Embed Size (px)
DESCRIPTION
Projecto de Licenciatura (UA)
Citation preview
Apresentação do Relatório de Projecto
António Ramos Nºmec: 30928
Atriplex patula e o stress ao Mercúrio
Sapal
É uma zona de transição entre a terra e o mar, em estuários
ou baías.
Sapal
É uma zona caracterizada por:
Formas aluvionares
Variação periódica das
marés
Grande diversidade faunística e
floristica
Elevada produtividade em termos biológicos
Elevada Salinidade
Atriplex patula
Arthrocnemum perenne
Halimione portucaloides
Juncus maritimus
Sapal – Diversidade Floristíca
Flora dominada por espécies halófitas
Arthrocnemum perenne
Halimione portucaloides
Sapal – Diversidade Floristíca
Flora dominada por espécies halófitas
Adaptações:
• Redução da área foliar
• Aumento da suculência das folhas e caules
• Aumento da massa radicular
• Protecção dos órgãos aéreos por uma cutícula espessa
• Presença de glândulas de sais ao nível das folhas que segregam e acumulam iões• Mecanismos fisiológicos de ajustamento osmótico ou osmorregulação
Plantas de Sapal - mecanismos de resistência
O sapal é uma zona de acumulação de metais, devido a que durante muitos anos foi considerada uma zona de desperdício,
e como tal, eram lançados resíduos para as águas dos rios, que mais tarde chegam ao sapal
Para resistir a esta contaminação, as plantas desenvolveram mecanismos de resistência
Plantas de Sapal - mecanismos de resistência
As plantas de sapal possuem mecanismos de resistência a stress causado por excesso de iões tóxicos:
Acumulação em glândulas de sal ou
em tricomas
Acumulação de metais em vacuolos nas partes aereas
Ligados a ácidos orgânicos (malato,
citrato)
Ligados a fitoquelatinas
Inibição da absorção de metais do solo
Acumulação e imobilização nas paredes celulares
Ria de Aveiro
Ria de Aveiro
É uma lagoa costeira de baixa profundidade
Está permanentemente ligada ao oceano através do canal da Barra
Ria de Aveiro
Principais fontes de água doce são os rios Vouga e Antuã
Encontra-se rodeada por áreas habitacionais e industriais que muitas vezes lançam descargas
poluentes
Ria de Aveiro
Nas últimas décadas têm sido lançados residuos ricos em mercúrio para o Rio Antuã
que mais tarde chegam à Ria de Aveiro no largo do Larajo
Mercúrio
• Símbolo químico Hg
• Metal de transição de número atómico 80
• Micro-contaminante ambiental
• Metal pesado, e como tal não se degrada e mantém-se no ambiente por muitos séculos
Como metal pesado, pode:
Influenciar a fisiologia celular precipitando nutrientes ou alterando a sua absorção
Alterar a actividade enzimática, alterando o armazenamento e transformação da energia
Afecta as possibilidades de sobrevivência e reprodução
Mercúrio
Utilizado amplamente:
Baterias
Barómetros
Extracção de ouro
Fungicidas
Óleos Lubrificantes
Lâmpadas
Termómetros
Mercúrio
O estudo da resistência das plantas de sapal à contaminação por Hg é importante para posterior utilização
em fitorremediação
A espécie Atriplex patula, é de especial interesse pois mostrou ser capaz de produzir elevadas quantidades de ácido oxálico que desempenha funções na tolerância ao
stress com metais
Atriplex patula
O género Atriplex é muito variado e está bem distribuido
Contém espécies presentes desde zonas áridas até zonas costeiras
Caracterizado por ser extremamente tolerante a elevadas
concentrações salinas
Atriplex patula
Atriplex patula pertence ao grupo das dicotiledóneas e encontra-se na família das
Chenopodiaceae
É uma planta anual e pode atingir o comprimento de 120
centimetros
Em Portugal encontra-se distribuida na zona Centro e Sul litoral, em zonas com terrenos
removidos, em solo salinos ou areias de praia
Atriplex patula
O estudo da resistência desta espécie a várias gamas de concentração de mercúrio é importante no âmbito da
sua utilização para fitorremediação de áreas contaminadas
Fitorremediação
A fitorremediação utiliza sistemas vegetais para recuperar águas e solos contaminados por poluentes orgânicos ou inorgânicos e é considerada uma
opção de limpeza de contaminantes de uma área medianamente contaminada a
baixo custo e muito eficaz
Fitorremediação
A ideia é utilizar as plantas como “agente purificador” das águas e solos imobilizando ou acumulando os
contaminantes nas suas raízes ou no solo, tornando-os indisponíveis a outras espécies.
