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ARTIGO DE REVISÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS CURSO: ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA E QUÍMICA AMBIENTAL CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS DE INTERESSE E METODOS DE CONSERVAÇÃO Isack Oliveira Pinto, <[email protected]> José Diogo Costa Sousa, <[email protected]> Kellen Kauanne Pimenta de Oliveira, <[email protected]> Leonardo Peixoto Carvalho, <[email protected]> Leandra Cristina A. Silva, <[email protected]> Murilo Augusto Ribeiro, <[email protected]> Valéria Cristina Ferreira Silva, <[email protected]> RESUMO Processos industriais tem se desenvolvido cada vez mais no último século e com eles inúmeras descobertas na área científica. Processos de produção com a utilização de microrganismos sempre existiram, contudo o desenvolvimento dessas técnicas e sua utilização em escala industrial têm ganhado força há pouco tempo. Indústrias alcooleiras, bebidas fermentadas, biocombustíveis, farmacêuticas entre outras se utilizam largamente de técnicas industriais como a fermentação. Para o desenvolvimento desses processos é de fundamental importância o desenvolvimento de estudos que aprimorem a qualidade dos mesmos, com a descoberta e otimização dos microrganismos utilizados e por meio de técnicas

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ARTIGO DE REVISOUNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINSCURSO: ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA E QUMICA AMBIENTALCAMPUS UNIVERSITRIO DE GURUPI

ISOLAMENTO E SELEO DE MICRORGANISMOS DE INTERESSE E METODOS DE CONSERVAOIsack Oliveira Pinto, Jos Diogo Costa Sousa, Kellen Kauanne Pimenta de Oliveira, Leonardo Peixoto Carvalho, Leandra Cristina A. Silva, Murilo Augusto Ribeiro, Valria Cristina Ferreira Silva,

RESUMOProcessos industriais tem se desenvolvido cada vez mais no ltimo sculo e com eles inmeras descobertas na rea cientfica. Processos de produo com a utilizao de microrganismos sempre existiram, contudo o desenvolvimento dessas tcnicas e sua utilizao em escala industrial tm ganhado fora h pouco tempo. Indstrias alcooleiras, bebidas fermentadas, biocombustveis, farmacuticas entre outras se utilizam largamente de tcnicas industriais como a fermentao. Para o desenvolvimento desses processos de fundamental importncia o desenvolvimento de estudos que aprimorem a qualidade dos mesmos, com a descoberta e otimizao dos microrganismos utilizados e por meio de tcnicas biotecnolgicas. Estas tcnicas se aplicam desde o isolamento in situ, mtodos de conservao at a escolha dos meios de cultura.

ABSTRACTIndustrial processes has developed increasingly in the last century and with them numerous discoveries in science. Production processes with the use of micro-organisms have always existed, but the development of these techniques and their use in industrial scale have gained strength recently. Alcohol industry, fermented beverages, biofuels, pharmaceutical and other techniques are used widely as industrial fermentation. For the development of these processes is of fundamental importance to develop studies that improve their quality, with the discovery and optimization of microorganisms used and through biotechnological techniques. These techniques apply in situ from insulation, to methods of preserving Choice of culture media.

