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HAMILTON R. F. BAVUTTI
MARCOS LUENGO BLANCO
MARIA RAQUEL MANHANI
Aulas Práticas do
Laboratório de Microbiologia
2011
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BIOSSEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
1. O trabalho no laboratório de microbiologia exige, obrigatoriamente, o uso de epi: avental de
mangas longas, com elástico nas mangas, fechado; óculos; touca; máscara facial; luvas; sapatos
fechados ou pró-pés;
2. Evitar o uso de lentes de contato (preferir óculos) e maquiagem;
3. Não fumar, não comer, não beber; evitar tocar a boca e outras mucosas ou pele;
4. Não deixar cadernos, canetas, livros, bolsas, sacolas, dentre outros na bancada de trabalho –
eles devem ser colocados em locais onde não haja risco de contaminação;
5. Cuidado com a chama do bico de Bunsen (figura 1), que deverá estar acesa durante a maior parte
do tempo;
6. Desinfetar a bancada no começo e no fim do trabalho com solução de álcool 70% ou outra
similar (cuidado! Verifique se o bico de Bunsen não está aceso!!!);
7. Ler atentamente o protocolo da aula prática e não iniciar o trabalho antes de ter certeza sobre o
que fazer, a cada passo;
8. Antes de iniciar o trabalho assegure-se de que tem, à mão, todo o material necessário – não
pegar mais material que o necessário nem material indevido;
9. Todo o material deve ser devidamente identificado;
10. Utilizar corretamente as técnicas de manuseio de culturas microbianas:
11. Não falar durante o manuseio das culturas, para minimizar o risco de contaminação das mesmas;
12. Relatar imediatamente, ao professor ou técnico, qualquer evento, acidente ou imprevisto;
13. Quando terminar de trabalhar com culturas, retirar as luvas e descartá-las em lixo infectante,
lavar as mãos com sabonete antisséptico ou similar; deixar secar ao ar;
14. Guardar todo material usado no local apropriado e deixar as bancadas em ordem ao fim do
trabalho;
15. O lixo deverá ser adequadamente acondicionado e todo material contaminado deve ser
autoclavado para descontaminação antes de ser descartado ou reutilizado;
16. Retirar todos os EPIs (avental, luvas, óculos de segurança) quando sair do laboratório;
17. Depois de usar o microscópio, desligar a luz e limpar a objetiva com lenço de papel fino
embebido em solução apropriada para limpeza das lentes, para retirar o óleo de imersão.
Várias precauções devem ser obrigatoriamente tomadas durante os procedimentos no
laboratório de Microbiologia para evitar a contaminação das pessoas, do ambiente e das culturas:
Qualquer procedimento só deve se iniciar depois que todos os objetos necessários estejam o
mais próximo possível do operador e deve ser realizado o mais rapidamente possível;
Os frascos que precisam ser abertos devem ser fechados o mais rapidamente possível; o
trabalho deve ser feito ao redor do bico de Bunsen e não são admitidas correntes de ar;
Figura 1 – Bico de Bunsen
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Todos os frascos abertos devem ter suas “bocas” flambadas imediatamente; eles devem ser
mantidos abertos ao redor do bico de Bunsen, na posição mais horizontal possível e deve ter sua
“boca” novamente flambada antes de ser fechado. Quando você flamba o tubo, o calor cria uma
corrente de convexão, que força o ar para fora, impedindo a entrada de contaminantes;
Os tampões de algodão ou roscas dos frascos não podem ser largados nem colocados sobre
nenhuma superfície; devem permanecer na mão do operador, entre o dedo mínimo e a palma da
mão durante todo o procedimento
Durante as manipulações, as superfícies internas estéreis das placas de Petri devem entrar em
contato com o ar o menor tempo possível;
As partes estéreis de alças ou pipetas que entrarão em contato com as culturas ou com frascos
estéreis não podem ser tocadas nem entrar em contato com outras superfícies não estéreis
como, por exemplo, panos, superfície da bancada, paredes externas de placas ou tubos, etc.
1. Flambagem de alças e agulhas de platina ou de níquel-cromo
alça de níquel-cromo: Segura-se a alça perto de sua parte superior, como se faz com um lápis
(dedo polegar, indicador e médio), num ângulo próximo à posição vertical. Essa posição deixa o dedo
mínimo livre para segurar os tampões dos tubos.
alças calibradas: que carregam um volume conhecido do material, podendo ser usadas em
determinações quantitativas.
"Flambagem": aquecimento gradual da ponta da alça, pois depois do uso em culturas, o
aquecimento rápido pode produzir a liberação de pequenas gotículas e formação de aerossóis. Deve-se
proceder da seguinte maneira:
1. Posicionar a ponta da alça na região azul claro da chama - essa é a região "fria" da chama;
2. Mover lentamente a alça para dentro da região mais quente da chama, acima do cone azul claro,
mantendo-a até que fique completamente vermelha;
3. Mover a alça para que toda a extensão seja aquecida adequadamente ("ao rubro");
4. Esfriar a alça no ar, mantendo-a na mão, sem colocá-la em nenhum local (para que ela não se
contamine outra vez); alternativamente ela pode ser resfriada nas paredes internas de um tubo
ou placa de Petri (regiões estéreis);
5. Usar imediatamente;
6. Re-esterilizar a alça imediatamente após o uso.
Os movimentos que devem ser realizados na flambagem de alças e agulhas encontram-se na figura 2.
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Figura 2 – Seqüência para flambagem de alça e de agulha de inoculação
2. Flambagem de tubos e frascos
Afrouxe o tampão do frasco ou tubo, para que ele saia facilmente;
Segure o tubo com a mão esquerda e retire o tampão com dedo mínimo da mão direita,
mantendo o seguro entre esse dedo e a palma da mão (para retirar o tampão, rode o frasco e
não o tampão - o tampão fica fixo);
Passe a boca do tubo para frente e para trás, dentro da chama do bico de Bunsen enquanto isso,
não se esqueça, o tampão fica preso na mão do operador;
Depois de usar, antes de fechar, repita a operação acima;
Feche o tubo, recolocando o tampão, rodando o tubo e não o tampão.
A seqüência de flambagem de tubos e frascos encontra-se na figura 3.
