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MAIRA OLIVEIRA SILVA
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE E COMPOSIÇÃO DE
OLIGOSSACARÍDEOS EM SUBPRODUTO OBTIDO DO
PROCESSAMENTO INDUSTRIAL DA GOIABA (Psidium guajava)
CAMPINAS
2015
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RESUMO
A goiaba (Psidium guajava L.), uma das frutas tropicais mais consumidas e utilizadas na
indústria brasileira, é conhecida como fonte de compostos bioativos relacionados à
prevenção de várias doenças no homem, sendo seu subproduto agroindustrial também
vinculado a esse benefício. A proposta do presente trabalho foi fornecer dados sobre o
subproduto obtido do processamento de goiaba da variedade Paluma, analisando-se
distintas metodologias de extração e determinação da capacidade antioxidante dos
compostos fenólicos presentes na matriz e identificando a presença de oligossacarídeos,
importante prebiótico, bem como sua quantificação, destacando-se a importância de sua
aplicação na alimentação. Dois tipos de extração – única com solução hidroetanólica 80% e
sequencial com solução hidroacetônica 80% (fenólicos livres), hexano (fenólicos
lipossolúveis) e acetato de etila (fenólicos conjugados) – foram utilizadas para a
quantificação dos compostos fenólicos, flavonoides e taninos, sendo a avaliação da
atividade antioxidante realizada por três ensaios antioxidantes DPPH – 2,2-difenil-1-
picrilhidrazil, ABTS – ácido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico e ORAC –
capacidade de absorção de oxigênio radical. A identificação e quantificação dos
oligossacarídeos foram realizadas em extratos obtidos por três mecanismos – shaker, ultra-
turrax e ultrassom, avaliando-se o mecanismo mais eficiente na recuperação do composto.
O subproduto agroindustrial se mostrou uma boa fonte de compostos fenólicos, sendo a
extração sequencial de melhor eficiência na extração dos compostos fenólicos (0,56 mg
EAG.g-1
– extração única e 2,60 mg EAG.g-1
– extração sequencial), refletindo na maior
atividade antioxidante determinada pelos três ensaios quando comparada com a fruta. Os
oligossacarídeos identificados nas amostras foram os FOS – fruto-oligossacarídeos (GF2,
GF3 e GF4) e os MOS – malto-oligossacarídeos (G3, G4, G5, G6 e G7), sendo maior teor
determinado na goiaba. O mecanismo de extração ultrassom mostrou ser o mais eficiente na
recuperação dos oligossacarídeos nas amostras. O estudo indica que o subproduto
agroindustrial da goiaba possui grande potencial antioxidante em extratos obtidos por
processos sequenciais, merecendo atenção para aplicação em alimentos. As informações
apresentadas de oligossacarídeos na goiaba e seu subproduto agroindustrial são uma boa
base para um desenvolvimento de banco de dados de composição de alimentos, podendo
ser melhores explorados por processo de otimização de extrações para melhor
aproveitamento desse prebiótico e aplicação em alimentos.
Palavras-chave: frutas tropicais; subprodutos; compostos fenólicos; compostos bioativos,
prebióticos.
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ABSTRACT
Guava (Psidium guajava L.), one of the most consumed tropical fruit and used in Brazilian
industry, is known as a source of bioactive compounds related to the prevention of various
diseases in humans and its agro-industrial by-product also linked to this benefit. The
purpose of this study was to provide data on the by-product obtained from guava processing
of the variety Paluma, analyzing different methodologies of extraction and determination of
the antioxidant capacity of phenolic compounds present in the matrix and identifying the
presence of oligosaccharides, important prebiotic and its quantification, highlighting the
importance of its application in food. Two kinds of extraction – single with hydroethanol
80% solution and sequentially with hydroacetonic 80% solution (free phenol), hexane
(soluble phenolic) and ethyl acetate (phenolic conjugates) - were used for the quantification
of the phenolic compounds, flavonoids and tannins, and the evaluation of the antioxidant
activity performed by three antioxidant assays (DPPH – 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl,
ABTS – 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) and ORAC – oxygen
radical absorbance capacity). The identification and quantification of the oligosaccharides
were performed on extracts obtained by three mechanisms - shaker, ultra-rurrax and
ultrasound, evaluating the most efficient mechanism to recover the compound. The agro-
industrial by-product proved to be a good source of phenolic compounds, sequential
extraction with an improved efficiency in extraction of phenolic compounds (0.56 mg
EAG.g-1
- single extraction and 2.60 mg GAE.g-1
- sequential extraction), reflecting the
increased antioxidant activity determined by the three tests when compared with fruit.
Oligosaccharides identified in the samples were the FOS – fructooligosaccharides (GF2,
GF3 and GF4) and MOS – maltooligosaccharides (G3, G4, G5, G6 and G7), higher specific
content in guava. The extraction mechanism ultrasound showed to be the most efficient in
the recovery of oligosaccharides in the samples. The study indicates that the agro-industrial
by-product from guava has great potential antioxidant extracts obtained by sequential
processes, deserving attention for application in food. The information presented
oligosaccharides in guava and its agro-industrial by-product are a good basis for a database
development of food composition and can be best exploited by extraction optimization
process to better use of prebiotic and application in food.
Keywords: tropical fruits; by-products, phenolic compounds; bioactive compounds;
prebiotics.
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xi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 3
2.1. Objetivo geral .............................................................................................................. 3
2.2. Objetivos específicos ................................................................................................... 3
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 5
3.1. Goiaba .......................................................................................................................... 5
3.1.1. Subprodutos agroindustriais do processamento da goiaba .................................... 8
3.2. Compostos Fenólicos ............................................................................................. 12
3.2.1. Flavonoides ..................................................................................................... 17
3.2.2. Taninos ........................................................................................................... 21
3.3. Atividade antioxidante ........................................................................................... 24
3.3.1. Métodos de determinação da atividade antioxidante ...................................... 29
3.4. Oligossacarídeos .................................................................................................... 33
3.4.1. Fruto-oligossacarídeos .................................................................................... 42
3.4.2. Malto-oligossacarídeo .................................................................................... 50
4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 53
4.1. Obtenção das amostras ........................................................................................... 53
4.2. Caracterização das amostras .................................................................................. 53
4.2.1. Determinação do pH ....................................................................................... 53
4.2.2. Análise de acidez total titulável ...................................................................... 54
4.2.3. Determinação de sólidos solúveis .................................................................. 54
4.3. Composição fenólica .............................................................................................. 54
4.3.1. Obtenção dos extratos ..................................................................................... 54
4.3.2. Determinação de fenólicos totais .................................................................... 55
4.3.3. Quantificação de flavonoides ......................................................................... 56
4.3.4. Determinação de taninos condensados ........................................................... 57
xii
4.4. Ensaios antioxidantes in vitro ................................................................................ 58
4.4.1. Atividade sequestradora do radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) ........ 58
4.4.2. Atividade antioxidante pelo método de redução do radical ABTS [2,2´-
azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)]......................................................... 58
4.4.3. Determinação da capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC)........ 59
4.5. Análise de açúcares e oligossacarídeos.................................................................. 60
4.5.1. Preparo dos extratos ....................................................................................... 60
4.5.2. Identificação e quantificação de açúcares e oligossacarídeos ........................ 60
4.6. Análise estatística .................................................................................................. 62
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 63
5.1. Caracterização das amostras .................................................................................. 63
5.2. Composição fenólica .............................................................................................. 66
5.3. Ensaios de atividade antioxidante .......................................................................... 74
5.3.1. Atividade sequestrante do radical livre DPPH ............................................... 74
5.3.2. Atividade antioxidante pelo método ABTS ................................................... 79
5.3.3. Ensaio da Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio (ORAC) ............... 82
5.3.4. Influência do tipo de extração na obtenção de compostos antioxidantes ....... 86
5.3.5. Correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante ..................... 90
5.4. Caracterização de açúcares e oligossacarídeos ...................................................... 93
5.4.1. Identificação e caracterização ......................................................................... 93
5.4.2. Efeito dos mecanismos de extração de açúcares e oligossacarídeos .............. 99
6. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 105
7. PERSPECTIVAS FUTURAS ..................................................................................... 107
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 109
xiii
“Pois vos é necessária à perseverança para fazerdes a vontade de Deus e
alcançardes os bens prometidos.”
Hebreus 10:36
xiv
xv
DEDICATÓRIA
À minha família que sempre me incentivou para a realização dos meus ideais, encorajando-
me a enfrentar todos os momentos difíceis da vida e a acreditar mais em mim. Com muito
carinho, dedico a vocês, obrigada pela compreensão, apoio e contribuição para essa mais
nova conquista na minha vida.
xvi
xvii
AGRADECIMENTOS
À Deus pela presença constante, pela sabedoria, força e amor que tem me dado
todos os dias, por ter ajudado a manter a fé nos momentos mais difíceis durante essa etapa.
À orientadora Gláucia Maria Pastore que me deu a oportunidade de fazer parte da
sua equipe, me ouvindo e confiando em mim, meus sinceros agradecimentos ao seu olhar
crítico e construtivo que me ajudaram na obtenção desse título.
Aos professores Solange Guidolin Canniatii-Brazzaca, Vera Sônia Nunes da Silva,
Rosângela dos Santos e Raimundo Wilane de Figueiredo pela disponibilidade em avaliarem
meu trabalho, contribuindo com sugestões e comentários valiosos para a sua melhoria.
Aos colegas do Laboratório de Bioaromas e Compostos Bioativos, Iramaia,
Gustavo, Renata, Maysa, Verônica, Nadir, Ana Paula, Ana Stela, Dora e Débora que
ouviram os meus desabafos, que me ajudaram nas dificuldades, que me passaram
ensinamentos valiosos, que contribuíram com o enriquecimento das minhas análises e na
minha vida acadêmica. Em especial, a Jane que com seu conhecimento em HPLC e
oligossacarídeos me ajudou de forma excepcional com paciência e carinho, minha eterna
gratidão; e ao Henrique que desde o início do mestrado esteve ao meu lado, me dando
conselhos, tirando duvidas, orientando em certas análises e sendo um amigo em momentos
bons e ruins, à você meu muito obrigada.
As amigas Arícia e Débora pelo convívio durante o mestrado, pelos ensinamentos,
pelos desabafos e pelas risadas.
As meninas da república Sabrina, Gabriela Souza, Gabriela Silva, Bárbara, Gizele,
Naara, Beatriz, Ana Cláudia, Ruth e Karol por esses dois anos de convivência,
confidências, compreensões, sorrisos e aprendizados. Grata pelo acolhimento e a amizade
formada.
À Tatiane, Tamires, Luiz Gustavo, Rafaela, Mariana, Natália e Suzan, amigos que
desde a graduação provam que a distância não é um empecilho quando verdadeiros laços de
amizade são formados. Grata pelos momentos especiais nos nossos reencontros, grata pela
torcida e motivação de sempre.
Ao Instituto Federal de São Roque por ter permitido o meu deslocamento à
Campinas para a realização do Mestrado, obrigada pela compreensão.
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Aos meus amigos de São Roque, Roseli, Tiago, Eddy, Milena, Thiago, Adriana,
Herlison, Solema, Allan, Ricardo Rodriguez, Silvan, Janaína, Ramiéri, Marcos, Rafael,
Elis, Ricardo Coelho, Daniela, Rodrigo, Diego, Nathália e Luiza que mostraram
preocupação e carinho, me motivando em momentos difíceis, seja na vida pessoal, como
profissional e acadêmica.
Aos meus amigos Suzan e Richtier que mesmo de longe contribuíram com
sugestões, dando apoio e motivação.
À indústria De Marchi por fornecer as matérias-primas necessárias para a realização
deste trabalho.
E em especial a minha família, meus pais Rubens e Maria Aparecida, irmãs Renata
e Carolina e cunhados Adriano e Felipe que desde sempre acreditaram em mim, me
incentivaram na realização dessa etapa, me deram broncas quando me sentia incapaz, me
motivaram quando o desânimo vinha, oraram pela minha vida, se alegraram com minhas
alegrias e me apoiaram em minhas conquistas, me mostrando sempre o verdadeiro sentido
do amor. Sem vocês os obstáculos seriam bem mais difíceis de serem ultrapassados, sem
vocês essa caminhada e conquista não teria o mesmo gosto de dever cumprido.
A todas as pessoas que de alguma forma contribuíram, meus sinceros
agradecimentos.
xix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Fluxograma das rotas da síntese dos compostos fenólicos. (Fonte: Tiveron, 2010).
.............................................................................................................................................. 13
Figura 2. (A) Estrutura básica dos flavonoides e (B) Estrutura básica dos flavonoides com
grupo carbonila no C-4. (Fonte: Huber & Rodriguez-Amaya, 2008). ................................. 18
Figura 3. Principais classes dos flavonoides. (Fonte: Huber & Rodriguez-Amaya, 2008). . 19
Figura 4. Estrutura genérica das maiores classes dos flavonoides. (Fonte: Balasundram,
Sundram e Samman, 2006). .................................................................................................. 19
Figura 5. Estrutura de um tanino hidrolisável. (Fonte: Battestin, Matsuda e Macedo, 2008).
