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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical
ASSEMBLEIA DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS DE
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) E AVALIAÇÃO DO
SEU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
RICARDO DOUGLAS DE SOUZA
C U I A B Á - MT
2013
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical
ASSEMBLEIA DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS DE
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) E AVALIAÇÃO DO
SEU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
RICARDO DOUGLAS DE SOUZA
Biólogo
Orientadora: Profª. Dra. ELISABETH A. FURTADO DE MENDONÇA
Dissertação apresentada à Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade Federal de Mato Grosso, para obtenção do título de Mestre em Agricultura Tropical.
C U I A B Á - MT
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Fonte.
Ficha catalográfica elaborada automaticamente de acordo com os dados fornecidos pelo(a)
autor(a).
Permitida a reprodução parcial ou total, desde que citada a fonte.
S729a Souza, Ricardo Douglas de.Assembleia de Microrganismos Endofíticos de
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) e Avaliação do seuPotencial Biotecnológico / Ricardo Douglas de Souza. --2013
xv, 174 f. : il. color. ; 30 cm.
Orientadora: Elisabeth Aparecida Furtado de Mendonça.Co-orientador: Marcos Antônio Soares.Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Mato
Grosso, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária,Programa de Pós-Graduação em Agricultura Tropical,Cuiabá, 2013.
Inclui bibliografia.
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
Programa de Pós-graduação em Agricultura Tropical
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
Título: ASSEMBLEIA DE MICRORGANISMOS
ENDOFÍTICOS DE Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) E
AVALIAÇÃO DO SEU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
Autor: RICARDO DOUGLAS DE SOUZA
Orientadora: Dra. ELISABETH APARECIDA FURTADO DE MENDONÇA
Aprovada em 22 de Fevereiro de 2013.
Comissão Examinadora:
____________________________
Profa. Elisabeth Aparecida Furtado
de Mendonça
(FAMEV/UFMT) (Orientadora)
___________________________
Prof. Marcos Antônio Soares
(IB/UFMT) (Co-orientador)
___________________________
Prof. Luciano Nakazato
(FAMEV/UFMT)
___________________________
Prof. Fabio Lopes Olivares
(CBB/ UENF)
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, pela fidelidade e presença sempre amiga. Pela
ajuda nos momentos difíceis e refugio nas horas de cansaço.
Agradeço àqueles sem os quais nada disso seria possível, pois são
meu porto-seguro, onde posso me atracar não importa as circunstancias:
minha família. Esse trabalho também é de vocês.
Agradeço professora Elizabeth, pela pronta disponibilidade em todos
os momentos, e pela confiança depositada em mim.
Agradeço ao professor Marcos Antônio Soares, pela infinita paciência,
dedicação, pelas palavras de apoio nos momentos difíceis, pelas correções
nas horas necessárias, obrigado por tudo.
Agradeço aos professores da banca (Fabio Lopes Olivares e Luciano
Nakazato) pela pronta aceitação em participar e pelas valiosas
contribuições, sugestões e discussões.
Agradeço aos professores do Programa de Pós-graduação em
Agricultura Tropical, pela disponibilidade e socorro em horas tão diversas.
Agradeço a equipe do LABEM, pela amizade e ajuda, sem vocês não
seria possível. Andressa, obrigado! Muito mais que pela ajuda nos
experimentos, obrigado pela amizade, por ser todo ouvido, por ser boca de
Deus pra mim e simplesmente por ser quem é. Deus lhe Abençoe sempre!
Ao Breno e William, pelos inúmeros auxílios, vocês tem parte nesse trabalho
também. A Katia, Bruna, Jaqueline, Fabio, Matthews, Marcelo, André, enfim,
todos do LABEM, Obrigado!
Agradeço ao Grupo de Oração Missão Misericórdia pelo apoio e pelas
orações de cada um, ajudaram muito, vocês nem sabem o quanto.
Agradeço a Carmem e Sidinéia pela ajuda, por ter me acolhido no
laboratório de sementes de forma impar, a ajuda de vocês fez toda a
diferença.
Agradeço ao pesquisador Carlos Roberto Casela (EMBRAPA Milho e
Sorgo, Sete Lagoa/MG), a pesquisadora Rosalee A. Coelho Netto (INPA) e
Drª. Dyana Alves Henriques (UMC/SP), pelas Linhagens de fungos
patogênicos, cedidas para a realização desse trabalho.
v
ASSEMBLEIA DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS DE
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) E AVALIAÇÃO
DO SEU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
vi
ASSEMBLEIA DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS DE
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) E AVALIAÇÃO DO
SEU POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO
Resumo – As interações microrganismos-planta são as mais diversas
possíveis, variando do parasitismo às associações simbióticas. Endófitos
merecem atenção especial entre estes microrganismos porque as suas
relações com os hospedeiros podem resultar no aumento da adaptabilidade
das populações vegetais num determinado ecossistema. Estes
microrganismos tem demonstrado serem importantes fontes de prospecção
de metabólitos especiais com diferentes propriedades bioativas de interesse
das indústrias farmacêuticas e agrícola, e ferramentas chaves no
desenvolvimento de processos biotecnológicos como no controle biológico
de patógenos. Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) é uma planta
conhecida pelo seu uso medicinal e ornamental encontrada nas áreas
inundáveis do pantanal matogrossense. Portanto, este trabalho tem como
objetivo: a) Isolar e identificar a assembleia de microrganismos endofíticos
por meio de método dependente de cultivo; b) Determinar e avaliar a
interação entre fungos obtidos de E. scaber com outros hospedeiros; c)
Avaliar a capacidade antagônica dos endófitos obtidos contra
microrganismos patógenos de interesse médico e agronômico e no controle
biológico em grãos; d) Verificar traços funcionais importante na promoção de
crescimento de planta no banco de bactéria endofíticas de E. scaber, e)
Avaliar a inoculação de bactérias com traços funcionais na germinação e
desenvolvimento de plântulas de soja. Um banco de endófitos foi construído
a partir do isolamento dependente de cultivo em meio ágar batata com
fragmentos de raízes e pecíolos. Após 15 dias de incubação, 113 e 46
linhagens de bactérias e fungos, respectivamente, foram obtidas de pecíolos
e raízes de E. scaber. Após a identificação molecular, as bactérias
apresentaram maior riqueza de espécies distribuídas em 10 gêneros e 25
táxons e os fungos diferenciados em 13 gêneros, distribuídos em 19 táxons.
vii
As linhagens de fungos FREII-ED1 e FREIII-ED2 foram inoculadas em
plantas assépticas em meios de cultura in vitro. As plantas hospedeiras
Vochysia divergens, V. haenkeana, Combretum lanceolatume Capsicum
frutensces em contato com FREII-ED1 e FREIII-ED2 mantiveram-se vivas e
não desenvolveram sintomas ou sinais de doenças. Estes dois fungos
colonizaram internamente o sistema radicular das espécies através de suas
hifas mielinizadas e septadas, diferenciando microesclérodio e, portanto,
foram definidos como fungos do tipo dark septates. O sequenciamento da
região ITS das linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2 classificou-os em
Pestalotiopsis theae e Lophiostoma cynaroidis, respectivamente. A seleção
de endófitos antagônicos a patógenos foi determinada pelo confronto
realizado através da técnica de cultura dupla. Nove microrganismos de
importância agronômica e médica, sendo cinco fungos patogênicos
(Colletotrichum lindemunthianum, C. gloeosporioides, Corynespora
cassiicula, Fusarium solani, Microsporum canis) e quatro bactérias
patógenas (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. saprophyticus
e Escherichia coli) constituíram os microrganismos patogênicos utilizados.
Além disso, grãos de soja foram microbiolizadas com as bactérias
endofíticas com atividade contra todos os microrganismos testados. Obteve-
se os extratos, fração acetato de etíla, dos fungos antagônistas a todos os
microrganismos patogênicos, a fim de avaliar a produção de compostos
antifúngicos. A atividade bactericida dos extratos foi avaliada através de
autobiografia contra E. faecalis, S. aureus, S. saprophyticus. Avaliou-se
sessenta e duas bactérias quanto à produção do fitohormônio AIA e
solubilização de fosfato de cálcio. Para o teste de promoção de crescimento,
sementes de soja foram microbiolizadas com sete linhagens de bactérias
produtoras de AIA e solubilizadoras de fosfato de cálcio. Avaliaram-se a
porcentagem de germinação, índice de velocidade de emergência e a massa
seca das plântulas aos 13 dias da semeadura. Os microrganismos de
interesse foram identificados através de técnicas moleculares pelo
sequenciamento parcial do gene 16S, para bactéria, e da região ITS para
fungo, do gene rRNA. Duas bactérias, identificadas como Bacilus,
viii
demonstram eficiencia no controle de todos os patógenos avaliados, e
demonstraram aptidão de controlar, quase 100% o desenvolvimento de
fungos em grãosde soja. Das 47 linhagens de fungos, 10 foram eficientes
para inibir o crescimento do micélio de todos os fungos patogênicos. Os
antagonistas classificaram-se em cinco gêneros, a saber: Corynespora,
Cochliobolus, Penicillium, Chaetomium e Eupenicillium. Cinco dos
antagonistas aos fungos patogênicos demonstraram capacidade de inibir o
crescimento das cepas patógenas bacterianas. Os extratos dos endófitos
demonstraram inibição contra todos os microrganismos testados. Todas as
bactérias avaliadas produziram AIA in vitro, e 47 solubilizaram fosfato de
cálcio in vitro. As linhagens de bactérias produtoras de AIA e solubilizadoras
de fosfatos foram identificadas como pertencentes ao gênero Enterobacter e
Klebsiella. As sementes de soja inoculadas com bactérias produtoras de AIA
e solubilizadores de fosfato de cálcio não tiveram sua germinação afetada,
sendo que quatro linhagens de bactérias endofíticas demonstram eficiência
em promover o acúmulo de massa seca em plântulas de soja.
Palavras-chave: Antagonismo, Promoção de crescimento, Microrganismos
endofíticos, Chapéu de couro, soja.
ix
ASSEMBLY OF ENDOPHYTES Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus) AND EVALUATION OF ITS POTENTIAL
BIOTECHNOLOGICAL
Abstract - The plant-microorganism interactions are the most diverse
possible, ranging from parasitic to symbiotic associations. Endophytes
deserve special attention among these microorganisms because their
relationships with the host may result in increasing the adaptability of plant
populations in an ecosystem. These microorganisms have been shown to be
important sources of prospecting special metabolites with different bioactive
properties of interest of the pharmaceutical and agricultural tools and key in
the development of biotechnological processes such as biological control of
pathogens. Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) is a plant known for its
medicinal and ornamental found in the wetlands of the Pantanal of Mato
Grosso. Therefore, this work aims to: a) isolate and identify the assembly of
endophytic microorganisms by culture-dependent method b) Determine and
evaluate the interaction between fungi obtained from E. scaber with other
hosts and c) evaluate the ability of antagonistic endophytes obtained against
pathogenic microorganisms of medical and agronomic and biological control
in grain d) Check functional traits important in promoting plant growth in bank
endophytic bacterium E. scaber, e) Evaluate the inoculation of bacteria with
functional traits in germination and development of soybean seedlings. A
database was constructed from endophyte isolation dependent in medium
potato agar with fragments of roots and stems. After 15 days of incubation,
113 and 46 strains of bacteria and fungi, respectively, were obtained from
stems and roots of E. scaber. After identifying molecular bacteria showed
greater richness of species in 10 genera and 25 different fungal taxa and 13
genera distributed in 19 taxa. The strains of fungi and FREIII FREII-ED1-ED2
were inoculated in aseptic culture medium in vitro. Host plants Vochysia
divergens, V. haenkeana, Combretum lanceolatum e Capsicum frutensces
contact FREII-ED1 and ED2-FREIII remained alive and did not develop
x
symptoms or signs of disease. These two fungi internally colonized the root
system of the species through their myelinated and septate hyphae,
differentiating microesclérodio and therefore were defined as fungi like dark
septates. The sequencing of the ITS region of strains FREII-ED1 and FREIII-
ED2 ranked them in Pestalotiopsis theae and Lophiostoma cynaroidis
respectively. The selection of endophytes antagonistic to pathogens was
determined by comparison performed by dual culture technique. Nine
microorganisms important agronomic and medical, five pathogenic fungi
(Colletotrichum lindemunthianum, C. gloeosporioides, Corynespora
cassiicula, Fusarium solani e Microsporum canis) and four pathogenic
bacteria (Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. saprophyticus
and Escherichia coli) were the microorganisms pathogenic used. Moreover,
grains of soybeans were microbiolized with endophytic bacteria with activity
against all tested microorganisms. The obtained extract, ethyl acetate
fraction, fungi antagonistic to pathogenic microorganisms all in order to
evaluate the production of antifungal compounds. The bactericidal activity of
the extracts was evaluated autobiography against E. faecalis, S. aureus, S.
saprophyticus. Reviewed Sixty-two bacteria for the production of
phytohormone IAA and solubilization of calcium phosphate. To test the plant
growth promotion, soybean seeds were microbiolized seven bacterial strains
producing IAA and solubilizing calcium phosphate. We evaluated the
germination percentage, rate of emergence and seedling dry mass at 13
days after sowing. The organisms of interest were identified using molecular
techniques by partial sequencing of the 16S for bacteria and fungus-ITS
region of the rRNA gene. Two bacteria, identified as Bacillus demonstrate
efficiency in controlling all pathogens evaluated, and demonstrated ability to
control almost 100% the development of fungi in grains of soybean. Of the 47
fungal strains 10 were effective for inhibiting the mycelial growth of all
pathogenic fungi. The antagonists were classified into five genera, namely:
Corynespora, Cochliobolus, Penicillium, Chaetomium and Eupenicillium. Five
pathogenic fungi antagonists have demonstrated an ability to inhibit the
growth of pathogenic bacterial strains. The extracts of endophytes showed
xi
inhibition against all tested microorganisms. All bacteria evaluated in vitro
produced IAA and 47 solubilize calcium phosphate in vitro. The bacterial
strains producing IAA and phosphate solubilizing were identified as belonging
to the genus Enterobacter and Klebsiella. Soybean seeds inoculated with
bacteria producing IAA and phosphate solubilizing calcium were not affected
their germination, and four strains of endophytic bacteria demonstrate
effective in promoting dry matter accumulation in soybean seedlings.
Keywords: Antagonism, Growth promotion, Endophytic, Chapél de couro,
Soybeans.
xii
1. SUMÁRIO
2. Página
3. RESUMO............................................................................................. vi
4. ABSTRACT......................................................................................... ix
5. 1. INTRODUÇÃO............................................................................... 16
6. 1.1 Referências Bibliográficas .......................................................... 21
7. 2. COMUNIDADE DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS
CULTIVÁVEIS DA PLANTA MEDICINAL Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus) NO PANTANAL DO BRASIL................................... 25
8. Resumo.............................................................................................. 26
9. Abstract.............................................................................................. 28
10. 2.1 Introdução.................................................................................... 30
11. 2.2 Material e Métodos...................................................................... 33
12. 2.2.1 Obtenção do material vegetal................................................... 33
13. 2.2.2 Isolamento dos microrganismos, purificação e preservação.... 33
14. 2.2.3 Variabilidade genética e identificação das linhagens de fungos
endofíticos.......................................................................................... 34
15. 2.2.4 Variabilidade genética e identificação molecular das linhagens
de bactérias endofíticas..................................................................... 36
16. 2.2.5 A análise dos dados.................................................................. 37
17. 2.3 Resultados e discussão............................................................... 38
18. 2.3.1 Estrutura da assembleia de fungos isolados de Echinodorus
scaber................................................................................................ 40
19. 2.3.2 Estrutura da assembleia de bactérias de Echinodorus scaber. 48
20. 2.4 Conclusões.................................................................................. 55
21. 2.5 Referências Bibliográficas........................................................... 56
22. 3. DARK SEPTATE DE Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) E
SUAS ESPECIFICIDADES EM DIFERENTES HOSPEDEIROS...... 66
23. Resumo.............................................................................................. 67
24. Abstract.............................................................................................. 69
25. 3.1 Introdução.................................................................................... 71
xiii
26. 3.2 Material e Métodos...................................................................... 74
27. 3.2.1 Microrganismos e meios de cultura utilizados.......................... 74
28. 3.2.2 Observação de estruturas fúngicas associadas às raízes de E.
scaber................................................................................................ 74
29. 3.2.3 Caracterização e Identificação molecular das linhagens
fúngicas.............................................................................................. 75
30. 3.2.4 Obtenção de plântulas gnotobióticas........................................ 76
31. 3.2.5 Inoculação de fungos em plântulas e observação
macroscópica..................................................................................... 76
32. 3.2.6 Estudo em microscopia das raízes inoculadas......................... 76
33. 3.3 Resultados e Discussão ............................................................. 78
34. 3.3.1 Associação entre raízes de Echinodorus scaber e fungos...... 78
35. 3.3.2 Colonização de plântulas axênicas em condições in vitro........ 78
36. 3.3.3 Identificação das linhagens de fungos endofíticos................... 85
37. 3.4 Conclusões.................................................................................. 87
38. 3.5 Referências Bibliográficas……………………………………....… 88
39. 4. ATIVIDADE ANTAGONICA A MICRORGANISMOS
PATOGÊNICOS E CONTROLE DE FUNGOS in vitro POR
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ISOLADAS DE Echinodorus scaber
Rataj (macrophyllus) EM GRÃOS DE SOJA..................................... 93
40. Resumo.............................................................................................. 94
41. Abstract……………………………………………………...........……… 96
42. 4.1. Introdução................................................................................... 97
43. 4.2. Material e Métodos................................................................... 100
44. 4.2.1. Microrganismos e meios de cultura....................................... 100
45. 4.2.2. Seleção de bactérias endofíticas antagônicas a fungos
patógenos........................................................................................ 101
46. 4.2.3. Ensaio de antibiose contra bactérias patógenas................... 101
47. 4.2.4. Analise de ERIC-PCR das bactérias endofíticas
selecionadas.................................................................................... 102
48. 4.2.5. Identificação e analise filogenética das bactérias endofíticas102
49. 4.2.6. Controle da incidência de fungos em grãos de soja.............. 103
xiv
50. 4.3. Resultados e Discussão........................................................... 104
51. 4.3.1. Seleção de bactérias antagônicas a microrganismos
patogênicos...................................................................................... 104
52. 4.3.2. Potencial de inibição de bactérias patogênicas..................... 106
53. 4.3.3. Caracterização e identificação molecular das linhagens BREI-
92 e BREIII-10................................................................................. 108
54. 4.3.4. Controle in vitro de fungos em grãos de soja........................ 110
55. 4.4. Conclusões............................................................................... 113
56. 4.5. Referências Bibliográficas…………………………… ….……... 114
57. 5. POTÊNCIAL AGRONÔMICO DE BACTERIAS ENDOFÍTICAS DE
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) EM PLÂNTULAS DE
SOJA............................................................................................... 120
58. Resumo............................................................................................ 121
59. Abstract ........................................................................................... 122
60. 5.1 Introdução.................................................................................. 123
61. 5.2 Material e Métodos.................................................................... 125
62. 5.2.1 Microrganismos e meios de cultura........................................ 125
63. 5.2.2 Produção de fitohormônio Acido indol-acético pelas linhagens de
endofíticos........................................................................................ 125
64. 5.2.3 Screening de isolados endofíticos solubilizadores de fosfato de
cálcio................................................................................................ 126
65. 5.2.4 Análise de ERIC-PCR das bactérias endofíticas
selecionadas.................................................................................... 127
66. 5.2.5 Identificação das bactérias endofíticas através do
sequenciamento parcial do gene 16S do rDNA............................... 127
67. 5.2.6 Microbiolização de sementes de soja com bactérias endofíticas
isoladas de E. scaber....................................................................... 128
68. 5.3 Resultados e Discussão............................................................ 129
69. 5.3.1 Bactérias endofíticas de Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus) com potencial para produzir AIA e solubilizar fosfato
de cálcio........................................................................................... 129
70. 5.3.2 Caracterização e sequenciamento do gene 16S rDNA.......... 134
xv
71. 5.3.3 Promoção de crescimento de plântulas de soja..................... 135
72. 5.4 Conclusões................................................................................ 139
73. 5.5 Referências Bibliográficas......................................................... 140
74. 6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FUNGOS ENDOFÍTICOS
ISOLADOS DE PLANTA MEDICINAL DO PANTANAL Echinodorus
scaber Rataj (macrophyllus)............................................................ 145
75. Resumo ........................................................................................... 146
76. Abstract............................................................................................ 148
77. 6.1 Introdução.................................................................................. 149
78. 6.2 Material e Métodos.................................................................... 152
79. 6.2.1 Microrganismos e meios de cultura........................................ 152
80. 6.2.2 Seleção de fungos endofíticos antagonista a patógenos....... 153
81. 6.2.3 Caracterização por ISSR-PCR e identificação das linhagens
com potencial antagônico................................................................ 154
82. 6.2.4 Obtenção de extratos dos fungos endofíticos......................... 155
83. 6.2.5 Detecção da atividade antimicrobiana dos extratos............... 155
84. 6.2.6 Ensaio de bioautografia dos extrados fúngicos obtidos.......... 156
85. 6.3 Resultados e Discussão............................................................ 158
86. 6.3.1 Linhagem de fungos endofíticos com atividade antagonica a
microrganismos patogênicos........................................................... 158
87. 6.3.2 Identificação dos fungos endofíticos com potencial
antagônico....................................................................................... 160
88. 6.3.3 Atividade antimicrobiana dos extratos AcOET dos fungos
endofíticos........................................................................................ 163
89. 6.3.4 Autobiografia dos extratos fúngicos........................................ 165
90. 6.4 Conclusões................................................................................ 168
91. 6.5 Referências Bibliográficas......................................................... 169
92. 7. Conclusões Gerais.................................................................... 173
16
1. INTRODUÇÃO
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) comumente denominada
como chapéu de couro é uma planta popularmente conhecida por seu uso
medicinal e ornamental (Pott e Pott, 2000). São apresentadas por Pott e Pott
(2000) oito espécies de chapéu de couro presentes na região pantaneira,
todas pertencentes à família Alismataceae e ao gênero Echinodorus.
A família Alismataceae é monocotiledônea colonizadora de áreas
alagáveis como canais, margens de lagos e pântanos (Tanaka, et. al 1997).
Esta família é formada por 12 gêneros e cerca de 80 espécies (Souzae
Lorenzi, 2005). No Brasil ocorrem dois gêneros (Echinodoruse Sagittaria)
agrupando cerca de 25 espécies, sendo 18 destas pertencentes ao gênero
Echinodorus (Vieirae Lima, 1997).
Segundo Pott e Pott (2000),E. scaber encontra-se apenas na América
do Sul, sendo distribuída no Brasil (Amapá, Amazonas, Piauí, Paraná, Santa
Catarina, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul) e Venezuela.
Dentre as espécies do gênero Echinodorus, E. grandiflorus e E.
scaber possuem propriedades medicinais semelhantes (Nuneset al. 2003).
Ambas as espécies são usadas popularmente para o tratamento de várias
enfermidades como: reumatismo, tratamento de ácido úrico, sífilis, doenças
de pele e de fígado e também para fins diuréticos (Pott e Pott, 2000).
Além das propriedades medicinais descritas acima, trabalhos com
extratos de espécies desse gênero têm demonstrado propriedades
17
antiedematogênica, efeito anti-hipertensiva, intiinflamatória, antinociceptiva e
antibacteriana (Duarteet al. 2002; Dutra et al. 2006; Garcia et al. 2010;
Lessa et al. 2008). Duarte et al. (2002) enfatizam que o potencial
antimicrobiano encontrado na espécie E. grandiflorus pode relacionar com
os esteróides, saponinas, polifenóis e flavonóides presentes no extrato.
Nesse sentido, a literatura demonstra que alguns microrganismos que
habitam o interior do tecido de plantas, denominados endófitos, apresentam
capacidade de produzir compostos bioativos idênticos ou semelhantes aos
da planta hospedeira (Zhao et al. 2011). Essa capacidade, segundo Zhao et
al. (2011), é possível devido ao processo co-evolutivo que culminou com
uma estreita relação entre o microrganismo e sua planta hospedeira.
Microrganismos endofíticos segundo Schuls e Boyle (2005) colonizam
internamente o tecido vegetal, intra ou extracelular, sendo detectados num
momento particular, de forma mutualística, em hospedeiros aparentemente
saudáveis.
Exemplos de compostos produzidos por plantas e relatados como
produzidos por microrganismos que habitavam o interior de seu tecido
vegetal é o Paclitaxel obtido da planta Taxus brevifolia e relatado para o
fungoTaxomyces andreanae isolado de folhas da mesma planta(Stierle et al.
1993).Podofilotoxinaencontrado na plantaSinopodophyllum hexandrum e
relatado também para o fungo Alternaria sp (Yang et al. 2003).
Segundo Strobel e Daisy (2003) os conhecimentos levantados pela
etnobotânica são muito importantes para a escolha de plantas que possuem
microrganismos endofíticos com potencial biotecnológico.
Os estudos dessa intrigante interação endofítico-planta demonstram
que muitos desses microrganismos podem favorecer o desenvolvimento do
hospedeiro de forma direta, pela produção de fitohormônios e
disponibilização de nutrientes para a planta, ou de forma indireta produzindo
compostos secundários que auxiliam na defesa contra a herbivoria e/ou no
aumento da resistência a outros organismos patogênicos (Piccoliet al. 2011).