Segure a alça como se fosse um lápis, quase na
vertical
Posicione a ponta na região fria da chama
Esfrie no ar, próximo à chama
Aqueça gradualmente toda a extensão "ao
rubro"
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Figura 3 – Flambagem de tubos e frascos
3. Manuseio de pipetas
As pipetas graduadas ou de Pasteur, com algodão na ponta, previamente esterilizadas,
acondicionadas em recipientes especiais ou individualmente embrulhadas devem ser
manuseadas na frente do bico de Bunsen;
Segurá-las pela região do bocal, como um lápis, colocando o aspirador e mantendo o dedo
mínimo livre para abrir o frasco que contem o líquido a ser transferido;
Não encostar a ponta da pipeta em regiões não estéreis dos tubos;
A pipeta contaminada deve ser colocada em um frasco com desinfetante, imediatamente após o
uso, para ser transportada.
Remova o tampão com o dedo mínimo
Segure o tampão entre o dedo e a palma da mão
Passe a boca do tubo dentro da chama
Recoloque o tampão, girando o tubo
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MANOBRAS ASSÉPTICAS
I - INTRODUÇÃO
As manobras assépticas são técnicas que impedem a entrada de microrganismos onde estes não são
desejados, ou seja, garantem a boa assepsia. Estas impedirão que microrganismos presentes no ar
ou depositados sobre as diversas superfícies com a poeira, venham a contaminar materiais estéreis
do laboratório como meios de cultura, soluções e equipamentos ou, ainda, culturas puras de
microrganismos. Também impedem que os microrganismos com que estamos trabalhando nos
contaminem ou ao ambiente.
As técnicas referentes à manipulação de culturas envolvem basicamente:
1. Trabalhar em áreas submetidas previamente à limpeza e à desinfecção, para reduzir o número
de potenciais microrganismos contaminantes.
2. Trabalhar dentro da “zona de segurança” do bico de Bunsen*, ou seja, os recipientes (tubos de
ensaio, placas de Petri, etc) com meio de cultura devem ser abertos o mais próximo possível da
chama do bico, sem que haja perigo de superaquecimento ou queimaduras.
3. Flambar ao rubro alça ou agulha antes e após cada inoculação.
4. Deixar esfriar o instrumento antes de obter o inóculo, dentro da zona de segurança,
preferencialmente na parte interna do recipiente que contém o meio de cultura.
5. Flambar rapidamente a boca dos tubos contendo microrganismos ou meio estéril, imediatamente
após abri-los, ou antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre a bancada, sendo
retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha durante a
inoculação.
Os procedimentos 2 a 5 estão ilustrados na Figura 4.
6. Desembrulhar a pipeta estéril dentro da zona de segurança, flambá-la rapidamente e mantê-la
nesta região durante todo o trabalho.
* Operações com microrganismos patogênicos que podem gerar aerossóis, como por exemplo,
agitação intensa, centrifugação, seguidas da abertura do frasco que contém a suspensão microbiana
devem ser realizadas em cabine de segurança (capela de fluxo laminar vertical) e alças e agulhas
devem ser esterilizadas em forno esterilizador (Figura 5).
II - MATERIAL NECESSÁRIO
- pipetador
- pipetas de 1 mL e 10 mL embaladas em papel kraft ou similar
- estante para tubos
- tubos de ensaio contendo 10 mL de solução de corante (simulando meio de cultura
estéril)
- tubos de ensaio contendo 9 mL de água (simulando diluente estéril)
- alça de platina ou de níquel-cromo
- tubos de ensaio vazios
- Erlenmeyer contendo 200 mL de solução de corante (simulando meio de cultura
estéril), com tampão de algodão
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- bico de Bunsen
- placas de Petri embaladas em papel Kraft ou similar
III - OBJETIVOS
1. Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais
frequente em Microbiologia.
2. Descrever as principais técnicas de manobras assépticas.
3. Desenvolver habilidade de: a. manipular tubos contendo meios estéreis, b. realizar diluições
seriadas, c. distribuir meios de cultura estéreis em placas de Petri previamente esterilizadas.
IV - PROCEDIMENTOS
Parte A. Mostrar a vidraria principal (pipetas, placas, tubos, etc) e outros objetos de frequente
manipulação (alça, agulha de inoculação, bico de Bunsen, etc).
Parte B. Treinamento de manobras assépticas
- Transferência de caldo estéril para tubos previamente esterilizados
1. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho.
2. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir, a
válvula da tubulação de gás).
3. Retirar uma pipeta de 1 mL da embalagem e acoplá-la ao pipetador. (Atenção! Este
procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de Bunsen).
4. Distribuir 1 mL de solução de corante, contida em um tubo, para outro tubo vazio, usando
pipeta estéril de 1 mL. (Atenção! flambar rapidamente a boca dos tubos contendo a solução de
corante, imediatamente após abri-los e antes de fechá-los. A tampa nunca deve ser colocada sobre
a bancada, sendo retirada e mantida segura pelo dedo mínimo da mão que detém a alça ou agulha
durante a inoculação; este procedimento deve ser realizado na zona de segurança do bico de
Bunsen). Repetir quantas vezes julgar necessárias até o domínio da técnica.
- Realização de diluições seriadas
1. A partir do tubo contendo solução de corante, transferir, com auxílio de pipeta de 1 ou 2 mL,
de maneira asséptica (próximo ao bico do Bunsen), 1 mL para tubo contendo 9 mL de água. Agitar
suavemente até que o corante se distribua de maneira uniforme. A partir deste tubo, transferir 1 mL
para outro tubo contendo 9 mL de água, agitando suavemente. Deste último tubo, transferir 1 mL para
outro tubo contendo 9 mL de água.
- Transferência de meio de cultura contido em Erlenmeyer para placas de Petri
1. Realizar a desinfecção da bancada de trabalho.
2. Acender o bico de Bunsen (abrir primeiramente a válvula do bico de Bunsen e a seguir, a
válvula da tubulação de gás).
3. Retirar as placas vazias da embalagem e mantê-las próximas ao bico de Bunsen.
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4. Transferir aproximadamente 20 mL de solução de corante contida em Erlenmeyer para cada
uma das placas. (Atenção! flambar rapidamente a boca do Erlenmeyer contendo a solução de
corante, imediatamente após abri-lo, ou antes de fechá-lo. Repetir quantas vezes forem necessárias
até se obter domínio da técnica.
Figura 4 - Manobras assépticas. Fonte: VERMELHO (2006)
Figura 5 - Esterilizador de alças e agulhas
V – Questões para fixação de conhecimento
1. Quais os principais objetivos das manobras assépticas?
2. Cite três procedimentos adotados em laboratório de microbiologia que minimizam o risco de
contaminação ambiental, do operador e do material em estudo.