INTRODUO - KauanneSegundo Canhos e Manfio (2001), os microrganismos apresentam uma imensa diversidade gentica e desempenham diferentes e importantes funes na manuteno de ecossistemas, como componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoqumicos. Apesar dos estudos avanarem, acredita-se que apenas uma pequena quantidade de microorganismos tenha sido descrita e caracterizada.Dentre esses microrganismos j caracterizados a maioria foi submetida a pesquisas por possuir qualidades de interesse particular para os seres humanos, que eram utilizados na produo de vrios produtos mesmo que no se conhecesse a fundo suas propriedades. Assim Desenvolveu-se o ramo da biotecnologia que de acordo com Schimidell (2001) se baseia na procura e descoberta de ferramentas biolgicas explorveis industrialmente e dentro delas esto os microorganismos. Este processo envolve vrias etapas, que vo desde a coleta e isolamento adequados do material, seleo, triagem de material com atributos desejveis, cultivo e armazenamento, entre outras.A maioria dos processos industriais, envolvendo microrganismos, faz uso dos processos fermentativos, que so dos mais variados, pois como j foi dito, h uma infinidade de microorganismos que podem ser utilizados em tais processos e cada um possui suas particularidades. Por isso, antes de se iniciar qualquer processo, deve-se estudar muito bem a fisiologia do microorganismo e as condies em que ele ir se adaptar melhor (SCHIMIDELL, 2001).Sendo assim para o sucesso de um processo fermentativo, quatro pontos bsicos devem ser bem definidos, so eles: o microorganismo, o meio de cultura, a forma de conduo do processo fermentativo e as etapas de recuperao do produto, que , num processo industrial, o objetivo de maior interesse, pois o processo deve gerar o mximo de lucro possvel, com o menor gasto de capital. (CANHOS E MANFIO, 2001).Devido a essa grande importncia dos microrganismos e aplicabilidade em processos industriais, interessante que se desenvolvam cada vez mais trabalhos voltados pesquisa e desenvolvimento de novas tecnologias, assim o presente trabalho tem por objetivo aprimorar a viso a respeito dos processos de seleo e cultivo de microrganismos de interesse industrial, uma rea de atuao direta dos biotecnlogistas.

REVISO DE LITERATURA

1 Isolamento e seleo de microrganismos de interesse e mtodos de conservao - IsackMicrorganismos so utilizados de diversas maneiras desde o inicio da humanidade com o desenvolvimento de processos para a produo de alimentos, bebidas e posteriormente remdios. Inicialmente com o pouco desenvolvimento da cincia microscpica este universo dos microrganismos que auxiliavam nas atividades humanas no era conhecido (TORTORA, 2006).Com o desenvolvimento da cincia e a descoberta das funes microbiolgicas de uma vasta gama de microrganismos se desenvolveu a pratica do isolamento de estirpes de interesse, sobretudo os relacionados a processos que posteriormente foram adotados em linha industrial (TORTORA, 2006).

1.1 Microrganismos de interesse industrialA utilizao de microrganismos em escala industrial j possui processos bem definidos, de acordo com cada tipo de microrganismo empregado, a partir de bancos de dados possui-se vasto conhecimento sobre todas as caractersticas fisiolgicas e dependncias nutricionais, sobretudo as relacionadas a processos fermentativos que so peas principais em grandes indstrias como as acar-alcooleira e de bebidas (SCHMIDELL, 2001). Mas como se chegar a essas estirpes de interesse industrial, se no meio ambiente existem inmeros microrganismos com caractersticas e produtos desconhecidos?Podemos extrair microrganismos de interesse industrial do meio ambiente de diversas formas, contudo faz-se necessria uma seleo, pois como j comentado, em um meio ambiente aberto existem inmeros microrganismos vivendo em um mesmo local e eles podem no ter as caractersticas desejadas podendo at serem competidores, que quando cultivados juntos no iro produzir o que se espera (TORTORA, 2006).