.............................................................................................................................................. 22
Figura 6. Estrutura de um tanino condensado. (Fonte: Martins, 2012). ............................... 22
Figura 7. Reação da vanilina com o tanino condensado. (Fonte: Martins, 2012). ............... 24
Figura 8. Representação esquemática da estrutura química do DPPH e sua redução a radical
DPPH•. (Fonte: Pazinatto, 2008). ......................................................................................... 30
Figura 9. Representação esquemática da estrutura química do composto ABTS. (Fonte:
Pereira, 2009). ...................................................................................................................... 31
Figura 10. Monossacarídeos presentes nas estruturas de oligossacarídeos. (Fonte: Mussatto
e Mancilha, 2007). ................................................................................................................ 34
Figura 11. Representação química de processos de produção de oligossacarídeos. (Fonte:
Mussatto e Mancilha, 2007, adaptada). ................................................................................ 41
Figura 12. Estrutura química dos principais fruto-oligossacarídeos: (A)1-kestose, (B)
nistose e (C) frutofuranosil nistose. (Fonte: Tuohy et al., 2005). ......................................... 44
Figura 13. Subprodutos agroindustriais da goiaba “Paluma” após lavagem e separação. ... 63
Figura 14. Aspecto visual da goiaba in natura e do subproduto agroindustrial antes da etapa
de liofilização (A) e (B), respectivamente e, após a etapa de liofilização e moagem (C) e
(D), respectivamente. ............................................................................................................ 66
Figura 15. Curva analítica – (A) ácido gálico padrão de referência (n=7) para o cálculo do
teor de compostos fenólicos; (B) catequina padrão de referência (n=9) para o cálculo do
teor de flavonoides e (C) catequina padrão de referência (n=8) para o cálculo do teor de
taninos. .................................................................................................................................. 67
Figura 16. Curva analítica do Trolox padrão de referência (n = 11) para capacidade
antioxidante de sequestro do radical DPPH ABTS e seu coeficiente de correlação linear
(R²). ....................................................................................................................................... 76
xx
Figura 17. Atividade antioxidante (%) dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial da goiaba na concentração 3,33 mg.mL-1
, em base fresca, pelo método do
sequestro do radical livre DPPH (média ± desvio padrão, mínimo n = 3). .......................... 78
Figura 18. Curva analítica do Trolox padrão de referência (n = 8) para capacidade
antioxidante de sequestro do radical ABTS e seu coeficiente de correlação linear (R²). ..... 80
Figura 19. Curva analítica do Trolox padrão de referência (n = 9) para capacidade
antioxidante determinada pelo ensaio ORAC hidrofílico (A) e lipofílico (B) e seus
respectivos coeficientes de correlação linear (R²). ............................................................... 82
Figura 20. Área de decaimento da intensidade dos extratos em relação ao branco no ensaio
ORAC para compostos fenólicos hidrofílicos e lipofílicos. ................................................. 84
Figura 21. Teor de (A) compostos fenólicos e (B) flavonoides (C) taninos e atividade
antioxidante pelos ensaios (D) DPPH, (E) ABTS e (F) ORAC em goiaba in natura e
subproduto agroindustrial de goiaba, em base fresca (média ± desvio padrão, mínimo n =
3). .......................................................................................................................................... 88
Figura 22. Perfil HPLC ilustrando os mono- e dissacarídeo na goiaba in natura (A) e seu
subproduto agroindustrial (B) e oligossacarídeos na goiaba in natura (C) e seu subproduto
agroindustrial (D) extraídos pelo mecanismo Ultrassom: GF2: 1-kestose, GF3: nistose,
GF4: 1F-β fructofuranosylnystose, G3: maltotriose, G4: maltotetriose, G5: maltopentaose,
G6: maltohexaose, G7: maltoheptaose. ................................................................................ 94
Figura 23. Teor de (A) açúcares (glicose, frutose e sacarose) e (B) oligossacarídeos em
goiana in natura e subproduto agroindustrial de goiaba de acordo com os mecanismos de
extração. .............................................................................................................................. 102
xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores nutricionais por 100 g da parte comestível de goiaba ............................... 7
Tabela 2. Usos medicinais de subprodutos da goiaba Psidium guajava .............................. 11
Tabela 3. Classificação dos compostos fenólicos segundo o esqueleto principal ................ 14
Tabela 4. Fontes de alguns flavonoides presentes em vegetais ............................................ 20
Tabela 5. Exemplos de oligossacarídeos e suas composições .............................................. 36
Tabela 6. Micro-organismos anaeróbicos predominantes no cólon humano ....................... 37
Tabela 7. Compostos prebióticos do grupo dos oligossacarídeos ........................................ 42
Tabela 8. Exemplos de fontes de fruto-oligossacarídeos e seus teores expressos em
porcentagem (base fresca) .................................................................................................... 43
Tabela 9. Exemplos de aplicações do FOS em produtos alimentícios e suas funcionalidades
.............................................................................................................................................. 46
Tabela 10. Características físico-químicas da goiaba in natura “Paluma” e do seu
subproduto agroindustrial ..................................................................................................... 64
Tabela 11. Valores de umidade, rendimento e matéria seca da goiaba in natura e do
subproduto agroindustrial após o processo de liofilização ................................................... 65
Tabela 12. Teor de compostos fenólicos, flavonoides e taninos condensados de goiaba in
natura e subproduto agroindustrial de goiaba, expressa em base fresca .............................. 68
Tabela 13. Valor do IC50 (mg.mL-1
) dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial da goiaba, expressa em base fresca ............................................................... 75
Tabela 14. Atividade antioxidante dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial da goiaba, expressa em base fresca, pelo método do sequestro do radical livre
DPPH•................................................................................................................................... 77
Tabela 15. Atividade antioxidante dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial de goiaba, expressa em base fresca, pelo método ABTS .............................. 80
Tabela 16. Atividade antioxidante dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial de goiaba pelo ensaio ORAC, expressos em µmol TE.g–1
, em base fresca .. 83
Tabela 17. Coeficiente de correlação linear de Pearson (r²) entre os compostos fenólicos e
flavonoides e os ensaios de atividade antioxidante de goiaba in natura e seu subproduto .. 91
Tabela 18. Coeficiente de correlação linear de Pearson (r²) entre os ensaios de atividade
antioxidante de goiaba in natura e seu subproduto agroindustrial ....................................... 92
xxii
Tabela 19. Composição de mono- e dissacarídeo em goiaba in natura e subproduto
agroindustrial de goiaba, expressa em base seca, obtidos por diferentes mecanismos de
extrações ............................................................................................................................... 95
Tabela 20. Composição de oligossacarídeos em goiaba in natura e subproduto
agroindustrial de goiaba, expressa em base seca, obtidos por diferentes mecanismos de
extrações ............................................................................................................................... 98
xxiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS: acido 2,2'-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico
AGCC: Ácidos graxos de cadeia curta
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC: Association of Official Analytical Chemists
ATT: Acidez total
CF: Compostos fenólicos
CLAE-TI: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada em sistema de troca iônica
Cr: Espécie mineral cromo
Cu: Espécie mineral cobre
Cu+: Íon cuproso
DNA: Ácido desoxirribonucleico
DP: Grau de polimerização
DPPH: 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
EAG: Equivalente de ácido gálico
ECFC: Extrato de compostos fenólicos conjugados
ECFL: Extrato de compostos fenólicos livres
ECFSH: Extrato de compostos fenólicos solúveis em hexano (lipossolúveis)
EE: Extrato em solvente hidroetanólico
ES: Processo de extração sequencial de compostos fenólicos
EU: Processo de extração única (apenas um solvente) de compostos fenólicos
FAO: Organização das Nações Unidas para agricultura e alimentação
Fe: Espécie mineral ferro
Fe2+:
Íon ferroso
FL: Flavonoides
FOS: Fruto-oligossacarídeo
HDL: Lipoproteína de alta densidade
H2O2: Radical peróxido de hidrogênio
HO2•: Radical hidroperóxido
HOCl: Radical ácido hipocloroso
xxiv
IAL Instituto Adolfo Lutz
IC50: Concentração mínima da substancia antioxidante necessária para reduzir em 50% a
concentração inicial do DPPH.
LDL: lipoproteína de baixa densidade
Mn: Espécie mineral manganês
MOS: Malto-oligossacarídeo
NO•: Radical óxido nitroso
NO2•: Radical dióxido de nitrogênio
O2•-: Radical
superóxido
OH•: Radical hidroxila
OND: Oligossacarídeos não digeríveis
OONO-: Radical peroxinitrito
ORAC: Capacidade de Absorção de Oxigênio Radical
pH: Potencial Hidrogeniônico
RNOS: Espécies reativas de nitrogênio
ROS: Espécies reativas de oxigênio
RS•: Radicais derivados de tióis
SK: Shaker
SST: Sólidos solúveis totais
TC: Taninos condensados
TE: Trolox
TEAC – Capacidade antioxidante equivalente ao Trolox
TROLOX – 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-acido carboxilico
US: Ultrassom
UT: Ultra-Turrax
USDA:United States Departament of Agriculture
1
1. INTRODUÇÃO
A comprovação de que dietas ricas em frutas contribuem na prevenção de doenças
como as cardiovasculares e os cânceres tem se tornado mais expressiva em estudos
científicos, despertando o interesse pela identificação de novas fontes de origem vegetal
com compostos bioativos com efeitos benéficos para aumento do consumo das frutas.
O Brasil, após a China e a Índia, se encontra entre os maiores produtores mundiais
de frutas. Ocupando a terceira posição no rancking, possui produção anual de mais de 41
milhões de toneladas, representando quase 5,7% da produção mundial (ANDRADE, 2010).
Dentre as frutas tropicais mais produzidas nacionalmente se destaca a goiaba da
variedade Paluma (GOUVEIA et al., 2004; ARSHIYA, 2013) da espécie Psidium guajava
L. (PEREIRA et al., 2005), que além de ser consumida na sua forma in natura apresenta
uma gama de aplicações na indústria alimentícia, podendo ser encontrada na forma
desidratada, servir de base para o preparo de polpa, geleia, xaropes, doces, bebidas,
sorvetes entre outras aplicações.
A goiaba apresenta excelente valor nutricional, sendo fonte de vitaminas C, A, E, do
complexo B (ácido pantotênico e niacina) (PEREIRA, 2009), de minerais como cálcio,
fósforo e ferro (TEIXEIRA et al., 2006; ROBERTO, 2012; ARSHIYA, 2013), e compostos
bioativos relacionados à prevenção de doenças como carotenoides entre eles licopeno e
compostos fenólicos, tais como taninos, flavonoides, óleos essenciais, álcoois
sesquiterpenoides e ácidos triterpenoides (NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010;
BARBALHO et al., 2012).
Do processamento da goiaba há a geração de um alto volume de resíduos,
conhecidos como subproduto, o qual é constituído basicamente por sementes, bagaços e
cascas (MANTOVANI et al., 2004; SOUSA, 2009). Esses subprodutos quando destinados
de forma inadequada contribuem com problemas ambientais globais tais como
contaminação do solo, do ar e dos recursos hídricos superficiais e subterrâneos.
Assim, como a fruta in natura, os subprodutos apresentam em sua composição
vitaminas, minerais, fibras e compostos bioativos como antioxidantes, podendo assim ser
utilizados para a suplementação na alimentação humana (SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011).
No entanto, os estudos sobre os compostos com propriedades funcionais presentes nos
subprodutos do processamento da goiaba ainda são limitados, sendo o maior foco nos
2
compostos com capacidade antioxidante (MELO, 2010; NASCIMENTO, 2010; SOUSA;
VIEIRA; LIMA, 2011; MARTÍNEZ et al., 2012).
Outro composto bioativo enfatizado em estudos científicos são os oligossacarídeos.
Encontrados nas plantas, atua como açúcares de reserva em sementes e tubérculos, sendo
utilizados durante o crescimento das plantas (VERNAZZA; RABIU; GIBSON, 2006).
Os oligossacarídeos são compostos de cadeia relativamente pequena com baixo grau
de polimerização (DP 2 a 10) (ROBERFROID; SLAVIN, 2000), que por apresentarem em
sua estrutura ligações do tipo β presentes nos carbonos anoméricos (C1 ou C2) entre seus
monossacarídeos não podem ser clivados pelas enzimas digestivas humanas (MARTIN;
BURKERT, 2009), sendo, portanto, fermentados pela microflora presente no intestino
grosso, refletindo em benefícios à saúde humana.
Desse modo, este composto bioativo não digerível tem sido aplicado na produção de
alimentos, cosméticos, e produtos farmacêuticos (MUSSATTO; MANCILHA, 2007)
devido às funcionalidades atribuídas a ele como efeitos bifidogênicos, redução do risco de
osteoporose, aumento da absorção de minerais, prevenção de aterosclerose por meio da
redução da síntese de triglicerídeos e redução das concentrações plasmáticas de colesterol
(JOVANOVIC-MALINOVSKA, KUZMANOVA, WINKELHAUSEN, 2014).
Apesar de existir pesquisas que identificaram e quantificaram oligossacarídeos em
alguns alimentos de origem vegetal, poucos estudos são encontrados em frutas e,
principalmente, em seus subprodutos, sendo a goiaba uma delas.
Assim, verifica-se a importância de mais estudos que envolvam frutas a fim de
despertar o interesse pelo maior consumo destas, visto o papel que representam na dieta
humana e, também a necessidade de investigações científicas e tecnológicas mais profundas
que possibilitem a utilização dos seus subprodutos agroindustriais como fontes de extração
de fitoquímicos ou aplicação em produção de alimentos de forma eficiente, econômica e
segura.
3
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Fornecer novos dados sobre o subproduto obtido do processamento de goiaba
vermelha da variedade Paluma e sobre sua importância na aplicação de produtos
alimentícios.
2.2. Objetivos específicos
Quantificar os compostos fenólicos, flavonoides e taninos condensados por dois
métodos de extração – único solvente e extração sequencial (fracionado), determinando
o método mais eficiente;
Avaliar a capacidade de sequestrar radicais livres dos extratos do subproduto do
processamento da goiaba e da fruta in natura por três ensaios – DPPH, ABTS e ORAC;
Identificar e quantificar, com auxílio de padrões analíticos, os oligossacarídeos
presentes no subproduto da goiaba vermelha bem como na fruta in natura para fins
comparativos, por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), em coluna de troca
iônica;
Realizar a extração de oligossacarídeos por três métodos de mecanismo (shaker,
ultrassom e ultra-turrax), a fim de se avaliar o efeito sobre a extração de
oligossacarídeos nas amostras;
Mostrar que o subproduto do processamento da goiaba vermelha, assim como a fruta,
pode apresentar um conteúdo de compostos bioativos significativo, podendo ser
aplicado como ingrediente funcional.
4
5
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. Goiaba
Com origem na América tropical, possivelmente entre o México e o Peru
(NASCIMENTO, 2010), a goiaba (Psidium guajava L.), pertencente à família Myrtaceae
(PEREIRA et al., 2005; SANTOS, 2011), abrange mais de 130 gêneros e 3600 espécies
difundidas principalmente nos trópicos e subtrópicos (HAIDA et al., 2011).
A goiabeira é uma árvore de médio porte (cerca de 10 metros de altura)
(GUTÍERREZ; MITCHELL; SOLIS, 2008). O fruto é uma baga, que consiste de casca,
polpa carnuda e sementes pequenas, brancas e duras distribuídas desuniformemente na
região central da polpa (JIMÉNEZ-ESCRIG, 2001; ARSHIYA, 2013). Comumente possui
5 centímetros de diâmetro (GUTIÉRREZ; MITCHELL; SOLIS, 2008) e de 4 a 12
centímetros de comprimento, sendo o seu formato redondo ou oval. O fruto apresenta
aroma peculiar semelhante à casca de limão, porém menos acentuado. A polpa com sabor
de doce a azedo apresenta coloração de quase branca à rosa escuro/vermelha, já a casca
apresenta sabor de amargo a doce e textura áspera (ARSHIYA, 2013).
A produção mundial da goiaba gira em torno de 500 mil toneladas por ano (MELO,
2010), com grande distribuição e importância no comércio internacional e na economia
interna de mais de 50 países das áreas tropicais e subtropicais (SENA, 2008), sendo
produzida, principalmente, em países da América Latina destacando-se o Brasil, a
Colômbia, o México e a Venezuela (MELO, 2010).
Sua importância se deve mais a fatores como bom valor nutricional, boa aceitação
da fruta in natura (UCHÔA, 2007), diversidade na aplicação em produtos alimentícios
(como suco, néctar, polpa, compota, desidratados, xarope e sorvete) (GOUVEIA et al.
2004; ARSHIYA, 2013) e excelente adaptação em climas adversos (UCHOA, 2007).
No Brasil, a goiaba se destaca dentre as frutas tropicais, sendo uma das mais
cultivadas, o que coloca o país na posição de um dos maiores produtores mundiais da fruta
(NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010), ocupando o 4º lugar do rancking, seguindo
Índia, Paquistão e México (POMMER; MURAKAMI; WATLINGTON, 2006).
