artigo cinetica enzimatica

Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.7, n.1, p.1-14, 2005 ISSN 1517-8595

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PRODUO E ESTUDO DO POTENCIAL DE HIDRLISE DE UMA NOVA FONTE DE ENZIMAS AMILOLTCAS A PARTIR DO MALTE DE MILHO (Zea mays)Alex Ferreira Evangelista1, Joana Paula Menezes Biazus1, Jos Carlos Curvelo Santana2, Elizabete Jordo3, Roberto Rodrigues de Souza4 RESUMO O malte de cevada um produto bastante utilizado pelas indstrias alimentcias, porm seu custo relativamente elevado quando comparado com o malte de milho. Como o malte de milho possui um potencial enzimtico relativamente menor que o de cevada, a concentrao das enzimas deste malte tornaria este produto mais vivel que na forma in natura. Assim, este trabalho objetivou a obteno de um derivado do malte de milho obtido por extrao lquidolquido em sistema bifsico aquoso PEG/CaCl2 e comparar seu potencial enzimtico com o malte de milho. Os dados de tempo (t) e de atividade enzimtica (AE) resultaram numa curva em forma de pico, onde a mxima atividade das sementes foi observada no quarto dia de germinao e a atividade enzimtica apresentou uma dependncia exponencial com tempo, anlogo ao crescimento de microrganismos. Estas enzimas ao serem recuperadas em PEG 4000, tornaram-se mais ativas que no malte de milho, mostrando que o PEG um meio que alm de conservar, ativa as enzimas. Desta forma conseguiu-se gerar uma nova forma de comercializao das enzimas amilolticas de malte de milho. Palavras chaves: Zea mays L., fonte de amilases, amilases em PEG, cintica enzimtica.

PRODUCTION AND STUDY OF THE HYDROLYSE POWER OF A NEW AMYLASES SOURCE BY MAIZE (Zea mays) MALTABSTRACT The barley malt is a product very utilized by food industries, but its cost is relatively elevated when its comparated to maize (Zea mays) malt. As this malt has a smaller enzymatic activity than barley malt, the enzymes concentration of maize malt could become this product more viable than its in nature form. Thus, this work aimed to obtain a maize malt derivate through liquid-liquid extraction in aqueous two-phase system PEG/ CaCl2 and to compare its enzymatic potential with maize malt. The data of the time (t) and enzymatic activity (EA) were shown as a curve in top form and EA presented on dependence with t, it was analogy to microorganisms growth. These recovering enzymes in PEG 4000 became more active that in the maize malt form. It showed that PEG is the best mean for preserving and activing its enzymes. Thus, we obtained a new commercial source of amylases enzymes from maize malt. Keywords: Zea mays L., amylases source, amylases in PEG, enzymes kinetic.

__________________________Protocolo 702 de 8 de abril de 20031 1

Graduandos em Engenharia Qumica, DEQ/ CCET/ UFS. Doutorando em Engenharia Qumica, DESQ/ FEQ/ UNICAMP. [email protected] . 1 Prof. Dr do Departamento de Engenharia e Sistemas Qumicos, FEQ/UNICAMP, Cid. Univ. Zeferino Vaz, Av. Albert Eistein, s/n, Baro Geraldo, Campinas SP, Caixa Postal: 6066, CEP: 13081-970, Tel: 0xx13 3788 3900. 1 Prof. Dr do Departamento de Engenharia Qumica, CCET/UFS. Cid. Univ. Prof. Jos Alosio de Campos, Av. Marechal Rondon, s/n, Rosa Elze, So Cristvo SE, CEP: 49480 000, Tel: 0xx79 2126687e-mail: [email protected].

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Produo e estudo do potencial de hidrlise de uma nova fonte de enzimas amiloltcas ...... Evangelista et al.

INTRODUO Sistemas bifsicos aquosos A bioseparao um ramo da bioengenharia que, nos ltimos tempos, vem sendo muito estudada, com o intuito de aprimorar tcnicas mais eficientes e mais econmicas, em larga escala (scale-up), alcanando um elevado grau de pureza e recuperao da biomolcula, mantendo sua atividade. A mais eficiente destas tcnicas a cromatografia em fase lquida. Contudo, esta, embora produza um material de alto grau de pureza e com boa atividade, seu rendimento baixo e o custo do produto elevado. Uma das tcnicas que possuem bom rendimento na separao de biomolcula sem interferir em sua atividade, com boa viabilidade econmica, a partio em sistemas bifsicos aquosos (SBA) (Diamond & Hsu, 1992). Os sistemas bifsicos aquosos mais utilizados, atualmente, so os sistemas polimero/polmero, mais comumente representados pelo polietileno glicol (PEG)/Dextrana e os sistemas polmero/ sal, representados na maioria dos estudos por PEG/fosfato de potssio. Estes sistemas foram descobertos por Per - ka Albertsson em 1955 e, desde esta data, os sistemas bifsicos so estudados e utilizados na recuperao e/ou purificao de diversas substncias, principalmente, de biomolculas (Albertsson, 1986). Os SBAs polmero/polmero, ou polmero/sal so muito utilizados na recuperao de biomolculas por oferecem ambientes fsico-qumicos apropriados para as biomolculas, apresentando baixas diferenas de potencial, tenso superficial em torno de 10-7 N/cm, que contm 80% a 90% em peso de gua em suas fases (Diamond & Hsu, 1992). Nas ltimas dcadas, tem-se pesquisado novos sistemas bifsicos que permitam uma melhora na recuperao de biomolculas especficas, como foi o caso de Santana (2003), que empregou um SBA obtido, a partir do polietileno glicol (PEG) e do sal CaCl2, na recuperao de amilases de malte de milho. Os resultados mostraram que no pH 5,0 e na linha de amarrao mais concentrada (3, neste estudo) este sistema foi seis vezes mais eficiente que os utilizados por alguns autores; quando estes recuperaram as mesmas enzimas de A. Niger em sistema PEG/ sais de fosfato e PEG/ Dextrana.

