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Diversidade molecular dos camarões de água doce do grupo
Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) (Decapoda,
Palaemonidae) nas ecorregiões hidrográficas do nordeste do
Brasil
ANA CAROLINA CARVALHO XAVIER________________________________________________
Dissertação de Mestrado
Natal/RN, Julho de 2018
Ana Carolina Carvalho Xavier
Diversidade molecular dos camarões de água doce do grupo Macrobrachium amazonicum
(Heller, 1862) (Decapoda, Palaemonidae) nas ecorregiões hidrográficas do nordeste do Brasil
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Sistemática e
Evolução da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito para obtenção
do título de Mestra em Sistemática e Evolução.
Orientador: Prof. Dr. Sergio Maia Queiroz Lima
Co-orientador: Prof. Dr. Fúlvio Aurélio Morais Freire
Natal
2018
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN
Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
Xavier, Ana Carolina Carvalho.
Diversidade molecular dos camarões de água doce do grupo Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) (Decapoda, Palaemonidae)
nas ecorregiões hidrográficas do nordeste do Brasil / Ana Carolina Carvalho Xavier. - 2018.
58 f.: il.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do
Norte, Centro de Biociências, Pós-Graduação em Sistemática e
Evolução. Natal, RN, 2018. Orientador: Prof. Dr. Sergio Maia Queiroz Lima.
Co-orientador: Prof. Dr. Fúlvio Aurélio Morais Freire.
1. Macrobrachium amazonicum - Dissertação. 2. Filogenia -
Macrobrachium amazonicum - Dissertação. 3. Filogeografia -
Macrobrachium amazonicum - Dissertação. I. Lima, Sérgio Maia
Queiroz. II. Freire, Fúlvio Aurélio Morais. III. Título.
RN/UF/BCZM CDU 595.371(812/813)
Elaborado por SARA SUNARIA DE ALMEIDA SILVA XAVIER - CRB-15/572
Ana Carolina Carvalho Xavier
Diversidade molecular dos camarões de água doce do grupo Macrobrachium amazonicum
(Heller, 1862) (Decapoda, Palaemonidae) nas ecorregiões hidrográficas do nordeste do Brasil
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Sistemática e
Evolução da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito para obtenção
do título de Mestra em Sistemática e Evolução.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________________________
Prof. Dr. Sergio Maia Queiroz Lima
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (Orientador)
____________________________________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Augusto Torres
Universidade Federal de Pernambuco
____________________________________________________________
Dra. Françoise Dantas de Lima
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Aliete (Rita) e Eloi (Deloigado) que me proveram todo amor, cuidados e
apoio em todas as decisões que precisei tomar (na vida!). Eles são minha fortaleza, meus filhos
crescidos (dão um trabalho danado), à eles eu devo tudo e mais um pouco.
Meus irmão Marcos, Ana Heloísa (Isa) e Ana Paula, por me aturarem e aceitarem que a
raspa do tacho aqui é a queridinha do papai e da mamãe rsrsrs, obrigada por me apoiarem (cada
um do seu jeito), por serem meu laboratório de observação de personalidades, pelas dicas de
como levar a vida (muitas vezes recusada por ser algo completamente sem sentido, rsrsrs).
Aos meus sobrinhos, Marina (Mari), Ana Luísa (Luli), Beatriz (Bia) e André Luis (Dedé)
por serem os filhos que ainda não tive, por terem os sorrisos e os abraços mais lindos e
apaixonantes que uma tia babona poderia querer. Obrigada por em muitos momentos de aflição
e nervosismos, serem meu alivío e minha calmaria ao me encherem de amor – amo demais
vocês!!!
Aos componentes do grupo de whatsapp familiar mais badalado e sem futuro “Carvalho
Family” – Yáskara (Kakinha), Angélica (Preta), Fabiana (Báfia), Silvio (Capeta), Cibelle
(Ciba), Gabrielle (Bizinha), Isa – Paula (Rimanas), João (OneEgg), Sandra (Sandy) e Gizelle
(Gi), por sempre me proporcionarem gargalhadas e aguentarem meus choros, e olha que foram
muiiitos, muiiitos, choros! Rsrsrs
À Thiago Montenegro, por ser aquele que me acompanhou em muitos momentos
inesquecíveis. Obrigada por todas as lembranças lindas que tenho, por estar ao meu lado em
muitos momentos difíceis. Por muitos anos me mostrou o que é ter alguém que acredita e torce
por você da forma mais sincera que existe...nossa ligação, seja ela qual for, é eterna!
Agradeço ao Professor Sergio Maia por ter sido àquele que me norteou e me deu suporte,
intelectual e emocional, num momento bem difícil. Ao Professor Fúlvio Freire, por ter sido a
porta de entrada para que eu pudesse conhecer à todos, e pela ideia inicial do projeto. Aos dois
pela confiança e amizade dedicados a mim nesse período.
À galera do Laboratório de Fauna Aquática (melhor laboratório), Dr. Márcio, Yasmim,
Matheus, Nathalia, Alex, Dani, Nielson, Bruna, Cadu (e Bela), Mateus, Jéssica, Valéria,
Aninha, Lucas, Roney, Flávia, Thais, Carol, Sávio, Luciano (e Jana) e Waldir, aos últimos sete,
um agradecimento em especial, por toda ajuda concedida, pelas contribuições nesse trabalho!
Agradeço a amizade de cada um de vocês, por me proporcionarem momentos de pura alegria,
descontração e claro, conhecimento, e sim, amo vocês!
À alguns amigos da Pós, Gislaine (Gis), Rudy, Ricardo, Alexandro, Brayan e Mariana
(Mari) por terem sempre uma palavra de carinho e conforto quando me foi necessário, a
amizade de vocês também é muito importante.
Aos meus amigos de trabalho, que mesmo depois de 2 anos longe, me recepcionaram e
me mostraram que a distância não diminui uma amizade, pelo contrário, ela foi fortalecida,
obrigada pelo apoio nos momentos finais dessa minha jornada: Eric, Carol, Jane, Toinha e
Neide.
Aos professores Bruno Bellini, Bruno Goto, Yuri Baseia e Tiego Costa, pelos
comentários e sugestões dadas, nas disciplinas e na banca de qualificação.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa
de estudos concedida durante todo o período do mestrado.
Agradeço à Deus, por me dar a força necessária para continuar sempre seguindo meus
sonhos, sempre colocando em meu caminho pessoas especiais para me ajudar, de uma forma
ou outra, me mostrando que não posso desistir.
Obrigada a todos!!
RESUMO
Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) é uma espécie de camarão de água doce com ampla
distribuição geográfica na região Neotropical e de grande importância socioeconômica no
Brasil. A espécie é encontrada em diversas ecorregiões hidrográficas cisandianas, ocorrendo
desde grandes bacias hidrográficas, como as dos rios Amazonas e Paraná-Paraguai, até bacias
costeiras menores em diferentes domínios fitofisionômicos. No entanto, parte dessa ocorrência
pode ser decorrente de introduções antrópicas. Por se tratar de uma espécie de água doce é
esperado que a dispersão seja limitada e que apresente estruturação populacional relacionada
com as ecorregiões hidrográficas. Mas a ocorrência nas áreas estuarinas pode permitir a
conexão entre bacias hidrográficas adjacentes. Apesar disso, poucos estudos sobre a sistemática
e distribuição geográfica desta espécie foram efetuados no nordeste brasileiro, onde
supostamente a espécie foi introduzida. O presente estudo tem como objetivo investigar a
diversidade molecular das linhagens do camarão do grupo M. amazonicum das bacias das
ecorregiões do nordeste brasileiro (Maranhão-Piauí, Nordeste Médio-Oriental e São Francisco),
no intuito de determinar se a estruturação genética da espécie está relacionada com as
ecorregiões hidrográficas, e verificar possíveis áreas de introdução da espécie. Para isso foram
utilizadas sequências de DNA mitocondrial do gene citocromo oxidade sub-unidade I (COI) e
análises filogenéticas e filogeográficas. Os dados moleculares mostraram a existência de três
clados – Amazonas, Costeiro e Paraná/Paraguai. As amostras do nordeste brasileiro pertencem
ao clado Costeiro e apresentaram baixa diversidade haplotípica na ecorregião do Nordeste
Médio-Oriental, além de apresentarem haplótipos idênticos ao da ecorregião do Estuário do
Amazonas, e distintos da ecorregião adjacente (Maranhão-Piauí), corroborando a hipótese de
que as populações dessa região, bem como da ecorregião do Alto Paraná, também com baixa
diversidade haplotípica, são de fato provenientes de introduções antropogênicas. Essas
informações sobre a evolução e distribuição geográfica do grupo M. amazonicum no Brasil
podem auxiliar no manejo e conservação, ao reconhecer uma linhagem distinta, como ocorreu
com a descrição de M. pantanalense Santos, Hayd & Anger, 2013, os resultados das
delimitações de linhagens e valores de distância p indicam uma possível nova espécie dentro
desse grupo, bem como é possível reconhecer áreas de introdução antrópica.
Palavras-chave: Filogeografia, introdução de espécies, complexo de espécies, DNA
mitocondrial, Macrobrachium pantanalense
ABSTRACT
Macrobrachium amazonicum (Heller, 1862) is a species of freshwater prawns with wide
geographical distribution in the Neotropical region and of great socioeconomic importance in
Brazil. The species is found in several cisandian hydrographic ecoregions, occurring from large
hydrographic basins, such as the Amazon and Paraná-Paraguay rivers, to smaller coastal basins
in different phytophysiognomic domains. However, part of this occurrence may be due to
anthropic introductions. Because it is a freshwater species, it is expected that the dispersion will
be limited and that it will present population structuring related to the hydrographic ecoregions.
But occurrence in estuarine areas may allow connection between adjacent watersheds. Despite
this, few studies on the systematics and geographic distribution of this species were carried out
in the Brazilian northeast, where the species was supposedly introduced. The present study aims
to investigate the molecular diversity of the shrimp strains of the M. amazonicum group of the
ecoregions of the Brazilian northeast (Maranhão-Piauí, Northeast Middle East and São
Francisco), in order to determine if the genetic structure of the species is related to hydrographic
ecoregions, and to verify possible areas of introduction of the species. Mitochondrial DNA
sequences of the cytochrome oxidase subunit I gene (COI) and phylogenetic and
phylogeographic analyzes were used. The molecular data showed the existence of three clades
- Amazonas, Coastal and Paraná/Paraguay. Northeastern Brazilian specimens belong to the
coastal clade and present low haplotypic diversity in the ecoregion of the Northeast of the
Middle East, as well as haplotypes similar to those in the Amazon Estuary ecoregion, and
distinct from the adjacent ecoregion (Maranhão-Piauí), corroborating the hypothesis that the
populations of this region, as well as the ecoregion of the Upper Paraná, also with low haplotype
diversity, are in fact derived from anthropogenic introductions. This information on the
evolution and geographic distribution of the M. amazonicum group in Brazil can help in the
management and conservation, when recognizing a distinct lineage, as occurred with the
description of M. pantanalense Santos, Hayd & Anger, 2013, the results of the delimitations of
lineages and distance values p indicate a possible new species within this group, as well as it is
possible to recognize areas of anthropic introduction.