3. Qual a diluição final obtida no procedimento de diluição seriada realizado?
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COLORAÇÃO DE GRAM E MORFOLOGIA BACTERIANA
I - INTRODUÇÃO
As células bacterianas são caracterizadas quanto aos seguintes aspectos:
Tamanho: as bactérias são microscópicas, medindo desde 0,3 por 0,8 m até 10 por 25 m. Sendo
assim, não é possível visualizá-las a olho nu, precisando de um microscópio óptico comum.
Forma: as bactérias podem ser classificadas quanto à forma em três grupos básicos:
Cocos: células esféricas;
Bacilos: células cilíndricas, em forma de bastonetes;
Espirilos: células espiraladas. Algumas células comportam-se como bacilos curvos, que podem
ser denominados víbrios. Entre as bactérias espiraladas, existem as espiroquetas, as quais são
células flexíveis que se movimentam por rotação e flexão.
Arranjo: grupamentos bacterianos. Dependendo do plano e do número de divisões através das quais as
bactérias continuam unidas, podem aparecer os seguintes arranjos:
- Cocos:
Divisão em um plano:
- Aos pares: diplococos
- Em cadeias: estreptococos
Divisão em dois planos:
- Tétrades
Divisão em três planos:
- Feixes cúbicos: sarcina
- De forma não organizada: cocos em cachos (estafilococos)
- Bacilos e Espirilos:
Apresentam-se, em geral, como células isoladas, porém, ocasionalmente, pode-se observar: bacilos aos
pares (diplobacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).
Coloração de Gram
Em 1884, o médico dinamarquês Christian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes
histológicos com violeta de genciana, através do método de Ehrlich (1882), que bactérias que eles
continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele
adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica) e estabeleceu, a partir daí,
uma nova metodologia de coloração diferencial.
Ao longo desses anos, o mecanismo da coloração de Gram foi intensamente estudado. Surgiram
muitas modificações, contudo sem afetar substancialmente a idéia original.
O mecanismo da coloração de Gram refere-se à composição da parede celular, sendo que as
Gram-positivas possuem várias camadas de peptideoglicano e ácidos teicóicos, e as Gram-negativas,
uma fina camada de peptideoglicano sobre a qual encontra-se uma camada constituída de
lipoproteínas, fosfolipídeos e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração de Gram, o
tratamento com álcool (ou álcool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou
permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal
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violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular
das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição diferente, torna-se desidratada durante o
tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o complexo CV-I não pode
ser extraído.
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de
bactérias. Nas bactérias Gram-positivas, o complexo CV-I é retido na parede após tratamento pelo
álcool-acetona, o que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de
peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactérias Gram-negativas permanecem
suficientemente grandes, mesmo após tratamento com álcool-acetona, possibilitando a extração do
complexo CV-I.
De acordo com Trabulsi (2008), na etapa diferencial com álcool-acetona, as bactérias Gram-
negativas, devido à pequena espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta
camada, em pontos de aderência entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo
corado extraído pelo álcool, que deixa as células descoradas.
A reação de Gram é extremamente dependente do estado fisiológico da célula. As culturas jovens
respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar
com Gram variável, pela perda da capacidade de retenção do corante. Enzimas líticas, excretadas
normalmente por culturas envelhecidas, podem causar danos à parede celular, como por exemplo,
alterando a permeabilidade aos solventes (álcool-acetona). Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal
violeta poderá ser retirado da célula.
Etapas da coloração de Gram e aspectos das células gram-positivas e gram-negativas
Soluções e ordem de aplicação Reação e aspecto das bactérias
Gram-positivas Gram-negativas
1 – Cristal violeta Coradas em violeta Coradas em violeta
2 – Solução de lugol Formação do complexo CV-
I no interior da célula, que
permanece violeta
Formação do complexo CV-
I no interior da célula, que
permanece violeta
3 – Álcool-acetona Desidratação da parede
celular, diminuição da
porosidade e da
permeabilidade;o complexo
CV-I não pode sair da
célula, que permanece
violeta
Extração dos lipídeos da
parede celular, aumento da
porosidade; o complexo
CV-I é removido da célula
4 – Fucsina ou safranina A célula não é afetada,
permanecendo violeta
A célula adquire o corante,
tornando-se vermelha.
II - OBJETIVOS
Executar a técnica de coloração de Gram, relacionar a composição da parede celular das
bactérias com os corantes de Gram, classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram, verificar
a importância de realizar a coloração de Gram a partir de um material clínico, citar as formas das
bactérias e descrever seus arranjos.
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III – MATERIAL
- Culturas de microrganismos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, etc) mantidas
em meio de cultura líquido ou em meio sólido.
Cristal violeta para Gram
Solução de Lugol
Solução de fucsina ou de safranina para Gram
Solução de álcool-acetona
Solução salina fisiológica
Microscópio óptico
Bico de Bunsen
Alça e agulha de inoculação
Pinça
Lâminas para microscopia
Lenços de papel absorvente
Óleo de imersão
IV – MÉTODO
As etapas da preparação do esfregaço a partir de meios líquido e sólido encontram-se na figura 6.
a) Preparação de esfregaço de microrganismos
A partir de meio líquido:
1. Com auxílio de uma alça de platina (ou de níquel-cromo) estéril, colocar duas alíquotas de cultura
bacteriana preparada no meio líquido sobre a superfície de uma lâmina de microscopia;
2. Espalhar sobre a lâmina, fazendo movimentos circulares de dentro para fora;
3. Flambar a alça e deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente;
4. Em seguida, realizar a fixação, passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen;
5. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração.
A partir de meio sólido:
1. Colocar uma pequena gota de solução salina fisiológica na superfície de uma lâmina, com auxílio de
uma alça de platina;
2. Flambar a alça, esfriá-la e coletar o inóculo bacteriano, fazendo uma suspensão homogênea;
3. Flambar novamente a alça;
4. Deixar o esfregaço secar à temperatura ambiente;
5. Em seguida, realizar a fixação, passando duas ou três vezes a lâmina na chama do bico de Bunsen;
6. Esperar a lâmina esfriar e realizar a coloração.
b) Técnica de coloração de Gram
1. Cobrir todo o esfregaço com solução de cristal violeta, aguardar um minuto e desprezar o corante na
pia;
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2. Cobrir todo o esfregaço com solução de lugol, aguardar um minuto e 30 segundos e desprezar o
corante na pia;
3. Inclinar a lâmina e gotejar solução álcool-acetona até que não haja desprendimento de corante (cerca
de 30 segundos). Lavar a lâmina rapidamente em água corrente;
4. Cobrir o esfregaço com fucsina (ou safranina) e aguardar 30 segundos. Lavar a lâmina e secá-la ao ar
(sem esfregá-la).
