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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE FSICO-QUMICA
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE FORMULAES LIPOSSOMAIS CONTENDO O
FRMACO NISTATINA
Edeilza Gomes Brescansin
Orientador: Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine (IQ-UNICAMP)
Campinas SP 2006
ii
iii
EDEIZA GOMES BRESCANSIN
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE FORMULAES LIPOSSOMAIS CONTENDO O FRMACO NISTATINA
Tese apresentada Universidade Estadual de Campinas, como requisito para obteno do ttulo de Doutor em Cincias
Aprovado em:
BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine (orientador) Profa. Dra. Eneida de Paula (IB-UNICAMP) Prof. Dr. Cludio Francisco Tormena (IQ-UNICAMP) Prof. Dr. Marcelo Ganzarolli de Oliveira (IQ-UNICAMP) Prof. Dr. Noboru Hioka (DQ-UEM)
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v
Dedico este trabalho
A meu Deus pela proteo e paz,
A minha querida me Maria Eunice que esteve sempre a meu lado em todas as horas,
A meu querido marido, Jos Valdir pelo apoio e companheirismo,
A meus filhos Mariana e Pedro.
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vii
"O valor das coisas no est no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem.
Por isso existem momentos inesquecveis, coisas inexplicveis e
pessoas incomparveis".
(Fernando Pessoa)
viii
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AGRADECIMENTOS
Ao Professor Francisco Benedito Teixeira Pessine, meus sinceros agradecimentos, no
apenas pela orientao, mas tambm pelo incentivo, confiana e amizade nestes anos
de convivncia.
Aos amigos que encontrei na UNICAMP pela simpatia, incentivo e auxlio nos
momentos difceis do projeto e na vida pessoal: Ana Paula, Milene, Neife, Dbora Biloti,
Adriana, Daniel, Anglica, Josivnia,
A minha amiga, professora Mrcia Portilho da UEM pela leitura e correes do trabalho.
Aos professores da UEM , Osvaldo A. Cavalcanti, Graciette Matioli, Elza Kimura, Maria
da Conceio T. Truiti, Adriana Lenita M. Albiero, Nelson Y. Uesu, Edna Regina N.
Oliveira pelas palavras de incentivo nesta reta final da tese.
Ao professor Luiz Carlos Dias (IQ/UNICAMP) e seus alunos, pela amizade,
companheirismo e pela colaborao na realizao de nosso projeto com o emprstimo
e doao de equipamentos e /ou reagentes.
A Professora Eneida de Paula (IB/UNICAMP) e funcionrios do IB pelo auxlio no uso
da ultracentrfuga
Aos professores Maria Helena Santana (FEQ/UNICAMP), Pedro L. O Volpe
(IQ/UNICAMP), Fernando Galenbeck (IQ/UNICAMP), Carlos F. S. Bonaf
(IB/UNICAMP), Anita J. Marsaioli, Lauro Kubota (IQ/UNICAMP), Maria Isabel M. S.
Bueno (FEQ/UNICAMP) e Renato Atlio Jorge (IQ/UNICAMP) pelo emprstimo de
equipamentos em seus laboratrios.
Ao Dr. Carlos Ramos (BFM/LNLS) e Silvia Lucas F. da Silva (IQ/UNICAMP) e ao
Laboratrio Nacional de Luz Sncroton (LNLS) pelo emprstimo e auxlio na utilizao
do MicroDSC.
A professora Anglica Zaninelli Schreiber (FCM/UNICAMP) e Luzia Lyra
(FCM/UNICAMP) pelo grande auxlio nas anlises de atividade antifngica do frmaco
estudado.
Aos Tcnicos do IQ que tanto nos auxiliaram nesta tese: Claudia Matelli, Robson, Maria
do Carmo, Ana, Ricardo Pereira, Divino, Sonia (RMN), Sr. Fontana, Pimpim, Cssia,
x
Fabiana, Iveraldo
Aos funcionrios das oficinas, vidraria, almoxarifado, marcenaria, manuteno e
informtica
A CAPES, pelo suporte financeiro com a concesso de bolsa de estudo pelo programa
Institucional de Capacitao Docente e Tcnico-Administrativo (PICDT).
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CURRICULUM VITAE
DADOS PESSOAIS Nome:Edeilza Gomes Brescansin Tel: (44)3026-8010 - e-mail: [email protected] Endereo residencial: Rua Joaquim Nabuco, 163, apto. 1401.
Zona 01, Maring PR. - CEP: 87013-340
FORMAO ACADMICA Doutorado em Cincias Fsico-Qumica. Desenvolvimento e Caracterizao de Formulaes Lipossomais contendo o Frmaco Nistatina. Universidade Estadual de Campinas Instituto de Qumica - Perodo: 2001 2006. rgo financiador: CAPES Programa PICDT Mestrado em Qumica Fsico-Qumica.
Determinao da Estabilidade Qumica e mecnica do Medicamento Reliflex e seu Princpio Ativo Nabumetona.
Universidade Estadual de Maring Departamento de Qumica - Perodo: 1995 1998. Especilizao em Gesto da Qualidade. Aplicao de Mtodos Estatsticos para a Melhoria da Qualidade na Produo de
Comprimidos. Universidade Estadual de Maring - Departamento de Administrao Perodo: setembro 1993 dezembro 1995. Graduao em Farmcia Farmcia Industrial Universidade Federal do Rio de Janeiro Departamento de Farmcia. Perodo: 1981 1986
ATUAO PROFISSIONAL Universidade Estadual de Maring, UEM, Brasil. Vnculo: Servidor Pblico, Enquadramento Funcional: Professor Assistente Nivel D, Carga horria: 40 h - Regime: Dedicao exclusiva. Perodo: 1991 Atual
LIVROS PUBLICADOS/ORGANIZADOS OU EDIES BRESCANSIN, E.G. VALENTINI, S. R. MEMENTO TERAPUTICO, SRIE
APONTAMENTOS. Maring: EDUEM - Editora da Universidade Estadual de Maring, 1999.
ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIDICOS MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; HIOKA, N. ; MAIONCHI, F. ; MATIOLI, G. .
ESTUDO DA DEGRADAO DO FRMACO NABUMETONA FRENTE LUZ . Acta Scientiarum, Maring, v. 23, n. 3, p. 651-659, 2001.
RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSO (ARTIGOS) BRESCANSIN, E. G.; MARTINS, M. H.; PESSINE, F. B. T. ENCAPSULATION OF NYSTATIN
IN MULTILAMELLAR LIPOSOMES. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, v. 39, supl. 2, 2003.
MARTINS, M. H.; BRESCANSIN, E. G.; PESSINE, F. B. T. PHOTOSTABILITY OF ISOTRETINOIN IN METHANOL AND IN LIPOSOMES. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, v. 39, supl. 2, 2003.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . IDENTIFICATION OF THE OBTAINED PHOTOPRODUCTS OF THE DEGRADATION THE NABUMETONE. European
xii
Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 13, n. 1, p. 57, 2001.
TRABALHOS COMPLETOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSO FERRACINI, Cristiane Nunes ; MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MORAES, Flvio
Farias de ; MATIOLI, G. . STUDY OF THE FORMATION OF THE COMPLEX ALBENDAZOLE-BETA-CYCLODEXTRIN. In: Congress of Pharmaceutical Science - CIFARP, 2001, guas de Lindia. European Journal of Pharmaceutical Sciences. New York : Elsevier, 2001. v. 13. p. 139-140.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . IDENTIFICATION OF THE OBTAINED PHOTOPRODUCTS OF THE DEGRADATION OF THE NABUMETONE. In: Congress of Pharmaceutical Science, 2001, guas de Lindia. European Journal of Science Pharmaceutical Sciences. New York : Elsevier, 2001. v. 13. p. 57-57.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ESTABILIDADE DA NABUMETONA FRENTE LUZ: UM ESTUDO FSICO-QUMICO. In: XIV Semana de Integrao de farmcia, 2000, MARING. Livro de Resumos da XIV Semana de Integrao de Farmcia, 2000.
MORIWAKI, Cristiane ; MORAES, Flvio Farias de ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ESTUDO DA FORMAO DO COMPLEXO ALBENDAZOL-BETA-CU\ICLODEXTRINA. In: IX Encontro Estadual de farmacuticos e Bioqumicos e VII Congresso Catarinense de, 2000, Florianpolis. Caderno de Resumos do IX Encontro Estadual de farmac6euticos e Bioqumicos, 2000. v. 1. p. 19.
LUCENA, F. A. M.; REIS, A. V. BRESCANSIN, E. G. CARACTERIZAO E AVALIAO CINTICA PRELIMINAR DA NABUMETONA. Anais do IX Encontro Anual de Iniciao Cientfica, v. 2, p. 392 393, 2000.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . FOTLISE DO FRMACO NABUMETONE E IDENTIFICAO DE SEUS FOTOPRODUTOS. In: IV Jornada de Farmcia e Anlises Clnicas de Londrina, 2000. LONDRINA. Anais da IV Jornada de Farmaia e Anlises Clnicas de Londrina, v. 1. p. 8-8 2000.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ISOLAMENTO E IDENTIFICAO DE FOTOPRODUTOS OBTIDOS DA DEGRADAO DA NABUMETONA. In: IX ENCONTRO ANUAL DE INICIAO CIENTFICA, 2000, LONDRINA. Anais do IX Encontro Anual de Iniciao Cientfica, v. 1, p. 384-385, 2000.
BRESCANSIN, E. G.; HIOKA, N.; SANTIN FILHO, Ourides. EVALUATION OF THE STABILITY OF NABUMETONE TO LIGHT. In: 2nd Congress of Pharmaceutical Sciences, 1999, Ribeiro Preto. Bolletino Chimico Farmaceutico. Milano : Societ Editoriale Farmaceutica, v. 138. p. CLXII 1999.
MARTINS, S. S. M. ; BRESCANSIN, E. G. ; HIOKA, N.; SANTIN FILHO, Ourides . AVALIAO DAS PROPRIEDADES MECNICAS E ESPECTROSCPICAS DO COMPRIMIDO RELIFLEX E SEU PRINCPIO ATIVO (NABUMETONA). In: V Encontro de Qumica da Regio Sul, Porto Alegre - RS. Livro de Resumos, 1997. p. AQ18 1997.