Enzimas amilolticas Desde o incio do sculo, o estudo da viabilidade de aplicao das enzimas em processos biotecnolgicos tem tido um grande destaque em nvel Mundial. Dentre estas enzimas, podemos destacar como as mais importantes para a biotecnologia; at o momento, as enzimas e amilases. O uso fundamental das amilases est na hidrlise do amido, principalmente, na indstria de panificao; no pr-cozimento de cereais, nas indstrias de fermentao, para a produo de lcool e bebidas alcolica; na fabricao de xaropes de glicose, via hidrlise pelas amilases; no preparo de gomas de dextrinas, usadas para acabamento de papis e tecidos, dentre outros. A enzima com cdigo e nome sistemtico EC 3.2.1.1; -1,4 glicano 4-glicanohidroxilase, respectivamente, comumente conhecida como -amilase. Esta uma grande enzima extracelular que hidrolisa, aleatriamente, e vrias ligaes -1,4 no terminais de molcula de amilose, amilopectina, glicognio e dextrinas, no atuam sobre as ligaes -1-6. Os produtos finais da hidrlise so 70 a 90%, de maltose, oligossacardeos e dextrinas, a maioria com quatro a oito unidades de glicose, alm de pequenas quantidades de D-glicose. A -amilase, tambm, chamada de enzima dextrinizante e de liquefao e encontram-se nos tecidos e diversos meios: saliva, pncreas, cereais, bactrias, fungos. Sua resistncia desnaturao trmica, a qual inativa a enzima, difere conforme sua origem ou biossntese. Algumas amilases bacterianas, de Bacillus subtilis, B. coagulans, B. licheniformis e B. stearothermophilus, tm temperatura tima entre 70C a 80C de temperatura (algumas so ativas at acima de 100C), isto devido presena de um on Ca2+ em sua estrutura molecular, com pH timo entre 5,5 a 7,0 e peso molecular variando entre 10 kDa a 20 kDa (Wiseman, 1987; Dixon & Webb, 1967). A enzima com cdigo e nome sistemtico EC.3.2.1.1, -1,4 glicano-maltohidrolase, respectivamente, comumente conhecida como -amilase. Esta uma enzima extracelular, largamente encontrada em gros de vegetais, degradando a amilopectina e glicognio, hidrolisando cada segunda ligao -1,4, mas, sempre, a partir dos terminais no redutores das cadeias. A maioria dos seus produtos quase sempre -maltose, so inibidas por reagentes sulfidricos, no atuam em ligaes -1,6 e desta forma, a hidrlise total da amilopectina no

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pode ser realizada por elas. Estas enzimas possuem temperatura tima por volta do 55 C, pH timo entre 6,5 a 7,0 e massa molar de, aproximadamente, 50 kDa (Wiseman, 1987; Dixon & Webb, 1967). Cintica enzimtica o estudo do caminho mais provvel para se definir a equao da taxa da reao de um sistema reacional catalisado por enzimas. Para que seja possvel a compreenso deste estudo considera-se o caso mais simples onde o substrato (S) transformado no produto (P) em uma reao catalisada por uma enzima (E). Com as condies experimentais do meio reacional em estudo prdefinidas (presso, temperatura, pH, concentraes inicial de substrato e de enzimas, etc). Supondo-se que seja possvel medir a concentrao do substrato (ou do produto) com o decorrer do tempo, a partir do instante em que esta teve incio. Estas medidas permitem configurar uma curva do tipo que se encontra na Figura 1, a qual traduz a variao da velocidade de reao com o consumo de substrato (formao do produto) com o tempo. Na realidade o nico instante em que se conhece com certeza a concentrao do substrato o tempo inicial, por isto as velocidades de reaes enzimticas so calculadas nos instantes iniciais.

aproximadamente, proporcional sua concentrao (o que indica uma reao de primeira ordem em relao ao substrato), porm para altas concentraes do substrato, a velocidade tende para um valor assinttico, designado pela velocidade mxima (Vmax), onde V0 tido como constante em relao concentrao do substrato (reao de ordem zero) (Friedman, 1994; Peter, et al., 1987). No incio do sculo XX, trabalhos realizados por Henri e posteriormente por Leonor Michaelis e Maud Menten levaram formulao da Teoria do Mecanismo de Reao Enzimtica mais conhecida at o presente momento; a qual segue os seguintes passos: Em reao rpida, enzima e substrato formam o complexo denominado de enzima substrato (ES). Em reao lenta, o complexo enzimasubstrato forma o produto e liberta a enzima. Esta reao representada pela Figura 2.k1