É uma técnica que visa a melhoria da qualidade das águas e dos solos
Fitorremediação
Fitorremediação Fitoextracção
Fitoestabilização FitoestimulaçãoFitovolatilização
Fitodegradação
Rizofiltração Barreiras hidráulicas
Métodos – Culturas in vitro e exposição ao Mercúrio
As concentrações de Hg escolhidas para a exposição foram 1µM, 2µM e
3µM.
Em experiências anteriores, exposições a 5µM ou superior mostraram ser letais in vitro
Condições da cultura in vitro
Temperatura: 24ºC
Fotoperíodo: 16horas
pH: 5,8
Meio MS
Composição mineral do meio e MS
Macronutrientes (g/l)
Micronutrientes (mg/100ml)
Vitaminas (mg/100ml)
KNO3 – 19 H3BO3 – 620 Ácido Nicotínico – 50
NH4NO3 – 16,5 MnSO4.4H20 – 2230 Tiamina.HCl – 50
MgSO4.7H2O – 3,7 ZnSO4.7H2O – 860 Mio-inositol – 5000
CaCL2.2H2O – 4,4 NaMoO4.2H2O – 25 Piridoxina.HCl – 50
KH2PO4 – 1,7 CuSO4.5H2O – 2,5 Biotina – 0,5
CaCl2.6H2O – 2,5 Pantothenate de Calcio - 50
Devido a:
Métodos – Culturas in vitro e exposição ao Mercúrio
Esterilização das sementes em solução de hipoclorito de cálcio a 4% e posterior
lavagem com água destilada esterilizada
Preparação do meio de cultura MS e esterilização.
Distribuição do meio MS por caixas de petri e frascos
Distribuição das sementes por caixas de petri com meio MS
Incubar as placas a 24ºC em um foto
período de 16 horas
Esperar a germinação das sementes e repicar
os embrioes para frascos com meio MS
Deixar as plantas crescer cerca de duas
semanas
Repicar as plantas para novos frascos
com meio MS tratados com
diferentes [Hg]Pesar as plantas expostas ao
mercúrio num intervalo de 2 em 2 dias durante cerca de uma semana, calcular a taxa de
crescimento
Todos os procedimentos têm de ser realizados numa câmara de fluxo
laminar e ter em conta as condições de assépcia
Devido a:
Resultados
Controlo 1 µM
2 µM 3 µM
Foram tiradas fotografias das plantas no final da exposição ao stress (1 semanas)
Resultados
Controlo 1 µM
2 µM 3 µM
Foram tiradas fotografias das plantas no final da exposição ao stress (1 semanas)
A planta exposta à maior concentração apresenta-se com os tecidos mortos, resultado
da exposição
A planta exposta a 2 µM apesar de apresentar sintomas de necrose, ainda possui algumas
folhas em bom estado
As plantas do controlo e [1µM] não apresentam sintomas de fitotoxicidade aparente
Resultados
Com os valores do peso das plantas foi possível construir um gráfico que representa-se a taxa de crescimento ao longo da
exposição
Após os dois dias d exposição, as plantas expostas a 2 e 3 µM começaram a apresentar uma taxa de crescimento negativo, que
se manteve até ao fim da exposição.
