Artigo Nano

i

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUMICA

DEPARTAMENTO DE FSICO-QUMICA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE FORMULAES LIPOSSOMAIS CONTENDO O

FRMACO NISTATINA

Edeilza Gomes Brescansin

Orientador: Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine (IQ-UNICAMP)

Campinas SP 2006

iii

EDEIZA GOMES BRESCANSIN

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE FORMULAES LIPOSSOMAIS CONTENDO O FRMACO NISTATINA

Tese apresentada Universidade Estadual de Campinas, como requisito para obteno do ttulo de Doutor em Cincias

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine (orientador) Profa. Dra. Eneida de Paula (IB-UNICAMP) Prof. Dr. Cludio Francisco Tormena (IQ-UNICAMP) Prof. Dr. Marcelo Ganzarolli de Oliveira (IQ-UNICAMP) Prof. Dr. Noboru Hioka (DQ-UEM)

v

Dedico este trabalho

A meu Deus pela proteo e paz,

A minha querida me Maria Eunice que esteve sempre a meu lado em todas as horas,

A meu querido marido, Jos Valdir pelo apoio e companheirismo,

A meus filhos Mariana e Pedro.

vii

"O valor das coisas no est no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem.

Por isso existem momentos inesquecveis, coisas inexplicveis e

pessoas incomparveis".

(Fernando Pessoa)

ix

AGRADECIMENTOS

Ao Professor Francisco Benedito Teixeira Pessine, meus sinceros agradecimentos, no

apenas pela orientao, mas tambm pelo incentivo, confiana e amizade nestes anos

de convivncia.

Aos amigos que encontrei na UNICAMP pela simpatia, incentivo e auxlio nos

momentos difceis do projeto e na vida pessoal: Ana Paula, Milene, Neife, Dbora Biloti,

Adriana, Daniel, Anglica, Josivnia,

A minha amiga, professora Mrcia Portilho da UEM pela leitura e correes do trabalho.

Aos professores da UEM , Osvaldo A. Cavalcanti, Graciette Matioli, Elza Kimura, Maria

da Conceio T. Truiti, Adriana Lenita M. Albiero, Nelson Y. Uesu, Edna Regina N.

Oliveira pelas palavras de incentivo nesta reta final da tese.

Ao professor Luiz Carlos Dias (IQ/UNICAMP) e seus alunos, pela amizade,

companheirismo e pela colaborao na realizao de nosso projeto com o emprstimo

e doao de equipamentos e /ou reagentes.

A Professora Eneida de Paula (IB/UNICAMP) e funcionrios do IB pelo auxlio no uso

da ultracentrfuga

Aos professores Maria Helena Santana (FEQ/UNICAMP), Pedro L. O Volpe

(IQ/UNICAMP), Fernando Galenbeck (IQ/UNICAMP), Carlos F. S. Bonaf

(IB/UNICAMP), Anita J. Marsaioli, Lauro Kubota (IQ/UNICAMP), Maria Isabel M. S.

Bueno (FEQ/UNICAMP) e Renato Atlio Jorge (IQ/UNICAMP) pelo emprstimo de

equipamentos em seus laboratrios.

Ao Dr. Carlos Ramos (BFM/LNLS) e Silvia Lucas F. da Silva (IQ/UNICAMP) e ao

Laboratrio Nacional de Luz Sncroton (LNLS) pelo emprstimo e auxlio na utilizao

do MicroDSC.

A professora Anglica Zaninelli Schreiber (FCM/UNICAMP) e Luzia Lyra

(FCM/UNICAMP) pelo grande auxlio nas anlises de atividade antifngica do frmaco

estudado.

Aos Tcnicos do IQ que tanto nos auxiliaram nesta tese: Claudia Matelli, Robson, Maria

do Carmo, Ana, Ricardo Pereira, Divino, Sonia (RMN), Sr. Fontana, Pimpim, Cssia,

x

Fabiana, Iveraldo

Aos funcionrios das oficinas, vidraria, almoxarifado, marcenaria, manuteno e

informtica

A CAPES, pelo suporte financeiro com a concesso de bolsa de estudo pelo programa

Institucional de Capacitao Docente e Tcnico-Administrativo (PICDT).

xi

CURRICULUM VITAE

DADOS PESSOAIS Nome:Edeilza Gomes Brescansin Tel: (44)3026-8010 - e-mail: [email protected] Endereo residencial: Rua Joaquim Nabuco, 163, apto. 1401.

Zona 01, Maring PR. - CEP: 87013-340

FORMAO ACADMICA Doutorado em Cincias Fsico-Qumica. Desenvolvimento e Caracterizao de Formulaes Lipossomais contendo o Frmaco Nistatina. Universidade Estadual de Campinas Instituto de Qumica - Perodo: 2001 2006. rgo financiador: CAPES Programa PICDT Mestrado em Qumica Fsico-Qumica.

Determinao da Estabilidade Qumica e mecnica do Medicamento Reliflex e seu Princpio Ativo Nabumetona.

Universidade Estadual de Maring Departamento de Qumica - Perodo: 1995 1998. Especilizao em Gesto da Qualidade. Aplicao de Mtodos Estatsticos para a Melhoria da Qualidade na Produo de

Comprimidos. Universidade Estadual de Maring - Departamento de Administrao Perodo: setembro 1993 dezembro 1995. Graduao em Farmcia Farmcia Industrial Universidade Federal do Rio de Janeiro Departamento de Farmcia. Perodo: 1981 1986

ATUAO PROFISSIONAL Universidade Estadual de Maring, UEM, Brasil. Vnculo: Servidor Pblico, Enquadramento Funcional: Professor Assistente Nivel D, Carga horria: 40 h - Regime: Dedicao exclusiva. Perodo: 1991 Atual

LIVROS PUBLICADOS/ORGANIZADOS OU EDIES BRESCANSIN, E.G. VALENTINI, S. R. MEMENTO TERAPUTICO, SRIE

APONTAMENTOS. Maring: EDUEM - Editora da Universidade Estadual de Maring, 1999.

ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIDICOS MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; HIOKA, N. ; MAIONCHI, F. ; MATIOLI, G. .

ESTUDO DA DEGRADAO DO FRMACO NABUMETONA FRENTE LUZ . Acta Scientiarum, Maring, v. 23, n. 3, p. 651-659, 2001.

RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSO (ARTIGOS) BRESCANSIN, E. G.; MARTINS, M. H.; PESSINE, F. B. T. ENCAPSULATION OF NYSTATIN

IN MULTILAMELLAR LIPOSOMES. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, v. 39, supl. 2, 2003.

MARTINS, M. H.; BRESCANSIN, E. G.; PESSINE, F. B. T. PHOTOSTABILITY OF ISOTRETINOIN IN METHANOL AND IN LIPOSOMES. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, v. 39, supl. 2, 2003.

MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . IDENTIFICATION OF THE OBTAINED PHOTOPRODUCTS OF THE DEGRADATION THE NABUMETONE. European

xii

Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 13, n. 1, p. 57, 2001.

TRABALHOS COMPLETOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSO FERRACINI, Cristiane Nunes ; MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MORAES, Flvio

Farias de ; MATIOLI, G. . STUDY OF THE FORMATION OF THE COMPLEX ALBENDAZOLE-BETA-CYCLODEXTRIN. In: Congress of Pharmaceutical Science - CIFARP, 2001, guas de Lindia. European Journal of Pharmaceutical Sciences. New York : Elsevier, 2001. v. 13. p. 139-140.

MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . IDENTIFICATION OF THE OBTAINED PHOTOPRODUCTS OF THE DEGRADATION OF THE NABUMETONE. In: Congress of Pharmaceutical Science, 2001, guas de Lindia. European Journal of Science Pharmaceutical Sciences. New York : Elsevier, 2001. v. 13. p. 57-57.

MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ESTABILIDADE DA NABUMETONA FRENTE LUZ: UM ESTUDO FSICO-QUMICO. In: XIV Semana de Integrao de farmcia, 2000, MARING. Livro de Resumos da XIV Semana de Integrao de Farmcia, 2000.

MORIWAKI, Cristiane ; MORAES, Flvio Farias de ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ESTUDO DA FORMAO DO COMPLEXO ALBENDAZOL-BETA-CU\ICLODEXTRINA. In: IX Encontro Estadual de farmacuticos e Bioqumicos e VII Congresso Catarinense de, 2000, Florianpolis. Caderno de Resumos do IX Encontro Estadual de farmac6euticos e Bioqumicos, 2000. v. 1. p. 19.

LUCENA, F. A. M.; REIS, A. V. BRESCANSIN, E. G. CARACTERIZAO E AVALIAO CINTICA PRELIMINAR DA NABUMETONA. Anais do IX Encontro Anual de Iniciao Cientfica, v. 2, p. 392 393, 2000.

MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . FOTLISE DO FRMACO NABUMETONE E IDENTIFICAO DE SEUS FOTOPRODUTOS. In: IV Jornada de Farmcia e Anlises Clnicas de Londrina, 2000. LONDRINA. Anais da IV Jornada de Farmaia e Anlises Clnicas de Londrina, v. 1. p. 8-8 2000.

MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE FOTOPRODUTOS OBTIDOS DA DEGRADAO DA NABUMETONA. In: IX ENCONTRO ANUAL DE INICIAO CIENTFICA, 2000, LONDRINA. Anais do IX Encontro Anual de Iniciao Cientfica, v. 1, p. 384-385, 2000.

BRESCANSIN, E. G.; HIOKA, N.; SANTIN FILHO, Ourides. EVALUATION OF THE STABILITY OF NABUMETONE TO LIGHT. In: 2nd Congress of Pharmaceutical Sciences, 1999, Ribeiro Preto. Bolletino Chimico Farmaceutico. Milano : Societ Editoriale Farmaceutica, v. 138. p. CLXII 1999.

MARTINS, S. S. M. ; BRESCANSIN, E. G. ; HIOKA, N.; SANTIN FILHO, Ourides . AVALIAO DAS PROPRIEDADES MECNICAS E ESPECTROSCPICAS DO COMPRIMIDO RELIFLEX E SEU PRINCPIO ATIVO (NABUMETONA). In: V Encontro de Qumica da Regio Sul, Porto Alegre - RS. Livro de Resumos, 1997. p. AQ18 1997.