Keywords: Phylogeography, Introduced species, Species complex, Mitochondrial DNA,
Macrobrachium pantanalense
Sumário
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 9
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 14
2.1. Objetivo geral ................................................................................................................ 14
2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 14
3. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 15
3.1. Área de estudo e amostragem ...................................................................................... 15
3.2. Análise molecular.......................................................................................................... 16
3.2.1 Extração, amplificação e verificação das sequências de DNA .................. 16
3.2.2 Inferência filogenética .................................................................................. 18
3.2.3 Diversidade e estruturação genética............................................................ 19
4. RESULTADOS .................................................................................................. 22
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................... 35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 41
ANEXOS ...................................................................................................................... 55
9
1. INTRODUÇÃO
Decapoda é o táxon bem representativo dentro de Pancrustacea (Regier et al., 2010) e
inclui alguns dos crustáceos mais familiares (Poore, 2004), dentre estes os camarões Caridea.
De acordo com a classificação de Crustacea, proposta por Martin & Davis (2001), esse grupo
de camarões subdivide-se em 36 famílias, dentre as quais se destaca a família Palaemonidae
Rafinesque, 1815 pela sua representatividade e enorme sucesso na colonização de habitats
aquáticos, com seus representantes distribuídos por todos os continentes nas regiões tropicais e
temperadas, habitando corpos de água doce ou salobra (Holthuis, 1952). A subfamília
Palaemoninae é composta por cinco gêneros: Cryphiops Dana, 1852, Palaemon Weber, 1795,
Pseudopalaemon Sollaud, 1911, Palaemonetes Heller, 1869, e Macrobrachium Bate 1868
(Melo, 2003).
O gênero Macrobrachium é o táxon numericamente dominante dentro da subfamília
Palaemoninae, representado por 247 espécies nominais válidas (De Grave & Fransen, 2011;
Fransen, 2015) e distribuídas mundialmente em ambientes de águas dulcícolas e estuarinas de
regiões tropicais e subtropicais (Bauer, 2004), na África, Américas, Ásia e Austrália (Holthuis,
1951,1952; De Grave et al., 2008; Chen et al., 2009; Magalhães & Pereira, 2007).
Muitas espécies do gênero apresentam importância econômica, sendo um dos motivos
para a introdução de algumas delas em outros continentes, como é o caso do Macrobrachium
rosenbergii (De Man, 1878), espécie exótica oriunda da Ásia, introduzida aqui no Brasil para a
comercialização (Magalhães et al., 2005).
Segundo Jalihal et al. (1993), as espécies deste gênero originaram-se de um ancestral
comum que migrou do ambiente marinho para águas continentais, ampliando dessa forma sua
área de distribuição, podendo ser considerados fatores favoráveis a essa transição bem sucedida
entre águas salobra e doce, a grande plasticidade adaptativa e variadas estratégias reprodutivas
que Macrobrachium possui (Jalihal et al., 1993; Short, 2004). Os camarões deste gênero são
componentes importantes da cadeia trófica de ecossistemas estuarinos e límnicos (Mantelatto
& Barbosa, 2005), além de atuarem como trituradores de folhas e consumidores de algas
(Bauer, 2013).
No Brasil são reconhecidas 17 espécies nativas de Macrobrachium (Mantelatto et al.,
2008; Dos Santos et al., 2013; Hayd e Anger, 2013; Pileggi et al., 2013), sendo a espécie M.
pantanalense Santos, Hayd & Anger, 2013, da bacia do rio Paraná-Paraguai recentemente
descrita, e que era reconhecida como M. amazonicum (Dos Santos et al., 2013). Destas, nove
10
apresentam distribuição no nordeste brasileiro: M. acanthurus (Wiegmann, 1836), M.
amazonicum (Heller, 1862), M. birai Lobão, Melo & Fernandes, 1986, M. carcinus (Linnaeus,
1758), M. denticulatum Ostrovski, Da Fonseca e Da Silva-Ferreira, 1996, M. heterochirus
(Wiegmann, 1836), M. jelskii (Miers, 1877), M. nattereri (Heller, 1862) e M. olfersii
(Wiegmann, 1836) (Melo, 2003). Dentre estas espécies, se destacam o M. carcinus, M.
acanthurus e M. amazonicum (Souza et al., 2011), por terem um rápido crescimento e fácil
manutenção em cativeiro, o que confere a essas espécies grande potencial para a aquicultura,
sendo esta última, bastante explorada comercialmente nos estados do norte do Brasil, dando a
essa espécie importância não só ecológica, mas também socioeconômica (Morais-Riodades &
Valenti, 2004; Silva et al., 2007).
O M. amazonicum apresenta ampla distribuição geográfica na região Neotropical
cisandina, com registros em águas costeiras e continentais, da Argentina, Bolívia, Colômbia,
Venezuela, Suriname, Guiana, Guiana Francesa, Peru, Paraguai e Brasil (Holthuis, 1952; Melo,
2003; Magalhães et al., 2005; Valência e Campos, 2007; Vergamini et al., 2010; Pileggi et al.,
2013). O delta do rio Amazonas é a sua localidade tipo (Kensley e Walker, 1982), na região de
Gurupá no Pará, e aqui no Brasil, um levantamentos realizado por Pileggi et al. (2013) relatou
sua ocorrência nas bacias hidrográficas dos estados do Amapá, Amazonas, Tocantins, Pará,
Acre, Roraima, Rondônia, Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, São Paulo,
Paraná, Bahia, Pernambuco, Paraíba, Maranhão, Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte. No
entanto, em alguns estados brasileiros das regiões nordeste e sudeste, estudos apontam que a
ocorrência de M. amazonicum é devido à introdução intencional (antropogênica), relacionados
ao desenvolvimento da pesca de subsistência e carcinicultura (Gurgel & Oliveira 1987;
Vergamini et al. 2011).
Estudos afirmam que o Departamento Nacional de Obras Contra Secas (DNOCS) foi o
principal responsável, desde a década de 40, pela introdução do camarão M. amazonicum, entre
outras, em diversas bacias e açudes do nordeste com a finalidade utilizar os camarões no
forrageio de peixes, oriundos principalmente da região Amazônica, que seriam cultivados
nessas regiões para incentivar a pesca e desenvolvimento por subsistência das comunidades
ribeirinhas do semiárido (Coelho, 1963; Pinto, 1977; Gurgel & Oliveira, 1987; Magalhães et
al., 2005). Da mesma forma, a introdução acidental do M. amazonicum em algumas bacias do
nordeste é relatada pelo próprio DNOCS, que foram confundidos com outra espécie do mesmo
gênero, o Macrobrachium jelskii (Miers, 1877), por serem muito semelhantes
morfologicamente nos estágios mais juvenis (Magalhães et al., 2005). Porém faltam
informações que forneçam com precisão as localidades de onde partiram as matrizes da espécie
11
M. amazonicum utilizadas para a introdução desses camarões na região nordeste do Brasil, bem
como as bacias onde foram de fato introduzidos.
O registro do M. amazonicum no estado de São Paulo, região sudeste do País, ocorreu por
volta de 1966 a 1973 (Torloni, 1993), possivelmente introduzido de forma não intencional, pois
foram confundidos novamente com M. jelskii, que foi trazido para a estação de piscicultura da
Companhia Energética de São Paulo (CESP), durante o processo de transplantação da corvina
de água doce Plagioscion squamosissimus (Heckel, 1840), oriundos de reservatórios do
nordeste (Magalhães et al., 2005). Somado a isso, a introdução da espécie na região de São
Paulo pode ter ocorrido através de outra via. Formas larvais ou até mesmo juvenis provenientes
da ecorregião do Paraguai, principalmente do Mato Grosso do Sul, podem ter sido trazidos junto
aos containers de peixes que foram transplantados nessa região para atividades relacionadas à
pesca esportiva (pesque e pague) (Magalhães, 2000; Magalhães et al., 2005).
Muitos estudos sobre M. amazonicum foram feitos nas últimas décadas. A maioria desses
direcionados à sua biologia, ecologia e desenvolvimento de tecnologias para a cultura comercial
(Odinetz-Collart, 1987; Odinetz-Collart & Moreira, 1993; Valenti, 1993; Moraes-Riodades e
Valenti, 1999; Moraes-Riodades & Valenti 2001; Pantaleão et al., 2011; Anger, 2013),
principalmente no norte do Brasil, devido à iminente sobrepesca da espécie (Freire et al., 2012).
São conhecidos também alguns estudos relacionados a aspectos fisiológicos e reprodutivos
(Maciel & Valenti, 2009; Charmantier & Anger, 2011; Augusto & Valenti, 2016; Soeiro et al.,
2016) relacionando capacidade osmorregulativa e níveis de suporte de salinidade no
desenvolvimento larval. E ainda estudos sobre variações biológicas relacionados à
diferenciação de tamanho em espécimes machos e fêmeas de ambientes lênticos e lóticos
(Odinetz-Collart & Magalhães, 1994), variação morfológica e molecular (Vergamini et al,
2011; Pantaleão et al., 2014) e distribuição e história de vida da espécie (Pileggi et al., 2013;
Hayd & Anger, 2013).
Apesar disso, pouco se sabe sobre a espécie no nordeste do Brasil, que apresenta regimes
hidrológicos extremos, variando de grandes rios com influência amazônica (ecorregião do
Maranhão-Piauí) até rios temporários no semiárido (Nordeste Médio-Oriental), onde
predomina a Caatinga, além de extensas bacias hidrográficas como o rio São Francisco
(Sarmento-Soares et al., 2017). Trabalhos como os de Santos et al. (2006), Sampaio et al.
(2007) e Andrade et al. (2010) analisaram a biologia e ecologia do M. amazonicum dessa região,
enquanto outros trabalhos se dedicaram apenas a indicar locais de ocorrência da espécie nas
regiões hidrográficas do Atlântico Oriental (Coelho & Ramos-Porto, 1984; Gurgel & Oliveira,
12
1987; Magalhães et al., 2005; Pileggi et al., 2013).
Variações populacionais são relevantes na diversificação de linhagens e têm gerado
importantes dados sobre os processos evolutivos através de estudos de padrões genéticos e
morfológicos de divergência populacional (Badyaev & Hill, 2000) e história de vida da espécie
(Mayr, 1997). Os padrões genéticos fornecem informações sobre sistemática, conectividade
entre populações, status de conservação e identificação de estoques pesqueiros (Baeza &
Fuentes, 2013). Estudos envolvendo dados moleculares foram realizados para o gênero
Macrobrachium, utilizando diversos marcadores moleculares buscando compreender melhor
esse gênero (Pereira et al., 2002; Miller et al., 2005, Liu et al., 2007; Pileggi et al., 2010,2014;
Guerra et al., 2014), porém pouco explorando sua ocorrência no nordeste brasileiro.
