Apostila microbiologia como fazer analise microbiologica

ISO 17025

KITLABOR Comércio de Produtos de Laboratórios Ltda. Rua Eurico Hosterno, 300 – Sala 03 – Santa Mônica Florianópolis/SC. Fone/Fax: (48)3233-3013, [email protected] - CNPJ: 09.164.441/0001-01.

1

SUMÁRIO

1 – Técnica de membranas filtrantes..............................................2 2 - Avaliação da qualidade microbiológica da água.....................4

2.1 - Bactérias Heterotróficas..................................................4

2.2 - Clostridium perfringens...................................................6 2.3 - E.coli / Coliformes totais..................................................8 2.4 – Enterococos....................................................................11 2.5 - Pseudomonas aeruginosa..............................................12

3 – Tempo de incubação das placas..............................................14

ISO 17025


2

.

1 - TÉCNICA DE MEMBRANAS FILTRANTES

A técnica de membrana filtrante é um método rápido e preciso para isolamento

e identificação de colônias de bactérias. Esta técnica é recomendada pelo Standart of

Methods for the Examination of Water and Wasterwater, referência internacional em

análises em águas.

Antes de começar as análises, esterilize a capela com álcool 70% e ligue a

lâmpada germicida por 10 minutos. Obs: Desligar a lâmpada germicida antes do início das análises. Se estiver ligada, a lâmpada germicida esterilizará sua

amostra e poderá ocasionar danos à saúde se ficar exposto por longos períodos.

Etapas:

1 – Com auxílio de bomba a vácuo, filtrar 100 mL de amostra através de uma

membrana filtrante de 47 mm de diâmetro e 0,45 µm de porosidade estéril, utilizando

equipamento de filtração fornecido pela KITLABOR;

2 – Remover assepticamente a membrana do equipamento de filtração, com

auxílio de uma pinça e colocá-la sobre a superfície da placa contendo o Agar desejado.

Obs: antes de usar a pinça, esteriliza-la flambando na chama.

3 – Incubar a placa a ser analisada invertendo-a.

Observações:

Antes do início de trabalho, o funil deve estar auto clavado;

Rinsar (limpar) o funil de filtração com 20 a 30 ml de água destilada após a

troca de amostra a ser filtrada;

Abaixo, encontram-se fotos exemplificando os passos:

ISO 17025


3

ISO 17025


4

2 - AVALIAÇÃO DA QUALIDADE MICROBIOLÓGICA DA ÁGUA

A água contém uma série de microorganismos, alguns naturais do

ecossistema aquático e outros, microorganismos transitórios, provenientes do solo e de

dejetos industriais e domésticos.

O controle dessa população bacteriana é de fundamental importância, visto

que densidades elevadas de microorganismos na água podem determinar a

deterioração de sua qualidade, com desenvolvimento de odores e sabores

desagradáveis e produção de biofilmes. Além disso, quantidades elevadas de bactérias

podem apresentar risco à saúde dos consumidores, pois algumas delas podem atuar

como patógenos oportunistas, especialmente problemáticas para indivíduos debilitados

imunologicamente.

2.1 - Bactérias Heterotróficas

Apesar de ser virtualmente impossível a determinação de todas as bactérias

presentes em uma água, a determinação de bactérias heterotróficas é de fundamental

importância, seja em água bruta ou tratada ou mineral.

A determinação da quantidade de bactérias heterotróficas em águas é um

importante instrumento auxiliar no controle bacteriológico para avaliação das condições

higiênicas e de proteção dos poços e fontes.

A presença de bactérias heterotróficas em quantidades elevadas pode impedir

a detecção de coliformes, seja devido a produção de fatores de inibição, seja por um

desenvolvimento mais intenso.

Não há na legislação um valor máximo permitido para a quantidade de

bactérias heterotróficas, mas é de extrema importância a determinação da densidade

delas, pois assim podemos determinar possíveis causas de deterioração da qualidade

da água.

ISO 17025


5

A composição em g/L (gramas por litro) do agar contendo o meio de bactérias

heterotróficas é a seguinte:

Digerido pancreático de caseína: 5,00

Extrato de levedura: 2,50

Dextrose: 1,00

Agar: 15,00

As colônias irão desenvolver uma coloração amarela-esbranquiçada, como por

exemplo, às que estão ilustradas na foto abaixo. O tempo de incubação é de 48 horas

a 36°C.

.

ISO 17025


6

2.2 - Clostridium perfringens

A determinação de esporos de Clostridium perfringens em água é uma

importante avaliação de contaminação fecal remota, útil em situações onde outros

indicadores de menor resistência, tais como E. coli, já não se encontrariam mais

presentes.