PALESTRAS PROFERIDAS Lipossomas como Carreador de Frmacos, na disciplina: Pr-formulao e Tecnologia

Farmacutica do Programa de Ps-Graduao em Cincias farmacuticas, 2006

Prmios E Ttulos Professsora Homenageada pelos Formandos de Farmcia de 1999, Universidade Estadual de

Maring. Patronesse da Turma dos Formandos de Farmcia de 2001, Universidade Estadual de Maring.

xiii

RESUMO No presente trabalho, buscamos desenvolver formulao lipossomal sistmica de

nistatina (NYS) com o propsito de aplicaes futuras na teraputica de micoses

sistmicas, que tanto afligem indivduos imunodeprimidos. Na primeira parte do projeto

caracterizamos o frmaco atravs de anlises trmicas (TGA e DSC), anlises

espectroscpicas (IV, UV e fluorescncia), teste de solubilidade, avaliao da umidade

segundo o mtodo de Karl-Fischer e coeficiente de partio octanol/meio aquoso. Na

segunda parte do trabalho procuramos desenvolver e otimizar formulaes lipossomais,

onde o frmaco apresentasse maior estabilidade qumica. Foram preparadas

formulaes lipossomais pelo mtodo do filme lipdico que foram analisadas por HPLC.

As preparaes passaram por processo de diminuio de tamanho e separao entre

frmaco livre e encapsulado A terceira e ltima fase do projeto consistiu da

caracterizao de duas preparaes, atravs de anlises do raio hidrodinmico,

determinao da carga de superfcie das partculas (potencial zeta), teor de fosfolipdios

totais (teor de fosfato), eficincia e avaliao da encapsulao por anlises de HPLC,

anisotropia e supresso de fluorescncia. Ainda na fase de caracterizao investigamos

a atividade biolgica in vitro, destas formulaes, pelo teste de susceptibilidade. As

preparaes foram desafiadas contra leveduras e dermatfitos. Pela seleo e

otimizao das formulaes desenvolvidas conclumos que a melhor formulao foi a

que apresenta uma composio de 70 % de Epikuron 200 SH; 20 % de Colesterol; 10

% de Diestearoilfosfatidilglicerol, 1,3 % de 2,6 - bis (1,1-dimetil) 4 - metil fenol (BHT) e

7 % de NYS. Duas preparaes foram caracterizadas L1 (hidratada a 55 C) e L2

(hidratada a 60 C). Os resultados para anisotropia e supresso de fluorescncia

evidenciam a encapsulao do frmaco nas preparaes estudadas, tanto na bicamada

lipdica quanto na superfcie dos lipossomas. Verificamos tambm que L2 apresentou

menor polidisperdidade de seu raio hidrodinmico, maior carga de superfcie e maior

eficincia de encapsulao, evidenciando ser L2 a preparao, fsico-quimicamente,

mais estvel. Todavia, a preparao L1 mostrou, aps sonicao, atividade biolgica in

vitro maior que L2. Estes resultados podem refletir a possvel degradao do frmaco,

quando aquecido a 60 C.

xiv

Palavras-chaves: nistatina, antifngicos, lipossomas,

xv

ABSTRACT

This study was designed to develop liposomal formulations containing Nystatin (NYS), looking forward its future applications in systemic mycosis therapy, which often affect immunodepressed individuals. In the first part of the project, the drug was characterized by means of thermal analyses (TGA and DSC), IR, UV/V and fluorescence spectroscopies, solubility tests, humidity contents evaluation (Karl-Fischer method) and octanol-water partition coefficient. In the second part of the study, liposomal formulations were developed and optimized, in which the drug presented improved chemical stability. Liposomal formulations were prepared by the dry lipid film hydration method and were analyzed by HPLC. The vesicles were submitted to the processes of size reduction and separation of non encapsulated drug. The last part of the project consisted in the characterization of the two formulations by means of analysis of the is hydrodynamic radius; determination of the particles superficial charge (zeta-potential); total phospholipids content (phosphate); degree of NYS with encapsulation by HPLC; degree of anisotropy and fluorescence quenching of NYS. Still during the characterization phase, the in vitro biological activity of the formulations was investigated by means of susceptibility tests. The formulations were challenged against some yeasts and filamentous fungi. Conclusions pointed that the best formulation was the one which presented in its compositions 70% Epikuron 200 SH, 20% Cholesterol, 10 % Distearoyl-phosphatidylglycerol, 1.3 % 2,6 bis (1,1-dimethylethyl) 4 - methylphenol (BHT) and 7 % NYS. Two formulations were characterized: L1 (hydrates at 55 C) and L2 (hydrated at 60 C). Results regarding the degree of anisotropy and fluorescence quenching evidenced by NYS encapsulation at the liposomal lipid bilayers. Moreover, it was observed that L2 presented lower polydispersity in size distribution, higher superficial load and higher encapsulation effectiveness, i.e. L2 presented higher physico-chemical stability. Nevertheless the L1 preparation showed, after sonication, higher biological activity in vitro than L2, which might reflect possible thermal degradation of NYS when heated to 60 C. Key words: antifungal, nystatin, liposomes.

xvii

NDICE

ABREVIAES ........................................................................................... XXI

NDICE DE TABELAS ................................................................................. XXIII

NDICE DE FIGURAS .................................................................................. XXVII

1 INTRODUO ............................................................................................. 01

2 OBJETIVOS ................................................................................................. 11

3 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 15

3.1 Fungos ......................................................................................................... 17

3.2 Dimorfismo Fngico ................................................................................... 24

3.3 Infeces Fngicas .................................................................................... 25

3.4 Antibiticos Antifngicos Polinicos ....................................................... 29

3.5 Lipossomas ................................................................................................. 31

3.5.1 Aplicaes de lipossomas em medicina .................................................. 37

3.5.2 Lipossomas em doenas parasitrias e infecesfngicas .................. 40

3.5.3 Mtodos de Preparao de lipossomas ................................................... 41

3.5.3.1 Mtodo pelo filme lipdico ......................................................................... 41

3.5.3.2 Mtodo de injeo de Etanol ..................................................................... 43

3.6 Caracterizao de preparaes lipossomais ........................................... 44

3.6.1 Determinao do raio hidrodinmico de lipossomas ............................. 44

xviii

3.6.2 Determinao da carga de superfcie das partculas .............................. 45

3.6 3 Anlise por supresso de Fluorescncia ................................................. 45

3.6.4 Espectroscopia de polarizao de fluorescncia ................................... 46

4 MATERIAIS E MTODOS ........................................................................... 49

4.1 Materiais ...................................................................................................... 51

4.2 Mtodos ....................................................................................................... 52

4.2.1 Caracterizao fsico-qumica da NYS...................................................... 52

4.2.1.1 Avaliao da solubilidade .......................................................................... 53

4.2.1.2 Determinao do teor de umidade ............................................................ 53

4.2.1.3 Anlises espectroscpicas ....................................................................... 53

4.2.1.3.1 Anlise por espectroscopia de absoro na regio do UV/V ................. 53

4.2.1.3.2 Anlise por espectroscopia de fluorescncia ......................................... 54

4.2.1.3.3 Anlise por espectroscopia no Infravermelho (IV) .................................. 54

4.2.1.4 Anlises por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) e Termogravimetria (TGA).............................................................................

54

4.2.1.5 Determinao do coeficiente de partio octanol/tampo ..................... 55

4.2.2 Anlise da atividade antifngica in vitro da NYS..................................... 56

4.2.3 Desenvolvimento de formulaes lipossomais com NYS ...................... 57

4.2.4 Tratamentos efetuados em vesculas multilamelares para obteno

xix

de lipossomas unilamelares ...................................................................... 59

4.2.5 Caracterizao qumica e fsica de suspenses lipossomais ............... 60

4.2.5.1 Anlise por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)................ 60

4.2.5.2 Determinao do teor (%) de fosfato ........................................................ 61

4.2.5.3 Determinao do raio hidrodinmico ....................................................... 62

4.2.5.4 Determinao do potencial Zeta ............................................................... 62

4.2.5.5 Anlise do grau de anisotropia de fluorescncia da NYS livre e

encapsulada em lipossomas ....................................................................

62

4.2.5.6 Estudo da supresso de emisso de fluorescncia da NYS livre e em lipossomas...................................................................................................

63

4.2.5.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro de suspenses lipossomais .................................................................................................

64

5 RESULTADOS E DISCUSSES ................................................................. 67

5.1 Caracterizao fsico-qumica da NYS ..................................................... 69

5.1.1 Solubilidade ................................................................................................ 69

5.1.2 Anlise do teor de Umidade ...................................................................... 70

5.1.3 Caracterizao espectroscpica da NYS na regio do UV/V em Metanol ........................................................................................................