A recente descrição da espécie M. pantanalense traz uma problemática, apesar de já ser
mencionada por autores em trabalhos anteriores, sobre a existência de um complexo de espécies
em M. amazonicum (Porto, 2004; Hayd & Anger, 2013), ainda se sabe muito pouco a respeito
(Dos Santos et al. 2013). Um trabalho sobre delimitação entre as espécies M. amazonicum e M.
pantanalense, utilizando espécimes de ecorregião da Estuário do Amazonas e Paraguai, foi
realizado por Weiss et al. (2015), onde os autores concordam que as espécies são geneticamente
próximas, com diversidade genética de até 3% para o gene COI, o que seria plausível como
uma variação intraespecífica, o que foi questionado como se tratando disso por Vergamini et
al. (2011), porém Weiss et al. (2015) não excluem a ideia de que um processo de especiação
recente possa ser a explicação para o caso de duas espécies aparentadas e isoladas
geneticamente.
Os camarões de água doce, embora sejam tolerantes à variações abióticas naturais, são
sensíveis a poluição no ambiente aquático, alterações de drenagens e desmatamento (Silva et
al., 2014). Estes impactos nos ambientes aquáticos continentais geralmente acarretam em
consequências negativas para a fauna aquática, como diminuição da diversidade biológica e
genética (Silva et al., 2014). Atualmente os rios do nordeste brasileiro estão passando por uma
grande mudança com a transposição do rio São Francisco, que poderá gerar alterações
ambientais nas bacias receptoras pertencentes à ecorregião no Nordeste Médio-Oriental (bacia
dos rios Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas-Açu e Paraíba do Norte). Assim, um estudo
molecular da biota aquática destas bacias antes da conclusão do empreendimento pode fornecer
um panorama das conexões pretéritas das drenagens destas ecorregiões, e obter informações
pertinentes sobre sua diversidade atual, que podem auxiliar futuras estratégias de manejo e
conservação (Berbel-Filho et al., 2016).
A partir do exposto, fica evidente a lacuna de informações sobre aspectos ecológicos
13
(distribuição geográfica natural e introduzida, influência do clima e da geomorfologia dos rios)
de M. amazonicum das ecorregiões hidrográficas no nordeste brasileiro. Portanto, a partir do
estudo desse táxon, será possível compreender padrões de variação genética, através do uso de
sequências de DNA mitocondrial do gene citocromo oxidade sub-unidade I (COI), numa tentativa
de sanar dúvidas ainda existentes sobre questões relacionadas a presença natural da espécie ou
se sua distribuição no nordeste é supostamente fonte de introdução antropogênica, pois é de
fundamental importância o conhecimento de fauna nativa e os possíveis problemas gerados pela
presença de espécies introduzidas quanto à manutenção do patrimônio genético, possíveis
consequências deletérias com perda de diversidade genética natural, hibridização, e problemas
ecológicos como mudança de cadeia trófica, predação e competição entre espécies nativa e
exóticas (De Moraes et al., 2017).
14
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
- Avaliar a diversidade genética dos camarões do grupo Macrobrachium amazonicum, nas
ecorregiões do Nordeste do Brasil (Nordeste Médio-Oriental, Maranhão-Piauí e São Francisco),
para verificar se há formação de complexo de espécies, se a estruturação genética tem relação
entre as ecorregiões hidrográficas, e verificar possíveis áreas de introdução.
2.2. Objetivos específicos
- Verificar se há existência de um complexo de espécies em M. amazonicum, utilizando
análises de delimitação de espécies, ao longo da distribuição geográfica de cada uma.
- Verificar se há estruturação genética entre as populações das ecorregiões do Nordeste do
Brasil;
- Determinar como é a estruturação genética do grupo M. amazonicum nas ecorregiões
Neotropicais;
- Através das comparações moleculares, analisar se M. amazonicum é uma espécie introduzida
ou natural nas ecorregiões do nordeste do Brasil;
15
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Área de estudo e amostragem
Os exemplares previamente identificados como Macrobrachium amazonicum foram
coletados após o período chuvoso em 2012 e 2013 nas bacias das ecorregiões (sensu Albert et
al., 2011) do Nordeste Médio-Oriental (NEMO), dos rios Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas-
Açu e Paraíba do Norte; e também nas ecorregiões do Maranhão-Piauí (MAPI), da bacia do rio
Parnaíba; e São Francisco (SFRE) em tributários da bacia de mesmo nome (Fig. 1).
As coletas em cada ecorregião foram realizadas com o uso de vários apetrechos de
pesca: peneiras, redes de arrasto, tarrafas, covos, seguindo o método ‘Rapid Bioasssessment
Protocol’ (Plafkin et al., 1989) sob a licença 32656-1/2012 MMA/ICMBio/SISBio. Os animais
coletados foram etiquetados e armazenados em álcool 70% e os que seriam utilizados para
análise molecular, em álcool 96%, um total de 10 indivíduos de cada bacia, quando possível,
tiveram parte de seu tecido (músculo) retirado para as análises. Em laboratório os espécimes
foram identificados e sexados a partir das descrições de seus caracteres diagnósticos descritos
nas chaves de identificação (Holthuis, 1959; Melo, 2003).
16
Figura 1. Representação dos locais de amostragem na bacia do rio Parnaíba (ecorregião do Maranhão-Piauí); nas
bacias dos rios Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas-Açu, Paraíba do Norte (ecorregião do Nordeste Médio-
Oriental), e na bacia do rio São Francisco (ecorregião do São Francisco). Os rios são apresentados em linhas de
diferentes cores e as ecorregiões em tons de cinza.
3.2. Análise molecular
3.2.1 Extração, amplificação e verificação das sequências de DNA
As sequências de DNA mitocondrial (mtDNA) do gene citocromo oxidade sub-unidade I
(COI) foram adquiridas através do protocolo de extração de DNA com cloreto de sódio
(modificado de Miller et al., 1988) e posterior amplificação do fragmento de interesse.
Fragmentos com aproximadamente 20mg de tecido muscular foram homogeneizados em 500ml
de solução tampão de lise celular (Tris HC 50mM, EDTA 50mM, SDS 1%, NaCl 50mM, pH
8,0) com 60 μg de proteinase K e incubado a 55°C durante três horas, no mínimo, até a
completa digestão do tecido. Em seguida, os restos celulares foram estratificados por um
período de 15 minutos por centrifugação a 14.0000rpm (12.000g). Para a precipitação das
proteínas, por serem menos solúveis em alta concentração de sal, 300ml de NaCl 5M foi
adicionado ao sobrenadante, seguido de centrifugação a 14.000 rpm por 15 minutos. Já para a
precipitação de DNA, foram transferidos para um novo tubo 500 ml do sobrenadante e
17
acrescentando-se um volume igual de isopropanol absoluto gelado, sendo armazenado por duas
horas, no mínimo, a - 20°C para uma otimização do processo, sendo em seguida centrifugado
a 14.000 rpm por 15 minutos para uma completa precipitação do DNA.
Após isso, para retirar o excesso de sal, o pellet de DNA formado foi lavado duas vezes
com 750 μL de etanol 70% (v/v) gelado e centrifugado a 14.000 rpm por aproximadamente 5
minutos. Em seguida, o pellet foi seco a 15°C por 15 minutos no concentrador a vácuo
(Concentrator plus, Eppendorf) e ressuspenso em 50 μL de água ultrapura. Todo o material
genético (DNA) foi quantificado em nanofotômetro (Implen®) e as amostras foram
normalizadas para uma concentração de aproximadamente 30ng/μL e armazenadas a -20ºC.
Para a amplificação e identificação das sequências dos marcadores mitocondriais, foi
realizada uma análise preliminar para o gene COI, com a finalidade de avaliar a qualidade das
sequências obtidas com dois pares de iniciadores para o fragmento 3’ do gene mitocondrial do
citocromo oxidase I. Desta forma, a maioria dos indivíduos foram amplificados com os
iniciadores universais COIf/COIa desenvolvidos por Palumbi e Benzie (1991). Os indivíduos
nos quais foram observados picos duplos foram reamplificados com os iniciadores
COIf/COI_MA_R (Rodriguez-Rey – dados não publicados) específico para camarões do
gênero Macrobrachium (Tabela 1).
O primer COI_MA_R foi desenhado considerando o mitogenoma das três espécies do
gênero - M. rosenbergii (Genbank: NC006880), M. lanchesteri (NC012217) e M. nipponense
(NC015073), disponíveis no banco de dados genéticos do “National Center for Biotechnology
Information, U.S. National Library of Medicine” (GenBank - NCBI).
Tabela 1 – Sequência dos iniciadores utilizados para extração e verificação de co- amplificação. Ta =
temperatura de anelamento.
Iniciador Sequência (5ˈ3ˈ) Ta Referência
COIf CCTGCAGGAGGAGGAGACCC 64 Palumbi & Benzie, 1991
COIa AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC 64 Palumbi & Benzie, 1991
COI_MA_R RTTAGCTGTTAGGGGGATTTT 55 Presente estudo
Para as reações de amplificação foram usados 30 ng aproximadamente de gDNA, 1 U de
enzima GoTaq Flexi DNA polimerase, 3 μL de solução tampão Green GoTaq Flexi (5X), 0,2
mM de cada dinucleotídeo (dNTP), 2,5 mM de MgCl2 para as amplificações com
18
COIf/COIMAR ou 2,0 mM de MgCl2 para as amplificações com COIf/COIa, e 0,3 μM de cada
iniciador em volume final de 15 μL. A fim de detectar presença de possíveis contaminações,
foram incluídos controles negativos.
Foram utilizados os seguintes parâmetros de termociclagem para a amplificação: ciclo
inicial de desnaturação a 95°C por um período de 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto
de desnaturação a 95°C, a uma temperatura de anelamento de 55°C por 40 segundos, e uma
extensão de 1 minuto a 72°C nos 35 ciclos para COIf/COIMAR ou 64°C para COIf/COIa,
extendido durante 45 segundos a 72°C, seguidos de outra extensão final de 5 minutos a 72°C.
A visualização dos produtos amplificados foi por eletroforese em gel de agarose a 2,0% (v/v)
em tampão TBE 0,5X (10X: Tris 1 M, Ácido Bórico 1 M, EDTA 2 mM, pH 8,0), corados com
brometo de etídio (10 mg/mL) e visualizados sob luz ultravioleta. O peso molecular padrão 100
pb Plus DNA ladder (Fermentas) foi usado para confirmar o tamanho dos fragmentos e
determinar a quantidade do DNA amplificados.