O Clostridium perfringens é uma bactéria anaeróbia em forma de bastonete,

sulfito redutora, amplamente distribuída na natureza e considerada como parte da

microbiota intestinal do homem e de animais. Os esporos são eliminados nas fezes e

dessa forma chegam ao meio aquático onde apresentam excepcional longevidade, em

função da grande resistência a condições ambientais desfavoráveis.

Após realizar as filtrações, seguir o procedimento:

● Colocar as placas na jarra de anaerobiose em posição invertida;

● Colocar 40 ml da solução “A” no becker;

● Colocar 2 cápsulas de carbonato de cálcio no becker;

● Feche a jarra de anaerobiose e deixe a 36°C por um período de 48 horas.

ISO 17025


7

A composição em g/L do agar é a seguinte:

Caseína enzimática hidrolizada: 3,70

Digestão peptídica de tecido animal: 3,70

Triptose: 7,50


Lactose: 9,40

Fosfato dipotássico: 3,30

Sulfato lauril de sódio: 0,05

Sulfito de sódio: 1,60

Agar: 15,00

Se ocorrer presença, as colônias apresentarão uma coloração azul escuro à

negra a exemplo da figura abaixo.

ISO 17025


8

2.3 - E.coli / Coliformes totais

As águas de abastecimento e águas minerais apresentam o risco de serem

poluídas por águas residuárias e excretas de origem animal ou humana, podendo,

desta forma, conter microorganismos patogênicos, tornando-se assim um veículo de

transmissão de doenças. Por isso há a necessidade de análises rotineiras das

mesmas, para determinar seu grau de segurança do ponto de vista bacteriológico.

Para a avaliação das condições de potabilidade de uma água utilizam-se

bactérias do grupo coliforme, que atuam como indicadores de poluição fecal, pois estão

presentes no trato intestinal humano e de outros animais de sangue quente, sendo

eliminadas em grande número pelas fezes. A presença de coliformes na água indica

poluição, com o risco potencial da presença de microorganismos patogênicos e sua

ausência é evidência em uma água bacteriologicamente potável, uma vez que são

mais resistentes na água que as bactérias patogênicas de origem intestinal.

Como o grupo dos coliformes totais inclui gêneros que não são de origem

exclusivamente fecal, isto limita sua aplicação como indicador específico de

contaminação fecal. O reconhecimento deste fato levou ao desenvolvimento de

métodos de enumeração de um sub-grupo de coliformes denominados coliformes

fecais (termo tolerantes), os quais são diferenciados dos coliformes totais pela sua

capacidade de fermentar a lactose em temperatura elevada.

A definição do grupo de coliformes totais inclui as bactérias na forma de

bacilos Gram-negativos, não formadores de esporos, aeróbios ou anaeróbios

facultativos, capazes de fermentar lactose com produção de gás em 24 horas a 36 C.

O grupo inclui cerca de 20 espécies, dentre as quais encontram-se tanto bactérias

originárias do trato gastrintestinal de humanos como também diversos gêneros e

espécies de bactérias não entéricas, como Serratia e Aeromonas, por exemplo. Por

essa razão, sua enumeração em água e alimentos é menos representativa, como

indicação de contaminação fecal do que a enumeração de coliformes fecais.

ISO 17025


9

A definição de coliformes fecais é a mesma do grupo de coliformes totais,

restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás

em 24 horas à 42ºC. Esta definição, objetivou, em princípio, selecionar apenas

coliformes do trato intestinal. Atualmente sabe-se, entretanto, que o grupo de

coliformes fecais inclui 3 gêneros (Escherichia coli, Enterobacter e Klebsiella), dos

quais os dois últimos incluem cepas de origem não fecal.

Todos os sistemas analisados deverão apresentar resultados negativos, isto é,

ausência em 100 mL.

Entretanto, para facilitar as análises, a KITLABOR disponibiliza a placa

E.coli/coliformes totais, onde pode-se obter os 2 grupos na mesma placa e na mesma

temperatura.

A composição em g/L do agar contendo o meio E.coli/coliformes totais é a

seguinte:

Peptona especial: 5,00

Cloreto de sódio: 5,00

Sorbitol: 1,00

Lauril sulfato de sódio: 0,10

Substrato cromogênico: 0,08

Substrato fluorogênico: 0,05

Agar: 15,00

A placa é incubada a 36ºC em 24 horas. Após esse período, faz-se então a

leitura. Para coliformes totais, as colônias ficarão verdes à azul. Terminada a contagem

das mesmas, levar a placa numa lâmpada UV negra. Se ocorrer brilho em alguma

colônia, esta será E. coli (coliforme fecal). Aconselhamos que para facilitar a leitura

destas colônias, deve-se fazer em local escuro. Segue abaixo fotos exemplificando-as.