5. Observar ao microscópio, com objetiva de imersão.
6. Desenhar as estruturas e arranjos observados.
Figura 6 - Seqüência de preparação de esfregaço.
Fonte: VERMELHO (2006)
V – Questões para fixação de conhecimento
1. Explique como pode ser realizada a fixação do esfregaço.
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2. Qual a importância de se realizar a fixação?
3. Descreva a função de cada substância empregada na coloração de Gram.
4. As células bacterianas gram-negativas submetidas à coloração de Gram, na qual o operador
deixou de realizar a etapa de lavagem com álcool-acetona terão que aspecto ao microscópio?
Explique.
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COLORAÇÃO DE ESPOROS BACTERIANOS – MÉTODOD DE WIRTZ
I – INTRODUÇÃO
Uma característica importante, tanto morfológica quanto fisiológica de um grande número de
bactérias Gram positivas pertencentes aos gêneros Bacillus e Clostridium é a esporulação.
Este fenômeno biológico é entendido como a formação de uma nova célula – o esporo, no
interior de uma célula bacteriana. O esporo também é chamado de endósporo e difere química e
fisiologicamente da célula que o originou. Algumas células desenvolvem um mecanismo de ordem
genética, que lhes permite sobreviver em circunstâncias precárias, mostrando um aumento de
resistência ao calor, dessecação, congelamento, alterações químicas e radiações.
Tais propriedades estão associadas em parte à desidratação progressiva por que passa o
citoplasma celular. Tal fenômeno também se verifica quando uma célula vegetativa, desidratada é
aquecida em um meio aquoso. Elas manifestam grande resistência ao calor. Mas esta não é a única
propriedade associada ao fenômeno.
A desidratação gera uma estrutura muito densa e altamente refrátil (refringente). Por esta razão,
uma preparação a fresco de bactérias esporuladas pode ser rápida e satisfatoriamente observada através
de um microscópio ótico de contraste de fase.
As técnicas de coloração usuais são ineficientes e o esporo se mostra impenetrável a corantes
comuns, tais como cristal violeta, azul de metileno. Isto, indubitavelmente, é reflexo da característica
particular de seu envoltório. A membrana do esporo apresenta em sua composição o ácido dipicolínico,
substância ausente na estrutura de células vegetativas. Normalmente, o ácido dipicolínico encontra-se
na forma de sal – dipicolinato de cálcio, devido à grande quantidade de cátions Ca2+ na célula. O
material genético, cromossomo, está protegido por uma dupla camada oriunda da invaginação da
própria membrana interna da forma vegetativa, dificultando (e até mesmo impedindo) a ação de
desinfetantes comuns sobre a estrutura queratinóide destas capas.
A esporulação é um processo demorado, o qual pode levar horas para se completar, dependendo
das condições de cultivo. Uma vez formado, o esporo pode permanecer estável por muitos anos, sem
uma fonte externa de nutrientes. Quando colocado em um meio de cultivo adequado, pode até ser
ativado e dar origem a uma célula vegetativa capaz de se multiplicar.
É indiscutível que a esporulação é um dos mais importantes eventos da fisiologia celular
bacteriana. Do ponto de vista morfológico (forma, tamanho, localização intracelular) os esporos
desempenham importante papel na sistemática bacteriana, pois estes detalhes não são muito repetidos
nas várias espécies.
Existem esporos ovais e esféricos, localizados no corpo da célula vegetativa em posição central,
subterminal ou terminal, e com dimensões variadas, que vão de valores que permitem a inclusão do
esporo no corpo celular até dimensões maiores, causando deformações nas células.
Um dos métodos mais empregados para a coloração de esporos é o de WIRTZ (1908), o qual
emprega o verde malaquita e safranina, como corante e contra-corante, respectivamente. Neste método,
o calor é usado para facilitar a penetração do corante verde-malaquita através da parede do esporo. O
contra-corante safranina é aplicado com a finalidade de diferenciar as células vegetativas dos esporos.
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II – OJBJETIVOS
Executar uma técnica de coloração específica para a visualização de esporos bacterianos.
Identificar através da coloração, a presença, dimensão, forma e localização celular de esporos em
bactérias.
III - PROCEDIMENTO
1. Em uma lâmina limpa, preparar um esfregaço fino a partir de cultura de Bacillus subtilis mantida
há vários dias em meio sólido (por exemplo: ágar triptona-soja).
2. Deixar secar ao ar naturalmente;
3. Fixar sobre a chama do bico de Bunsen (3 a 4 vezes);
4. Deixar esfriar;
5. Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa de verde malaquita a 5% e aquecer até
desprendimento de vapores durante 5 minutos sobre a chama do bico de Bunsen (ou em banho-maria a
100o C por 5 a 10 minutos). Não deixar a preparação secar, acrescentando mais corante;
6. Deixar esfriar;
7. Lavar em água corrente;
8. Corar rapidamente, por 30 segundos, com uma solução aquosa de safranina a 1%;
9. Lavar em água corrente;
10. Deixar secar;
11. Observar ao microscópio ótico com a objetiva de 100 X (imersão).
IV - INTERPRETAÇÃO
Células vegetativas: cor vermelha
Endosporo: cor verde
Bactérias não esporuladas: cor vermelha
Esporos bacterianos livres: cor verde
Anotar os resultados, em relação à forma, dimensão e localização intracelular do esporo.
Aspecto do bacilo: normal ou dilatado
Forma do endósporo: oval ou esférico
Localização do endósporo: central, subterminal ou terminal
V – Questões para fixação de conhecimento
1. Explique o que ocorre com as células de Bacillus subtilis quando estas são deixadas por vários
dias em meio de cultura.
2. Quais gêneros bacterianos são capazes de formar esporos?
3. Por que o esfregaço e a solução de corante verde-malaquita devem ser aquecidos?
4. Se a coloração de Wirtz tivesse sido aplicada a um esfregaço proveniente de células de Bacillus
subtilis reativadas há 24 horas sob condições ideais de cultivo, que estruturas seriam observadas
na lâmina após a coloração?
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PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA
I - INTRODUÇÃO
Até cerca de 1880 os microrganismos eram cultivados em meios líquidos, quando Robert Koch e
sua equipe introduziram os meios de cultura sólidos, os quais permitiram o estudo de espécies isoladas
(culturas puras), separando-as de espécies contaminantes.