1.2 Obteno e caractersticasMicrorganismos de interesse industrial podem ser obtidos de diversas maneiras, a partir do isolamento direto no meio ambiente, compra bancos de microrganismos e cepas, pela obteno de mutantes naturais ou at mesmo induzidos geneticamente por mtodos convencionais ou de tcnicas de engenharia gentica (SCHMIDELL, 2001). Mtodos pelos quais sempre se busca a obteno de culturas que consigam produzir de maneira contnua e em um estado pice para o microrganismo.Uma das maiores fontes de microrganismos o meio ambiente natural, como gua, solos plantas, etc., e o isolamento a partir desses locais sempre teve uma grande relevncia para a obteno e desenvolvimento de novas linhagens. A pesar de toda essa riqueza, a obteno desses microrganismos depende de um trabalho rduo, com um custo relativamente elevado e muito trabalho experimental, porm o ganho pode ser compensatrio, pois, pode-se conduzir ao isolamento de linhagens melhor produtoras de um dado produto [...] (alm da) descoberta de novos produtos, [...] (SCHMIDELL, 2001).Cabe ainda ressaltar que assim como afirma Schmidell, 2001, existem grandes indstrias, como produtoras de antibiticos e enzimas que possuem programas de isolamento de linhagens de recursos naturais, com a finalidade de melhorar a produo de certos produtos, ou com a finalidade de desenvolver estirpes produtoras de novos antibiticos.Todo microrganismo para ser cultivado e se desenvolver em ambientes artificialmente controlados devem ser adaptados a essas condies e estas tambm devem ser oferecidas de acordo com o tipo de microrganismo com que se pretende trabalhar. Assim algumas caractersticas j observadas podem ser ressaltadas de maneira geral, para que possa se obter microrganismos com caractersticas desejveis e meios de cultura mais favorveis ao desempenho de cada linhagem microbiolgica.Para a aplicao industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes caractersticas gerais: apresentar elevada eficincia na converso do substrato em produto; permitir o acumulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentrao do produto no caldo fermentado; no produzir substncias incompatveis com o produto apresentar constncia quanto ao comportamento fisiolgico; no ser patognico; no exigir condies de processo muito complexas; no exigir meios de cultura dispendiosos; permitir a rpida liberao do produto para o meio.(SCHMIDELL, 2001).

2 Seleo de microrganismos - MuriloUma das etapas importantes no processo desenvolvimento de culturas de interesse industrial so a sua seleo e propagao e isso depende profundamente do meio de cultivo, assim o meio de cultivo pode influenciar diretamente na capacidade do microrganismo, e deve ser estabelecido de forma a proporcionar a sua utilizao em processos de larga escala.De acordo com Schimidell (2001), podemos considerar algumas caractersticas fundamentais para os meios de cultura tais como: ser o mais barato possvel; atender s necessidades nutricionais dos microrganismos; auxiliar no controle do processo, como o caso de ser ligeiramente tamponado, o que evita variaes drsticas de pH, ou evitar uma excessiva formao de espuma; no provocar problemas na recuperao do produto; permitir um tempo de armazenagem razovel; ter composio razoavelmente fixa.Assim destacam-se a seguir alguns dos mtodos de seleo mais utilizados em que se utiliza de dois tipos bsicos de meio de cultivo slido e lquido, de acordo com a tcnica especfica e com a qualidade do microrganismo.

2.1 Isolamentos em cultivo slidoDentro os vrios mtodos de isolamento existe cada um que melhor empregado de acordo com o tipo de microrganismo que se interessa desenvolver e estudar, assim aps estudos de viabilidade e adaptao estes mtodos podem ser empregados em processos industriais, de modo a se obter uma resposta mxima no que diz respeito a gerao de produtos pela via metablica do microrganismo. Segundo Prescott et al (2002) o mtodo de isolamento em cultivo slido uma forma muito utilizada para isolamento de certos produtores de enzimas, a partir de meios seletivos contendo um determinado substrato que pode ser degradado pelas enzimas produzidas pelos microrganismos desejados.O Bacteriologista alemo Robert Koch teve uma grande importncia nos estudos iniciais sobre a seleo e obteno de culturas puras. Antigamente o isolamento era feito apenas por meio liquido, por este motivo era muito difcil o isolamento de bactrias, Koch ento buscou isolar microrganismos a partir de um cultivo slido em superfcie de batata (LECLERC et al., 1983).Em 1882 o japons Minora Tarazaemon dono de uma hospedaria descobriu o gar, que passou a ser utilizado como agente solidificante (PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002). Outro agente solidificante que pode ser utilizado o cido slico, muito importante na preparao de meios rigorosamente definidos (LECLERC et al., 1983). 2.1.1 Tcnica de semeadura por estrias Existe uma infinidade de tcnicas de isolamento, onde diferentes espcies de uma espcie natural podem ser isoladas e de forma purificada e selecionada serem desenvolvidas, entre esses processos um dos mais difundidos e com uma grande aplicao em prticas laboratoriais o mtodo de isolamento a partir de semeadura por estrias em meio solido. Mtodo tambm conhecido como esgotamento de ala, que utiliza uma ala de platina. O procedimento comea com a coleta do inoculo e o espalha sobre uma placa de Petri com gar fazendo movimentos em ziguezague em um nico sentido, formando uma espcie de estria, que pode ser contnua ou descontnua (DROVAL, LIMA e HABU, 2001).