Os produtos de PCR que apresentavam mais de 40 ng/μL de DNA foram purificados com
o kit de purificação de produtos de PCR Agencourt® AMPure® na plataforma epMotion®
5075 (Eppendorf) através do uso de esferas magnéticas. Os sequenciamentos foram feitos no
sequenciador automático ABI3500 (Applied Biosystems), do Laboratório de Biodiversidade
Molecular na Universidade Federal do Rio de Janeiro (LBDM - UFRJ).
3.2.2 Inferência filogenética
Foram utilizadas sequências parciais do gene COI com 553 pares de base do presente
estudo, sendo 53 sequências de exemplares de M. amazonicum das localidades das bacias da
ecorregião do NEMO – bacia do rio Apodi-Mossoró (Santa Cruz – RN), bacia do rio Jaguaribe
(Orós, Araripe, São Nicolau, Lima Campos e Icó – CE), bacia do rio Piranhas-Açu (São José
de Piranhas – PB e Serra Negra – RN), bacia do rio Paraíba do Norte (Barra de Santana e
Boqueirão – PB); ecorregião do São Francisco, bacia do Rio São Francisco, riacho da Serrinha,
(Serra Talhada – PE); e ecorregião do Maranhão-Piauí, bacia do rio Parnaíba (Pio IX e Aroazes
– PI).
Para o mesmo gene, também foram obtidas 81 sequências de M. amazonicum no
GenBank, publicados por Vergamini et al. (2011), das seguintes ecorregiões: Amazonas
Ocidental (Itacoatiara – AM), Estuário do Amazonas (Santana Aroazes – AP, Abaetetuba – PA,
Belém – PA, Santa Bárbara – PA), NEMO na bacia do Jaguaribe (Aquiraz – CE), Alto Paraná
(Sertãozinho – SP, Avaré – SP, Miguelópolis – SP), e Paraguai (Aquidauana e Miranda – MS).
19
Foram solicitadas diretamente ao autor correspondente do trabalho de Weiss et al., (2015) 13
sequências de M. amazonicum pertencente a ecorregião do Estuário do Amazonas (Almeirim –
PA) e 14 sequências de M. pantanalense da ecorregião do Paraguai (Lago Baiazinha – MS)
(Fig. 2). Essas sequências ainda não estão disponibilizadas no GenBank, totalizando 161
sequências detalhadas na Tabela 2.
Para a edição dos eletroferogramas obtidos foi utilizado o programa SeqMan II 4.0
(DNASTAR Inc.). Em seguida, o alinhamento das sequências foi realizado utilizando o
algoritmo Clustal W no programa Mega 6.06 (Tamura et al., 2013), os alinhamentos obtidos
foram inspecionados visualmente e editados quando necessário. Não foram observados nos
alinhamentos das sequências do COI eventos de inserção/deleção ou indels. No programa Mega
6.06 também foi ajustado o Modelo de Verossimilhança, observando os maiores valores de AIC
(Critério Akaike) e o melhor modelo de substituição foi o “Hasegama-Kishino- Yano” (HKY),
sem distribuição gama (+G) ou sítios invariáveis (+I).
A análise filogenética foi feita através de inferência Bayesiana (MCMC = 10.000.000)
sendo as árvores e parâmetros amostrados a cada 10.000, com retirada dos primeiros 15%
(burnin) para verificar as relações de parentesco entre os haplótipos, utilizando o programa
BEAST v 1.8.1 (Drummond et al., 2012) com os seguintes parâmetros: sítios - modelo de
substituição de nucleotídeos; relógio molecular - relógio relaxado com distribuição log-normal;
taxa de mutação = 0,014% por MA (Knowlton & Weight, 1998), utilizando como grupo-externo
as espécies Macrobrachium jelskii (HM352484.1) e Potimirim potimirim (Müller, 1881)
(EF489975.1) disponíveis no GenBank.
3.2.3 Diversidade e estruturação genética
Foram calculadas as distâncias genéticas inter e intraespecífica através dos valores de
distância p, na comparação par a par utilizando o Mega 6.06 (Tamura et al., 2013). As análises
de delimitação de espécies, implementação bayesiana de Poisson Tree Process (bPTP) (Zhang
et al., 2013), single-threshold of Generalized Mixed Yule-Coalescent (sGMYC) (Fujisawa and
Barraclough, 2013), multiple-threshold GMYC (mGMYC) (Fujisawa and Barraclough, 2013)
também foram utilizadas para verificar a formação dos clados, e a principal separação de
linhagens.
Para a análise bPTP foram utilizados os mesmos parâmetros usados anteriormente na
contrução da filogenia (BEAST), dessa vez para gerar um filograma bifurcado usando o
MrBayes v. 3.2.6 (Huelsenbeck & Ronquist, 2001) como arquivo de entrada para essa análise
20
que foi conduzida no servidor online. Nas análises sGMYC e mGMYC, a filogenia bayesiana
também foi utilizada como arquivo de entrada, e ambas foram realizadas no R (Core Team,
2017), utilizando o pacote SPLITS (Ezard et al., 2009).
A variabilidade intraespecífica, os índices de diversidade haplotípica (h) e nucleotídica
(π) com sua variância e desvio padrão foram estimados usando o programa Arlequin 3.11.
(Excoffier & Lischer, 2010). Para a obtenção do número de haplótipos, sítios polimórficos,
transições e transversões, foi utilizado o programa DnaSP 5.1. (Librado & Rozas, 2009). As
sequências geradas serão depositadas no GenBank.
O nível de diferenciação entre as populações foi estimado pelo índice de endocruzamento
ɸST par a par, e uma Análise de Variância Molecular (AMOVA), também com o Arlequin 3.11.
(Excoffier & Lischer, 2010), foi realizada pra examinar a estrutura populacional. A AMOVA
testou várias hipóteses de estruturação geográfica com a finalidade de visualizar qual
agrupamento populacional melhor explica a variação amostrada, maximizando a porcentagem
de variância entre grupos.
Os cenários testados foram os seguintes: 1) com sete grupos (k=7), de acordo com a
delimitação por ecorregiões (Albert et al., 2011), Amazonas Ocidental, Estuário do Amazonas,
Nordeste Médio-Oriental, Maranhão-Piauí, São Francisco, Alto Paraná e Paraguai; 2) por
províncias (Albert et al., 2011), formando três grupos (k=3), agrupando nesse caso as
ecorregiões da Amazonas Ocidental com Estuário do Amazonas, Alto Paraná com Paraguai, e
as do nordeste (Maranhão-Piauí, NEMO e São Francisco); 3) agrupamento com quatro grupos
(k=4) formados pelas ecorregiões Amazonas Ocidental, Estuário do Amazonas, Paraguai, e
unindo as ecorregiões Maranhão-Piauí, Nordeste Médio-Oriental, São Francisco e do Alto
Paraná considerando serem as áreas supostamente introduzidas; 4) com base na topologia
gerada pela inferência bayesiana, com três grupos (k=3), ecorregião Amazonas Ocidental
(Itacoatiara – AP), Paraguai com Alto Paraná (apenas a localidade de Avaré-SP) e todas as
outras localidades das ecorregiões Estuário do Amazonas (Santana Aroazes – AP, Abaetetuba,
Belém, Santa Bárbara e Almeirim – PA), Maranhão-Piauí, NEMO, São Francisco e Alto Paraná
(Sertãozinho e Miguelópolis – SP). A significância estatística foi avaliada por 10.000
permutações.
Em seguida para verificar a variação genética e testar a máxima diferenciação
populacional considerando também a informação geográfica, foi realizada uma análise espacial
de variância molecular (SAMOVA), que não considera hipóteses prévias, mas apenas o número
de agrupamentos, no software SAMOVA v. 1.0 (Dupanloup et al., 2002).
A rede haplotípica foi construída com o critério de TCS Network (95% de parcimônia)
21
(Clement et al., 2002) empregando o programa PopArt 1.7 (Leigh and Bryant, 2015), geradas
para avaliar as relações genealógica entre os haplótipos e o número de mutações entre estes.
Também foi utilizado o software GenGIS v.1.08 (Parks et al., 2009) para visualizar
geograficamente as relações filogenéticas das linhagens do grupo M. amazonicum.
Figura 2. Mapa com a amostragem das sequências do gene mitocondrial citocromo Oxidade sub-unidade I do
grupo Macrobrachium amazonicum utilizadas nas análises moleculares. Cada ecorregião é indicada em uma escala
de cor cinza como especificado na legenda. Os círculos representam as supostas áreas de ocorrência natural
(verdes) e introduzidas (laranjas) (Tabela 2) onde os espécimes foram obtidos.
22
4. RESULTADOS
Na topologia gerada, a inferência bayesiana mostrou a formação de três grupos (clados),
denominados Amazonas, Costeiro e Paraná/Paraguai. Os clados Amazonas e Costeiro mais
aparentados entre si, é composto pela espécie de M. aff. amazonicum e M. amazonicum
respectivamente, visto que abrange a localidade tipo da espécie (clado Costeiro), e o clado
Paraná/Paraguai, o terceiro grupo, cujas sequências incluem aquelas identificadas como M.
pantanalense é grupo irmão do clado Amazonas e Costeiro.
O clado Amazonas é constituído pelas linhagens da ecorregião Amazonas Ocidental
(Itacoatiara – AM), enquanto o clado Costeiro, representado pelas linhagens das bacias
hidrográficas da ecorregião do NEMO (bacias dos rios Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas-
Açu e Paraíba do Norte), do São Francisco (Serra Talhada – PE), do Maranhão-Piauí (bacia do
rio Parnaíba), e do Estuário do Amazonas (Almeirim, Abaetetuba, Belém, Santa Bárbara – PA
e Santana – AP) e parte das localidades do Alto Paraná (Sertãozinho e Miguelópolis – SP). O
clado Paraná/Paraguai é composto pelas demais linhagens da ecorregião do Alto Paraná (Avaré
– SP) e Paraguai (Aquidauana e Miranda – MS), que incluem as sequências previamente
identificadas como M. pantanalense (Fig.3).
Figura 3. Relações filogenéticas entre os haplótipos (Hap 1 a 22) do grupo Macrobrachium amazonicum obtidos
por sequências parciais do gene mitocondrial Citocromo Oxidase sub-unidade I, formando os seguintes clados:
Clado Costeiro (M. amazonicum); Clado Amazonas (M. aff. amazonicum); Clado Paraná/Paraguai (M.
pantanalense).
23
As distâncias genéticas (p) entre os clados estão mostrados na tabela 3. Os valores de
divergência entre os Clados Amazonas e Costeiro foram de 3% (0.30), que são os clados
formados pelos espécimes de M. amazonicum, enquanto que o Clado Paraná/Paraguai, a
divergência em relação aos outros dois clados foi de 3.3% (0.33), o que mostra uma distância
um pouco maior por ser o clado formado pela espécie M. pantanalense. Como esses valores são
próximos entre si, e M. pantanalense é considerada uma espécie distinta de M. amazonicum, a
partir daqui os clados serão tratados como linhagens separadas e os dados apresentados
separadamente.