PALESTRAS PROFERIDAS Lipossomas como Carreador de Frmacos, na disciplina: Pr-formulao e Tecnologia
Farmacutica do Programa de Ps-Graduao em Cincias farmacuticas, 2006
Prmios E Ttulos Professsora Homenageada pelos Formandos de Farmcia de 1999, Universidade Estadual de
Maring. Patronesse da Turma dos Formandos de Farmcia de 2001, Universidade Estadual de Maring.
xiii
RESUMO No presente trabalho, buscamos desenvolver formulao lipossomal sistmica de
nistatina (NYS) com o propsito de aplicaes futuras na teraputica de micoses
sistmicas, que tanto afligem indivduos imunodeprimidos. Na primeira parte do projeto
caracterizamos o frmaco atravs de anlises trmicas (TGA e DSC), anlises
espectroscpicas (IV, UV e fluorescncia), teste de solubilidade, avaliao da umidade
segundo o mtodo de Karl-Fischer e coeficiente de partio octanol/meio aquoso. Na
segunda parte do trabalho procuramos desenvolver e otimizar formulaes lipossomais,
onde o frmaco apresentasse maior estabilidade qumica. Foram preparadas
formulaes lipossomais pelo mtodo do filme lipdico que foram analisadas por HPLC.
As preparaes passaram por processo de diminuio de tamanho e separao entre
frmaco livre e encapsulado A terceira e ltima fase do projeto consistiu da
caracterizao de duas preparaes, atravs de anlises do raio hidrodinmico,
determinao da carga de superfcie das partculas (potencial zeta), teor de fosfolipdios
totais (teor de fosfato), eficincia e avaliao da encapsulao por anlises de HPLC,
anisotropia e supresso de fluorescncia. Ainda na fase de caracterizao investigamos
a atividade biolgica in vitro, destas formulaes, pelo teste de susceptibilidade. As
preparaes foram desafiadas contra leveduras e dermatfitos. Pela seleo e
otimizao das formulaes desenvolvidas conclumos que a melhor formulao foi a
que apresenta uma composio de 70 % de Epikuron 200 SH; 20 % de Colesterol; 10
% de Diestearoilfosfatidilglicerol, 1,3 % de 2,6 - bis (1,1-dimetil) 4 - metil fenol (BHT) e
7 % de NYS. Duas preparaes foram caracterizadas L1 (hidratada a 55 C) e L2
(hidratada a 60 C). Os resultados para anisotropia e supresso de fluorescncia
evidenciam a encapsulao do frmaco nas preparaes estudadas, tanto na bicamada
lipdica quanto na superfcie dos lipossomas. Verificamos tambm que L2 apresentou
menor polidisperdidade de seu raio hidrodinmico, maior carga de superfcie e maior
eficincia de encapsulao, evidenciando ser L2 a preparao, fsico-quimicamente,
mais estvel. Todavia, a preparao L1 mostrou, aps sonicao, atividade biolgica in
vitro maior que L2. Estes resultados podem refletir a possvel degradao do frmaco,
quando aquecido a 60 C.
xiv
Palavras-chaves: nistatina, antifngicos, lipossomas,
xv
ABSTRACT
This study was designed to develop liposomal formulations containing Nystatin (NYS), looking forward its future applications in systemic mycosis therapy, which often affect immunodepressed individuals. In the first part of the project, the drug was characterized by means of thermal analyses (TGA and DSC), IR, UV/V and fluorescence spectroscopies, solubility tests, humidity contents evaluation (Karl-Fischer method) and octanol-water partition coefficient. In the second part of the study, liposomal formulations were developed and optimized, in which the drug presented improved chemical stability. Liposomal formulations were prepared by the dry lipid film hydration method and were analyzed by HPLC. The vesicles were submitted to the processes of size reduction and separation of non encapsulated drug. The last part of the project consisted in the characterization of the two formulations by means of analysis of the is hydrodynamic radius; determination of the particles superficial charge (zeta-potential); total phospholipids content (phosphate); degree of NYS with encapsulation by HPLC; degree of anisotropy and fluorescence quenching of NYS. Still during the characterization phase, the in vitro biological activity of the formulations was investigated by means of susceptibility tests. The formulations were challenged against some yeasts and filamentous fungi. Conclusions pointed that the best formulation was the one which presented in its compositions 70% Epikuron 200 SH, 20% Cholesterol, 10 % Distearoyl-phosphatidylglycerol, 1.3 % 2,6 bis (1,1-dimethylethyl) 4 - methylphenol (BHT) and 7 % NYS. Two formulations were characterized: L1 (hydrates at 55 C) and L2 (hydrated at 60 C). Results regarding the degree of anisotropy and fluorescence quenching evidenced by NYS encapsulation at the liposomal lipid bilayers. Moreover, it was observed that L2 presented lower polydispersity in size distribution, higher superficial load and higher encapsulation effectiveness, i.e. L2 presented higher physico-chemical stability. Nevertheless the L1 preparation showed, after sonication, higher biological activity in vitro than L2, which might reflect possible thermal degradation of NYS when heated to 60 C. Key words: antifungal, nystatin, liposomes.
xvi
xvii
NDICE
ABREVIAES ........................................................................................... XXI
NDICE DE TABELAS ................................................................................. XXIII
NDICE DE FIGURAS .................................................................................. XXVII
1 INTRODUO ............................................................................................. 01
2 OBJETIVOS ................................................................................................. 11
3 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 15
3.1 Fungos ......................................................................................................... 17
3.2 Dimorfismo Fngico ................................................................................... 24
3.3 Infeces Fngicas .................................................................................... 25
3.4 Antibiticos Antifngicos Polinicos ....................................................... 29
3.5 Lipossomas ................................................................................................. 31
3.5.1 Aplicaes de lipossomas em medicina .................................................. 37
3.5.2 Lipossomas em doenas parasitrias e infecesfngicas .................. 40
3.5.3 Mtodos de Preparao de lipossomas ................................................... 41
3.5.3.1 Mtodo pelo filme lipdico ......................................................................... 41
3.5.3.2 Mtodo de injeo de Etanol ..................................................................... 43
3.6 Caracterizao de preparaes lipossomais ........................................... 44
3.6.1 Determinao do raio hidrodinmico de lipossomas ............................. 44
xviii
3.6.2 Determinao da carga de superfcie das partculas .............................. 45
3.6 3 Anlise por supresso de Fluorescncia ................................................. 45
3.6.4 Espectroscopia de polarizao de fluorescncia ................................... 46
4 MATERIAIS E MTODOS ........................................................................... 49
4.1 Materiais ...................................................................................................... 51
4.2 Mtodos ....................................................................................................... 52
4.2.1 Caracterizao fsico-qumica da NYS...................................................... 52
4.2.1.1 Avaliao da solubilidade .......................................................................... 53
4.2.1.2 Determinao do teor de umidade ............................................................ 53
4.2.1.3 Anlises espectroscpicas ....................................................................... 53
4.2.1.3.1 Anlise por espectroscopia de absoro na regio do UV/V ................. 53
4.2.1.3.2 Anlise por espectroscopia de fluorescncia ......................................... 54
4.2.1.3.3 Anlise por espectroscopia no Infravermelho (IV) .................................. 54
4.2.1.4 Anlises por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) e Termogravimetria (TGA).............................................................................
54
4.2.1.5 Determinao do coeficiente de partio octanol/tampo ..................... 55
4.2.2 Anlise da atividade antifngica in vitro da NYS..................................... 56
4.2.3 Desenvolvimento de formulaes lipossomais com NYS ...................... 57
4.2.4 Tratamentos efetuados em vesculas multilamelares para obteno
xix
de lipossomas unilamelares ...................................................................... 59
4.2.5 Caracterizao qumica e fsica de suspenses lipossomais ............... 60
4.2.5.1 Anlise por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)................ 60
4.2.5.2 Determinao do teor (%) de fosfato ........................................................ 61
4.2.5.3 Determinao do raio hidrodinmico ....................................................... 62
4.2.5.4 Determinao do potencial Zeta ............................................................... 62
4.2.5.5 Anlise do grau de anisotropia de fluorescncia da NYS livre e
encapsulada em lipossomas ....................................................................
62
4.2.5.6 Estudo da supresso de emisso de fluorescncia da NYS livre e em lipossomas...................................................................................................
63
4.2.5.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro de suspenses lipossomais .................................................................................................
64
5 RESULTADOS E DISCUSSES ................................................................. 67
5.1 Caracterizao fsico-qumica da NYS ..................................................... 69
5.1.1 Solubilidade ................................................................................................ 69
5.1.2 Anlise do teor de Umidade ...................................................................... 70
5.1.3 Caracterizao espectroscpica da NYS na regio do UV/V em Metanol ........................................................................................................