Com plantação concentrada nas regiões Sudeste e Nordeste do Brasil
(NASCIMENTO, 2010), a sua aplicação em produção de polpa congelada para indústrias
6
de suco e produção de doces como sorvetes e geleias tem se intensificado (SENA, 2008). E
devido às condições climáticas e do solo brasileiro serem favoráveis ao cultivo da
goiabeira, além do ótimo valor nutricional, a tendência de melhorar o desenvolvimento da
produção agrícola e, consequentemente, aumentar a produção da fruta, leva a expansão da
atividade industrial e aumento do potencial de exportação (SANTOS, 2011).
A goiaba vermelha da variedade “Paluma” (P. guajava var pomifera) e a branca da
variedade “Kumagai” (P. guajava var pyrifera) (HAIDA et al., 2011; BARBALHO et al.
2012) são as variedades de maior produção e destaque no Brasil, no entanto, por ser mais
nobre e apreciável pelo paladar, além de ter maior utilidade na aplicação de alimentos, a
goiaba vermelha tem produção predominante (PEREIRA, 2009).
O volume de produção de goiaba no Brasil é de cerca de 316 mil toneladas plantada
em uma área de aproximadamente 15 mil ha (RAMOS et. al., 2011). O estado de São Paulo
como maior produtor detém cerca de 40% da produção brasileira de goiaba,
correspondendo a 35 mil toneladas por ano da fruta. Nos municípios de Vista Alegre do
Alto, Monte Alto e Taquaritinga, responsáveis pela maior produção da fruta, se concentram
as maiores agroindústrias processadoras de goiaba, onde 70% da produção se destinam à
industrialização (NATALE et al., 2011), pois o processamento da goiaba é uma forma de
agregar valor econômico à fruta, levando a minimização de desperdícios e perdas que
naturalmente ocorrem durante a comercialização da fruta in natura.
O conhecimento das características nutricionais da goiaba ainda é escasso. A goiaba
é uma fruta rica em vitaminas como ácido ascórbico (teor no mínimo quatro vezes superior
ao da laranja) (PEREIRA, 2009), vitamina A, E, do complexo B (ácido pantotênico e
niacina), além de ser fonte de minerais como cálcio, fósforo, e ferro (PEREIRA et al. 2005;
TEIXEIRA et al., 2006; ROBERTO, 2012; ARSHIYA, 2013), selênio, cobre e magnésio
(UCHOA, 2007), e fibras (TEIXEIRA et al., 2006).
A Tabela 1 apresenta a composição centesimal, de minerais e de vitaminas por 100
g de goiaba (TACO-UNICAMP, 2006).
7
Tabela 1. Valores nutricionais por 100 g da parte comestível de goiaba
Nutriente Teor Nutriente Teor
Umidade 85 g Fósforo 15 mg
Proteína 1,1 g Ferro 0,2 mg
Lipídeos 0,4 g Sódio Traço
Carboidrato 13 g Potássio 198 mg
Fibra alimentar 6,2 g Cobre 0,04 mg
Cinzas 0,5 g Zinco 0,1 mg
Magnésio 7 mg Riboflavina Traço
Manganês 0,09 mg Piridoxina 0,03 mg
Fonte: TACO-UNICAMP, 2006.
O consumo da fruta, principalmente em sua forma in natura, é indicado em dietas
por possuir baixo teor de açúcar e gordura. E devido os seus nutrientes e compostos
bioativos, a goiaba traz benefícios à saúde humana, sendo o carotenoide licopeno (goiaba
vermelha) o composto de maior interesse, visto que está relacionado à prevenção de
diversos tipos de câncer (UCHOA, 2007), principalmente o de próstata bem como de
doenças cardiovasculares (PEREIRA, 2009).
Além dos carotenoides outros compostos fitoquímicos contribuem com a ação
benéfica à saúde do consumo da goiaba. A fruta é rica em compostos fenólicos, tais como
taninos, flavonoides, óleos essenciais, álcoois sesquiterpenoides e ácidos triterpenoides, os
quais por suas propriedades antioxidantes estão relacionados à prevenção de doenças
crônicas degenerativas não transmissíveis (NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010;
BARBALHO et al., 2012).
E é devido à presença desses compostos bioativos que o consumo regular de goiaba
está relacionado a tratamentos de várias doenças e sintomas tais como disenteria, diarreia,
cólicas, enterite, infecções amebianas, arritmias e algumas doenças cardíacas, infecções de
ouvido e olho, gota, malária, úlcera, depressão, tosse, hipertensão, ansiedade, convulsões e
dores menstruais (KUMAR, 2012).
No entanto, parte dos compostos responsáveis por tais benefícios à saúde humana
não são aproveitados por serem descartados durante o processamento industrial da goiaba.
8
3.1.1. Subprodutos agroindustriais do processamento da goiaba
O crescimento populacional bem como a concentração da população em centros
urbanos tem refletido no aumento da demanda por alimentos (NATALE et al., 2011).
Consequentemente, as atividades agroindustriais têm se intensificado, levando a um
aumento da geração de resíduos agroindustriais (MENDES, 2013).
O termo resíduo, no âmbito alimentício, pode ser definido como qualquer
componente não considerado produto ou matéria-prima dentro da especificação oriundo do
processamento de matérias-primas na agroindústria (SANTOS, 2011).
De acordo com as características físico-químicas, os resíduos alimentícios são
classificados como resíduos sólidos molhados e orgânicos, respectivamente, podendo ser de
origem domiciliar, industrial e agrícola. A norma NBR 10.004 - Resíduos Sólidos (2004),
redigida pela ABNT (Associação Brasileira de Normas Técnicas), também classifica os
resíduos em três classes distintas: classe I - perigosos, classe II – não inertes e classe III –
inertes, sendo os resíduos de alimentos enquadrados na classe II por não oferecerem
periculosidade, apesar de não serem inertes, pois podem apresentar propriedades como
biodegradabilidade ou solubilidade em água (KRAEMER, 2005).
Grande parte dos resíduos gerado em indústrias, comércio e domicílios é
direcionada para aterros sanitários (NATALE et al., 2011). Estes resíduos frequentemente
são caracterizados como poluidores ambientais, podendo o seu mau gerenciamento e
direcionamento implicar na gravidade de problemas ambientais (SOUSA, 2009), por serem
fontes de contaminação do solo, do ar e dos mananciais hídricos superficiais e subterrâneas
(KRAEMER, 2005). Contudo, os resíduos possuem em suas composições importantes
nutrientes que são depreciados durante o descarte, refletindo na perda de biomassa e de
nutrientes (SOUSA, 2009).
Os estabelecimentos geradores de resíduos são obrigados a realizar o
gerenciamento, o transporte, o tratamento e a destinação final adequada dos mesmos. Nesse
contexto, a busca por ações de controle e soluções como reaproveitamento dos resíduos
como subprodutos a fim de reduzir os possíveis impactos ao ambiente e aproveitar as
propriedades tecnológicas, nutricionais e funcionais destes resíduos tem se intensificado
(KRAEMER, 2005).
9
O reaproveitamento dos subprodutos agroindustriais, além de favorecer o meio
ambiente, beneficia as indústrias processadoras por reduzir o volume total de resíduos,
minimizar os gastos operacionais e gerar, possivelmente, uma nova formulação alimentar
para indústria (SANTOS, 2011) e pode agregar valor a algum produto da indústria
(ROBERTO, 2012), sendo uma excelente alternativa para as indústrias alimentícias.
O Brasil é um dos países que mais produz subprodutos agroindustriais. No
processamento das frutas, sementes, parte da fração da pele/casca e da polpa oriundos do
despolpamento ou de outras etapas físicas são descartados (NASCIMENTO; ARAÚJO;
MELO, 2010). Estudos comprovam que a maior parte dos nutrientes se concentram nas
cascas e sementes das frutas (SOUSA et al., 2011), os quais poderiam ser aplicados para o
desenvolvimento de novos produtos alimentícios como biscoitos, bolos e barras de cereais
(SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011). Contudo, os componentes presentes nas frutas e suas
propriedades devem ser melhores estudadas para que haja o aproveitamento adequado do
subproduto (SANTOS, 2011).
No caso da goiaba utilizada na indústria processadora, após as etapas de
despolpamento e de lavagem com água clorada, o subproduto gerado é composto por uma
mistura constituída por sementes, principalmente, bagaços e cascas, na proporção de 4 a
12% da massa total dos frutos (MANTOVANI et al., 2004; SOUSA, 2009). A etapa de
corte também gera os subprodutos cascas e sementes (SANTOS, 2011). Estima-se que de
cerca de 202 mil toneladas por ano de goiaba processadas, 6% corresponde a sementes, o
que representa, aproximadamente, 12 mil toneladas de subprodutos por ano (SANTOS,
2011).
Assim como a goiaba in natura, o subproduto da goiaba apresenta composição
química com vários nutrientes – 8,6-10,90% de proteína bruta, 43,44 – 61,25% fibra bruta e
48,81 – 81,95% de fibra detergente neutro (LIRA et al., 2011).
O subproduto da goiaba é considerado um resíduo com alto índice de fibra
alimentar e fibra bruta. Uchoa et al. (2008) analisando bagaço de goiaba (sementes e
cascas), transformados em pós alimentícios, encontraram 39,56% de fibra bruta total e
24,46% de fibra alimentar, representando 61,83% da fibra bruta total do subproduto de
goiaba, o que permite considerar o bagaço de goiaba como um alimento de elevado teor de
fibra alimentar, visto que de acordo com a Portaria nº27, de 13 de janeiro de 1998
10
(BRASIL, 1998) para um alimento ser considerado com alto teor de fibras deve possuir no
mínimo 6 g de fibra por 100 g de produto pronto.
Além de fibras, o subproduto de goiaba também contém minerais que contribui com
sua utilização. Fernandes et al. (2002) analisando subproduto da goiaba determinou 17, 2 e
3 g.kg-1
de N, P e K, respectivamente (MANTOVANI et al., 2004).
A Tabela 2 mostra algumas aplicações medicinais que se encontram associadas às
folhas, cascas e sementes da goiaba. A explicação para as propriedades citadas se deve a
presença significativa de fitoquímicos com potencial antioxidante como os compostos
fenólicos não só na polpa da goiaba como nas folhas, cascas e sementes da fruta (MELO,
2010). Sousa, Vieira e Lima (2011) encontraram no subproduto da goiaba teores fenólicos
igual a 46,77 e 24,63 mg.100 g-1
, expressos em ácido gálico, em extrato hidroalcoólico e
aquoso, respectivamente.
Segundo Naczk e Shahidi (2004) a eficiência da extração dos compostos fenólicos
nos vegetais depende de alguns fatores como natureza química dos fitoquímicos e
solventes; o método de extração utilizado e solvente; o tamanho da amostra de partícula; o
tempo e as condições de armazenamento; e a presença de substâncias interferentes. Além
disso, os fenólicos podem ser encontrados complexados com hidratos de carbono, proteínas
e outros nutrientes presentes nos vegetais ou estar em sua forma insolúvel na matriz.
A solubilidade depende de características dos compostos fenólicos como polaridade
dos polifenóis presentes na amostra, grau de polimerização e interação com outros
constituintes no vegetal (NACZK; SHAHIDI, 2004; NASCIMENTO, 2010). Nascimento,
Araújo e Melo (2010) avaliando a eficiência de extração de fenólicos em subproduto da
goiaba com diferentes solventes – hidroacetônico, hidrometanólico, hidroetanólico e
aquoso – encontraram 5.317,27; 2.176,46; 514,23 e 498,80 mg.100 g-1
, respectivamente.
Certos subprodutos de frutas apresentam teores de compostos fenólicos superiores
ao da polpa (NASCIMENTO, 2010). De acordo com os pesquisadores Hassimotto,
Genovese e Lajolo (2005), na polpa de goiaba vermelha encontram-se cerca de 124
mg.100g-1
de fenólicos, na casca da fruta em torno de 420 mg.100g-1
e nas sementes 250,53
mg.100g-1
. Reforçando a necessidade de utilização dos subprodutos de goiaba na
alimentação humana por apresentarem compostos bioativos com poder antioxidante.
11
Tabela 2. Usos medicinais de subprodutos da goiaba Psidium guajava
Tipo de
resíduo
Ação Referências
Folhas
Tratamentos respiratórios, hipertensão,
obesidade, diabete, antiespasmódico, anti-
inflamatório, sedativo para a tosse,
anticancerígenas
Barbalho et al., 2012
Antibacterial, analgésico, Lozoya et al., 2002
Tratamento de aftas Mailoa et al., 2013
Tratamento de gastroenterite e disenteria Lozoya et al., 2002; Gutiérrez,Mitchell,
Solis, 2008; Barbalho et al., 2012
Tratamento para diarreias Lozoya et al., 2002; Gutiérrez,Mitchell,
Solis, 2008; Barbalho et al., 2012;
Kumar, 2012; Mailoa et al., 2013
Tratamento de dor reumática, úlcera e dor
de dente
Tratamento malária, inflamações nos rins,
dores menstruais, tosses, alergias,
hemorragia uterina
Gutiérrez, Mitchell, Solis, 2008;
Kumar, 2012
Atividade antioxidante Melo, 2010
Cascas
Tratamento de leucorréia, de cólera
asiática e de úlceras externas;
Okamoto, 2010
Atividade antifúngica Gutiérrez ,Mitchell, Solis, 2008;
Richard, Joshua, Philips, 2013
Atividade antibacteriana Rahim et al., 2010, Richard, Joshua,
Philips, 2013
Tratamento de diarréia, distúrbios
gastrointestinais
Gutiérrez, Mitchell, Solis, 2008;
Okamoto, 2010; Barbalho et al., 2012;
Richard, Joshua, Philips, 2013
Dores de dente, resfriados e inchaço Richard, Joshua, Philips, 2013
Problemas respiratórios, hipertensão,
obesidade, diabete, antiespasmódico, anti-
inflamatório, sedativo para a tosse,
anticancerígenas
Cicatrização de feridas
Barbalho et al., 2012
Kumar, 2012
Atividade antioxidante Hassimotto, Genovese, Lajolo, 2005;
Melo et al., 2008; Nascimento, Araújo,
Melo, 2010
Sementes
Tratamentos gastrointestinais, antialérgica,
anticarcinogênico, antiglicêmico
Barbalho et al., 2012
Antimicrobiana Pelegrini et al., 2008; Castro-Vargas et
al., 2010; Barbalho et al., 2012
Atividade antioxidante Guo et al., 2003; Castro-Vargas et al.,
2010; Melo, 2010
12
O teor de carboidratos em subproduto da goiaba (27,98%) (SOUSA et al., 2011)
também é superior ao da polpa (13%) (TACO-UNICAMP, 2006). Dentre os carboidratos
destacam-se os oligossacarídeos, classificados como carboidratos não digeríveis. Estes
compostos glicosídicos formados por poucos resíduos de monossacarídeos (SLAVIN,
2007), além de conferirem propriedades tecnológicas aos alimentos, têm merecido destaque
pela ação prebiótica que permite que sejam aplicados na produção de alimentos, cosmético
e em produtos farmacêuticos (MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
Apesar de existir pesquisas que identificaram e quantificaram oligossacarídeos em
alimentos de origem vegetal como alcachofra, cebola, alho e chicória (VERNAZZA;
RABIU; GIBSON, 2006; MUSSATTO; MANCILHA, 2007), poucos estudos são
encontrados em frutas e nenhum em seus subprodutos, sendo a goiaba uma delas.