0
-9,488
45,702
-33,525
0 -0,807
15,259
-12,092
0
46,154
-1,378 -2,9220
26,134
-15,755 -13,493
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 2 4 7
Dias
Ta
xa
de
cre
sc
ime
nto
(%
)
[Hg] 0 uM
[Hg] 1 uM
[Hg] 2 uM
[Hg] 3 uM
Resultados
Com os valores do peso das plantas foi possível construir um gráfico que representa-se a taxa de crescimento ao longo da
exposição
As plantas exposta a 1 µM, apenas após 4 dias de exposição, começaram a mostrar sintomas de stress com uma taxa negativa
de crescimento
O controlo apresenta um crescimento aberrante, tendo ora taxas de crescimento positivas ora negativas
0
-9,488
45,702
-33,525
0 -0,807
15,259
-12,092
0
46,154
-1,378 -2,9220
26,134
-15,755 -13,493
-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 2 4 7
Dias
Ta
xa
de
cre
sc
ime
nto
(%
)
[Hg] 0 uM
[Hg] 1 uM
[Hg] 2 uM
[Hg] 3 uM
Discussão de Resultados
Podemos afirmar em relação à espécie Antriplex patula que:
• Há um stress associado à contaminação por Hg
• Stress é letal para as plantas expostas a concentrações acima de 2 µM de Hg
• Se forem expostas a concentrações mais baixas, conseguem sobreviver, embora o crescimento seja afectado
• In vitro esta espécie consegue sobreviver a exposições até 2 µM, contudo ex vitro, a contaminação da Ria de Aveiro é muito superior devido a factores ambientais, externos, e no entanto esta espécie consegue sobreviver
Leva a crer que existem mecanismos de resistência que são activados ex vitro que lhes permitem resistir a concentrações
mais elevadas
Discussão de Resultados
Com base nos resultados obtidos e sabendo que esta espécie utiliza vários mecanismos de resistência à contaminação por mercúrio, podemos dizer que é um espécie com potencial na
aplicação para fitorremediação
Contudo é necessário continuar o estudo, de modo a saber se acumula mercúrio, que quantidade é capaz de acumular e
onde acumula, antes de poder ser aplicado na fitorremediação
Fim da primeira parte
Comparação de vários protocolos de isolamento de DNA em folha de Vitis
vinífera
DNAPresente em todos os organismos vivos e sobre várias formas:
DNA nuclear, DNA mitocondrial, DNA cloroplastídico, DNA plasmidico
Molécula formada por um polímero de nucleótidos em que cada nucleótido possui:
Base azotada (Timina, Adenina, Citosina, Guanina)
Desoxirribose (açúcar)
Grupo fosfato ligado ao açúcar
DNAPresente em todos os organismos vivos e sobre várias formas:
DNA nuclear, DNA mitocondrial, DNA cloroplastídico, DNA plasmidico
Molécula de DNA é formada por duas cadeias de nucleotidos anti-paralelas,
Formando uma dupla hélice, onde as bases azotadas de uma cadeia se ligam às da cadeia
paralela
Este modelo permite a incorporação de toda a informação do funcionamento da célula
DNA
O isolamento do DNA de plantas é fundamental para:
• Caracterização genómica de uma dada espécie
• Procedimentos de mapeamento que recorrem a marcadores
genéticos
• Isolamento e identificação de genes para engenharia genética
• Outros
DNA
O isolamento de DNA deve obedecer a vários critérios:
• DNA extraído não deve possuir contaminantes que interfiram com PCR
• DNA deve estar suficientemente intacto
• A quantidade de DNA extraído deve ser adequado