Várias pesquisas realizadas com microrganismos endofíticos que
produzem metabólitos secundários indicam que essas novas fontes de
18
compostos bioativos podem ser aproveitadas em diferentes áreas como na
agricultura, como novos fármacos e também na indústria (Alyet al. 2011;
Wang et al. 2010; Zhao et al. 2011).
A constante mutação dos microrganismos, resultando em linhagens
resistentes aos antimicrobianos disponíveis no mercado, tem levado a um
empenho em pesquisas para a descoberta de novos fármacos (Dzidicet al.
2008). Porém, entre os anos de 1980-2000, poucos antibióticos naturais
foram lançados no mercado devido à redução de pesquisas na busca de
novas linhagens que produzam compostos ativos contra microrganismos
infecciosos, sendo focado nesse período pesquisas genômicas e de
compostos de linhagens até então conhecidas (Guimarães et al. 2010).
Essa crescente demanda da indústria farmacêutica pela procura de
novos bioativos tem como principal objetivo descobrir novas substâncias que
atuam em microrganismos resistentes para aplicação tanto em animais
como em humanos. Segundo Saleem et al. (2010), a necessidade da
descoberta de novos antibióticos vê-se necessária pela resistência adquirida
pelos microrganismos patógenos aos antibióticos atuais e a indisponibilidade
de novos agentes antimicrobianos no mercado. Além disso, a descoberta de
novas famílias de antibióticos é imprescindível para a medicina e agronomia
(Hu, 2007;Bale et al. 2008).
Mato Grosso tem se despontado na produção agrícola, aumentado a
cada ano sua produção de grãos. A estimativa de produção de soja para a
safra 2011/2012 é de 22.162.350 toneladas no Estado (Instituto
Matogrossense de Economia Agropecuária – IMEA, 2012).
Um dos fatores para o crescente aumento da produção de soja no
Estado também se deve ao aumento da área plantada. Esse aumento de
área do plantio de soja, segundo Gomes et al.(2009), vem ocasionando o
aumento da quantidade e intensidade de doenças de importância
econômica. A elevada ocorrência de patógenos no atual sistema de
produção de soja, caso não seja controlada, podem acarretar problemas
fisiológicos nas plantas, diminuindo a produção (Soares et al. 2004).
19
Grande parte do sistema de produção vigente, utiliza produtos
químicos para controlarem doenças causadas por microrganismos com o
objetivo de aumentar a produtividade e/ou reduzir perdas resultantes da
doença (Godoy et al. 2004). O uso constante desses produtos, a longo
prazo, acarreta danos ao meio ambiente, como contaminação dos sistemas
hídricos superficiais ou subterrâneos (Veiga, et. al 2006) e contaminação, de
forma direta ou indireta, da comunidade que está envolvida na produção
(Araújo et. al 2007). Outrossim, apesar dos fungicidas químicos reduzirem o
nível de infecção de fungos em sementes (Soto-Arias e Munkvold, 2011), o
tratamento recorrente com esses produtos pode provocar o surgimento de
linhagens de fungos resistentes. Além disso, esse tipo de tratamento é
dispendioso aos produtores (Vurro e Gresselro, 2006).
Dentro deste panorama da produção agrícola, não se pode deixar de
comentar que nas últimas décadas tem-se dado ênfase a busca de
alternativas biológicas para aumentar sua produtividade, encontrando-se
assim novas formas de disponibilizar nutrientes para as plantas e
metodologias que diminuam a severidade de doenças, acarretando um
menor impacto no meio ambiente pelo uso excessivo de defensivos
químicos (Carmonaet al. 2011). Uma dessas alternativas tem sido o uso de
microrganismos endofíticos para controlar fitopatógenos, insetos pragas,
promover o crescimento de seu hospedeiro além de auxiliar na resistência a
estresses abióticos (Akelloet al. 2007; Bae et al. 2008; Barrettiet al. 2008;
Ryanet al. 2008; Senthilkumaret al. 2009; Baldottoet al. 2010; Lanna Filhoet
al. 2010).
O objetivo geral deste trabalho é construir um banco de
microrganismos endofíticos de E. scaber para avaliação do potencial
biotecnológico das linhagens obtidas. Já os objetivos específicos, são:
a) Isolar e identificar a assembleia de microrganismos endofíticos de
E. scaber por meio de método dependente de cultivo;
b) Determinar e avaliar a interação entre fungos obtidos de E. scaber
com outros hospedeiros;
20
c) Avaliar a capacidade antagônica dos endófitos obtidos contra
microrganismos patógenos de interesse médico e agronômico e no controle
biológico em grãos;
d) Avaliar a atividade antimicrobiana de extratos obtidos de fungos
endófitos.
e) Verificar traços funcionais importante na promoção de crescimento
de planta no banco de bactéria endofíticas de E. scaber,
f) Avaliar a inoculação de bactérias com traços funcionais na
germinação e desenvolvimento de plântulas de soja.
21
1.1 Referências Bibliográficas
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25
2. COMUNIDADE DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS
CULTIVÁVEIS DA PLANTA MEDICINAL Echinodorus
scaber Rataj (macrophyllus) NO PANTANAL DO BRASIL
26
COMUNIDADE DE MICRORGANISMOS ENDOFÍTICOS CULTIVÁVEIS DA
PLANTA MEDICINAL Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) NO
PANTANAL DO BRASIL
Resumo – Este estudo descreve a assembléia de endófiticos presentes em
pecíolo e raízes de três indivíduos de Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus), planta medicinal coletada de área úmida brasileira. Obteve-
se um total de 159 linhagens de microrganismos cultiváveis de 221
fragmentos de pecíolo e raiz. Deste total, 46 linhagens corresponderam a
fungos (30 de pecíolo e 16 de raiz) e as demais 113 são bactérias (69 de
pecíolo e 44 de raiz). Identificação morfológica e o sequenciamento da
região do espaçador interno transcrito (ITS) do gene rRNA foram utilizadas
na identificação dos fungos revelando suas distribuições nas classes
Sordariomycetes (Sordariales, Xylariales, Microascales, Hypocreales e
Glomerellales), Dothideomycetes (Pleosporales e Capnodiales) e
Eurotiomycetes (Eurotiales), sendo a primeira mais abundante. Com
exceção da linhagem identificada como Massariosphaeria sp, os demais
gêneros são relatados como endófitos em outros hospedeiros. Os gêneros
mais frequentes em E. scaber constitui-se de Acremonium e Penicillium.
Houve nítida diferença na composição da assembleia fúngica entre pecíolo e
raiz. Somente o gênero Penicillium foi comum nos dois órgãos. A
Identificação molecular das bactérias pelo sequenciamento parcial do gene
16S rRNA resultou em 10 gêneros distribuídos em 25 táxons pertencentes
aos filos Proteobacteria (78,32% das linhagens – representando as classes
gamma e beta-proteobacteria), Firmicutes (19,59%) e Actinobacteria
representando aproximadamente 2% dos isolados analisados. Os gêneros
mais comuns consistiram-se de Enterobacter, Bacillus (19,59%), Klebsiela
(13,40%) e Pseudomonas. Quatro táxons (Klebsiela pneumonie, Bacillussp.,
Pseudomonas sp HE 613571.1 e Pseudomonas putida) foram comuns entre
pecíolo e raiz. A sequência 16S do isolado de Rasltonia picketti apresentou
identidade com outra linhagens de Rasltonia picketti isolada de raízes de
27
Vochysia divergens coletada na mesma área úmida. Estes resultados
demonstram que E. scaber abriga uma diversa assembleia de endófitos
constituída por linhagens de fungos e bactérias. Estes microrganismos são
candidatos importantes para a prospecção de produtos e processos
biotecnológicos visando o uso sustentável de recursos naturais.
Palavras-chave: Chapéu de couro, Bactéria endofítica, Fungo endofítico,
Diversidade genética.
28
COMMUNITY CULTIVABLE ENDOPHYTES MEDICINAL PLANT
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) NO PANTANAL OF BRAZIL
ABSTRACT – This study describes the assembly of endophyte present in
stems and roots of three individuals of Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus), medicinal plant collected from wetland Brazilian. There was
obtained a total of 159 strains of microorganisms cultivated stem 221 and
root fragments. Of this total, 46 strains corresponded to fungi (30 stems and
16 root) and the remaining 113 are bacteria (69 stems of petiole and 44 of
root). Morphological identification and sequencing of the internal transcribed
spacer region (ITS) rRNA gene were used in the identification of fungi
revealing their distributions in classes Sordariomycetes (Sordariales,
Xylariales, Microascales, Hypocreales and Glomerellales) Dothideomycetes
(Pleosporales and Capnodiales) and Eurotiomycetes (Eurotiales ), the first
being the most abundant. Except for the strain identified as Massariosphaeria
sp, the other genera are reported as endophytes in other hosts. The genera
most frequently in E. scaber consists of Acremonium and Penicillium. There
was a clear difference in the composition of the assembly between fungal
root and stems. Only the genus Penicillium was common in both organs. The
molecular identification of bacteria by partial sequencing of the 16S rRNA
gene resulted in 10 genera distributed in 25 taxa belonging to the phylum
Proteobacteria (78.32% of the lines - representing class gamma and beta-
proteobacteria), Firmicutes (19.59%) and Actinobacteria representing
approximately 2% of the isolates analyzed. The most common is consisted of
Enterobacter, Bacillus (19.59%), Klebsiela (13.40%) and Pseudomonas. Four
taxa (Klebsiela pneumonie, Bacillus sp, Pseudomonas sp HE 613571.1 and
Pseudomonas putida) were common between stems and root. The sequence
of the 16S isolated Rasltonia picketti showed identity with other strains from
roots Rasltonia picketti isolated Vochysia divergens collected in the same
wetland. These results demonstrate that E. scaber houses a diverse
29
assembly consists of endophyte strains of fungi and bacteria. These
microorganisms are important candidates for the exploration of biotechnology
products and processes aimed at the sustainable use of natural resources.
Keywords: Chapéu de couro, Endophytic bacteria, Endophytic fungus,
Genetic diversity.
30
2.1 Introdução
As associações planta-microrganismos possuem uma miríade de níveis
variando do parasitismo ao mutualismo simbiótico. A interação estreita entre
estes dois organismos além de ancestral, é amplamente distribuído entre os
diferentes grupos vegetais e microbianos. Diferentes autores propuseram
definições específicas para esse grupo particular de microrganismos, o que
demonstra a complexidade da própria interação (Hyde; Soytong, 2008)
Neste trabalho, endofítós serão definidos de acordo com Schuls e Boyle
(2005): microrganismos que colonizam internamente o tecido vegetal intra ou
extracelularmente num momento particular, e coexistindo de forma
mutualística em hospedeiros aparentemente saudáveis. Essa complexa
comunidade é constituída por fungos e bactérias, e ao contrário de
microrganismos patogênicos, não causam prejuízo à planta hospedeira
(Porras-Alfaro e Bayman, 2011).
A interação endófito-planta é um importante componente para a
diversidade nos ecossistemas naturais (Suryanarayanan et al. 2011). Vários
estudos demonstraram a capacidade destes microrganismos em auxiliar o
desenvolvimento de seu hospedeiro seja pela capacidade de aturem como
agentes de controle biológico de microrganismos patogênicos ou pela
produção de hormônios vegetais que auxiliaram o crescimento da planta
hospedeira (Piccoli; Travaglia, 2011;Seo et al. 2010; You et al. 2012).
As Avaliações das comunidades endofíticas em diferentes hospedeiros
vêm aumentando, o que possibilita a descoberta de novas espécies
31
microbianas, suas possíveis aplicações biotecnológicas e seus papeis
funcionais nos ecossistemas (Guo et al. 2010). Esses organismos colonizam
todos os tecidos de diferentes órgãos, tais como raízes, folhas, pecíolos,
frutos, flores, sementes e caule, podendo apresentar especificidade de
colonização a diferentes órgãos como folha, ramos e raízes (Fishery e
Petrini, 1992; Kumar e Hyde, 2004; Qin et al. 2012; Shimizu, 2011).
Segundo Rodrigues (1994), essa especificidade pode ocorrer pela diferença
química ou tecidual das estruturas internas de cada órgão vegetal da planta.
Além do tipo de tecido ou órgão da planta, estudos têm demonstrado
que a colonização endófito-planta pode variar de acordo com a espécie
hospedeira, podendo influenciar na composição de sua comunidade de
microrganismos endofíticos (Quilliam; Jones, 2012;Sun et al. 2012).
Várias pesquisas realizadas com endófitos demostram a potencialidade
deles em sintetizarem metabólitos que sob o ponto biotecnológico,
constituem novas fontes de compostos bioativos, aplicáveis em diferentes
áreas como na indústria de alimentos, agrícola ou farmacêutica (Aly et al.
2011; Piccoli et al. 2011; Zhao et al. 2011). In vivo, estes metabólitos
possuem um papel importante nas interações metabólicas entre
microrganismos e seu hospedeiro, tais como sinalização, defesa natural e
regulação da simbiose (Schulz e Boyle, 2005).
Diversos compostos bioativos, inicialmente isolados de plantas, são
produzidos por endófitos em condições in vitro e, portanto, podem ser novas
fontes de obtenção e prospecção destes compostos utilizando demandas
tecnológicas menos complexas. De acordo com Strobel (2003), plantas
medicinais podem abrigar uma assembléia de endófitos capazes de
sintetizarem compostos bioativos com potencial farmacológico ou aplicação
agrícola. A obtenção de um banco de endófitos cultiváveis de plantas
medicinais permite a busca de produtos e processos biotecnológicos
utilizando estes microrganismos como fonte para a prospecção, além de
possibilitar a avaliação do papel funcional destes microrganismos.
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus), pertencente à família
Alismataceae, é uma espécie conhecida popularmente por seu uso
32
medicinal e ornamental (Pott e Pott, 2000). A família dessa espécie ocorre
em áreas alagáveis como canais, margens de lagos e pântanos (Tanaka, et.
al 1997). Sendo que, a distribuição das espécies dessa família é limitada a
lugares especificos, como demonstra Pott e Pott (2000), ao indicar que E.
scaber está presente apenas na América do sul, sendo encontrada
frequentemente apenas no Brasil e Venezuela. O perfil fitoquímico de
flavonas C-Glicosiladas presentes nas folhas desta espécie foi recentemente
estudando, demonstrando atividade antinociceptiva em dores abdominais
induzidas em camundongos Swiss, demonstrando que essa planta possui
potencial de aplicações farmacológicas (Estrada, 2012). Assim, o objetivo
desse estudo foi investigar a diversidade na assembléia de endófitos
cultiváveis presentes em pecíolos e raízes de E. scaber além de,
estabelecer um banco destes microrganismos para prospecção de
compostos bioativos ou processos biotecnológicos.
33
2.2 Material e Métodos
2.2.1 Obtenção do material vegetal
Foram coletados três indivíduos, em sua fase adulta, da planta
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) na região do pantanal de Poconé –
MT (16° 25' 22.5"S e 56° 25' 17.4"W) no mês de Junhode 2011
representando o estágio final do período de cheia. Os indivíduos coletados
foram retirados integralmente do solo com uso de escavador manual e
manuseados cuidadosamente para impedir que as raízes fossem
danificadas. As amostras foram acondicionadas em sacos plásticos e em
caixas térmicas contendo gelo, sendo imediatamente transportadas para o
laboratório para serem processadas em até 24h.
2.2.2 Isolamento dos microrganismos, purificação e preservação
O isolamento dos microrganismos endofíticos de E. scaber foi
realizado no Laboratório de Biotecnologia e Ecologia Microbiana (LABEM)
do Instituto de Biociências (IB) da Universidade Federal de Mato Grosso
(UFMT). Depositou-se uma exsicata no Herbário da Universidade Federal
de Mato Grosso do Sul sob o registro CGMS-30907. Os microrganismos
endofíticos foram isolados de pecíolo e raiz utilizando a metodologia de
Petrini & Muller (1986), com modificações.
Os indivíduos foram lavados cautelosamente com água corrente para
retirada de todo o solo e outros resíduos. Em seguida, parte das raízes foi
meticulosamente retirada e depositadas em béquer com água e detergente e
34
agitadas por 5 minutos. Posteriormente, realizou-se o enxague com água
destilada até a total retirada do detergente; em seguida as raízes foram
levadas a capela de fluxo laminar. Para o pecíolo, realizou-se a limpeza
superficial com o auxilio de esponja e detergente, e posteriormente, retirou-
se um fragmento de aproximadamente 5 cm com o auxilio de um bisturi, e as
extremidades foram parafinadas. A assepsia do material vegetal proceseu-
se com álcool 70% por um minuto, NaClO com 2,5% de cloro ativo por três
minutos e álcool 70% por 30 segundos. Finalmente enxaguou-se o material
com água destilada esterilizada por três vezes, sendo que 50 µL da última
água do enxágue foi adicionada a um tubo contendo 5 mL de caldo nutriente
(3g de extrato de carne; 5g de peptona; 1000 mL de agua destilada) para
confirmar a eficiência da assepsia. Posteriormente retirou-se fragmentos de
aproximadamente 1 cm com o auxilio de um bisturi, previamente flambado.
Sete fragmentos foram depositados em cada placa de Petri contendo o meio
de cultura batata dextrose ágar (BDA), com o auxílio de uma pinça flambada.
Quanto a amostra de raízes, fragmentos de aproximadamente 1 cm, obtidos
com o auxilio de uma tesoura, previamente flambada foram depositados em
meio de cultura BDA. Depositaram-se todas as placas a 28 ºC por 15 dias,
sendo transferidos os microrganismos que cresceram nos fragmentos para
placas de Petri contendo BDA.
As colônias de bactérias obtidas dos fragmentos de pecíolo e raiz de
E. scaber foram estriadas em meio de cultura ágar nutriente (AN) para
obtenção de culturas puras. A constatação da purificação ocorreu por
coloração de Gram e a armazenagem procede-se a 4ºC, sendo
posteriormente estocados a -20ºC em glicerol 80% (v/v). A purificação dos
fungos ocorreu monosporicamente ou por repicagem do micélio em placas
contendo meio BDA e estocados a 4ºC em tubos contendo BDA.
2.2.3 Variabilidade genética e identificação das linhagens de fungos
endofíticos
Separou-se as linhagens de fungos endofíticos em morfotipos de
acordo com suas características macro e microscópicas do micélio crescido
em BDA por 7 dias a 28ºC. Culturas esporulantes foram identificadas de
35
acordo com as descrições das espécies e utilizando chaves de identificação
(Sutton, 1980; Barnett et al. 1998; Carmichael et al. 1980). Culturas não
esporulantes foram designadas mycelia sterilia e separadas em diferentes
morfotipos de acordo com a cor do micélio, textura e extensão de
crescimento em BDA (Guo et. al. 2000). A conformação do agrupamento nos
diferentes morfotipos ocorreu por análises moleculares.
A extração do DNA genômico dos fungos foi realizada com kit de
extração de DNA, seguindo recomendações do fabricante (Axygen
biosciences, USA). A conformação da morfotipagem ocorreu pela análise da
variabilidade genética utilizando-se o marcador molecular ISSR (Inter simple
sequence repeat amplification), com o oligonucleotídeo BH1 (5' - GTG GTG
GTG GTG GTG - 3') (Integrated DNA Technologies, Inc). O volume de uma
reação foi de 25µl, contendo 1 µl de extrato de DNA, 2,5 µl de tampão de
PCR 10x, 2,5mM de cada dNTP, 10pM de cada primer e 1U de taq
polimerase. O programa do PCR consiste em um passo de desnaturação
inicial de 94ºC por 2 min, seguido de 35 ciclos de 94 ºC por 1 min, 50 ºC por
2 min e 72 ºC por 2 min, e o passo final de alongamento de 72 ºC por 10 min
em um AMPLITHERM Thermal Cyclers.
O produto de ISSR-PCR foi submetido à eletroforese em gel de
agarose 1,2% em tampão TEB 0,5x. Determinou-se o tamanho dos
amplicons com marcador 123pb DNA Ladder (Sigma-Aldrich, Inc.). As
imagens foram salvas em um fotodocumentador (Loccus Biotecnologia,
Brasil) para posterior analise. A avaliação da diversidade ocorreu por
inspeção visual do gel, considerando todos os amplicons visíveis. Isolados
com o mesmo perfil de amplificação foram considerados dentro do mesmo
morfotipo. Selecionou-se uma linhagem representante de cada morfotipo
para identificação molecular.
A identificação ocorreu pelo sequenciamento parcial do espaçador
interno transcrito (ITS) da região rDNA de representantes de cada grupo de
morfotipo. Os oligonucleotídeos ITS 4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-
3′) e ITS 5 (5`-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3') (White et al. 1990)
foram utilizados para amplificação da região intergênica 18S a 28S. O
36
volume de reação foi de 25 µL e as condições de amplificação realizou-se
como segue: desnaturação inicial de 94ºC por 2 min, seguido de 35 ciclos de
94 ºC por 45 seg, 50 ºC por 45 seg e 72 ºC por 1 min, e o passo final de
alongamento de 72 ºC por 10 min em um AMPLITHERM Thermal Cyclers.
Os produtos de amplificação foram purificados (Dunn; Blattner, 1987)
e quantificados por eletroforese em gel de agarose 1,2%. O sequenciamento
foi realizado pelo método de Sanger com o Kit Big Dye no ABI3100 Applied
Biosystem.
2.2.4 Variabilidade genética e identificação molecular das linhagens de
bactérias endofíticas
A extração do DNA genômico total das bactérias purificadas foi
realizada segundo a metodologia de Cheng et. al. (2006) e os
oligonucleotídeos ERIC1 (5'-ATGTAAGCTCCCTGGGGATTCAC-3') e ERIC2
(5'-AAGTAA GTGACTGGGGTGAGCG-3') (Tian-Xing, 2011) usados para
avaliar a diversidade genética dos isolados. O volume da reação de ERIC-
PCR foi de 25 µL e a amplificação aconteceu através dos seguintes passos:
desnaturação inicial a 94 ºC por 2 min, seguida de 30 ciclos a 94 ºC por 1
min, 45,5 ºC por 1 min e 30 seg. e 68 ºC por 6 min, e a extensão final a 68
ºC por 10 min.
O produto de ERIC-PCR foi submetido à eletroforese em gel de
agarose 1,2% em tampão TEB 0,5x. Determinaram-se os tamanhos dos
amplicons com marcador 123pb DNA Ladder (Sigma-Aldrich, Inc.). As
imagens foram salvas em um foto documentador (Loccus Biotecnologia,
Brasil) para posterior análise. A avaliação da diversidade ocorreu por
inspeção visual do gel, considerando todos os amplicons visíveis. O perfil de
amplificação transformou-se em uma matriz binária com os valores:
0:ausência e 1: presença para cada amplicon. A similaridade dos dados foi
calculada através do Coeficiente de Jaccard (Sneath e Sokal, 1973). O
agrupamento, utilizando o algoritimo UPGMA (Unweighted Pair-Group
Method with Arithmetical Average), foi obtido baseando-se na matriz de
similaridade com o software NTSys v.2.1(Rohlf, 2001). Considerou-se um
37
nível de 80% de similaridade mínima entre os isolados para definição de
Unidade Taxonômica Operacional (OTU) (Torres et al, 2008).
A amplificação do gene 16S rDNA foi realizado utilizando os primers
27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3′) e 1492R (5′-TAC GGY TAC
CTT GTT ACG ACT T-3′) (Weisburg et al. 1991). As condições de
amplificação ocorreu como segue: desnaturação inicial de 94 ºC por 2 min,
seguido de 35 ciclos de 94 ºC por 45 seg., 50 ºC por 45 seg. e 72 ºC por 1
min, e extensão final de 72 ºC por 10 min.
Os produtos de amplificação foram purificados (Dunn; Blattner, 1987)
e quantificados por eletroforese em gel de agarose 1,2%. O sequenciamento
incidiu pelo método de Sanger com o Kit Big Dye no ABI3100 Applied
Biosystem.
2.2.5 A análise dos dados
As sequências ITS e 16S foram comparadas no banco de dados do
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com sequências conhecidas, por
uma pesquisa de similaridade via Blastn (Altschul et al. 1990).
O calculo da frequência de colonização dos endofíticos deu-se pela
fórmula:
Onde TC é a taxa de colonização, FE é o número de fragmentos com
pelo menos um endofítico e FT é o número total de fragmentos analisados
(Photita et al. 2001). A abundância relativa foi calculada dividindo o número
de isolados de um táxon pelo número total de isolados de todos os táxons.
Os táxons raros consistiram-se dos isolados com frequência inferior a 3,3%
(Sun et al. 2012). O índice dediversidade de Shannon (H’) foi calculado de
acordo com a fórmula:
Onde s é o número de espécie, e pi é a abundancia relativa de cada
espécie. A equitabilidade (J) foi estimada de acordo com a fórmula J=
HS/HSmax , onde HS é o índice de diversidade de Shannon e HSmax
representa o valor máximo de HS, considerando um indivíduo de cada
espécie na comunidade (Kumar & Hyde 2004).