Alimentos de origem vegetal fontes de oligossacarídeos não digeríveis (OND) além
de possuírem custo de aquisição mais barato quando comparado com produtos
industrializados, proporcionam a ingestão variada de OND combinados com outros
nutrientes, como fenólicos, vitaminas e minerais (JOVANOVIC-MALINOVSKA;
KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2014).
3.2. Compostos Fenólicos
Devido à funcionalidade dos compostos fenólicos sobre a saúde humana, o interesse
por alimentos de origem vegetal fontes destes compostos tem crescido anualmente.
Os compostos fenólicos são produtos aromáticos do metabolismo secundário dos
vegetais (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006). Por serem sintetizados
durante as fases de desenvolvimento e em condições de estresse (ferimentos, infecções,
radiações UV, injúrias e, entre outros), são essenciais no desenvolvimento e reprodução, na
promoção de ação antipatogênica nas plantas, na produção de pigmentação (NACZK;
SHAHIDI, 2004; ANGELO; JORGE, 2007), na síntese de lignina e na formação de
características sensoriais e nutricionais dos vegetais (SOUSA, 2009).
O termo “fenólico” envolve um grupo de compostos que possui como característica
comum pelo menos um anel aromático e hidroxilas nas formas simples ou de polímeros
como substituintes (MENDONÇA et al., 2003; ANGELO; JORGE, 2007, PRADO, 2009),
sendo derivados de fenilalanina e tirosina (NACZK; SHAHIDI, 2004).
13
Dentro do grupo dos fenólicos encontram-se os compostos fenóis simples, ácidos
fenólicos (benzoico e derivados do ácido cinâmico), flavonoides, taninos hidrolisáveis e
condensados, cumarinas, estilbenos, lignanas e ligninas (NACZK; SHAHIDI, 2004), os
quais se encontram na natureza em pequena ou grande escala, sendo os flavonoides e
derivados e os ácidos fenólicos de grande escala (PRADO, 2009).
Os compostos fenólicos podem ser encontrados na forma livre ou conjugada, sendo
a maior parte conjugado com mono e polissacarídeos, ligado a um ou mais dos grupos
fenólicos (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
A síntese dos compostos fenólicos pelas plantas pode ser de duas maneiras: por
ácido chiquímico (participa da biossíntese da maioria dos fenóis vegetais) e por ácido
malônico (Figura 1) (TIVERON, 2010).
Figura 1. Fluxograma das rotas da síntese dos compostos fenólicos. (Fonte: Tiveron, 2010).
14
Os fenólicos fazem parte do complexo grupo de fitoquímicos, com mais de 8.000
estruturas conhecidas que podem ser divididas em várias classes de acordo com o esqueleto
carbônico dos fitoquímicos (MELO et al., 2008). Na Tabela 3 é apresentada a classificação
segundo o esqueleto da cadeia principal dos fenólicos.
Tabela 3. Classificação dos compostos fenólicos segundo o esqueleto principal
Esqueleto básico Classe de compostos
C6
C6-C1
Fenóis simples, benzoquinonas
Ácidos fenólicos
C26-C2 Acetofenonas e ácidos fenilacéticos
C6-C3 Fenilpropanóides: ácidos cinâmicos e compostos análogos,
fenilpropenos, cumarinas, isocumarinas e cromonas
C6-C4 Naftoquinonas
C6-C1-C6 Xantonas, benzofenonas
C6-C2-C6 Estilbenos, antraquinonas
C6-C3-C6 Flavonóides, isoflavonóides e chalconas
(C6-C3)2 Lignanas
(C6-C3-C6)2 Diflavonóides
(C6)n Melaninas vegetais
(C6-C3)n Ligninas
(C6-C1)n Taninos hidrolisáveis
(C6-C3-C6)n Taninos condensados
Fonte: Tiveron, 2010.
As concentrações dos compostos fenólicos nos vegetais variam de acordo com o
gênero, a espécie, a cultivar (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006), as
condições climáticas, a germinação, o estágio de maturação, o processamento, o tipo de
armazenamento (ROCKENBACH et al., 2008; SOUSA, 2009), a complexidade dos
compostos presentes, as metodologias de extração e/ou de quantificação aplicada
(ROCKENBACH et al., 2008), entre outros fatores.
Devido parte dos compostos fenólicos estar presente na forma ligada nas plantas, a
quantificação dessa forma muitas vezes é excluída da análise, resultando num teor de
fenólicos subestimados (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
Além de seu interesse para as plantas, os compostos fenólicos contribuem com as
características sensoriais dos alimentos, conferindo sabores como amargos ou
adstringentes, contribuindo no desenvolvimento da cor e do odor e promovem estabilidade
15
oxidativa do produto alimentício, sendo de grande interesse para os produtores,
processadores e consumidores (NACZK; SHAHIDI, 2004).
Devido à ação antioxidante, os fenólicos cooperam com a redução dos danos
oxidativos celulares originados por espécies reativas de oxigênio e nitrogênio
(NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010), bem como na prevenção de cânceres,
mutações e outras doenças crônicas degenerativas (VIEIRA et al., 2011).
A ação se deve pela capacidade dos compostos fenólicos em transferir hidrogênio
ou elétrons aos radicais, contribuindo com a inibição da oxidação de vários constituintes do
alimento, particularmente de ácidos graxos, bem como na prevenção de certas doenças
(HAIDA et al, 2011).
A relação ação antioxidante e benefícios à saúde humana depende da capacidade de
absorção e metabolismo do composto fenólico que é determinada pela sua estrutura,
incluindo a sua conjugação com outros compostos fenólicos, o grau de
glicosilação/acilação, tamanho molecular e solubilidade. No entanto, a ingestão elevada de
alguns compostos fenólicos pode causar efeitos adversos como carcinogenicidade,
genotoxicidade, toxicidade da tireóide, a interação com os produtos farmacêuticos e
atividade estrogênica (isoflavonas), devendo se ter cuidado com a ingestão em grandes
quantidades (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
Dentre os alimentos de origem vegetal, as frutas, principalmente as que exibem cor
vermelha/azul, são as mais importantes fontes de fenólicos (DEGÁSPARI;
WASZCZYNSKYJ, 2004), sendo de grande importância na saúde humana
(ROCKENBACH et al., 2008).
O perfil dos compostos fenólicos se diferencia pela parte da fruta. A goiaba
apresenta em sua composição flavonoides (miricetina, apigenina, antocianina, quercetina,
canferol) (THAIPONG et al., 2006; PRADO, 2009), ácido elágico (THAIPONG et al.,
2006), taninos, óleos essenciais, álcoois sesquiterpenoides, e ácidos triterpenoides
(NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010).
Os antioxidantes presentes na goiaba possuem ação primária (PRADO, 2009), ou
seja, são capazes de transferir elétrons ou hidrogênio aos radicais livres, interrompendo a
reação em cadeia (ANGELO e JORGE, 2007).
16
Tanto a polpa quanto a casca da goiaba possuem teores significativos de compostos
fenólicos com efeito antioxidante comprovado (PRADO, 2009). Estudos mostram a
presença de compostos fenólicos totais nos subprodutos agroindustriais do processamento
da goiaba bem como sua atividade antioxidante. Extratos de sementes de goiaba exibiram
efeitos anticâncer, antimicrobiano, gastrointestinais e antiglicêmico devido à presença de
glicosídeos fenólicos (BARBALHO et al., 2012).
As camadas externas dos vegetais podem possuir maiores teores de compostos
fenólicos do que as partes internas (NACZK; SHAHIDI, 2004) como afirmado por estudos
que verificaram que as cascas de certos frutos exibem maior teor de fenólicos do que a
polpa, sendo também nas sementes encontrado maior nível destes compostos
(NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010; HUBER et al., 2012).
Nascimento, Araújo e Melo (2010) analisando as partes da goiaba vermelha
verificaram teor maior na casca (420 mg.100g -1
), em seguida na semente (250,53 mg.100g-
1) e, por fim, na polpa (124 mg.100g
-1). O que direciona maior atenção para os subprodutos
agroindustriais das frutas, os quais podem ser utilizados como fonte de compostos fenólicos
para benefícios à saúde humana (SOUSA, 2009).
De modo geral, os compostos fenólicos podem ser extraídos de suas matrizes por
meio de vários métodos, sendo os solventes mais utilizados na determinação de compostos
fenólicos metanol, etanol, acetona, propanol, acetato de etila e dimetilformamida, podendo
ser na sua forma pura ou em diferentes concentrações na água. A polaridade do solvente
influencia na solubilidade do composto e, consequentemente, na sua recuperação. Os
procedimentos de extração podem variar, também, as condições de extração como
temperatura e tempo utilizados, o que pode, também, influenciar na quantificação precisa
do teor e capacidade antioxidante do composto, bem como no tipo de composto fenólico
extraído, sendo essa diversidade de método de extração um fator que dificulta a
comparação de resultados obtidos com relatos na literatura (ALOTHMAN; BHAT;
KARIM, 2009).
Dentre os grupos de fenólicos presentes em plantas destacam-se os flavonoides
(NASCIMENTO, 2010) e os taninos (BATTESTIN; MATSUDA; MACEDO, 2008)
devido a sua larga distribuição na natureza (BATTESTIN; MATSUDA; MACEDO, 2008;
NASCIMENTO, 2010).
17
3.2.1. Flavonoides
Os flavonoides representam o maior grupo dos compostos fenólicos de plantas
(ROCKENBACH et al., 2008), estando presentes, principalmente, nas frutas, folhas,
sementes e em outras partes da planta (NASCIMENTO, 2010).
Responsáveis pelo crescimento, desenvolvimento, aumento da resistência das
plantas a condições adversas e proteção contra herbívoros e patógenos (PRADO, 2009), os
flavonoides também apresentam funcionalidade na saúde humana, estando envolvidos em
ações como prevenção de alergias, hipertensão, viroses, inflamações, artrites, mutações e
carcinogênese, câncer (ROCKENBACH, 2008), antifibrótica, anticoagulante,
antibacteriana, anti-hipertensiva e doenças cardiovasculares (HUBER; RODRIGUEZ-
AMAYA, 2008), antidiabéticos, antienvelhecimento, prevenção e tratamento de catarata,
úlcera, asma e outras alergias além de possuírem atividade antioxidante e aumentarem o
efeito antioxidante de vitaminas (SHOHAIB et al., 2011).
Oriundos da junção de derivados sintetizados a partir da fenilalanina (via metabólica
do ácido chiquímico) e ácido acético (HUBER; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008), os
flavonoides são constituídos por 15 átomos de carbono arranjados em uma configuração
C6-C3-C6, resultando em uma estrutura de baixo peso molecular (ROCKENBACH et al.,
2008).
Presentes na forma de glicosídeos ou agliconas (ANGELO; JORGE, 2007), a
estrutura química dos flavonoides consiste em dois anéis aromáticos - anel A e B, unidos
por três carbonos que formam um anel heterocíclico, denominado anel C (ANGELO;
JORGE, 2007; PRADO, 2009), no caso dos flavonóis e antocianidinas, por exemplo, ou
formam uma pirona como nos flavonóis, flavonas, isoflavonas e flavanonas, que possuem
um grupo carbonila na posição C-4 do anel C, compreendendo as principais classes dos
flavonoides (Figura 2). O anel aromático A é oriundo do ciclo acetato/malonato, já o anel B
é oriundo da fenilalanina (ANGELO; JORGE, 2007; ROCKENBACH et al., 2008) por
meio da via metabólica do shikimato (ROCKENBACH et al., 2008).
18
Figura 2. (A) Estrutura básica dos flavonoides e (B) Estrutura básica dos flavonoides com grupo carbonila no
C-4. (Fonte: Huber & Rodriguez-Amaya, 2008).
Os subgrupos de flavonoides resultam de acordo com a substituição do anel C
padrão, sendo eles: flavonóis (quercetina, miricetina, por exemplo), flavonas (apigenina,
luteolina, por exemplo), flavanonas (naringenina, hesperitina, por exemplo), catequinas
(epicatequina, galocatequina, por exemplo), isoflavonas (genisteina, daidzeina, por
exemplo) e antocianinas (cianina, pelargonina, por exemplo) (ANGELO; JORGE, 2007;
HOFFMANN-RIBANI; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008) (Figura 3). Os glicosídeos de
quercetina pertencentes ao grupo flavonóis são os mais abundantes na natureza (PRADO,
2009) e com o maior poder sequestrador de espécies reativas de oxigênio, atribuído pela
presença do grupo catecol no anel B e do grupo hidroxila na posição 3 do anel C (HUBER;
RODRIGUEZ-AMAYA, 2008).
E é devido as diferentes estruturas químicas e dos vários substituintes da molécula,
que a capacidade antioxidante é variável, visto que a estrutura básica pode sofrer uma série
de modificações, como glicosilação, esterificação, amidação, hidroxilação, entre outras
alterações que modularão a polaridade, toxicidade e direcionamento intracelular destes
flavonoides (HUBER; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008).
Na dieta humana os flavonoides mais consumidos são os glicosilados, os quais são
classificados em antocianinas, flavanóis, flavonas, flavanonas, e flavonóis (Figura 4)
(ROCKENBACH et al., 2008), sendo distribuídos de forma variada nos alimentos (Tabela
4) (PRADO, 2009). No entanto, as informações sobre a composição de flavonóis e flavonas
em alimentos ainda são escassas em âmbito mundial.
19
Figura 3. Principais classes dos flavonoides. (Fonte: Huber & Rodriguez-Amaya, 2008).
Figura 4. Estrutura genérica das maiores classes dos flavonoides. (Fonte: Balasundram, Sundram e Samman,
2006).
20
Tabela 4. Fontes de alguns flavonoides presentes em vegetais
Classes Nome Fonte
Flavonóis
Epicatequina
Catequina
Epigalocatequina
Epicatequina galato
Epigalocatequina galato
Chás verde e preto, uvas, vinho tinto
Flavanonas Naringina
Taxofolina
Cascas de frutas cítricas
Frutas cítricas
Flavonóis Canferol
Quercetina
Mirecetina
Brócolis, chá preto, alho-poró, rabanete
Cebola, alface, casca de maçã, cerejas,
brócolis, vinho tinto
Uvas, vinho
Antocianidinas Malvidina
Cianidina
Apigenidina
Uvas roxas, vinho tinto
Morangos, uvas, cerejas
Frutas e casca de frutas coloridas
Fonte: Rice-Evans, Miller, Paganda (1996).
Nos alimentos os subgrupos de flavonoides mais analisados são os flavonóis
miricetina, quercetina e kaempferol e as flavonas apigenina e luteolina. Em goiaba branca
encontra-se em média 12 μg.g-1
de parte comestível de quercetina e 10 μg.g-1
em goiaba
vermelha (HUBER; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008).
Em subprodutos agroindustriais do processamento de goiaba foram encontrados
teores de flavonoides com efeitos antioxidantes evidenciados. Extratos de casca de goiaba
foram investigados em estudos para redução de índices glicêmicos e tratamento de malária,
apresentando efeitos positivos (BARBALHO et al., 2012).