Esgotamento por estrias. Fonte: CORDEIRO, 2011.

Na forma descontnua, consideram-se trs regies, onde so feitas as estrias na poro 1 da placa, logo em seguida flamba-se a ala, retira e espalha as bactrias da regio 1 na regio 2, novamente flamba a ala e espalha-se as bactrias da regio 2 na regio 3. Na forma contnua, primeiramente ocorre a coleta de uma determinada quantidade do meio de semeadura e percorrer a partir da borda com a ala formando uma estria at o centro da placa, e do lado oposto fazer o mesmo procedimento (DROVAL, LIMA, HABU, 2001).Segundo Cordeiro (2011), aps a inoculao por esgotamento, a placa levada estufa bacteriolgica a uma temperatura controlada de 37C por 48h. Aps isso pode-se submeter a amostra a anlise microscpica das diferentes colnias formadas na superfcie da placa, com diferentes fundos e bactrias.

Resultado da tcnica de esgotamento. Fonte: CORDEIRO, 2011.

2.2 Isolamentos em cultivo lquido - ValriaOs meios lquidos so os que proporcionam a um grande aumento de uma determinada populao microbiana. Aps o crescimento avantajado, ocorre o isolamento de determinadas clulas. Este procedimento pode ento ser realizado a partir de tcnicas de diluio em meio lquido. Realizando uma diluio em um novo meio estril, espera-se que em certo momento se obter culturas provenientes de somente uma nica clula. Este procedimento, por exemplo, muito utilizado para o isolamento, seleo e contagem de clulas da Escherichia coli em guas ou alimentos (LECLERC et al., 1983).

2.2.1 Isolamento em cultivo contnuo um mtodo que deve produzir um nmero de clulas maior, do que em relao aos outros, que depende da capacidade de desenvolvimento de um microrganismo em um determinado meio. O cultivo em meio de enriquecimento na maioria das vezes feito em Erlenmeyers. No entanto, o crescimento de um determinado microrganismo oriundo de uma amostra variada na forma de batelada pode resultar numa mudana das condies do meio, ocasionando uma variao nas presses seletivas. Porm esta variao pode ser resolvida, inoculando uma parcela desse meio de enriquecimento em um novo meio idntico ao inicial (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).Vrios outros microrganismos podem crescer em um meio, portanto a prevalncia do microrganismo desejado com relao aos demais, depende da taxa mxima de crescimento do microrganismo, ou seja aquele que crescer mais rpido com os substratos disponveis, ter um nmero maior de clulas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).Em determinados procedimentos, o organismo desejado no o com maior crescimento, mas sim aquele que possui maior afinidade com o substrato disponvel. Nestes casos, utilizado um tipo de cultivo denominado cultivo contnuo, onde um novo meio de cultivo ento adicionado de tempos em tempos, com as presses devidamente restauradas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).Em um cultivo contnuo, deve-se observar que a taxa de crescimento dependente da taxa de diluio do substrato limitante. Para determinar isso, utilizada a equao de Monod, que definida por: = mx.s/( Ks + s) (Frmula1) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995)Onde a taxa de crescimento, s a concentrao do substrato residual, Ks a constante de utilizao do substrato (que expressa afinidade do microrganismo para o consumo do substrato).No estado estacionrio, temos que igual taxa de diluio (D), transformando a frmula em: D= mx.S/(Ks + S)(Frmula 2) (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).Onde S a concentrao do substrato no reator, que ser constante no estado estacionrio (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).Como pode ser mostrado a partir da Frmula dois, se o substrato estiver abaixo da taxa de crescimento predita pela taxa de diluio, ocorrer a eluio das clulas do reator, resultando na diminuio da concentrao de biomassa do determinado microrganismo (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Organismos que podem ser obtidos atravs do cultivo em batelada ou em placas de Petri podem muitas vezes no se adaptar ao cultivo contnuo, sendo assim, mais vantajoso realizar um isolamento direto atravs do cultivo contnuo para que sejam selecionados os microrganismos adaptados para essa condio (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995). Esta uma tcnica que muito utilizada na seleo de microrganismos para produo de biomassa, e tambm j foi muito utilizada para bactrias produtoras de enzimas (STANBURY, WHITAKER E HALL, 1995).