70
5.1.4 Anlise fluorimtrica da NYS .................................................................... 74
5.1.5 Anlise por espectroscopia na regio do Infravermelho (IV) ................. 75
xx
5.1.6 Anlise da NYS por DSC ............................................................................ 78
5.1.7 Anlise da NYS por TGA ............................................................................ 79
5.1.8 Determinao do coeficiente de partio octanol/tampo ..................... 80
5.2 Preparao das formulaes lipossomais ............................................... 81
5.3 Caracterizao fsico-qumica das suspenses lipossomais ................ 93
5.3.1 Raio hidrodinmico .................................................................................... 93
5.3.2 Potencial Zeta ............................................................................................. 95
5.3.3 Teor de fosfato ............................................................................................ 95
5.3.4 Eficincia de encapsulao ....................................................................... 96
5.3.5 Determinao do grau de anisotropia de fluorescncia ......................... 98
5.3.6 Estudo da interao da NYS em lipossomas ........................................... 101
5.3.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro da NYS e NYS lipossomal . 110
5.3.8 Concluses sobre as preparaes lipossomais selecionadas ............. 116
6 CONCLUSES GERAIS ............................................................................. 119
7 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................... 123
8 REFERNCIAS BIBIOGRFICAS .............................................................. 127
xxi
ABREVIAES
AnfB: Anfotericina B ASD: meio de cultura Agar Saboraud Dextrose BHT: 2,6 bis (1,1-dimetil)-4-metil fenol CLAE: Cromatografia Lquida de Alta eficincia DMPC: 1,2-Di-meristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DMPG: 1,2-Di-meristoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol DPPC: 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DSC: Calorimetria Exploratria Diferencial DSPC: 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina DSPG: 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol DTG: Termogravimetria Diferencial ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay FDA: Food and Drug Administration" GUV: vesculas gigantes unilamelares HEPES: N-[2-hidroxietil] piperazina-N-[2-cido tanosulfnico] IgG: Imunoglobulina G IgM: Imunoglobulina M IV: Infravermelho LUV: vesculas unilamelares grandes MIC: Concentrao Inibitria Mnima microDSC: MicroCalorimetria Exploratria Diferencial MLV: vesculas multilamelares MVV: vesculas multivesiculares NYS: Nistatina OLV: vesculas oligolamelares PCH: fosfatidilcolina de soja hidrogenada QELS: Espalhamento Quase-Elstico de Luz
xxii
RMN: Ressonncia Magntica Nuclear RPMI: meio de cultura Roswell Park Memorial Institute SUV: vesculas unilamelares pequenas Tc: temperatura de transio de fases TGA: Anlise Termo-Gravimtrica UV/Vis.: Ultravioleta/Visvel v:v : razo volume:volume max: comprimento de onda mximo
xxiii
NDICE DE TABELAS Tabela 1 Classificao de lipossomas, baseada em parmetros estruturais . .. 34
Tabela 2 Solubilidade da NYS em diferentes solventes. As concentraes as solues de NYS com os solventes testados foram de 1,94 mol.L-1 ...................................................................................................................
69
Tabela 3 Dados de regresso linear da curva de calibrao ( Mx 292 nm) .... 72 Tabela 4 Dados de regresso linear da curva de calibrao ( Mx 304 nm) ..... 73 Tabela 5 Dados de regresso linear da curva de calibrao ( Mx 320 nm) .... 73 Tabela 6 Freqncias de absoro caractersticas das vibraes de ligao
da NYS Medley e Cristlia ...................................................................... 76
Tabela 7 Coeficientes de partio da NYS em n-octanol/tampo succinato (0,02 mol L-1; pH 5,6) isotnico a 25 e 37 C .........................................
81
Tabela 8 Teores % de NYS recuperada nas formulaes lipossomais, contendo 10 % de NYS em relao concentrao molar de PCH, hidratadas com Hepes (0,01 mol.L-1; pH 7,4) ou tampo succinato (0,02 mol.L-1, pH 5,6) , isotnicos, a 55 e 65 C ...................................................................................................................
82
Tabela 9 Teores obtidos de NYS recuperada na formulao 80 % PCH e 20% de Colesterol, hidratada com os tampes Hepes (0,01 mol L-1; pH 7,4) ou tampo succinato (0,02 mol.L-1, pH 5,6), isotnicos, 55 e 65 C ..........................................................................................................
84
Tabela 10 Teores de NYS recuperada nas formulaes lipossomais (Etapa 2), compostas de lipdios PCH, colesterol e DSPG, contendo NYS (NYS/lipdio 7 %), hidratadas com tampo succinato (0,02 mol.L-1) , isotnico, a 55 C ....................................................................................
87
Tabela 11 Teores obtidos de NYS recuperada nas formulaes: 80 % PCH e 20 % de Colesterol e 70 % PCH e 30 % de DSPG, quando as formulaes so hidratadas com tampo succinato (0,02 mol L-1); pH 5,6 isotnico. As preparaes foram hidratadas a 55 C e foram variadas as concentraes de lipdios de 10 a 15 mM. A relao frmaco/lipdio de 7 para 10 % .....................................................................................................................
88
xxiv
Tabela 12 Teores de NYS nas formulaes lipossomais compostas PCH, colesterol e DSPG, BHT e NYS em uma relao frmaco/lipdio de 7 %, hidratadas com tampo succinato (0,02 mol.L-1) isotnico, a 60 C ................................................................................................................
89
Tabela 13 Teores de NYS recuperada na formulao lipossomal composta de PCH, colesterol, DSPG, BHT e NYS numa relao frmaco/lipdio de 6,5 %; hidratada com tampo succinato (0,02 mol L-1 ), isotnico, a 55 e 60 C, modo de hidratao AU e AE ....................................................................................................................
92
Tabela 14 Teores de encapsulao de NYS em preparaes lipossomais L1 e L2 .............................................................................................................
97
Tabela 15 Grau de anisotropia de fluorescncia (r) da NYS livre e encapsulada em lipossomas em tampo succinato (0,02 mol L-1), isotnico, pH 5,6 a 25 C ................................................................................................
98
Tabela 16 Variao da fluorescncia da NYS em concentraes e temperaturas diferentes, na ausncia e presena de lipossomas, em tampo succinato (0,02 mol L-1), isotnico, pH 5,6 .....................................................................................................................
100
Tabela 17 Valores de 1/fa obtidos para a NYS encapsulada em lipossomas (L1 e L2), usando como os supressores iodeto de potssio e Acrilamida .....................................................................................................................
110
Tabela 18 Resultados do teste de susceptibilidade in vitro (MIC(M/ml)) para as NYSs 1 e 2 em leveduras do gnero Candida, das espcies krusei, albicans, parapsilosis e do gnero Cryptococcus, espcie neoforman .................................................................................................
111
Tabela 19 MIC(M/ml) para as amostras de NYS 1 e 2 em fungos dos gneros Trichophyton (espcies rubrum, mentagrophytes e espcie indefinida (spp.); Fusarium spp. e Aspergillus fumigatus .................................................................................................................
112
Tabela 20 MIC(M/ml) e CFM (M/ml) para a NYS livre, NYS 1 e NYSs L1A (hidratadas a 55 C) e L2A (hidratadas a 60 C), em leveduras dos gneros Candida e Cryptococcus .......................................................
113
Tabela 21 MIC(M/ml) e CFM (M/ml) para dois lotes de NYS livre (NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1 e L2, empregando as espcies albicans e krusei ..................................................................................................................
115
xxv
Tabela 22 MIC e CFM para dois lotes de NYS livre (NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1 e L2, empregando os gneros Candida (parapsilosis) e Cryptococcus (neoformans) .........................................................................................
116
xxvi
xxvii
NDICE DE FIGURAS Figura 1 Estruturas moleculares de NYSS A1, A2 e A3 ................................. 04 Figura 2 Direcionamento da encapsulao de frmacos em lipossoma
multilamelar (MLV): molculas hidrossolveis, lipossolveis e anfipticas .........................................................................................
07
Figura 3 Ilustraes de hifas septadas mononucleadas, multinucleadas e no septadas, presentes em de fungos filamentosos ...................
18
Figura 4 Ilustrao de hifa com esporo assexuado do tipo clamidsporo de fungos filamentosos ....................................................................
20
Figura 5 Ilustrao de esporo assexuado do tipo artrsporo de fungo do gnero Geotrichum ...........................................................................
20
Figura 6 Ilustrao de esporo assexuado do tipo blastsporo ................... 21 Figura 7 Ilustrao de esporo assexuado do tipo esporangisporo .......... 21 Figura 8 A Cultura, em Agar, de Aspergillus fumigatus (imagem
esquerda) e Condios de Aspergillus fumigatus (imagem central e direita). B Ilustrao de Condios de Aspergillus agrupados em forma de cabea, ao redor de uma vescula ..............................................
22
Figura 9 Ilustrao de Condios de Peniccilium agrupados em forma de pincel ..................................................................................................
23
Figura 10 Fotos de Candida albicans crescendo na forma filamentosa ( esquerda) e na forma de levedura (no centro e direita) .............
24
Figura 11 Caractersticas dos diferentes gneros de fungos filamentosos e septados, principais causadores de dermatomicoses ...............
27
Figura 12 Onicomicose por Trichophyton rubrum .......................................... 27 Figura 13 Representao esquemtica de poro formado pela NYS em uma
membrana celular .............................................................................. 30
Figura 14 Frmulas estruturais moleculares dos fosfolipdios 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DSPC), 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC), 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-
xxviii
3-fosfatidilglicerol (DSPG) e do lipdio Colesterol ........................ 32 Figura 15 Grupos cabea de fosfolipdios encontrados em membranas
biolgicas ........................................................................................... 33
Figura 16 Seco transversal (A) de um lipossoma e (B) de uma bicamada lipdica ................................................................................................
34
Figura 17 Transio das fases gel e lquida cristalina da bicamada lipdica de fosfolipdio (A). Diferentes configuraes (trans e gauche) causadas pela rotao de ligao simples C-C das cadeias acila dos fosfolipdios (B) ..........................................................................
36
Figura 18 Possveis mecanismos de interao dos lipossomas com clulas ................................................................................................
38
Figura 19 Esquema do mtodo de preparo de lipossomas por filme lipdico ................................................................................................
42
Figura 20 Representao Esquemtica da hidratao e o preparo de diferentes tipos de lipossomas ........................................................
43
Figura 21 Espectros de absoro, da NYS Medley, na regio do UV/V em MeOH, 25C (2,6; 3,9; 5,3; 6,6; 7,9; 9,2x10-6; 1,0x10-5 mol.L-1) ......
71
Figura 22 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (mx 292 nm) .............................................................................................................
71
Figura 23 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (mx 304nm) .............................................................................................................
72
Figura 24 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (mx 320nm) .............................................................................................................
73
Figura 25 Espectros de fluorescncia de NYS Medley em MeOH (1,05x10-5; 9,2; 7,9; 6,6; 5,3; 3,9; 2,6x10-6 mol.L-1) e de metanol puro ..............
74
Figura 26 Espectros no IV das amostras de NYS Medley (azul) e Cristlia (preto) .................................................................................................
75
Figura 27 Espectros no IV da NYS dos diferentes tipos de cristalizao da NYS A, B e C ......................................................................................
77
Figura 28 Curvas de aquecimento obtidas por DSC para as amostras de NYS Medley (A); Cristlia (B) ...........................................................