70

5.1.4 Anlise fluorimtrica da NYS .................................................................... 74

5.1.5 Anlise por espectroscopia na regio do Infravermelho (IV) ................. 75

xx

5.1.6 Anlise da NYS por DSC ............................................................................ 78

5.1.7 Anlise da NYS por TGA ............................................................................ 79

5.1.8 Determinao do coeficiente de partio octanol/tampo ..................... 80

5.2 Preparao das formulaes lipossomais ............................................... 81

5.3 Caracterizao fsico-qumica das suspenses lipossomais ................ 93

5.3.1 Raio hidrodinmico .................................................................................... 93

5.3.2 Potencial Zeta ............................................................................................. 95

5.3.3 Teor de fosfato ............................................................................................ 95

5.3.4 Eficincia de encapsulao ....................................................................... 96

5.3.5 Determinao do grau de anisotropia de fluorescncia ......................... 98

5.3.6 Estudo da interao da NYS em lipossomas ........................................... 101

5.3.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro da NYS e NYS lipossomal . 110

5.3.8 Concluses sobre as preparaes lipossomais selecionadas ............. 116

6 CONCLUSES GERAIS ............................................................................. 119

7 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................... 123

8 REFERNCIAS BIBIOGRFICAS .............................................................. 127

xxi

ABREVIAES

AnfB: Anfotericina B ASD: meio de cultura Agar Saboraud Dextrose BHT: 2,6 bis (1,1-dimetil)-4-metil fenol CLAE: Cromatografia Lquida de Alta eficincia DMPC: 1,2-Di-meristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DMPG: 1,2-Di-meristoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol DPPC: 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DSC: Calorimetria Exploratria Diferencial DSPC: 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DSPG: 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol DTG: Termogravimetria Diferencial ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FDA: Food and Drug Administration" GUV: vesculas gigantes unilamelares HEPES: N-[2-hidroxietil] piperazina-N-[2-cido tanosulfnico] IgG: Imunoglobulina G IgM: Imunoglobulina M IV: Infravermelho LUV: vesculas unilamelares grandes MIC: Concentrao Inibitria Mnima microDSC: MicroCalorimetria Exploratria Diferencial MLV: vesculas multilamelares MVV: vesculas multivesiculares NYS: Nistatina OLV: vesculas oligolamelares PCH: fosfatidilcolina de soja hidrogenada QELS: Espalhamento Quase-Elstico de Luz

xxii

RMN: Ressonncia Magntica Nuclear RPMI: meio de cultura Roswell Park Memorial Institute SUV: vesculas unilamelares pequenas Tc: temperatura de transio de fases TGA: Anlise Termo-Gravimtrica UV/Vis.: Ultravioleta/Visvel v:v : razo volume:volume max: comprimento de onda mximo

xxiii

NDICE DE TABELAS Tabela 1 Classificao de lipossomas, baseada em parmetros estruturais . .. 34

Tabela 2 Solubilidade da NYS em diferentes solventes. As concentraes as solues de NYS com os solventes testados foram de 1,94 mol.L-1 ...................................................................................................................

69

Tabela 3 Dados de regresso linear da curva de calibrao ( Mx 292 nm) .... 72 Tabela 4 Dados de regresso linear da curva de calibrao ( Mx 304 nm) ..... 73 Tabela 5 Dados de regresso linear da curva de calibrao ( Mx 320 nm) .... 73 Tabela 6 Freqncias de absoro caractersticas das vibraes de ligao

da NYS Medley e Cristlia ...................................................................... 76

Tabela 7 Coeficientes de partio da NYS em n-octanol/tampo succinato (0,02 mol L-1; pH 5,6) isotnico a 25 e 37 C .........................................

81

Tabela 8 Teores % de NYS recuperada nas formulaes lipossomais, contendo 10 % de NYS em relao concentrao molar de PCH, hidratadas com Hepes (0,01 mol.L-1; pH 7,4) ou tampo succinato (0,02 mol.L-1, pH 5,6) , isotnicos, a 55 e 65 C ...................................................................................................................

82

Tabela 9 Teores obtidos de NYS recuperada na formulao 80 % PCH e 20% de Colesterol, hidratada com os tampes Hepes (0,01 mol L-1; pH 7,4) ou tampo succinato (0,02 mol.L-1, pH 5,6), isotnicos, 55 e 65 C ..........................................................................................................

84

Tabela 10 Teores de NYS recuperada nas formulaes lipossomais (Etapa 2), compostas de lipdios PCH, colesterol e DSPG, contendo NYS (NYS/lipdio 7 %), hidratadas com tampo succinato (0,02 mol.L-1) , isotnico, a 55 C ....................................................................................

87

Tabela 11 Teores obtidos de NYS recuperada nas formulaes: 80 % PCH e 20 % de Colesterol e 70 % PCH e 30 % de DSPG, quando as formulaes so hidratadas com tampo succinato (0,02 mol L-1); pH 5,6 isotnico. As preparaes foram hidratadas a 55 C e foram variadas as concentraes de lipdios de 10 a 15 mM. A relao frmaco/lipdio de 7 para 10 % .....................................................................................................................

88

xxiv

Tabela 12 Teores de NYS nas formulaes lipossomais compostas PCH, colesterol e DSPG, BHT e NYS em uma relao frmaco/lipdio de 7 %, hidratadas com tampo succinato (0,02 mol.L-1) isotnico, a 60 C ................................................................................................................

89

Tabela 13 Teores de NYS recuperada na formulao lipossomal composta de PCH, colesterol, DSPG, BHT e NYS numa relao frmaco/lipdio de 6,5 %; hidratada com tampo succinato (0,02 mol L-1 ), isotnico, a 55 e 60 C, modo de hidratao AU e AE ....................................................................................................................

92

Tabela 14 Teores de encapsulao de NYS em preparaes lipossomais L1 e L2 .............................................................................................................

97

Tabela 15 Grau de anisotropia de fluorescncia (r) da NYS livre e encapsulada em lipossomas em tampo succinato (0,02 mol L-1), isotnico, pH 5,6 a 25 C ................................................................................................

98

Tabela 16 Variao da fluorescncia da NYS em concentraes e temperaturas diferentes, na ausncia e presena de lipossomas, em tampo succinato (0,02 mol L-1), isotnico, pH 5,6 .....................................................................................................................

100

Tabela 17 Valores de 1/fa obtidos para a NYS encapsulada em lipossomas (L1 e L2), usando como os supressores iodeto de potssio e Acrilamida .....................................................................................................................

110

Tabela 18 Resultados do teste de susceptibilidade in vitro (MIC(M/ml)) para as NYSs 1 e 2 em leveduras do gnero Candida, das espcies krusei, albicans, parapsilosis e do gnero Cryptococcus, espcie neoforman .................................................................................................

111

Tabela 19 MIC(M/ml) para as amostras de NYS 1 e 2 em fungos dos gneros Trichophyton (espcies rubrum, mentagrophytes e espcie indefinida (spp.); Fusarium spp. e Aspergillus fumigatus .................................................................................................................

112

Tabela 20 MIC(M/ml) e CFM (M/ml) para a NYS livre, NYS 1 e NYSs L1A (hidratadas a 55 C) e L2A (hidratadas a 60 C), em leveduras dos gneros Candida e Cryptococcus .......................................................

113

Tabela 21 MIC(M/ml) e CFM (M/ml) para dois lotes de NYS livre (NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1 e L2, empregando as espcies albicans e krusei ..................................................................................................................

115

xxv

Tabela 22 MIC e CFM para dois lotes de NYS livre (NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1 e L2, empregando os gneros Candida (parapsilosis) e Cryptococcus (neoformans) .........................................................................................

116

xxvii

NDICE DE FIGURAS Figura 1 Estruturas moleculares de NYSS A1, A2 e A3 ................................. 04 Figura 2 Direcionamento da encapsulao de frmacos em lipossoma

multilamelar (MLV): molculas hidrossolveis, lipossolveis e anfipticas .........................................................................................

07

Figura 3 Ilustraes de hifas septadas mononucleadas, multinucleadas e no septadas, presentes em de fungos filamentosos ...................

18

Figura 4 Ilustrao de hifa com esporo assexuado do tipo clamidsporo de fungos filamentosos ....................................................................

20

Figura 5 Ilustrao de esporo assexuado do tipo artrsporo de fungo do gnero Geotrichum ...........................................................................

20

Figura 6 Ilustrao de esporo assexuado do tipo blastsporo ................... 21 Figura 7 Ilustrao de esporo assexuado do tipo esporangisporo .......... 21 Figura 8 A Cultura, em Agar, de Aspergillus fumigatus (imagem

esquerda) e Condios de Aspergillus fumigatus (imagem central e direita). B Ilustrao de Condios de Aspergillus agrupados em forma de cabea, ao redor de uma vescula ..............................................

22

Figura 9 Ilustrao de Condios de Peniccilium agrupados em forma de pincel ..................................................................................................

23

Figura 10 Fotos de Candida albicans crescendo na forma filamentosa ( esquerda) e na forma de levedura (no centro e direita) .............

24

Figura 11 Caractersticas dos diferentes gneros de fungos filamentosos e septados, principais causadores de dermatomicoses ...............

27

Figura 12 Onicomicose por Trichophyton rubrum .......................................... 27 Figura 13 Representao esquemtica de poro formado pela NYS em uma

membrana celular .............................................................................. 30

Figura 14 Frmulas estruturais moleculares dos fosfolipdios 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DSPC), 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC), 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-

xxviii

3-fosfatidilglicerol (DSPG) e do lipdio Colesterol ........................ 32 Figura 15 Grupos cabea de fosfolipdios encontrados em membranas

biolgicas ........................................................................................... 33

Figura 16 Seco transversal (A) de um lipossoma e (B) de uma bicamada lipdica ................................................................................................

34

Figura 17 Transio das fases gel e lquida cristalina da bicamada lipdica de fosfolipdio (A). Diferentes configuraes (trans e gauche) causadas pela rotao de ligao simples C-C das cadeias acila dos fosfolipdios (B) ..........................................................................

36

Figura 18 Possveis mecanismos de interao dos lipossomas com clulas ................................................................................................

38

Figura 19 Esquema do mtodo de preparo de lipossomas por filme lipdico ................................................................................................

42

Figura 20 Representao Esquemtica da hidratao e o preparo de diferentes tipos de lipossomas ........................................................

43

Figura 21 Espectros de absoro, da NYS Medley, na regio do UV/V em MeOH, 25C (2,6; 3,9; 5,3; 6,6; 7,9; 9,2x10-6; 1,0x10-5 mol.L-1) ......

71

Figura 22 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (mx 292 nm) .............................................................................................................

71

Figura 23 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (mx 304nm) .............................................................................................................

72

Figura 24 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (mx 320nm) .............................................................................................................

73

Figura 25 Espectros de fluorescncia de NYS Medley em MeOH (1,05x10-5; 9,2; 7,9; 6,6; 5,3; 3,9; 2,6x10-6 mol.L-1) e de metanol puro ..............

74

Figura 26 Espectros no IV das amostras de NYS Medley (azul) e Cristlia (preto) .................................................................................................

75

Figura 27 Espectros no IV da NYS dos diferentes tipos de cristalizao da NYS A, B e C ......................................................................................

77

Figura 28 Curvas de aquecimento obtidas por DSC para as amostras de NYS Medley (A); Cristlia (B) ...........................................................