Os meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de substâncias que
fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento (cultivo) de microrganismos fora do seu meio
natural. Tendo em vista a ampla diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de
meios de cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais. Além dos nutrientes é preciso
fornecer condições ambientais favoráveis ao desenvolvimento dos microrganismos, tais como pH,
pressão osmótica, umidade, temperatura, atmosfera (aeróbia, microaeróbia ou anaeróbia), dentre
outras.
Os meios de cultura são classificados quanto ao estado físico em sólidos, quando contêm
agentes solidificantes, principalmente ágar entre 1 e 2%. O ágar é um polímero - sulfato de ácido
poligalacturônico, extraído de várias espécies de algas, principalmente do gênero Gellidum, cuja função
é solidificar os meios de cultura. Geralmente, a maioria das bactérias não metaboliza o ágar. Os meios
semi-sólidos contêm de 0,075 a 0,5 %, de ágar, dando uma consistência intermediária, de modo a
permitir o crescimento de microrganismos em tensões variadas de oxigênio ou a verificação da
motilidade e também para conservação de culturas; os meios líquidos, não contêm agentes
solidificantes, apresentando-se como um caldo, utilizados para ativação das culturas, repiques de
microrganismos, provas bioquímicas, dentre outros.
Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto à procedência dos constituintes em
naturais ou complexos, quando emprega ingredientes com composição química não definida, tais como
extratos de vegetais (malte, tomate, amido de tubérculos, peptona de soja, etc.) de animais (carne,
cérebro, fígado, caseína, etc.) e de microrganismos (levedura) e artificiais, sintéticos ou ainda
quimicamente definidos quando a composição química é conhecida (usados para trabalhos de pesquisa)
e seus componentes servem para suprir as exigências nutritivas dos microrganismos, em fontes de
carbono, nitrogênio, vitaminas, energia, sais minerais, dentre outros, quando então são conhecidas as
necessidades nutricionais específicas. Quanto à composição química podem ser simples (meios básicos)
ou complexos.
Básicos são aqueles que permitem o crescimento bacteriano sem satisfazer, contudo, nenhuma
exigência em especial (Ex. caldo e ágar simples).
Especiais quando cumprem com as exigências vitais de determinados microrganismos, como meio de
infusão de cérebro e coração, ágar sangue, ágar chocolate (ágar simples fundido, adicionado de sangue
e aquecido a 80°C), meio de carne cozida (com fragmentos de fígado - para anaeróbios), meios Shahidi
Ferguson Perfringens (SFP), Triptose Sulfito Ciclosserina (TSC) , Baird-Parker (com gema de ovo) (meios
ricos ou meios enriquecidos com as substâncias citadas), etc.
De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica, os meios especiais podem ser
classificados em:
Meios de pré-enriquecimento - são aqueles que permitem a recuperção/multiplicação de
microrganismos injuriados, ou seja, para amostras que sofreram algum tipo de tratamento (térmico ou
químico). Ex. água peptonada tamponada, caldo lactosado (isolamento de Salmonella sp em alimentos).
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Meios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de
microrganismos presentes usualmente em baixos números ou de crescimento lento, bem como
microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios têm a propriedade de estimular o crescimento de
determinados microrganismos, mas existem alguns que também podem inibir o crescimento de outros.
Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonella sp (líquidos), Caldo Tioglicolato para
Clostridium perfringens.
Diferenciais - quando contêm substâncias que permitem estabelecer diferenças entre microrganismos
muito parecidos, tais como meio de Eosina Azul de Metileno – EMB (diferencial para coliformes), Ágar
MacConkey para a diferenciação de Enterobactérias, Ágar sangue, agar Baird-Parker para isolamento e
diferenciação de cocos Gram positivos (sólidos).
Seletivos - os que contêm substâncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de
microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: meios com telurito de potássio (para
isolamento de Corynebacterium diphtheriae), ágar Salmonella-Shigella (SS) e ágar MacConkey, meios
com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de
sódio, meio Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibióticos para
isolamento de diversos microrganismos (TSC, SFP, etc.). A maioria deles é também diferencial,
permitindo diferenciar as colônias (sólidos) dos microrganismos.
Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metabólicas permitindo caracterização e
identificação perfunctória ou presuntiva de muitos microrganismos (ágar tríplice açúcar e ferro, meio
Escola Paulista de Medicina – EPM, meio motilidade, indol, lisina – MILi, caldo ou ágar uréia, etc.)
Identificação – utilizados na realização de provas bioquímicas e verificação de funções fisiológicas de
organismos submetidos à identificação (meios Oxidação/Fermentação, ágar citrato, caldo nitrato, meio
semi-sólido, caldo triptofano, meio de sulfito indol motilidade, etc.
Dosagem - empregados nas determinações de vitaminas, antibióticos e aminoácidos.
Contagem - empregados para a determinação quantitativa da população microbiana (ágar de Contagem
padrão em placas – PCA, ágar triptona de soja – TSA, ágar batata dextrose - PDA, ágar Baird-Parker,
etc.)
Estocagem ou manutenção - utilizados para conservação de microrganismos no laboratório, ou seja,
garantem a viabilidade de microrganismos (ágar Sabouraud, para fungos; meio com leite; ágar sangue,
ágar simples; ágar triptona de soja; meio semi-sólido, etc).
II – OBJETIVOS
Familiarizar-se com técnicas de preparação e esterilização de meios de cultura sólidos e
líquidos, de diluentes, além do preparo de pipetas e placas de Petri para posterior utilização.
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III - PROCEDIMENTOS
A. Preparação de meio de cultura sólido de uso geral
1. Em um Erlenmeyer ou outro recipiente apropriado de 250mL, pesar quantidade necessária para o
preparo de 100 mL de meio de cultura não seletivo (por exemplo: Ágar Padrão para Contagem – PCA ou
Ágar Triptona de Soja - TSA) e adicionar 100 mL de água destilada, com auxílio de proveta;
2. Aquecer em banho-maria (ou em chama de bico de Bunsen), agitando freqüentemente com auxílio de
bastão de vidro, até completa dissolução do meio de cultura (o meio torna-se translúcido);
3. Adicionar tampão de algodão e gaze, proteger o tampão com papel manilha ou Kraft (ou similar);
4. Esterilizar o meio de cultura em autoclave à temperatura de 121o C por 15 minutos;
5. Após a esterilização, armazenar o meio de cultura em geladeira (ou em lugar fresco e ao abrigo da
luz).
B. Preparação de meio de cultura líquido – caldo triptona e soja
1. Em um béquer de 150 mL, pesar quantidade necessária para o preparo 50 mL de caldo triptona e soja
– TSB e adicionar 100 mL de água destilada. Com auxílio de um bastão de vidro, agitar até completa
dissolução do meio e cultura;
2. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, 5 mL de caldo para tubos de ensaio com tampa
rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos);
3. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo, um béquer de vidro ou lata de
alumínio), protegendo-os com papel manilha ou kraft;
4. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos.