E + S ES k2 E + P k 1

Figura 2 Esquema de uma reao enzimtica global, simples. Onde: k1, k-1 e k2 so constantes cinticas. Como notao foi admitida [E], [S] e [ES], como as respectivas concentraes de E, de S e de ES. Ao admitir-se que o sistema reacional esteja em equilbrio, pode-se definir Ks, como sendo a constante de dissociao do complexo ES, dada por:

Ks =Figura 1 Curva de desenvolvimento cintico de um sistema reacional enzimtico. comum indicar a velocidade inicial (V0), numericamente igual tangente curva de formao do produto com o tempo (Halpern, 1997; Peter et al.; 1987). Os primeiros estudos comprovaram que a velocidade de reao enzimtica proporcional concentrao de enzimas (V0 [E]) e que esta velocidade possui uma dependncia hiperblica com a concentrao do substrato. Para baixas concentraes de substrato, a velocidade ,

k 1 [ E ][S ] = [ES] k1

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Esta suposio conhecida como hiptese de equilbrio e s vlida quando k-1 >>> k2, ou seja, no foi levada em considerao a complexao da enzima com o produto para retornar ao complexo enzima substrato (E + P em ES) para determinao da velocidade inicial (V0 ), j que [P] = 0 (Voet & Voet, 1995). Em 1925, Briggs e Haldane propuseram uma hiptese de equilbrio rpido, onde as constantes k-1 e k-1 so aproximadamente iguais. Estes cientistas verificaram que se fazendo medidas em pequenos intervalos de tempo, onde a variao da concentrao do complexo


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ES to pequena que pode ser considerada constante; desta maneira eles conseguiram observar um estado estacionrio (ou pseudoestacionrio) para ES. No entanto, para que isto ocorra, necessrio que a concentrao do substrato seja muito superior de enzimas, o que acontece na maioria dos sistemas in vitro. Desta forma, de acordo com a definio de velocidade de reao, tem-se (Friedman, 1994; Halpern, 1997; Voet & Voet, 1995):

V0 =

Vmx [S ] K m + [S ]

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V0 =

d [P] = k 2 [ES ] dt

(2)

Na Equao 8, Vmax a velocidade mxima da reao e Km a constante de MichaelisMenten. Quando ocorre um estado de equilbrio rpido (k-1>>k2), constata-se que a constante de Michaelis-Menten se aproxima da constante de dissociao do complexo enzimasubstrato (Halpern, 1997; Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995):

Como difcil medir [ES], logo esta grandeza deve ser substituda. Para isto, considera-se a hiptese de estado estacionrio e iguala-se as duas equaes de velocidade (de formao e decomposio do complexo ES), como descrito abaixo (Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995):

Km =

k 1 = Ks k1

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A Equao 8 tambm comprova a variao hiperblica de V0 com [S]. Um estudo de dois casos abaixo relatado, os quais apresentam limites de concentrao de substrato. i) Para baixas concentraes de substrato ([S] > Km); a Equao 8 toma a forma da Equao 6, j que V0 Vmax, o que esta de acordo com as observaes j mencionadas para os extremos cinticos de ordem zero e ordem um, em relao ao substrato [S] (Halpern, 1997; Peter et al., 1987; Voet & Voet, 1995). Para que seja entendido o significado de Vmax e Km, so feitas as seguintes igualdades:

E assim por substituio da equao 4.b na equao 3, obtm-se:

[ ES ] =

[E ]0 [S ]k 1 + k 2 + [S ] k1

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V0 = k 2 [ ES ] = k 2 [ E]0 Vmx

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Fazendo-se as seguintes consideraes:

Vmx = k 2 [E ]0e

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Km =

k 1 + k 2 k1

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Esta equao indica que a velocidade mxima ocorre quando todas as enzimas esto na forma complexada, ES, ou seja, todas as enzimas esto saturadas de substrato. No entanto se [S] = Km e for substitudo na Equao 8, tem-se:

Obte-se assim, a equao de Michaelis Menten, dada por:

V0 =

Por meio desta expresso pode-se concluir que o Km corresponde concentrao do substrato onde se observa que a reao

Vmx 2

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alcanou um valor mdio da velocidade mxima e a concentrao de enzimas est 50% saturada. Outros mecanismos podem ser obtidos, como o que considera tambm o complexo enzima-produto (EP), os que inserem as influncias do pH, de inibidores, etc; mas todos so deduzidos, levando-se em considerao as hiptese de Michaelis-Menten. Mtodo para determinao da velocidade mxima e a constante de Michaelis-Menten Como a representao grfica da Equao 8 hiperblica, o valor de Vvax no pode ser obtido exatamente, pois este se torna assinttico. Contudo, ao se linearizar a expresso de Michaelis-Menten em funo de 1/V0 e 1/[S], chega-se a:

K 1 1 1 = + m V0 V mx V mx [ S ]