Tabela 3. Distância genética (p) entre os Clados Costeiro (A), Amazonas (B) e Paraná/Paraguai (C) para o gene
Citocromo Oxidade I (COI). Os valores marcados na cor cinza claro mostram os valores de divergência
interespecífica e em cinza escuro (valores na diagonal) os valores intraespecífico de cada clado.
A B C
CLADO Costeiro (A) – M. amazonicum 0,002
CLADO Amazonas (B) - M. aff. amazonicum 0,030 0,003
CLADO Paraná/Paraguai (C) - M. pantanalense 0,033 0,033 0,003
O método bPTP indicou a formação de três linhagens, com a mesma formação já mostrada
pela filogenia: Clado Costeiro, Clado Amazonas e Paraná/Paraguai. O mesmo resultado foi
mostrado pela análise de delimitação sGMYC e pela distância genética (p). Apenas o método
mGMYC indicou a formação de cinco linhagens no total, sendo eles: o Clado Amazonas, o
Clado Paraná/Paraguai, e o Clado Costeiro foi subdividido em três linhagens, uma formada
pelos haplótipos 1, 2, 3, 4, 5 e 22 (ecorregiões do São Francisco, Maranhão-Piauí, Estuário do
Amazonas, Alto do Paraná (apenas nas localidades de Sertãozinho e Miguelópolis –SP) e bacias
do NEMO), os haplótipos 6 e 11 (ambos da ecorregião Estuário do Amazonas) como uma
segunda e terceira linhagens respectivamente (Fig. 4).
24
Figura 4. Árvore ultramétrica gerada por reconstrução filogenética bayesiana para o gene Citocromo Oxidade I
(COI) no grupo Macrobrachium amazonicum. As barras em cores representam os grupos formados por cada
análise de delimitação de espécies. A barra com linhas indicam onde houve diferenciação quanto a formação das
linhagens.
Foi encontrado um total de 22 haplótipos, dentre 161 sequências do grupo M. amazonicum
com 147 sequências e 12 haplótipos de M. amazonicum, e 14 sequências e 10 haplótipos de M.
pantanalense, nas 26 localidades abordadas no presente estudo (Tabela 4).
Analisando os valores de diversidade entre os clados formados na filogenia, o clado
Amazonas (H = 0.644; SD = 0,152) apresentou uma menor diversidade haplotípica em relação
ao clado Costeiro (H = 0.652; SD = 0.035) e clado Paraná/Paraguai (H = 0.780; SD = 0.051),
mas é o clado com menor número de indivíduos (N = 10) e apenas uma única localidade
(Itacoatiara – PA), e também menor número de haplótipos (Nh = 4) encontrados.
O clado Costeiro, mesmo apresentando uma maior quantidade de ecorregiões, bacias e
indivíduos (N = 114) e um baixo número de haplótipos (Nh = 8) encontrados e distribuídos nas
ecorregiões que formam esse clado, apresentou uma menor diversidade haplotípica que o clado
Paraná/Paraguai (N = 41) com 10 haplótipos em uma quantidade de indivíduos analisados bem
menor (Tabela 5).
25
Tabela 5. Índices de diversidade genética do grupo Macrobrachium amazonicum nas bacias hidrográficas e
ecorregiões Neotropicais: NEMO = Nordeste Médio-Oriental, ALPA = Alto Paraná, AMOC = Amazonas
Ocidental, ESAM = Estuário Amazonas, MAPI = Maranhão-Piauí, SFRE = São Francisco, e PARE = Paraguai. N
= total de espécimes sequenciados, Nh = número de haplótipos, H = diversidade haplotípica, π = diversidade
nucleotídica, e SD = desvio padrão.
Bacia (Ecorregião) N Nh H (SD) π (SD)
Apodi-Mossoró (NEMO) 10 2 0.467 (0.132) 0.0008 (0.0002)
Jaguaribe (NEMO) 18 3 0.016 (0.128) 0.0007 (0.0007)
Piranhas-Açu (NEMO) 10 1 - -
Paraíba do Norte (NEMO) 10 2 0.533 (0.095) 0.0009 (0.0000)
São Francisco (SFRE) 5 2 0.600 (0.175) 0.0010 (0.0003)
Parnaíba (MAPI) 10 3 0.644 (0.101) 0.0023 (0.0004)
Amazonas (AMOC) 15 6 0.790 (0.079) 0.0136 (0.0022)
Tocantins-Araguaia (ESAM) 37 5 0.416 (0.095) 0.0008 (0.0002)
Alto Paraná (ALPA) 20 3 0.468 (0.104) 0.0131 (0.0026)
Paraguai (PARE) 31 9 0.647 (0.076) 0,0025 (0.0006)
Clado Amazonas (M. amazonicum) 10 4 0.644 (0,152) 0.0024 (0.0007)
Clado Costeiro (M. aff. amazonicum) 114 8 0.652 (0.035) 0.0016 (0.0001)
Clado Paraná/Paraguai (M. pantanalense) 37 10 0.780 (0.051) 0.0086 (0.0022)
Total 161 22 0.805 (0.024) 0.0150 (0.0011)
Nas localidades amostradas pelo presente estudo (MAPI, NEMO e SFRE) só foram
encontrados quatro haplótipos (Hap 1, 2, 3 e 4), os demais (n=18) foram obtidos por sequências
da Vergamini et al., (2011) e Weiss et al., (2015).
O haplótipo 1 foi o mais frequente, encontrado em 61 espécimes dos 114, pertencentes às
bacias do NEMO (Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas-Açu, Paraíba do Norte), do Maranhão-
Piauí, São Francisco, Estuário do Amazonas e Alto Paraná. O haplótipo 2 foi encontrado em 12
indivíduos do Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Paraíba do Norte e São Francisco, sendo o segundo
mais compartilhado (Tabela 4).
A bacia pertencente a ecorregião do NEMO que apresentou maior diversidade haplotípica
foi a da Paraíba do Norte (H = 0.533; SD = 0.095), seguida do Apodi-Mossoró (H = 0.467; SD
= 0.132) e Jaguaribe (H = 0.0163; SD = 0.128). A bacia do Piranhas-Açu não apresentou valores
de diversidade haplotípica nem nucleotídica, pois todos os espécimes são do mesmo haplótipo.
Nas demais ecorregiões, a do Maranhão-Piauí (H = 0.644; SD = 0.101), dos 10 indíviduos
sequenciados, três haplótipos foram encontrados, sendo dois deles exclusivos (haplótipos 3 e
4) na localidade de Aroazes – PI. A ecorregião do São Francisco (H = 0.600; SD = 0.175),
26
apresentou valores de diversidade haplotípica bem próximo ao encontrado na ecorregião do
Maranhão-Piauí, em ambas, as diversidade haplotípicas foram maiores que os das ecorregiões
do Estuário do Amazonas (H = 0.573; SD = 0.110), Paraguai (H= 0.529; SD = 0.045) e Alto
Paraná (H = 0.468; SD = 0.104). A ecorregião Amazonas Ocidental (H = 0.790; SD = 0.079)
foi a que teve maior diversidade haplotípica de todas as ecorregiões e bacias amostradas.
Todas as bacias da ecorregião do Nordeste Médio-Oriental, bem como as do Maranhão-
Piauí, São Francisco, Estuário do Amazonas e Paraguai, apresentaram uma menor diversidade
nucleotídica em relação as ecorregiões do Amazonas Ocidental e Alto Paraná.
A rede haplotípica mostrou um padrão de diferenciação de grupos semelhante a topologia
gerada, com a formação de 3 grupos: um grupo maior (Clado Costeiro) com os haplótipos
compartilhados entre as ecorregiões do Maranhão-Piauí, NEMO (Jaguaribe, Apodi-Mossoró,
Piranhas-Açu e Paraíba do Norte), São Francisco, Estuário do Amazonas, Alto Paraná
(Sertãozinho e Miguelópolis – SP) e apresentando os haplótipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11 e 22. Um
outro grupo (Clado Amazonas) com indivíduos da ecorregião Amazonas Ocidental (Itacoatiara
– AM), com os haplótipos 7, 8, 9 e 10. E um terceiro (Clado Paraná/Paraguai) formado por
espécimes das ecorregiões do Alto Paraná (Avaré – SP) e Paraguai, compartilhando os
haplótipos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 e 21 (Fig. 5).
27
Figura 5. Rede haplotípica para o gene mitocondrial citocromo oxidase sub-unidade I do grupo Macrobrachium
amazonicum. Cada círculo colorido representa um haplótipo (1 ao 22), e o tamanho de cada círculo é proporcional
a frequência de cada um deles. As cores representam as ecorregiões e as bacias, no caso do Nordeste Médio-
Oriental (Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas-Açu e Paraíba do Norte). Os traços nos ramos indicam o número
de passos mutacionais.
A Análise de Variação Molecular (AMOVA) e o índice de ɸST par a par foram avaliados
para verificar o grau de diferenciação populacional. A AMOVA mostrou que entre todas as
hipóteses testadas, a de maior valor em porcentagem de variação entre grupos (92.70%) foi a
baseada na estruturação da árvore bayesiana gerada, refletindo os clados Amazonas, Costeiro e
Paraná-Paraguai, e a variação dentro das populações foi muito baixa (3.21%). A estruturação
das populações mostradas tanto na filogenia quanto na rede de haplótipos, condiz com as
variações genéticas significativas das populações entre grupos, todos os valores das hipóteses
testadas (entre ecorregiões, províncias e ecorregiões com introduções) foram significativas,
porém a dos clados foi a que mais explicou a divergência entre os grupos (Tabela 5).
28
Tabela 5. Resultado das análises de variância molecular (AMOVA) do grupo Macrobrachium
amazonicum. Em destaque cinza está a hipótese que mais explica a porcentagem de variação de
diferenciação populacional. Todos os valores foram significativos (P<0.05).
Os valores dos índices ɸST par-a-par foram observados entre as linhagens de cada clado,
Paraná/Paraguai e o Costeiro apenas, pois o clado Amazonas é formado apenas por uma única
localidade. O clado Paraná/Paraguai, composto pela espécie M. pantanalense, mostrou índices
ɸST par-a-par significativos entre as localidades que o compõem, com exceção de Aquidauana
– MS (PARE), que não apresentou valor significativo com a linhagem de Lago Baiazinha – MS
(PARE) (Tabela 6).
No clado Costeiro, as linhagens das bacias da ecorregião do NEMO, Maranhão-Piauí (Pio
IX – PI), São Francisco (Serra Talhada – PE) e Alto Paraná (Sertãozinho e Miguelópolis – SP)
mostraram um valor significativo de FST em relação as linhagens da ecorregião do Estuário do
Amazonas, especificamente com a localidade de Santa Bárbara – PA.