78
xxix
Figura 29 Curvas de aquecimento obtidas por TGA da NYS Lotes: NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia. Massas: 3,7mg (Medley) e 3,5mg (Cristlia) .................................................................................
79
Figura 30 Curvas de DTG da NYS Lotes: NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia. Massas: 3,7 mg (Medley) e 3,5 mg (Cristlia) ............................................................................................
80
Figura 31 Estruturas moleculares das formas isomricas interconvertveis do antibitico NYS. A - maior atividade biologica. B - menor atividade biolgica ............................................................................
83
Figura 32 Cromatogramas das duas formulaes (Etapa 1). (A) 80% de PC
e 20% de colesterol e teor de 98,1 0,4% de NYS e (B) 100% de PCH e teor de 90,8 0,1 % de NYS ..................................................
85
Figura 33 Cromatogramas das formulaes com 80 % de PCH e 20 % de Colesterol (Etapa 1). (A): tampo succinato (0,02 mol.L-1), pH 5,6
e 55 C; (B): tampo succinato (0,02 mol.L-1), pH 5,6 e 65 C; (C): tampo Hepes (0,01 mol.L-1), pH 7,4 e 55 C; (D): tampo Hepes (0,01 mol.L-1), pH 7,4 e 65 C .............................................................
86
Figura 34 Cromatogramas das formulaes P1 (PCH 54 %, colesterol 26 % e DSPG 20 %) (A), P2 (PCH 80 %, colesterol 20 %) (B), P3 (PCH 70 %, colesterol 20 % e DSPG 10 %) (C) e P4 (PCH 70 % e DSPG 30 %) (D), respectivamente em tampo succinato (0,02 mol.L-1),
pH 5,6 e 60 C .....................................................................................
91
Figura 35 Distribuio multimodal de tamanho. (A) Preparao lipossomal L1; (B) Preparao lipossomal L2 ....................................................
94
Figura 36 Cromatogramas da NYS presente em formulao lipossomal MLV (L2) sem ultracentrifugar (A) e ultracentrifugada (B). Suspenso em tampo succinato (0,02 mol.L-1); pH 5,6; isotnico. O Pico com tempo de reteno prximo a 3 min o pico do solvente e em cerca de 10 min o da NYS ............................................................................................................
96
Figura 37 Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da
xxx
NYS (C = 9,9 M) nos lipossomas L1 (hidratado a 55 C) e L2 (hidratado a 60 C) aps a adio sucessiva dos agentes supressores iodeto de potssio (A e B) e acrilamida (C e D), a
25 C. As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 ................................................................................................
103
Figura 38 Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) livre em tampo succinato aps a adio sucessiva dos agentes supressores iodeto de potssio (A) e
acrilamida (B) a 25 C. As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 .............................................................
104
Figura 39 Grficos de Stern-Volmer relativos ao estudo da supresso de fluorescncia no estado fixo da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 ..................................................................................
105
Figura 40 Grficos da equao de Stern-Volmer modicada (equao 5) empregada para supresso de fluorescncia combinada dinmica e esttica, no estado fixo, da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 ..................................................................................
107
Figura 41 Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6) para as fraes de acessibilidade ao supressor no estudo da supresso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). ). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 .............................................................................
108
xxxi
Figura 42 Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6) para os estudos da supresso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas, com os supressores iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L-1 .......................................
109
_____________________________________________________________________Introduo
1
1.INTRODUO
_____________________________________________________________________Introduo
2
_____________________________________________________________________Introduo
3
Durante muitos anos a teraputica de micoses especialmente de micoses profundas, encontrava dificuldades devido ao fato dos fungos serem clulas
eucariticas que parasitam hospedeiros com clulas da mesma natureza. Assim, as
diferenas citolgicas entre o parasito e o hospedeiro so pequenas e os frmacos que
interferem no metabolismo daqueles habitualmente agem no metabolismo dos ltimos
(TAVARES, 1984).
A Nistatina (NYS) (C47H75NO17) ou fungicidina (massa molar 926,13 g/mol) um antibitico extrado principalmente de culturas de Streptomyces Nursei. Este composto
foi isolado em 1950 por Hazen e Brown da diviso de laboratrios e pesquisa do
departamento de sade do Estado de Nova York, Estados Unidos da Amrica
(MICHEL, 1972). Apresenta em sua estrutura uma lactona macrocclica (Figura 1),
consistindo de dieno tetraeno hidroxilado ligado a um ou dois grupamentos amino
acar. Devido presena de grupos carboxil e amino, a NYS anfotrica e tambm
anfiflica, pois possui uma estremidade polar e outra apolar em sua molcula (Figura 1).
A NYS pouco solvel na gua e solventes orgnicos, mas solvel em
dimetilformamida e dimetilsulfxido.
A NYS comercial representa uma mistura de compostos intimamente
relacionados. Segundo POROWSKA e col. (1972) que caracterizaram amostras de NYS
comercial, o frmaco na verdade um complexo contendo trs constituintes
biologicamente ativos, designados como NYS A1, A2 e A3 (MICHEL, 1972 &
POROWSKA e col., 1972). O principal componente do complexo o componente A1,
que apresenta em sua estrutura um amino acar, a D - micosamina ligada ao oxignio
do carbono 19 (RICKARDS & CHONG, 1970; MANWARING & RICKARDS, 1969;
BOROWSKI e col., 1971). A NYS A2 (figura 1) mostra uma estrutura muito semelhante
a A1. As diferenas esto na aglicona do antibitico, nas variaes na estereoqumica
dos grupamentos hidroxilas que carecem de uma hidroxila no carbono 10 do macrociclo
e na posio da carboxila o carbono 15. J o componente A3 possui mudanas na
estereoqumica dos grupos hidroxilas e tem um outro radical acar, a L-digitoxose,
ligada ao carbono 35 (ZIELINSKY e col., 1979; ZIELINSKY e col., 1987) (Figura1).
_____________________________________________________________________Introduo
4
Todavia A3 tem o mesmo amino acar presente nos outros dois componentes. Os
compostos A1 e A2 foram identificados por SHENIN e col., (1993) que analisaram
amostras de NYS grau farmacutico. Todavia, a designao da estrutura do
componente A2 do complexo NYS foi realizada por PAWLAK e col., (2005). A
complexidade da composio do composto NYS devida a sua obteno atravs de
processo fermentativo, onde os trs componentes so produzidos.
Nistatina A1
Nistatina A2
Nistatina A3
Figura 1. Estruturas moleculares de NYSS A1, A2 e A3 (Borowski e col., 1971; Zielinsky e col., 1987; Pawlak e col., 2005).
_____________________________________________________________________Introduo
5
A NYS membro de um grupo relativamente grande de compostos
estruturalmente relacionados, altamente insaturados, chamados antibiticos
antifngicos polinicos. Entre os quimioterpicos antifngicos, os antibiticos so muito
eficazes na teraputica de micoses profundas. Essa classe de compostos altera a
permeabilidade da membrana de clulas sensveis, como as clulas fngicas. A NYS
ativa frente a diversas espcies de fungos dos gneros Candida, Cryptococcus,
Aspergillus, Histoplasma, Blastomyces y Coccidioides. Contudo, os polinicos no tm
ao em clulas de protozorios, bactrias, exceto para Acholeplasma crescido na
presena de esterol, assim como contra algas azul-verdes (GALE e col., 1972).
Na prtica clnica, a NYS utilizada no tratamento da candidases superficiais de
pele e mucosas (esofgica, intestinal e vaginal). O antibitico praticamente no
absorvido por via oral, entretanto devido a sua ao superficial local, administrado
oralmente em casos de candidase bucal e intestinal (WASAN e col., 1996). Contra a
candidase vaginal empregada sob a forma de vulos e na cutnea e periungueal sob
a forma de cremes, pomadas e loes (TAVARES, 1984). Quando administrada por via
intramuscular e intravenosa muito txica, sendo capaz de causar hemlise, necrose e
abscessos frios nos locais de injeo. Isto se deve imediata ligao do frmaco aos
esteris das membranas das hemcias e clulas tissulares, causando sua destruio
(HIEMENZ & WALSH, 1996).
A NYS tem estrutura molecular similar da Anfotericina B (AnfB) mas, em alguns
casos, mostra um espectro de ao antifngica in vitro mais amplo do que esta ltima,
pois atua em fungos AnfB resistentes (GROLL e col., 1999). Entretanto, a NYS e a AnfB
apresentam problemas de pouca solubilidade em gua e de grande toxicidade para os
pacientes, quando administradas intravenosamente, como nefrotoxicidade,
tromboflebite, febre, calafrios e nuseas. Em funo disso, tem-se evitado a aplicao
parenteral da NYS (MORIBE & MARUYAMA, 2002; MORIBE & MARUYAMA, 2000).
Desde que a NYS mostra propriedades farmacolgicas diferentes daquelas da AnfB, ou
seja, maior ao sobre leveduras e alguns casos tem um espectro de ao maior do
que a AnfB, desejvel o desenvolvimento de formulao para a administrao
_____________________________________________________________________Introduo
6
intravenosa da NYS, j que se dispe no mercado farmacutico uma preparao
lipossomal de AnfB, comercializada sob o nome AMBISOME (marca registrada da
NeXstar Pharmaceuticals, Inc.) e distribuda no Brasil pela empresa United Medical.
A cincia e tecnologia envolvida na obteno de novos frmacos, sejam os
mesmos, sintticos ou de fontes naturais, tiveram grande desenvolvimento nas dcadas
de 40 e 50 e continuam, de forma desacelerada, a evoluir. A partir da dcada de 80,
molculas com efeitos teraputicos, tm sido enriquecidas por produtos obtidos pela
aplicao de processos biotecnolgicos, que utilizam princpios da engenharia gentica,
tais como fermentaes com microrganismos geneticamente modificados e cultura de
clulas de mamferos (GOMES & REIS, 2001). Mais recentemente no cenrio mundial,
tm-se observado que companhias farmacuticas pioneiras tm deixado de
comercializar novos frmacos sintticos para produzir produtos genricos, conforme
tem expirado suas patentes (http://www.sbqrio.sbq.org.br/download/set1801.pdf). Este
cenrio cria a necessidade de apresentar frmacos clssicos sob novas formas, que
podem ser novos sistemas de entrega (TYLE, 1988). Outra questo, que o
desenvolvimento de novos frmacos est relacionado aos altos custos, principalmente
em rotas sintticas e ainda se observa que pouca inovao ocorreu em relao ao
surgimento de novas formas farmacuticas mais eficientes na entrega do frmaco aos
stios de ao, registrando-se efeitos colaterais indesejveis e danos ao organismo do
paciente. Vrios frmacos empregados na teraputica, devido ao alto grau de
toxicidade, exigem que a quantidade a ser administrada seja a menor possvel, para
no causar danos aos tecidos sadios e, ao mesmo tempo, seja suficiente para atingir as
clulas alvo, aps ser absorvido e distribudo no organismo.