3 Mtodos de Conservao de Microrganismos - LeonardoA maneira mais eficaz de conservar microrganismos de interesse industrial, acadmico e econmico a preservao em colees. Logo, sua preservao e conservao devem ser feita com intuito de garantir sua pureza, estabilidade e sobrevivncia por perodos de tempo prolongado conservando as caractersticas genticas e suas propriedades morfolgicas e fisiolgicas.O isolamento, identificao e conservao de microrganismo se caracterizam como prtica imprescindvel para o desenvolvimento da pesquisa, processos e obteno de produtos interesse econmico (GIRO et al., 2004).Segundo COSTA & FERREIRA (1991), os mtodos de conservao de microrganismo podem ser classificados de acordo com o tempo mximo de preservao: Mtodos de conservao de curto prazo: repique contnuo; Mtodos de mdio prazo: preservao em leo mineral, preservao em gua esterilizada; Mtodos de longo prazo: liofilizao, criopreservao.Jos Diogo3.1 Repique contnuoO repique contnuo uma das tcnicas mais antigas de conservao. um mtodo simples e bastante utilizado em laboratrios para se obter a viabilidade de microrganismo, principalmente bactria (ROMEIRO, 2006).O mtodo consiste na inoculao do microrganismo em meio adequado, incubao em ambiente favorvel multiplicao e estocagem em baixas temperaturas, aps a inoculao. aconselhvel que o meio inoculado seja preservado em refrigeradores (5 a 8C), em busca da reduo do metabolismo microbiano (COSTA & FERREIRA, 1991).Este mtodo possui muitas vantagens, como ter baixo custo no requerer manejo especializado e o manejo simples, porm, h tambm certas desvantagens, como riscos de contaminao e possvel perda da linhagem, perda de caractersticas morfolgicas, fisiolgicas ou patogenicidade, a seleo de clulas atpicas (variantes ou mutantes), a superviso especializada, a necessidade de mo-de-obra e espao relativamente grande para o armazenamento (ROMEIRO, 2006).

3.2 Preservao em leo mineralO mtodo de manuteno em leo mineral consiste na aplicao de uma camada de leo mineral esterilizado sobre a cultura de microrganismo, a fim de limitar a quantidade de oxignio disponvel, causando assim uma reduo no metabolismo e consequentemente na taxa de multiplicao do agente, no se deve utilizar camadas de leo superiores a um centmetro, pois uma diminuio na viabilidade do microrganismo quando h total exausto do oxignio (COSTA & FERREIRA, 1991; ROMEIRO, 2006).A preservao em leo mineral requer um espao relativamente grande para o armazenamento. O leo mineral deve ter pureza elevada e deve ser autoclavado por duas horas antes do precesso, a superfcie inclinada da cultura precisa ser totalmente recoberta pelo leo, pois o miclio em contato com o ar drena a gua do meio para o exterior, levando desidratao total da cultura (ROMEIRO, 2006).A temperatura do ambiente de armazenamento deve ser ajustada s necessidades individuais dos microrganismos a serem preservados e as repicagens provenientes de culturas em leo devem ser feitas para o mesmo meio sobre o qual a espcie esta sendo preservada e isso deve ser feito aps a drenagem total do leo (ROMEIRO, 2006).