5. Após esterilização, armazená-la em geladeira ou em lugar fresco.
Observação: Alguns meios de cultura são preparados da mesma forma, porém se for necessário utilizar
algumas substâncias termolábeis (por exemplo: uréia) ou que reajam com as substâncias dos meios
(aminoácidos, açúcares), as mesmas são esterilizadas à parte por filtração, através de membranas (de
nitrocelulose ou acetato de celulose) com poros de 0,22 m de diâmetro (Millipore, Sartorius), e depois
incorporadas, assepticamente, ao meio previamente esterilizado.
C. Preparação de solução fisiológica (0,85% de NaCl) estéril
1. Em um béquer de 250 mL, pesar 0,85 g de cloreto de sódio (NaCl) e adicionar 100 mL de água
destilada. Com auxílio de um bastão de vidro, agitar até completa dissolução;
2. Transferir, com auxílio de pipeta graduada, 5 mL de solução para tubos de ensaio com tampa
rosqueável (Atenção! Não fechar completamente as tampas dos tubos);
3. Acondicionar os tubos em um suporte adequado (por exemplo, um béquer de vidro ou lata de
alumínio), protegendo-os com papel manilha ou kraft;
4. Esterilizar o meio de cultura em autoclave a 121o C por 15 minutos.
5. Após esterilização, armazená-la em geladeira ou em lugar fresco.
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D. Preparação de pipetas e placas de Petri para esterilização
1. De acordo com orientação de seu professor, embrulhar 4 placas de Petri e 5 pipetas graduadas de 2
mL em papel manilha (ou similar);
2. Esterilizar este material em estufa a 180o C por 1 hora ou em autoclave a 121o C por 15 minutos
(neste caso, o material deverá ser seco em estufa antes de ser utilizado);
3. Após esterilização, armazená-lo em lugar seco.
IV – Questões para fixação de conhecimento
1. De acordo com o estado físico, como os meios de cultura são classificados?
2. Cite dois exemplos de meios de cultura que sejam simultaneamente seletivos e diferenciais.
3. Cite o nome de um meio de cultura utilizado na manutenção de culturas bacterianas.
4. Por que o tempo de esterilização é maior em estufa a 180ºC do que em autoclave a 121ºC?
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ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAIS EM AUTOCLAVE
I – INTRODUÇÃO
A autoclave é um equipamento bastante empregado na esterilização de materiais, como meios
de cultura e instrumentação cirúrgica, através de calor úmido (vapor d’ água). Funciona sob altas
pressões e temperaturas, exigindo muito cuidado e atenção durante sua operação. A figura
II – OBJETIVOS
Demonstrar o funcionamento de uma autoclave vertical elétrica e manual, de acordo com as
normas de segurança.
III - PROCEDIMENTO
1. Abrir cuidadosamente a tampa da autoclave.
2. Adicionar água limpa e em quantidade suficiente à autoclave.
3. Colocar o cesto contendo o material a ser autoclavado (distribuir adequadamente os recipientes
de maneira a permitir que o vapor permeie todos eles).
4. Fechar a autoclave através de suas presilhas de segurança.
5. Ligar a autoclave, deixando o botão de controle de velocidade de aquecimento no máximo.
6. Deixar a válvula (situada na tampa da autoclave) aberta até perceber a saída de vapor
condensado.
7. Assim que o vapor começar a sair pela mangueira, indicando que o ar quente foi expulso e a
câmara está saturada de vapor, fechar a válvula.
8. Observar o manômetro/termômetro e aguardar até atingir a pressão e a temperatura desejadas
(geralmente: 1 atm e 121ºC, respectivamente).
9. Assim que se atingirem pressão e temperatura desejadas, reduzir a velocidade de aquecimento e
marcar o tempo de esterilização (geralmente, 15 minutos). Atenção!!! Não deixar que haja
oscilação da pressão e temperatura! Posicionar o contra-peso (situado na tampa da autoclave)
para frente para diminuir a pressão ou para trás para aumentar a pressão.
10. Após o tempo de esterilização, desligar o equipamento.
11. Aguardar que a temperatura decaia para 100º C (ou menor).
12. Com auxílio de luvas de cano longo, abrir a válvula (situada na tampa) para que haja saída total
do vapor.
13. Abrir todas as presilhas de segurança e finalmente, levantar a tampa.
14. Com auxílio de luvas de cano longo retirar da câmara o material esterilizado.
b.
a.
Figura 8 - Autoclave vertical. a. cesto; b. resistência para aquecimento da água e geração de vapor
21
ESTUDO DA CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL E DA MICROBIOTA HUMANA
1 - OBJETIVOS
1. Aplicar as técnicas de manobras assépticas.
2. Verificar a presença de microrganismos em partes do corpo humano, superfícies e ar.
2 - PROCEDIMENTOS
1. Verter o meio de cultura “ágar de contagem padrão” ou ágar triptona de soja previamente fundido em
banho-maria em placas de Petri estéreis. (Atenção! Realizar esta etapa de distribuição dos meios de
cultura na “zona de segurança” da chama do bico de Bunsen para evitar contaminação);
2. Aguardar a solidificação dos meios de cultura nas placas;
3. Expor uma placa com o meio de cultura solidificado em um local de sua preferência (laboratório,
elevador, rampa, saguão, etc) durante 15 minutos;
4. Com as placas restantes, realizar algumas das seguintes opções:
Friccionar um swab previamente umedecido em solução salina estéril na bancada e, em seguida,
espalhá-lo na superfície do ágar (cuidado para não romper o ágar!);
Fazer o mesmo em outro tipo de superfície;
Com auxílio de um swab, retirar material de partes do corpo humano: saliva, língua, ouvido,
superfície das mãos, região inferior da unha, nariz e, em seguida, espalhá-lo na superfície dos
meios de cultura;
Depositar alguns fios de cabelo, unhas sobre os meios de cultura;
Tocar suavemente a extremidade dos dedos na superfície dos meios de cultura;
Soprar, tossir ou espirrar sobre a superfície dos meios;
Expor as placas abertas ao fluxo de saída de ar de um aparelho de ar-condicionado por alguns
segundos.
5. Incubar as placas a 35º C por 48 horas.
III – INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
1. Observar a presença de diferentes colônias na superfície dos meios de cultura, com diferentes
tamanhos, aspectos, cor.