• Procedimento deve ser rápido, simples, barato e com o menor numero possível de químicos perigosos
Vitis vinífera
Pertence à família das Vitaceae
O nome do género esta relacionado com o fruto que produz: a uva
O fruto é geralmente utilizado para a produção de vinho ou uvas de mesa
Dependendo do objectivo da produção, utilizam-se diferentes castas (variedades)
de Vitis vinífera
Vitis vinífera
A videira é uma planta arbustiva, trepadeira
Cresce bem em zonas com Invernos rigorosos (clima temperado) mas também pode crescer em áreas de
clima tropical
A propagação da videira é feita por enxertia, pois desta maneira, apresenta vantagens na qualidade e na
produtividade
Vitis vinífera
O isolamento de DNA na videira é complicado por causa da elevada quantidade de contaminantes
presentes nas células tais como proteínas, polissacarídeos, polifenois, taninas e pigmentos
Para resolver este problema, foram desenvolvidos vários protocolos de isolamento
aperfeiçoados
Contudo, muitos deles continuam a ter problemas com a pureza do extracto, a quantidade, ou são
demorados e complicados
Importância de um protocolo standardIsolamento de DNA
Sem protocolo standard Com protocolo standard
Protocolos diferentes dependendo do objectivo do isolamento
Protocolos diferentes para diferentes órgãos
Muitos tampões
Mais lento devido ao problema de realizar protocolos diferentes
Mais caro
Maior probabilidade de erro humano
Bons resultados, se tudo correr bem
Mesmo protocolo para diferentes objectivos
Mesmo protocolo para diferentes órgãos
Poucos tampões
Barato
Rápido
Probabilidade de erro humano baixa
Bons resultados
Importância de um protocolo standard
Objectivo de um protocolo standard:
É proporcionar um método rápido, simples, barato com bons resultados e facilmente repetível caso necessário
MétodosIsolamento de DNA: princípios básicos
Quebrar a parede celular, triturando o material com azoto
liquido
Membrana celular é desfeita com ajuda de um detergente
(ex:CTAB) para que o DNA seja libertado para o tampão de
extracção
Nesta altura já temos o extracto inicial de DNA.
Contudo este tem um elevado numero de contaminantes
como proteínas, açúcares, etc.
As proteinas são separadas através de desnaturação e
precipitação com cloroformio e fenol
A precipitação do DNA faz-se com etanol e temperaturas baixas
É necessário remover o RNA. Para isto utiliza-se
a enzima RNAse
No fim destes passos, devemos ter um
extracto de DNA de maior ou menor
pureza. Para quantificar o DNA
recorremos ao espectofetometro,
e/ou recorremos uma electroforese em gel
de agarose
Para resolver o problema dos contaminantes, alguns métodos utilizam substâncias como PVP que remove polifenois, a adição de NaCl antes de precipitar o DNA com etanol com a função de
aumentar a solubilidade dos polissacarídeos no etanol, entre outras substâncias.
Métodos - Comparação
1º Protocolo Lodhi et al
• Tampão de extracção
•Utiliza CTAB no tampão
•PVP é utilizado
•Há adição de NaCl antes da precipitação do DNA
•Não tem tampão de lise Nuclear
• Tampão de extração
•Utiliza CTAB no tampão e adição de uma solução 1% CTAB
•Não usa PVP
•Não junta NaCl
•Não tem tampão de lise nuclear
2º Protocolo Stockinger et al
• 4 tampões
•Utiliza CTAB no tampão de lise nuclear
•PVP é utilizado