78

xxix

Figura 29 Curvas de aquecimento obtidas por TGA da NYS Lotes: NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia. Massas: 3,7mg (Medley) e 3,5mg (Cristlia) .................................................................................

79

Figura 30 Curvas de DTG da NYS Lotes: NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia. Massas: 3,7 mg (Medley) e 3,5 mg (Cristlia) ............................................................................................

80

Figura 31 Estruturas moleculares das formas isomricas interconvertveis do antibitico NYS. A - maior atividade biologica. B - menor atividade biolgica ............................................................................

83

Figura 32 Cromatogramas das duas formulaes (Etapa 1). (A) 80% de PC

e 20% de colesterol e teor de 98,1 0,4% de NYS e (B) 100% de PCH e teor de 90,8 0,1 % de NYS ..................................................

85

Figura 33 Cromatogramas das formulaes com 80 % de PCH e 20 % de Colesterol (Etapa 1). (A): tampo succinato (0,02 mol.L-1), pH 5,6

e 55 C; (B): tampo succinato (0,02 mol.L-1), pH 5,6 e 65 C; (C): tampo Hepes (0,01 mol.L-1), pH 7,4 e 55 C; (D): tampo Hepes (0,01 mol.L-1), pH 7,4 e 65 C .............................................................

86

Figura 34 Cromatogramas das formulaes P1 (PCH 54 %, colesterol 26 % e DSPG 20 %) (A), P2 (PCH 80 %, colesterol 20 %) (B), P3 (PCH 70 %, colesterol 20 % e DSPG 10 %) (C) e P4 (PCH 70 % e DSPG 30 %) (D), respectivamente em tampo succinato (0,02 mol.L-1),

pH 5,6 e 60 C .....................................................................................

91

Figura 35 Distribuio multimodal de tamanho. (A) Preparao lipossomal L1; (B) Preparao lipossomal L2 ....................................................

94

Figura 36 Cromatogramas da NYS presente em formulao lipossomal MLV (L2) sem ultracentrifugar (A) e ultracentrifugada (B). Suspenso em tampo succinato (0,02 mol.L-1); pH 5,6; isotnico. O Pico com tempo de reteno prximo a 3 min o pico do solvente e em cerca de 10 min o da NYS ............................................................................................................

96

Figura 37 Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da

xxx

NYS (C = 9,9 M) nos lipossomas L1 (hidratado a 55 C) e L2 (hidratado a 60 C) aps a adio sucessiva dos agentes supressores iodeto de potssio (A e B) e acrilamida (C e D), a

25 C. As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 ................................................................................................

103

Figura 38 Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) livre em tampo succinato aps a adio sucessiva dos agentes supressores iodeto de potssio (A) e

acrilamida (B) a 25 C. As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 .............................................................

104

Figura 39 Grficos de Stern-Volmer relativos ao estudo da supresso de fluorescncia no estado fixo da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 ..................................................................................

105

Figura 40 Grficos da equao de Stern-Volmer modicada (equao 5) empregada para supresso de fluorescncia combinada dinmica e esttica, no estado fixo, da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 ..................................................................................

107

Figura 41 Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6) para as fraes de acessibilidade ao supressor no estudo da supresso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). ). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 .............................................................................

108

xxxi

Figura 42 Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6) para os estudos da supresso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas, com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 .......................................

109

_____________________________________________________________________Introduo

1

1.INTRODUO

_____________________________________________________________________Introduo

2

_____________________________________________________________________Introduo

3

Durante muitos anos a teraputica de micoses especialmente de micoses profundas, encontrava dificuldades devido ao fato dos fungos serem clulas

eucariticas que parasitam hospedeiros com clulas da mesma natureza. Assim, as

diferenas citolgicas entre o parasito e o hospedeiro so pequenas e os frmacos que

interferem no metabolismo daqueles habitualmente agem no metabolismo dos ltimos

(TAVARES, 1984).

A Nistatina (NYS) (C47H75NO17) ou fungicidina (massa molar 926,13 g/mol) um antibitico extrado principalmente de culturas de Streptomyces Nursei. Este composto

foi isolado em 1950 por Hazen e Brown da diviso de laboratrios e pesquisa do

departamento de sade do Estado de Nova York, Estados Unidos da Amrica

(MICHEL, 1972). Apresenta em sua estrutura uma lactona macrocclica (Figura 1),

consistindo de dieno tetraeno hidroxilado ligado a um ou dois grupamentos amino

acar. Devido presena de grupos carboxil e amino, a NYS anfotrica e tambm

anfiflica, pois possui uma estremidade polar e outra apolar em sua molcula (Figura 1).

A NYS pouco solvel na gua e solventes orgnicos, mas solvel em

dimetilformamida e dimetilsulfxido.

A NYS comercial representa uma mistura de compostos intimamente

relacionados. Segundo POROWSKA e col. (1972) que caracterizaram amostras de NYS

comercial, o frmaco na verdade um complexo contendo trs constituintes

biologicamente ativos, designados como NYS A1, A2 e A3 (MICHEL, 1972 &

POROWSKA e col., 1972). O principal componente do complexo o componente A1,

que apresenta em sua estrutura um amino acar, a D - micosamina ligada ao oxignio

do carbono 19 (RICKARDS & CHONG, 1970; MANWARING & RICKARDS, 1969;

BOROWSKI e col., 1971). A NYS A2 (figura 1) mostra uma estrutura muito semelhante

a A1. As diferenas esto na aglicona do antibitico, nas variaes na estereoqumica

dos grupamentos hidroxilas que carecem de uma hidroxila no carbono 10 do macrociclo

e na posio da carboxila o carbono 15. J o componente A3 possui mudanas na

estereoqumica dos grupos hidroxilas e tem um outro radical acar, a L-digitoxose,

ligada ao carbono 35 (ZIELINSKY e col., 1979; ZIELINSKY e col., 1987) (Figura1).

_____________________________________________________________________Introduo

4

Todavia A3 tem o mesmo amino acar presente nos outros dois componentes. Os

compostos A1 e A2 foram identificados por SHENIN e col., (1993) que analisaram

amostras de NYS grau farmacutico. Todavia, a designao da estrutura do

componente A2 do complexo NYS foi realizada por PAWLAK e col., (2005). A

complexidade da composio do composto NYS devida a sua obteno atravs de

processo fermentativo, onde os trs componentes so produzidos.

Nistatina A1

Nistatina A2

Nistatina A3

Figura 1. Estruturas moleculares de NYSS A1, A2 e A3 (Borowski e col., 1971; Zielinsky e col., 1987; Pawlak e col., 2005).

_____________________________________________________________________Introduo

5

A NYS membro de um grupo relativamente grande de compostos

estruturalmente relacionados, altamente insaturados, chamados antibiticos

antifngicos polinicos. Entre os quimioterpicos antifngicos, os antibiticos so muito

eficazes na teraputica de micoses profundas. Essa classe de compostos altera a

permeabilidade da membrana de clulas sensveis, como as clulas fngicas. A NYS

ativa frente a diversas espcies de fungos dos gneros Candida, Cryptococcus,

Aspergillus, Histoplasma, Blastomyces y Coccidioides. Contudo, os polinicos no tm

ao em clulas de protozorios, bactrias, exceto para Acholeplasma crescido na

presena de esterol, assim como contra algas azul-verdes (GALE e col., 1972).

Na prtica clnica, a NYS utilizada no tratamento da candidases superficiais de

pele e mucosas (esofgica, intestinal e vaginal). O antibitico praticamente no

absorvido por via oral, entretanto devido a sua ao superficial local, administrado

oralmente em casos de candidase bucal e intestinal (WASAN e col., 1996). Contra a

candidase vaginal empregada sob a forma de vulos e na cutnea e periungueal sob

a forma de cremes, pomadas e loes (TAVARES, 1984). Quando administrada por via

intramuscular e intravenosa muito txica, sendo capaz de causar hemlise, necrose e

abscessos frios nos locais de injeo. Isto se deve imediata ligao do frmaco aos

esteris das membranas das hemcias e clulas tissulares, causando sua destruio

(HIEMENZ & WALSH, 1996).

A NYS tem estrutura molecular similar da Anfotericina B (AnfB) mas, em alguns

casos, mostra um espectro de ao antifngica in vitro mais amplo do que esta ltima,

pois atua em fungos AnfB resistentes (GROLL e col., 1999). Entretanto, a NYS e a AnfB

apresentam problemas de pouca solubilidade em gua e de grande toxicidade para os

pacientes, quando administradas intravenosamente, como nefrotoxicidade,

tromboflebite, febre, calafrios e nuseas. Em funo disso, tem-se evitado a aplicao

parenteral da NYS (MORIBE & MARUYAMA, 2002; MORIBE & MARUYAMA, 2000).

Desde que a NYS mostra propriedades farmacolgicas diferentes daquelas da AnfB, ou

seja, maior ao sobre leveduras e alguns casos tem um espectro de ao maior do

que a AnfB, desejvel o desenvolvimento de formulao para a administrao

_____________________________________________________________________Introduo

6

intravenosa da NYS, j que se dispe no mercado farmacutico uma preparao

lipossomal de AnfB, comercializada sob o nome AMBISOME (marca registrada da

NeXstar Pharmaceuticals, Inc.) e distribuda no Brasil pela empresa United Medical.

A cincia e tecnologia envolvida na obteno de novos frmacos, sejam os

mesmos, sintticos ou de fontes naturais, tiveram grande desenvolvimento nas dcadas

de 40 e 50 e continuam, de forma desacelerada, a evoluir. A partir da dcada de 80,

molculas com efeitos teraputicos, tm sido enriquecidas por produtos obtidos pela

aplicao de processos biotecnolgicos, que utilizam princpios da engenharia gentica,

tais como fermentaes com microrganismos geneticamente modificados e cultura de

clulas de mamferos (GOMES & REIS, 2001). Mais recentemente no cenrio mundial,

tm-se observado que companhias farmacuticas pioneiras tm deixado de

comercializar novos frmacos sintticos para produzir produtos genricos, conforme

tem expirado suas patentes (http://www.sbqrio.sbq.org.br/download/set1801.pdf). Este

cenrio cria a necessidade de apresentar frmacos clssicos sob novas formas, que

podem ser novos sistemas de entrega (TYLE, 1988). Outra questo, que o

desenvolvimento de novos frmacos est relacionado aos altos custos, principalmente

em rotas sintticas e ainda se observa que pouca inovao ocorreu em relao ao

surgimento de novas formas farmacuticas mais eficientes na entrega do frmaco aos

stios de ao, registrando-se efeitos colaterais indesejveis e danos ao organismo do

paciente. Vrios frmacos empregados na teraputica, devido ao alto grau de

toxicidade, exigem que a quantidade a ser administrada seja a menor possvel, para

no causar danos aos tecidos sadios e, ao mesmo tempo, seja suficiente para atingir as

clulas alvo, aps ser absorvido e distribudo no organismo.