2. Observar os diferentes tipos de bactérias e fungos.
3. Selecionar algumas colônias para serem submetidas à coloração de Gram.
4. Descrever as características (morfologia, arranjo, gram) das colônias submetidas à coloração.
IV – Questões para fixação de conhecimento
1. Quais os cuidados que devem ser observados durante a distribuição de meio de cultura estéril
nas placas de Petri?
2. Qual técnica pode ser empregada para se estimar o grau de contaminação microbiana presente
em um ambiente? Como esta técnica é denominada? Quais suas vantagens e limitações?
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ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA
ONT
I – INTRODUÇÃO
Entende-se por água potável a água para consumo humano cujos parâmetros microbiológicos,
físicos, químicos e radioativos atendam ao padrão de potabilidade e que não ofereça riscos à saúde
(BRASIL, 2004).
A água potável deve estar em conformidade com o padrão microbiológico estabelecido pela
Portaria nº518, de 25 de março de 2004, do Ministério da Saúde (BRASIL, 2004), apresentado na Tabela
abaixo:
Padrão microbiológico de potabilidade da água para consumo humano
PARÂMETRO VMP(1)
Água para consumo humano(2)
Escherichia coli ou coliformes termotolerantes(3)
Ausência em 100mL
Água na saída do tratamento
Coliformes totais Ausência em 100mL
Água tratada no sistema de distribuição (reservatórios e rede)
Escherichia coli ou coliformes termotolerantes(3)
Ausência em 100mL
Coliformes totais Sistemas que analisam 40 ou
mais amostras por mês:
Ausência em 100mL em 95% das
amostras examinadas no mês;
Sistemas que analisam menos de
40 amostras por mês:
Apenas uma amostra poderá
apresentar mensalmente resultado
positivo em 100mL.
NOTAS:
(1) Valor Máximo Permitido.
(2) água para consumo humano em toda e qualquer situação, incluindo fontes individuais como poços,
minas, nascentes, dentre outras.
(3) a detecção de Escherichia coli deve ser preferencialmente adotada.
II – OBJETIVOS
Avaliar a qualidade microbiológica de amostras de água de abastecimento e de água mineral.
III - PROCEDIMENTOS
a) Seleção e preparação dos frascos para coleta das amostras de água
Utilizar frascos com tampas à prova de vazamentos, de material aprovado para contato com água
destinada ao consumo humano e, de preferência, autoclaváveis ou pré-esterilizados. Podem-se também
empregar recipientes descartáveis (sacos plásticos) previamente esterilizados, comercialmente
disponíveis.
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Procedimento para coleta:
- Água mineral engarrafada: deve ser coletada na embalagem original, lacrada. Havendo necessidade de
coletar volumes menores, a partir de embalagens de maior capacidade, deve-se homogeneizar todo o
conteúdo, invertendo a embalagem várias vezes, desinfetar o bocal com etanol 70% e,assepticamente,
abrir o lacre com uma faca ou tesoura estéril ou flambada. Desprezar o volume inicial e coletar a
amostra em um frasco estéril.
- Água de torneira ou tubulações: limpar a área externa da saída com etanol 70%, flambar, se o material
for resistente ao calor, deixar a água fluir por 2 a 3 minutos. Amostras de água clorada devem ter o
cloro totalmente neutralizado imediatamente após a coleta. Para tal, adicionar ao frasco de coleta, antes
da esterilização, 0,1 mL de solução de tiossulfato de sódio a 1,8% para cada 100 mL de água que se
pretende coletar.
b) Abertura das embalagens e tomada da unidade analítica: antes de abrir as embalagens deve-se
desinfetar a área externa com etanol 70%, para remoção dos contaminantes presentes. A abertura e a
retirada da unidade analítica devem ser feitas, preferencialmente, no interior de câmaras de fluxo
laminar, para prevenir qualquer contaminação da amostra. Se não houver fluxo laminar, deve-se
trabalhar na região próxima à chama do bico de Bunsen de tamanho médio, chama azulada, com as
portas e janelas do laboratório fechadas, para evitar correntes de ar.
Todos os instrumentos e utensílios empregados na abertura das embalagens e retirada das
unidades analíticas (tesouras, pinças, facas, espátulas, etc) devem ser previamente esterilizados em
autoclave ou estufa de esterilização ou mergulhados em etanol 70% e flambados no momento do uso.
Se a quantidade de amostra encaminhada para análise for menor do que a unidade analítica requerida,
deve-se submeter metade à análise, reservando a outra metade como contra-amostra.
c) Métodos de análise de água
I. Contagem de heterotróficos- plaqueamento em profundidade (“pour plate”)
Também conhecida como contagem padrão em placas, é um procedimento que objetiva estimar
o número de bactérias heterotróficas na água, particularmente como uma ferramenta para acompanhar
variações nas condições de processo, no caso das águas minerais, ou a eficiência das diversas etapas de
tratamento, no caso de águas tratadas, permitindo ainda verificar as condições higiênicas em diferentes
pontos da rede de distribuição.
1. Inoculação: através de pipeta estéril, adicionar 1 mL e 0,1 mL da amostra de água em placas de Petri
vazias estéreis.
2. Adição do meio de cultura: verter nas placas inoculadas, 15 a 20 mL de ágar padrão para contagem
(PCA), previamente fundido e resfriado a 45o C. Misturar o inóculo com o meio de cultura
movimentando suavemente as placas, numa superfície plana, em movimentos na forma de oito ou em
movimentos circulares, 8 a 10 vezes no sentido horário e 8 a 10 vezes no sentido anti-horário.
3. Incubação: aguardar a completa solidificação do meio de cultura, distribuindo as placas numa
superfície plana. Após a solidificação, inverter as placas e incubar a 35o C por 48 horas.
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Contagem as colônias e cálculo dos resultados: selecionar as placas com 30 a 300 colônias e contar as
colônias com o auxílio de uma lupa, em um contador de colônias. Calcular o UFC por mL da amostra
multiplicando o número de colônias pelo inverso da diluição inoculada. Usar notação exponencial e
apenas uma casa decimal depois da vírgula, na apresentação dos resultados.
UFC/mL = No de colônias/diluição
II. Número Mais Provável de Coliformes Totais e Termotolerantes – Técnica dos Tubos Múltiplos
Introdução
Grupo dos coliformes totais: este grupo inclui as bactérias na forma de bastonetes Gram
negativos, não esporogênicos, aeróbias ou anaeróbias facultativas, capazes de fermentar a lactose com
produção de gás em 24 a 48 horas a 35o C. O grupo inclui cerca de 20 componentes, dentre os quais
encontram-se tanto bactérias do trato intestinal de humanos e de outros animais de sangue quente,
como também diversos gêneros e espécies não entéricas, como Serratia e Aeromonas. Por essa razão,
sua quantificação em água e alimentos é menos representativa, como indicação de contaminação fecal,
do que a quantificação de coliformes fecais ou de E. coli.