•Não adiciona NaCl antes de precipitar DNA
•Tem tampão de lise nuclear
3º Protocolo Hanania et al
Métodos - Comparação
• Dois tampões
•Utiliza CTAB no tampão de lise nuclear
•Não usa PVP
•Não é adicionado NaCl antes de precipitar DNA
•Tem tampão de lise nuclear
4º Protocolo Cabrils et al
• Três tampões
•Utiliza CTAB no tampão de lise nuclear
•PVP é utilizado
•NaCl é adicionado antes de precipitar DNA
•Tem tampão de lise nuclear
5º Protocolo Adaptado no laboratório
Resultados e Discussão
Depois de obter os extractos de DNA dos diferentes protocolos, estes foram quantificados espectofotometricamente, e para aqueles que possuíam maior quantidade de DNA, foi corrido
uma electroforese em gel de agarose (0,65%)
Resultados e Discussão
1º Protocolo
Lodhi2º Protocolo
Stockinger
3º Protocolo
Hanania
4º Protocolo
Cabrils et al5º Protocolo
Adaptado no laboratório
A260 0,1589 0,0244 0,204 0,3097 0,0989
A260/A280 0,9978 1,3811 0,9438 0,9360 1,1017
Concentração (µg/g) 264,833 40,667 340 516,167 164,667
Foram realizadas duas réplicas para cada um dos protocolo, e dado que os resultados entre as réplicas do mesmo protocolo eram diferentes, a avaliação dos resultados vai recair sobre as
réplicas com maior quantidade de DNA
Resultados e Discussão
1º Protocolo
Lodhi2º Protocolo
Stockinger
3º Protocolo
Hanania
4º Protocolo
Cabrils et al5º Protocolo
Adaptado no laboratório
A260 0,1589 0,0244 0,204 0,3097 0,0989
A260/A280 0,9978 1,3811 0,9438 0,9360 1,1017
Concentração (µg/g) 264,833 40,667 340 516,167 164,667
O 2º protocolo que apresenta baixas quantidades, o que o torna pouco viável quando são necessárias
elevadas quantidades
Comparando os resultados dos diversos protocolos podemos dizer que:
5º Protocolo obteve a maior pureza, apesar de ter obtido menos quantidade
4º Protocolo obteve o resultado com maior quantidade de DNA, contudo a
pureza mantém-se a par com as outras réplicas
Os 1º e 2º protocolos, apresentam elevadas quantidades de DNA, mas pouca pureza
Resultados e Discussão
Observando os índices de pureza para cada protocolo, vemos que nenhum deles se aproxima de 1,8 que é característico de um isolado puro
Devido a:
Contaminação por proteínas, açucares, etc.
A contaminação pode ser devido a:
Resultado do próprio protocolo
Erro Humano
Material mal esterilizado, ou contaminação pós-esterilização
Para uma melhor avaliação do estado do extracto de DNA, foram realizadas
electroforeses para as réplicas com maior concentração de DNA
Resultados e Discussão1º Protocolo 2º Protocolo 3º Protocolo 4º Protocolo 5º Protocolo
Bandas de DNA – mostram a presença de DNA
Bandas nos poços do gel – causado por contaminações que impediram a completa dissolução do DNA no tampão TE
Marcas de arrastamento nas bandas de DNA – a presença indica de DNA fragmentado, causado provavelmente por manuseamento inadequado.
Conclusão
Com os dados do espectofotómetro e a observação do gel podemos dizer:
• O protocolo adaptado no laboratório, quando comparado com os restantes, apresenta resultados melhores, se considerarmos a quantidade de isolado versus pureza do isolado
•Os protocolos de mais rápida e fácil excussão são o 1º protocolo (Lodhi) , 4º protocolo (Cabrils) , e o 5º protocolo (adaptado no laboratório).
