trofozoíta Plasmodium falciparum

gametócitos Plasmodium falciparum

microgametócito Plasmodium falciparum

macrogametócito

Plasmodium vivax

trofozoíta Plasmodium vivax

esquizonte Plasmodium vivax

merozoíto Plasmodium vivax microgametócito

Plasmodium vivax macrogametócito

Trypanosoma cruzi

epimastigota Trypanosoma cruzi

tripomastigota Trypanosoma cruzi

tripomastigota Trypanosoma cruzi

amastigota

Leishmania sp.

amastigota Leishmania sp.

amastigota Leishmania sp. –

promastigota Toxoplasma gondii

trofozoíta Toxoplasma gondii

cisto

VETORES Barbeiros

Triatoma Panstrongylus Rhodnius

Anophelini

Ovos Larva Pupa Macho Fêmea

Adultos Posição de pouso do adulto

Culicini

Ovos Larvas Pupa Macho Fêmea

Adultos Posição de pouso do adulto

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA

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INSTITUTO DE BIOLOGIA / UNICAMP

HELMINTOS INTESTINAIS

Ovo de

Ancilostomatídeo Ovo larvado de

Ancilostomatídeo Ovo de Ancilostomatídeo Ovo de Enterobius

vermicularis Ovos de Enterobius

vermicularis

Ovo de Ascaris

(fertilizado) Ovo de Ascaris (fertilizado) Ovo de Ascaris (larvado e

decorticado) Ovo de Ascaris

(infértil) Ovo de Ascaris (infértil)

Ovo de Schistosoma

mansoni Ovo de Fasciola hepatica Ovos de Taenia Ovo de Taenia Proglote grávido

Taenia solium

Ovo de Hymenolepis

diminuta Ovo de Hymenolepis

nana Ovo de Trichuris trichiura Ovo larvado de

Trichuris trichiura Proglote grávido Taenia saginata

Cápsula bucal

Ancilostoma duodenale Cápsula bucal Ancilostoma

duodenale Cápsula bucal

Necator americanus Cápsula bucal Necator americanus

Bolsa copuladora de A. duodenale

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Bibliografia Consultada

- DE CARLI, G.A. – Parasitologia Clínica – Seleção de Métodos e Técnic as de Laboratório para

o Diagnóstico das Parasitoses Humanas – Editora Atheneu, São Paulo, 2001.

- CIMERMAN, B. & FRANCO, M.A. - Atlas de parasitologia: artrópodes, protozoários e helmintos.

São Paulo, Ed. Atheneu, 1999.

- LEVENTHAL, R. & CHEADLE, R.- Parasitologia Médica. Texto e Atlas. 4ªed. Editora Premiere,

2000.

- NEVES, D.P. - Parasitologia humana . 10ª ed. Editora Atheneu (SP), 2003

- REY, L. - Bases da parasitologia médica. 2ª ed. Guanabara Koogan (RJ), 2002.

- VALLADA, E.P.; -Manual de Exames de Fezes - coprología e parasitolo gia. Editora Atheneu

São Paulo, 1993

- NEVES, D.P. - Parasitologia dinâmica . 1ª ed. Editora Atheneu (SP), 2003.

- FERREIRA, M.U. e SCHHUMAKER, T.T.S. – Fundamentos Biológicos da Parasitologia

Humana. Editora Manole, São Paulo, 2003.

- VERONESI, R. & FOCACCIA, R. - Tratado de Infectologia. São Paulo, Editora Atheneu, 1999

Páginas de internet: WWW.dpd.cdc.gov/dpdx/Default.htm : página do Center for Disease Control and Prevention com imagens e textos sobre parasitos de importância em saúde pública. www.cdfound.to.it/html/atlas.htm www.fcfrp .usp.br /dactb/Parasitologia/ATLAS_DE_PARASITOLOGIA .htm www.farmacia.ufmg.br/ACT/atlas/