Grupo dos coliformes termotolerantes: a definição é a mesma dos coliformes totais, porém,
restringindo-se aos membros capazes de fermentar a lactose com produção de gás, em 24 horas a
45,5o C. Esta definição objetivou, em princípio, selecionar apenas os coliformes originários do trato
intestinal. Atualmente, sabe-se, entretanto que o grupo dos coliformes fecais inclui pelo menos três
gêneros, Escherichia, Enterobacter e Klebsiella, dos quais dois (Enterobacter e Klebsiella) incluem cepas
de origem não fecal. Por este motivo, a presença de coliformes fecais em água e alimentos é menos
representativa, como indicação de contaminação fecal do que a enumeração direta de E. coli, porém
muito mais significativa do que a presença de coliformes totais, dada a alta incidência de E. coli no
grupo fecal.
II.1. Teste presuntivo:
1. Com uma pipeta de 10 mL estéril, adicionar 5 porções de 10 mL em 5 tubos contendo 10 mL de
caldo lauril sulfato triptose (LST) em concentração dupla com tubo de Durhan.
2. Incubar os tubos a 35o C/24h e observar se há crescimento (turvação) com produção de gás. Em
caso positivo, passar aos itens subseqüentes. Em caso negativo, reincubar até completar 48
horas e repetir a leitura, passando para os itens subseqüentes, em caso de crescimento com
produção de gás. A não ocorrência gás após 48 h, indica ausência de coliformes (totais ou fecais)
nos 50 mL de amostra.
II.2. Confirmação de coliformes totais:
1. A partir de cada tubo positivo no item anterior, transferir uma alçada bem carregada de cultura
para tubos de caldo Verde brilhante (VB). Incubar os tubos a 35oc por 24 a 48 h e observar se há
crescimento com produção de gás, confirmativo de coliformes totais.
2. Anotar o número de tubos de VB com gás e determinar o Número Mais Provável (NMP) de
coliformes totais/50mL em tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela 1).
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3. A não ocorrência de gás após 48 h de incubação indica ausência de coliformes totais na amostra.
II.3. Confirmação de coliformes termotolerantes:
1. A partir de cada tubo positivo de LST (item II.1) transferir uma alçada bem carregada da cultura
para tubos de caldo EC.
2. Incubar os tubos a 45,5o C por 24 h e observar se há crescimento com produção de gás,
confirmativo de coliformes termotolerantes.
3. Anotar o número de tubos de EC com gás e determinar o NMP de coliformes fecais/50mL em
uma tabela de NMP apropriada às diluições inoculadas (Tabela1). A não ocorrência de gás após
24 h indica ausência de coliformes termotolerantes na amostra.
Número Mais Provável (NMP) - nível de 95% de probabilidade, para diversas combinações de tubos
positivos e negativos na inoculação de 5 alíquotas de 10 g ou 10 mL da amostra por tubo.
Número de tubos positivos NMP/50mL
1 < 2,2
2 2,2
3 4,4
4 7,2
5 10,2
Fonte: SILVA et al. (2005)
IV – Questões para fixação de conhecimento
1. Explique como os microrganismos coliformes são classificados em nível laboratorial.
2. Os procedimentos para coleta de amostras de água mineral e de água de torneira ou de
tubulações são exatamente os mesmos? Por quê?
3. Uma alíquota de 0,1mL de água mineral foi inoculada, em duplicata, através da técnica de
semeadura em profundidade (pour plate) em ágar padrão para contagem (PCA), seguido de
incubação a 35-37ºC por 48 horas. As contagens de UFC em cada uma das placas foram: 68 e
77. Expresse o resultado em UFC de heteroróficos por mL de água analisada.
4. Em uma análise de coliformes em água pela técnica do Número Mais Provável, empregando-se 5
tubos, encontraram-se:
a) 4 tubos de caldo verde brilhante turvos e com gás
b) 3 tubos de tubos de caldo EC turvos e com gás.
Expresse os resultados em NMP de coliformes/100mL de amostra.
5.
IVIIV - V -
NAÇÃO
26
DETECÇÃO DE COLIFORMES EM ÁGUA – MÉTODO CROMOGÊNICO
ONT ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ÁGUA
Essa metodologia emprega substratos cromogênicos e fluorogênicos para detecção simultânea
de coliformes totais e de Escherichia coli. Basta adicionar o reagente à amostra de água e incubar a 35-
37ºC por 18 a 48h (até 24h para COLILERT – da IDEXX e até 48 h para COLITEST – LKP Diagnósticos).
Interpretação dos resultados - COLILERT
Incolor: frasco com 100 mL de amostra de água.
Amarelo: teste positivo para presença de coliformes totais.
Amarelo/Fluorescência azul: teste positivo para presença de E. coli. AMBIENTAL
À medida que os coliformes se reproduzem no Colilert, eles utilizam ß-galactosidase para
metabolizar o indicador de nutriente ONPG e alterá-lo de incolor para amarelo. E. coli utiliza ß-
glucuronidase para metabolizar MUG e criar fluorescência. Juma vez que a maioria dos não coliformes
não conta com estas enzimas, eles não podem se reproduzir e interferir. Os poucos não coliformes
que têm estas enzimas são seletivamente suprimidos pela matriz especificamente formulada do
Colilert.
abordagem diminui a incidência de falso-positivos e falso-negativos.
27
Passos para uso do COLITEST:
1) Coletar a amostra de água até a marca de 100mL 2) Adicionar o meio de cultura COLItest,
incubando-o a 37ºC por 18-48h
3) Interpretação dos resultados:
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REFERÊNCIAS
RIBEIRO, M. C.; SOARES, M. M. S. R. Microbiologia pratica: roteiro e manual, bacterias e fungos . São
Paulo, SP: Atheneu, 2000. 112p.
SILVA, N. da; CANTÚSIO NETO, R.; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de métodos de análise
microbiológica da água. São Paulo: Varela, 2005. 164 p.
SILVA, N. da; JUNQUEIRA, V. C. A.; SILVEIRA, N. F. A. Manual de métodos de análise microbiológica de
alimentos. 3. ed. rev. e atual São Paulo, SP: Livraria Varela, 2007. 536 p
VERMELHO, A. B. Práticas de microbiologia. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006. 239 p.