O consumo de flavonoides no Brasil é maior que em outros países. Estudos
mostram que mulheres brasileiras consomem em média 70,5 mg.dia-1
de flavonoides, sendo
que 68% desse consumo vem da ingestão de laranja, 12% dos vegetais (como alface) e
2,5% de tomate; mulheres do Japão em média consomem diariamente 16,7 mg.dia-1
de
flavonóis e flavonas, sendo 46% provenientes da cebola e 47,2 mg.dia-1
de isoflavonas
(37% de tofu); já o consumo de flavonoides pela população holandesa é estimada em torno
de 23 mg.dia-1
, onde 48% do total de ingestão é proveniente de chá, seguido de 29% de
cebola e 7% de maçã (HASSIMOTTO; GENOVESE; LAJOLO, 2005).
21
A extração dos flavonoides de plantas normalmente é realizada simultaneamente
com a hidrólise das formas glicosídicas a agliconas (HUBER; RODRIGUEZ-AMAYA,
2008), sendo os solventes mais utilizados metanol, etanol, água ou a sua combinação, que
em alguns casos são acidificados (NACZK; SHAHIDI, 2004).
Para a determinação de flavonoides nas frutas podem ser usados ensaios
colorimétricos. O princípio consiste na reação de cloreto de alumínio (AlCl3) e nitrito de
sódio (NaNO2) com formação de um complexo flavonoide-alumínio, ao alcalinizar o meio
com hidróxido de sódio (NaOH), o complexo adquire coloração rosa, cuja intensidade da
absorção é medida no comprimento de onda igual a 510 nm (JIA; TANG; WU, 1999),
sendo um método que permite que não haja interferência de outras classes de compostos
fenólicos, principalmente dos ácidos fenólicos (JANOVIK et al., 2009).
3.2.2. Taninos
Os taninos são polímeros fenólicos solúveis em água e solventes orgânicos
amplamente distribuídos no reino vegetal, podendo ser encontrado de forma variada (teor e
tipo) nas raízes, no lenho, na casca, nas folhas, nos frutos, nas sementes e na seiva das
plantas (BATTESTIN; MATSUDA; MACEDO, 2008).
De peso molecular relativamente alto são classificados em taninos hidrolisáveis e
taninos condensados de acordo com a estrutura química (ANGELO e JORGE, 2007).
Os taninos hidrolisáveis (Figura 5), presentes na família Choripetalae das
dicotiledôneas (CASTEJON, 2011), são formados por ésteres complexos, consistindo em
uma cadeia de carboidrato central, normalmente a D-glicose, na qual duas ou mais
hidroxilas são esterificadas com ácido gálico ou ácido hexa-hidroxidifênico (OLIVEIRA;
BERCHIELLI, 2007).
Presentes normalmente em baixa concentração nas plantas, os taninos hidrolisáveis
no metabolismo microbiano e na digestão gástrica são convertidos em metabólitos de baixo
peso molecular, sendo alguns desses metabólitos tóxicos e associados a hemorragias gastro-
entéricas e necrose do fígado e rins, principalmente em monogástricos (BEELEN;
PEREIRA FILHO; BELEN, 2008).
22
Figura 5. Estrutura de um tanino hidrolisável. (Fonte: Battestin, Matsuda e Macedo, 2008).
Os taninos condensados (Figura 6) são mais comuns na dieta humana do que os
taninos hidrolisáveis, em concentrações relativamente importantes em alguns frutos tais
como uvas e maçãs, no cacau e chocolate. (CASTEJON, 2011). Amplamente distribuídos
nas folhas, flores, frutos e raízes de plantas de grande porte são oriundos da polimerização
de flavonoides como flavan-3-ol (catequina) e flavan-3,4-diol (leucoantocianinas) e por
conferir um conjunto de nuances rosa, vermelha, violeta e azul às plantas (BATTESTIN;
MATSUDA; MACEDO, 2008) como as antocianidinas também recebe o nome de
proantocianidinas (MARTINS, 2012).
Figura 6. Estrutura de um tanino condensado. (Fonte: Martins, 2012).
23
O tanino condensado mais amplamente distribuído nos tecidos da planta são as
procianidinas, derivadas de catequina ou epicatequina, podendo conter ésteres de ácido
gálico (SULAIMAN et al., 2011).
Além de pigmentação, os taninos condensados estão envolvidos no fornecimento de
adstringência de frutas, sucos e vinhos (BATTESTIN; MATSUDA; MACEDO, 2008). A
sensação de adstringência aparentemente é resultante da interação entre os constituintes de
tanino e proteínas da saliva e/ou o tecido da mucosa da boca (AMAROWICZ, 2007).
A reatividade dos taninos condensados com moléculas de importância biológica tem
consequências nutricionais e fisiológicas importantes (SULAIMAN et al., 2011).
Devido à sua elevada afinidade por ligações com polímeros como a celulose,
hemicelulose e pectina, minerais e, principalmente, proteínas, com formação de complexos
insolúveis difíceis de serem digeridos, os taninos estão associados a efeitos antinutricionais
(AMAROWICZ, 2007; OLIVEIRA; BERCHIELLI, 2007).
Por outro lado, os taninos têm sido considerados "componentes que promovem a
saúde" devido a efeitos funcionais assim como os flavonoides e outros compostos
fenólicos. A atividade biológica dos taninos condensados pode estar associada à presença
do ácido gálico em sua cadeia (OLIVEIRA; BERCHIELLI, 2007). Dentre os benefícios
encontram-se anticancerígenas, antimutagênicas, antimicrobianas, antioxidantes
(AMAROWICZ, 2007), antialérgico, redução de risco de doenças cardiovasculares, úlceras
(ZHANG et al., 2010) e pressão arterial, anti-inflamatório, anti-helmíntico (TIAN et al.,
2012). No entanto, os efeitos dependem do tipo de tanino ingerido, da dose e período de
ingestão (CASTEJON, 2011).
Pesquisas já comprovaram a eficiência de tanino contido nas folhas de goiaba como
antibacterianos (MAILOA et al., 2013), os quais apresentam potencial antioxidante (SEO et
al., 2014). No entanto, há uma escassez de pesquisa em goiaba e, principalmente, em
subproduto agroindustrial, gerando mais em torno da folha da planta.
O método de vanilina (Figura 7) é um dos métodos colorimétricos mais utilizados
na determinação de taninos condensados em alimentos. O princípio da reação baseia-se na
formação de um complexo em meio ácido com coloração em tons de vermelho que por
espectrofotometria permite ser lido (JANOVIK et al., 2009).
24
Figura 7. Reação da vanilina com o tanino condensado. (Fonte: Martins, 2012).
O ensaio é específico para flavan-3-ols, di-hidrochalconas e proantocianinas que
possuem uma ligação simples na posição 2-3 e uma hidroxila livre na posição meta do anel
B (ANGELO; JORGE, 2007).
3.3. Atividade antioxidante
Antioxidante é o nome fornecido a compostos que mesmo presentes em baixas
concentrações apresentam a capacidade de intervir na iniciação ou propagação de reações
em cadeia de oxidação que originam compostos tóxicos como cetonas, aldeídos,
hidrocarbonetos e álcoois, retardando, neutralizando ou prevenindo ações de substratos
oxidáveis, (ANDRADE et al., 2007; SILVA; ROCHA; CANNIATTI BRAZACA, 2009),
além de atuar na inibição da peroxidação lipídica e da lipoxigenase (HUBER et al., 2012).
Os radicais oxidativos como espécies reativas de oxigênio (ROS), de cloro, de
carbono e de nitrogênio (NO•), radicais derivados de tióis e complexos metais de transição
são formados nos processos metabólicos como subprodutos acidentais ou produtos
principais de reações enzimáticas ou não enzimáticas (HAIDA et al., 2011; SOUSA;
VIEIRA; LIMA, 2011), podendo ser de fontes exógenas também (SOUSA; VIEIRA;
LIMA, 2011).
Como espécies reativas de oxigênio (ROS) encontram-se o superóxido (O2•),
peróxido de hidrogênio (H2O2), o ácido hipocloroso (HOCl) e o radical hidroxila (OH•). O
superóxido é gerado a partir da coenzima Co-Q ou de enzimas com metais como citocromo
P450, xantinaoxidase e NADPH-oxidase. O superóxido por ser aceptor de elétrons pode ser
25
reduzido a peróxido de hidrogênio. Já o radical hidroxila é produzido a partir do superóxido
na presença de Fe2+
ou Cu+ por meio da reação de Fenton e/ou a partir de peróxido de
hidrogênio na reação de Haber-Weiss (HAIDA et al., 2011).
As espécies reativas de nitrogênio (RNOS) são representadas pelo composto não
radical peroxinitrito (OONO-) e o radical dióxido de nitrogênio, gerados na reação do
radical livre óxido nitroso (NO) com o O2 ou com o superóxido (O2•-), além de estarem
presentes naturalmente no meio ambiente (fumaça de cigarro e radiação ultravioleta, por
exemplo) e poderem ser formados na célula (HAIDA et al., 2011).
Esses radicais quando em excesso podem ocasionar danos celulares, contribuindo
com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares, neurológicas, alguns tipos de câncer
(SOUSA; VIEIRA; LIMA; 2011), reumatismo, catarata (PRADO, 2009), arterosclerose,
artrite, diabetes e processos de envelhecimento do corpo (SOUSA, 2009).
De modo geral, a ação dos radicais livres se deve a presença de um elétron isolado
livre o qual pode se ligar a qualquer outro elétron de uma molécula e, assim, reagir com
lipídeos das membranas celulares, nucleotídeos do DNA e ligações sulfidril em proteínas
(PRADO, 2009).
Os antioxidantes podem ser classificados em sintéticos e naturais (PRADO, 2009;
NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010). Apesar dos antioxidantes sintéticos possuírem
maior estabilidade e terem uma boa eficiência, a busca por novas fontes naturais de
antioxidantes está mais intensa, visto que o uso de sintéticos está relacionado a reações
adversas às enzimas do sistema biológico humano (PRADO, 2009) e a combinação de
antioxidantes naturais apresenta maior efeito em processos de oxidação do que compostos
sintéticos (HUBER et al., 2012).
Dentre os antioxidantes presentes na natureza os compostos fenólicos são os mais
encontrados e que apresentam maior ação antioxidante, sendo muito utilizados em
indústrias alimentícias a fim de prevenir oxidações lipídicas, prevenindo a qualidade
nutricional do alimento e, de promover benefícios à saúde humana reduzindo os danos
provocados por espécies reativas (PRADO, 2009).
Os fenólicos tais como os flavonoides (antocianinas, flavonóis e seus derivados),
ácidos fenólicos (ácidos benzoicos, cinâmico e seus derivados), fenóis simples, cumarinas,
ligninas e tocoferóis (ANGELO; JORGE, 2007) são responsáveis pela desativação de
26
radicais livres como os superperóxidos (O2•), as hidroxilas (OH•), os hidroperóxidos
(HO2•), os óxidos nítricos (NO•), os dióxidos de nitrogênio (NO2•) (BISCARO, 2009),
radicais derivados de tióis (RS•), espécies reativas de cloro, de carbono e complexos de
metais de transição, principalmente Fe, Cu, Mn e Cr (HUBER et al., 2012), sendo as
hidroxilas as mais reativas em lesionar moléculas celulares e os peróxidos responsáveis por
danificar o DNA celular (BISCARO, 2009).
Ao interagir com os radicais, os fenólicos são consumidos durante a reação,
conferindo estabilidade oxidativa ao alimento, sendo seu modo de ação classificado em
primários e secundários. Os antioxidantes de ação primária ao doarem elétrons ou
hidrogênio aos radicais livres atuam na interrupção da cadeia da reação, convertendo-os em
produtos termodinamicamente estáveis (ANGELO; JORGE, 2007), devido à ressonância
do anel aromático presente na estrutura dessas substâncias (HUBER et al., 2012). Já os
antioxidantes secundários retardam a etapa de iniciação da autoxidação, por meio de
mecanismos diferentes, como complexação de metais, sequestro de oxigênio,
decomposição de hidroperóxidos, absorção da radiação ultravioleta ou desativação de
oxigênio singlete, dando origem as espécies não radicais (ANGELO; JORGE, 2007).
Desse modo, o mecanismo de ação dos compostos fenólicos permite a redução da
oxidação lipídica em tecidos, vegetal e animal, contribuindo com a conservação e qualidade
do alimento, além de promover a redução do risco de desenvolvimento de patologias, como
hipertensão, arteriosclerose e câncer (ANGELO; JORGE, 2007).
A ação antioxidante dos compostos fenólicos depende de fatores como absorção e
metabolismo os quais são determinados pela estrutura química (BALASUNDRAM;
SUNDRAM; SAMMAN, 2006; MELO et al., 2008), a conjugação com outros compostos
fenólicos, o grau de glicosilação/acilação, tamanho molecular, solubilidade
(BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006) e concentração deles no alimento
(MELO et al., 2008).
Os fenólicos apresentam em sua estrutura química pelo menos um anel aromático,
unido a uma ou mais hidroxilas (SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011), sendo o número e a
posição dessas hidroxilas na cadeia determinantes para o modo de complexar os radicais
livres e a intensidade da ação antioxidante (MELO et al., 2008; SOUSA; VIEIRA; LIMA,
2011).
27
Os flavonoides atuam eliminando espécies reativas oxidantes, como ânion
superóxido, hidroxilas, e radicais peroxil (HASSIMOTTO; GENOVESE; LAJOLO, 2005)
e sequestrando quelantes de metais capazes de catalisar a peroxidação de lipídeos (HUBER;
RODRIGUEZ-AMAYA, 2008), sendo sua capacidade antioxidante determinada pelas
características estruturais e natureza de substituições nos anéis B e C (BALASUNDRAM;
SUNDRAM; SAMMAN, 2006); o número e a posição dos grupos de hidrogênio e suas
conjugações; e a presença de elétrons nos anéis benzênicos (ROCKENBACH, 2008).
A substituição de grupos hidroxila no anel B dos flavonoides por grupos metoxil
altera o potencial redox, o que modifica a capacidade de capturar os radicais pelos
flavonoides. A presença de uma ligação dupla entre C2 e C3, conjugado com o grupo 4 -
oxo no anel C aumenta a capacidade antioxidante dos flavonoides (BALASUNDRAM;
SUNDRAM; SAMMAN, 2006). Flavonoides com grupos hidroxila nas posições 3, 4 e 5 do
anel B apresentam maior potencial antioxidante do que compostos com apenas um grupo
hidroxila (ROCKENBACH, 2008).
O método colorimétrico Folin Ciocalteau é o mais empregado na quantificação de
compostos fenólicos. O reagente Folin Ciocalteau é formado pela mistura dos ácidos
fosfomolibídico e fosfotúngstico, onde o molibdênio se encontra no estado de oxidação (cor
amarela – Na2MoO4.2H2O). Os compostos fenólicos em meio alcalino sofrem
desprotonação, originando os ânions fenolatos, os quais atuam como agentes redutores
sobre os componentes do reagente de Folin formando o complexo molibdênio-tungstênio
de coloração azul [(PMoW11O4)4-
], permitindo a determinação da concentração das
substâncias redutoras (OLIVEIRA et al., 2009).