Já a linhagem de Aroazes - PI (MAPI) se mostrou estruturada com a maioria das
localidades do estudo, apresentando valores significativos com quase todas as outras linhagens
que compõem o clado Costeiro (Tabela 7).
Estruturação Fonte de variação % de variação P*
Ecorregiões
Entre grupos 79.13 0.00000
Entre populações dentro dos grupos 15.32 0.00000
Dentro das populações 5.55 0.00000
Províncias
Entre grupos 49.48 0.00196
Entre populações dentro dos grupos 45.12 0.00000
Dentro das populações 5.40 0.00000
Ecorregião + Introdução
Entre grupos 80.57 0.00000
Entre populações dentro dos grupos 14.75 0.00000
Dentro das populações 4.69 0.00000
Filogenia
Entre grupos 92.70 0.00000
Entre populações dentro dos grupos 4.10 0.00000
Dentro das populações 3.21 0.00000
29
Tabela 6. Valores dos índices de FST par a par mostrando o grau de diferenciação populacional da espécie M.
pantanalense (Clado Paraná/Paraguai). As siglas correspondem a cada localidade: Lago Baiazinha – MS (PLMS),
Aquidauana – MS (AQMS), Miranda – MS (MIMS) e Avaré – SP (AVSP). * Valores significativos (P<0.05).
PLMS AVSP AQMS MIMS
PLMS 0.000
AVSP 0.633* 0.000
AQMS 0.093 0.954* 0.000
MIMS 0.453* 0.923* 1.000* 0.000
30
Tabela 7. Valores dos índices de FST par a par mostrando o grau de diferenciação populacional da espécie Macrobrachium amazonicum (Clado Costeiro). As siglas
correspondem a cada localidade: Almeirim – PA (AAPA), Santa Cruz – RN (SARN), Orós – CE (ORCE), Araripe – CE (ARCE), São Nicolau – CE (SACE), Lima Campos
– CE (LICE), Icó – CE (ICCE), São José de Piranhas – PB (SAPB), Serra Negra – RN (SERN), Barra de Santana – PB (BAPB), Boqueirão – PB (BOPB), Serra Talhada – PE
(SEPE), Pio IX - PI (PIPI ), Aroazes – PI (ARPI), Santana Aroazes – AP (SAAP), Aquiraz – CE (AQCE), Abaetetuba – PA (ABPA), Belém – PA (BEPA), Santa Bárbara –
PA (SAPA), Sertãozinho – SP (SESP), Miguelópolis – SP (MISP). * Valores significativos (P<0.05).
AAPA SARN ORCE ARCE SACE LICE ICCE SAPB SERN BAPB BOPB SEPE PIPI ARPI SAAP AQCE ABPA BEPA SAPA SESP MISP
AAPA 0.000
SARN 0.788* 0.000
ORCE 0.844* -0.287 0.000
ARCE 0.871* -0.093 0.000 0.000
SACE 0.871* -0.093 0.000 0.000 0.000
LICE 0.857 -0.555 -1.000 0.000 0.000 0.000
ICCE 0.857 -0.555 -1.000 0.000 0.000 0.000 0.000
SAPB 0.895* 0.113 0.473 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
SERN 0.895* 0.113 0.473 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000
BAPB 0.844* -0.287 -1.000 0.000 0.000 -1.000 -1.000 0.473 0.473 0.000
BOPB 0.791* -0.112 -0.400 -0.012 -0.012 -0.428 -0.428 0.200 0.200 -0.400 0.000
SEPE 0.809* -0.149 -0.504 -0.016 -0.016 -0.500 -0.500 0.250 0.250 -0.504 -0.192 0.000
PIPI 0.895* 0.113 0.473 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.473 0.200 0.250 0.000
ARPI 0.825* 0.822* 0.802* 0.857 0.857* 0.818 0.818 0.909* 0.909* 0.802 0.812* 0.807* 0.909* 0.000
SAAP 0.069 0.704* 0.680 0.743 0.743* 0.666 0.666 0.833* 0.833* 0.680* 0.693* 0.687* 0.833* 0.714* 0.000
AQCE 0.717* -0.064 -0.153 -0.250 -0.250 -0.851 -0.851 -0.020 -0.020 -0.153 -0.039 -0.066 -0.020 0.781* 0.615* 0.000
ABPA 0.143 0.710* 0.698* 0.715* 0.715* 0.657 0.657 0.788* 0.788* 0.698* 0.703* 0.699* 0.788* 0.712* -0.185 0.631* 0.000
BEPA 0.640* 0.739* 0.637 0.739 0.739 0.600 0.600 0.861* 0.861* 0.637 0.720* 0.698* 0.861* 0.734* 0.151 0.670* 0.116 0.000
SAPA 0.111 0.476* 0.370 0.294 0.294 0.071 0.071 0.457* 0.457* 0.370 0.467* 0.434* 0.457* 0.579* -0.051 0.364* 0.012 0.165 0.000
SESP 0.919* 0.222 0.687 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.687 0.327 0.417 0.000 0.942* 0.892* 0.074 0.847* 0.921* 0.574* 0.000
MISP 0.889* 0.075 0.384 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.384 0.157 0.194 0.000 0.896* 0.812* -0.058 0.770* 0.836* 0.420* 0.000 0.000
31
A análise espacial da variância molecular (SAMOVA) mostrou que a melhor forma de
decompor a variância molecular seria com a formação de cinco grupos (k=5), com o valor
significativo (P = 0.000) de FCT de 0.92724 (Tabela 8). Estruturando-se em: Grupo 1 – linhagens
da ecorregião do Amazonas Ocidental (Itacoatiara – AM); Grupo 2 – linhagens da ecorregião
do Estuário do Amazonas (Santana Aroaze – AP, Abaetetuba, Santa Bárbara, Belém, Almeirim
- PA ,); Grupo 3 – as linhagens das bacias do Apodi-Mossoró (Santa Cruz – RN), Jaguaribe
(Orós, Araripe, São Nicolau, Lima Campos, Icó e Aquiraz – CE), Piranhas-Açu (São José de
Piranhas e Serra Negra – PB), Paraíba do Norte (Barra de Santana e Boqueirão – PB)
pertencentes a ecorregião do NEMO, São Francisco (Serra Talhada – PE), Maranhão-Piauí (Pio
IX), Alto Paraná (Sertãozinho e Miguelópolis – SP); Grupo 4 – espécimes da ecorregião
Maranhão-Piauí (Aroazes – PI); e Grupo 5 – formado por linhagens do Alto Paraná (Avaré –
SP) e Paraguai (Aquidauana, Miranda e Lago Baiazinha – MS), que inclui as sequências de M.
pantanalense (Fig. 6).
Tabela 8. Estruturação dos grupos formados pela análise espacial de variância molecular (SAMOVA).
SAMOVA
GRUPO 1 ITAM (Clado Amazonas)
GRUPO 2 SAAP, ABPA, SAPA, BEPA, AAPA (Clado Costeiro)
GRUPO 3 SARN, ORCE, ARCE, SACE, LICE, ICCE, SAPB, SERN, BAPB, BOPB,
SEPE, PIPI, SESP, MISP (Clado Costeiro)
GRUPO 4 ARPI (Clado Costeiro)
GRUPO 5 AVSP, AQMS, MIMS, PLMS (Clado Paraná/Paraguai)
32
Figura 6. Mapa ilustrando o resultado obtido na análise da SAMOVA. Em escalas de cor cinza estão as ecorregiões
descritas na legenda. Os símbolos descriminam os grupos formados, sendo eles, o Grupo 1 (losango), Grupo 2
(círculos), Grupo 3 (pentágono), Grupo 4 (triângulo) e Grupo 5 (estrela), as ecorregiões e localidades que compõe
cada grupo já foi descrita no texto.
33
O mapeamento geográfico mostrou as relações filogenéticas dos clados formados com as
localidades atribuídas ao clado Amazonas (Macrobrachium aff. amazonicum) em verde, ao
clado Paraná/Paraguai (M. pantanalense) em vermelho, e ao clado Costeiro (Macrobrachium
amazonicum.) em azul e roxo, conforme já descrito anteriormente, tanto na filogenia quanto na
rede haplotípica (Fig. 7).
34
Figura 7. Representação geográfica das relações filogenéticas dos haplótipos de Macrobrachium aff. amazonicum (clado Amazonas, verde), M. amazonicum (clado Costeiro,
azul e roxo) e M. pantanalense (clado Paraná/Paraguai, vermelho) nas seguintes ecorregiões hidrográficas: Amazonas Ocidental, Estuário do Amazonas, Paraguai, Alto Paraná,
Maranhão-Piauí, São Francisco, Nordeste Médio-Oriental – bacias do Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas- Açu e Paraíba do Norte.
35
5. DISCUSSÃO
A partir dos resultados encontrados, a árvore filogenética construída utilizando as
sequências do gene mitocondrial citocromo oxidase I (COI) corroborou o monofiletismo da
espécie Macrobrachium amazonicum, indicando a existência de pelo menos três linhagens
(Vergamini et al., 2011).
Todavia, a descrição recente da espécie Macrobrachium pantanalense (Dos Santos et al.,
2013), mostrou que os espécimes antes reconhecidos como uma linhagem de M. amazonicum,
apresentam diferenças morfológicas que justificaram sua alocação em uma espécie distinta, na
região do Pantanal (Dos Santos, et al., 2013). Porém, com as sequências obtidas no trabalho de
Weiss et al., (2015) ficou evidente que no trabalho da Vergamini et al. (2011) contiam
espécimes dessa nova espécie, ainda tratada como M. amazonicum.
Contudo, a partir dos nossos resultados, e utilizando sequências de espécimes de M.
pantanalense (Weiss et al., 2015), os clados detalhados por Vergamini et al., (2011) em
comparação com o do presente trabalho assim ficaram: o Clado I de Vergamini et al. (2011),
com sequências dos espécimes apenas da localidade de Itacoatiara – AM, corresponde ao Clado
Amazonas aqui recuperado composto por M. amazonicum da ecorregião Amazonas Ocidental
(bacia do rio Amazonas). O clado Paraná/Paraguai, corresponde ao Clado II de Vergamini et
al. (2011), com amostras das ecorregiões hidrográficas do Alto Paraná e Paraguai (Avaré SP,
Miranda – MS e Aquidauana – MS). Com a adição das sequências de M. pantanalense do
trabalho de Weiss et al., (2015), da localidade Lago Baiazinha – MS, essas permaneceram
juntas nesse clado, indicando que o que a autora tratava como M. amazonicum, é um clado
formado pela espécie M. pantanalense. Por fim, o Clado III da mesma autora, com populações
costeiras da ecorregião do Estuário do Amazonas (Santana Aroazes – AP, Abaetetuba – PA,
Belém – PA e Santa Bárbara - PA) e ecorregião do Nordeste Médio-Oriental, que incluiu
sequências da bacia do Jaguaribe (Aquiraz – CE). Junto com estas, as sequências de M.
amazonicum de Weiss et al., (2015) da localidade de Almeirim – PA (ESAM) e as sequências
originais do presente trabalho das bacias da região do Nordeste também foram agrupadas neste
clado, então denominado Costeiro.