Teoricamente, um dos objetivos bsicos da qumica teraputica entregar a
substncia medicinal especfica e eficientemente ao local da doena ou distrbio. Em
geral isto pode ser conseguido pela administrao do frmaco por via oral (em forma de
cpsulas, comprimidos, suspenses, solues, entre outras.), nasal, transdrmica
(tpica), intramuscular, endovenosa, subcutnea, entre outras. Em muitos casos,
entretanto, a eficcia do frmaco pode ser melhorada, e os efeitos colaterais reduzidos,
_____________________________________________________________________Introduo
7
encapsulando-o em algum tipo de transportador. Idealmente, este dever vetorizar o
frmaco em concentrao adequada e apenas no local onde o mesmo necessrio,
evitando a sua perda, degradao e a ocorrncia de efeitos colaterais indesejveis
(PRISTA e col., 1996).
Os lipossomas so vesculas lipdicas, onde uma fase aquosa totalmente
cercada por uma ou mais lamelas (bicamadas de fosfolipdios), constituindo, ao lado de
aerossis, hidrogis, micro/nanopartculas polimricas, "patches" um dos sistemas mais
importantes para encapsulao e liberao sustentada de frmacos in vivo. Eles podem
encapsular ingredientes hidroflicos, hidrofbicos ou anfiflicos. Drogas hidroflicas tm
tendncia a permanecer no compartimento central aquoso e drogas
hidrofbicas/anfiflicas encontram-se inseridas na bicamada lipdica (Figura 2). As
drogas lipoflicas permanecem mais tempo encapsuladas devido ao alto
particionamento na fase membranar (SHARATA, 1996).
Figura 2. Direcionamento da encapsulao de frmacos em lipossoma multilamelar (MLV): molculas hidrossolveis, lipossolveis e anfipticas.(Arajo e col,2003).
Os sistemas lipossomais tm sido testados com sucesso como transportadores
_____________________________________________________________________Introduo
8
de diversos frmacos, material gentico e enzimas para o interior de clulas. So
atxicos, pouco imunognicos, biodegradveis e capazes de proteger os compostos
encapsulados da diluio e degradao no sangue, de forma que quando alcanam os
tecidos que necessitam de tratamento podem liberar doses concentradas de frmaco
aumentando sua ao teraputica. Entretanto, ao circularem na corrente sangunea, os
lipossomas funcionam como corpos estranhos, sendo rapidamente atacados pelos
macrfagos que, assim, passam a transportar os frmacos veiculados nos lipossomas.
Compostos antimicrobianos lipossomados podem penetrar em clulas do sistema
mononuclear fagocitrio onde microrganismos patognicos residem, causando a morte
do agente microbiano (PRISTA e Col., 1996 & LASIC, 1993). O tamanho dos
lipossomas determina o grau de reconhecimento pelo Sistema Mononuclear Fagocitrio
(SMF) e determina a velocidade de retirada dos mesmos da circulao sangunea.
Para uso humano, os sistemas lipossomais tm sido empregados para reduzir a
toxicidade clnica sistmica de frmacos aumentando, assim, a eficcia teraputica de
agentes antimicrobianos, antineoplsicos e outros (TORCHILIN, 2005). OFFNER e col., (2004) avaliaram a atividade e segurana da nistatina lipossomal, numa dose de 4
mg/kg, em pacientes com aspergilose invasiva refratria ou intolerante a AnfB, estes
pesquisadores verificaram que a NYS lipossomal foi efetiva contra a aspergilose
invasiva, todavia alguns efeitos adversos observados para a AnfB, tambm foram para
a NYS lipossomal, como: tremores calafrios, febre, hipo ou hipertenso e taquicardia .
Outros autores, tambm comprovaram que a NYS incorporada em lipossomas, nas
doses de 2 a 6 mg/kg, demonstrou significante reduo da toxicidade enquanto que a
atividade antifngica foi preservada (CARRILLO-MUNOZ e col., 1999; GROLL e col.,
1999; JOHNSON e col., 1998; MEHTA e col., 1987; OAKLEY e col., 1999). A utilidade
de formulaes lipossomais em clnica mdica comprovada pela aprovao da
agncia controladora norte-americana, "Food and Drug Administration" (FDA), de
formulaes lipossomais para entrega de algumas substncias com atividade
antineoplsica (DOXIL com doxorrubicina e DAUNOSOME com daunorrubicina) e
antifngica (AMBISOME com Anfotericina B), j comercializadas em vrias partes do
mundo.
_____________________________________________________________________Introduo
9
Uma formulao lipossomal de NYS (NYOTRAN) foi preparada pela Aronex
Pharmaceuticals, com boa atividade em ratos. A referida formulao j se encontra em
aplicao clnica e para obteno da nistatina lipossomal os autores utilizaram os
lipdios Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e Dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) em
uma razo mssica de 7:3. A formulao apresenta tamanho de partculas que variam
de 0,1 a 3 M porm as propriedades fsicas da formulao ainda no esto bem compreendidas (MEHTA e col., 1987, TORCHILIN, 2005). Sendo assim, plenamente
justificado um trabalho no sentido de preparar e caracterizar formulaes lipossomais
contendo NYS.
Os sistemas lipossomais podem ser estudados em relao a fatores como
eficincia de encapsulao, tamanho, teor de fosfolipdios na formulao, entre outros.
Na caracterizao desses sistemas podem ser utilizadas vrias tcnicas analticas
como espectroscopia (de absoro UV/Vis, de emisso, IV e RMN), espalhamento de
luz, calorimetria diferencial de varredura (DSC), Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (CLAE). preciso, tambm, avaliar a atividade dos lipossomas em sistemas
biolgicos in vitro e in vivo.
_____________________________________________________________________Introduo
10
______________________________________________________________________Objetivos
11
2.OBJETIVOS
______________________________________________________________________Objetivos
12
______________________________________________________________________Objetivos
13
Os objetivos deste trabalho foram:
1) desenvolver e otimizar formulaes lipossomais contendo o frmaco NYS;
2) selecionar formulaes em que o frmaco apresentasse maior estabilidade
qumica;
3) caracterizar as formulaes lipossomais de NYS fsico-quimicamente;
4) testar a atividade in vitro das formulaes lipossomais contendo NYS.
______________________________________________________________________Objetivos
14
____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica
15
3.REVISO BIBLIOGRFICA
____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica
16
____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica
17
3.1.Fungos
Fungos (do latim fungus = cogumelo) so seres eucariticos, com um s ncleo,
como as leveduras, ou multinucleados, como os fungos filamentosos ou bolores. As
clulas de fungos podem apresentar uma membrana citoplasmtica, que mais
externamente, apresentam uma parede celular que reveste o citoplasma e organelas
dispersas. So tambm revestidas por membranas semelhantes o retculo
endoplasmtico, aparelho de Golgi, ribossomos, mitocndrias, vacolos, ncleo e
nuclolo. As membranas celulares fngicas contm esteris, assemelhando-se s
membranas de organismos superiores, como as dos mamferos. As clulas fngicas
possuem vida independente e no se organizam em tecidos e os componentes
principais da parede celular so hexoses e hexosaminas. Alguns fungos apresentam
parede rica em quitina (N-acetil glicosamina). Outros possuem complexos de
polissacardeos e protenas, com predominncia de cistena. Fungos do gnero
Cryptococcus, como o Cryptococcus neoformans, apresentam cpsula de natureza
polissacardica que envolve a parede celular (TORTORA e col., 1993).
Os fungos constituem um grupo de organismos que no possuem clorofila e so
ditos hetertrofos por absoro, pois suas hifas, no caso de fungos filamentosos
(filamentos tubulares), crescem penetrando os substratos orgnicos e neles lanando
suas enzimas digestivas. Os produtos finais solveis, resultantes da digesto, so lenta
e continuamente absorvidos. A gua utilizada na solubilizao das enzimas e
indispensvel na ao das mesmas. Desta forma, justifica-se o bom desenvolvimento
dos fungos em ambientes midos (PELCZAR e col., 1996). Para seu desenvolvimento,
esses organismos exigem sempre uma fonte de carbono, que ser utilizada como
material energtico. Necessitam ainda de fontes de nitrognio, que podem ser
inorgnica (NO3- e NH4+) ou orgnica (aminocidos, polipeptdeos e protenas). s
vezes, certas substncias como aminocidos, podem funcionar como fontes de carbono
e nitrognio. Os fungos podem ser saprobiticos (ou saprfitas) e parasitas (facultativos
ou obrigatrios), conforme vivam de fontes de alimentos existentes livres ou em
hospedeiros (PELCZAR e col., 1980).
____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica
18
Dependendo da forma como os fungos se desenvolvem em meios de cultura,
pode-se classific-los em leveduriforme e filamentosos. As colnias leveduriformes so
pastosas ou cremosas, formadas por microrganismos unicelulares ovais ou esfricos,
geralmente com largura de 1 a 5 m e comprimento de 5 a 30 m, chamados
leveduras. Esses microrganismos cumprem funes vegetativas (de crescimento) e
reprodutivas. As colnias filamentosas podem ser algodonosas, aveludadas ou
pulverulentas; so constitudas fundamentalmente por elementos multicelulares em
forma de tubo, as hifas (do grego hyphe= teia). Essas estruturas so filamentos
tubulares ramificados com cerca de 2 a 10 m de largura, podendo ser contnuas ou
septadas. As no-septadas, tambm denominadas cenocticas, so multinucleadas. J
as septadas podem ser: mono e multinucleadas (Fig. 3). As hifas septadas tm um
septo que divide os filamentos em clulas distintas. Entre essas clulas ocorre migrao
do citoplasma e ncleos por poros existentes em cada septo (TORTORA e col., 1993,
PELCZAR e col, 1980).