Teoricamente, um dos objetivos bsicos da qumica teraputica entregar a

substncia medicinal especfica e eficientemente ao local da doena ou distrbio. Em

geral isto pode ser conseguido pela administrao do frmaco por via oral (em forma de

cpsulas, comprimidos, suspenses, solues, entre outras.), nasal, transdrmica

(tpica), intramuscular, endovenosa, subcutnea, entre outras. Em muitos casos,

entretanto, a eficcia do frmaco pode ser melhorada, e os efeitos colaterais reduzidos,

_____________________________________________________________________Introduo

7

encapsulando-o em algum tipo de transportador. Idealmente, este dever vetorizar o

frmaco em concentrao adequada e apenas no local onde o mesmo necessrio,

evitando a sua perda, degradao e a ocorrncia de efeitos colaterais indesejveis

(PRISTA e col., 1996).

Os lipossomas so vesculas lipdicas, onde uma fase aquosa totalmente

cercada por uma ou mais lamelas (bicamadas de fosfolipdios), constituindo, ao lado de

aerossis, hidrogis, micro/nanopartculas polimricas, "patches" um dos sistemas mais

importantes para encapsulao e liberao sustentada de frmacos in vivo. Eles podem

encapsular ingredientes hidroflicos, hidrofbicos ou anfiflicos. Drogas hidroflicas tm

tendncia a permanecer no compartimento central aquoso e drogas

hidrofbicas/anfiflicas encontram-se inseridas na bicamada lipdica (Figura 2). As

drogas lipoflicas permanecem mais tempo encapsuladas devido ao alto

particionamento na fase membranar (SHARATA, 1996).

Figura 2. Direcionamento da encapsulao de frmacos em lipossoma multilamelar (MLV): molculas hidrossolveis, lipossolveis e anfipticas.(Arajo e col,2003).

Os sistemas lipossomais tm sido testados com sucesso como transportadores

_____________________________________________________________________Introduo

8

de diversos frmacos, material gentico e enzimas para o interior de clulas. So

atxicos, pouco imunognicos, biodegradveis e capazes de proteger os compostos

encapsulados da diluio e degradao no sangue, de forma que quando alcanam os

tecidos que necessitam de tratamento podem liberar doses concentradas de frmaco

aumentando sua ao teraputica. Entretanto, ao circularem na corrente sangunea, os

lipossomas funcionam como corpos estranhos, sendo rapidamente atacados pelos

macrfagos que, assim, passam a transportar os frmacos veiculados nos lipossomas.

Compostos antimicrobianos lipossomados podem penetrar em clulas do sistema

mononuclear fagocitrio onde microrganismos patognicos residem, causando a morte

do agente microbiano (PRISTA e Col., 1996 & LASIC, 1993). O tamanho dos

lipossomas determina o grau de reconhecimento pelo Sistema Mononuclear Fagocitrio

(SMF) e determina a velocidade de retirada dos mesmos da circulao sangunea.

Para uso humano, os sistemas lipossomais tm sido empregados para reduzir a

toxicidade clnica sistmica de frmacos aumentando, assim, a eficcia teraputica de

agentes antimicrobianos, antineoplsicos e outros (TORCHILIN, 2005). OFFNER e col., (2004) avaliaram a atividade e segurana da nistatina lipossomal, numa dose de 4

mg/kg, em pacientes com aspergilose invasiva refratria ou intolerante a AnfB, estes

pesquisadores verificaram que a NYS lipossomal foi efetiva contra a aspergilose

invasiva, todavia alguns efeitos adversos observados para a AnfB, tambm foram para

a NYS lipossomal, como: tremores calafrios, febre, hipo ou hipertenso e taquicardia .

Outros autores, tambm comprovaram que a NYS incorporada em lipossomas, nas

doses de 2 a 6 mg/kg, demonstrou significante reduo da toxicidade enquanto que a

atividade antifngica foi preservada (CARRILLO-MUNOZ e col., 1999; GROLL e col.,

1999; JOHNSON e col., 1998; MEHTA e col., 1987; OAKLEY e col., 1999). A utilidade

de formulaes lipossomais em clnica mdica comprovada pela aprovao da

agncia controladora norte-americana, "Food and Drug Administration" (FDA), de

formulaes lipossomais para entrega de algumas substncias com atividade

antineoplsica (DOXIL com doxorrubicina e DAUNOSOME com daunorrubicina) e

antifngica (AMBISOME com Anfotericina B), j comercializadas em vrias partes do

mundo.

_____________________________________________________________________Introduo

9

Uma formulao lipossomal de NYS (NYOTRAN) foi preparada pela Aronex

Pharmaceuticals, com boa atividade em ratos. A referida formulao j se encontra em

aplicao clnica e para obteno da nistatina lipossomal os autores utilizaram os

lipdios Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e Dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) em

uma razo mssica de 7:3. A formulao apresenta tamanho de partculas que variam

de 0,1 a 3 M porm as propriedades fsicas da formulao ainda no esto bem compreendidas (MEHTA e col., 1987, TORCHILIN, 2005). Sendo assim, plenamente

justificado um trabalho no sentido de preparar e caracterizar formulaes lipossomais

contendo NYS.

Os sistemas lipossomais podem ser estudados em relao a fatores como

eficincia de encapsulao, tamanho, teor de fosfolipdios na formulao, entre outros.

Na caracterizao desses sistemas podem ser utilizadas vrias tcnicas analticas

como espectroscopia (de absoro UV/Vis, de emisso, IV e RMN), espalhamento de

luz, calorimetria diferencial de varredura (DSC), Cromatografia Lquida de Alta

Eficincia (CLAE). preciso, tambm, avaliar a atividade dos lipossomas em sistemas

biolgicos in vitro e in vivo.

_____________________________________________________________________Introduo

10

______________________________________________________________________Objetivos

11

2.OBJETIVOS

______________________________________________________________________Objetivos

12

______________________________________________________________________Objetivos

13

Os objetivos deste trabalho foram:

1) desenvolver e otimizar formulaes lipossomais contendo o frmaco NYS;

2) selecionar formulaes em que o frmaco apresentasse maior estabilidade

qumica;

3) caracterizar as formulaes lipossomais de NYS fsico-quimicamente;

4) testar a atividade in vitro das formulaes lipossomais contendo NYS.

______________________________________________________________________Objetivos

14

____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica

15

3.REVISO BIBLIOGRFICA


16


17

3.1.Fungos

Fungos (do latim fungus = cogumelo) so seres eucariticos, com um s ncleo,

como as leveduras, ou multinucleados, como os fungos filamentosos ou bolores. As

clulas de fungos podem apresentar uma membrana citoplasmtica, que mais

externamente, apresentam uma parede celular que reveste o citoplasma e organelas

dispersas. So tambm revestidas por membranas semelhantes o retculo

endoplasmtico, aparelho de Golgi, ribossomos, mitocndrias, vacolos, ncleo e

nuclolo. As membranas celulares fngicas contm esteris, assemelhando-se s

membranas de organismos superiores, como as dos mamferos. As clulas fngicas

possuem vida independente e no se organizam em tecidos e os componentes

principais da parede celular so hexoses e hexosaminas. Alguns fungos apresentam

parede rica em quitina (N-acetil glicosamina). Outros possuem complexos de

polissacardeos e protenas, com predominncia de cistena. Fungos do gnero

Cryptococcus, como o Cryptococcus neoformans, apresentam cpsula de natureza

polissacardica que envolve a parede celular (TORTORA e col., 1993).

Os fungos constituem um grupo de organismos que no possuem clorofila e so

ditos hetertrofos por absoro, pois suas hifas, no caso de fungos filamentosos

(filamentos tubulares), crescem penetrando os substratos orgnicos e neles lanando

suas enzimas digestivas. Os produtos finais solveis, resultantes da digesto, so lenta

e continuamente absorvidos. A gua utilizada na solubilizao das enzimas e

indispensvel na ao das mesmas. Desta forma, justifica-se o bom desenvolvimento

dos fungos em ambientes midos (PELCZAR e col., 1996). Para seu desenvolvimento,

esses organismos exigem sempre uma fonte de carbono, que ser utilizada como

material energtico. Necessitam ainda de fontes de nitrognio, que podem ser

inorgnica (NO3- e NH4+) ou orgnica (aminocidos, polipeptdeos e protenas). s

vezes, certas substncias como aminocidos, podem funcionar como fontes de carbono

e nitrognio. Os fungos podem ser saprobiticos (ou saprfitas) e parasitas (facultativos

ou obrigatrios), conforme vivam de fontes de alimentos existentes livres ou em

hospedeiros (PELCZAR e col., 1980).


18

Dependendo da forma como os fungos se desenvolvem em meios de cultura,

pode-se classific-los em leveduriforme e filamentosos. As colnias leveduriformes so

pastosas ou cremosas, formadas por microrganismos unicelulares ovais ou esfricos,

geralmente com largura de 1 a 5 m e comprimento de 5 a 30 m, chamados

leveduras. Esses microrganismos cumprem funes vegetativas (de crescimento) e

reprodutivas. As colnias filamentosas podem ser algodonosas, aveludadas ou

pulverulentas; so constitudas fundamentalmente por elementos multicelulares em

forma de tubo, as hifas (do grego hyphe= teia). Essas estruturas so filamentos

tubulares ramificados com cerca de 2 a 10 m de largura, podendo ser contnuas ou

septadas. As no-septadas, tambm denominadas cenocticas, so multinucleadas. J

as septadas podem ser: mono e multinucleadas (Fig. 3). As hifas septadas tm um

septo que divide os filamentos em clulas distintas. Entre essas clulas ocorre migrao

do citoplasma e ncleos por poros existentes em cada septo (TORTORA e col., 1993,

PELCZAR e col, 1980).