ISO 17025


10

ISO 17025


11

2.4 - Enterococos

O habitat normal destes grupos de bactérias é o trato intestinal humano e de

outros animais e estas bactérias normalmente não ocorrem em águas e solos de áreas

não poluídas, sendo que as poucas incidências estão relacionadas diretamente a

animais de vida selvagem ou à drenagem dos solos por enxurradas.

Embora estas bactérias possam persistir por longos períodos em águas de

irrigação com alto teor eletrolítico, geralmente não se multiplicam em águas poluídas,

sendo, portanto, sua presença indicativa de contaminação fecal recente.

Este grupo de bactérias engloba várias espécies que apresentam diferentes

graus de resistência às variações ambientais e origens fecais específicas. Assim, as

espécies incluídas no gênero Enterococcus apresentam maior resistência e são

caracterizadas por sua capacidade de crescer em temperaturas de 10 a 45 C, pH de

até 9,6 e em meios com altas concentrações de NaCl. Além disso, conseguem

sobreviver a temperaturas de 60 C durante 30 minutos.

As placas de Petri contendo o meio de cultura Agar são colocadas em estufa a

36 C durante 48 horas. A coloração das colônias varia do rosa ao vermelho escuro.

A composição em g/L do agar contendo o meio de Enterococos é a seguinte:

Triptose: 20,00


Dextrose: 2,00

Fosfato dipotássio: 4,00

Agar: 10,00

A foto abaixo ilustra a presença de Enterococos numa análise realizada em

laboratório.

ISO 17025


12

2.5 - Pseudomonas aeruginosa

A diversidade bioquímica da Pseudomonas aeruginosa e sua resistência a

agentes antimicrobianos são fatores que têm determinado um grande interesse em seu

estudo, pois contribuem para sua importância como patógeno oportunista, como

microrganismo formador de biofilme (“limo”), interferindo em muitos processos

industriais e como microrganismo de importância em processos de deterioração,

atacando uma variedade de materiais.

Nos últimos anos, seu estudo em águas de piscina tem merecido uma atenção

especial e esse interesse deriva do fato de pesquisas recentes terem evidenciado a

relação entre a alta incidência de otite em nadadores e a presença de Pseudomonas

aeruginosa nessas águas recreacionais.

A contaminação dessas águas por Pseudomonas aeruginosa pode ser

decorrente de sua introdução através da pele de banhistas, da superfície da pele

contaminada por matéria fecal, da urina ou de contaminação da própria fonte de água

ISO 17025


13

que abastece as piscinas. A presença desta bactéria em águas minerais envazadas em

garrafões plásticos reutilizáveis (normalmente de 20 litros) também tem sido

constantemente relatada, especialmente pela grande produção de biofilme no interior

destes recipientes e a má higienização destes nas empresas engarrafadoras,

determinando a deterioração da água (alteração de sabor, odor e aparência), além de

poder contribuir para a disseminação de um patógeno oportunista de extrema

importância.

As placas de Petri contendo o meio de cultura Agar são incubadas a 36 C por

aproximadamente 48 horas.

A composição em g/L do agar contendo o meio de Pseudomonas aeruginosa é

a seguinte:

Digestão pancreática de gelatina: 20,00

Cloreto de magnésio: 1,40

Sulfato de potássio: 10,00

Cetrimida: 0,300

Agar: 15,00

O crescimento das colônias tem de 0,8 a 2,2 mm de diâmetro de aparência

achatada com coloração acastanhada à esverdeada-negra.

ISO 17025


14

3 - TEMPO DE INCUBAÇÃO DAS PLACAS

BACTÉRIAS TEMPO DE INCUBAÇÃO VALOR MÁXIMO

PERMITIDO

Bactérias heterotróficas 48 horas Sem especificação

Clostridium perfringens 48 horas Ausência

E.coli / coliformes totais 24 horas Ausência

Enterococos 48 horas Ausência

Pseudomonas aeruginosas 48 horas Ausência

S.A.C KITLABOR / LAB. BIOLÓGICO

Rua Eurico Hosterno, 300 – Sala 03 – Santa Mônica

Florianópolis- SC – CEP: 88035-400

CNPJ: 09.164.441-0001-01

Fones: (48) 3233-3013 / 8402-1571 / 9632-0023

[email protected] – Marco Aurélio

comercial@laboratóriobiologico.com.br - Raphael

Documents

Apostila microbiologia como fazer analise microbiologica