Figura 3. Ilustraes de hifas septadas mononucleadas, multinucleadas e no septadas multicleadas, presentes em de fungos filamentosos (Pelczar e col., 1980).
As hifas crescem pelo alongamento de suas pontas (crescimento apical) e pela
____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica
19
produo de ramificaes laterais. Em geral, as hifas formam um conjunto de estruturas
tubulares microscpicas, junto ao substrato (fonte de alimento), chamada de miclio
vegetativo (ALEXOPOULOS e col., 1996). J outras hifas, relacionadas reproduo,
correspondem ao miclio reprodutivo ou areo. O miclio areo se projeta na superfcie
e cresce acima do meio de cultura. Quando o miclio areo se diferencia por apresentar
clulas reprodutivas ou esporos (propgulos), constitui o miclio reprodutivo. Este
cresce em contato com o ar e dissemina os esporos produzidos. Outras hifas podem
organizar-se em estruturas grandes para formar fungos corpulentos, como cogumelos,
por exemplo: bufa-de-lobo e orelha-de-pau (TORTORA e col., 1993; PELCZAR e col.,
1996).
A reproduo ocorre por formao de esporos. Os esporos so classificados,
segundo sua origem, em sexuados e assexuados. Embora o miclio vegetativo no
tenha especificamente funes de reproduo, alguns fragmentos de hifa podem se
desprender do miclio vegetativo e cumprir funes de propagao, uma vez que as
clulas fngicas so autnomas. Os esporos assexuais so produzidos por um fungo
individual atravs de mitose e consecutiva diviso celular. Entre os esporos assexuados
podem ser citados os clamidsporos, artrsporos, blastsporos, esporangisporos e
conidisporos (PELCZAR e col., 1980).
Os clamidsporos (Fig. 4) tm funo de resistncia, semelhante dos esporos
bacterianos. So clulas, geralmente arredondadas, de volume aumentado, com
paredes duplas e espessas que limitam o citoplasma. Sua localizao no miclio pode
ser apical (terminal) ou intercalar. Esses esporos se formam em condies ambientais
adversas, como escassez de nutrientes, de gua e temperaturas no favorveis ao
desenvolvimento fngico. Um fungo que produz clamidsporo a Candida albicans
(TORTORA e col., 1993).
____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica
20
Figura 4. Ilustrao de hifa com esporo assexuado do tipo clamidsporo de fungos filamentosos ( Pelczar e col., 1980).
Os artrsporos (Fig. 5) so formados por fragmentao das hifas septadas em
segmentos retangulares. So encontrados nos fungos do gnero Geotrichum,
Coccidioides immitis e em dermatfitos (TORTORA e col., 1993).
Figura 5. Ilustrao de esporo assexuado do tipo artrsporo de fungo do gnero Geotrichum (SwateK, 1967).
Os blastsporos, tambm denominados gmulas, so comuns nas leveduras e
se derivam por brotamento da clula-me. Em alguns casos, os blastsporos
permanecem ligados clula-me, formando cadeias, as pseudo-hifas, cujo conjunto
o pseudomiclio, como se pode visualizar na Fig. 6 (TORTORA e col., 1993).
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Figura 6. Ilustrao de esporo assexuado do tipo blastsporo (Alexopoulos e col., 1996). Os esporangisporos (Fig. 7) so formados no interior de uma espcie de saco
(esporngio), situado ao final de hifas areas denominadas esporangiforo. A liberao
dos esporos se realiza pela clivagem do citoplasma dos esporngios. Esse tipo de
esporo produzido pelo gnero Rhizopus (TORTORA e col., 1993).
Figura 7. Ilustrao de esporo assexuado do tipo esporangisporo (Pelczar e col., 1980). Um quinto tipo de esporo assexual o conidisporo ou condios. Os
conidisporos se formam em cadeias ao final dos conidiforos, que nada mais so do
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que ramificaes das hifas. Dependendo de suas caractersticas morfolgicas, podem
ser classificados em micro e macrocondios (PELCZAR e col., 1980). Na Fig. 8A
visualizamos-se os condios agrupados do gnero Aspergillus e na 8B os condios de
Aspergillus fumigatus
A
B
Figura 8: Cultura, em gar, de Aspergillus fumigatus (imagem esquerda) e Condios de Aspergillus fumigatus (imagem central e direita) (A). Ilustrao de Condios de Aspergillus agrupados em forma de cabea, ao redor de uma vescula (B) (http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_microorg/fungos.htm e Alexopoulos e col., 1996).
No aparelho de conidiao ou produtor de condios (esporos) do gnero
Aspergillus, os condios formam cadeias sobre filides, estruturas no formato de
garrafa, em torno de uma vescula que uma dilatao na extremidade do conidiforo
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(Fig. 8).
Outros gneros, como o Penicillium, apresentam um aparelho de conidiao
onde os conidiforos se ramificam e no se verifica a presena de vescula. Como no
caso do gnero Aspergillus, os condios formam cadeias que se distribuem sobre as
filides (Fig. 9).
Figura 9. Ilustrao de Condios de Penicillum agrupados em forma de pincel(Alexopoulos e col., 1996) Os esporos sexuados fngicos so os resultados do processo de reproduo sexual meitico, que compreende as fases: 1) um ncleo haplide (metade dos
cromossomos da espcie) de uma clula doadora (macho) penetra no citoplasma de
uma clula receptora (fmea); 2) os ncleos macho e fmea se fundem para formar um
ncleo diplide; 3) atravs de meiose, o ncleo diplide d surgimento a quatro ncleos
haplides (PELCZAR e col., 1980). ALEXOPOULOS e col., (1996) postularam que a
reproduo sexual em muitos fungos envolve a formao de esporos especializados.
Os quatro tipos que tm sido observados so osporos, zigsporo, ascsporo e
basidisporo.
Os fungos produzem esporos sexuais com menos freqncia que os assexuais e
s se reproduzem por processo sexual em determinadas condies, como em casos de
variaes de umidade, temperatura e disponibilidade de nutrientes (PELCZAR e col.,
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1980).
3.2.Dimorfismo fngico Alguns fungos e especialmente alguns patognicos apresentam dimorfismo, ou
seja, duas formas de crescimento: filamentosa e leveduriforme, como ilustrado na Fig.
10 (PELCZAR e col., 1996).
Figura 10. Fotos de Candida albicans crescendo na forma filamentosa ( esquerda) e na forma de levedura (no centro e direita) (Pelczar e col., 1996).
Os fungos dimrficos podem ter morfologia diferente, conforme as condies
nutricionais e a temperatura de seu meio de desenvolvimento. Esse fenmeno de
variao morfolgica, muito importante em micologia mdica se expressa por um
crescimento micelial entre 22 C e 28 C e leveduriforme entre 35 C e 37 C. Em geral,
as formas so reversveis. A fase micelial ou saproftica a forma infectante e est
presente no solo e nas plantas. A fase leveduriforme ou parasitaria encontrada nos
tecidos. O fenmeno de dimorfismo fngico se observa entre os fungos de importncia
mdica, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides
brasiliensis, Sporothrix schenckii. Na Candida albicans, a forma saproftica infectante
a leveduriforme e a forma parasitria, isolada dos tecidos, a micelial. Em laboratrio,
possvel reproduzir o dimorfismo mediante variaes de temperatura de incubao, de
tenso de O2 e de meios de cultura especficos (PELCZAR e col., 1980)
Ainda que o pH mais favorvel ao desenvolvimento dos fungos esteja entre 4 e
7, a maioria dos fungos tolera amplas variaes de pH (ALEXOPOULOS e col., 1996).
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Os fungos filamentosos podem crescer em meio cujo pH est entre 1,5 e 11, mas as
leveduras toleram pouco o meio alcalino e se desenvolvem bem em meios com pH
ajustados 3,5 e 3,8. Em geral os limites de tolerncia de pH para leveduras de 2,2 e
8,0, de acordo com as diversas espcies (PELCZAR e col., 1980).
O crescimento de fungos mais lento que o das bactrias e suas culturas
precisam, em mdia, de 7 a 15 dias, ou mais, de incubao. Com a finalidade de evitar
o desenvolvimento bacteriano que pode inibir ou se sobrepor ao do fungo, necessrio
incorporar, aos meios de cultura, agentes antibacterianos de largo espectro, como o
cloranfenicol. Tambm se pode acrescentar cicloheximida, para diminuir o crescimento
de fungos saprfitas contaminantes de culturas de fungos patognicos (ZAITZ C. e col.,
1998).
Muitas espcies fngicas exigem luz para seu desenvolvimento, outras so por
ela inibidos e outras ainda mostram-se indiferentes a esse agente. Em geral, a luz solar
direta, devido radiao ultravioleta, elemento fungicida (ALEXOPOULOS e col.,
1996).
Por diferentes processos, os fungos podem elaborar vrios metablitos, como
antibiticos, como a penicilina (Penicillium chrysogenum) e as cefalosporinas
(Cephalosporium acremonium); agentes imunossupressores como a ciclosporina
(Cylindrocarpon lucidum e Tolypocladium inflatum); lcoois (etanol saccharomyces
cerevisae); cidos orgnicos (cido ctrico (Aspergillus niger)), enzimas (amilase,
celulase, lpase e pectinase (Aspergillus niger)) e micotoxinas, como aflatoxinas
(Aspergillus flavus e A. parasiticus) que confere aos fungos, um importante papel nas
reas: farmacutica, agrcola e alimentcia (ALEXOPOULOS e col., 1996, PELCZAR e
col., 1980).