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Esta expresso chamada de equao de Lineweaver-Burk, que uma relao linear onde 1/Vmax o seu coeficiente linear e Km/ Vmax o seu coeficiente angular. Ao tocar no eixo das abscissas, esta reta fornece o valor 1/Km (recproco negativo da constante de MichaelisMenten), como se observa na Figura 3, que uma representao esquemtica da linearizao desta equao (Friedman, 1994; Halpern, 1997; Morris, 1979; Peter, et al., 1987; Voet & Voet, 1995).

camada protetora (casca), aleurona, endosperma e o embrio. Este ltimo composto pelo cotildone, o epictilo (que origina o broto) e a radcula (que se origina a raiz). Na Figura 4, encontra-se uma representao esquemtica da germinao de uma monocotiledonea que ocorre, quando o crescimento da radcula rompe o tegumento da semente e aparece como uma raiz jovem. A energia para a germinao da semente vem da respirao e do acar do endosperma. Contudo, o embrio e o amido esto separados um do outro, ou seja, para que a semente germine deve haver ao de foras externas para ativar suas funes fisiolgicas. Naturalmente, h uma pequena atividade biolgica nas sementes, devido presena das enzimas -amilase que degrada o amido para produzir a maltose e fornecer energia para manter a atividade biolgica, nas clulas da semente. A gua, entrando na semente e no embrio, dissolve uma substncia produzida no interior do embrio. Esta substncia conhecida como cido giberlico (AG). Este um hormnio vegetal no muito diferente dos esterides. O AG dissolvido transportado com a gua pelo restante dos tecidos da semente, at chegar camada de aleurona. O AG entra no citoplasma dessas clulas, "ativando" certos genes do DNA nuclear. O DNA , naturalmente, a molcula hereditria e contm as instrues para fazer todas as protenas necessrias para a sobrevivncia da planta. O mecanismo preciso sobre como o AG "ativa" o DNA ainda desconhecido. claro, contudo, que o modo de ao ligar apenas alguns genes especficos do DNA (Borzani et al., 1986; Santana, 2003).

Figura 3 Linearizao dos dados cinticos ou mtodo de Lineweaver-Burk (Morris, 1979). Germinao das sementes de milho O milho (Zea mays) tem um mono cotildone, e sua semente est dividida em Figura 4 Esquema da sntese da enzima amilase, em uma semente monocotiledonea Os genes que so "ligados" so transcritos. A informao arquivada em DNA preciosa, de modo que as clulas de aleurona


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fazem uma cpia "descartvel" em RNA do gene a que est ligado. Est cpia, como um tipo de projeto, chamada de RNA mensageiro. O processo de fazer esta cpia chamado transcrio. O RNA que foi feito no processo de transcrio transportado at o citoplasma das clulas de aleurona. No citoplasma, o RNA mensageiro se junta ao ribossomo para comear o processo de produo de uma protena. Este processo denominado sntese protica ou traduo. Neste processo o ribossomo examina a informao mantida na seqncia de bases do RNA. RNAs transportadores carregados com aminocidos especficos so colocados nas posies especificadas nas instrues do RNA mensageiro e os aminocidos so agrupados na seqncia certa pelo ribossomo. A seqncia de aminocidos determina as propriedades da protena que est sendo montada. Neste caso, a protena crtica feita com a informao mantida no RNA a -amilase. Esta protena resulta em uma enzima de mesmo nome que tem grande importncia para a indstria de alimentos (Santana, 2003). Maltagem A maltagem a tcnica de preparo do malte, e constam de operaes como a macerao, a germinao e a secagem. O processo altera os gros e esta alterao afeta a composio deles, e estes diferem conforme o tipo de malte a ser obtido, podendo ser utilizado nas cervejarias e ou destilarias. Se for destinado para ser utilizado em cervejarias, que o caso mais comum para as sementes de cevada, os gros devem ser densos, com endosperma macio e frivel, sua macerao ser entre 43% a 46% de umidade, aps a germinao so secos a 4% de umidade em temperaturas variando de 70C a 100C, o que torna o malte mais escuro, reduz sua atividade enzimtica, d a cerveja uma colorao mais escura, sabor e aroma mais encorpado (Borzani et al., 1986). No caso do malte para destilaria, so usados gros menores, com teor protico mais elevado, sendo macerados na faixa de 45% a 49% de umidade, seca depois de germinados, de 5% a 7% de umidade, em temperaturas, variando entre 50C a 60C, gerando um malte de maior potencial enzimtico e mais claro. Suas etapas basicamente so: Limpeza e classificao das sementes, que, geralmente, so feitas, usando-se peneiras, ventiladores ou eletroims, isolados ou em conjunto. Depois feita a macerao, que nada mais que elevar o