3.3 Conservao em gua esterilizaA conservao em gua esteriliza deve ser usada preferencialmente com culturas jovens, cerca de 10 a 15 dias e visa atingir o estgio de hipobiose, o mtodo consiste na transferncia de uma suspenso de clulas com a posterior adio da gua esterilizada ou uma soluo salina. Este mtodo e indicado para preservao de microrganismos sensveis a baixas presses osmticas de solues hipotnicas (NEUFELD & OLIVEIRA, 2008).Segundo ALTERTHUMM (2001), o passo subsequente ao isolamento de microrganismos em cultura pura sua conservao. Para tala cultura de interesse acondicionada em temperaturas baixas, onde se busca obter uma diminuio da atividade metablica permanecendo o microrganismo vivel ao uso por mais tempo. Dentre os mtodos mais empregados para conservao, tem-se a liofilizao. Nesse, o microrganismo de interesse suspenso em soluo adequada como albumina, introduzido ento em uma ampola e resfriado rapidamente a uma temperatura de 30 C, em seguida a soluo congelada sublimada (gua ebulida), fechada hermeticamente e conservada temperatura de geladeira. A criopreservao e um mtodo utilizado na preservao de vrios tipos de microrganismo sob baixas temperaturas. So usadas baixas temperaturas (-20 a -80 C em freezers) e ultra-baixa temperaturas (-150 a -196 C em nitrognio liquido). A estocagem dos microrganismos a baixa temperatura, a pesar de ser eficiente, pode comprometer a qualidade dos microrganismos, pois pode ocorrer uma variao de temperaturas nos freezers. J o sistema com nitrognio lquido e mais eficiente, pois sua temperatura permanece constante e por longos perodos de tempo (ROMEIRO, 2006).Em conservaes em curto prazo, cerca de dois ou trs anos, pode-se utilizar a conservao por meio do emprego de leos minerais esterilizados aplicados sobre a cultura a ser preservada, pois o leo limita a quantidade de oxignio ao microrganismo que por sua vez tem o metabolismo desacelerado. Ento essa tcnica til para conservar bactrias e fungos, alm de diminuir a desidratao da cultura devido ao baixo teor de oxignio (vlido para microrganismos aerbicos e facultativos) (OLIVEIRA et al., 2012).Para esse mtodo recomendvel se usar uma camada de 1 a 2 cm de espessura, visto que valores acima desses podem causar a perda total do suprimento de oxignio a espcime de interesse. Recomenda-se tambm que o leo mineral usado possua massa especfica entre 0,865 e 0,890 e seja devidamente esterilizado (CEFAR, 2006).Outro mtodo de conservao microbiana o uso de gua destilada esterilizada, que consiste na transferncia do microrganismo, preferencialmente em grandes concentraes, para recipientes contendo gua destilada esterilizada ou soluo salina sendo armazenados em temperatura ambiente. recomendado para culturas jovens de 10 a 15 dias de inoculao. No entanto, esse mtodo est sujeito contaminao e a desestabilizao da cultura, podendo ocorrer mutaes (OLIVEIRA et al., 2012).

4 Consideraes Finais - KAUANNEComo visto as caractersticas adequadas do microorganismo a ser utilizado no processo, assim como o meio de cultura para este, etapa de grande importncia para o sucesso do processo fermentativo. Tambm de extrema importncia escolher o processo fermentativo mais adequado para o microorganismo escolhido e o objetivo a se alcanar, assim como cuidar para que a etapa de recuperao do produto seja corretamente realizada. (SCHIMIDELL, 2001).Outro passo a ser lembrado o de conservao do microorganismo de interesse, visto que com isso este permanecer vivel ao uso por mais tempo. importante escolher dentre os vrios mtodos de conservao existentes aquele mais indicado para o microorganismo de interesse e para o tempo em que se deseja armazen-lo. (OLIVEIRA et al., 2012).Contudo relevante alertar sobre a constante necessidade de desenvolvimento do processo produtivo j instalado, em virtude da grande variedade de desenvolvimentos possveis. muito difcil que uma empresa possua o microorganismo timo, ou do meio de cultura otimizado, com isso da mais alta importncia que essa empresa busque o desenvolvimento de microorganismos e meios de cultura mais eficientes para o processo desejado; caso contrrio a empresa poder ser ultrapassada por outras com oferta de produtos com menor custo ou de melhor qualidade. (SCHIMIDELL, 2001).

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