3.3.Infeces fngicas
As infeces fngicas so denominadas micoses e so classificadas,
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geralmente, como micoses superficiais e sistmicas. As micoses superficiais localizam-
se nas camadas superficiais da pele e seus anexos, bem como nas mucosas e zonas
cutneo-mucosas. As micoses superficiais podem ser subdivididas em cutneas e
subcutneas. J as infeces sistmicas ou profundas afetam os tecidos e rgos de
indivduos imunodeprimidos (RANG e col., 2004; LACAZ e col., 2002).
Existem condies ambientais, hbitos e condies de sade humanas que
favorecem o desenvolvimento de micoses superficiais e sistmicas. Com relao s
micoses superficiais, os fatores que favorecem seu desenvolvimento so calor e
umidade ambiente, uso de roupas e sapatos impermeveis (botas de borracha, tnis,
roupas de nylon), deficincias nutricionais (avitaminoses, anemia, desnutrio),
transpirao abundante e presena de feridas e machucados na pele. No caso das
micoses sistmicas, como o principal mecanismo de proteo do hospedeiro ao fungo
a resposta imunolgica celular, as doenas imunossupressivas que diminuem a ao
dos linfcitos T predispem o hospedeiro a infeces fngicas oportunistas; portanto,
so considerados suscetveis a infeces oportunistas indivduos infectados pelo vrus
HIV, ps-transplantados, neutropnicos, com neoplasias, alm daqueles
imunodeprimidos por drogas ou outras patologias (LAZZARINI e col., 1999).
As micoses so produzidas por diversos tipos de fungos, de diferentes gneros e
espcies. Alguns afetam tecidos queratinizados como cabelos, unhas, plos e o extrato
crneo da epiderme, produzindo as dermatomicoses (micoses superficiais), tambm
chamadas Tinhas. Os agentes etiolgicos responsveis pelas dermatomicoses so
principalmente os gneros de fungos filamentosos Tricoppytum, Microsporum e
Epidermophyton, que apresentam diferenas morfolgicas relativas ao nmero de
macro e microcondios, as estruturas responsveis pela reproduo assexuada dos
fungos (Fig. 11) (MAZN e col., 1997; RUBIO e col., 1999).
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Figura 11.Caractersticas dos diferentes gneros de fungos filamentosos e septados, principais causadores de dermatomicoses ([http://ib.ufpel.edu.br/dermatomicose.pdf).
As dermatomicoses promovem descamaes e ulceraes da pele, placas de
calvcie, infeces da bainha de plos e unhas. Na Fig. 12, visualiza-se a onicomicose
provocada pelo dermatfito Trichophyton rubrum.
Figura 12. Onicomicose por Trichophyton rubrum([http://ib.ufpel.edu.br/dermatomicose.pdf).
As micoses sistmicas so produzidas por fungos patognicos capazes de
invadir rgos e tecidos sadios, se multiplicar e provocar dano tecidual. Os fungos ditos
patognicos pertencem s espcies Histoplasma capsulatum, Coccidiodes imitis,
Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomices dermatitides e Esporotrix schenkii. Todavia,
fungos oportunistas, que normalmente so incuos para indivduos imunocompetentes,
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podem promover micoses severas. Entre eles citam-se: Candida albicans e espcies
no albicans to ou mais freqentes, especialmente a Candida tropicalis, Candida
parapsilosis, Cndida glabrata e Candida krusei; e outras espcies; Aspergillus
fumigatus, Cryptococus neoformans, Fusarium sp.(ZAITZ e col., 1998).
H tempos, infeces superficiais graves por fungos eram relativamente raras e
as sistmicas ainda mais. Nos ltimos 35 anos, houve um aumento uniforme na
incidncia de infeces fngicas sistmicas secundrias graves. Os fatores envolvidos
nesse aumento tem sido o uso disseminado de antibiticos de amplo espectro, a
presena de indivduos com reduo da resposta imune devido AIDS (Sndrome da
Imuno Deficincia Adquirida) ou ao de agentes imunossupressores ou frmacos
utilizados na quimioterapia do cncer. Estes fatores levaram a um aumento na
prevalncia de infeces oportunistas (http://www.cumc.columbia.edu/research/Faculty
_Profiles/profiles/mitchell_ap.htm). No Brasil, as doenas sistmicas mais comuns so:
candidase sistmica, criptococose e histoplasmose, sendo o Cryptococcus neoformans
o agente que infecta 10% dos pacientes com AIDS, causando meningite. A infeco
pela referida espcie fngica ainda no tem tratamento eficaz; logo, apresenta altos
ndices de mortalidade
(http://caibco.ucv.ve/caibco/CAIBCO/Vitae/VitaeOcho/Articulos/Micologia/ArchivosPDF/
Micologia.PDF; http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/guia bolso 5ed2.pdf.
No panorama internacional, verifica-se que a sepse fngica vem se tornando
freqente nas unidades de terapia intensiva peditrica e neonatal. Entre os agentes
etiolgicos identificados encontram-se a Candida spp., Aspergillus spp. e Fusarium spp.
A taxa de mortalidade elevada e varia de 15% a 50% (LEIBOVITZ, 2002). Novos
antifngicos esto sendo empregados, como novos compostos triazlicos, o voriconazol
e o acetato de caspofungina (equinocandina). A caspofungina um antifngico
lipopeptdico que inibe a enzima -1-3-D-glucano sintetase, envolvida na sntese de
polissacardeo vital para a formao da parede celular de fungos filamentosos e
leveduras e no presente em clulas de mamferos (ARKADER e CARVALHO, 2006).
No entanto, o emprego de antifngicos mais antigos em carreadores de frmacos como
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os lipossomas devem ser mais uma opo no combate s micoses sistmicas.
3.4.Antibiticos antifngicos polinicos Os antibiticos polinicos constituem um grupo de substncias ativas contra os
fungos. Apresentam ao fungisttica e fungicida sobre organismos sensveis. Contudo,
so substncias txicas para o homem e outros mamferos, por provocarem leses
celulares. O mecanismo de ao destes polinicos envolve a interao do frmaco com
esteris existentes na membrana do microrganismo (TAVARES, 1984). Os antibiticos
antifngicos so compostos amplamente usados no tratamento de infeces fngicas
tpicas e invasivas em humanos (ZOTCHEV, 2003). A principal vantagem dos
polinicos sobre outros frmacos antifngicos, como azis e flucitozinas, a ao
fungicida e a baixa incidncia de patgenos resistentes. As aes fungicidas dos
antibiticos macroldeos dependem estritamente da presena de esteris na membrana
das clulas sensveis (BOLARD, 1986).
Mecanismo de ao
O mecanismo de ao da NYS e de outros antibiticos polinicos caracteriza-se
pela sua ligao ao ergosterol presente na membrana citoplasmtica de fungos
sensveis, resultando em alteraes na permeabilidade da membrana pela formao de
poros intramembranares, ocasionando perda dos componentes vitais intracelulares, tais
como ons e pequenas molculas, resultando na morte celular (Fig. 13) (LEIBOVITZ,
2002). Em geral, os antibiticos polinicos tm maior afinidade pelo esterol fngico, o
ergosterol, do que o das clulas de mamferos, o colesterol, pois o ergosterol possui
uma estrutura mais rgida que o colesterol (FRANZINI, 2006). Sendo assim, os
antibiticos polinicos so menos txicos para as clulas de mamferos (MICHEL, 1972;
NG e WASAN, 2003).
A estrutura dos poros formados pela nistatina em membranas ricas em ergosterol
no est clara. (HELRICH e col., 2006). Contudo, COUTINHO A. e col., (2004)
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declaram que a partir de estudos espectroscopia de fluorescncia, realizadas em
lipossomas, LUV (Vesculas Unilamelar grande), contendo ergosterol e POPC (1-
palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina) e a nistatina, o frmaco pode apresentar
duas fases distintas em seu modo de ao. Na primeira fase, molculas do antibitico
se ligam superfcie da bicamada lipdica (Nistatina monomrica) e numa fase posterior
quando o nmero mdio de molculas atinge um valor crtico de 100
molculas/lipossoma acorre formao de agregados moleculares (oligmeros) que
passam ao modelo clssico de nistatina transmembrana, ocorrendo a formao dos
poros.
Figura 13. Representao esquemtica de poro formado pela NYS em uma membrana celular(Adaptado de Lasic, 1993). A ausncia de ergosterol nas membranas de bactrias pode explicar porque esse
antibitico no capaz de afetar o crescimento daqueles microrganismos.
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3.5.Lipossomas Os lipossomas so estruturas lamelares constitudas por sistemas lipdio:gua e
foram descritas em meados dos anos 60 do sculo XX, por BANGHAM e col que
estudaram a hidratao de filmes lipdicos depositados nas paredes de frascos de vidro.
Os referidos pesquisadores observaram que as molculas do lipdio se organizavam em
bicamadas formando estruturas vesiculares microscpicas, que posteriormente, foram
denominadas genericamente lipossomas por SESSA e WEISSMANN, que mostraram
que estas vesculas, em seu interior encerravam um compartimento aquoso (SANTOS e
CASTANHO, 2002). Na realidade, essas estruturas se formam espontaneamente
quando os lipdios (especialmente fosfolipdios) so dispersos em meio aquoso,
originando uma populao de vesculas esfricas com dimenses coloidais (cujo
dimetro pode variar de 0,02m a 100m) limitadas por duas ou mais camadas lipdicas, cuja espessura , aproximadamente, de 4nm. Os lipossomas ganharam
bastante popularidade como modelos para estudos sobre propriedades de membranas
celulares (SANTOS & CASTANHO, 2002; PAPAHADJOPOULOS & WATKINS, 1967) e,
mais recentemente como carreadores de frmaco (TORCHILIN, 2005).
Os lipdios empregados no preparo dos lipossomas so substncias anfiflicas,
caracterizadas por apresentarem grupamentos hidroflico e hidrofbico na mesma
molcula. Os referidos lipdios so compostos por duas cadeias hidrocarbnicas,
tambm denominadas caudas hidrofficas, ligadas a um grupo hidroflico, comumente,
denominado como cabea polar. Os lipdios que contenham grupo fosfato na cabea
polar so chamados fosfolpidios e constituem a principal classe de lipdios das
membranas biolgicas. Na Fig. 14, so apresentadas as frmulas estruturais
moleculares de trs fosfolipdios utilizados no presente trabalho, alm do colesterol.