teor de umidade na semente at nveis prximos de 45% de umidade, condio necessria germinao. O tempo de germinao depende da velocidade com que as enzimas hidrolticas atuam. Segundo Borzani et al. (1986), para que as sementes de cevada atinjam o mximo de atividade enzimtica, estas devem apresentar o broto com 1 a 2 vezes o seu tamanho. A secagem destas sementes (agora malte) necessria para aumentar a conservao do malte por um maior tempo. A temperatura empregada no deve exceder as temperaturas timas das enzimas para evitar a inativao delas. O malte um produto muito utilizado nas indstrias cervejeiras, e em outras indstrias que trabalham com processos fermentativos a partir do malte, sendo as sementes de cevada as mais utilizadas, pelo seu alto poder enzimtico. Contudo estas sementes no so muito cultivadas em nosso pas, necessitando a sua importao e, elevando o custo na obteno do produto. J as sementes de milho, para produzir malte, pode ser uma alternativa vivel, uma vez que esta cultura bastante difundida no Brasil, o que torna o custo na obteno do malte menor se comparado com o da cevada, porm difcil encontrar relatos de estudos da sua atividade enzimtica com relao ao tempo de germinao, que d suporte a interrupo do processo, pelo maltador. A literatura, apenas, faz meno do maior poder enzimtico das sementes de cevada (potencial tido como 100) que as de milho (tido como 28). Com um estudo das melhores condies de germinao para que se obtenha a mxima atividade enzimtica no malte e uma posterior concentrao destas enzimas em PEG 4000, pode-se obter um produto com maior potencial enzimtico e, assim, poder oferecer ao mercado um novo de malte de milho com alto potencial de hidrlise de amido. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo a obteno de um derivado do malte de milho obtido por extrao lquido-lquido em sistema bifsico aquoso PEG/CaCl2 e comparar seu potencial enzimtico com o malte de milho. MATERIAIS E MTODOS Macerao das Sementes Sementes selecionadas provenientes da EMBRAPA-SE foram limpas com gua destilada, para eliminar cidos volteis e outras substncias retidas na superfcie dos gros, depois se umedeceram as sementes, at que elas



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atingissem um teor de gua entre 40 a 45%, trocando-se a gua a cada uma hora. O tempo de durao deste processo foi em torno de 12 a 14 horas, sendo observada a mxima absoro relativa de umidade pelas sementes, durante a lavagem e nas primeiras 4 horas (Borzani, 1986; Reguly, 1996; Santana, 2003). Germinao Foi feita em bancada de laboratrio, onde as sementes midas foram distribudas sobre uma superfcie artificial. As sementes foram, sempre, umedecidas com borrifadores de gua destilada, a superfcie era composta de folhas de papel filtro (tamanho A4) e estas sobre camadas de algodo, para reter o mximo possvel de umidade na superfcie, evitando, assim, que as sementes perdessem umidade. A germinao era interrompida entre 8 e o 10 dia, quando se observava o aparecimento de fololos nos brotos (Borzani et. al., 1986; Santana, 2003). Amostragem As amostras foram coletadas, diariamente, em um mesmo horrio, sendo depois modas em moinho de parafuso e uma pequena massa variando entre 1,0 g a 2,0g dela foi solubilizada a 50 mL em soluo de NaCl e CaCl2 a 3 e 2 g/L, respectivamente, (Santana, 2003). Determinao da atividade enzimtica da amilase nas sementes Foi feita pelo Mtodo de Wohlgenuth, modificado por Sandstedt, Kneen, Blish, o qual se baseia na dextrinizao de certa massa de amido solvel que, sob influncia de um excesso de -amilase, pela -amilase em uma hora, sendo sua unidade usual dada em SKB (Reguly, 1996). Com base neste mtodo foram utilizados volumes variados das amostras (dependendo da atividade), para dextrinizar 20 mL de uma soluo de amilodextrina 2% a 30C. A anlise foi feita por comparao colorimtrica com um padro de iodo/dextrina. O mtodo do DNS, ou do Miles Laboratory, tambm, foi utilizado para medir a variao da concentrao de acares redutores com o tempo de incubao, no estudo cintico enzimtico, descrito a seguir (Reguly, 1996). Quantificao da protena total Foi feita pelo mtodo de Bradford (1976), o qual consistiu em coletar amostras,

adicionar nestas o reagente Coomasie Biliante Blue e medir sua absorbncia a 595 nm. A concentrao de protenas encontrada ao se comparar a absorbncia da amostras na curva de calibrao obtida com a protena padro BSA (soro de albumina bovina). Recuperao das enzimas A partir do sistema bifsico aquoso de composio 25% PEG 4000 e 1,8 % de CaCl2, as enzimas em malte de milho foram recuperadas. Uma soluo de malte a 2% em CaCl2 foi introduzida com o auxlio de uma micro-seringa na fase inferior do sistema. Esperou que o equilbrio fosse estabelecido (24 a 48 h). Recolheram-se amostras de ambas as fases e, nelas, mediu-se a concentrao de protena total para que estas fossem utilizadas nos ensaios de cintica. Cintica de hidrlise do amido Foram feitos estudos comparativos de cintica enzimtica entre as enzimas e amilases do extrato em malte de milho e do extrato em PEG 4000. Utilizou-se o pH 5,0 e as temperaturas de 75C e 55, j que estas variveis esto prximas das condies timas das -amilase e -amilase, respectivamente. Para tanto, foram preparadas solues de amido a 10 g/L e 0,2 g/L em pH 5,0, e a partir destas foram feitas as devidas diluies para fornecer concentraes dentro das especificaes da metodologia que se baseia nas condies limite do substrato (Friedman, 1994; Peter et al., 1987). Possibilitando desta forma, observar se o PEG atua como inibidor ou ativador destas enzimas, enquanto que a temperatura definiu qual das enzimas encontra-se mais ativa no extrato em PEG 4000. Para este estudo, usou-se como base matemtica para obteno dos modelos cinticos a metodologia de Michaelis-Menten, que se baseia na determinao das velocidades iniciais de reao nas condies limites do sistema reacional, ou seja: 1- Para baixas concentraes de substrato ([S] > Km). A linearizao do modelo foi feita seguindo a metodologia de Lineweave-Burk. A determinao da concentrao de acares redutores gerados no meio foi feita segundo o Mtodo do Milles Laboratory (Reguly, 1996).