Figura 3. Ilustraes de hifas septadas mononucleadas, multinucleadas e no septadas multicleadas, presentes em de fungos filamentosos (Pelczar e col., 1980).

As hifas crescem pelo alongamento de suas pontas (crescimento apical) e pela


19

produo de ramificaes laterais. Em geral, as hifas formam um conjunto de estruturas

tubulares microscpicas, junto ao substrato (fonte de alimento), chamada de miclio

vegetativo (ALEXOPOULOS e col., 1996). J outras hifas, relacionadas reproduo,

correspondem ao miclio reprodutivo ou areo. O miclio areo se projeta na superfcie

e cresce acima do meio de cultura. Quando o miclio areo se diferencia por apresentar

clulas reprodutivas ou esporos (propgulos), constitui o miclio reprodutivo. Este

cresce em contato com o ar e dissemina os esporos produzidos. Outras hifas podem

organizar-se em estruturas grandes para formar fungos corpulentos, como cogumelos,

por exemplo: bufa-de-lobo e orelha-de-pau (TORTORA e col., 1993; PELCZAR e col.,

1996).

A reproduo ocorre por formao de esporos. Os esporos so classificados,

segundo sua origem, em sexuados e assexuados. Embora o miclio vegetativo no

tenha especificamente funes de reproduo, alguns fragmentos de hifa podem se

desprender do miclio vegetativo e cumprir funes de propagao, uma vez que as

clulas fngicas so autnomas. Os esporos assexuais so produzidos por um fungo

individual atravs de mitose e consecutiva diviso celular. Entre os esporos assexuados

podem ser citados os clamidsporos, artrsporos, blastsporos, esporangisporos e

conidisporos (PELCZAR e col., 1980).

Os clamidsporos (Fig. 4) tm funo de resistncia, semelhante dos esporos

bacterianos. So clulas, geralmente arredondadas, de volume aumentado, com

paredes duplas e espessas que limitam o citoplasma. Sua localizao no miclio pode

ser apical (terminal) ou intercalar. Esses esporos se formam em condies ambientais

adversas, como escassez de nutrientes, de gua e temperaturas no favorveis ao

desenvolvimento fngico. Um fungo que produz clamidsporo a Candida albicans

(TORTORA e col., 1993).


20

Figura 4. Ilustrao de hifa com esporo assexuado do tipo clamidsporo de fungos filamentosos ( Pelczar e col., 1980).

Os artrsporos (Fig. 5) so formados por fragmentao das hifas septadas em

segmentos retangulares. So encontrados nos fungos do gnero Geotrichum,

Coccidioides immitis e em dermatfitos (TORTORA e col., 1993).

Figura 5. Ilustrao de esporo assexuado do tipo artrsporo de fungo do gnero Geotrichum (SwateK, 1967).

Os blastsporos, tambm denominados gmulas, so comuns nas leveduras e

se derivam por brotamento da clula-me. Em alguns casos, os blastsporos

permanecem ligados clula-me, formando cadeias, as pseudo-hifas, cujo conjunto

o pseudomiclio, como se pode visualizar na Fig. 6 (TORTORA e col., 1993).


21

Figura 6. Ilustrao de esporo assexuado do tipo blastsporo (Alexopoulos e col., 1996). Os esporangisporos (Fig. 7) so formados no interior de uma espcie de saco

(esporngio), situado ao final de hifas areas denominadas esporangiforo. A liberao

dos esporos se realiza pela clivagem do citoplasma dos esporngios. Esse tipo de

esporo produzido pelo gnero Rhizopus (TORTORA e col., 1993).

Figura 7. Ilustrao de esporo assexuado do tipo esporangisporo (Pelczar e col., 1980). Um quinto tipo de esporo assexual o conidisporo ou condios. Os

conidisporos se formam em cadeias ao final dos conidiforos, que nada mais so do


22

que ramificaes das hifas. Dependendo de suas caractersticas morfolgicas, podem

ser classificados em micro e macrocondios (PELCZAR e col., 1980). Na Fig. 8A

visualizamos-se os condios agrupados do gnero Aspergillus e na 8B os condios de

Aspergillus fumigatus

A

B

Figura 8: Cultura, em gar, de Aspergillus fumigatus (imagem esquerda) e Condios de Aspergillus fumigatus (imagem central e direita) (A). Ilustrao de Condios de Aspergillus agrupados em forma de cabea, ao redor de uma vescula (B) (http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm e Alexopoulos e col., 1996).

No aparelho de conidiao ou produtor de condios (esporos) do gnero

Aspergillus, os condios formam cadeias sobre filides, estruturas no formato de

garrafa, em torno de uma vescula que uma dilatao na extremidade do conidiforo


23

(Fig. 8).

Outros gneros, como o Penicillium, apresentam um aparelho de conidiao

onde os conidiforos se ramificam e no se verifica a presena de vescula. Como no

caso do gnero Aspergillus, os condios formam cadeias que se distribuem sobre as

filides (Fig. 9).

Figura 9. Ilustrao de Condios de Penicillum agrupados em forma de pincel(Alexopoulos e col., 1996) Os esporos sexuados fngicos so os resultados do processo de reproduo sexual meitico, que compreende as fases: 1) um ncleo haplide (metade dos

cromossomos da espcie) de uma clula doadora (macho) penetra no citoplasma de

uma clula receptora (fmea); 2) os ncleos macho e fmea se fundem para formar um

ncleo diplide; 3) atravs de meiose, o ncleo diplide d surgimento a quatro ncleos

haplides (PELCZAR e col., 1980). ALEXOPOULOS e col., (1996) postularam que a

reproduo sexual em muitos fungos envolve a formao de esporos especializados.

Os quatro tipos que tm sido observados so osporos, zigsporo, ascsporo e

basidisporo.

Os fungos produzem esporos sexuais com menos freqncia que os assexuais e

s se reproduzem por processo sexual em determinadas condies, como em casos de

variaes de umidade, temperatura e disponibilidade de nutrientes (PELCZAR e col.,


24

1980).

3.2.Dimorfismo fngico Alguns fungos e especialmente alguns patognicos apresentam dimorfismo, ou

seja, duas formas de crescimento: filamentosa e leveduriforme, como ilustrado na Fig.

10 (PELCZAR e col., 1996).

Figura 10. Fotos de Candida albicans crescendo na forma filamentosa ( esquerda) e na forma de levedura (no centro e direita) (Pelczar e col., 1996).

Os fungos dimrficos podem ter morfologia diferente, conforme as condies

nutricionais e a temperatura de seu meio de desenvolvimento. Esse fenmeno de

variao morfolgica, muito importante em micologia mdica se expressa por um

crescimento micelial entre 22 C e 28 C e leveduriforme entre 35 C e 37 C. Em geral,

as formas so reversveis. A fase micelial ou saproftica a forma infectante e est

presente no solo e nas plantas. A fase leveduriforme ou parasitaria encontrada nos

tecidos. O fenmeno de dimorfismo fngico se observa entre os fungos de importncia

mdica, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides

brasiliensis, Sporothrix schenckii. Na Candida albicans, a forma saproftica infectante

a leveduriforme e a forma parasitria, isolada dos tecidos, a micelial. Em laboratrio,

possvel reproduzir o dimorfismo mediante variaes de temperatura de incubao, de

tenso de O2 e de meios de cultura especficos (PELCZAR e col., 1980)

Ainda que o pH mais favorvel ao desenvolvimento dos fungos esteja entre 4 e

7, a maioria dos fungos tolera amplas variaes de pH (ALEXOPOULOS e col., 1996).


25

Os fungos filamentosos podem crescer em meio cujo pH est entre 1,5 e 11, mas as

leveduras toleram pouco o meio alcalino e se desenvolvem bem em meios com pH

ajustados 3,5 e 3,8. Em geral os limites de tolerncia de pH para leveduras de 2,2 e

8,0, de acordo com as diversas espcies (PELCZAR e col., 1980).

O crescimento de fungos mais lento que o das bactrias e suas culturas

precisam, em mdia, de 7 a 15 dias, ou mais, de incubao. Com a finalidade de evitar

o desenvolvimento bacteriano que pode inibir ou se sobrepor ao do fungo, necessrio

incorporar, aos meios de cultura, agentes antibacterianos de largo espectro, como o

cloranfenicol. Tambm se pode acrescentar cicloheximida, para diminuir o crescimento

de fungos saprfitas contaminantes de culturas de fungos patognicos (ZAITZ C. e col.,

1998).

Muitas espcies fngicas exigem luz para seu desenvolvimento, outras so por

ela inibidos e outras ainda mostram-se indiferentes a esse agente. Em geral, a luz solar

direta, devido radiao ultravioleta, elemento fungicida (ALEXOPOULOS e col.,

1996).

Por diferentes processos, os fungos podem elaborar vrios metablitos, como

antibiticos, como a penicilina (Penicillium chrysogenum) e as cefalosporinas

(Cephalosporium acremonium); agentes imunossupressores como a ciclosporina

(Cylindrocarpon lucidum e Tolypocladium inflatum); lcoois (etanol saccharomyces

cerevisae); cidos orgnicos (cido ctrico (Aspergillus niger)), enzimas (amilase,

celulase, lpase e pectinase (Aspergillus niger)) e micotoxinas, como aflatoxinas

(Aspergillus flavus e A. parasiticus) que confere aos fungos, um importante papel nas

reas: farmacutica, agrcola e alimentcia (ALEXOPOULOS e col., 1996, PELCZAR e

col., 1980).