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32
DPPC
DSPC
DSPG
Colesterol Figura 14. Frmulas estruturais moleculares dos fosfolipdios 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3- fosfatidilcolina (DSPC), 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC), 1,2-Di- estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol (DSPG) e do colesterol (www.avantilipids.com).
Alm do grupo fosfato, a frao polar do fosfolipdio, pode conter os grupos
cabea: etanolamina, colina, glicerol e inositol, encontrados em fosfolipdios de
membranas biolgicas, como mostra a Figura 15. As cabeas polares podem ser
carregadas (positiva ou negativamente) e zwitterinicas (carga lquida nula), dependo
das cargas dos grupos cabea e fosfato.
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Figura 15 Grupos cabea de fosfolipdios encontrados em membranas biolgicas (Adaptado de New, 1990)
Em geral, as molculas de fosfolipdios so insolveis em gua e nesse meio
formam estruturas agregadas decorrentes da organizao das molculas. A parte
hidroflica do fosfolipdio ser seletivamente hidratada e as cadeias hidrocarbnicas
hidrofbicas preferem ficarem escondidas no interior da estrutura formada, ou seja,
minimiza-se contato com meio aquoso. As molculas de fosfolipdios se mantm juntas,
lado a lado formando folhetos separados por compartimentos aquosos. Dependendo
da concentrao, da estrutura molecular dos lipdios, da temperatura, do teor de gua
no meio, pH e fora inica, pode se ter diferentes estruturas agregadas, como as
bicamadas lipdicas (lamelas) que se unem para formar um folheto bidimensional ou
folheto que se dobra entre si formando uma esfera, denominada lipossoma (LASIC,
1993). Esquemas da seco transversal de um lipossoma e de uma bicamada lipdica
podem ser observados na Fig. 16.
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A B
Figura 16. Seco transversal (A) de um lipossoma e (B) de uma bicamada lipdica.
Dependendo do nmero de lamelas contidas nos lipossomas, estes podem ser
classificados em multilamelares, MLV (vrias lamelas separadas por compartimentos
aquosos) ou unilamelares com uma nica lamela. Os lipossomas unilamelares podem
ser classificados pelo tamanho; grandes e pequenos (LUV) e (SUV), respectivamente.
Na Tabela 1, tem-se a classificao de lipossomas de acordo com seus parmetros
estruturais (tamanho e nmero de lamelas) (BERENHOLZ e CROMMELIN, 1994).
Tabela 1 Classificao de lipossomas, baseada em parmetros estruturais.
Classificao do Lipossoma Tamannho
MLV Vesculas Multilamelares > 0,5m
OLV Vesculas Oligolamelares 0,1-1m
UV- Vesculas Unilamelares todos os tamanhos
SUV Vesculas Unilamelares pequenas 20-100nm
LUV Vesculas Unilamelar grande > 100nm
GUV Vesculas Unilamelares gigantes > 1m
MVV Vesculas Multivesicular > 1m
Quando so selecionados os lipdios que vo compor uma formulao
lipossomal, tem-se que considerar questes como temperatura de transio de fases
(Tc), estabilidade qumica, carga, fonte de lipdios, presena de colesterol na
composio. Em sistemas compostos de um tipo de lipdio, agregado em bicamadas, a
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temperatura de transio de fase principal corresponde temperatura requerida para
induzir uma mudana no estado fsico do lipdio agregado de uma fase gel, mais
ordenada, quando as cadeias hidrocarbnicas encontram-se totalmente estendidas e
apresentando uma estrutura inclinada, em configurao toda-trans e empacotadas, para
uma fase lquida cristalina desordenada, na qual as cadeias hidrocarbnicas dos lipdios
esto menos orientadas e fluidas, em configurao trans-gauche (Fig. 17) (SMALL,
1986 e NEW, 1990). Na escolha de lipdios para uma formulao lipossomal deve-se
selecionar aqueles que apresentem altas temperaturas de transio de fase
(fosfolipdios com cadeias hidrocarbnicas longas), grande estabilidade qumica, ou
resitncia a oxidao (cadeias acilas saturadas) e presena de colesterol na
composio lipdica (LASIC, 1993). A presena de ncleos rgidos planares de
colesterol na bicamada lipdica tem o efeito de mudar a fluidez da bicamada lipdica na
fase gel, tornando-a mais fluida na referida fase. A mudana na fluidez seguida por
mudanas na permeabilidade da membrana, diminuda em temperatura maior do que
Tc, mas aumentada em temperaturas menores que Tc, assim, impedindo o escape dos
compostos encapsulados (NEW, 1990). A utilizao da combinao fosfolipdios
neutros e com carga negativa pode favorecer a repulso entre as partculas
lipossomais, devido carga e formao de partculas com menores tamanhos.
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36
A
B
Figura 17. Transio das fases gel e lquida cristalina da bicamada lipdica de fosfolipdio (A). Diferentes configuraes (trans e gauche) causadas pela rotao de ligao simples C-C das cadeias acila dos fosfolipdios (B) (Adaptado de New, 1990).
As bicamadas dos lipossomas so qumica e biologicamente compatveis com as
membranas celulares, o que facilita a entrega de frmacos, aumentando a eficincia
teraputica. Os lipossomas podem, ainda, ser modificados quimicamente pela insero
de polmeros como o polietileno glicol 2000 na bicamada, para escapar do
patrulhamento exercido pelas clulas do sistema imunolgico e aumentar sua interao
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com tecidos doentes, reduzindo seu acmulo nos tecidos sadios.
Neste trabalho, foram produzidos lipossomas convencionais, definidos como
aqueles tipicamente compostos de fosfolipdios (neutros e negativamente carregados) e
colesterol. Os lipossomas convencionais so caracterizados tambm por um tempo
relativamente curto de circulao no sangue, quando administrados in vivo por via
parenteral, geralmente intravenosa (STORM e CROMMELIN, 1998). A literatura contm
muitos exemplos de aplicaes com sucesso de lipossomas convencionais, tendo como
alvo macrfogos infectados, como na vetorizao de agentes antimicrobianos
(BAKKER-WOUDENBERG, 1995; RASTOGI e col., 2006) e de imunomoduladores que
vo aumentar a capacidade dos macrfagos em destruir clulas neoplsicas e
aumentar a resistncia contra microrganismos infecciosos (DAEMEN, 1992; VASIR e
col., 2005). Lipossomas convencionais tambm so usados para entrega de antgenos.
Os lipossomas empregados como vacinas tm sido efetivos em modelos experimentais
contra vrus, bactrias e parasitas (GREGORIADIS, 1994; ALVING, 1995; TORCHILIN,
2005).
3.5.1. Aplicaes de lipossomas em medicina As aplicaes de lipossomas em medicina podem ser divididas em aplicaes
teraputicas e diagnsticas. Os lipossomas podem veicular frmacos e agentes de
contraste (marcadores) importantes no diagnstico de vrias patologias. Podem,
tambm, ser empregados como modelo, ferramenta ou reagente em estudos bsicos
sobre interaes celulares, processos de reconhecimento e modo de ao de certas
substncias (LASIC, 1993).
Devido a sua estrutura de bicamadas, semelhante das membranas celulares,
os lipossomas so capazes de interagir profundamente com as clulas do organismo.
Os benefcios e limitaes de lipossomas utilizados como carreadores de frmacos
dependem da interao dos mesmos com clulas e seu destino in vivo aps a
administrao. Estudos in vitro e in vivo mostraram que a interao predominante de
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lipossomas com clulas por adsoro simples e subseqente endocitose. A fuso
com membranas celulares muito mais rara. Outra possvel interao a troca de
constituintes com os da bicamada, como lipdios, colesterol e molculas ligadas a
componentes da membrana (Fig. 18) (CHORILLI e col., 2004).
Figura 18. Possveis mecanismos de interao de lipossomas com clulas(Adaptado de Chorilli e col., 2004).
O sistema imunolgico humano apresenta um complexo sistema de defesa,
visando proteo contra agentes potencialmente perigosos que podem trazer riscos
sade do organismo. Aps a administrao intravenosa de lipossomas convencionais,
as protenas do plasma conhecidas como opsoninas (imunoglobulinas IgM e IgG,
relacionadas resposta imune inata do organismo) so rapidamente adsorvidas na
superfcie das partculas. Esta adsoro leva ao rpido reconhecimento pelas clulas do
sistema mononuclear fagocitrio (macrfagos, principalmente do bao e clulas de
Kuppfer, do fgado) e conseqente fagocitose das partculas, especialmente no fgado
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(60 %-90 %), bao (2 %-20 %), medula ssea (0,1 %-1 %) e quantidades variadas nos
pulmes (GULYAAEV e col., 1998). Em funo disso, foram feitos estudos para reduzir
a captura das partculas coloidais pelo sistema monuclear fagocitrio, aumentar a
concentrao desses veculos no sangue e, consequentemente, no tecido ou rgo alvo
desejado (GUO e THOMAS, 2001; ELLEY, 2001). A resposta do sistema imune tem
desencadeado esforos no desenvolvimento de superfcies biocompatveis e no
reconhecveis pelo sistema de defesa humano. Desta forma, tem-se estreitado o
espectro de aplicaes de micro e nanopartculas empregadas como carreadores de
frmacos e, em alguns casos, almejando ter como alvo as referidas clulas do sistema
imunolgico.
Os lipossomas como sistemas carreadores de frmacos, podem oferecer vrias
vantagens sobre as formas farmacuticas convencionais, especialmente em relao
parenteral (injeo local, sistmica ou infuso), tpica e pulmonar. Entre elas, pode-se
citar (LASIC, 1993):
- melhora na solubilidade de frmacos lipo e anfiflicos e aumento da solubilidade de
compostos hidroflicos;
- direcionamento passivo de compostos para clulas do sistema imune, especialmente
para as do sistema mononuclear fagocitrio;
- liberao sustentada de frmacos veiculados em lipossomas, administrados local ou
sistemicamente;
- mecanismo de fuga de stios: os lipossomas geralmente no se dirigem a rgos,
como corao, rins, crebro e sistema nervoso, reduzindo a toxicidade de cert