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RESULTADOS E DISCUSSO Na Tabela 1, encontram-se os dados de atividade enzimtica das sementes de milho, durante a germinao em escala laboratorial. Foram realizados trs ensaios num mesmo perodo com as sementes de uma mesma safra. Todos os ensaios foram realizados em triplicata e seus valores mdios esto na Tabela 1. Tabela 1 Dados experimentais de atividade enzimtica durante a germinao das sementes de milho Tempo Atividade Enzimtica (SKB) (dias) Ensaio 01 Ensaio 02 Ensaio 03 0 0,157 0,117 0,0762 1 0,234 0,234 0,25 2 2,182 2,074 1,959 3 5,714 5,648 5,581 4 21,818 24,242 26,667 5 6,667 8,386 10,105 8 5,714 7,48 8,727 Na Figura 5, encontra-se o crescimento da atividade enzimtica (AE) das amilases, durante o decorrer de um perodo de 8 dias, para trs ensaios com amostras de uma mesma variedade de milho, de mesma poca de colheita, germinadas no mesmo perodo, com umidade controlada e nas condies ambientais de temperatura e presso. Nesta figura, pode ser observado que a atividade enzimtica, durante a germinao, apresenta comportamento semelhante para ambos os ensaios. V-se que a atividade enzimtica apresenta crescimento lento at o terceiro dia aps as sementes serem postas a germinar, sendo que no quarto dia alcanam seu valor mximo em ambos os experimentos, gerando um pico nos grficos, para depois cair a um valor constante. de se esperar, inicialmente, uma taxa de atividade enzimtica baixa nas sementes (quase que exclusiva devido presena das -amilases) j que estas ainda esto em estado de dormncia. Quando a gua penetra na semente, facilita o transporte de glicerdeos (formas pela -amilase) e do cido giberlico (AG) para as camadas de aleurona onde, os primeiros fornecero energia para alimentar as clulas, enquanto que o segundo ativa os genes do DNA, responsveis pela formao das -amilases. Com isto, percebe-se que esta gerao de enzimas, a princpio, lenta, acelerando, posteriormente, at alcanar seu valor mximo, no quarto dia, quando a

concentrao de produtos gerados pelas enzimas faz com que parte destas sejam inibidas e sua atividade se reduza a um valor constante (Santana, 2003). Na Figura 5, perceptvel observar um comportamento da atividade enzimtica semelhante a uma curva do tipo exponencial, na etapa de crescimento enzimtico (primeira parte antes dos picos nos grficos). Logo este comportamento pode ser modelado semelhante ao da taxa de crescimento microbiano, do tipo y =y0 eb x. Ento, neste estudo, para provar que esta analogia vlida, fizeram-se as seguintes denominaes: AE, ser a simbologia usada para a atividade enzimtica (neste caso em SKB); AE0, a atividade enzimtica das sementes 'in natura' ou a atividade inicial das sementes (SKB); t, o tempo de germinao das sementes (em dias); E a taxa de crescimento da atividade enzimtica da semente caracterstica para cada variedade. Desta forma, o modelo para este trabalho : AE = AE0 et

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A partir de um ajuste exponencial dos dados de atividades enzimticas (valores mdios), obtidos, experimentalmente, em escala laboratorial, Tabela 01, foram encontrados os valores dos parmetros AE0 e . Esses valores encontram-se nas equaes 15, 16 e 17. Como se pode observar a taxa de crescimento enzimtico () apresenta um valor prximo de 1,362 s-1 (0,133 de desvio, 9,8% de erro), mostrando que este valor caracterstico para a variedade estudada. Contudo, mesmo em amostras de uma mesma safra, a atividade destas no estado natural (atividade inicial, AE0) no pode ser considerada como constante, j que seu valor mdio ficou em torno de 0,110 e sua oscilao foi de 44 % (0,048 de desvio padro), ou seja, este valor caracterstico das amostras, embora seus gentipos sejam parecidos. Na Figura 6, esto as curvas geradas pelos modelos empricos (equaes 15, 16 e 17) que correlacionam a atividade enzimtica com o tempo de germinao das sementes de milho. Percebe-se que as curvas representam satisfatoriamente os dados experimentais, pois os coeficientes de correlao encontram-se prximos ao do valor mximo (1,0), indicando assim, um bom ajuste dos modelos.