3.3.Infeces fngicas

As infeces fngicas so denominadas micoses e so classificadas,


26

geralmente, como micoses superficiais e sistmicas. As micoses superficiais localizam-

se nas camadas superficiais da pele e seus anexos, bem como nas mucosas e zonas

cutneo-mucosas. As micoses superficiais podem ser subdivididas em cutneas e

subcutneas. J as infeces sistmicas ou profundas afetam os tecidos e rgos de

indivduos imunodeprimidos (RANG e col., 2004; LACAZ e col., 2002).

Existem condies ambientais, hbitos e condies de sade humanas que

favorecem o desenvolvimento de micoses superficiais e sistmicas. Com relao s

micoses superficiais, os fatores que favorecem seu desenvolvimento so calor e

umidade ambiente, uso de roupas e sapatos impermeveis (botas de borracha, tnis,

roupas de nylon), deficincias nutricionais (avitaminoses, anemia, desnutrio),

transpirao abundante e presena de feridas e machucados na pele. No caso das

micoses sistmicas, como o principal mecanismo de proteo do hospedeiro ao fungo

a resposta imunolgica celular, as doenas imunossupressivas que diminuem a ao

dos linfcitos T predispem o hospedeiro a infeces fngicas oportunistas; portanto,

so considerados suscetveis a infeces oportunistas indivduos infectados pelo vrus

HIV, ps-transplantados, neutropnicos, com neoplasias, alm daqueles

imunodeprimidos por drogas ou outras patologias (LAZZARINI e col., 1999).

As micoses so produzidas por diversos tipos de fungos, de diferentes gneros e

espcies. Alguns afetam tecidos queratinizados como cabelos, unhas, plos e o extrato

crneo da epiderme, produzindo as dermatomicoses (micoses superficiais), tambm

chamadas Tinhas. Os agentes etiolgicos responsveis pelas dermatomicoses so

principalmente os gneros de fungos filamentosos Tricoppytum, Microsporum e

Epidermophyton, que apresentam diferenas morfolgicas relativas ao nmero de

macro e microcondios, as estruturas responsveis pela reproduo assexuada dos

fungos (Fig. 11) (MAZN e col., 1997; RUBIO e col., 1999).


27

Figura 11.Caractersticas dos diferentes gneros de fungos filamentosos e septados, principais causadores de dermatomicoses ([http://ib.ufpel.edu.br/dermatomicose.pdf).

As dermatomicoses promovem descamaes e ulceraes da pele, placas de

calvcie, infeces da bainha de plos e unhas. Na Fig. 12, visualiza-se a onicomicose

provocada pelo dermatfito Trichophyton rubrum.

Figura 12. Onicomicose por Trichophyton rubrum([http://ib.ufpel.edu.br/dermatomicose.pdf).

As micoses sistmicas so produzidas por fungos patognicos capazes de

invadir rgos e tecidos sadios, se multiplicar e provocar dano tecidual. Os fungos ditos

patognicos pertencem s espcies Histoplasma capsulatum, Coccidiodes imitis,

Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomices dermatitides e Esporotrix schenkii. Todavia,

fungos oportunistas, que normalmente so incuos para indivduos imunocompetentes,


28

podem promover micoses severas. Entre eles citam-se: Candida albicans e espcies

no albicans to ou mais freqentes, especialmente a Candida tropicalis, Candida

parapsilosis, Cndida glabrata e Candida krusei; e outras espcies; Aspergillus

fumigatus, Cryptococus neoformans, Fusarium sp.(ZAITZ e col., 1998).

H tempos, infeces superficiais graves por fungos eram relativamente raras e

as sistmicas ainda mais. Nos ltimos 35 anos, houve um aumento uniforme na

incidncia de infeces fngicas sistmicas secundrias graves. Os fatores envolvidos

nesse aumento tem sido o uso disseminado de antibiticos de amplo espectro, a

presena de indivduos com reduo da resposta imune devido AIDS (Sndrome da

Imuno Deficincia Adquirida) ou ao de agentes imunossupressores ou frmacos

utilizados na quimioterapia do cncer. Estes fatores levaram a um aumento na

prevalncia de infeces oportunistas (http://www.cumc.columbia.edu/research/Faculty

_Profiles/profiles/mitchell_ap.htm). No Brasil, as doenas sistmicas mais comuns so:

candidase sistmica, criptococose e histoplasmose, sendo o Cryptococcus neoformans

o agente que infecta 10% dos pacientes com AIDS, causando meningite. A infeco

pela referida espcie fngica ainda no tem tratamento eficaz; logo, apresenta altos

ndices de mortalidade

(http://caibco.ucv.ve/caibco/CAIBCO/Vitae/VitaeOcho/Articulos/Micologia/ArchivosPDF/

Micologia.PDF; http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/guia bolso 5ed2.pdf.

No panorama internacional, verifica-se que a sepse fngica vem se tornando

freqente nas unidades de terapia intensiva peditrica e neonatal. Entre os agentes

etiolgicos identificados encontram-se a Candida spp., Aspergillus spp. e Fusarium spp.

A taxa de mortalidade elevada e varia de 15% a 50% (LEIBOVITZ, 2002). Novos

antifngicos esto sendo empregados, como novos compostos triazlicos, o voriconazol

e o acetato de caspofungina (equinocandina). A caspofungina um antifngico

lipopeptdico que inibe a enzima -1-3-D-glucano sintetase, envolvida na sntese de

polissacardeo vital para a formao da parede celular de fungos filamentosos e

leveduras e no presente em clulas de mamferos (ARKADER e CARVALHO, 2006).

No entanto, o emprego de antifngicos mais antigos em carreadores de frmacos como


29

os lipossomas devem ser mais uma opo no combate s micoses sistmicas.

3.4.Antibiticos antifngicos polinicos Os antibiticos polinicos constituem um grupo de substncias ativas contra os

fungos. Apresentam ao fungisttica e fungicida sobre organismos sensveis. Contudo,

so substncias txicas para o homem e outros mamferos, por provocarem leses

celulares. O mecanismo de ao destes polinicos envolve a interao do frmaco com

esteris existentes na membrana do microrganismo (TAVARES, 1984). Os antibiticos

antifngicos so compostos amplamente usados no tratamento de infeces fngicas

tpicas e invasivas em humanos (ZOTCHEV, 2003). A principal vantagem dos

polinicos sobre outros frmacos antifngicos, como azis e flucitozinas, a ao

fungicida e a baixa incidncia de patgenos resistentes. As aes fungicidas dos

antibiticos macroldeos dependem estritamente da presena de esteris na membrana

das clulas sensveis (BOLARD, 1986).

Mecanismo de ao

O mecanismo de ao da NYS e de outros antibiticos polinicos caracteriza-se

pela sua ligao ao ergosterol presente na membrana citoplasmtica de fungos

sensveis, resultando em alteraes na permeabilidade da membrana pela formao de

poros intramembranares, ocasionando perda dos componentes vitais intracelulares, tais

como ons e pequenas molculas, resultando na morte celular (Fig. 13) (LEIBOVITZ,

2002). Em geral, os antibiticos polinicos tm maior afinidade pelo esterol fngico, o

ergosterol, do que o das clulas de mamferos, o colesterol, pois o ergosterol possui

uma estrutura mais rgida que o colesterol (FRANZINI, 2006). Sendo assim, os

antibiticos polinicos so menos txicos para as clulas de mamferos (MICHEL, 1972;

NG e WASAN, 2003).

A estrutura dos poros formados pela nistatina em membranas ricas em ergosterol

no est clara. (HELRICH e col., 2006). Contudo, COUTINHO A. e col., (2004)


30

declaram que a partir de estudos espectroscopia de fluorescncia, realizadas em

lipossomas, LUV (Vesculas Unilamelar grande), contendo ergosterol e POPC (1-

palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina) e a nistatina, o frmaco pode apresentar

duas fases distintas em seu modo de ao. Na primeira fase, molculas do antibitico

se ligam superfcie da bicamada lipdica (Nistatina monomrica) e numa fase posterior

quando o nmero mdio de molculas atinge um valor crtico de 100

molculas/lipossoma acorre formao de agregados moleculares (oligmeros) que

passam ao modelo clssico de nistatina transmembrana, ocorrendo a formao dos

poros.

Figura 13. Representao esquemtica de poro formado pela NYS em uma membrana celular(Adaptado de Lasic, 1993). A ausncia de ergosterol nas membranas de bactrias pode explicar porque esse

antibitico no capaz de afetar o crescimento daqueles microrganismos.


31

3.5.Lipossomas Os lipossomas so estruturas lamelares constitudas por sistemas lipdio:gua e

foram descritas em meados dos anos 60 do sculo XX, por BANGHAM e col que

estudaram a hidratao de filmes lipdicos depositados nas paredes de frascos de vidro.

Os referidos pesquisadores observaram que as molculas do lipdio se organizavam em

bicamadas formando estruturas vesiculares microscpicas, que posteriormente, foram

denominadas genericamente lipossomas por SESSA e WEISSMANN, que mostraram

que estas vesculas, em seu interior encerravam um compartimento aquoso (SANTOS e

CASTANHO, 2002). Na realidade, essas estruturas se formam espontaneamente

quando os lipdios (especialmente fosfolipdios) so dispersos em meio aquoso,

originando uma populao de vesculas esfricas com dimenses coloidais (cujo

dimetro pode variar de 0,02m a 100m) limitadas por duas ou mais camadas lipdicas, cuja espessura , aproximadamente, de 4nm. Os lipossomas ganharam

bastante popularidade como modelos para estudos sobre propriedades de membranas

celulares (SANTOS & CASTANHO, 2002; PAPAHADJOPOULOS & WATKINS, 1967) e,

mais recentemente como carreadores de frmaco (TORCHILIN, 2005).

Os lipdios empregados no preparo dos lipossomas so substncias anfiflicas,

caracterizadas por apresentarem grupamentos hidroflico e hidrofbico na mesma

molcula. Os referidos lipdios so compostos por duas cadeias hidrocarbnicas,

tambm denominadas caudas hidrofficas, ligadas a um grupo hidroflico, comumente,

denominado como cabea polar. Os lipdios que contenham grupo fosfato na cabea

polar so chamados fosfolpidios e constituem a principal classe de lipdios das

membranas biolgicas. Na Fig. 14, so apresentadas as frmulas estruturais

moleculares de trs fosfolipdios utilizados no presente trabalho, alm do colesterol.