Contudo, os protocolos 4º (Cabrils et al) e 5º (adaptado no laboratório) apresentam melhores resultados (maior
quantidade de DNA e maior pureza do extracto respectivamente), por isso, apesar de não serem tão rápidos
como o 1º Protocolo (Lodhi et al), são mais viáveis pelos resultados que apresentam
BibliografiaPrimeira parte
• Antiochia R. Campanella L. Ghezzi P. Movasaqhi K.; The use of vetiver for remediation of heavy metal soil contamination. Dipartimento di Scienze Chimiche, Universita di Padova, Via Marzolo 1, 35131, Padua, Italy
• Howard Hu, M.D., M.P.H., Sc.D; 2002; HUMAN HEALTH AND HEAVY METALS EXPOSURE; In Life Support: The Environment and Human Health; Michael McCally (ed), MIT press;
• Hagemeyer, J., and Y. Waisel, 1998. Excretions of ions (CD2+, Li+, Na+ and Cl-) by Tamarix aphylla. Physiol. Plant. Vol. 73, pag 541-546;
• McFarlane, G.R. and M. Burchett, 1999. Zinc distribution and extretion in the leaves of the grey mangrove Avicenia marina (Forsk.) Vierh. Environ. Exp. Bot. Vol. 41, pag 411-417;
• Neumann, D., U. Zurnieden, O. Liechtenberger, and I. Leopold, 1995. How does Armeria maritime tolerate high heavy metal concentrations? J. Plant. Physiol, vol. 146, pag 704-717;
• Dinardi, A. L., Formagi, V. M., Coneglian, C. M. R., Brito, N. N., Sobrinho, G. N., Tonso, S., Pelegrini, R., Fitorremediação, Centro Superior de Educação Tecnológica, Laboratório de Pesquisas Ambientais;
• Lutts, S., Lefêre, I., Delpéree, C., Kivits, S., Dechemps, C., Robledo, A., Correal, E., 2004. Heavy Metal acuumulation by the Halophyte Species Mediterranean Saltbush, J. Environ. Qual. Vol. 33, pag 1271-1279;
• Ouarda, Héla El Ferchichi, 2005. Effect of mineral concentration of culture media without growth sibstances on the callogenesis of Atriplex halimus L. African Journal of Biotechnology vol. 4 (9), pp. 960-962;
• Souayah, N., Khouja, M.L., Rejeb, M.N., Bouzid, S., Micropropagation d’un arbuste sylvo-pastoral, Atriplex halimus L. (Chénopodiacées),
• Bajji, M., Kinet, Jean-Marie, Lutts, S., Salt stress effects on roots and leaves of Atriplex halimus L. and their corresponding callus cultures, 1998. Plant Science vol. 137, pp. 131-142;
BibliografiaPrimeira parte
• Weis, J., S., Weis, P., Review: Metal uptake, transport and release by wetland plants: implications for phyroremediation and restoration, 2004, Environment International Vol. 30, pp. 685 – 700;
• Gamborg, O.L., Phillips, G.C., Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Springer Lab Manual;
• http://en.wikipedia.org/wiki/Atriplex;• http://www.biorede.pt/text.asp?id=2305;• http://en.wikipedia.org/wiki/Mercury_(element)#Compounds;• http://portal.icn.pt/ICNPortal/vPT/Areas+Protegidas/ParquesNaturais/RiaFormosa/
ValoresNaturais/Flora+e+vegetacao.htm?res=1280x1024; • http://www.inag.pt/estuarios/MenusEstuarios/Descri%C3%A7%C3%A3o/
descricao_RiaAveiro.htm Segunda Parte
• Correia, António, Mendo, Sónia, Genética Exercícios Teórico-Práticos e Práticos, Universidade de Aveiro, 2001;
• Clark, M.S., Plant Molecular Biology, A laboratory Manual, Springer Lab Manual, 1996;• Lodhi, Muhammad A., Guang-Ning Ye, Norman F. Weeden, Reich, Bruce I., 1994. A simple and
efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and Ampelopsis, Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 12 (1), pp. 6-13;
• Stockinger et al, 1996, A linkage map of sweet cherry based on RAPD analysis of a microspore-derived callus culture population. J. Heredity, Vol. 87, pp. 214-218;
• Hanania, Uri, Velcheva, Margarita, Sahar Nachman, Perl, Avihai, 2004, An Improver Method for Isolating High-Quality DNA From Vitis vinifera Nuclei, Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 22, pp. 173-177;
• Purves, William K., Sadava, David, Orians, Gordon H., Heller, H. Craig, 2001. Life, The Science of Biology, Sixth Edition, Sinauer Associates Inc., W.H. Freeman and Company, U.S.A;
• http://globoruraltv.globo.com/GRural/0,27062,LTP0-4373-0-L-U,00.html;• http://pt.wikipedia.org/wiki/Vitis_vinifera
FIM