TC (%)= FE
FT x 100
38
2.3 Resultados e discussão
As interações entre vegetais e seus microrganismos associados são
complexas e capazes de influenciar o estabelecimento de comunidades
vegetais e alterar diferentes atributos do ecossistema. Tais relações, são
alvo do interesse de diferentes pesquisadores e os resultados, além de
contribuir na elucidação dos mecanismos de interação, tem diferentes
aplicações ecológicas e biotecnológicas. Este trabalho apresenta o
isolamento e elucidação da diversidade taxonômica e genética de endófitos
cultiváveis presentes em Echinodorus scaberRataj (macrophyllus) presente
em área úmida no Brasil. Apesar da metodologia utilizada, ser dependente
de cultivo, e espécies com baixa taxa de crescimento ou não cultiváveis
serem improváveis de isolamento por esta técnica (Hyde & Soytong, 2008),
uma relativa diversidade de endófitos foi obtida de E. scaber, representada
pelas 159 linhagens de microrganismos cultiváveis obtidos a partir de 221
fragmentos de pecíolo e raiz de (Tabela 1). Deste total, 46 linhagens
correspondem a fungos (29 de pecíolo e 17 de raiz) e as demais 113 são
bactérias (69 de pecíolo e 44 de raiz). As frequências de colonização geral,
desconsiderando os diferentes órgãos analisados, constituíram 23,34 e
50,42% para fungo e bactéria, respectivamente.
39
TABELA 1 - Taxa de colonização (%), índice de diversidade de Shannon (H'),
índice de equitabilidade (J) e riqueza de endófitos cultiváveis
presentes nos pecíolo e raiz de Echinodorus scaber
Fungo Bactéria
Pecíolo Raiz Total Pecíolo Raiz Total
Nº de Amostras 119 102 221 119 102 221
Nº de amostras
infectadas 37 14 51 86 32 118
Nº de isolados
recuperados 30 16 46 69 44 113
Taxa de
colonização (%) 30.15 13.70 23.34 73.17 31.48 50.42
H’ 1.96 2.07 2.56 1.56 2.40 2.49
J 0.81 0.94 0.87 0.61 0.86 0.77
Riqueza 11 8 19 13 16 25
Apesar do índice de diversidade de Shannon para fungos (H’ 2,56) ser
levemente maior em relação ao índice de bactérias (H’ 2,49), a riqueza de
espécies bacterianas, representada pelas 25 espécies, foi maior que as 19
espécies de fungos. Os valores de equitabilidade (J) das comunidades foram
0.77 e 0,87 para bactérias e fungos, respectivamente. Índices de diversidade
permitem a compreensão do espectro e densidade de endófitos num único
número facilitando comparações entre espécies de plantas, hábitats, clima,
assim como determinar mudanças nas relações da comunidade frente a
alterações nos fatores bióticos e abióticos (Mahaffee and Kloepper 1997a,
1997b). A riqueza de espécies e composição geralmente variam entre
40
hospedeiros individuais e influenciadas pela condição do hospedeiro (Sieber
e Hugentobler, 1987), pelo tempo de amostragem e pela localização precisa
das unidades amostradas (Unterseher et al. 2007). Consequentemente, a
apresentação da riqueza e composição de endófitos basearam-se em
metodologias de cultivo utilizando três indivíduos coletados da mesma região
e sob condições ambientais muito semelhantes.
.
2.3.1 Estrutura da assembleia de fungos isolados de Echinodorus
scaber
As 46 linhagens de fungos obtidas de E. scaber foram agrupadas em
19 morfotipos pelas características macroscópicas do micélio e diferenciação
de estruturas reprodutivas in vitro. Metodologias tradicionais de identificação
de fungos, envolvendo análise de caracteres morfológicos, não identificam
linhagens estéreis e podem agrupar linhagens com características
semelhantes. A confirmação dos agrupamentos ocorreu pelo perfil de
amplificação do marcador molecular ISSR das diferentes linhagens dentro
do mesmo grupo (dados não mostrados). Linhagens agrupadas
morfologicamente apresentaram perfis de amplificação ISSR idênticos.
A identificação da linhagens resultou em 13 gêneros distribuídos em 19
táxons (Tabela 2). Três morfotipos foram identificados pelas características
reprodutivas ao nível de gênero: Acremonium sp, Colletotrichum sp e
Penicillium sp; um quarto morfotipo, por não diferenciar esporos não pode
ser identificada e, portanto, denominada de micelia sterillia (MS).
Os demais quinze grupos morfológicos foram identificados pelo
sequenciamento da região ITS da grande subunidade do gene rRNA. A
identificação molecular revelou 15 diferentes táxons com alta identidade -
97% de identidade da região ITS foi usado como critério de similaridade ao
nível de espécie (Brienet al. 2005)- com outras sequências depositadas no
GenBank (Tabela 2). As sequências ITS de três táxons resultaram em
identidades abaixo de 93% podendo representar espécies ainda
desconhecidas ou ineficiência do marcador utilizado na identificação.
Apesar da região ITS possuir regiões variáveis favoráveis à análise de
espécies próximas, outros marcadores tem sido utilizados para elucidar
41
relações filogenéticas mais complexas, tais como os genes da citocromo
oxidase C mitocondrial , DNA topoisomerase e beta-globulina (White et
al.1990; Guarro et al. 1999; Hinukson et al. 2005).
A identificação molecular demonstrou que os fungos são Dikarya,
especificamente Ascomycota, distribuídos em Pezizomycotina. As classes
representativas foram Sordariomycetes (Sordariales, Xylariales,
Microascales, Hypocreales e Glomerellales), Dothideomycetes (Pleosporales
e Capnodiales) e Eurotiomycetes (Eurotiales) representando 44,4, 31,2 e
24,4% das linhagens identificadas, respectivamente. Arnold e Lutzoni (2007)
indicam Sordariomycetes como classe abundante de fungos endofíticos
presentes em planta tropicais. E. scabera presentou porcentagens
consideráveis de Dothideomycetes e Eurotiomycetes, sugerindo que esta
espécie possa ser um reservatório destas classes de importância econômica
e ecológica, assim como observado em plantas de café em países tropicais
(Vega et al. 2010).
O gênero mais frequente em E. scaber constituiu-se de Acremonium,
seguido de Penicillium sp (Tabela 3). O primeiro é amplamente distribuído na
subfamília Pooideae de Poaceae (White et al. 1993) e, em determinados
hospedeiros, contribui na resistência a insetos (Breen, 1994). Este gênero
ocorreu especificamente em pecíolo, bem como a sua especificidade por
folhas da planta medicinal Tinospora cordifolia (Mishra et al. 2012).
Penicillium é outro gênero comumente conhecido por colonizar diversos
órgãos como raiz, pecíolo e folha de diferentes hospedeiros (Geris et al.
2003; Xing e Guo, 2011; Mishra et al. 2012) e do ponto de vista
biotecnológico, representa uma excelente fonte de produtos naturais com
propriedades anti-tumor (Nicoletti et al. 2008).
Novetáxons raros (Abundância relativa < 3,3%) e outros sete, apresentando
frequência mediana (Abundância relativa entre 3% e10%), estão presentes
nesta espécie hospedeira (Tabela 3).
Em geral, a assembléia de fungos endofíticos possui um ou poucos grupos
dominantes, sendo a maioria composta por espécies raras (Petrini et
al,1992). Em folhas de Myrciaria floribunda e Alchoenea castaneifolia,
42
espécies vegetais de savanas brasileiras, o gênero Colletotrichum foi o mais
frequentemente isolado (Vaz et al, 2012) e, nas folhas e pecíolos de Hevea
brasiliensis, os gêneros Pestalotiopsis, Penicillium, Trichoderma foram os
mais frequentes (Gazis & Chaverri, 2010).
A frequência de colonização nos pecíolos de E. scaber por fungos
endofíticos foi maior em relação às raízes (Tabela 1). Houve diferença no
índice de diversidade de Shannon (H’=1,96, H’=2.07) entre as comunidades
fúngicas de pecíolo e raiz, respectivamente. Em muitos casos, as raízes
apresentam maiores índices em relação a outros órgãos, como folhas, por
exemplo, (Tao et al. ,2012). Da mesma forma, a equitabilidade (J) foi maior
em raiz, conforme apresentado para os fungos endofíticos das raízes da
orquídea Bletilla ochracea (Tao et al. ,2012).
Houve diferença nítida na composição e riqueza da comunidade fúngica
considerando os diferentes órgãos analisados (Tabela 3). Penicillium sp
constituiu o único táxon comum aos dois órgãos analisados e os demais 18
táxons foram tecidos específicos. A riqueza de espécies foi maior no pecíolo
(11 táxons em comparação aos oito presentes em raíz) onde encontrou-se
seis táxons raros obtidos somente deste órgão. Acremonium sp e
Massariosphaeria sp. constituíram os mais frequentes em pecíolo, enquanto
nas raízes, o gênero Penicillium (representados pelos grupos Penicillium sp
e Penicillium shearii) foi dominante.
Diferenças na comunidade endofítica entre órgãos do mesmo hospedeiro
são comumente encontradas indicando certo grau de tecido especificidade
(Rivera-Orduna et al. 2011; Tao et al 2012; Rodrigues e Samuels 1990;
Rodrigues 1994; Photita et al. 2001;Kumar e Hyde 2004). Diferentes
hipóteses auxiliam na compressão desta especialização: diferentes táxons
podem apresentar capacidades diferenciadas em utilizar e sobreviver a partir
de um substrato específico (Carroll e Petrini, 1983); comunidades de fungos
são afetadas pela textura e alterações na fisiologia e fitoquímica do tecido
vegetal (Arnold et al. 2001); hospedeiros ou ambientes, por exemplo, parte
aérea e radicular do hospedeiro, possuem diferentes fatores físico-químicos
limitantes ao desenvolvimento das diferentes espécies microbianas, tais
43
como umidade, compostos químicos, temperatura, pH, dentre outros. A
dificuldade de translocação das hifas nos tecidos internos do hospedeiro
pode contribuir para a sua permanência em determinado órgão no qual a
infecção iniciou.
Com exceção do gênero Massariosphaeria, os demais táxons encontrados
em E. scaber foram descritos anteriormente em outros hospedeiros (Gond et
al. 2007;Ge et al. 2008;Madki et al. 2010;Rivera-Orduña e Suarez-Sanchez,
2011;Liu et al. 2012;Khan et al. 2012a;Maciá-Vicente e Ferraro, 2012;Qi et
al. 2012;Spiteller et al. 2012;Wang et al. 2012).
O potencial de fungos endófitos como fonte de novos produtos naturais com
bio-atividades é evidente e atrativo para diferentes áreas da biotecnologia
farmacêutica e agrícola. Em pouco mais de um ano, diferentes
pesquisadores descreveram mais de 178 substâncias produzidas por
fungos, sendo 138 novos metabólitos (Debbab et al., 2012). Algumas
espécies de fungos obtidas de E. scaber são promissoras na produção de
compostos com propriedades bio-ativas e merecem atenção especial pelo
seu potencial biotecnológico.
Polocetideos é uma grande família de produtos naturais com grande
diversidade estrutural sintetizados por plantas, fungos e bactérias utilizado
como medicamento clinicamente efetivas em diferentes aplicações; três
novos policetídeos foram isolados do endófito E. shearii isolado da planta
medicinal Thysanoleana latifolia(Jumpathong; Seshime, 2011). Em
Pestalotiopsis theae identificou-se quatro novos pestalotíois, sendo que um
destes inibiu eficientemente a replicação do vírus HIV in vitro (Li et al. 2008).
Brefeldina A, composto com diferentes propriedades biológicas (Harri et al.
1963), foi produzido por Cladosporium sp isolado da planta medicinal
Quercus variabilis(Wang et al. 2007). Acremonium e Colletotrichum são
comumente relatados como gêneros importantes na prospecção de produtos
ou processos biotecnológicos (Yu et al. 2010; Baker e Satish, 2012).
Outras espécies são importantes em processos que resultam na
promoção de crescimento de plantas ou no controle de doenças causadas
por patógenos. Paecilomyces lilacinus destaca-se no controle biológico de
44
nematódeos por parasitar ovos e fêmeas reduzindo a sua densidade
populacional no solo e algumas linhagens tem sido objeto de patentes (EPA,
2005; Kiewnick e Sikora, 2003, 2006).
Este estudo demonstrou que E. scaber abriga uma diversidade fungos
endofíticos com grau de órgão especificidade em relação as espécies
obtidas. As linhagens isoladas e mantidas em micoteca são uma importante
fonte para a prospecção de novos metabólitos com propriedades de
interesse ou de compostos similares relatados para seu hospedeiro, além de
compreender seus papeis funcionais. Para essas propostas, o foco da
pesquisa foi especificamente sobre a assembléia de fungos cultiváveis.
Obviamente, a utilização de técnicas independentes de cultivo e baseadas
na análise de DNA devem ser utilizadas para identificar e ampliar o
conhecimento da comunidade de fungos endofíticos de E. scaber.
45
TABELA 2 - Identificação molecular de morfotipos de fungos endofíticos
isolados de Echinodorus scaber, baseados em suas
sequências ITS com base em consultas BLASTN em NCBI
Isolados GenBank Nº de
Acesso
Identidade
(%)
FAEII-23 Cercospora apii JX143532.1 99
FREII-55, FREII-54 Chaetomium aureum JQ846057.1 99
FAEII-18 Cladosporium
cladosporioides JQ936096.1 99
FAEII-19, FAEII-24 Cochliobolus lunatus JN853778.1 99
FAEII-21 Cochliobolus sativus EF452447.1 99
FAEII-7a, FAEII-15, FAEII-16 Corynespora sp. JN853778.1 99
FREI-39 Eupenicillium shearii JQ863221.1 99
FAEII-13 Paecilomyces lilacinus HM439952.1 99
FAEII-9 Corynespora cassiicola AY238606.1 98
FREIII-62 Pseudallescheria boydii JQ889698.1 98
FREII-57 Eupenicillium javanicum U18358.1 97
FAEII-23a, FAEII-12,
FAEII-18a, FAEII-22 Massariosphaeria sp. JQ435790.1 96
FREIII-ED2 Lophiostoma cynaroidis EU552138.1 93
FREI-35, FREI-36, FREI-40 Penicillium shearii GU944606.1 92
FREII-50, FREII-ED1 Pestalotiopsis theae HQ832793.1 89
FAEII-4, FAEII-7, FAEII-8,
FAEII-10, FAEII-20, FAEII-25,
FAEII-26, FAEII-27, FAEII-28,
FAEII-29, FAEII-30, FAEIII-33
Acremonium sp. - -
FREIII-59, FREIII-60 Colletotrichum sp. - -
FAEII-11 Mycelia sterilia
FAEII-6a, FAEII-14, FAEII-15a, Penicillium sp. - -
FREI-37, FREII-56, FREIII-58
-: Fungos identificados por características morfológicas
46
TABELA 3 - Abundância relativa (%) dos microrganismos endofíticos isolados de pecíolo e raiz de Echinodorus scaber
Bactérias
Fungos
Pecíolo Raiz Total
Pecíolo Raiz Total
Bacillus sp. 1,92 8,89 5,15
Penicillium sp. 10 17,65 12,77
Klebsiella pneumoniae 7,7 20 13,40
Acremonium 40 - 25,53
Pseudomonas putida 1,92 4,44 3,10
Cercospora apii 3,33 - 2,13
Pseudomonas sp. HE613571.1 1,92 4,44 3,10
Cladosporium cladosporioides
3,33 - 2,13
Acinetobacter schindleri 1,92 - 1,03
Cochliobolus lunatus 6,67 - 4,25
Acinetobacter sp 1,92 - 1,03
Cochliobolus sativus 3,33 - 2,13
Enterobacter cloacae 5,77 - 3,10
Corynespora cassiicola
3,33 - 2,13
Enterobacter ludwigii 1,92 - 1,03
Corynespora sp. 10 - 6,38
Enterobacter sp.
JN 391530.1 3,85 - 2,10
Massariosphaeria sp.
13,33 - 8,51
Enterobacter sp. JQ396391.1 61,54 - 32,99
Mycelia sterilia I 3,33 - 2,13
Microbacterium sp. 1,92 - 1,03
Paecilomyces lilacinus
3,33 - 2,13
47
Táxons raros (frequência <3,3%) (Sun et al. 2012).
Bactérias
Fungos
Pecíolo Raiz Total
Pecíolo Raiz Total
Pseudomonas hibiscicola 5,77 - 3,10
Chaetomium aureum - 11,77 4,25
Pseudomonas sp. FJ405364.1 1,92 - 1,03 Colletotrichum sp. - 11,77 4,25
Aeromonas hydrophila - 2,22 1,03
Eupenicillium javanicum
- 5,88 2,13
Bacillus não cultivável - 6,67 3,10
Eupenicillium shearii - 5,88 2,13
Bacillus pumilus - 22,22 10,31
Lophiostoma cynaroidis
- 5,88 2,13
Bacillus subtilis - 2,22 1,03
Penicillium shearii - 23,53 8,51
Burkholderia nodosa - 2,22 1,03
Pestalotiopsis theae - 11,77 4,25
Enterobacter cancerogenus - 6,67 3,10
Pseudallescheria boydii
- 5,88 2,13
Enterobacter sp. HQ673829.1 - 8,89 4,12
Enterobacter sp. JX941543.1 - 2,22 1,03
Microbacteriaceae bacterium - 2,22 1,03
Ralstonia pickettii - 2,22 1,03
Stenotrophomonas sp. - 2,22 1,03
48
2.3.2 Estrutura da assembleia de bactérias de Echinodorus scaber
Até o presente momento, informações sobre à diversidade de
bactérias endofíticas foram obtidas por metodologias dependentes de
cultivo. Ao total, 113 linhagens heterotróficas foram isoladas de pecíolo e
raíz de E. scaber indicando que os tecidos internos destes órgãos abrigam
uma assembléia de bactérias endofíticas. A diversidade genética destes
isolados foi avaliada por meio da análise comparativa dos padrões
eletroforéticos obtidos da amplificação ERIC-PCR. A análise de
agrupamento, utilizando o modelo UPGMA, resultou no dendrograma (Figura
1). Considerando o nível de 80% de similaridade, observa-se 51 Unidades
Taxonômicas Operacionais (OTU’s) constituídas de 22 grupos compostos
por pelo menos duas linhagens (apresentando similaridade J-=1). As demais
OTU’s são constituídas por linhagens de perfis únicos de amplificação via
ERIC-PCR.
Identificação molecular pelo sequenciamento parcial do gene 16S
rRNA de 44 OTU’s resultou em 10 gêneros distribuídos em 25 táxons
pertencentes aos filos Proteobacteria (78,32% das linhagens –
representando as classes gamma e beta-proteobacteria), Firmicutes
(19,59%) e Actinobacteria representando aproximadamente 2% dos isolados
analisados (Tabela 4).
Proteobacteria é um importante e frequente grupo de endófitos
encontrado em vegetais (Ferrando et al. 2012), inclusive em espécies
presentes em áreas úmidas (Li et al. 2011a). Deste filo, a classe
Gammaproteobacteria foi mais diversificada sendo representada pelos
gêneros Enterobacter, Acinetobacter, Pseudmonas, Klebsiela, Aeromonas e
Stenotrophomonas. Somente os gêneros Bukholderia e Ralstonia
constituíram-se como Betaproteobacteria.
É esperado que diferentes hospedeiros abriguem uma comunidade
relativamente diversificada de bactérias endofíticas como a encontrada neste
estudo. Em 220 fragmentos de raízes de canola isolou-se 18 diferentes
gêneros de bactérias endofíticas (Germida et al. 1998).
49
O gênero predominante em E. scaberfoi Enterobacter representando
aproximadamente 48% das linhagens, bem como os gêneros Bacillus
(19,59%), Klebsiela (13,40%) e Pseudomonas (10,31%) (Tabela 3). Os dois
gêneros mais comuns são comumente descritos como endófitos de
diferentes espécies vegetais, como Glycine max e Sophora
alopecuroides(Assumpçãoet al. 2009; Zhaoet al. 2011b) e possuem
importantes aplicações controle biológico de patógenos (Senthilkumar et al.
2009; Cho et al. 2009), produção de enzimas hidrolíticas (Islam et al. 2010) e
na promoção do crescimento vegetal (Dias et al. 2009; Madmony et al.
2005). Acinetobacter, Microbacterium, Aeromonas, Burkholderia, Ralstonia e
Stenotrophomonas constituiram os gêneros menos frequentes encontrados
em E. scaber (Tabela 3). Os dois primeiros foram obtidos somente de
pecíolos e os demais isolados de fragmentos de raízes. As espécies
dominantes de pecíolo e raiz variaram de acordo com o órgão, sendo
Enterobactersp. JQ396391.1 abundante no primeiro, e Bacillus pumilus no
segundo.
Enterobacter é comumente relatado como endofíto, encontrado
como dominante em caule de cana de açúcar (Magnaniet al. 2010).
Interessantemente, a linhagem Enterobacter sp. JQ396391.1 – isolada de
pecíolo -possui alta homologia com sequências depositadas no GenBank
obtidas de bactérias endofíticas fixadoras de nitrogênio isoladas de arroz
(JN698043) e a Enterobacter sp. PXG11 (JQ396391) presente no trato
digestivo de Plutella xylostella - traça das crucíferas.
Os índices de diversidade e a riqueza de espécies em raíz foram
maiores (H’ 2,40 e 16 espécies) (Tabela 1) em relação aos parâmetros
encontrados em pecíolo (H’ 1,56 e 13 espécies) como observado na
assembléia de bactérias endofíticas de batata e Panax notoginseng (Berg et
al. 2005; Ma et al. 2012). Esse resultado está de acordo com Rosenblueth e
Martínez-Romero (2004) que afirmam que na maioria das espécies vegetais,
as raízes abrigam maiores quantidades de endófitos quando comparadas às
partes aéreas.
50
Em E. scaber, bactérias endofíticas são menos restritivas a
colonização de um determinado órgão em relação aos resultados
encontrados para fungos. Klebsiela pneumonie, Bacillussp., Pseudomonas
sp HE 613571.1 e Pseudomonas putida foram comuns entre pecíolo e raiz
(Tabela 3). O tamanho e a plasticidade metabólica das bactérias podem ter
contribuído para a translocação ou movimentação de espécies entre órgãos
próximos através do xilema. A órgão-especificidade resultou em nove e doze
espécies características de pecíolo e raiz, respectivamente.
Os gêneros Enterobacter, Pseudomonas, Klebsiella, Aeromonas e
Burkholderia foram descritas em outros hospedeiros presentes em áreas
úmidas na China em Typha angustifolia e Phragmites australis (Jha e
Kumar, 2007; Li et al. 2010, Li et al. 2011); Microbacterium e
Stenotrophomonas detectados em Oryza sativa (Ferrando et al. 2012) e
Lima (2012) obteve os gêneros Burkholderia, Bacillus, Acinetobacter e
Ralstonia de fragmentos de raízes de Vochysia divergens coletados na
mesma área desta pesquisa. Especificamente, a espécie Rasltonia picketti
obtida das raízes de E. scaber e V. divergens possuem homologia entre si
compartilham identidade com as mesmas sequencias depositadas no
GenBank. A proximidade genética entre as linhagens bactérias isoladas na
mesma área em de E. scaber e V. divergens será futuramente determinada
para discutir a possível transferência horizontal destes táxons entre os
hospedeiros.
Durante a associação entre planta-endófito, o hospedeiro fornece uma
miríade de nutrientes, além de um habitat cujas condições físico-quimicas
são mais constantes em relação aquelas do ambiente externo ao
hospedeiro. Em contrapartida, esses microrganismos favorecem, direta ou
indiretamente, o crescimento e produtividade ao seu parceiro (Costa e
Loper, 1994; Verma et al. 2001; Muthukumarasamy et al. 2002; Lee et al.
2004; Wakelin et al. 2004; Ryan et al. 2008). A estação úmida no Pantanal é
marcada por uma intensa produtividade, principalmente pela disponibilidade
de água, que até então, era um dos fatores mais limitantes neste ambiente
na estação de seca. A comunidade endofítica pode ter um papel significativo
51
na ciclagem de nutrientes, atuando na degradação e/ou mineralização da
matéria orgânica e consequentemente, disponibilizando nutrientes neste
ecossistema. Bactérias endofíticas podem fixar nitrogênio, além de
solubilizar fosfato mineral, sugerindo que estes organismos possam
aumentar a disponibilidade de nutrientes para seus hospedeiros, como é
sugerido por Kuklinsky-Sobral et al. (2004) para Pseudomonas, Ralstonia,
Enterobacter, Pantoea e Acinetobacter em soja.
Outros gêneros, como Stenotrophomonassp faz parte da microbiota
edáfica e sua diversidade metabólica permite a utilização de compostos
fenólicos e desnitrificação (Heylen et al. 2007). Liu et al. (2007) demonstrou
a capacidade de degradação de p-nitrofenol por Stenotrophomonassp
linhagem LZ-1 e seu potencial uso em programas de biorremediação, já que
este é um composto tóxico derivado da degradação do paration (Mulbry e
Karns, 1989). Características importantes em programas de remediação, tais
como degradação de compostos fenólicos (Al-Zuhair e El-Naas, 2012) e
derivados de petróleo (Bucheli-Witschel et al. 2009), foram demonstradas
em linhagens da espécie R. picketti. Resultados semelhantes ocorreram na
degradação de óleo diesel (Kaczoreket al. 2010) e remoção de cádmio/zinco
por A. hydrofila e Microbacterium sp (Aniszewski et al. 2010),
respectivamente.
E. scaber possui uma assembleia de bactérias heterotróficas
endofíticas nos pecíolos e raízes com um potencial a ser explorado na
promoção de crescimento de plantas, no controle biológico de patógenos e
na capacidade de biorremediação de compostos tóxicos no ambiente.
52
FIGURA 1 - Dendograma gerado a partir da analise do perfil de amplificação
por ERIC-PCR das linhagens de bactérias endofíticas isoladas
de E. scaber, utilizando coeficiente de similaridade de Jaccard.