32

DPPC

DSPC

DSPG

Colesterol Figura 14. Frmulas estruturais moleculares dos fosfolipdios 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina (DSPC), 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC), 1,2-Di- estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol (DSPG) e do colesterol (www.avantilipids.com).

Alm do grupo fosfato, a frao polar do fosfolipdio, pode conter os grupos

cabea: etanolamina, colina, glicerol e inositol, encontrados em fosfolipdios de

membranas biolgicas, como mostra a Figura 15. As cabeas polares podem ser

carregadas (positiva ou negativamente) e zwitterinicas (carga lquida nula), dependo

das cargas dos grupos cabea e fosfato.


33

Figura 15 Grupos cabea de fosfolipdios encontrados em membranas biolgicas (Adaptado de New, 1990)

Em geral, as molculas de fosfolipdios so insolveis em gua e nesse meio

formam estruturas agregadas decorrentes da organizao das molculas. A parte

hidroflica do fosfolipdio ser seletivamente hidratada e as cadeias hidrocarbnicas

hidrofbicas preferem ficarem escondidas no interior da estrutura formada, ou seja,

minimiza-se contato com meio aquoso. As molculas de fosfolipdios se mantm juntas,

lado a lado formando folhetos separados por compartimentos aquosos. Dependendo

da concentrao, da estrutura molecular dos lipdios, da temperatura, do teor de gua

no meio, pH e fora inica, pode se ter diferentes estruturas agregadas, como as

bicamadas lipdicas (lamelas) que se unem para formar um folheto bidimensional ou

folheto que se dobra entre si formando uma esfera, denominada lipossoma (LASIC,

1993). Esquemas da seco transversal de um lipossoma e de uma bicamada lipdica

podem ser observados na Fig. 16.


34

A B

Figura 16. Seco transversal (A) de um lipossoma e (B) de uma bicamada lipdica.

Dependendo do nmero de lamelas contidas nos lipossomas, estes podem ser

classificados em multilamelares, MLV (vrias lamelas separadas por compartimentos

aquosos) ou unilamelares com uma nica lamela. Os lipossomas unilamelares podem

ser classificados pelo tamanho; grandes e pequenos (LUV) e (SUV), respectivamente.

Na Tabela 1, tem-se a classificao de lipossomas de acordo com seus parmetros

estruturais (tamanho e nmero de lamelas) (BERENHOLZ e CROMMELIN, 1994).

Tabela 1 Classificao de lipossomas, baseada em parmetros estruturais.

Classificao do Lipossoma Tamannho

MLV Vesculas Multilamelares > 0,5m

OLV Vesculas Oligolamelares 0,1-1m

UV- Vesculas Unilamelares todos os tamanhos

SUV Vesculas Unilamelares pequenas 20-100nm

LUV Vesculas Unilamelar grande > 100nm

GUV Vesculas Unilamelares gigantes > 1m

MVV Vesculas Multivesicular > 1m

Quando so selecionados os lipdios que vo compor uma formulao

lipossomal, tem-se que considerar questes como temperatura de transio de fases

(Tc), estabilidade qumica, carga, fonte de lipdios, presena de colesterol na

composio. Em sistemas compostos de um tipo de lipdio, agregado em bicamadas, a


35

temperatura de transio de fase principal corresponde temperatura requerida para

induzir uma mudana no estado fsico do lipdio agregado de uma fase gel, mais

ordenada, quando as cadeias hidrocarbnicas encontram-se totalmente estendidas e

apresentando uma estrutura inclinada, em configurao toda-trans e empacotadas, para

uma fase lquida cristalina desordenada, na qual as cadeias hidrocarbnicas dos lipdios

esto menos orientadas e fluidas, em configurao trans-gauche (Fig. 17) (SMALL,

1986 e NEW, 1990). Na escolha de lipdios para uma formulao lipossomal deve-se

selecionar aqueles que apresentem altas temperaturas de transio de fase

(fosfolipdios com cadeias hidrocarbnicas longas), grande estabilidade qumica, ou

resitncia a oxidao (cadeias acilas saturadas) e presena de colesterol na

composio lipdica (LASIC, 1993). A presena de ncleos rgidos planares de

colesterol na bicamada lipdica tem o efeito de mudar a fluidez da bicamada lipdica na

fase gel, tornando-a mais fluida na referida fase. A mudana na fluidez seguida por

mudanas na permeabilidade da membrana, diminuda em temperatura maior do que

Tc, mas aumentada em temperaturas menores que Tc, assim, impedindo o escape dos

compostos encapsulados (NEW, 1990). A utilizao da combinao fosfolipdios

neutros e com carga negativa pode favorecer a repulso entre as partculas

lipossomais, devido carga e formao de partculas com menores tamanhos.


36

A

B

Figura 17. Transio das fases gel e lquida cristalina da bicamada lipdica de fosfolipdio (A). Diferentes configuraes (trans e gauche) causadas pela rotao de ligao simples C-C das cadeias acila dos fosfolipdios (B) (Adaptado de New, 1990).

As bicamadas dos lipossomas so qumica e biologicamente compatveis com as

membranas celulares, o que facilita a entrega de frmacos, aumentando a eficincia

teraputica. Os lipossomas podem, ainda, ser modificados quimicamente pela insero

de polmeros como o polietileno glicol 2000 na bicamada, para escapar do

patrulhamento exercido pelas clulas do sistema imunolgico e aumentar sua interao


37

com tecidos doentes, reduzindo seu acmulo nos tecidos sadios.

Neste trabalho, foram produzidos lipossomas convencionais, definidos como

aqueles tipicamente compostos de fosfolipdios (neutros e negativamente carregados) e

colesterol. Os lipossomas convencionais so caracterizados tambm por um tempo

relativamente curto de circulao no sangue, quando administrados in vivo por via

parenteral, geralmente intravenosa (STORM e CROMMELIN, 1998). A literatura contm

muitos exemplos de aplicaes com sucesso de lipossomas convencionais, tendo como

alvo macrfogos infectados, como na vetorizao de agentes antimicrobianos

(BAKKER-WOUDENBERG, 1995; RASTOGI e col., 2006) e de imunomoduladores que

vo aumentar a capacidade dos macrfagos em destruir clulas neoplsicas e

aumentar a resistncia contra microrganismos infecciosos (DAEMEN, 1992; VASIR e

col., 2005). Lipossomas convencionais tambm so usados para entrega de antgenos.

Os lipossomas empregados como vacinas tm sido efetivos em modelos experimentais

contra vrus, bactrias e parasitas (GREGORIADIS, 1994; ALVING, 1995; TORCHILIN,

2005).

3.5.1. Aplicaes de lipossomas em medicina As aplicaes de lipossomas em medicina podem ser divididas em aplicaes

teraputicas e diagnsticas. Os lipossomas podem veicular frmacos e agentes de

contraste (marcadores) importantes no diagnstico de vrias patologias. Podem,

tambm, ser empregados como modelo, ferramenta ou reagente em estudos bsicos

sobre interaes celulares, processos de reconhecimento e modo de ao de certas

substncias (LASIC, 1993).

Devido a sua estrutura de bicamadas, semelhante das membranas celulares,

os lipossomas so capazes de interagir profundamente com as clulas do organismo.

Os benefcios e limitaes de lipossomas utilizados como carreadores de frmacos

dependem da interao dos mesmos com clulas e seu destino in vivo aps a

administrao. Estudos in vitro e in vivo mostraram que a interao predominante de


38

lipossomas com clulas por adsoro simples e subseqente endocitose. A fuso

com membranas celulares muito mais rara. Outra possvel interao a troca de

constituintes com os da bicamada, como lipdios, colesterol e molculas ligadas a

componentes da membrana (Fig. 18) (CHORILLI e col., 2004).

Figura 18. Possveis mecanismos de interao de lipossomas com clulas(Adaptado de Chorilli e col., 2004).

O sistema imunolgico humano apresenta um complexo sistema de defesa,

visando proteo contra agentes potencialmente perigosos que podem trazer riscos

sade do organismo. Aps a administrao intravenosa de lipossomas convencionais,

as protenas do plasma conhecidas como opsoninas (imunoglobulinas IgM e IgG,

relacionadas resposta imune inata do organismo) so rapidamente adsorvidas na

superfcie das partculas. Esta adsoro leva ao rpido reconhecimento pelas clulas do

sistema mononuclear fagocitrio (macrfagos, principalmente do bao e clulas de

Kuppfer, do fgado) e conseqente fagocitose das partculas, especialmente no fgado


39

(60 %-90 %), bao (2 %-20 %), medula ssea (0,1 %-1 %) e quantidades variadas nos

pulmes (GULYAAEV e col., 1998). Em funo disso, foram feitos estudos para reduzir

a captura das partculas coloidais pelo sistema monuclear fagocitrio, aumentar a

concentrao desses veculos no sangue e, consequentemente, no tecido ou rgo alvo

desejado (GUO e THOMAS, 2001; ELLEY, 2001). A resposta do sistema imune tem

desencadeado esforos no desenvolvimento de superfcies biocompatveis e no

reconhecveis pelo sistema de defesa humano. Desta forma, tem-se estreitado o

espectro de aplicaes de micro e nanopartculas empregadas como carreadores de

frmacos e, em alguns casos, almejando ter como alvo as referidas clulas do sistema

imunolgico.

Os lipossomas como sistemas carreadores de frmacos, podem oferecer vrias

vantagens sobre as formas farmacuticas convencionais, especialmente em relao

parenteral (injeo local, sistmica ou infuso), tpica e pulmonar. Entre elas, pode-se

citar (LASIC, 1993):

- melhora na solubilidade de frmacos lipo e anfiflicos e aumento da solubilidade de

compostos hidroflicos;

- direcionamento passivo de compostos para clulas do sistema imune, especialmente

para as do sistema mononuclear fagocitrio;

- liberao sustentada de frmacos veiculados em lipossomas, administrados local ou

sistemicamente;

- mecanismo de fuga de stios: os lipossomas geralmente no se dirigem a rgos,

como corao, rins, crebro e sistema nervoso, reduzindo a toxicidade de cert

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