Um estudo com chá verde e suco de uva mostrou a capacidade dos flavonoides
antocianinas, delfinidina, cianidina, daidzeína, genisteína, equol, catequina e teaflavina de
impedir a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL). Em geral, esse efeito de
proteção está relacionado com o poder destes compostos de eliminar radicais livres ou
quelar metais. Outro estudo demonstrou a capacidade dos flavonoides de inibir a ação das
enzimas ciclooxigenase-2 e 5-lipoxigenase envolvidas em processos inflamatórios
(HASSIMOTTO; GENOVESE; LAJOLO, 2005).
Os flavonoides catequinas e epicatequinas possuem um alto potencial antioxidante e
de inibir a proliferação celular (SOARES et al., 2008). No entanto, a quercetina é o
28
flavonoide que apresenta o maior poder de sequestrar espécies reativas de oxigênio, devido
à presença do grupo catecol no anel B e do grupo hidroxila na posição 3 do anel C
(HUBER; RODRIGUEZ-AMAYA, 2008).
Estudos demonstraram que a malvidina 3-p-cumarilglucósido-5-glucósido, a
cianidina 3-glucósido e a cianidina presentes em extratos brutos de uvas, groselhas,
framboesas e uva-do-monte apresentam excelente atividade antioxidante, sendo o potencial
da malvidin 3-p-cumarilglucósido-5-glucósido o dobro dos antioxidantes comerciais como
a catequina e o α-tocoferol. A cianidin 3-O-β-D-glucósido e a cianidina em ratos promoveu
uma ação antioxidante na auto-oxidação do ácido linoleico, em lipossomas, na membrana
de eritrócitos e nos sistemas microssomais do fígado (SOARES et al., 2008). Extratos
enriquecidos com antocianina obtidos a partir de amora preta selvagem promoveu aumento
na capacidade antioxidante do plasma em seres humanos, além de inibir o desenvolvimento
de células cancerígenas em pulmão (HASSIMOTTO et. al, 2013).
O potencial antioxidante dos taninos se deve a capacidade de quelar íons de metal
tais como Fe2+
, interferindo em um dos passos de reação na reação de Fenton e assim
retarda a oxidação bem como de inibe a peroxidação lipídica por meio da inibição da ciclo-
oxigenase. No entanto, poucas pesquisas relatam a capacidade antioxidante dos taninos, o
que faz de seus mecanismos de ação para essa finalidade pouco citado (AMAROWICZ,
2007).
Por causa das atividades biológicas dos compostos fenólicos, novas fontes vegetais
naturais estão sendo pesquisadas. Neste contexto, pesquisas com subprodutos
agroindustriais vêm crescendo a fim de se caracterizar os possíveis compostos bioativos
presentes responsáveis por conferir ação antioxidante, como já realizado em subproduto de
carambola, de maracujá, de abacaxi, de acerola e em casca de manga, entre outros
(NASCIMENTO; ARAÚJO; MELO, 2010).
Levando em consideração que a goiaba possui potencial antioxidante primário,
sendo os compostos fenólicos responsáveis por fazer uma varredura nos radicais, inibindo a
iniciação e propagação da reação em cadeia (ARSHIYA, 2013), os subprodutos gerados do
seu processamento também exibem atividade antioxidante, visto que estudos apontam que
sementes e cascas de algumas frutas possuem maior potencial antioxidante do que a polpa
(NASCIMENTO, 2010). Assim, a divulgação do potencial antioxidante dos subprodutos
29
pela realização de ensaios antioxidantes (SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011) e sua utilização
subprodutos para extração de seus compostos antioxidantes naturais até mesmo para
aplicação em produtos alimentícios pode ser uma boa alternativa na prevenção contra
doenças decorrentes de estresse oxidativo se consumida regularmente na dieta humana
(ARSHIYA, 2013).
3.3.1. Métodos de determinação da atividade antioxidante
A determinação da atividade antioxidante permite se conhecer o potencial
antioxidante dos alimentos para efeitos de saúde, se avaliar a proteção contra oxidação e
deterioração que os compostos antioxidantes presentes neles conferem aos alimentos,
contribuindo com a qualidade e o valor nutricional do produto (RIBEIRO, 2011).
Apesar do potencial antioxidante de compostos bioativos não poderem ser medidos
diretamente (PRADO, 2009), existem várias técnicas analíticas (químicas, físicas e/ou
físico-químicas) para determinação da capacidade antioxidante de compostos bioativos
(PEREIRA, 2009), os quais medem o controle da extensão da oxidação proporcionado
pelos compostos (PRADO, 2009).
Devido à diversidade dos métodos com fundamentos variados e interferências, a
comparação dos resultados de atividade antioxidante se torna difícil (PEREIRA, 2009;
PRADO, 2009), sendo o uso de solventes no preparo da amostra também um fator
influenciável na eficiência de extração e resultado da determinação da capacidade
antioxidante da matriz (PEREIRA, 2009). Desse modo, a aplicação de duas ou mais
técnicas de determinação antioxidante é recomendável, visto que nenhum método isolado
permite a obtenção exata do potencial antioxidante de um composto bioativo, assim pode-
se avaliar de modo mais completo a atividade de antioxidante (BRAGA et al., 2010).
Os métodos analíticos utilizados para a determinação da atividade antioxidante in
vitro são muito utilizados em frutas e hortaliças devido à facilidade de aplicação (PRADO,
2009), sendo os métodos ORAC (Capacidade de Absorção de Oxigênio Radical), ABTS
(ácido 2,2-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6-sulfônico) e DPPH ( radical 1,1-difenil-2-
picrilhidrazil) frequentemente utilizados na avaliação da capacidade antioxidante relativa
de diferentes amostras de alimentos (THAIPONG et al., 2006; BRAGA et al., 2010;
30
TIVERON, 2010; RIBEIRO, 2011). Nestes ensaios resultados diferentes entre as espécies
dos vegetais analisadas e laboratórios podem ser obtidos (THAIPONG et al., 2006).
Os métodos DPPH e ABTS são relativamente simples, rápidos e de baixo custo para
se realizarem (PRADO, 2009; TIVERON, 2010). As técnicas se baseiam em reações de
transferência de elétron, em que um composto antioxidante reduz um substrato oxidante por
meio da transferência de elétrons (PAZINATTO, 2008).
O método DPPH, sugerido em meados da década de 50, a priori era utilizado para
descobrir doadores de hidrogênio em produtos naturais e após algumas décadas começou a
ser aplicado na determinação do potencial antioxidante em fenólicos na forma individual ou
em conjunto (TIVERON, 2010) de forma prática, rápida e sensível, sendo muito aplicado
na análise de mecanismos de reação de compostos fenólicos com radicais livres, onde
alguns compostos ao reagir com o DPPH•, reduz um número de moléculas igual ao número
de grupos OH disponíveis, formando as ortoquinonas correspondentes (PAZINATTO,
2008).
O DPPH (2,2-difenil-2-picrilhidrazil) é um radical nitrogênio orgânico estável de
cor violeta intenso com espectro de absorção de UV-Vis máxima em 515 nm em meio
metanólico. Esse radical simula as espécies reativas de oxigênio (ROS) e ao receber um
elétron do agente antioxidante tem seu elétron emparelhado (Figura 8) e sua intensidade de
coloração reduzida até amarela (PAZINATTO, 2008), podendo ser medida a atividade
antioxidante pelo método de espectrofotometria no comprimento de onda 517 nm, onde a
medida que o antioxidante vai inativando os radicais por meio da doação de elétron ocorre
a diminuição da intensidade da coloração violeta (TIVERON, 2010), ou seja, a redução da
absorbância é proporcional a concentração e a atividade antioxidante da amostra
(RIBEIRO, 2011).
Figura 8. Representação esquemática da estrutura química do DPPH e sua redução a radical DPPH•. (Fonte:
Pazinatto, 2008).
31
Entretanto, o ensaio por DPPH apresenta limitações como: apresentar baixíssima
similaridade com a elevada reatividade e transitoriedade dos radicais peroxil envolvidos na
peroxidação lipídica por ser um radical de nitrogênio de vida longa (PAZINATTO, 2008);
não poder ser aplicado em avaliações in vivo pelo fato do pH do meio reacional ser em
torno de 5,5, diferente do pH fisiológico humano; pode interagir com outros radicais como
alquil (RIBEIRO, 2011); proporcionar mensuração não apropriada da atividade
antioxidante, visto que alguns antioxidantes que reagem rapidamente com radicais peróxido
podem reagir vagarosamente ou mesmo serem inertes ao DPPH (PAZINATTO, 2008).
O ABTS (Figura 9) é um método caracterizado pelo sequestro de radicais cátions
ABTS•+
por antioxidantes presentes na reação em longo prazo (PEREIRA, 2009), sendo um
método indireto com boa estabilidade assim como o DPPH (TIVERON, 2010).
Figura 9. Representação esquemática da estrutura química do composto ABTS. (Fonte: Pereira, 2009).
Ao contrário do radical DPPH que já vem pronto, o ABTS•+
necessita ser gerado por
meio de reações químicas com persulfato de potássio e água, dando origem a um composto
de cor azul esverdeada, sendo a solução estocada no escuro a temperatura ambiente por 12–
16 h antes do uso (RIBEIRO, 2011). A leitura se dá por meio da absorbância lida em
espectro de absorção de UV-Vis máxima em 734 nm e, a medida que a captura do radical
vai ocorrendo, há um decréscimo da absorbância, visualizada pela redução da intensidade
da cor do composto (PEREIRA, 2009).
Apresenta a vantagem, em relação ao DPPH, de ser solúvel tanto em solventes
aquosos como em orgânicos, não sendo afetado pela força iônica, assim pode ser aplicado
na determinação da capacidade antioxidante de extratos e fluidos corpóreos, hidrofílicos e
lipofílicos (RIBEIRO, 2011).
32
O método ORAC, diferente do DPPH e ABTS, baseia-se em reações de
transferência de átomos de hidrogênio (PAZINATTO, 2008), sendo mais relevante por
utilizar fonte de radicais que se assemelham mais ao sistema biológico (THAIPONG et al.,
2006).
Na reação do ensaio ORAC participam os seguintes constituintes: radicais
peroxilas; composto AAPH [2,2′-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride] que
promove a geração das peroxilas na reação por meio da sua decomposição espontânea
acima de determinada temperatura; e fluoresceína, que é um marcador fluorescente
fotoestável e termoestável, que tem sua fluorescência reduzida pela peroxila (RIBEIRO,
2011) ao ter sua estrutura química degradada (PEREIRA, 2009).
Os geradores térmicos de radicais levam a fluxos constantes de radicais peroxilas
em soluções saturadas de ar, ocorrendo à competição entre o antioxidante e o oxidante
pelos radicais com inibição ou retardo do substrato oxidante (PAZINATTO, 2008).
O antioxidante ao doar átomos de hidrogênio, inibe a perda da intensidade da
fluorescência, sendo a inibição proporcional à atividade antioxidante. Apesar do padrão
utilizado para construção da curva ser o Trolox, ao contrário do DPPH e ABTS, o
decaimento não segue uma cinética de primeira ordem (linear com o tempo), mas sim de
segunda ordem com o tempo, assim a quantificação é realizada por meio da técnica da área
sob a curva de decréscimo (AUC) (PEREIRA, 2009; RIBEIRO, 2011).
Assim como o ABTS, o ORAC pode ser aplicado para determinação da capacidade
antioxidante de compostos lipofílicos e hidrofílicos. Quando comparado com os demais
métodos, o ORAC apresenta as vantagens de sofrer menos interferências de compostos
coloridos presentes em amostras como frutas e hortaliças por se basear na fluorescência e
não na absorbância, além disso, o ensaio reflete mais as condições reais do sistema
biológico por utilizar radicais peroxilas ou hidroxilas pró-oxidantes (PEREIRA, 2009),
radicais abundantes e os maiores responsáveis pelos danos oxidativos (RIBEIRO, 2011).
O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA, 2007) publicou um
estudo com a capacidade antioxidante de 277 alimentos por meio do método ORAC, sendo
a atividade antioxidante da goiaba vermelha expressa em equivalente de Trolox de 19,90
μmol.g-1
(RIBEIRO, 2011). Thaipong et al. (2006) aplicando três ensaios verificou a
33
atividade antioxidante em quatro cultivares de goiaba, sendo a média de 25,2 (DPPH), 31,1
(ABTS) e 21,3 (ORAC) μmol de Trolox.g-1
.
Os resultados dos ensaios antioxidantes DPPH, ABTS e ORAC podem ser
expressos em TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Activity – Atividade antioxidante
equivalente ao Trolox). Trolox é um composto sintético hidrossolúvel análogo da vitamina
E. As leituras realizadas no comprimento de onda específico para o radical específico
formado pelo ensaio são interpolados em uma curva de calibração e expressas em
capacidade antioxidante equivalente de Trolox (PEREIRA, 2009), que indica o número de
μmoles de Trolox que produz a mesma atividade correspondente a 1 mg de amostra
(RIBEIRO, 2011).
3.4. Oligossacarídeos
Os carboidratos, representantes de um dos grandes grupos de biomoléculas na
natureza, apresentam papéis estruturais e metabólicos de extrema importância ao ser
humano (BENDER; MAYES, 2013), tais como fonte de energia, preservativos de
proteínas, protetores contra corpos cetônicos e combustível para o sistema nervoso central
(PINHEIRO; PORTO; MENEZES, 2005).
Uma das classificações dos carboidratos pode ser de acordo com o número de
monômeros que possuem em sua estrutura química, sendo ela: monossacarídeos,
oligossacarídeos e polissacarídeos (PINHEIRO; PORTO; MENEZES, 2005).
Os monossacarídeos são as unidades mais simples de carboidratos que não podem
ser hidrolisadas em carboidratos mais simples, como exemplo de monossacarídeos mais
encontrados em frutas tem-se a frutose e a glicose (BENDER; MAYES, 2013).
A frutose é caracterizada por ser o mais doce dos açúcares simples e por fornecer
energia de forma gradativa, sendo absorvida lentamente, evita que a concentração de açúcar
no sangue aumente muito depressa. Ao contrário da glicose que é rapidamente absorvida
pelas células, sendo utilizada como uma das principais fontes de energia imediata ou
armazenada no fígado e no músculo na forma de glicogênio muscular (PINHEIRO;
PORTO; MENEZES, 2005).
A condensação de duas moléculas de monossacarídeos resulta na formação de
dissacarídeos, sendo o mais comum nas frutas a sacarose (BENDER; MAYES, 2013). A
34
sacarose, oriunda da ligação glicosídica α 1-4 entre glicose e frutose (TAPPY; LÊ, 2010),
apresenta rápida absorção e metabolização, sendo responsável por elevar o índice glicêmico
e fornecer energia imediata para a atividade física, além de contribuir para a formação das
reservas de glicogênio (PINHEIRO; PORTO; MENEZES, 2005).
De modo geral, os monossacarídeos e os dissacarídeos são responsáveis por conferir
sabor, cor e textura ao alimento, contribuindo de forma diferenciada com o poder de
doçura, sendo sua quantificação importante para o sabor final do produto (SILVA;
MAGALHÃES; GONÇALVES, 2009).