53
TABELA 4 - Identificação molecular das bactérias endofíticas, baseados em
suas sequências parciais do gene 16S rRNA
Isolados GenBank Nº de
Acesso Identidade
(%)
BAEI-8 Acinetobacter sp AM184209.1 99
BAEIII-63 Enterobacter cloacae JX514409.1 99
BAEI-1, BAEI-3, BAEI-7, BAEI-9, BAEI-10, BAEI-12, BAEI-13, BAEI-15, BAEI-16, BAEI-18, BAEI-20, BAEI-24, BAEI-25, BAEI-26, BAEII-33, BAEII-37, BAEII-39, BAEII-40, BAEII-49
Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEI-2, BAEI-4 Enterobacter sp. JN391530.1 99
BAEI-11 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEI-19, BAEI-21, BAEI-22, BAEI-23, BAEIII-75
Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEI-30 Enterobacter sp. JQ396391.1 99 BAEII-36 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEII-38 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEII-48, BAEIII-79 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BREI-82 Enterobacter sp. JX941543.1 99
BAEIII-62 Klebsiella pneumoniae JX435602.1 99
BREI-117, BREI-131, BREII-150
Klebsiella pneumoniae JF772061.1 99
BAEIII-76, BREI-85, BREI-88a Klebsiella pneumoniae JF772079.1 99
BREI-129, BREI-118 Klebsiella sp. JQ793784.1 99 BAEIII-57 Pseudomonas putida JX276777.1 99
BAEII-31 Pseudomonas sp. HE613571.1 99
BAEI-14, BAEI-17 Enterobacter cloacae JF513137.1 98
BREIII-107 Bacillus subtilis JX489606.1 98 BREI-88 Bacterium MCF49 HQ179093.1 98
BREI-89, BREII-139 Pseudomonas sp. HE613571.1 98
BAEII-50, BAEIII-72 Pseudomonas hibiscicola
JQ659719.1 98
BAEIII-60 Pseudomonas hibiscicola
JQ291604.1 98
BAEIII-59, BREI-92, BREI-121, BREI-126, BREIII-104
Bacillus sp. AY437616.1 97
BAEIII-64 Enterobacter ludwigii JN644550.1 97
BAEIII-67, BREII-142 Klebsiella pneumoniae JX435602.1 97
BREI-116 Pseudomonas putida JX276777.1 97
BREIII-108, BREI-132, BREII-135, BREII-138
Enterobacter sp. HQ677829.1 96
54
Isolados GenBank Nº de
Acesso Identidade
(%)
BREI-86 Microbacteriaceae bacterium
DQ490447.1 96
BREI-84 Uncultured bacterium HM778681.1 96
BREII-136 Stenotrophomonas sp. EU722314.1 95
BREII-99, BREI-128, BREII-100
Uncultured Bacillus sp. FJ227516.1 95
-: Linhagens ainda não sequenciadas
55
2.4 Conclusões
Pecíolo e raiz de Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) são
colonizados por fungos e bactérias endofíticas. Isolou-se 46 linhagens de
fungos e 113 cepas de bactérias deste hospedeiro.
A riqueza da assembléia de bactérias é maior em relação à de
fungos. Treze gêneros distribuídos em 19 táxons de fungos foram
identificados ao passo que para bactérias distinguiu-se 10 gêneros
distribuídos em 25 táxons.
Observou-se tecido especificidade maior para fungos, sendo o
gênero Penicillium comum a raízes e pecíolos, e para bactérias,
Enterobacter, Klebsiela, Bacillus e Pseudomonas foram obtidas nos dois
órgãos analisados.
O banco de fungos e bactérias obtidas de E. scaber possuem
gêneros e espécies com potencial para a prospecção de metabólitos
especiais, uso em programas de controle biológico, biorremediação e
promoção de crescimento de plantas.
56
2.5 Referências Bibliográficas
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66
3. DARK SEPTATE DE Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus) E SUAS ESPECIFICIDADES EM
DIFERENTES HOSPEDEIROS
67
DARK SEPTATE DE Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) E SUAS
ESPECIFICIDADES EM DIFERENTES HOSPEDEIROS
Resumo – Fungos endofíticos dark septate (DSE), são um grupo de fungos
endofíticos caracterizados pelas hifas melanizadas e septadas e que
colonizam assintomaticamente a raiz da planta hospedeira, geralmente em
habitats estressantes. Essa interação pode conferir a planta hospedeira
diversas vantagens, como resistência induzida a estresses bióticos e
abióticos. Fungos endofíticos isolados de Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus), com características de DSE foram selecionados a fim de
confirmar a característica de dark septate das linhagens e identificá-las, além
de determinar o potencial endofítico das possíveis linhagens DSE em
diferentes hospedeiros in vitro. Raízes de E. scaber foram diafanizadas,
coradas e observadas em microscópio para averiguar se essa planta
continha estruturas características de DSE; o que resultou na observação de
diferentes estruturas fúngicas, tanto de fungos endomicorrízicos e DSE. A
identificação molecular pelo sequenciamento da região do espaçador interno
transcrito do gene rRNA das linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2, apresentou
89 e 93% de identidade com as linhagens Pestalotiopsis theae
(HQ832793.1) e Lophiostoma cynaroidis (EU552138.1). Essa baixa
identidade pode caracterizar novas linhagens de DSE isolados de E. scaber.
Posteriormente, FREII-ED1 e FREIII-ED2 foram inoculados em plântulas
gnotobióticas de quatro espécies não hospedeiras, pertencentes a três
famílias botânicas diferentes, sendo as espécies Vochysia divergens Pohl,
Vochysia haenkeana, Combretum lanceolatum Pohl ex Eichler, pertencentes
à comunidade de plantas da área de coleta, e Capsicum frutensces L.
(pimenteira). Nenhuma das espécies vegetais inoculadas apresentou
sintomas aparentes de doença quando inoculados com as linhagens
fúngicas. As raízes das espécies inoculadas foram diafanizas e coradas com
azul de tripano para observação em microscópio, o que demonstrou que os
endofíticos colonizaram as raízes de todas as espécies onde foram
68
observadas hifas junto ao sistema radicular. Estruturas típicas de DSE,
como hifas melanizadas septadas inter e intracelularmente e
microescleródios internamente as células foram observadas nas raízes das
espécies vegetais utilizadas, demonstrando que FREII-ED1 e FREIII-ED2
correspondem a microrganismos DSE. A colonização de diferentes
hospedeiros, incluindo C. frutensces, uma espécie de interesse agronômico
demonstra que esses microrganismos são capazes de se infectar
assintomaticamente outras espécies da comunidade de espécies de plantas
local, sendo possível que essas linhagens possam ter papéis funcionais
importantes no estabelecimento das espécies aos quais estejam presentes,
sendo necessários futuros estudos a campo para averiguação dessa
hipótese.
Palavras-chave: Fungos edofíticos, interação fungo-planta, chapéu de
couro, Pantanal.
69
DARK SEPTATE OF Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) AND
SPECIFIC IN DIFFERENT HOSTS
Abstract – Dark septate endophytic fungi (DSE) are a group of endophytic
fungi and characterized by melanized septate hyphae and asymptomatically
colonize the roots of the host plant, usually in stressful habitats. This
interaction may confer several advantages to the host plant, as induced
resistance to biotic and abiotic stresses. Endophytic fungi isolated from
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus), with characteristics of SDRs were
selected to confirm the characteristic dark septate strains and identify them
and determine the potential of endophytic possible DSE strains in different
hosts in vitro. Roots of E. scaber were cleared and stained and observed
under microscope to see if this plant characteristic structures contained in
SDRs, which resulted in the observation of different fungal structures, both
SDR and mycorrhizal fungi. Molecular identification by sequencing the
internal transcribed spacer region of the rRNA gene of the strains FREII-and
ED1-ED2 FREIII, showed 89 and 93% identity with the strains Pestalotiopsis
theae (HQ832793.1) and Lophiostoma cynaroidis (EU552138.1). This low
identity can characterize new strains isolated from E. SDRs scaber. Later,
FREII-ED1 and ED2 FREIII-gnotobiotics seedlings were inoculated in four
non-host species, belonging to three different botanical families, and species
Vochysia divergens Pohl, Vochysia haenkeana, Combretum lanceolatum
Pohl ex Eichler, community owned plant area collection, and Capsicum L.
frutensces (Pepper). None of the inoculated plant species showed apparent
symptoms of disease when inoculated with fungi. The roots of the species
have been inoculated diafanizas and stained with trypan blue for observation
under a microscope, which showed that endophytes colonize the roots of all
species where hyphae were observed in the root system. Structures typical
of SDRs, as melanized septate hyphae and microsclerotia inter and
intracellularly internally cells were observed in the roots of the plant species
used, demonstrating that FREII-ED1 and ED2-FREIII correspond to
microorganisms DSE. The colonization of different hosts, including C.
frutensces, a species of agronomic interest demonstrates that these
70
microorganisms are able to infect other species asymptomatically community
site of plant species, it being possible for these strains could have important
functional roles in establishing the species which are present, requiring
further studies the field to investigate this hypothesis.
Keywords: Endophytic fungal, plant-fungus interaction, chapéu de couro,
Pantanal.
71
3.1 Introdução
Endofíticos são microrganismos que colonizam os tecidos internos de
vegetais pelo menos em alguma fase do seu ciclo de vida, sem causar
danos aparentes ao hospedeiro. A interação ocorre em espécies vegetais
das mais diferentes famílias botânicas e ecossistemas. Esta relação, na
maioria das vezes mutualística, resulta em aumento de crescimento,
resistência induzida a estresses bióticos e abióticos (Schulz et al. 2006).
Entre os fungos endofíticos, o grupo dark septate (DSE) destaca-se
pela colonização do sistema radicular de inúmeras espécies vegetais, sendo
o complexo Phialophora-Gaeumannomyces e Phialocephala fortinii os
principais subgrupos de DSE (Gruning et al. 2011). Estes microrganismos
compõem um grupo polifilético caracterizado pelas hifas septadas escuras e
colonizam intra ou extra-celularmente o tecido radicular de plantas
aparentemente saudáveis (Stoykeet al. 1992; Pierceyet al. 2004).
Microscopicamente, são facilmente reconhecidos pela diferenciação de
microescleródios no interior da célula hospedeira. A identificação morfológica
nem sempre é evidente ou possível, pois muitas vezes, não diferenciam
estruturas reprodutivas in vitro taxonomicamente importantes, resultando em
linhagens sem a devida identificação (Mandyam e Jumpponen, 2005). Por
outro lado, a classificação molecular deste grupo nem sempre é conclusiva
devido à sua origem polifilética.
A distribuição dos hospedeiros de DSE é taxonomicamente e
espacialmente diversa, sendo capazes de colonizarem diferentes famílias
72
vegetais e distribuindo-se dos trópicos ao ártico (Jumpponen e Trappe
(1998). Esses fungos geralmente colonizam plantas presentes em ambientes
estressantes como desertos, ambientes de altitudes elevadas e rochosos e
áreas úmidas (Barrowet al. 2008;Schmidt et al. 2008;Kandalepaset al. 2010)
e em determinados casos, contribuem para a adaptabilidade do hospedeiro
às condições ambientais estressantes, como temperaturas elevadas
(Khidiret al. 2010; Mandyam e Jumpponen, 2012).
O papel funcional desses fungos ainda é controverso (Mandyam e
Jumpponen, 2005). Apesar da pouca compreensão da funcionalidade deste
grupo de endófitos, sua vasta ocorrência, abundância e ampla gama de
hospedeiros indicam a importância de DSE nos diversos ecossistemas
naturais (Jumpponen e Trappe 1998).
A compreensão dos mecanismos que estabelecem uma interação
mutualística necessita de estudos moleculares. A facilidade de manipulação
dos organismos envolvidos e protocolos de estabelecimento da associação
in vitro são requisitos importantes, até mesmo essenciais, para compreender
etapas necessárias da interação e os mecanismos moleculares expressos
no estabelecimento mutualístico. A interação modelo entre Arabidopsis
thaliana - Piriformospora indica tem sido utilizada em diferentes estudos
(Khatabiet al. 2012). A. thaliana possui seu genoma sequenciado, sua
manipulação laboratorial é relativamente simples e diversos mecanismos
moleculares da interação desta planta com patógenos são conhecidos;
(Joshiet al. 2012; Rodrigoet al. 2012; Zhanget al. 2013). P. indica é um
basidiomicota capaz de associar-se às raízes de uma gama de hospedeiros
de forma assintomática e, muitas vezes mutualística, afetando positivamente
a desempenho vegetal (Franken, 2012; Qianget al. 2012).
A investigação da diversidade de fungos endofíticos presentes em
raízes de Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus), coletada no Pantanal,
resultou na obtenção de três linhagens – FREII-50, FREII-ED1 e FREIII-ED2
– com características semelhantes aquelas descritas para DSE quando
cultivadas in vitro (Gruninget al. 2011).
73
E. scaber pertencente à família Alismataceae, e é uma espécie
conhecida popularmente por seu uso medicinal e ornamental (Pott e Pott,
2000). A família dessa espécie ocorre em áreas alagáveis como canais,
margens de lagos e pântanos (Tanaka, et. al 1997). Segundo Pott e Pott
(2000), E. scaber está presente na América do sul, encontrada apenas no
Brasil e Venezuela. Essa espécie é usada popularmente para o tratamento
de várias enfermidades como: reumatismo, tratamento de ácido úrico, sífilis,
doenças de pele e de fígado e também para fins diuréticos (Pott e Pott,
2000).
Os objetivos desta pesquisa foram avaliar presença de estruturas
fungicas em raiz de E. scaber, confirmar a característica de dark septate das
linhagens endofíticas de interesse e identifica-las, determinar o potencial
endofítico das possíveis linhagens DSE em diferentes hospedeiros in vitro e
estabelecer um protocolo de interação para avaliação de mecanismos
moleculares desta associação.
74
3.2 Material e Métodos
3.2.1 Microrganismos e meios de cultura utilizados
Três linhagens de fungos – FREII-50, FREII-ED1 e FREIII-ED2 –
obtidas de tecidos internos de raiz Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus)
foram acessadas no banco de microrganismos endofíticos pertencentes ao
Laboratório de Biotecnologia e Ecologia Microbiana (LABEM) da
Universidade Federal de Mato Grosso – Cuiabá. O meio de cultura batata
dextrose ágar (BDA) foi usado para manutenção das culturas dos fungos e o
meio mineral mínimo-MM- K2HPO4, 1,6 g; KH2PO4, 0,2 g; (NH4)2SO4, 1 g;
MgSO4.7H2O, 0,2 g; FeSO4.7H2O, 0,01 g; NaCl, 0,1 g; CaCl2.2H2O, 0,02 g;
1000 mL de água destilada- (Murashige e Skoog, 1962) foi utilizado para
germinação e estabelecimento da interação fungo-planta. Quando
necessário, as linhagens foram crescidas em meio caldo batata dextrose
sem agitação até obtenção de uma massa micelial necessária à extração de
DNA.
3.2.2 Observação de estruturas fúngicas associadas às raízes de E.
scaber
A existência de simbiose entre as raízes de E. scaber e fungos foi
determinada qualitativa e quantitativamente em raízes coletadas e coradas
de acordo com Phillips e Heyman (1970). Raízes de três indivíduos foram
processadas e coradas. A diafanização de segmentos de aproximadamente
1 cm ocorreu em KOH 2,5% aproximadamente 30 min em água fervente. Em
75
seguida, drenou-se a solução e enxagou o material em água correte. O pH
foi acidificado com HCl 1% por cinco min à 65 °C e após retirada o excesso
de ácido, os fragmentos de raízes foram corados com com azul de tripano
0,05% em lactoglicerol (1:1:1, ácido lático:glicerol:água). Posteriomente
montaram-se lâminas para microscopia com fragmentos a fim de observa-los
com auxílio de microscópio. As estruturas fúngicas foram classificadas de
acordo com literatura especializada (Peterson et al, 2004; Petrini, 1986).
Cauculou-se a frequência das estruturas de acordo com o método de grade
de intersecção (Mcgonigleet al. 1990) observando-se 100 campos sob
aumento de 400X.
3.2.3 Caracterização e Identificação molecular das linhagens fúngicas
A extração do DNA genômico das linhagens foi realizada com kit de
extração Miniprep, seguindo recomendações do fabricante (Axygen
biosciences, USA). A identificação deu-se pelo sequenciamento parcial do
espaçador interno transcrito (ITS) da região rDNA de representantes de cada
grupo de morfotipo. Os oligonucleotídeos ITS 4 (5′-TCC TCC GCT TAT TGA
TAT GC-3′) e ITS 5 (5`-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3') (White et
al. 1990) foram utilizados para amplificação da região intergênica 18S a 28S.
O volume de reação foi de 25 µL e as condições de amplificação ocorreram
como segue: desnaturação inicial de 94ºC por 2 min, seguido de 35 ciclos de
94 ºC por 45 seg, 50 ºC por 45 seg e 72 ºC por 1 min, e o passo final de
alongamento de 72 ºC por 10 min em um AMPLITHERM Thermal Cyclers.
Os produtos de amplificação foram purificados com PEG 6000(Dunn;
Blattner, 1987) com modificações, e quantificados por eletroforese em gel de
agarose 1,2%. O sequenciamento incidiu pelo método de Sanger com o Kit
Big Dye no ABI3100 Applied Biosystem. As sequências foram comparadas
no banco de dados do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com
sequências conhecidas, por uma pesquisa de similaridade via Blastn
(Altschulet al. 1990).
76
3.2.4 Obtenção de plântulas gnotobióticas
A capacidade infectiva e especificidade das linhagens DSE foram
avaliadas em quatro espécies vegetais: duas arbóreas, constituídas por
Vochysia divergens Pohl (cambará) e Vochysia haenkeana Mart. (pau
amarelo), ambas Vochysieaceae; um arbusto da família Combretaceae
representado por Combretum lanceolatum Pohl ex Eichler (pombeiro); e uma
espécie herbácea representada pela Solanaceae Capsicum frutensces L.
(pimenteira).
A obtenção de plântulas gnotobióticas foi possível com a
desinfestação das sementes das quatro espécies vegetais. Para as espécies
Vochysieaceae, Combretaceae e Solanaceaeas sementes foram
desinfestadas de acordo com Pinto et al. (2011), Pinto et al. (2012a e b).
Após o procedimento de desinfestação superficial, depositou-se as
sementes em placas de Petri contendo aproximadamente 25 mL de meio
MM. As placas foram mantidas em câmara de crescimento a 28 ºC com
fotoperíodo de 12/12h escuro/claro.
3.2.5 Inoculação de fungos em plântulas e observação macroscópica
Após os sete dias do período de germinação das espécies, duas
plântulas foram transferidas para placas de Petri contendo MM. Discos
contendo fragmentos de micélio das linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2
foram depositados próximo ao sistema radicular. Cada placa continha uma
espécie vegetal e uma linhagem de fungo. O tratamento controle consistiu
em plântulas não inoculadas com as linhagens endofíticas e, portanto,
consideradas assépticas. Após a inoculação, as placas foram mantidas nas
mesmas condições de germinação por um período de 25 a 30 dias.
Diariamente, observaram-se características de desenvolvimento das
plântulas inoculadas e comparou-se com aquelas mantidas como controle.
3.2.6 Estudo em microscopia das raízes inoculadas
Após o período de 25 a 30 dias, as plântulas foram coletadas e as
suas raízes submetidas ao processo de diafanização pelo método de Phillips
e Hayman (1970), com modificações. Armazenou-se as raízes em frascos
77
com solução KOH 10% a 60ºC por 1 hora. Posteriormente, drenou-se o KOH
e os fragmentos enxaguados em água destilada. Em seguida, foi adicionado
ao frasco HCl 1% e mantido a 60ºC. Após 5 minutos, drenou-se o ácido e as
raízes coradas em azul de tripano 0,05% em lactoglicerol (1:1:1-ácido lático,
glicerol, água) (Phillips e Heyman, 1970). Lâminas de microscopia foram
montadas com fragmentos das raízes coradas e observadas em microscópio
óptico para observação de estruturas típicas de fungos DSE (Petersonet al.
2008).
78
3.3 Resultados e Discussão
3.3.1 Associação entre raízes de Echinodorus scaber e fungos
Os indivíduos de Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) coletados
não apresentavam sinais aparentes de infecção por fitopatógenos e suas
raízes estavam aparentemente integras. A descoloração e observação dos
fragmentos radiculares corados possibilitou o reconhecimento de estruturas
fúngicas presentes nos tecidos internos (Figura 1). Observaram-se hifas
coradas pelo azul de tripano sem a presença de septo, indicando uma
possível colonização por fungos endomicorrízicos, e estruturas semelhantes
a vesículas foram observadas em dois dos três indivíduos coletados. Hifas
de coloração marrom e septadas, juntamente com microescleródios,
permaneciam presentes em 3,67 e 1,33% respectivamente, dos campos
observados nos fragmentos corados, respectivamente (Tabela 1).
3.3.2 Colonização de plântulas axênicas em condições in vitro
As raízes são os órgãos vegetais com ampla diversidade de interação
com a microbiota edáfica. Fungo associados às raízes de plantas, nas
regiões alpinas, levou ao reconhecimento de um grupo com hifas estéreis,
escuras, septadas e microescleródio sendo incialmente denominados dark
septate (DS) (Read e Haselwandter, 1981). Especificamente, o termo dark
septate endophyte (DSE) foi utilizado para agrupar um conjunto de fungos
que apresentam variações na melanização das hifas septadas e
colonizadores dos tecidos internos do sistema radicular de hospedeiros
79
saudáveis (Stoyke e Currah, 1991). FREII-50, FREII-ED1 e FREIII-ED2
foram isolados de raízes de E. scaber e possuem coloração marrom intenso
ao crescerem em meio BDA apresentando hifas septadas levando a crer que
pudesse se tratar de linhagens DSE. Não se utilizou a linhagem FREII-50
nestes experimentos por que pertence a mesma espécie que a linhagem
FREII-ED1, de acordo com os dados de identificação molecular.
FIGURA 1. Estruturas fúngicas em raiz de Echinodorus scaber. A – hifas
sem septos, coradas com azul de tripano. B – Vesículas. C –
hifas septadas marrons e microescleródios. As setas indicam
as estruturas observadas. Aumento de 400x.
TABELA 1. Percentagem de estruturas fúngicas observadas em raizes de
três indivíduos de Echinodorus scaber
Estruturas Fúngicas Média (%) Indivíduos com presença de estruturas
Microescleródios 1,33 ±0,58 3
Hifa septada 3,67 ±5,51 2
Hifa azul 7 ±3,61 3
Vesícula 1 ±1 2 ± - desvio padrão
Vochysia divergens, Vochysia haenkeana, Combretum lanceolatum e
Capsicum frutensces inoculadas com as linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2
80
permaneceram vivas após o período de interação. Estas plântulas
desenvolveram-se conforme aquelas mantidas em condições axênicas, ou
seja, sem inoculação dos fungos. Sintomas ou sinais de doenças não foram
detectados no sistema radicular nem na parte aérea das espécies vegetais
interagindo com estes fungos in vitro (Figura 2). Não houve queda foliar,
sintomas de murcha nem clorose durante o período de interação. Segundo
Wu e Guo (2008), esse fato pode ser um indicativo de compatibilidade na
associação entre plântulas e microrganismos mutualísticos.
FIGURA 2. V. dyvergens, V. haenkeana, C. lanceolatum C. frutensces
inoculadas com linhagens endofíticas FREII-ED1 e FREIII-ED2
isoladas de E. scaber.
A observação microscópica de fragmentos das raízes demonstrou
claramente a capacidade infectiva destes fungos nos tecidos internos das
raízes das quatro espécies analisadas (Tabela 2). Apenas em C. frutensces-
FREII-ED1 não apareceram hifas sobre as raízes diafanizadas, sendo
necessário repetir o experimento para observação da interação dessas
espécies. FREII-ED1 e FREIII-ED2, além de crescerem sobre o sistema
radicular das espécies vegetais testadas, são capazes de penetrarem os
tecidos internos deste órgão nos hospedeiros. A presença de hifas
81
melanizadas inter e intracelularmente nos tecidos das raízes foi observada
em todas as espécies hospedeiras, onde se observaram hifas sobre as
raízes diafanizadas, e para os dois isolados avaliados. Houve diferenciação
de microescleródios internamente às células das raízes de V. divergens, V.
haenkeana, C. lanceolatum e C. frutensces (Figura 3). Essas estruturas
observadas são morfologicamente similares àquelas descritas para fungos
endofíticos do tipo dark septate (Jumpponen e Trappe, 1998) confirmando o
caráter DSE das linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2.
TABELA 2. Estruturas de infecção das linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2
em raízes de hospedeiros após 25 dias de interação in vitro.
Plantas FREII-ED1 FREIII-ED2 Sintomas
HMS ME HMS ME
Vochysia divergens + + + + NS
Vochysia haenkeana + + + + NS
Combretum lanceolatum + + + + NS
Capsicum frutensces - - + + NS
HMS – hifa melanizada septada; ME – microescleródios; + presença; - ausência; NS –
nenhum sintoma aparente.
A associação de fungos DSE com plantas hospedeiras é amplamente
distribuída e diversificada, relatada em mais de 600 hospedeiros
filogeneticamente diferentes (Jumpponen (2001). Esses endófitos
contribuem de diferentes formas com seus hospedeiros, seja melhorando a
nutrição mineral, produzindo metabólitos especiais com atividade contra
microrganismos patogênicos e diminuição da herbivoria (Mandyam e
Jumpponen (2005).