9

AE(1) = 0,1643 e1,2197 t R = 0,9986 AE(2) = 0,0944 e R = 0,990230

(15) (16)

. AE(3) = 0,0727e1,4821 t R = 0,9958 (17)

1,3851 t

25

E n s a io 0 1 E n s a io 0 2 E n s a io 0 3

20

AE (SKB)

15

10

5

0

0

2

4

6

8

T e m p o ( d ia s )

Figura 5 Comportamento da atividade enzimtica (AE) durante o decorrer da germinao das sementes de milho.30

25

20

AE (SKB)

15

10

5

0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5

Tempo (dias)1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio Expon. (3 Ensaio) Expon. (2 Ensaio) Expon. (1 Ensaio)

Figura 6 Grfico da dependncia da atividade enzimtica (AE) com o tempo de germinao de acordo com o modelo emprico Cintica comparativa entre as amilases de malte de milho in natura e em PEG Este estudo foi baseado, exclusivamente, na equao de cintica enzimtica proposta por Michaelis-Menten, que usa as concentraes de substrato no limites inferior e superior da curva gerada pela equao de cintica. A aplicao de uma regresso linear dos recprocos das concentraes do substrato e das velocidades iniciais na equao linearizada da curva de cintica enzimtica, segundo a metodologia aplicada por Lineweaver-Burk (Morris, 1979; Voet & Voet, 1995), foi usada para determinao das constantes de MichaelisMenten (Km) e de cintica da reao (kcat), e a velocidade mxima de reao (Vmax). Nas Figuras de 7 a 12, encontram-se os comportamentos das cinticas enzimticas, proposta por Michaelis Menten, das enzimas e -amilases de malte de milho nos estados in natura e em meio contendo PEG 4000.


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Todas as curvas foram determinadas em microbioreatores de 5,0 mL, que contm como substrato o amido a concentraes variadas em tampo fosfato a pH 5,0 (prximo do timo das duas enzimas) e a temperaturas de 75 2 C e 55 2C e (timos da e -amilases, respectivamente). Percebe-se que em ambas as figuras as curva geradas pelas enzimas em PEG, apresentam valores maiores em suas regies assintticas que as curvas geradas pelas enzimas em malte de milho. Sendo assim, as primeiras possuem velocidades mximas maiores que as segundas, j que nesta regio se encontram os valores quase constantes de Vmx. Isto indica que as enzimas em extrato de malte possuem uma atividade menor que as enzimas em extrato de PEG 4000, pois necessitam de

um tempo maior para hidrolisar totalmente uma mesma massa de amido. O que tambm pode ser comprovado ao se observar as Figuras 8 e 10, que se referem s curvas anteriores linearizadas pelo mtodo de Liweneaver-Burk. Nestas ltimas figuras, pode-se comparar melhor s atividades das enzimas em malte de milho com as recuperadas em PEG, pois o coeficiente linear destas retas o recproco da velocidade mxima, logo aquela que apresentou um menor valor deste coeficiente possui uma maior atividade enzimtica. Este fato comprova que o PEG agente ativador destas enzimas como j foi percebido por outros autores (Malinowski, 2001), alm de ser um meio propcio para a catalise sem contaminao dos produtos, com uso liberado pelo FDA em alimentos (Harris, 1992).Amilases em malte Amilases em PEG 4000

0,7 0,6 0,5

V (g/L.m in)

0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

[S] (g/L)

Figura 7 Cinticas de hidrlise do amido, a pH 5,0 e 75C.Amilases em malte Amilases em PEG 40005,5 5,0 4,5 4,0

1 /V

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400

1/[S]

Figura 8 Linearizao pelo mtodo de Lineweaver Burk das curvas de hidrlise do amido, a pH 5,0 e 75C.Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais, Campina Grande, v.7, n.1, p.1-14, 2005


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As Figuras 11 e 12 representam a comparao entre as curvas de cintica normal e linearizada das enzimas recuperada em PEG nas temperaturas de 55 2C e 75 2C. Observa-se por comparao que em ambas h uma superao dos dados das enzimas em PEG a 75C sobre as enzimas em PEG a 55C, de forma que ambas as figuras demonstram que na primeira temperatura as enzimas possuem uma

atividade maior, ou seja, h uma maior percentagem das -amilases que as -amilases no extrato enzimtico em PEG, j que as primeiras possuem atividade tima para o pH e a temperatura prxima de 5,0 e 75C, respectivamente, e as segundas enzimas perderem sua atividade medida que se eleva a temperatura alm do seu timo, 55C.

Amilases em malte Amilases em PEG0,65 0,60 0,55 0,50

V(g .m ) /L in

0,45 0,40 0,35 0,30 0,25 0,20 -0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

[S] (g/L)

Figura 9 Cinticas de hidrlise do amido, a pH 5,0 e 55C.

3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6

Amilases em malte Amilases em PEG

1 /V

2,4 2,2 2,0 1,8 1,6 1,4 -100

0

100

200

300

400

500

600

700

800

1/[S]

Figura 10 Linearizao pelo mtodo de Lineweaver Burk das curvas de hidrlise do amido, a pH 5,0 e 55C. Este fato tambm comprovado pelos dados obtidos aps linearizao das equaes de cintica, j que a velocidade mxima (Vmax) e a constante cataltica (kcat) do extrato


12


enzimtico em PEG a 75 superam os valores destas constantes para o extrato enzimtico em

PEG a 55C.