No entanto, nos últimos anos a busca por carboidratos funcionais tem se
intensificado, sendo os oligossacarídeos um composto promissor à saúde humana.
Os oligossacarídeos são compostos de cadeia relativamente pequena (VERNAZZA;
RABIU; GIBSON, 2006) com baixo grau de polimerização (DP 2 a 10) (ROBERFROID;
SLAVIN, 2000), sendo constituídos geralmente de 3 a 10 unidades de monossacarídeos
(SLAVIN, 2007) unidas covalentemente por meio de ligações glicosídicas (MARTIN;
BURKET, 2009), os quais são representados por frutose, galactose, glicose e/ou xilose
(Figura 10) (MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
Figura 10. Monossacarídeos presentes nas estruturas de oligossacarídeos. (Fonte: Mussatto e Mancilha,
2007).
A maioria dos oligossacarídeos é considerada não digerível, visto que as ligações do
tipo β presentes nos carbonos anoméricos (C1 ou C2) entre seus monossacarídeos não
podem ser clivadas pelas enzimas digestivas humanas (MARTIN; BURKERT, 2009),
sendo, portanto, fermentados pela microflora presente no intestino grosso, refletindo em
benefícios à saúde humana (SLAVIN, 2007).
Glicose Galactose Frutose Xilose
35
Os oligossacarídeos se diferenciam pelo comprimento da cadeia, composição
monossacarídica (Tabela 5), grau de ramificação e pureza. A lactulose apesar de ter menos
que três unidades de monossacarídeos apresenta propriedades semelhantes às dos
oligossacarídeos, sendo inclusa na classe de oligossacarídeos, assim como a xilobiose (DP
2), que por possuir propriedades tecnológicas e efeitos benéficos como os xilo-
oligossacarídeos faz parte desse grupo (MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
As plantas são fontes de oligossacarídeos, os quais são considerados como açúcares
de reserva em sementes e tubérculos e utilizados durante o crescimento das plantas
(VERNAZZA; RABIU; GIBSON, 2006). Desse modo, podem ser encontrados em frutas e
legumes, como cebola, alcachofra de Jerusalém, chicória, alho-poró, alho, alcachofra,
banana, centeio e cevada, sendo as concentrações de oligossacarídeos entre 0,3 % e 6 % do
peso fresco; a alcachofra de Jerusalém é o alimento de origem vegetal que apresenta a
maior porcentagem de oligossacarídeos – 20%. Além de frutas e vegetais, os
oligossacarídeos também podem ser encontrados em mel e leite (MUSSATTO;
MANCILHA, 2007).
No entanto, na literatura poucos dados são encontrados sobre a presença e
quantificação de oligossacarídeos em alimentos, mostrando a necessidade da realização de
mais estudos e divulgação de seus resultados à comunidade (JOVANOVIC-
MALINOVSKA; KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2014).
Os oligossacarídeos são de natureza intermediária entre açúcares simples e
polissacarídeos e por se comportarem como fibras dietéticas são considerados prebióticos
(QIANG; YONGLIE; QIANBING, 2009).
Substâncias prebióticas são ingredientes alimentares não digeríveis que beneficiam
o hospedeiro ao incitar seletivamente o crescimento e/ou a atividade de um ou mais grupos
limitados de bactérias presentes naturalmente no cólon, contribuindo assim em uma
mudança no equilíbrio microbiano global no cólon e na melhora da saúde do hospedeiro
(VERNAZZA; RABIU; GIBSON, 2006; CASCI, RASTALL, GIBSON, 2007).
36
Tabela 5. Exemplos de oligossacarídeos e suas composições
Tipo Estrutura
molecular*
Monossacarídeos** Número de
monossacarídeos
**
Ligação responsável pela
funcionalidade**
IMOS (Isomalto-oligossacarídeos) (Gu)n Glicose 2–5 α-1,4
SBOS (Oligossacarídeos de soja) (Ga)n–Gu–Fr Frutose, galactose, glicose 2–4 α-1,6
FOS (Fruto-oligossacarídeos) (Fr)n–Gu Sacarose, frutose 2–5 β-1,2
XOS (Xilo-oligossacarídeos) (Xy)n Xilose 2–7 α-1,4
MOS (Malto-oligossacarídeos) (Gu)n Manitose, glicose 2–10 α-1,2, α-1,4
Gentio-oligossacarídeos (Gu)n Glicose 2–10 β-1,6
Glicose-oligossacarídeos (Gu)n Glicose 2–10 α -1,2, β-1,3, β-1,6
Palatinose ou isolmaltulose (Gu–Fr)n Glicose, frutose 2 β-1,6
Malto-oligossacarídeos (Gu)n Glicose 2–8 α-l,2
Lactosucrose Ga–Gu–Fr Galactose, frutose 2–3 β-1,4
Glicosilsucrose (Gu)n–Fr Glicose, frutose 3 α-l,2, β-l,4
GOS (Galato-oligossacarídeos) (Ga)n–Gu Galactose 2–5 β-1,2, α-1,4
Lactulose Ga–Fr Galactose, frutose 2 β-1,4
Rafinose Ga–Gu–Fr Galactose, frutose, glicose 3 β-l,2, α-l,4
Estaquiose Ga–Gu–Fr Galactose, frutose, glicose 4 α-1,4
*Ga, galactose; Gu, glucose; Fr, fructose; Xy, xylose
Fonte: Mussatto e Mancilha, 2007*; Qiang, Yonglie e Qianbing, 2009**.
37
O cólon possui cerca de 400 espécies de bactérias distintas (PAK, 2006), sendo a
maioria anaeróbica (Tabela 6) (MUSSATTO; MANCILHA, 2007), as quais são
distribuídas entre cepas patogênicas, produtoras de metabólitos tóxicos e carcinogênicos e
espécies benéficas (PAK, 2006).
Tabela 6. Micro-organismos anaeróbicos predominantes no cólon humano
Grupo de anaeróbios Faixa na contagem de log (g peso seco-1
)
Bacteroides 9.2–13.5
Eubacteria 5.0–13.3
Bifidobacterium 4.9–13.4
Clostridium 3.3–13.1
Lactobacillus 3.6–12.5
Ruminococci 4.6–12.8
Peptostreptococci 3.8–12.6
Peptococci 5.1–12.9
Streptococci (anaerobic) 7.0–12.3
Methanobrevibacter 7.0–10.3
Desulfovibrios 5.2–10
Fonte: Mussatto e Mancilha, 2007.
As bifidobactérias e os lactobacilos são os grupos de bactérias benéficas ao
organismo mais relatados em estudos envolvendo oligossacarídeos (MUSSATTO;
MANCILHA, 2007; VANDENPLAS et al., 2008), os quais ajudam no processo de síntese
de vitaminas e enzimas digestivas, além de inibirem a adesão e crescimento de micro-
organismos patogênicos, reduzirem o pH do ambiente colonizado, contribuírem na resposta
imunológica (VANDENPLAS et al., 2008), estimularem o crescimento de bactérias
benéficas ao intestino, ajudarem com a absorção de íons como cálcio e facilitarem a síntese
de vitamina B (PAK, 2006).
A extensão da fermentação depende de alguns fatores como grau de polimerização,
tipo de oligossacarídeo e ligação glicosídica, grau de ramificação, sinergia entre as
bactérias fermentativas, relação entre as bactérias do substrato e dos produtos de
fermentação, natureza das impurezas e capacidade sacarolítica (MUSSATTO;
MANCILHA, 2007; VANDENPLAS et al., 2008).
38
A ingestão de probióticos e prebióticos contribui na restauração das bifidobactérias
(ROWLAND; GILL, 2008), sendo os prebióticos responsáveis por induzir aumento de 10 a
100 vezes o número da população intestinal de espécies Bifidobacterium (CRITTENDEN,
2006).
No grupo dos prebióticos os oligossacarídeos têm despertado grande interesse na
saúde humana em pesquisas na área de Ciência e Tecnologia, visto que além de
contribuírem com o crescimento e desenvolvimento de espécies bacterianas como as
Bifidobacterium no cólon (CASCI, RASTALL, GIBSON, 2007), conferem baixo índice
glicêmico, não são cariogênicos (CRITTENDEN, 2006) e estão relacionados à redução de
riscos de infecção e de diarreia, e melhora na resposta do sistema imunitário (MUSSATTO;
MANCILHA, 2007).
Os oligossacarídeos, devido a sua não digestibilidade, não possuem valor calórico,
no entanto, o processo de fermentação que sofrem no cólon (ROBERFROID; SLAVIN,
2000) contribuem com um valor energético de cerca de 0 a 3 kcal.g-1
(QIANG; YONGLIE;
QIANBING, 2009), análogo ao da fibra dietética solúvel (ROBERFROID; SLAVIN,
2000).
Na literatura, os oligossacarídeos com efeitos prebióticos mais citados e estudados
são Fruto-oligossacarídeo (FOS), Galacto-oligossacarídeo (GOS), Xilo-oligossacarídeo
(XOS), Isomalto-oligossacarídeo (IMO) e Lactulose (CRITTENDEN, 2006; VERNAZZA;
RABIU; GIBSON, 2006), sendo o FOS de maior representação.
De forma resumida, o interesse pelos oligossacarídeos se deve aos seguintes fatores:
capacidade de formarem gel viscoso que diminui a absorção de glicose liberada na corrente
sanguínea e a secreção de insulina, sendo indicado para diabéticos; possuem baixa caloria,
sendo um bom substituto do açúcar comum para perda de peso; não são cariogênicos;
promovem ambiente intestinal propício às bactérias benéficas da flora; melhoram e
eliminam sintomas de diarreia; estimulam a absorção intestinal de minerais, como cálcio,
magnésio e ferro; diminuem o risco de doenças crônicas degenerativas, tais como a doença
cardiovascular, câncer de cólon e obesidade (QIANG; YONGLIE; QIANBING, 2009).
Estudos com cultura de fermentação de bactérias fecais humanas têm demonstrado
que os FOS, GOS, XOS e IMO atuam como bons alteradores na microflora, elevando o
nível de bifidobactéria e/ou lactobacilos (VERNAZZA; RABIU; GIBSON, 2006).
39
Os oligossacarídeos contribuem, também, com a redução ou inibição da colonização
da mucosa intestinal por bactérias patogênicas como clostrídios e bacteroides
(VERNAZZA; RABIU; GIBSON, 2006). Essas bactérias são capazes de se ligar as
glicoproteínas (lectinas ou fimbrias) da parede intestinal, se proliferando. Os
oligossacarídeos por terem afinidade com as glicoproteínas se ligam a elas e, ao serem
excretados na forma de fezes carregam com eles as bactérias patogênicas (LAMOUNIER,
2012).
Os oligossacarídeos não digeríveis, em geral, apresentam outras ações benéficas aos
seres humanos, tais como: alívio de constipação, melhora o controle da glicemia,
modulação no metabolismo de triglicérides, contribuição na produção de vitaminas do
complexo B (B1, B2, B6 e B12), ácido fólico e nicotínico e na absorção de minerais como
cálcio, ferro e magnésio; efeito benéfico sobre o metabolismo de hidratos de carbono e
lipídios; redução de risco de câncer intestinal, principalmente (MUSSATTO; MANCILHA,
2007).
Além disso, muitos oligossacarídeos apresentam melhor solubilidade em água
quando comparado às suas moléculas nativas (SILVA et al., 2008) e apresenta dulçor em
torno de 0,3 a 0,6 vezes superior ao da sacarose, sendo esse poder determinado pela
estrutura química, grau de polimerização e níveis da presença de mono e dissacarídeos na
mistura, conforme aumento o comprimento da cadeia de oligossacarídeos o dulçor reduz
(MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
Na aplicação em alimentos, são bons substitutos de açúcares simples, conferindo
menor dulçor, fornecendo maior viscosidade, apresentando menor ponto de congelamento e
menor participação em reações de Maillard (CRITTENDEN, 2006). Atuam como agente
de volume em alimentos muito doce, juntamente com edulcorantes artificiais como o
aspartame ou sucralose, mascarando os “aftertastes” oriundos de alguns de alguns
edulcorantes e, proporcionam boa capacidade de retenção de umidade, impedindo a
secagem excessiva com baixa atividade de água e, consequentemente, ajuda no controle da
contaminação microbiana (MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
Sendo, assim, utilizados em indústrias alimentícias na produção de bebidas como
sucos, café, chás, refrigerantes, bebidas alcoólicas; produtos lácteos como iogurtes, leite
fermentado, pó instantâneo, leite em pó e sorvete; produtos de confeitaria como doces,
40
biscoitos, bolachas e pães (CRITTENDEN, 2006; MUSSATTO; MANCILHA, 2007);
sobremesas como gelatinas, pudins, sorvetes, chocolates, compotas e geleias; e produtos de
carne, tais como pasta de peixe e tofu, além de serem encontrados comercialmente em sua
forma pura ou heterogenia, contendo um número de oligossacarídeos de diferentes
tamanhos moleculares (número de porções de açúcar) (CRITTENDEN, 2006).
A utilização de oligossacarídeos também se estende a produção de cosméticos,
produtos estabilizantes, agentes imunoestimulantes e as indústrias farmacêuticas (QIANG;
YONGLIE; QIANBING, 2009), sendo utilizados em formulação de medicamentos como
agentes carreadores, por resistirem à ação de glicosidases e outras hidrolases que existem
nos organismos (GIESE et al., 2011).
Apesar dos benefícios tecnológicos e funcionais, o consumo de oligossacarídeos
deve ser moderado, visto que está relacionado a desconfortos intestinais como flatulências,
dores abdominais e diarreias. No entanto, os efeitos negativos dependem de fatores como
idade e predisposição do indivíduo (MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
Os oligossacarídeos podem ser obtidos por três maneiras: extração direta de plantas;
hidrólise controlada de polissacarídeos; síntese enzimática usando hidrolases e/ou glicosil-
transferases de plantas ou de micro-organismos, sendo pela via enzimática, as hidrolases
(EC 3.2) e as transferases (glicosil-transferases, EC 2.4) as principais enzimas envolvidas
na produção (CASCI; RASTALL, 2006).
Dentre as reações enzimáticas para produção industrial dos oligossacarídeos
destacam-se as reações de hidrólise, transglicosilação e isomerização, sendo a reação de
acordo com o tipo de oligossacarídeo (GIESE et al., 2011) (Figura 11).
41
Figura 11. Representação química de processos de produção de oligossacarídeos. (Fonte: Mussatto e
Mancilha, 2007, adaptada).
Nos processos industriais a extração se dá a partir de fontes naturais por hidrólise de
polissacarídeos, enzimática ou síntese química a partir de substratos de dissacarídeos, sendo
o processo enzimático por transglicosilação ou hidrólise de polissacarídeos (amido e xilano,
por exemplo) o mais aplicado, gerando oligossacarídeos com diferentes graus de
polimerização (DP) (MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
Em geral, os xilo-oligossacarídeos (XOS) e os isomalto-oligossacarídeos (IMO) são
oriundos da hidrólise enzimática de polissacarídeos; fruto-oligossacarídeo (FOS) e galacto-
42
oligossacarídeo (GOS) por meio da transgalactosilação; e lactulose por meio de
isomerização (CASCI; RASTALL, 2006). A Tabela 7 apresenta a via de obtenção dos
principais oligossacarídeos.