82
Nas condições avaliadas, houve um equilíbrio entre os fatores de
patogenicidade de FREII-ED1 e FREIII-ED2 e o sistema de defesa das
espécies vegetais avaliadas resultando numa colonização assintomática
(Shulz e Boyle, 2005). A interação de A. thaliana com oito linhagens
endófitas demonstrou que somente três colonizaram assintomaticamente
esse hospedeiro in vitro, as demais linhagens provocaram sintomas de
doenças como clorose e redução no crescimento (Junkeret al.2012).
Plântulas de Hyptis marrubioides apresentaram sintomas de murcha quando
o seu sistema radicular foi inoculadas com seus endófitos Trichodermasp,
Fusarium sp ou Papulaspora sp em condições in vitro, sendo esta última, a
espécie mais virulenta (Vitorinoet al. 2012). Estas avaliações da interação
planta-microrganismos e da capacidade endofítica são importantes na
seleção de modelos com o objetivo de compreender os passos e os
mecanismos da interação não somente em condições artificiais. Outras
vantagens dos protocolos de associação endófito-hospedeiro in vitro são a
possibilidade de avaliar o papel funcional dos microrganismos no
desenvolvimento do hospedeiro sem influência de demais fatores bióticos e
abióticos, além de possibilitar qual o efeito da interação dos parceiros da
relação no perfil qualitativo e quantitativo de metabólitos em ambos
(Fusconiet al. 2010; Vitorino et al. 2012).
A conexão entre sistemas radiculares de plantas hospedeiras é bem
documentada em fungos micorrízicos justamente pela baixa especificidade
das micorrizas arbusculares (Chiariello e Hickman, 1982; Selosseet al.
2006). Esta conexão pode funcionar como canais de troca de informações
entre as plantas conectadas (Whitfield, 2007) e consequentemente
influenciar no estabelecimento de plântulas, competição, diversidade e
dinâmica da comunidade vegetal (Simard e Durall, 2004; Selosse et al. 2006;
Whitfield, 2007).
A baixa especificidade dos fungos DSE possibilita vislumbrá-los como
componentes do ecossistema capaz de interligar hospedeiros através do
sistema radicular tendo suas hifas como pontes ou agentes conectores,
podendo a interconexão ocorrer entre indivíduos da mesma espécie ou entre
83
espécies distintas. FREII-ED1 e FREIII-ED2 demonstraram características
de fungos dark septate e baixa especificidade evidenciada pela capacidade
infectiva em V. divergens, V. haenkeana, C. lanceolatum e C. frutensces
espécies bem distintas representantes de três famílias botânicas, sendo a
última representando uma espécie de interesse agronômico e ornamental
não sendo encontrada na área de coleta de E. scaber.
V. divergens, V. haenkeana e C. lanceolatum são espécies presentes
no mesmo habitat onde houve a coleta dos indivíduos de E. scaber dos
quais foram obtidas as linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2. É possível que
no Pantanal, estes fungos dark septate tenham papéis funcionais
importantes no estabelecimento das populações vegetais nas quais eles
estejam presentes. Visto que E. scaber, no pantanal de Mato Grosso, está
presente fortamente apenas nas épocas de inundação do pantanal; segundo
Pott e Pott (2000) as folhas secam no período de seca. Outras espécies
podem funcionar como repositório destes endófitos para E. scaber que
possui ciclo de vida limitado; por outro lado, o endófito pode se manter no
ambiente pantaneiro mesmo sem a presença de um dos seus hospedeiros.
Para comprovar essa hipótese, é necessária a detecção destes fungos nos
referidos hospedeiros em condições de campo.
84
FIGURA 3. Raízes diafanizadas e coradas com azul de tripano, das espécies vegetais C. lanceolatum, V. dyvergens, V.
haenkeana, e C. frutensces inoculadas com as linhagens endofíticas FREII-ED1 e FREIII-ED2 isoladas de E.
scaber.
85
3.3.3 Identificação das linhagens de fungos endofíticos
Uma parte da diversidade em fungos associados a plantas pode ser
atribuída aos DSE, seja pelas suas variações morfológicas e filogenéticas
(Jumpponen e Trappe, 1998). A maioria das espécies DSE são classificados
dentro de Helotiales das ordens mais diversa de Ascomycota, além de
espécies presentes em Pleosporales, Sordariales e Pezizales (Gruninget al.
2011).
As sequências ITS de FREII-50 e FREII-ED1 apresentaram 89% de
identidade com Pestalotiopsis theae (HQ832793.1) e, FREIII-ED2
demonstrou 93% de identidade com Lophiostoma cynaroidis (EU552138.1)
quando comparadas com sequencias depositadas no GenBank. A identidade
abaixo de 97% com sequencias depositadas no banco de dados pode
representar novas espécies até então não isoladas e descritas, como
apresenta (Sun et al 2012), ao considerar esse valor de identidade da região
ITS para espécies de fungos.
Esses dados moleculares indicam que FREII-50 e FREII-ED1
representam duas linhagens da mesma espécie de DSE colonizadora da
raíz de E. scaber. Estes dois isolados foram coincidentemente obtidos do
mesmo indivíduo hospedeiro. Em contrapartida, FREIII-ED2 representando
uma segunda espécie DSE, foi obtida das raízes de um segundo indivíduo
hospedeiro, apesar de todos os indivíduos terem sido coletados na mesma
área. A observação das raízes dos três indivíduos de E. scaber coletados
em campo demonstrou que todos possuíam estuturas características de
DSE.
A região ITS de FREII-50 e FREII-ED1 possui identidade outras
linhagens de Pestalotiopsis theae (EF423551.1 – 89%), Pestalotiopsis
microspora (JQ863222.1 – 88%),Pestalotiopsis sp (EF423555.1 – 88%) e
fungo endofítico não identificado (EU561622 – 89%). Pestalotiopsis theae foi
descrito na assembléia endofítica das raízes de Holarrhena antidysenterica
na Índia (Tejesviet al. 2009) e em partes aéreas das espécies chinesas
Camellia nitidíssima e Podocarpus macrophyllus(Weiet al. 2006). Em
86
contrapartida, outras linhagens foram consideradas patógenas nas folhas de
C. reticulata e C. sinensis(Wei et al. 2006).
FREIII-ED2 possui identidades na região ITS com outras linhagens de
Lophiostoma cynaroidis (FJ487937.1- 91%), com fungos não cultiváveis
(EU917115.1 – 92%) ou fungos não identificados (HM123518.1 – 93%).
Lophiostoma cynaroidis é uma espécie saprófita presente em solos de
florestas tropicais da Austrália (Curlevskiet al. 2010) e Sul da África
(Marincowitz et al. 2008). Sua capacidade endofítica e características de
DSE são sugeridas para raízes de Sporobolus cryptandrus – gramínea
presente em ambientes áridos nos EUA (Khidiret al. 2010) – e Inula
crithmoides – halófita presente em mangue na Espanha (Maciá-vicente e
Ferraro, 2012).
O tipo de relação endófito-hospedeiro não depende apenas do
genoma das espécies interagindo num fino controle do balanço entre
patogenicidade e mutualismo (Schulz e Boyle, 2005) características
abióticas –temperatura, umidade, salinidade– influenciam a plasticidade
desta interação. Consequentemente, endófitos de uma determinada espécie
podem comporta-se diferentemente com hospedeiros distintos. Porras-Alfaro
e Bayman (2011) relataram um isolado de Moniliophthora sp. assintomático
em raiz de gramínea apesar da sua patogenicidade em cacaueiro.
O endofítismo assintomático das linhagens FREII-ED1 e FREIII-ED2
foi similar para as espécies avaliadas neste trabalho in vitro indicando a
possibilidade de interação com quatro genótipos diferentes sob as mesmas
condições ambientais.
Esse é o primeiro estudo envolvendo fungos DSE isolados de E. scaber e
com capacidade endofítica em quatro diferentes espécies vegetais. A ampla
gama de hospedeiros destes fungos desperta novas perguntas, com o
objetivo de verificar se FREII-ED1 e FREIII-ED2 possuem papeis funcionais
capazes de propiciar melhor adaptabilidade nestes diferentes hospedeiros e
o papel dessa interferência na dinâmica da população de V. dyvergens, V.
haenkeana e C. lanceolatum em áreas úmidas.
87
3.4 Conclusões
Raízes de Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) estão
associadas com estruturas de fungos semelhantes à endomicorrizicos e dark
septate.
Duas diferentes espécies, uma representada pela linhagem
FREII-ED1 e outra composta pela linhagem FREIII-ED2, são capazes de
associar-se assintomaticamente com as raízes de Vochysia divergens,
Vochysia haenkeana, Combretum lanceolatum e Capsicum frutensces in
vitro.
Apesar da baixa identidade, as sequencias ITS de FREII-ED1 e
FREIII-ED2 possuem similaridades com sequencias das espécies
Pestalotiopsis theae e Lophiostoma cynaroidis, respectivamente.
88
3.5 Referências Bibliográficas
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93
4. ATIVIDADE ANTAGÔNICA A MICRORGANISMOS
PATOGÊNICOS E CONTROLE DE FUNGOS in vitro POR
BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS ISOLADAS DE Echinodorus
scaber Rataj (macrophyllus) EM GRÃOS DE SOJA
94
ATIVIDADE ANTAGÔNICA A MICRORGANISMOS PATOGÊNICOS E
CONTROLE DE FUNGOS in vitro POR BACTÉRIAS ENDOFÍTICAS
ISOLADAS DE Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) EM GRÂOS DE
SOJA
Resumo – Bactérias endofíticas colonizam o tecido de plantas, sem causar
sintomas aparentes. Vários estudos têm relatado o uso de bactérias do
gênero Bacillus como agentes de bio-controle e como novas fontes de
bioativos. O objetivo desta pesquisa foi identificar e avaliar o potencial
antagônico in vitro de bactérias endofíticasisoladas de Echinodorus scaber
Rataj (macrophyllus) contra patógenos de interesse medicinal e agronômico
e também verificar sua capacidade de controlar o desenvolvimento de
fungos em grãos de soja. Avaliaram-se um total de 113 linhagens de
bactérias endofíticas para selecionar aquelas com potencial antagônico.
Para isso foram confrontadas com os fungos patogênicos Colletotrichum
lindemunthianum, C. gloeosporioides, Corynespora cassiicula, Fusarium
solanI e Microsporum canis, pelo método de cultura dupla. As bactérias
antagonistas foram submetidas a teste de antibiose contra quatro bactérias
patógenas: Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. saprophyticus
e Escherichia coli pela técnica de sobre-camada. Identificaram-se as
linhagens selecionadas através de técnicas moleculares. A avaliação de
controle de crescimento de fungo em grãosde soja foi realizada em Blotter
teste com 200 grãos por tratamento. Foram selecionadas duas
linhagens,BREI-92 e BREIII-107, identificadas como pertencentes ao gênero
Bacilluse possivilemente de espécies diferentes. Ambas inibiram o
crescimento micelial de todos os fungos avaliados. Quando inoculados em
grãos de soja, BREI-92 e BREIII-107 demonstraram 95 e 97% de controle do
desenvolvimento de fungos sobre os grãos. Somente BREIII-107 foi eficiente
no teste de antibiose, inibindo o crescimento de E. faecalis, S. aureus,
S. saprophyticus. As bactérias endofíticas selecionadas possuem amplo
potencial antimicrobiano e no controle biológico de fungos em grãos de soja,
95
sendo necessários maiores estudos para compreender o mecanismo
antagônico e de controle.
Palavras-chave: Bacillus sp, Controle biológico, Fungos fitopatógenos,
Antibiose.
96
ANTAGONISTIC ACTIVITY TO PATHOGENIC MICROORGANISMS AND
CONTROL OF FUNGI in vitro BY ENDOPHYTIC BACTERIA ISOLATED
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) IN SOYBEAN GRAIN
Abstract – Endophytic bacteria colonize the plant tissue without causing
apparent symptoms. Several studies have reported the use of bacteria of the
genus Bacillus as bio-control agents and as new sources of bioactive. The
aim of this study was to identify and evaluate the potential of in vitro
antagonistic endophytic bacteria isolated from Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus) against pathogens of agronomic and medicinal interest and
also verify its ability to control the growth of fungi in soybean grain. A total of
113 isolates of endophytic bacteria were evaluated to select those with
antagonistic potential. To this were confronted with pathogenic fungi
Colletotrichum lindemunthianum, C. gloeosporioides, Corynespora
cassiicula, Fusarium solani and Microsporum canis, the dual culture method.
Bacteria antagonists underwent antibiosis test against four pathogenic
bacteria: Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. saprophyticus,
and Escherichia coli by the technique of over-layer. The selected strains
were identified by molecular techniques. The evaluation of fungal growth
control in soybeans was conducted in Blotter test with 200 seeds per
treatment. We selected two strains, and BREIII Brei-92-107, identified as
belonging to the genus Bacillus and possivilemente different species. Both
inhibit mycelial growth of all fungi evaluated. When inoculated in soybean
grain, and BREIII brei-92-107 showed 95 and 97% control of fungal growth
on the grain. Only BREIII-107 was effective in antibiosis test, inhibiting the
growth of E. faecalis, S. aureus, S. saprophyticus. The selected endophytic
bacteria possess broad antimicrobial activity and biocontrol fungi in soybean,
larger studies are needed to understand the mechanism of control and
antagonistic.
Keywords: Bacillus sp., biological control, phytopathogenic fungi, Antibiosis.
97
4.1. Introdução
Microrganismos endofíticos segundo Schuls e Boyle (2005) colonizam
internamente o tecido vegetal, intra ou extracelular, e são detectados num
momento particular, de forma mutualística, em hospedeiros aparentemente
saudáveis.
Várias pesquisas realizadas com endófitos demostram a potencialidade
deles em sintetizarem metabólitos especiais que sob o ponto de vista
biotecnológico, constituem novas fontes de compostos bioativos, aplicáveis
em diferentes áreas, como na indústria de alimentos, agrícola ou
farmacêutica (Aly et al. 2011; Piccoli et al. 2011; Zhao et al. 2011).
A atividade antagônica de bactérias endofíticas isoladas de diversas
espécies vegetais vem sendo estudada contra diferentes patógenos
humanos, e tem obtido resultados positivos (Asraful e Renukaradhya, 2010;
Seo et al. 2010), indicando que esses microrganismos são promissoras
fontes de novos compostos bioativos antimicrobianos a serem aplicados na
medicina (Strobel e Deisy, 2003).
Grande parte do sistema de produção vigente utiliza produtos químicos
para controlar doenças causadas por microrganismos com o objetivo de
aumentar a produtividade e/ou reduzir perdas resultantes da doença. Apesar
dos fungicidas químicos reduzirem o nível de infecção de fungos em
sementes (Soto-Arias e Munkvold, 2011), o tratamento recorrente com esses
produtos podem provocar o surgimento de linhagens de fungos resistentes.
98
Além disso, esse tipo de tratamento é dispendioso aos produtores e
prejudiciais a saúde humana e ao meio ambiente (Vurro e Gresselro, 2006).
Diferentes métodos são capazes de mitigarem o uso de defensivos
agrícolas (Baleet al. 2008; Wanner, 2010). Um destes é o uso de
microrganismos não patogênicos e antagônicos aos fitopatógenos, sendo
denominado de controle biológico. A capacidade antagônica dos endófitos
tem-se demostrado eficiente no controle de patógenos e consequentemente
na redução do uso de agrotóxicos (Li et al. 2011).
Bacillus é um gênero bem estudado que apresenta atividade
antagônica contra vários patógenos, sendo utilizado como biopesticidas em
culturas de trigo, soja, feijão, entre outros e, inoculação de linhagens
diretamente em plantas para controlar doenças na cultura de tomate,
pimentão, arroz e cevada (Caoet al. 2010; Cho et al. 2012). Na medicina,
estudos in vitro têm demonstrado o potencial do gênero Bacillus em suprimir
o crescimento de bactérias patogênicas ao homem como Staphylococcus
aureus e Escherichia coli (Sihem et al. 2011; Wu et al. 2012).
Esse empenho no estudo de novos compostos bioativos com atividade
antimicrobiana deve-se ao fato da constante mutação dos microrganismos
resultando em linhagens resistentes aos antibióticos disponíveis no mercado
(Dzidic et al. 2008). Porém, entre os anos de 1980-2000, poucos antibióticos
naturais foram lançados no mercado devido à redução de pesquisas na
seleção de novas linhagens que produzam compostos ativos contra
microrganismos infecciosos, sendo focado nesse período pesquisas
genômicas e de compostos de linhagens até então conhecidas
(Guimarães,et al. 2010). Assim, segundo Saleem et al.(2010), a necessidade
da descoberta de novos antibióticos vê-se necessária pela resistência
adquirida pelos microrganismos patógenos aos antibióticos atuais e a falta
de disponibilidade de novos agentes antimicrobianos no mercado. Além
disso, a descoberta de novas famílias de antibióticos é imprescindível para a
medicina atual (Hu, 2007).
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) é uma planta conhecida
popularmente no Brasil por seu uso medicinal e ornamental, denominada
99
pelas populações como chapéu de couro. Essa espécie é usada
popularmente para o tratamento de varias enfermidades como: reumatismo,
tratamento de ácido úrico, sífilis, doenças de pele e de fígado e também para
fins diuréticos (Pott e Pott, 2000).
Esta pesquisa teve como objetivo:
a) selecionar in vitro bactérias endofíticas isoladas de E. scaber
antagônicas a patógenos animais e vegetais.
b) determinar a capacidade de controle biológico no desenvolvimento
de patógenos pós-colheita em grãosde soja.
100
4.2. Material e Métodos
4.2.1. Microrganismos e meios de cultura
Um total de 113 isolados de bactérias endofíticas isoladas de
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) foi utilizado para seleção de
linhagens de interesse com potencial antagônico. O banco de
microrganismos endofíticos pertencentes ao laboratório de Biotecnologia e
Ecologia Microbiana (LABEM) da Universidade Federal de Mato
Grosso/Cuiabá-MT.
Avaliou-se o antagonismo de bactérias endofíticas contra quatro
espécies de bactérias - Enterococcus faecalis (ATCC 29212),
Staphylococcus aureus (ATCC 25923), S. saprophyticus (ATCC 43867),
Escherichia coli (ATCC 25922) - e cinco espécies de fungos - Colletotrichum
lindemunthianum, agente causal da antracnose do feijoeiro; C.
gloeosporioides, responsável pela antracnose pós-colheita em frutos e pela
antracnose foliar em diversas hortaliças; Corynespora cassiicola, promotor
da mancha alvo em soja; Microsporum canis, agente causal de
dermatomicoses em animais, e Fusarium solani, promotor da podridão
radicular de diversas culturas.
O meio de cultura batata dextrose ágar (BDA) foi usado para os testes
de antagonismo e manutenção dos fungos patógenos. Ágar nutriente (AN)
constituiu o meio utilizado para manutenção das culturas de bactérias.
101
Quando necessário, os fungos foram ativados por sete dias e as bactérias
em 24h, ambos a temperatura de aproximadamente de 28ºC.
4.2.2. Seleção de bactérias endofíticas antagônicas a fungos
patógenos
O teste de antagonismo baseou-se na metodologia de cultura dupla
(Mew e Rosales, 1986) com modificações. Inoculou-se no centro da placa de
Petri um fragmento de 0,5 cm de diâmetro obtido da borda do micélio dos
fungos patógenos. Foram testadas duas bactérias por placa. Cada linhagem
de bactéria endofítica foi inoculada em dois pontos equidistantes a 3,5 cm do
disco de micélio. Repicaram-se as colônias a 3,5 cm equidistante do centro
da placa. Encubaram-se todas as placas de Petri do ensaio a 28ºC. A
interação foi analisada diariamente até o sétimo dia. Determinou-se a
atividade antagônica pela observação da inibição do micélio do fungo
patogênico em comparação com o controle que continha apenas o patógeno
ao centro da placa.
As linhagens que apresentaram resultados positivos, contra todos os
fungos testados, foram submetidas novamente ao ensaio em triplicata.
Obteve-se a taxa de inibição do crescimento do patógeno pela medição do
diâmetro em centímetro do micélio no sétimo dia. montaram-se lâminas com
os patógenos que apresentaram alterações na coloração do micélio próximo
a zona de confronto com os isolados endofíticos; e as lâminas foram
observadas em microscópio. O experimento foi conduzido em delineamento
inteiramente casualizado e as médias submetidas à análise de variância
(ANOVA) e o teste de média adotado foi Scott-Knott.
4.2.3. Ensaio de antibiose contra bactérias patógenas
Realizou-se o teste de antibiose pelo método de sobrecamada
(Pugsley, 1987). As bactérias endofíticas foram inoculadas em pontos
específicos em meio AN. Após 24h, as células das bactérias endofíticas
ativadas foram mortas com vapor de clorofórmio e, as placas armazenadas
até completa evaporação do solvente. Posteriormente, adicionou-se, sobre a
camada de células mortas, uma suspensão de bactérias patógenas em AN
102
fundente e armazenadas por 1h em geladeira. Após esse período
incubaram-se as placas a 28ºC e após 24h, o diâmetro do halo de inibição
mensurado. Todos os testes foram realizados em triplicata e as medias
obtidas posteriormente avaliadas.
4.2.4. Analise de ERIC-PCR das bactérias endofíticas selecionadas
A extração do DNA genômico total das bactérias selecionadas foi
realizada segundo a metodologia de Chenget al. (2006). Os
oligonucleotídeos específicos utilizados foram ERIC1 (5'-
ATGTAAGCTCCCTGGGGATTCAC-3') e ERIC2 (5'-AAGTAA
GTGACTGGGGTGAGCG-3') (Tian-Xing, 2011). Realizou-se a amplificação
através dos seguintes passos: desnaturação inicial a 94ºC por 2 min,
seguida de 30 ciclos a 94ºC por 1 min, 45,5ºC por 1 min e 30 s e 68ºC por 6
min, e a extensão final a 68ºC por 10 min.
O produto de ERIC-PCR foi submetido a eletroforese em gel de
agarose 1,2% em tampão TEB 0,5x. Determinaram-se os tamanhos dos
amplicons com marcador 123pb DNA Ladder (Sigma-Aldrich, Inc.). As
imagens foram salvas em um fotodocumentador (Loccus Biotecnologia,
Brasil) para posterior analise. Obteve-se a avaliação da diversidade por
inspeção visual do gel, considerando todos os amplicons visíveis. O perfil
das bandas foi transformado em uma matriz binária com os valores: 0:
ausência e 1: presença. Calculou-se a similaridade dos dados através do
Coeficiente de Jaccard (Sneath; Sokal, 1973).
4.2.5. Identificação e analise filogenética das bactérias endofíticas
A amplificação do gene 16S rRNA foi realizado utilizando os
oligonucleotídeos 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3′) e 1492R (5′-
TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) (Weisburg, 1991). As condições de
amplificação consistiram em: desnaturação inicial a 94ºC por 5 min, seguido
de 30 ciclos a 94 ºC por 40s, 58 ºC por 35s e 72 ºC por 1 min e 20s, e
extensão final de 72ºC por 10 min.
Os produtos de amplificação foram purificados utilizando
polietilenoglicol (PEG 6000) 20% (Dunn e Blattner, 1987), e quantificados
103
por eletroforese em gel de agarose 1,2%. Rrealizou-se o sequenciamento
pelo método de Sanger com o Kit Big Dye no ABI3100 Applied Biosystem, e
as sequencias comparadas no banco de dados do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com sequencias conhecidas, por uma pesquisa
de similaridade via Blastn (Altschul et al. 1990). Os resultados com maior
identidade foram incluídos e alinhados utilizando ClustalW. Realizou-se as
análises filogenéticas pelo método Vizinho mais Próximo com o programa
MEGA 5 (Tamura et al. 2007). Confiança nos clados específicos obtidos nas
topologias das árvores foi testada pela análise de bootstrap com 1000
réplicas. Eliminaram-se todas as posições com gaps do conjunto da análise
e posições mal pareadas foram corrigidas.
4.2.6. Controle da incidência de fungos em grãos de soja
Utilizaram-se grãos de soja (Pionner y30, safra 2010/2011; colhido na
Fazenda Aricá cidade de Diamantino-MT). Os testes de microbiolização de
grãos de soja foram realizados em setembro de 2012.
Bactérias cresceram em Caldo Nutriente (CN) por 24h, a 28ºC e sob
agitação de130 rpm. A suspensão de células de cada linhagem bacteriana
foi ajustada no espectrofotômetro UV-VIS (Shimadzu, UV mini 1240) para
A540=0,50, utilizando solução salina 0,85%.
Os grãos foram submetidos à assepsia superficial (solução de
hipoclorito de sódio 2,5% por três minutos e três enxágues sequenciais em
água destilada esterilizada); posteriormente, a microbiolização seguiu as
recomendações de Luz (2001), com modificações. Imergiu-se os Grãos
desinfestados nas suspensões bacterianas por três minutos, sob agitação
manual, e distribuí-os uniformemente sobre placas de Petri contendo
substrato de papel de filtro. Os grãos do tratamento controle foram imersos
em CN. Cada tratamento constituiu-se de 200 grãos, distribuídas em oito
repetições de 25 grãos. Os grãos foram incubados em câmera de
germinação tipo BOD a 25±1 ºC, com fotoperíodo de 12/12h por sete dias,
sendo umedecidos a cada dois dias com uma solução de restrição hídrica -
1,0 Mpa. Posteriormente, avaliaram-se os grãos em microscópio
estereoscópio, verificando a incidência de fungos filamentosos nos grãos de
soja.