Logo as novas sequências ampliaram o reconhecimento de um clado Costeiro, cuja
distribuição geográfica envolve as bacias das ecorregiões do Nordeste Médio-Oriental (dos rios
Jaguaribe, Apodi-Mossoró, Piranhas-Açu, Paraíba do Norte), do São Francisco, e do Maranhão-
Piauí (rio Parnaíba).
36
A diferença na diversidade genética entre os clados, obtidos nos resultados apresentados
pelas análises de delimitações de espécies (sGMYC e bPTP) e os valores de distância genética
(p), valores dos índices ɸST par-a-par e da AMOVA, mostraram que a formação de três clados
é bem consistente, corroborando ao que foi relatado por Weiss et al. (2015), que a linhagem do
Paraguai, incluindo amostras da ecorregião do Paraná (Avaré-SP), é um clado distinto das
demais linhagens, formado pela espécie M. pantanalense. Apenas no método mGMYC e na
SAMOVA, essas linhagens foram divididas em mais de três grupos, mas essas alterações
correspondem a sub-divisões apenas do clado Costeiro, as linhagem formadas são a da
ecorregião Maranhão-Piauí (bacia do Parnaíba) que pelos resultados parece ser uma área de
ocorrência nativa, que é plausível visto que há registro de presença de paleo-canais e incursões
marinhas conectando essa região com a bacia Amazônica (Albert et al., 2011; Lovejoy et al.,
2005), outra linhagem do Estuário do Amazonas, também área de origem natural, e por fim as
que compõem as demais bacias do NEMO, São Francisco e Alto Paraná (Sertãozinho e
Miguelópolis – SP) que são as supostas áreas de introdução da espécie. Este clado Costeiro
apresentou uma baixa diversidade genética e uma ampla distribuição geográfica disjunta, que
inclui todas as áreas onde a espécie de M. amazonicum foi supostamente introduzida, nas bacias
do Nordeste e do Paraná (Sertãozinho e Miguelópolis –SP) (Gurgel et al., 1983, Mantelatto et
al., 2005).
Enquanto Vergamini et al., (2010) considera M. amazonicum uma única espécie com alta
variabilidade intraespecífica em ambientes distintos e isolados geograficamente, outros
trabalho já consideram se tratar de um complexo de espécies (Anger & Hayd, 2010), em
comparações entre linhagens principalmente entre as regiões do Delta do Amazonas e regiões
do Paraguai e Alto Paraná. Estudos de desenvolvimento de estágios larvais, relacionados a
diferentes estratégias reprodutivas (Anger & Hayd, 2010), aspectos relacionados a
osmorregulação e tolerância à salinidade em estágios larvais também mostraram diferenças
entre populações inteiramente límnicas e as de estuário (Charmantier & Anger, 2011), bem
como trabalhos que mostraram variações na morfologia entre espécimes da região amazônica e
do Pantanal (Dos Santos et al.,2013) que levaram a descrição do M. pantanalense.
Desta forma, o valor de distância genética entre espécies de Macrobrachium para COI é
de 2,3% a 20,6% (interespecífica) (Pileggi e Mantelatto, 2010). Assim se faz necessário
confirmar se a localidade tipo do M. amazonicum é realmente em Gurupá – PA na ecorregião
o Estuário do Amazonas, pois na descrição original essa informação não está clara, cita apenas
como sendo Rio Amazonas, bem como examinar o holótipo para estabelecer em qual dos
37
clados, Costeiro ou Amazonas, poderia ser também considerado uma outra espécie
(Macrobrachium sp.), mais aparentada com M. amazonicum.
Weiss et al., (2015) mostra que seus resultados corroboram com as distâncias genéticas
encontradas por Vergamini et al., (2011), com uma variabilidade genética interespecífica bem
próxima (2,96 a 3,3%) entre M. amazonicum e o M. pantanalense. Nossos resultados mostraram
uma distância genética entre os clados Costeiro, Amazonas e Paraná/Paraguai variando de 3,0
a 3,3% (Tabela 3), valores bem semelhantes aos dos trabalhos citados anteriormente. Porém há
muitas controvérsias com relação a valores discriminantes de diversidade genética
intraespecífica e interespecífica para espécies, mas os valores encontrados no presente trabalho
está de acordo com o que geralmente é utilizado como um consenso no reconhecimento para
separação de espécies na codificação de barras de DNA, com uma distância genética entre 2 a
3% (Herbert et al., 2003).
Os baixos índices de diversidade haplótipica e nucleotídica encontrados para algumas
bacias do NEMO como a do Apodi-Mossoró, Jaguaribe e Piranhas-Açu, sugerem que as
populações de M. amazonicum dessas bacias podem ter passado por processos recentes de
deriva gênica causada por efeito fundador, ou até mesmo por efeito de gargalo populacional
(Grant & Bowen, 1998). Cenário este de baixa diversidade genética também reforça a ideia de
que são localidades onde houveram introduções antrópicas da espécie, provavelmente de uma
única matriz de origem (Handley et al., 2011).
Houve compartilhamento do haplótipo 1, o mais frequente, entre as localidades das
ecorregiões do Maranhão-Piauí (localidade de Pio IX - PI), São Francisco, bacias das
ecorregiões do Nordeste Médio-Oriental, e localidades das ecorregiões do Alto Paraná
(Sertãozinho e Miguelópolis – SP) e Estuário do Amazonas.
Além dessa relação de compartilhamento de haplótipos, essas mesmas localidades das
ecorregiões do clado Costeiro citados acima, mostraram nos resultados dos valores de índices
ɸST par-a-par que há uma estruturação genética dessas linhagens com linhagens da ecorregião
do Estuário do Amazonas. Isto indicaria que deveria existir fluxo gênico entre as populações
do clado Costeiro. Porém são regiões geográficas distantes e sem conectividade atual. Assim o
presente trabalho sugere, assim como já mencionado por Magalhães et al. (2005), que as
populações presentes nas bacias do Nordeste, com exceção da localidade de Aroaze – PI, são
subpopulações que foram introduzidas de uma matriz da ecorregião do Estuário do Amazonas.
Na ecorregião do Maranhão-Piauí, a localidade de Aroazes - PI chama a atenção a
presença de dois haplótipos exclusivos (haplótipos 3 e 4), não encontrados em espécimes das
38
outras ecorregiões. Embora haja a possibilidade deste apenas não ter sido amostrado em outras
localidades, também pode ser que estes haplótipos tenham surgido por mutação apenas nessa
ecorregião, representando uma possível área de ocorrência natural do M. amazonicum, talvez o
limite oeste da distribuição geográfica natural desta linhagem (clado Costeiro).
Alternativamente, pode se tratar de um evento de introdução onde foi utilizado matrizes de
localidades diferentes não amostradas.
Como relatado por Magalhães et al. (2005), o M. amazonicum pode ter sido introduzido
posteriormente das bacias do Nordeste para a ecorregião do Alto Paraná, juntamente como o
M. jelskii, durante a translocação da corvina de água doce Plagioscion squamosissimus, pela
dificuldade de distinguir as duas espécies, o que justificaria o compartilhamento de haplótipos
entre as ecorregiões do Nordeste Médio-Oriental e algumas localidades (Miguelópolis e
Sertãozinho – SP) da ecorregião do Alto Paraná. Os resultados dos valores de índices ɸST par-
a-par entre essas populações concordam com essa afirmação, e que são também subpopulações
introduzidas.
Magalhães et al., (2005) também aborda outras introduções no Alto Paraná, que
possivelmente teve origem de matrizes da ecorregião do Paraguai, em eventos de introdução
de peixes para atividades de pesque-pague, mas o que era tratado por esses autores como M.
amazonicum, possivelmente era M. pantanalense, o que condiz na formação do Clado
Paraná/Paraguai, o compartilhamento de haplótipos entre as regiões hidrográficas do Paraguai
e Alto Paraná, na localidade de Avaré – SP.
Uma outra abordagem para tentar explicar essa grande distribuição da espécie no
Nordeste brasileiro é a que envolve as regressões marinhas ocorridas na América do Sul durante
o Plioceno (2.5 a 5.3 Ma), onde houve conexão da região hidrográfica Amazônica com outras
bacias do Nordeste e Sul do Brasil pela formação de paleo-canais (López-Fernadéz & Albert,
2011; Hunbert & Renno, 2006). Pela filogenia gerada no atual estudo, os clados apresentam
uma separação recente, durante o Pleistoceno, e a baixa distância genética entre eles pode se
tratar de um recente processo de especiação.
Uma das razões que reforçam a existência de M. amazonicum, em diversas regiões
neotropicais, é devido a sua alta capacidade adaptativa em suportar variações ecológicas que
vai desde diversos níveis de salinidade, podendo ser encontrada em ambiente inteiramente
dulcícolas (Magalhães et al., 2005) à ambientes estuarinos (Peixoto, 2002; Silva et al., 2007),
bem como possui estratégia reprodutiva que suporta uma distribuição de ambientes costeiros e
continentais (Magalhães & Walker, 1988). O clado Paraná/Paraguai apresentou uma
39
estruturação pelos resultados mostrado nos valores de Fst, diferentemente do clado Costeiro,
que a estruturação só foi visível para certas regiões, como as da ecorregião do Estuário do
Amazonas e Maranhão-Piauí (Aroazes –PI), estas regiões podem ser consideradas áreas de
origem natural. Porém, para a ecorregião do Maranhão-Piauí, uma amostragem de áreas
intermediárias poderiam esclarecer melhor se é de fato uma população estruturada. As bacias
do Nordeste Médio-Oriental, ecorregião do São Francisco e as localidades de Sertãozinho e
Miguelópolis – SP na ecorregião do Alto Paraná, não mostraram estruturação, o que reforça a
ideia de serem áreas de introdução da espécie.
Contudo, os indícios de introdução antropogênica parecem ser a explicação mais
plausível com base nos resultados apresentados neste estudo, no que se refere a presença do M.
amazonicum nas bacias das ecorregiões do NEMO e São Francisco. No entanto, para uma
resposta mais conclusiva, uma amostragem maior e mais bem representada dessa espécie,
principalmente da região hidrográfica da Amazônia, por sua grande extensão geográfica e ser a
localidade tipo da espécie, utilizando outros marcadores moleculares, bem como uma
amostragem de outras ecorregiões onde se tem conhecimento que a espécie ocorre (ecorregiões
da Mata Atlântica Nordeste e Paraíba do Sul). Em comparação ao trabalho recente com a
espécie M. jelskii (Moraes et al., dados não publicados) no nordeste brasileiro, os resultados
também mostraram uma baixa diversidade haplotípica e nucleotídica, até menor que o
encontrado para M. amazonicum, e que segundo Gurgel & Oliveira (1987), o M. jelskii seria
uma espécie de ocorrência natural nas bacias do nordeste, o que não parece ser o caso, como
afirma De Moraes et al. (2017).