75 C 55 C0,7

0,6

0,5

V(g .m ) /L in

0,4

0,3

0,2

0,1 -0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

[S]Figura 11 Comparao entre as curvas de cintica de hidrlise do amido nas temperaturas de 55C e 75C, utilizando as amilases em PEG 4000, a pH 5,0.75 C 55 C5,5 5,0 4,5 4,0

1 /V

3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0 100 200 300 400 500 600 700 800

1/[S]Figura 12 Comparao entre as curvas de hidrlise do amido linearizadas nas temperaturas de 55C e 75C, utilizando as amilases em PEG 4000, a pH 5,0. A seguir so descriminadas as equaes 18, 19, 20 e 21 que contem os valores dos parmetros dos modelos de cintica enzimtica, segundo Michaelis-Menten linearizados por Lineweaver Burk. As equaes de nmeros pares representam as curvas de cintica linearizadas para as enzimas em malte de milho e as de nmeros mpares representam as enzimas recuperadas em PEG 4000, a 75 e 55C, respectivamente. Abaixo destas equaes encontram-se os valores das respectivas correlaes mltiplas (R2), da velocidade mxima (Vmx), da constante de Michaelis Menten (Km) e da constante cataltica (kcat), com suas devidas unidades. Para os clculos das constantes cinticas, consideraram-se as concentraes de enzimas, [E], como sendo s medidas das concentraes de protena total nos



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extratos, as quais foram: 0,01014 g/L e 0,004979 g/L, nos extratos enzimticos em malte e em PEG, respectivamente. 1 - Modelo cintico linearizado para as enzimas em extrato de PEG a 75C. 1 1 = 0,0101 + 1,533 V [S]R2 = 0,9964 Vmx = 0,6523 (g / L. min) Km = 0,006588(g / L) kcat = 1310 (min1 ) ,

(18)

2 - Modelo cintico linearizado para as enzimas em extrato do malte de milho a 75C. 1 1 = 0,0097 + 1,808 V [S]

R2 = 0,9970 Vmx = 0,5529 (g / L. min) Km = 0,01754 (g / L) kcat = 54,51 (min1 )

(19)

3 Modelo cintico linearizado para as enzimas em extrato de PEG a 55C. 1 1 = 0,0024 + 1,616 V [S]R 2 = 0,9981 Vmx = 0,6189 (g / L. min) Km = 0,001485 ( g / L) kcat = 124,3 (min1 )

estudo, que no quarto dia de germinao as sementes de milho, tem a sua mxima atividade enzimtica, sendo considerado ponto timo para o processo de maltagem dessas sementes; O estudo cintico enzimtico comparativo entre as enzimas e -amilases nas formas de malte de milho e de extrato em PEG 4000, ambos a pH 5,0 e temperaturas de 55 2C e 75 2C, demonstrou que as enzimas recuperadas em PEG 4000 possuem uma maior velocidade mxima, para ambas as temperaturas, que as enzimas em malte de milho, o que j foi comprovado durante a partio em batelada, onde o valor da atividade especfica do extrato enzimtico em PEG foi superior ao extrato enzimtico em malte a temperatura ambiente (30 2C); Tambm se pode concluir que h uma maior atividade das enzimas -amilases que as -amilases, ao serem comparados as constantes cinticas e a velocidade de mxima de reao, obtidos nas devidas temperaturas e pH timos de cada enzima (75C e 55C), percebeu-se que os valores da primeira superaram os valores da segunda. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Albertsson, P. - . Partition of cell particles and macromolecules. 3 ed., John Willey, New York - USA, 1986, 324 p. Borzani, W. Aquarone, E. & Lima, U. A. Biotecnologia: Tecnologia das Fermentaes. Vol. 01. 3 Reimpresso. Ed. Edgard Blucher Ltda. So Paulo SP. 1986, 304 p. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein. Utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochem. 72. 248-254, 1976. Diamond, A.D., Hsu, J.T. Aqueos two phase systems for biomolecule separation. Advences in Biochemistry Engineering, v. 47, p. 89-135, 1992. Forgaty, W. M. & Kelly, C. T. Topics in Enzyme and Fermentation. Biotechnology; v.3, Chichester, G, Howood- J. Wiley & Sons, 1979, p. Friedman, P. J. Biochemistry: An Illustrated Review with Questions and Explanation.

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4 - Modelo cintico linearizada para as enzimas em extrato do malte de milho a 55C. 1 1 = 0,0024 + 1,538 V [S]R 2 = 0,9991 Vmx = 0,6504 (g / L. min) Km = 0,003690 (g / L) kcat = 64,17 (min1 )

(21)

CONCLUSES A plotagem dos dados de tempo em dias e atividade enzimtica em SKB, resultou numa curva em forma de pico, onde a mxima atividade das sementes, foi observada no quarto dia de germinao e at a formao do pico a atividade enzimtica (AE) uma funo exponencial do tempo (t), do tipo: AE = A0 e t, onde AE0 a atividade da semente 'in natura' e a taxa de crescimento da atividade enzimtica da semente caracterstica de cada variedade, anlogo ao crescimento de microrganismos. Concluiu-se, tambm, neste


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