104
Para avaliar o potencial antagônico das linhagens endofíticas em
fungos presentes nos grãos de soja, calculou-se a porcentagem de controle
de grãos com fungos dos tratamentos pela fórmula:
Onde, Nº GCF é o número de grãos do tratamento controle com fungos
e Nº GMF é o número de grãosmicrobiolizados com fungos. Realizou-se a
analise estatística pelo teste de kruskal-Wallis para avaliar se os dois
tratamentos inoculados apresentavam diferença significativa entre si.
4.3. Resultados e Discussão
4.3.1. Seleção de bactérias antagônicas a microrganismos patogênicos
Das 113 linhagens de bactérias acessadas para o teste de
antagonismo duas - BREI-92 e BREIII-107 - foram eficientes na inibição do
crescimento do micélio de todos os fungos patogênicos testados. Estas
linhagens foram obtidas do tecido interno das raízes de dois indivíduos
distintos de Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) e, coletados na área
úmida brasileira denominada Pantanal. As raízes dos hospedeiros abrigam
maiores quantidades de bactérias que outros órgãos (Hallmann et al. 1997)
facilitando a obtenção de linhagens antagonistas a partir desse órgão (Berg
et al. 2005; Ma et al. 2012). Segundo Cao et al. (2012), essa especificidade
de órgão pode ocorrer por se tratar de um ambiente com condições
favoráveis, como abundância de água e nutrientes, tornando-se assim o
principal local de competição entre antagonistas e demais organismos da
microbiota deste órgão.
Houve diferenças significativas entre BREI-92 e BREIII-107 na
porcentagem de antibiose refletida nas inibições do crescimento micelial. M.
canis foi mais sensível ao efeito inibidor das duas bactérias endofíticas;
porém, com diferença entre os isolados, resultando em 52,9 e 59,3% de
inibição do crescimento micelial quando confrontado com BREI-92 e BREIII-
107, respectivamente. C. cassiicula e C. gloeosporioidesforam menos
sensíveis aos efeitos antagônicos. A inibição do crescimento micelial nestes
105
dois patógenos obteve diferença estatística, alcançando apenas 6,3 e
19,6%, respectivamente, quando confrontados com BREI-92 (Figura 1).
A antibiose exercida por bactérias sobre patógenos atua por diferentes
mecanismos, tais como síntese de substâncias antimicrobianas, competição
por espaço e nutriente, secreção de enzimas líticas, alteração de pH e/ou
síntese de compostos voláteis. Os mecanismos de síntese de compostos
voláteis e metabolitos secundários têm demonstrado eficiência em inibir o
crescimento de fungos (Chen et al. 2008; Leelasuphakul et al, 2008).
Leelassuphakul et al. (2008) indicaram que a inibição do micélio de
fitopatógenos através da produção de metabólitos secundários possui uma
maior eficiência quando comparado à síntese de compostos voláteis. A
diferença entre a porcentagem de inibição do crescimento do micélio de
fungos patogênicos (Figura 1) pode indicar uma possível distinção entre os
mecanismos utilizados por essas linhagens ou ao grau do mecanismo.
Futuros trabalhos poderão ser realizados para definir qual o mecanismo de
antibiose usado por BREI-92 e BREIII-107.
FIGURA 1. Taxa de inibição de fungos patogênicos por bactérias endofíticas
isoladas de E. scaber. BREIII-107, BREI-92. CL: C. lindemuthianum, CC: C. cassiicola, CG: C. gloeosporioides, FS: F. solani, MC: M. canis. As médias seguidas pela mesma letra, maiúscula entre espécies de fungos e minúscula entre bactérias considerando uma espécie de fungo, não diferem estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras representam o desvio padrão das médias.
[
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e
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106
Após análise da atividade antagônica as estruturas das hifas na placa
de confronto foram observadas, por apresentar alteração na coloração do
micélio próximo à zona de inibição. Observou-se que as hifas de C.
lindemunthianum confrontadas pela BREIII-107 apresentaram vacuolização
e ruptura celular, enquanto as hifas do tratamento controle não
apresentaram alteração celular (Figura 2). Esse efeito de vacuolização já foi
descrito por Leelasuphakul et al.(2008), como sendo causado pela produção
de lipopeptídeos que modificam a permeabilidade da membrana do fungo e
da composição lipídica, provocando uma diferenciação na hifa do fungo em
contato com esse composto. Porém, a produção de enzimas líticas,
produzidas por bactérias, como a quitinase, também interfere na lise da
parede das células dos fungos patógenos, como descrito para o fungo
fitopatógenos Fusarium oxysporum(Li et al. 2009; Dihazi et al. 2012).
4.3.2. Potencial de inibição de bactérias patogênicas
As linhagens BREI-92 e BREIII-107 foram utilizadas nos testes de
inibição de bactérias patogênicas. Avaliaram-se patógenos Gram positivos:
E. faecalis, S. aureus, S. saprophyticus e gram negativos:E. coli.
A bactéria BREI-92 não inibiu nenhuma das espécies testadas,
enquanto BREIII-107 inibiu E. faecalis, S. aureus, S. saprophyticus (Figura 3)
nas condições avaliadas. A inibição variou entre as espécies patogênicas,
chegando a 1,66; 1,76 e 2,23 cm de halo, para S. aureus, E. faecalis e S.
saprophyticus, respetivamente. Esse resultado está de acordo com vários
trabalhos realizados com linhagens de bactérias do gênero Bacillus que têm
demonstrado aptidão para inibir o crescimento de diversas bactérias
patógenas de humanos como E. coli, S. aureus (Asraful; Renukaradhya,
2010; Wu et al. 2012). Estudos recentes têm demonstrado que algumas
bactérias do gênero Bacillus produzem compostos extracelulares, como
bacteriocinas e/ou iturinas, com propriedades antibacterianas contra
espécies patogênicas (Basurto-Cadena et al. 2012;Brittes et al. 2012).
Basurto-Cadena, et al. (2012), obeteve resultado semelhante ao avaliar a
atividade antibacteriana de Bacillussubitilis,que produzem bacteriocinas,
contra bacterias patógenas, alcançando atividade positiva para S. aureus e
negativa para E. coli.
107
FIGURA 2. Hifas de fungos patógenos em confronto com bactéria endofíticas BREIII-107 isolada de E. scaber. CC: C. cassiicola, CG: C. gloeosporioides, FS: F. solani, MG: M. canis, C. lindemuthianum. (B): Hifas confrontadas com BREIII-107; (C): Tratamento controle. Setas indicam vacuolização das hifas.
Tratamento
Controle
108
FIGURA 3. Teste de antibiose entre bactérias patógenas e endofíticas BREI-92 e BREIII-107 isoladas de E. scaber. (1): colônia da bactéria endofítica BREI-92 e (2) colônia da bactéria endofítica BREIII-107. E. faecalis, S. aureus, S. saprophyticus e E. coli foram inoculadas na placa de Petri, sobre as colônias das bactérias endofíticas mortas com vapor de clorofórmio. As setas indicam o halo de inibição em volta da colônia da bactéria endofítica.
4.3.3. Caracterização e identificação molecular das linhagens BREI-92 e
BREIII-107
A amplificação dos isolados BREIII-107 e BREI-92 utilizando o
oligonucleotídeo ERIC resultou em cinco e 18 bandas (Figura 4),
respectivamente. O tamanho das bandas variou de 150 a 1230bp para
BREI-92 e 738 a 1000bp para BREIII-107. Estes resultados indicam que os
dois isolados possuem diferentes padrões de marcadores ERIC.
FIGURA 4. Amplificação por ERIC-PCR das duas linhagens de bactérias endofíticas isoladas de E. scaber. M: marcador 123pb, I: BREI-92, II: BREIII-107.
109
A sequência parcial do gene 16S do rDNA demonstrou que ambos os
isolados pertencem ao gênero Bacillus quando comparadas a sequencias
depositadas no GenBank, sendo que BREI-92 apresentou 97% de
identidade com a espécie Bacillus sp. (HQ843093.1)e, BREIII-107
demonstrou 98% de identidade por Bacillus subtilis (JX489606.1). Os
isolados serão denominados Bacillussp. BREI-92 e Bacillussp. BREIII-107.
A partir da sequencia do gene 16S do rDNA foi construída a árvore
filogenética através do método do Vizinho mais Próximo (Figura 5). A árvore
filogenética demonstrou que as duas bactérias separam-se em clados
diferentes indicando que pertençam a espécies distintas.
Interessantemente, as linhagens das bactérias com alta similaridade
da sequencias do gene 16S rDNA avaliadas no estudo da filogenia das
bactérias endofíticas BREI-92 e BREIII-107 são descritas como
antagonistasde fungos fitopatógenos como C. gloeosporioides, C.
lagenarium, Pythium aphanidermatum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia
solani, Aspergillus flavus (Wulff et al. 2002; Ongena et al. 2005; Cho et al.
2009; Hu et al.2010). Essa atividade antagônica, segundo os autores, é
permeada pela produção de lipopeptídeos da família das Iturinas,
surfactinas, fengicinas e, proteínas como LCI, LCII, LCIII.
FIGURA 5. Árvore filogenética baseada na análise de sequência parcial de
genes 16S rDNA mostrando o agrupamento das duas bactérias endofíticas isoladas de E. scaber com sequencias obitidas no GenBank. A árvore foi gerada aplicando o método Vizinho mais Próximo (software MEGA;. Tamura et al, 2007). Os números nos nós indicam valores de bootstrap em percentagem (1000 bootstraps). Os números entre parênteses são os números de acesso no GenBank.
Bacillus é um dos gêneros bacterinos com grande importância em
programas de controle biológico, prospecção de metabólitos bioativos e
110
capacidade antibiose resultante de compostos antimicrobianos (Cao et al,
2010;Wang et al. 2009; Yan et al. 2011; Li et al. 2011). Este gênero, quando
em condição endófita, pode auxiliar no desempenho de seu hospedeiro
impedindo a colonização de organismos patógenos (ASRAFUL et al. 2010).
Ela é comumente encontrado nos tecidos internos de diferentes hospedeiros
como Epimedium brevicornum Maxim (He et al, 2009), Prunus mume (Li et
al, 2009), Panaxnotoginseng(Ma et al. 2012). Esses resultados indicam que
as duas linhagens de Bacillus, encontradas em raiz de E. scaber, podem
desempenhar papel importante junto a seu hospedeiro, auxiliando no
controle de fitopatógenos. Essa afirmação ainda necessita de demonstração
experimental.
De acordo com a análise filogenética de BREIII-107 ela pode
pertencer às espécies B. subitilis ou B. amyloliquefaciens, o que vem
concordar com seu potencial antagônico a diversos patógenos, visto que
essas espécies são relatadas como produtoras de substâncias proteicas
com atividade antimicrobiana (Hu et al. 2010; Seo et al. 2010).
4.3.4. Controle in vitro de fungos em grãosde soja
Bacillussp.BREI-92e oBacillussp.BREIII-107 foram eficientes no
controle in vitro do desenvolvimento de fungos filamentosos sobre os
grãosde soja (Figura 6). A inibição do aparecimento de fungos sobre os
grãos chegou próximo de 100% quando comparados à testemunha. O
resultado indica que essas linhagens também possuem antagonismo sobre o
desenvolvimento dos fungos presentes nos grãos. Outros estudos são
necessários para compreender o mecanismo utilizado pelas bactérias
endofíticas nessa interação, seja ela através da produção de metabólitos
secundários, compostos voláteis ou a relação de competição entre bactérias
endofíticas-fungos. Os tratamentos com Bacillussp. BREI-92 e Bacillussp.
BREIII-107 não diferiam estatisticamente entre si, alcançando 95% e 97% de
inibição de grãos mofados, respectivamente (Figura 6).
111
Segundo Mertz et al (2009), um dos fatores mais importantes para
comercialização de grãos é a sua qualidade fisiológica que é permeada pela
forma de armazenagem após a colheita. Os fungos presentes nos grãos
podem causar perda de peso do grão através do consumo de matéria seca e
gorduras (Lázzari, 1993). O detrimento de grãos devido à deteriorização
causada por fungos está entre as principais causas de prejuízos após a
colheita (Krishnamurthy, et al. 2008). Além disso, esses grãos mofados
podem ser fontes de propagação de doenças para os locais de destino
(Hartman et al. 1999). Para solucionar esses problemas, métodos de
controle, sejam eles através fungicidas químicos ou usando microrganismos
antagonistas como bioprotetores, têm sido desenvolvidos para contornar
esse problema (Araújo et al. 2005; Benatto Junior et al. 2012).
FIGURA 6. Controle do crescimento de fungos em grãos de soja por
bactérias endofíticas isoladas de E. scaber. BREIII-107; BREI-92. As barras acima das médias representam seu desvio padrão.
112
Estudo usando bactérias indica a eficiência do gênero Bacillus no
controle do desenvolvimento de patógenos em sementes de milho, arroz e
soja (Luz, 2001; Ludwig et al. 2009; Young et al. 2009). Esses estudos
reforçam a eficiência desse gênero como possíveis meios alternativos de
controle de patógenos em grãos.
A descoberta do potencial antifúngico de BREI-92 e BREIII-107 abre
uma gama de possibilidades de estudos que visam controlar a incidência de
patógenos pós-colheita em grãos de soja, sendo necessários estudos sobre
a interação bactéria endofítica-soja a fim de verificar a atuação benéfica
dessas linhagens a serem usadas como bioprotetores em grãos de soja.
113
4.4. Conclusões
Das 113 bactérias testadas, as linhagens BREI-92 e BREIII-
107 possuem potencial antagônico a cinco espécies de fungos patogênicos:
Colletotrichum lindemunthianum, C. gloeosporioides, Corynespora
cassiicula, Fusarium solani, Microsporum canis.
BREIII-107 é capaz de inibir bactérias patogênicas nas
condições avaliadas.
O potencial inibitório destas linhagens resultou na redução de
aproximadamente 100% do crescimento de patógenos pós-colheita em
grãos de soja, quando avaliadas em condições in vitro.
BREI-92 e BREIII-107 possuem alta identidade com
sequências do gênero Bacillus, sendo denominadas de Bacillus sp BREI-92
e Bacillus sp BREIII-107.
114
4.5. Referências Bibliográficas
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120
5. POTÊNCIAL AGRONÔMICO DE BACTERIAS ENDOFÍTICAS DE Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus)
EM PLÂNTULAS DE SOJA
121
POTÊNCIAL AGRONÔMICO DE BACTERIAS ENDOFÍTICAS DE Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) EM PLÂNTULAS DE SOJA
RESUMO – O objetivo desta pesquisa foi averiguar o potencial de produção
do fitohormonio ácido indol acético - AIA e solubilização de fosfato de cálcio
por bactérias endofíticas isoladas de Echinodorus scaberRataj
(macrophyllus)e avaliar sua aplicação napromoção de crescimento de
plântulas de soja. Acessou-se 61 bactérias endofíticas de E. scaber para os
testes. A produção de AIA foi quantificada por método colorimétrico e a
solubilização de fosfato de cálcio procedeu-se com inoculação das linhagens
endofíticas em meio National Botanical Research Institute’s phosphate
(NBRIP) por 15 dias. Os halos de solubilização foram mensurados e o índice
de solubilização calculado. Para o teste de promoção de crescimento,
microbiolizou-se sementes de soja com sete linhagens de bactérias
produtoras de AIA e solubilizadoras de fosfato de cálcio. Avaliou-se a
porcentagem de germinação, índice de velocidade de emergência e a massa
seca das plantas aos 13 dias da semeadura. As linhagens de interesse
foram identificadas pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA.Todas
as linhagens de bactérias demonstraram eficiência para produzir AIA e 47
solubilizaram fosfato de cálcio in vitro. O vigor das sementes não foi alterado
pela microbiolização, visto que não houve diferença significativa no índice
de velocidade de germinação comparado ao da testemunha não inoculada.
As linhagens BAEI-28, BAEII-37, BAEIII79, BREI-117, promoveram o
aumento da massa seca de plântulas. Esses resultados evidenciaram que
todas as bactérias endofíticas de E. scaber avaliadas, são capazes de
produzir AIA e, grande parte delas, podem solubilizar fosfato de cálcio in
vitro e que BAEI-28, BAEII-37, BAEIII79, BREI-117 possuem traços de
promoção de crescimento de plântulas de soja evidenciado pelo aumento de
massa seca.
Palavras-chave: Acido indol acético, Solubilização de fosfato, Promoção de
crescimento, Sementes de soja.
122
AGRONOMIC POTENTIAL OF ENDOPHYTIC BACTERIA DE Echinodorus
scaber Rataj (macrophyllus) IN SOYBEAN SEEDLINGS
ABSTRACT – The aim of this study was to evaluate the production potential
of the phytohormone indole acetic acid - IAA and solubilization of calcium
phosphate by endophytic bacteria isolated from Echinodorus Scaber Rataj
(macrophyllus) and assess their application in promoting growth of soybean
seedlings. Were accessed 61 endophytic bacteria E. scaber for testing. The
production of IAA was quantified by a colorimetric method and solubilization
of calcium phosphate proceeded with inoculation of endophytic fungi in
medium National Botanical Research Institute's phosphate (NBRIP) for 15
days. The halos were measured solubility and solubilization index calculated.
To test for growth promotion, soybean seeds were microbiolized seven
bacterial strains producing IAA and solubilizing calcium phosphate. We
evaluated the percentage of germination, speed of emergence and plant dry
matter at 13 days after sowing. Strains of interest were identified by partial
sequencing of the 16S rRNA.Todas strains of bacteria were effective to
produce IAA and 47 were positive to solubilize calcium phosphate in vitro.
Seed vigor was not altered by microbiolization, whereas no significant
difference in the rate of germination rate compared to the noninoculated.
Strains BAEI-28, BAEII-37, BAEIII79, Brei-117, promoted increased seedling
dry weight. These results indicated that all endophytic bacteria E. scaber
evaluated are capable of producing IAA, and most of them can solubilize
calcium phosphate in vitro and BAEI-28, BAEII-37, BAEIII79, brei-117
possess traits of growth promotion of the seedlings of soybean evidenced by
increased dry weight.
Keywords: indole acetic acid, phosphate solubilization, growth promotion,
Soya beans.
123
5.1 Introdução
A soja (Glycine maxL.) é a principal oleaginosa cultivada no mundo,
alcançando a produção de 263.948 milhões de toneladas na safra
2010/2011 (Hiroshi e Lazzarotto, 2011). Segundo os autores, o Brasil ocupa
o segundo lugar em produção, perdendo apenas para os Estados Unidos.
O crescente aumento na produção deve-se, entre outros, a sua qualidade
nutricional, com elevado teor proteico, empregado na alimentação humana e
animal, seu potencial para a produção de óleos aplicados na alimentação
humana e na síntese do biodiesel. Além disso, é cultura padronizada e
uniforme, com aptidão de ser comercializada e produzida em diversos
países do mundo (Hiroshi e Lazzarotto, 2011).
Nas ultimas décadas, tem-se dado ênfase a pesquisas que atinem
alternativas biológicas para aumentar a produtividade agrícola, encontrando-
se assim novas formas de disponibilizar nutrientes, promover o crescimento
e auxiliar na resistência a estresses bióticos e abióticos em culturas
cultiváveis, visando assim, aumentar a produção e manter a sustentabilidade
(Akello et al. 2007; Bae et al. 2008; Barretti et al. 2008; Ryan et al. 2008;
Senthilkumar et al. 2009; Baldotto et al. 2010; Lanna Filho et al. 2010). Uma
das opções para se conseguir alcançar o desafio de aumentar a produção e
reduzir impactos ambientais, é o uso de microrganismos endofíticos com
potencial de aplicação agronômico.
124
Microrganismos endofíticos, segundo Schuls & Boyle (2005), colonizam
internamente o tecido vegetal, intra ou extracelular, detectados num
momento particular, de forma mutualística, em hospedeiros aparentemente
saudáveis.
Os estudos dessa intrigante interação microrganismo endofítico-planta
demonstram que muitos desses microrganismos podem favorecer o
desenvolvimento de seu hospedeiro de formas diretas, pela produção de
fitohormônios, como ácido indol acético (AIA) (Khan et al. 2012; Piccoli et al.
2011), ou aumentando e melhorando a nutrição mineral do hospedeiro,
como a solubilização do fósforo imobilizado no solo (Ma et al. 2011), ou de
forma indireta, produzindo compostos secundários que auxiliam na defesa
contra a herbivoria e no aumento da resistência a outros organismos
patogênicos (Yang et al. 2011).
Diversos estudos relatam o potencial de bactérias endofíticas para
promover crescimento, tanto de parte aérea quanto de raiz, aumentar a
produção de frutos e melhorar o desempenho da planta diante de estresses
abióticos em diversas culturas como pimenta, tomate, abóbora e milho (Khan
et al. 2012). As linhagens endofíticas isolados por Khan et al. (2012), foram
isoladas de hospedeiros diferentes das culturas que foram aplicadas,
demonstrando serem capazes de colonizar outras espécies além de seu
hospedeiro original. No entanto, os autores indicam que é necessário
estudos prévios entre cultivar-microorganismo endofítico por se tratar de
uma relação estritamente específica. Diante dessa perspectiva, esse
trabalho teve por objetivo averiguar o potencial de produção do fitohormonio
AIA, solubilização de fosfato por bactérias endofíticas isoladas de
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) e avaliar sua aplicação para
promoção de crescimento de soja.
125
5.2 Material e Métodos
5.2.1 Microrganismos e meios de cultura
Um total de 61 bactérias endofíticas isoladas de Echinodorus scaber
Rataj (macrophyllus) do pantanal de Mato Grosso foram acessadas no
banco de microrganismospertencentes ao laboratório de Biotecnologia e
Ecologia Microbiana (LABEM) da Universidade Federal de Mato
Grosso/Cuiabá-MT, para screening das linhagens com potencial de
produção de AIA, solubilização de fosfato de cálcio e promoção de
crescimento de plântulas de soja.
Ágar nutriente (AN) foi o meio usado para manutenção das culturas
de bactérias. Quando necessário, as bactérias foram ativadas por 24h, sob
agitação de 125rpm, a temperatura de 28ºC aproximadamente.
5.2.2 Produção de fitohormônio Acido indol-acético pelas linhagens de
endofíticos
Avaliou-se a produção de AIA por método colorimétrico descrito por
Gordon & Weber (1951). Inicialmente, as bactérias foram crescidas em
10mL de meio de cultura caldo Nutriente (CN). Ajustou-se a densidade
óptica (DO) de todas as amostras para A600: 0,5 através de diluição com
solução salina (0,85%). Posteriormente, transferiu-se os isolados (5% v/v)
para o meio caldo nutriente suplementado com triptofano (100 μg mL-1) e
incubou-se por 72h, no escuro, a 28ºC sob agitação constante (125rpm)
(Melo Pereira et al. 2012). Após o período de incubação os isolados foram
126
centrifugados a 12.000g por 5 min. Em seguida, procedeu-se a avaliação da
produção de AIA, misturando 1mL do sobrenadante e 1 mL do reagente de
Salkowski (1 mL de FeCl3 – 1,35g/10mL; 50 mL de HClO4 – 35%). Os tubos
contendo o mix permaneceram no escuro por 15 min a 28ºC. A presença de
AIA foi visualizada pela coloração rósea. Como controle negativo, foi
utilizado apenas o caldo nutriente suplementado com triptofano. A
quantificação de AIA deu-se pela leitura da absorvância em
espectrofotômetro (530 nm). Realizaram-se todas as dosagens em triplicata.
A concentração de AIA foi determinada utilizando-se de uma curva padrão
de AIA sintético (Sigma). O experimento constituiu em um delineamento
inteiramente casualizado e submeteram-se os resultados à Análise de
Variância (ANOVA). O teste de médias adotado foi Skott-Knott, em nível de
5% de significância.
5.2.3 Screening de isolados endofíticos solubilizadores de fosfato de
cálcio
Submeteram-se os isolados com resultado positivo para produção de
AIA à avaliação de solubilização de fosfato de cálcio. Alíquotas de 5 μL das
soluções bacterianas, com densidade óptica (DO) ajustada para A600: 0,5
foram colocadas em placas de Petri com meio de cultura sólido National
Botanical Research Institute’s phosphate (NBRIP) segundo Nautiyal (1999),
e incubadas a 28ºC por 15 dias. Os isolados que apresentaram formação de
halos translúcidos no meio de cultura foram considerados positivos para
solubilizar fosfato de cálcio in vitro, e submetidos novamente ao teste em
triplicata. A avaliação do índice de solubilização de fosfato foi realizada por
meio da medição do diâmetro do halo translúcido formado pela bactéria
solubilizadora no décimo quinto dia. Para isso, mediu-se o halo com o auxilio
de uma régua milimétrica e calculou-se o índice por meio da fórmula:
Onde, IS é o índice de solubilização; DTH é o diâmetro total do halo e
DC é o diâmetro da colônia de bactéria. OIS foi realizado de acordo com
DTH IS (mm)=
DC
127
Hara e Oliveira (2005), em baixa solubilização (IS < 2), média solubilização
(2< IS < 3) e alta solubilização (IS > 3).