Com a utilização de linhagens de M. amazonicum de outras ecorregiões que compõem o
nordeste brasileiro, foi possível ampliar a área de estudo referente a espécie M. amazonicum,
por meio de dados moleculares de estudos anteriores. Os resultados encontrados corroboram as
informações de introduções da espécie relatadas tanto na região nordeste quanto no sudeste do
Brasil (Gurgel & Oliveira, 1987; Magalhães et al., 2005; Vergamini et al., 2011). Porém nossos
resultados mostram a possível presença de uma nova espécie, como mencionado anteriormente,
se o clado Amazonas ou o Costeiro é que o compõe, abordada aqui como Macrobrachium sp.
O M. amazonicum é uma espécie de grande interesse econômico, e gradativamente a falta
de fluxo gênico entre essas regiões, facilita uma possível especiação, como a formação de duas
espécies distintas. Estudos já mostram que há diferenciação (genéticas e morfológicas) entre
linhagens costeiras e continentais (Vergamini et al., 2011), com pelo menos dois tipos: as que
dependem de água salobra para completar seu ciclo de vida, e as que vivem em ambiente
40
completamente interiorano (água doce) (Anger, 2013). Devido também a variações em sua
ecologia, fisiologia osmorregulatória e reprodutiva, já se cogita tratar-se de um complexo de
espécies muito relacionadas ao invés de várias populações de uma mesma espécie (Odinetz-
Collart & Rabelo 1996; Charmantier & Anger 2011; Hayd & Anger, 2013).
Desta forma, uma abordagem taxonômica integrativa com dados morfológicos,
ecológicos somados aos dados moleculares, poderiam esclarecer melhor as diferenças genéticas
aqui encontradas, bem como respaldar a descrição da nova espécie (Padial et al., 2010).
O conhecimento dessas variações possibilita abordagens diferenciadas em técnicas de
manejo para conservação ou para estoques pesqueiros, permitindo o possível reconhecimento
de espécies crípticas ou de espécies muito aparentadas entre si, para garantir a diversidade
genética existente.
41
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55
ANEXOS
Tabela 2 - Descrição das amostras utilizadas com seus ID/NºGenBank (identificação no presente estudo ou número de identificação no banco de dados de Nucleotídeos do
NLM/NCBI - National Center for Biotechnology Information), siglas das bacias e ecorregiões pertencentes, nomes das bacias e ecorregiões, localidade (Munícipio, Estado),
Coordenadas Geográficas (* indica que a coordenada geográfica foi estimada) e referência (literatura na qual a sequência foi obtida).
ID/N°GenBank Sigla Bacia/Ecorregião Localidade Coord Geo Referência
CRT2301 a CRT2310 APO01_NEMO (1) Apodi/Nordeste Médio-Oriental Santa Cruz, RN 05°32'27.8''S 37°17'27.8''O Presente Estudo
CRT2341 a CRT2342 JAG01_NEMO (2) Jaguaribe/Nordeste Médio-Oriental Orós, CE 06°14'18.8''S 38°54'45.3''O Presente Estudo
CRT2349 a CRT2350 JAG02_NEMO (3) Jaguaribe/Nordeste Médio-Oriental Araripe, CE 07°11'58.3''S 40°07'45''O Presente Estudo
CRT2352 a CRT2353 JAG03_NEMO (4) Jaguaribe/Nordeste Médio-Oriental São Nicolau, CE 06° 40'48.8''S 40°04'49.1''O Presente Estudo
CRT2366 JAG04_NEMO (5) Jaguaribe/Nordeste Médio-Oriental Lima Campos, CE 06°24'20.9''S 38°57'15.6''O Presente Estudo
CRT2377 JAG05_NEMO (6) Jaguaribe/Nordeste Médio-Oriental Icó, CE 06° 24'13.7''S 38°57'19.4''O Presente Estudo
CRT2381 a CRT2385 PIR01_NEMO (7) Piranhas-Açu/Nordeste Médio-Oriental São José de Piranhas, PB 07°06'18.4''S 38°29'28.1''O Presente Estudo
CRT2395 a CRT2399 PIR02_NEMO (8) Piranhas-Açu/Nordeste Médio-Oriental Serra Negra, RN 06°34'47.2''S; 37°15'21.5''O Presente Estudo
CRT2466 a CRT2467 PARN01_NEMO (9) Paraíba do Norte/Nordeste Médio-Oriental Barra de Santana, PB 07°31'45"S; 35°59'55.3"O Presente Estudo
CRT2473 a CRT2480 PARN02_NEMO (10) Paraíba do Norte/Nordeste Médio-Oriental Boqueirão, PB 07°29'11.9''S; 36°07'24.5"O Presente Estudo
CRT2421 a CRT2424,
CRT2443
SFR01_SFRE (11)
São Francisco/São Francisco
Serra Talhada, PE
08°0'1.9''S; 38°14' 41.2''O
Presente Estudo
CRT2504 a CRT2508 PNB01_MAPI (12) Parnaíba/Maranhão Piauí Pio X, PI 06°52'57.3''S; 40°38'38.1''O Presente Estudo
CRT2537 a CRT2541 PNB02_MAPI (13) Parnaíba/Maranhão Piauí Aroazes, PI 06°11'32.1''S; 41°59'35.3''O Presente Estudo
GU929500 a GU929504 AM01_ESAM (14) Amazonas/Estuário do Amazonas Santana, AP 00º02'07"N; 51º29'21"O Vergamini et al. (2011)
56
GU929542 a GU929551 AM02_AMOC (15) Amazonas/Amazonas Ocidental Itacoatiara, AM 03º10'01" S; 58º25'31"O Vergamini et al. (2011)
GU929479 a GU929488 JAG06_NEMO(16) Jaguaribe/Nordeste Médio-Oriental Aquiraz, CE 03º55'20"S; 38º21'07"O* Vergamini et al. (2011)
GU929471 a GU929478 TOA01_ESAM (17) Tocantins-Araguaia/Estuário do Amazonas Abaetetuba, PA 01º42'31"S; 48º52'57"O* Vergamini et al. (2011)
GU929489 a GU929491 TOA02_ESAM (18) Tocantins-Araguaia/ Estuário do Amazonas Belém, PA 01º17'38"S; 48º36'54"O* Vergamini et al. (2011)
GU929492 a GU929499 TOA03_ESAM (19) Tocantins-Araguaia/ Estuário do Amazonas Santa Bárbara, PA 01º14'30'S; 48º19'52''O Vergamini et al. (2011)
GU929505 a GU929514 PAR01_ALPA (20) Paraná/Alto Paraná Sertãozinho, SP 21º06'46,7''S; 48º03'18,2''O* Vergamini et al. (2011)
GU929532 a GU929537 PAR02_ALPA (21) Paraná/Alto Paraná Avaré, SP 23º05'15"S; 48º56'26"O* Vergamini et al. (2011)
GU929538 a GU929541 PAR03_ALPA (22) Paraná/Alto Paraná Miguelópolis, SP 20º10'40"S; 48º02'40"O* Vergamini et al. (2011)
GU929515 a GU929523 PGY01_PARE (23) Aquidauana/Paraguai Aquidauana, MS 20º28'26"S; 55º48'16"O* Vergamini et al. (2011)
GU929524 a GU929531 PGY02_PARE (24) Miranda/Paraguai Miranda, MS 20º14'43"S; 56º23'58"O* Vergamini et al. (2011)
WP738-1 a 738-9, WP780-
1 a 780-5 PGY03_PARE (25) Miranda/Paraguai Miranda, MS 20º16'00''S; 56º23'00''O Weiss et al. (2015)
WA736-1 a 736-9,
WA780-1 a 780-4 AM03_ESAM (26) Amazonas/Estuário do Amazonas Almeirim, PA 1º31'15''S; 52º34'45''O Weiss et al. (2015)
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Tabela 4 – Distribuição haplotípica da espécie M. amazonicum e M. pantanalense (ecorregião PARE e ALPA – Avaré –SP) por ecorregições (bacias e localidades) a que
pertencem. Hap (1 ao 22) é o número de haplótipos encontrados e os valores abaixo de cada um deles indicam a quantidade de sequências que possuem cada haplótipo nas
respectivas localidade. * Ecorregiões e localidades onde o M. amazonicum foi supostamente introduzido.
Ecorregião Hidrográfica Bacia Localidade ID
Loc
Hap
1
Hap
2
Hap
3
Hap
4
Hap
5
Hap
6
Hap
7
Hap
8
Hap
9
Hap
10
Hap
11
Hap
12
Hap
13
Hap
14
Hap
15
Hap
16
Hap
17
Hap
18
Hap
19
Hap
20
Hap
21
Hap
22
Nordeste Médio Oriental
(NEMO) *
Apodi-Mossoró Santa Cruz – RN 1 7 3
Jaguaribe Orós – CE 2 1 1
Jaguaribe Araripe – CE 3 2
Jaguaribe São Nicalu – CE 4 2
Jaguaribe Lima Campos – CE 5 1
Jaguaribe Icó – CE 6 1
Jaguaribe Aquiraz – CE 7 7 2 1
Piranhas Açu São José de Piranhas –
PB 8 5
Piranhas Açu Serra Negra – RN 9 5
Paraíba do Norte Barra de Santana – PB 10 1 1
Paraíba do Norte Boqueirão – PB 11 5 3
São Francisco (SFRE) * São Francisco Serra Talhada – PE 12 3 2
Maranhão-Piauí (MAPE)
*
Parnaíba Pio IX – PI 13 5
Parnaíba Aroazes– PI 14 4 1
Amazonas Ocidental
(AMOC) Amazonas Itacoatiara – AM 15 2 1 1 6
Estuário do Amazonas (ESAM)
Tocantins-Araguaia
Santana – AP 16 4 1
Tocantins-
Araguaia Abaetetuba – PA 17 6 2
Tocantins-
Araguaia Belém – PA 18 1 2
Tocantins-
Araguaia Santa Bárbara – PA 19 2 5 1
Amazonas Almeirim - PA 20 12 1
Alto Paraná (ALPA)* Alto Paraná Sertãozinho – SP 21 10
58
Alto Paraná Avaré – SP 22 1 5
Alto Paraná Miguelópolis – SP 23 4
Paraguai (PARE)
M. pantanalense
Paraguai Aquidauana – MS 24 9
Paraguai Lago Baiazinha - MS 25 8 1 1 1 1 1 1
Paraguai Miranda – MS 26 8
Total 61 12 4 1 29 5 2 1 1 6 1 1 5 17 8 1 1 1 1 1 1 1