5.2.4 Análise de ERIC-PCR das bactérias endofíticas selecionadas
A extração do DNA genômico total das bactérias selecionadas foi
realizada segundo a metodologia de Cheng et. al. (2006) e os
oligonucleotídeos específicos utilizados consistiram em ERIC1 (5'-
ATGTAAGCTCCCTGGGGATTCAC-3') e ERIC2 (5'-AAGTAA
GTGACTGGGGTGAGCG-3') (Tian-Xing, 2011). A amplificação seguiu os
seguintes passos: desnaturação inicial a 94ºC por 2 min, seguida de 30
ciclos a 94ºC por 1 min, 45,5ºC por 1 min e 30s e 68ºC por 6 min, e a
extensão final a 68ºC por 10 min.
O produto de ERIC-PCR foi submetido a eletroforese em gel de
agarose 1,2% em tampão TEB 0,5x. Determinaram-se os tamanhos dos
amplicons com marcador 123pb DNA Ladder (Sigma-Aldrich, Inc.). As
imagens foram salvas em um fotodocumentador (Loccus Biotecnologia,
Brasil) para posterior análise. A avaliação da diversidade foi obtida por
inspeção visual do gel, considerando todas as bandas visíveis.
5.2.5 Identificação das bactérias endofíticas através do
sequenciamento parcial do gene 16S do rDNA
A amplificação do gene 16S rDNA aconteceu utilizando os
oligonucleotídeos 27F (5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTCAG-3′) e 1492R (5′-
TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3′) (WEISBURG, 1991). As condições
de amplificação foram realizadas como segue: desnaturação inicial a 94ºC
por 2 min, seguido de 35 ciclos a 94 ºC por 45s, 50ºC por 45s e 72ºC por 1
min, e extensão final a 72ºC por 10 min.
Os produtos de amplificação foram purificados, e quantificados por
eletroforese em gel de agarose 1,2%. Realizou-se o sequenciamento pelo
método de Sanger com o Kit Big Dye no ABI3100 Applied Biosystem, e as
sequencias comparadas no banco de dados do GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com sequencias conhecidas, por uma pesquisa
128
Blastn (Altschul et al. 1990). Os resultados mais próximos foram incluídos e
alinhados utilizando ClustalW.
5.2.6 Microbiolização de sementes de soja com bactérias endofíticas
isoladas de E. scaber
Utilizou-se nesse ensaio sementes de soja pertencente a cultivar TMG
132RR oriundas da Fazenda Bela Vista, Município de Sinop-MT. Sete
linhagens de bactérias endofíticas, três com maior potencial de solubilizar de
fosfato (BAEI-26, BAEI-28, BAEIII-55), três com maiores concentrações de
AIA (BAEII-37, BAEII-49, BREI-117) e uma intermediária para solubilizar
fosfato e produzir AIA (BAEIII-79), foram usadas nesse ensaio.
As bactérias cresceram em CN por 24h e a suspensão de células de
cada linhagem bacteriana foi ajustada no espectrofotômetro para A540=0,5
utilizando solução salina (0,85%).
A microbiolização seguiu as recomendações de Luz (2001), com
modificações. Mergulhou-se as sementes de soja em suspensões das
bactérias endofíticas durante 10 minutos a 25ºC, sob agitação manual. As
sementes do tratamento testemunha foram mergulhadas em caldo nutriente
esterilizado sob as mesmas condições dos demais tratamentos. Quatro
repetições com 25 sementes, totalizando 100 sementes constituíram um
tratamento. Após a inoculação, semearam-se as sementes em bandejas
contendo areia lavada, onde permaneceram acondicionadas em ambiente
de laboratório sob fotoperíodo de 12h a temperatura de 25ºC±1 e umidade
relativa do ar de aproximadamente 51%. Foram determinadas a
porcentagem de germinação de plântulas, o índice de velocidade de
emergência (Edmond e Drapala, 1958) e a massa seca da plântula no
décimo terceiro dia.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado
com oito tratamentos e quatro repetições. Os resultados foram submetidos à
análise de variância,e as médias comparadas pelo teste de Skott-Knott, a
5% de significância.
129
5.3 Resultados e Discussão
5.3.1 Bactérias endofíticas de Echinodorus scaberRataj
(macrophyllus)com potencial para produzir AIA e solubilizar fosfato de
cálcio
Todas as 62 bactérias estudadas nesse trabalho produziram AIA,
destas, 47 (78%) foram capazes de solubilizar fosfato de cálcio insolúvel in
vitro (Tabela 1).
Dentre os 62 isolados produtores de AIA selecionaram-se
aleatoriamente dez para avaliação da concentração da produção desse
fitohormônio. Nove das dez bactérias avaliadas, não diferiram
estatisticamente na concentração de AIA, produzindo entre 22 e 31,5 µg/mL.
Apenas a bactéria BREI-95 produziu 11,5 µg/mL (Figura 1).
Essa ampla gama de bactérias produtoras de AIA já foi descrita por
Assumpção et al. (2009), onde 100% dos isolados bacterianos isolados de
sementes de soja produziram esse fitohormônio. Melo Pereira et al. (2011),
encontraram resultados semelhantes quando isolaram bactérias endofíticas
de morango e constataram que aproximadamente 80% das linhagens
sintetizaram AIA. Segundo os mesmos autores, essas linhagens possuem
grande potencial para promover o crescimento de plantas de morango. Esse
potencial de promoção de crescimento de planta exercido por AIA se deve
ao fato dele pertencer ao grupo de fitohormônio conhecidos como Auxinas,
130
que é conhecido por estimular o crescimento de vegetais. A forma
predominante desse fitohormônio é o AIA que atua no alongamento celular
(Kotake et al. 2000).
A concentração de AIA encontrada na maioria dos isolados está de
acordo com o trabalho de Assumpção et al. (2009), que obtiveram entre 2,6
e 34,9 µg/mL ao avaliar a concentração desse fitohormônio por bactérias
endofíticas isoladas de soja. Valores próximos também foram descritos por
Patel et al. (2011), quando analisaram a produção de AIA por Pseudomonas.
Estudos anteriores demonstraram que a concentração de AIA em
inoculantes comerciais variou de 6,62 e 13,16 µg/mL para Bradyrhizobium
japonicum E109 e Azospirillum brasilense Az39, respectivamente (Cassan et
al. 2009). Esses relatos indicam a maior eficiência das linhagens endofíticas
presentes nesse trabalho para produzir AIA. Porém, dados de pesquisas
recentes apresentam um numero reduzido de Bradyrhizobium com
capacidade de produção de AIA (Prévost e Juge, 2012), indicando que
pesquisas que visam analisar o sinergismo entre linhagens padrão e
endofíticas, produtoras de fitohormônio, podem ser uma boa alternativa para
promover o crescimento de planta como sugerem Lima et al. (2011) na
cultura de feijão.
Tabela 1. Avaliação da produção de AIA e solubilização de fosfato de cálcio
por bactérias endofíticas isoladas de E. scaber.
Isolado AIA Ca3(PO4)2 Isolado AIA Ca3(PO4)2
BAEI-1 + + BAEI-23 + + BAEI-2 + + BAEI-24 + + BAEI-3 + + BAEI-25 + + BAEI-4 + - BAEI-26 + + BAEI-5 + + BAEI-28 + + BAEI-7 + + BAEI-30 + + BAEI-9 + + BAEII-33 + +
BAEI-10 + + BAEII-35 + + BAE-11 + + BAEII-37 + + BAEI-12 + + BAEII-38 + + BAEI-13 + + BAEII-40 + + BAEI-15 + + BAEII-41 + + BAEI-16 + + BAEII-44 + + BAEI-17 + + BAEII-48 + -
131
BAEI-18 + + BAEII-49 + + BAEI-21 + + BAEII-50 + +
Isolado AIA Ca3(PO4)2 Isolado AIA Ca3(PO4)2
BAEIII-51 + - BREII-97 + + BAEIII-54 + + BREIII-105 + + BAEIII-55 + + BREIII-108 + - BAEIII-57 + + BREI-115 + + BAEIII-58 + + BREI-116 + - BAEIII-72 + - BREI-117 + - BAEIII-75 + + BREI-118 + - BAEIII-78 + - BREI-121 + + BAEIII-79 + + BREI-124 + - BREI-84 + - BREI-125 + - BREI-85 + - BREI-126 + + BREI-88 + - BREI-129 + - BREI-90 + + BREI-132 + + BREI-95 + + BREII-134 + + BREI-96 + + - - -
+ produz AIA e/ou solubiliza fosfato. – não solubiliza fosfato.
FIGURA 1. Produção de AIA por bactérias endofíticas de E. scaber. As
médias seguidas pela mesma letra não diferem estatisticamente entre si. Foi
aplicado o Teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Entre os 48 isolados positivos para solubilizar fosfato, 46 possuem IS
baixo, e os outros dois isolados apresentaram IS médio. As bactérias com
maiores índices de solubilização foram os isolados BAEIII-55, BAEII-50 e
BAEI-28 com IS de 2,15; 2,02 e 1,91, respectivamente (Figura 2).
132
133
Figura 2: Índice de solubilização de fosfato por Bactérias endofíticas isoladas de E. scaber em meio NBRIP após 15 dias de encubação. As barras nas colunas representam o desvio padrão das médias.
134
Bactérias endofíticas com habilidade de solubilizar fosfato insolúvel in
vitro são obtidas de diversos hospedeiros (Luo et al. 2011; Nyambura
Ngamau, 2012; Quecine et al. 2012). O fosforo é um dos principais
nutrientes necessários para o desenvolvimento das plantas. Porém, cerca de
90 a 95% do fosforo do solo encontra-se presente em forma insolúvel,
inviabilizando o aproveitamento desse nutriente pelas plantas (Vassileva et
al. 1998). Essa aptidão de solubilizar fosfato por bactérias endofíticas pode
ocorrer pela produção de vários ácidos orgânicos, como: ácido málico,
acético, cítrico, fumárico, lático, succicínico e glucônico(Leyval et al. 1989;
Taha et al. 1969). Segundo He et al. (1996), ácidos reduzem o pH do solo,
aumentando a solubilização de fosfato, tendo assim, papel importante para
esse processo.Os resultados encontrados nesse trabalho sugerem que as
bactérias endofíticas isoladas de E. scaber possui potencial de solubilizar
formas de fosfato insolúveis.
5.3.2 Caracterização e sequenciamento do gene 16S rDNA
A amplificação dos isolados utilizando o oligonucleotídeo ERIC
resultou na detecção de 9 a 25 bandas (Figura 3). O tamanho das bandas
variou de 100 a 1230bp entre os isolados. Visualmente a bactéria endofítica
BREI-117 se difere do padrão de bandas das demais bactérias indicando
que este isolado possui diferentes padrões de marcadores ERIC.
FIGURA 3. Perfil de amplificação ERIC-PCR em sete linhagens de bactérias endofíticas isoladas de E. scaber. M: marcador 123pb, 1: BAEI-26, 2: BAEI-28, 3: BAEII-37, 4: BAEII49, 5: BAEIII-55, 6: BAEIII-79, 7: BREI-117.
135
A sequência parcial do gene 16S do rDNA, concordando com a
caracterização em ERIC-PCR, demonstrou que, dentre os isolados
identificados, apenas BREI-117 pertence a gênero diferente, sendo BAEI-26,
BAEII49, BAEIII-79 pertencentes ao gênero Enterobacter e BREI-117
pertencentes ao gênero Klebsiella quando comparadas a sequências
depositadas no GenBank (Tabela 2). Os isolados BAEI-28, BAEII-37, BAEIII-
55 estão em processo de sequenciamento, porém, pela análise do padrão
de banda de ERIC-PCR esses isolados também pertencem ao gênero
Enterobacter.
Na literatura esses dois gêneros são comumente descritos como
produtores de fitorhomônio e solubilizadores de fosfato (Santi Ferrara et al.
2011), desempenhando papel importante no crescimento de milho e arroz
(Jha et al. 2007; Kumar et al. 2012).
TABELA 2. Identificação de bactérias endofíticas isoladas de E. scaber com
base no seqüenciamento parcial do gene 16S rRNA.
Isolados GenBank Nº de Acesso % de Identidade
BAEI-26 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEI-28
BAEII-37 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEII-49 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BAEIII-55
BAEIII-79 Enterobacter sp. JQ396391.1 99
BREI-117 Klebsiella pneumoniae JF772061.1 99
5.3.3 Promoção de crescimento de plântulas de soja
Nenhuma das linhagens de bactérias endofíticas isoladas de E.
scaber inoculadas em soja acarretou prejuízo a germinação ou a velocidade
de emergência das plântulas (Tabela 3). Quatro das sete bactérias testadas
136
aumentaram a massa seca das plântulas de soja avaliadas no décimo
terceiro dia da semeadura (Figura 4).
TABELA 3. Dados médios de germinação e índice de velocidade de
emergência (IVE) de plântulas normais de soja aos 15 dias após a
instalação.
Tratamentos Germinação
(1ª contagem) Germinação IVE (%)
____________%______________
Testemunha 74 a 97 a 4.58 a
BAEI-26 73 a 97 a 4.60 a
BAEI-28 66 a 97 a 4.54 a
BAEII-37 60 a 98 a 4.59 a
BAEII-49 50 b 97 a 4.47 a
BAEIII-55 63 a 97 a 4.36 a
BAEIII-79 44 b 97 a 4.51 a
BREI-117 66 a 99 a 4.39 a
CV% 9,12 2.93 3.16
* Médias seguidas da mesma letra não diferem entre si pelo teste de Skott-Knott ao nível de 5% de probabilidade.
Esse resultado está de acordo com os relatos de Jha et al. (2007) e
Kumar et al. (2012), que identificaram linhagens de bactérias endofíticas do
gênero Klebsiela e Enterobacter como agentes promotores de crescimento
de planta de arroz e milho. Além disso, Enterobacter e Klebsiella já foram
descritas como pertencentes à comunidade endofítica de soja (Assumpção
et al. 2009; Kuklinsky-Sobral et al. 2004). Assumpção et al. (2009) obtiveram
resultado positivo para o incremento da massa seca da raiz de plantas de
soja ao inocular uma linhagem de Enterobacter, isolada de semente de soja.
O resultado positivo de promoção de crescimento de plântula de soja
pelos isolados BREI-117 (Klebsiella sp.), BAEII-37 e BAEIII-79 (Enterobacter
sp.) encontrado em nosso trabalho pode estar associado diretamente a
produção de AIA e solubilização de fosfato, indicados como responsáveis
pela acumulação de massa seca (Quecine et al. 2012). Porém, o isolado
*
137
BAEI-26, também pertencente ao gênero Enterobacter, não apresentou
resultado satisfatório na promoção de crescimento de plântulas de soja.
Esse resultado também foi demonstrado por Assumpção et al. (2009), ao
inocular duas linhagens de Enterobacter em soja; indicando que além da
produção de fitohormônio e solubilização de fosfato existem outros fatores
importantes para o bom êxito da promoção de crescimento, sendo a
especificidade da interação bactéria-planta fundamental nesse caso, além
disso, as variações dos genótipos das espécies envolvidas também possui
papel importante (Salvaudon et al. 2008, Khan et al. 2012).
FIGURA 4. Incremento de massa seca de plântulas de soja inoculadas com
bactérias endofíticas isoladas de E. scaber após 13 dias de
semeadura. As médias seguidas pela mesma letra não diferem
estatisticamente entre si. Foi aplicado o Teste de Scott-Knott a
5% de probabilidade.
A aplicação de bactérias endofíticas em espécies não-hospedeiras de
interesse agronômico já vem sendo relatada com bom êxito para várias
culturas como o arroz, cana-de-açúcar, laranja, feijão, abobora, pimentão
138
(Lacava et al. 2007; Zakria et al. 2008; Eduardo et al. 2012; Khan et al. 2012;
Quecine et al. 2012). Indicando ser uma alternativa para o desenvolvimento
de uma agricultura sustentável, diminuindo assim o uso de defensivos e
fertilizantes químicos. Khan et al. (2012), ao utilizar linhagens de bactérias
endofíticas isoladas de Populus trichocarpa e Sitka sitchensis e obter
resultados promissores na promoção de crescimento de varias culturas de
interesse agronômico como milho, adverte a necessidade de estudos
peculiares entre bactéria endofítica-cultura, por se tratar de uma associação
específica entre cada linhagem-cultivar. Outro aspecto relevante sobre o uso
de bactérias endofíticas em plantas não-hospedeiras é a possibilidade de
aplicação de diversos isolados com potencial de produção de fitohormônio, e
disponibilização de nutrientes, presentes em espécies não cultivadas, sobre
culturas de interesse agronômico como a soja.
Esse é o primeiro relado de bactérias endofíticas de E. scaber, com
traços funcionais de promoção de crescimento de plantas com efeito positivo
em plântulas de soja, isoladas no pantanal de Mato Grosso, Brasil. Esse
estudo abre uma vasta gama de possibilidades para estudos com
microrganismos endofíticos do Pantanal brasileiro a serem empregados na
agricultura.
139
5.4 Conclusões
Das 61 bactérias endofíticas avaliadas nesse estudo, todas
sintetizaram AIA e 47 isolados solubilizaram fosfato de cálcio in vitro.
Sementes de soja microbiolizadas com os isolados endofíticos
testados não são prejudicadas em seu estádio de germinação,
permanecendo inalterado o seu vigor.
Os isolados BAEI-28, BAEII-37, BAEIII-79 pertencente ao
gênero Enterobacter e BREI-117 pertencente ao gênero Klebsiella
promoveram o aumento de massa seca de plântulas de soja.
140
5.5 Referências Bibliográficas
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145
6. ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FUNGOS
ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE PLANTA MEDICINAL DO
PANTANAL Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus)
146
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS
DE PLANTA MEDICINAL DO PANTANAL Echinodorus scaber Rataj
(macrophyllus)
Resumo – Fungos endofíticos têm apresentado diversas aplicações
biotecnológicas pela produção de metabólitos secundários de interesse na
indústria farmacológica e agronômica. O objetivo desse estudo é caracterizar
extratos obtidos do cultivo de fungos endofíticos de Echinodorus scaber
Rataj com propriedades antibacterianas. Um total de 46 fungos endofíticos
isolados de E. scaber foram avaliados quanto ao seu potencial de
antagonismo contra os fungos patogênicos Colletotrichum lindemunthianum,
C. gloeosporioides, Corynespora cassiicula, Fusarium solani eMicrosporum
canis. A seleção de microrganismos antagonistas foi realizada pela técnica
de cultura dupla. Testaram-se os isolados positivos para inibir todos os
fungos patogênicos contra as bactérias patógenas Enterococcus faecalis,
Staphylococcus aureus, S. saprophyticus e Escherichia coli, pela técnica de
difusão em bloco de ágar. As linhagens com potencial antagônico foram
identificadas por técnicas moleculares. Obtiveram-se Extratos fração Acetato
de etíla dos fungos com potencial para inibir todos os microrganismos
testados. A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada pela técnica de
difusão em disco contra todos os fungos patogênicos novamente; e através
da técnica de cromatografia em camada delgada para avaliação da atividade
antibactericida com as bactérias E. faecalis, S. aureus, S. saprophyticus. Os
fungos endofíticos antagonistas pertencem aos gêneros Corynespora,
Penicillium, Chaetomium, Eupenicillium. Dez isolados foram eficientes para
inibir os fungos testados,alçando inibição do crescimento do micélio do fungo
patogênico acima de 40% para todos os fungos testados. Cinco isolados
inibiram todas as bactérias avaliadas. O extrato Acetato etílico dos fungos
selecionados como antagonistas, inibiram o desenvolvimento de todos os
fungos patogênicos, alcançando inibição máxima de 29% para M. canis. A
147
bioautografia demonstrou presença de varias frações para cada extrato e a
atividade anti bactericida dos extratos foram confirmadas.
Palavras-chave: autobiografia, Extrato acetato de etila, Fungos endofíticos,
chapéu de couro.
148
ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF ISOLATED ENDOPHYTIC FUNGI
MEDICINAL PLANT PANTANAL Echinodorus scaber Rataje (macrophyllus)
ABSTRACT - Endophytic fungi have submitted several applications for
biotechnological production of secondary metabolites of interest in the
pharmaceutical industry and agronomy. The aim of this study is to
characterize the extracts of endophytic fungi cultivation of Echinodorus
scaber Rataj with antibacterial properties. A total of 46 endophytic fungi
isolated from E. scaber were assessed for their potential antagonism against
pathogenic fungi Colletotrichum lindemunthianum, C. gloeosporioides,
Corynespora cassiicula, Fusarium solani and M. canis. Selection of
antagonistic microorganisms was performed by dual culture technique.
Isolates positive for inhibiting pathogenic fungi were all tested against
pathogenic bacteria Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S.
saprophyticus and Escherichia coli, by diffusion technique in agar block. The
strains with antagonistic potential were identified by molecular techniques.
Extracts were obtained ethyl acetate fraction of the fungi with the potential to
inhibit all microorganisms tested. The antimicrobial activity of the extracts
was evaluated by the disk diffusion technique against all pathogenic fungi
again, and through the technique of thin layer chromatography for evaluation
of antibacterial activity with the bacteria E. faecalis, S. aureus, S.
saprophyticus. The endophytic fungi antagonists were identified as belonging
to the genera Corynespora, Penicillium, Chaetomium, Eupenicillium. Ten
isolates were effective in inhibiting the fungi tested, raising growth inhibition
of the pathogenic fungus mycelium of above 40% for all tested fungi. Five
isolates were positive to inhibit all bacteria evaluated. The ethyl acetate
extract of fungi selected as antagonists inhibited the development of all
pathogenic fungi, reaching maximum inhibition of 29% for M. canis. The
bioautography showed the presence of various fractions for each extract and
anti bactericidal activity of the extracts were confirmed.
Keywords: autobiography, ethyl acetate extract, endophytic fungi, chapéu de
couro.
149
6.1 Introdução
Microrganismos endofíticos, segundo Schuls e Boyle (2005), colonizam
internamente o tecido vegetal, intra ou extracelular, e são detectados num
momento particular, vivendo mutualisticamente em órgãos aparentemente
saudáveis.
A aplicação biotecnológica de microrganismos endofíticos possui um
leque diversificado de funções na indústria farmacêutica e agronômica. Um
exemplo clássico de produção de compostos bioativos produzido por fungos
endofíticos, com aplicação na indústria farmacêutica, é o paclitaxel obtido do
fungo endofítico Taxomyces andreanae isolado de folhas da planta Taxus
brevifolia. Além disso, esses microrganismos foram reportados para produzir
metabolitos com atividade anticancerígena, antioxidante, antimicrobiana,
entre outras (Stierleet al. 1993;Carvalho et al. 2012; Pavithra et al. 2012). O
Antibiótico griseofulvina, obtido originalmentea partir de Penicilliumsp, foi
detectadoem Xylaria sp. F0010isolado da casca interna de Abies holophylla.
Na agricultura, esse grupo de microrganismos vem sendo reportado como
eficiente na promoçãodo crescimento e desenvolvimento de seu hospedeiro
de forma direta pela produção de fitohormônios e disponibilização de
nutrientes (Latif et al. 2011; Chutima e Lumyong, 2012; You et al. 2012).
Chutima e Lumyong (2012) demonstraram que Colletotrichum
gloeosporioides e Tulasnellasp. isolados de espécies de orquídeas, foram
capazes de produzir ácido índol acético (AIA) e promover o crescimento de
150
arroz e feijão, além de melhorar a germinação de sementes de milho. Outro
mecanismo indireto de promoção de crescimento da planta hospedeira é o
controle biológico exercido pelo fungo endofítico, impedindo que
fitopatógenos colonizem e desenvolva doença no hospedeiro (Rojas et al.
2008).
Antagonismo microbiano, segundo Romeiro (2007), é o ato de um
microrganismo utilizar de todos seus recursos para provocar a morte,
impedir o crescimento e/ou a multiplicação de outro. A atividade antagônica
exercida por fungos endofíticos é bem conhecida, sendo resultado de
diferentes mecanismos, como parasitismo, competição por espaço e
nutriente, produção de metabólitos secundários com atividade
antimicrobiana como enzimas líticas, antibióticos e compostos voláteis
(Romeiro, 2007). A produção de substâncias antimicrobianas por fungos
endofíticos filamentosos tem ganhado ênfase nos últimos anos pela procura
de novos antibióticos que atuem contra microrganismos resistentes (Pavithra
et al. 2012).
Diferentes metabólitos antimicrobianos são biosssintetizados por
fungos endofíticos, como: brefeldina A, obtida de Paecilomyces sp.
eAspergillus clavatus (Wang et al. 2002), ergosterol, impetrada por
Rhizoctonia sp. (Maa et al. 2004), emodim produzido por um fungo endofítico
com 98% de similaridade com Chaetomium globosum (Kusari et al. 2008)
e7-amino-4-coumarina produzido por Xylaria sp. (Liu et al. 2008). Além
desses bioativos, Kim et al. (2004), descreveram os diterpenos
periconomicinas A e B isolados de Periconia sp. com forte atividade
antimicrobiana. Esses relatos conferem a esse grupo de microrganismo um
grande potencial de uso de seus metabólitos secundários a serem
empregados na indústria, medicina e agricultura (Guo et al. 2008; Strobel,
2003).
A literatura demonstra que alguns microrganismos endofíticos podem
produzir compostos bioativos idênticos ou semelhantes aos da planta
hospedeira, levando a uma longa discussão da origem dessas substâncias
(Zhao et al., 2011). De todo jeito Strobel e Daisy (2003), afirma que os
151
conhecimentos levantados pela etnobotânica são muito importantes para a
escolha de plantas que possuem microrganismos endofíticos com potencial
biotecnológico.
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) é uma planta conhecida
popularmente no Brasil por seu uso medicinal e ornamental, denominada
pelas populações como chapéu de couro. Esta espécie é usada
popularmente para o tratamento de várias enfermidades como: reumatismo,
tratamento de ácido úrico, sífilis, doenças de pele e de fígado e também para
fins diuréticos (Pott e Pott, 2000).
O objetivo desse estudo foi caracterizar extratos obtidos do cultivo
defungos endofíticos de E. scaberRataj(macrophyllus) com propriedades
antibacterianas.
152
6.2 Material e Métodos
6.2.1 Microrganismos e meios de cultura
A seleção de linhagens de interesse peocedeu-se por métodos que
avaliam o antagonismo de endófitos contra microrganismos.
O potencial antagônico dos fungos endofíticos foi avaliado contra
nove microrganismos patogênicos, sendo cinco espécies de fungos e quatro
espécies de bactérias. Os fungos patogênicos testados constituíam-se de
Colletotrichum lindemunthianum, agente causal da antracnose do feijoeiro;
C. gloeosporioides, responsável pela antracnose pós-colheita em frutos e
pela antracnose foliar em diversas hortaliças; Corynespora cassiicola,
responsável pelamancha alvo em soja; Microsporum canis, agente causal de
dermatomicoses em animais, e Fusarium solani, relacionado à podridão
radicular de diversas culturas. As linhagens de bactérias foram Enterococcus
faecalis (ATCC 29212), Staphylococcus aureus (ATCC 25923), S.
saprophyticus (ATCC 43867) e Escherichia coli (ATCC 25922).Um total de
47 fungos endofíticos isolados de Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus)
foi acessado no banco de microrganismos endofíticos pertencentes ao
Laboratório de Biotecnologia e Ecologia Microbiana (LABEM) da
Universidade Federal de Mato Grosso - Cuiabá, para screening das
linhagens com potencial antagônico.
153
O meio de cultura batata dextrose ágar (BDA) foi usado para os testes
de antagonismo e manutenção dos fungos. Ágar nutriente (AN) serviu para a
manutenção das culturas de bactérias. Quando necessário, os fungos foram
ativados por sete dias e as bactérias em 24h sob agitação de 125 rpm em
meio liquido, ambos a temperatura de aproximadamente de 28ºC.
6.2.2 Seleção de fungos endofíticos antagonista a patógenos
A seleção foi realizada pela técnica de cultura dupla (Mew e Rosales,
1986), com modificações. Inoculou-se um disco de 0,5cm do micélio dos
fungos patogênicos no centro da placa de Petri com meio BDA e, a 3,5cm
equidistante foram inoculados dois discos das linhagens endofíticas. A
inoculação de um disco de micélio do patógeno ao centro da placa de Petri
constitui o tratamento controle. As placas foram seladas e armazenadas a
28ºC. A interação dos micélios foi analisada diariamente até o sétimo dia de
incubação. Observou-se o potencial de inibição do crescimento micelial do
fungo patógeno nesse período. Os fungos com potencial antagônico foram
submetidos a novo teste em triplicata e no sétimo dia de incubação calculou-
se a taxa de inibição pela fórmula:
(Shiomi et al. 2008)
Onde, TI é a taxa de inibição, DC é o diâmetro em cm do fungo
patogênico no tratamento controle e DM é o diâmetro em cm do fungo
patogênico no tratamento com o fungo endofítico.
As linhagens de fungos endófitos com potencial para inibir todos os
fungos patógenos selecionados no experimento acima foram submetidos a
teste qualitativo de antagonismo contra bactérias patogênicas. Para isso,
realizou-se a técnica de antibiose em bloco de ágar, conforme Ichikawa et. al
(1971), com modificações. Cresceram-se as bactérias patógenas em caldo
nutriente (CN) espalhando-as em placas de Petri com meio AN e, em
seguida, inoculou-se sobre a placa, discos de micélios dos fungos
endofíticos. Posteriormente, incubaram-se as placas a temperatura de 4ºC
154
por quatro horas. Após esse período, as placas foram incubadas a 28 ºC por
24 horas. A atividade antimicrobiana foi confirmada pela visualização de
halos de inibição próximos aos discos de micélio dos fungos endofíticos.
6.2.3 Caracterização por ISSR-PCR e identificação das linhagens com
potencial antagônico
A extração do DNA genômico dos fungos foi realizada com kit de
extração de DNA, seguindo recomendações do fabricante (Axygen
biosciences, USA). Realizou-se a análise de ISSR-PCR utilizando-se o
oligonucleotídeo BH1 (5' - GTG GTG GTG GTG GTG - 3') (Integrated DNA
Technologies, Inc). O volume de uma reação foi de 25µl, contendo 1 µl de
extrato de DNA, 2,5 µl de tampão de PCR 10x, 2,5mM de cada dNTP, 10pM
de cada oligonucleotídeo e 1U de taq polimerase. O programa do PCR
consiste em um passo de desnaturação inicial a 94ºC por 2 min, seguido de
35 ciclos a 94 ºC por 1 min, 50 ºC por 2 min e 72 ºC por 2 min, e o passo
final de alongamento a 72 ºC por 10 min em um AMPLITHERM Thermal
Cyclers.
O produto de ISSR-PCR foi submetido à eletroforese em gel de
agarose 1,2% em tampão TEB 0,5x. Os tamanhos dos aplicons foram
determinados com marcador 123pb DNA Ladder (Sigma-Aldrich, Inc.). As
imagens foram salvas em um fotodocumentador (Loccus Biotecnologia,
Brasil) para posterior analise. Obteve-se a avaliação da diversidade por
inspeção visual do gel, considerando todos os amplicons visíveis. O perfil de
amplificação foi transformado em uma matriz binária com os valores:
0:ausência e 1: presença para cada amplicon. Calculou-se a similaridade
dos dados através do Coeficiente de Jaccard (Sneath e Sokal, 1973).
Obteve-se o agrupamento, utilizando o algoritimo UPGMA (Unweighted Pair-
Group Method with Arithmetical Average), baseando-se na matriz de
similaridade com o software NTSys v.2.1(ROHLF, 2001). Um nível de 80%
de similaridade mínima entre os isolados foi considerado para definição de
Unidade Taxonômica Operacional (OTU) (Torres et al. 2008).
155
A identificação dos microrganismos foi realizada pelo sequenciamento
parcial do espaçador interno transcrito (ITS) da região rDNA de
representantes de cada OTU. Para isso, uzou-se os oligonucleotídeos ITS 4
(5′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′) e ITS 5 (5`-GGA AGT AAA AGT
CGT AAC AAG G-3') (White et al. 1990) para amplificação da região
intergênica 18S a 28S. O volume de reação e o programa do PCR foram os
mesmo para análise de ISSR-PCR.
Os produtos de amplificação foram purificados (Dunn; Blattner, 1987) e
quantificados por eletroforese em gel de agarose 1,2%. Realizou-se o
sequenciamento pelo método de Sanger com o Kit Big Dye no ABI3100
Applied Biosystem, e as sequências comparadas no banco de dados do
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) com sequências conhecidas, por
uma pesquisa de similaridade via Blastn (Altschul et al. 1990).Todas as
sequências analisadas foram depositadas no GenBank sob número de
acesso: KC662100 – KC662101, KC662104 – KC662107.
6.2.4 Obtenção de extratos dos fungos endofíticos
Fermentados foram preparados a partir do cultivo de fungos
endofíticos que inibiram todas as bactérias e fungos patogênicos. Obteve-se
o extrato pela maceração do micélio em acetato de etila (AcOEt). Para isso,
cultivou-se as linhagens endofíticas em duas placas de Petri contendo
aproximadamente 20 mL de BDA, em cada uma, por 15 dias a 28ºC. Após o
período de incubação, cortou-se o micélio em pequenos pedaços
transferindo-os para um erlenmeyer contendo 50 mL do solvente AcOET,
ficando armazenado por 72h a 25ºC no escuro. Posteriormente o micélio foi
separado do solvente por filtração em papel de filtro nº4, e o extrato
concentrado com remoção do solvente em rotavapor a 30 ºC. Os extratos
foram transferidos para um frasco previamente tarado para obtenção da
massa total.
6.2.5 Detecção da atividade antimicrobiana dos extratos
Testou-se os extratos de AcOET contra os fungos patogênicos. Para
isso, discos de micélio de 0,5 cm dos fungos patógenos foram inoculados no
156
centro de placas de Petri contendo meio BDA; e ao terceiro dia de
crescimento, dois discos de papel de filtro contendo 250µg dos extratos de
AcOET, foram colocados a 3,5cm equidistante do centro da placa. Inoculou-
se o tratamento controle com discos de papel de filtro contendo o solvente
AcOET. A atividade antimicrobiana foi determinada pela observação da
inibição do micélio do fungo patógeno em comparação com o tratamento
controle. Obteve-se a taxa de inibição do crescimento do patógeno pela
medição do diâmetro em centímetro do micélio no sétimo dia. O experimento
foi conduzido em triplicata e delineamento inteiramente casualizado. As
médias então submetidas à análise de variância (ANOVA) e o teste de
média adotado foi Scott-Knott a 5% de probabilidade.
6.2.6 Ensaio de bioautografia dos extrados fúngicos obtidos
A atividade antimicrobiana contra as bactérias patogênicas E. faecalis,
S. aureus e S. saprophyticus foi detectada pela técnica de bioautografia,
segundo Zheng et al. (2005), com modificações. Frações de 200 µg dos
extratos AcOET foram eluidas utilizando clorofórmio:metanol (9:1 v/v) em
placas de sílica (PF254) de cromatografiaemcamada delgada analítica
(CCDA), previamente desinfestadas em estufa de esterilização a 80ºC por
24h. Observou-se As placas desenvolvidas sob luz ultra-violeta nos
comprimentos de onda de 254 nm para observação do cromatograma das
frações presentes na sílica. Posteriormente, a placa cromatográfica foi
transferida para placa de Petri (15cm) e coberta com AN fundente contendo
uma suspensão das bactérias patogênicas. Incubou-se as placas por 24h a
37ºC, e em seguida, o AN foi pulverizado com 2,5mg/ml de Brometo Tiazolil
azuldetetrazólio(MTT), e incubadas novamente até a revelação dos halos de
inibição.
157
158
6.3 Resultados e Discussão
6.3.1 Linhagens de fungos endofíticos com atividade antagônica a
microrganismos patogênicos
Dos 47 fungos endofíticos avaliados, 10 linhagens foram eficientes
para inibir o crescimento do micélio de todos os fungos patógenos testados.
A ação antagônica dos isolados endofíticos variou entre os tratamentos,
sendo as linhagens FREI-36 e FREI-35 menos eficientes na inibição de F.
solani (38%) e C. gloeosporioides (42%), respectivamente. Contudo, os
isolados FAEII-19 e FAEII-24, exerceram o maior antagonismo, resultando
em 81 e 85% de inibição do crescimento do micélio de C. lindemunthianum,
respectivamente (Figura 1).
A atividade antagônica exercida por endofíticos sobre os fungos
patógenos ocorre por diferentes mecanismos, seja por competição por
nutrientes, parasitismo e predação, produção de compostos antimicrobianos,
como antibióticos e compostos voláteis, e produção de enzimas líticas como
quitinases (Romeiro 2007). No entanto, Handelsman e Stabb (1996),
sugerem que muitos agentes de controle biológico suprimem doenças
causadas por fungos fitopatogênicos por mais de um mecanismo de
antagonismo.
Em geral, dez fungos endofíticos (21%) isolados de Echinodorus
scaber Rataj (macrophyllus) apresentaram amplo espectro de atividade
antagônica frente ao controle de cinco diferentes fungos patogênicos de
159
plantas e animais. Essa ampla gama de atividade nem sempre é encontrada
entre os antagonistas endofiticos, como sugere os isolados endófitos de
beterraba que apresentaram alta especificidade de antagonismo,
demonstrando controle contra apenas um patógeno (Zachow et al. 2008).
FIGURA 1. Antagonismos de fungos endofíticos isolados de E. scaber exercido contra fungos patogênicos. C. lindemunthianum, b C. gloeosporioides, C. cassiicula, F. solani, M. canis. Médias seguidas pelas mesmas letras, maiúsculas entre as linhagens endofíticas e minúsculas dento do mesmo tratamentos, não diferem significativamente entre si pelo teste Skott-Knott, a 5% de probabilidade.
O teste de antibiose revelou que, das 10 linhagens de fungos
positivas para inibir todos os fungos patógenos, somente FAEII-21, FREI-35,
FREI-36, FREI-40, FREII-57 demonstraram atividade antagônica a todos as
bactérias patogênicas no teste de antibiose por difusão em bloco de ágar
(Figura 2).
160
FIGURA 2. Antibiose exercida por fungos endofíticos isolados de E. scaber (macrophyllus) contra bactérias patogênicas. Os números representam as linhagens endofíticas com atividade a todos os patógenos, sendo: 1: FAEII-21, 2: FREII-57, 3: FREI-35, 4: FREI-40, 5: FREI-36. As setas demonstram a presença de halo de inibição.
6.3.2 Identificação dos fungos endofíticos com potencial antagônico
As 10 linhagens de fungos endofíticos, positivos para inibir todos os
fungos patógenos avaliados, foram separados em seis grupos, de acordo
com suas características morfológicas macro e microscópicas (Figura 3).
Dentre esses grupos, FAEII-16, FAEII-19, FAEII-21 e FAEII-24, foram isolados
de pecíolo de E. scaber; e FREI-35, FREI-36, FREI-40, FREII-54, FREII-57
foram obtidos de raiz de E. sacaber.
O ISSR do DNA total dos isolados resultou em seis padrões de
amplificação. A Figura 4 demonstra a estrutura dos grupos formados pelo
UPGMA. O dendograma confirma a distância genética entre os grupos
obtidos pela analise morfológica, indicando a presença de grupos
antagonistas diferentes na comunidade de fungos endofíticos isolados de E.
scaber. Considerando o nível de 80% de similaridade no dendograma, pode
-se verificar seis OTU constituídas de três grupos e três perfis únicos. Os
três grupos apresentaram similaridade J=1, portanto, possuem o mesmo
padrão de amplificação.
161
FIGURA 3. Vista frontal dos morfotipos dos fungos endofíticos antagonistas
isolados de E. scaber em placas de Petri aos sete dias de
crescimento em meio BDA. As setas indicam as hifas dos
isolados fungicos em aumento de 400x.
A identificação molecular demonstrou que os sete grupos pertencem a
seis gêneros diferentes quando comparados às sequências encontradas no
GenBank, sendo que FAEII-16 apresentou 99% de identidade com
Corynespora sp, FAEII-21 apresentou 99% de identidade com Cochliobolus
sativus, FAEII-24 obteve 99% de identidade com Cochliobolus lunatus,
FREI-40 descrito para Penicillium shearii com 92% de identidade, FREII-54
foi descrito como Chaetomium aureum, com 99% de identidade e FREII-57
apresentou 97% de identidade com Eupenicillium javanicum (Tabela 1).
162
FIGURA 4. Dendograma gerado a partir da analise do perfil de amplificação por ISSR-PCR das linhagens de fungos endofíticos com atividade antagônica isoladas de E. scaber, utilizando coeficiente de similaridade de Jaccard.
TABELA 1. Identificação dos fungos endofíticos isoladas de E. scaber com
base no seqüenciamento ITS rRNA.
Isolados GenBank Nº de
Acesso Identidade (%)
FAEII-16 Corynespora sp. JN853778.1 99
FAEII-21 Cochliobolus sativus EF452447.1 99
FAEII-24 Cochliobolus lunatus JN853778.1 99
FREI-40 Penicillium shearii GU944606.1 92
FREII-54 Chaetomium aureum JQ846057.1 99
FREII-57 Eupenicillium javanicum U18358.1 97
Todos os gêneros encontrados nesse trabalho já foram isolados
anteriormente como fungos endofíticos. Os gêneros Corynespora e
Chaetomium isolados da casca de Aegle marmelos na Índia (Gond et al.
163
2007); já o gênero Penicillium foi isolado na China, de pecíolo de Quercus
variabilis (Ge et al. 2008); Cochliobolus encontrado em casca, folha e raiz de
Taxus globosa, no México (Rivera-Orduña e Suarez-Sanchez, 2011); e, por
fim, o gênero Eupenicillium, isolado na China de folhas deMurraya
paniculata(Wang et al. 2012). No entanto, muitos trabalhos relatam que
algumas dessas espécies também podem exercer patologias em diversas
culturas, como Corynespora sp.em tomateiro (Coelho netto et al. 2012) e
Cochliobolus sativus em trigo (Aggarwall et al. 2004). Porém, a interação
microrganismo-planta não depende somente das espécies envolvidas, o
ambiente e o tempo são fatores importantes no estabelecimento e no tipo de
interação (Schlz e Boyle, 2005). Barreto et al. (2003), isolou a espécie C.
cassiicola, patógeno da planta Lantana camara, vivendo assintomaticamente
no mesmo hospedeiro, e com forte indício de exercer controle biológico em
alguns biótipos de L. camara. Nos últimos anos, foram relatados isolamento
de substâncias importantes dos gêneros descritos, como enzimas e
antifúngicos produzidos por E. javanicum(Nakadate et al. 2008; Tao et al.
2011), Chaetomium globosum (Li et al. 2011), Cochliobolus
lunatus(Podobnik et al. 2008), Corynespora cassiicola (Hunter et al. 2011),
Penicillium chrysogenum(Brakhage et al. 2005); demonstrando que esses
gêneros pertencem a importantes grupos de microrganismos com potencial
para aplicações biotecnológicas.
6.3.3 Atividade antimicrobiana dos extratos AcOET dos fungos
endofíticos
O rendimento dos extratos AcOET variou de 11 a 16 mg.Todos os
extratos AcOET foram eficientes para inibir o crescimento micelial dos
fungos patogênicos (Figura 5). A porcentagem de inibição variou entre os
endofíticos e os patógenos confrontados. Utilizando 250 µg do extrato
AcOET, a atividade antimicrobiana variou de 4,12% para C.gloeosporioides
a 29% para M. canis, na presença dos extratos de FREI-35 e FREI-40,
respectivamente. Ambas as linhagens endofíticas pertencem ao gênero
164
Penicillium, que é comumente conhecido pela produção de compostos
antimicrobianos (Brakhage et al. 2005).
Podobnik et al. (2008), relataram que Cochliobolus lunatus produz
citocromo P450, um precursor do ergosterol, já descrito como composto
antifúngico. O extrato AcOET, extraído de FREI-21 que pertence ao gênero
Cochiolbolus, na concentração de 25µg/µLinibiu o crescimento micelial de C.
lindemunthianum, C. gloeosporioides e M. canis em 28, 17 e 17%,
respetivamente; indicando ter uma ampla atividade antifúngica em
microrganismos de interesse agronômico e clinico.
FIGURA 5. Teste antimicrobiano dos extratos de AcOET dos fungos endofíticos FREI-35, FREI-36, FREI-40, FREII-57, FREII-21, isolados de E. scaber contra fungos patogênicos. C. lindemunthianum, C. gloeosporioides, C. cassiicula, F. solani, M. canis. Médias seguidas pelas mesmas letras, maiúsculas entre os fungos patogênicos, no mesmo tratamento; e minúsculas entre as linhagens de fungos endofíticos, não diferem significativamente entre si pelo teste Skott-Knott, a 5% de probabilidade.
165
O extrato da linhagem FREII-57, identificada como pertencente ao
gênero Eupenicillium obteve uma inibição acima de 10% do crescimento
para todos os fungos patógenos, tendo menor inibição para C. cassiicula e
F. solani com 11% de inibição e maior controle sobre C. lindemunthianum
com 27% de inibição do crescimento do micélio. O gênero Eupenicillium é
descrito pela produção de eujavanicina A, eficiente no controle do fungo
patógeno Aspergillus fumigatus (Nakadate et al. 2008).
De modo geral, a atividade de controle do crescimento de fungos
filamentosos patogênicos foi menor, quando comparado ao teste em cultura
dupla. Esse resultado está de acordo com Handelsman e Stabb (1996), que
afirma que o controle de fungos antagonistas é realizado através de
múltiplos mecanismos. Assim, um determinado fungo endofítico, com
atividade antagônica, pode inibir o crescimento de outros organismos
através da produção de metabolitos secundários com atividade
antimicrobiana, bem como também pode inibir simultaneamente através de
competição por espaço e nutriente.
6.3.4 Autobiografia dos extratos fúngicos
Pela CCDA eluída em clorofórmio/metanol (9:1), foi possível detectar
o padrão de variação das substâncias nos extratos fúngicos obtidospela
observação dos diferentes fatores de retenção visualmente discrepantes na
revelação (Figura 6). Agruparam-se os extratos de acordo com o provável
número de substâncias apresentadas na CCDA. Os extratos dos fungos
FREI-35 e FREI-40apresentaram três substâncias; os demais foram
agrupados separadamente, sendo que o extrato do fungo FREI-36
apresentou quatro substâncias; FREII-57 apresentou duas substâncias; e
finalmente o extrato do fungo endofítico FREII-21 apresentou cinco
substâncias.
Os extratos FREII-57 e FAEII-21 apresentam zonas de inibição com
atividade antimicrobiana em todas as bactérias testadas por autobiografia.
No entanto, E. faecalis foi mais sensível a todos os extratos, demonstrando
que os extratos FREI-35, FREI-36, FREI-40 possuem maior diversidade de
166
compostos antibacterianos, apesar de não aparecer zonas de inibição nas
demais bactérias nas concentrações testadas.
FIGURA 6. Cromatografia em camada delgada analítica dos extratos Acetatoetílicos de fungos endofíticos isolados de E. scaber irradiada com luz ultra-violeta a 254 nm. Os números representam os extratos aplicados a placa de sílica. 1: FREI-36; 2: FREI-35; 3: FREI-40; 4: FREII-57 e 5: FAEII-21.
O teste conseguiu demonstrar que os extratos possuem substâncias
com maior atividade antimicrobiana, destacando-se o extrato FREII-57 de E
jacanicum, na presença de E. faecalis, S aureus, S. saprophyticus. Esse
resultado está de acordo com Nakadate et al. (2008) que demonstraram que
E. javanicum possui atividade antibacteriana a várias bactérias patógenas
de humanos, incluindo a linhagem MBRC12732 de S. aureus. Esse autor
também afirma que E. javanicum produz um composto antimicrobiano
denominado Eujavanicina A.
A forte atividade antimicrobiana do extrato FAEII-21, pertencente ao
gênero Cochliobolus, também é suportada pelo resultado de Shao et al.
(2011), que demonstraram que o fungo Cochliobolus lunatus produtor de
167
lactonas possui atividade antimicrobiana contra varias bactérias
patogênicas.
Futuros trabalhos deverão elucidar o perfil químico dos extratos de
acetato de etila obtidos das linhagens endofítica isoladas de E. scaber.
FIGURA 7. Atividade antimicrobiana revelado pelo teste de bioautografia-CCD dos extratos AcOET de Fungos endofíticos isolados de E. scaber. O solvente usado na eluição das amostras foi clorofórmio-metanol (9:1 v/v). A atividade antimicrobiana foi detectada pela presença de zonas de inibição claras, contrastando com o fundo purpura. 1: Extrato FREI-35, 2: FREI-36, 3: FREI-40, 4: FREII-57, 5: FAEII-21.
168
6.4 Conclusões
Extratos AcOET das linhagens FREI-35, FREI-36, FREI-40, FREII-57
e FREII-21, pertencentes aos gênerosPenicillium, Cochliobolus e
Eupenicillium,apresentaram atividades antibacteriana e antifúngica in vitro.
A cromatografia dos extratos das linhagens FREII-21 e FREII-
57apresentaram compostos com diferentes fatores de retenção com
atividade antibacteriana.
169
6.5 Referências Bibliográficas
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173
7. Conclusões Gerais
Echinodorus scaber Rataj (macrophyllus) possui bactérias e
fungos endofíticos. As bactérias endofíticas cultiváveis pertencem a 10
gêneros e 25 taxons, e os fungos estão distribuídos em 19 taxons e 13
gêneros diferentes.
As raízes de E. scaber apresentaram estruturas tipocas de
fungos endofíticos dark septate (DSE).As linhagens FREII-ED1 e FREIII-
ED2que apresentaram características com DSE, demonstraram identidade
com Pestalotiopsis theae e Lophiostoma cynaroidis, respectivamente.
Colonizaram assintomaticamente o tecido interno de quatro espécies não
hospedeira: Vochysia divergens, Vochysia haenkeana, Combretum
lanceolatum e Capsicum frutensces.
Bactérias endofíticas do gênero Bacillus e fungos endofíticos
dos gêneros Corynespora, Cochliobolus, Penicillium, Chaetomium e
Eupenicillium,possui aptidão antagônica aos fungos patogênicos
Colletotrichum lindemunthianum, C. gloeosporioides, Corynespora
cassiicula, Fusarium solanie Microsporum canis; e as bactérias patógenas
Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, S. saprophyticus e
Escherichia coli.
Bactérias dos gêneros Enterobacter e Klebsiella isoladas de E.
scaberproduzem AIA e solubilizam fosfato de cálcio.
Os isolados BAEI-28, BAEII-37, BAEIII-79 pertencente ao
gênero Enterobacter e BREI-117 pertencente ao gênero Klebsiella,
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produtoras de AIA e solubilizadoras de fosfato de cálcio, promoveram o
aumento de massa seca de plântulas de soja.
Extratos acetato de etila dos fungos pertencentes aos gêneros
Corynespora, Cochliobolus, Penicillium, Chaetomium e Eupenicillium possui
atividade antimicrobiana contra todos os microrganismos patogênicos
testados.