Tabela 7. Compostos prebióticos do grupo dos oligossacarídeos
Oligossacarídeo Método de produção
Fruto-oligossacarídeo (FOS) Extração de água quente a partir de raiz de
chicória, seguido de hidrólise enzimática ou
por polimerização de monômeros de frutose
Galacto-oligossacarídeo (GOS) Transgalactosilação enzimática da lactose
Xilo-oligossacarídeo (XOS) Hidrólise enzimática de xilanos
Isomalto-oligossacarídeo (IMO) Transglucosilação de amido liquefeito
Fonte: Vernazza, Rabiu e Gibson, 2006.
Apesar dos oligossacarídeos isomalto-oligossacarídeos, glico-oligossacarídeos e
xilo-oligossacarídeos serem considerados prebióticos em algumas pesquisas, infelizmente,
as enzimas específicas para a hidrólise desses compostos ainda não foram totalmente
elucidadas, sendo o mecanismo de ação prebiótica não totalmente evidente (CASCI,
RASTALL, GIBSON, 2007).
A separação e a análise quantitativa de oligossacarídeos são importantes para
aplicação na área industrial e de saúde. A determinação de oligossacarídeos em geral é
realizada por técnicas cromatográficas, sendo a cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE ou HPLC) a mais aplicada (LAMOUNIER, 2012).
3.4.1. Fruto-oligossacarídeos
Os fruto-oligossacarídeos (FOS) são os carboidratos não digeríveis de maior
representação no grupo de oligossacarídeos, sendo encontrados em vários alimentos de
origem vegetal (Tabela 8), como cebola, aspargos, alcachofra, alho, trigo, banana, tomate,
além do mel (SABATER-MOLINA et al., 2009; ALLES, 2012), porém em baixa
concentração em mel (CSANÁDI; SISAK, 2008).
43
Tabela 8. Exemplos de fontes de fruto-oligossacarídeos e seus teores expressos em
porcentagem (base fresca)
Fonte Parte comestível Unidades de
frutose
Teor de fruto-
oligossacarídeos (%)
Banana Fruta 2 0,3 – 0,7
Centeio Cereal 2 0,5 – 1
Alho poro Bulbo na 2 – 10
Trigo Cereal N 0,8 – 4
Alho Bulbo N 1 – 16
Chicória Raiz N 15 – 24
Aspargo Broto 2 – 4 2 – 3
Alcachofra
Jerusalém
Tubérculo 2 16 – 22
Alcachofra Folhas centrais 2 3 – 10
Yacon Raiz 3 – 19
Cebola Bulbo 2 – 4 1,1 – 7,5
Fonte: Hauly e Moscatto, 2002; Vernazza; Rabiu; Gibson, 2006.
Com um grau de polimerização de 3 a 10 (ALLES, 2012), são representados por
cadeias mistas de frutosil, com uma unidade terminal de glicose, sendo derivados a partir de
açúcar por meio de processos de fermentação naturais, produzindo 1-cestose (GF2), nistose
(GF3) e 1-frutosil-nistose (GF4) em que as unidades de frutosilo (F) são ligadas na posição
β-2,1 da sacarose (SABATER-MOLINA et al., 2009) (Figura 12) (LAMOUNIER, 2012).
Devido à presença de ligações β(2-1) entre os monômeros de frutose, resistem às
hidrólises enzimáticas na parte superior do trato gastrintestinal humano (PAK, 2006,
ALLES, 2012), as quais atuam somente sobre ligações α-glicosídicas (KOLIDA; GIBSON,
2008; ALLES, 2012), se comportando assim como fibras alimentares.
Ao atingirem o intestino grosso intactos, primeiramente são hidrolisados por beta-
oxidases bacterianas originando monômeros (SABATER-MOLINA et al., 2009) e,
posteriormente, fermentados pelas bactérias do cólon gerando como produtos ácidos graxos
de cadeia curta – AGCC (acetato, propionato, butirato), lactato, biomassa bacteriana e gases
(CO2, H2 e metano) (PAK, 2006; SABATER-MOLINA et al., 2009). No entanto, a
quantidade e o tipo de AGCC obtidos da fermentação dependerão do tipo de
44
oligossacarídeo não digerível e do perfil da flora intestinal (MUSSATTO; MANCILHA,
2007).
Figura 12. Estrutura química dos principais fruto-oligossacarídeos: (A)1-kestose, (B) nistose e (C)
frutofuranosil nistose. (Fonte: Tuohy et al., 2005).
Desse modo, os FOS são considerados prebióticos, proporcionando o crescimento e
estabilização dos probióticos, como Acidophillus, Bifidus e Faecium (PASSOS; PARK,
2003; GIESE et al., 2011) e inibição de bactérias patogênicas, como Escherichia coli e
Clostridium perfringens, por reduzir o pH do trato gastrointestinal (PASSOS; PARK,
2003), se tornando moduladores na integridade do epitélio e do sistema imunológico e
melhora na produção de enzimas digestivas, proporcionando benefícios ao intestino
humano como redução de riscos de enfermidades gastrointestinais (PAK, 2006; ALLES,
2012). De modo geral, com a ingestão regular de FOS podem-se observar aumentos entre
0,5 e 1,0 ciclo logarítmicos na população de bifidobactérias (ALLES, 2012).
Em plantas, os FOS são sintetizados a partir da sacarose por meio da transferência
repetida de frutosil (transfrutosilação pela enzima β- fructoranosidase ou β-D-
frutosiltransferases) (CASCI; RASTALL, 2006).
Na indústria a produção de FOS por meio da sacarose necessita inicialmente de uma
alta concentração de sacarose para se obter uma transfrutosilação eficiente, além de reduzir
custos com evaporação no processamento final (MUSSATTO; MANCILHA, 2007). Nesse
meio de produção existem duas rotas: (i) sistemas de lote usando enzimas solúveis; e (ii)
sistemas contínuos utilizando enzimas imobilizadas ou células inteiras. As enzimas
45
envolvidas podem ser intra ou extracelular (CASCI; RASTALL, 2006) e o grau de
polimerização varia entre 1 e 5 unidades de frutosil (PASSOS; PARK, 2003).
Comercialmente, encontram-se disponíveis FOS em pó e na forma de xaropes com
75% de sólidos (ALLES, 2012). A composição dos xaropes de FOS comerciais apresenta
de 25 - 30 % (m/m) de 1-cestose (GF2), de 10 - 15% de nistose (GF3), de 5 - 10% de
nistose 1F-frutofuranosil (GF4) e de 25 - 30 % de glicose (CASCI; RASTALL, 2006).
Os FOS também podem ser obtidos a partir da hidrólise parcial enzimática da
inulina extraída da raiz da chicória. A inulina é um tipo de frutano com ligações β-2,1-D-
fructofuranosil encontrados em plantas e sintetizada por fungos e com grau de
polimerização (DP) variando entre 2 e 70, sendo maior que o de FOS, o qual tem peso
molecular inferior a inulina (DP > 30) (CASCI; RASTALL, 2006).
Segundo a terminologia da IUB-IUPAC (1982), o ponto de divisão entre oligo e
polissacarídeos é 10 (HAULY; MOSCATTO, 2002). O grau de polimerização dos FOS
obtidos por meio da inulina varia entre 1 e 7 unidades de frutosil. E a hidrólise pode ocorrer
de forma natural, sendo esses FOS encontrados em uma ampla variedade de plantas, sendo
as principais, alcachofras, aspargos, beterraba, chicória, banana, alho, cebola, trigo, tomate,
tubérculos, como o yacon, bulbos, como os de lírios vermelhos e até em mel e açúcar
mascavo (PASSOS; PARK, 2003).
As frutosiltransferases aplicadas na produção de FOS podem ser obtidas por meio
de plantas ou de micro-organismos (principalmente fungos), sendo as espécies de micro-
organismos mais usadas para obtenção dessa enzima as Aspergillus niger, Aureobasidium
pullulans e Aspergillus japonics (CASCI; RASTALL, 2006).
Um exemplo de micro-organismo que pode se obter a enzima β-frutofuranosidase é
a levedura Scwhanniomyces occidentalis. A ação da enzima sobre a sacarose gera o
composto 6-cestose, que é um oligossacarídeo constituído por moléculas de frutose ligadas
por ligações glicosídicas do tipo β-(2→6). Indústrias também utilizam a enzima produzida
pelo Aspergillus niger para obter FOS de beterraba (GIESE et al., 2011).
Quando comparada com a sacarose os FOS apresentam grandes diferenças nas
propriedades tais como: baixa intensidade de doçura; baixíssima caloria por não ser
metabolizado, apenas fermentado; alta capacidade higroscópica; viscosidade superior de
outro açúcar devido ao maior peso molecular de FOS; estabilidade térmica superior ao da
46
sacarose; não cariogênico já que não são utilizados pelo Streptococcus mutans para formar
os ácidos e insolúveis β-glucanas, principais causas de cáries dentárias (SABATER-
MOLINA et al., 2009); não cristalizam; não precipitam e; não deixam sensação de secura
ou aspereza na boca (PASSOS; PARK, 2003).
Todas essas propriedades permitem que o FOS seja um bom substituto da sacarose
(SABATER-MOLINA et al., 2009) em formulações de sorvetes e sobremesas lácteas com a
indicação de açúcar reduzido, sem adição de açúcar, calorias reduzidas ou produto sem
açúcar; em dietas para diabéticos; como ingrediente funcional em formulações que
combinem efeito nutricional com efeito prebiótico; em iogurtes, promovendo efeito
simbiótico com o probiótico; em produtos de panificação e confeitaria; em barras de
cereais; sucos e néctares frescos, molhos, entre outras aplicações (PASSOS; PARK, 2003).
A Tabela 9 apresenta algumas funcionalidades dos FOS na produção de alimentos
(ALLES, 2012).
Tabela 9. Exemplos de aplicações do FOS em produtos alimentícios e suas funcionalidades
Aplicação Funcionalidade Dosagem
(%massa/massa)
Produtos lácteos Substituto de açúcar; sinergia com
edulcorantes; corpo e mounth feel
(sensação na boca); estabilidade de espuma; fibras e prebióticos
2 – 10
Sobremesas
congeladas
Substituto de açúcar; sinergia com
edulcorantes; textura e ponto de derretimento; fibras e prebióticos
5 – 12
Produtos de panificação
Retenção de umectância; substituto de açúcar; fibras e prebióticos
2 – 25
Cereais matinais Crocância; fibras e prebióticos 2 – 15
Recheios Substituto de açúcar; melhoria de textura 2 – 50
Preparados de frutas Substituto de açúcar; sinergia com
edulcorantes; corpo e mounth feel (sensação na boca); fibras e prebióticos
5 – 50
Produtos dietéticos e
substitutos de refeições
Substituto de açúcar; sinergia com
edulcorantes; corpo e mounth feel
(sensação na boca); fibras e prebióticos; baixo valor calórico
2 – 20
Pastilhas Substituto de açúcar; fibras e prebióticos 2 – 10
Fonte: Franck, 2002.
47
Devido à maior produção e estudos direcionados a ação prebiótica, os FOS são
considerados uma das principais classes de oligossacarídeos bifidogênicas (KOLIDA;
GIBSON, 2008). No entanto, para se obter o efeito bifidogênico a ingestão diária de FOS
deve ser entre 5 a 20 g de FOS (PAK, 2006).
De acordo com a ANVISA (BRASIL, 2008) para receber a alegação “contribuem
para o equilíbrio da flora intestinal” a porção do alimento deve fornecer no mínimo 3 g de
FOS, para alimentos sólidos ou 1,5 g, para alimentos líquidos, sendo na tabela de
informação nutricional declarada a quantidade de FOS abaixo de fibras alimentares.
Os FOS, na maioria dos países, são considerados ingredientes e não aditivos
alimentares. Nos Estados Unidos o carboidrato não digerível apresenta o status GRAS
(Geralmente Reconhecido como Seguro) (PASSOS; PARK, 2003).
Vários estudos já demonstraram os efeitos benéficos do FOS. O consumo de 12,5
g.dia-1
de FOS durante 3 dias promovem a redução significativa de micro-organismos
anaeróbios totais em fezes. Este estudo realizado por BOUHNIK et al. (2006) também
verificou diminuição no pH do intestino grosso, na atividade de nitroredutases, nas
azoredutases, nas β-glucoronidases e nas concentrações de bile ácida e esterol neutro e
inibição de bactérias patogênicas putrefativas, fatores que contribuem com a colonização de
bifidobactérias no intestino. Além disso, a ingestão de FOS evita a constipação e
desconforto intestinais (PASSOS; PARK, 2003).
A ingestão diária de FOS para obtenção dos efeitos bifidogênicos, de acordo com
alguns estudos, varia entre 2 a 13 g. Um aumento na contagem de bifidobactérias fecais em
seres humanos foi verificado ao se ingerir doses de 4 a 12,5 g.dia-1
de fruto
oligossacarídeos de cadeia curta (BOUHNIK et al., 2006). Outro estudo já comprovou que
doses entre 2 e 10 g.dia-1
em adultos é o suficiente para se obter o efeito bifidogênico do
FOS. E outros pesquisadores verificaram que o consumo de pelo menos 4 g.dia-1
, sendo
preferencialmente, de 8 g.dia-1
de fruto-oligosacarídeos são suficientes para aumentar de
forma significativa o número de células de bifidobactérias no intestino humano
(MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
O FOS pode evitar a constipação devido ao aumento da produção de gases e de
massa microbiana que leva a um aumento do conteúdo fecal do cólon. O aumento do bolo
fecal se deve aos ácidos graxos de cadeia curta obtidos da fermentação de FOS no cólon
48
que são absorvidos e utilizados pelas células do epitélio do cólon, estimulando o
peristaltismo intestinal. Há também aumento da absorção de sais e água pela massa fecal, o
que eleva a umidade das fezes por meio da pressão osmótica, resultando no aumento do
peristaltismo intestinal, na redução do tempo de trânsito do bolo fecal e do tempo
disponível para a reabsorção de água que, consequentemente, aumenta o volume das fezes
(SABATER-MOLINA, 2009; QIANG; YONGLIE; QIANBING, 2009). Os
oligossacarídeos MOS e GOS também apresentam o mesmo mecanismo de ação (QIANG;
YONGLIE; QIANBING, 2009).
Além de seu efeito bifidogênico, os FOS apresentam baixo valor calórico (1,9 –
2,15 kcal) em comparação aos monossacarídeos, não gerando em sua hidrólise moléculas
de glicose e frutose intrassanguíneas, ou seja, não induz aumento de concentração de
insulina no sangue, como mostrado em estudo com diabéticos insulinos independentes,
onde o consumo de 8 gramas de FOS durante 2 semanas reduziu as concentrações de
insulina, glicose sanguínea, colesterol total e LDL, podendo o efeito ser explicado pela
influência dos ácidos graxos de cadeia curta gerado na fermentação sobre o metabolismo
dos carboidratos e lipídeos (PAK, 2006).
Alterações no metabolismo de hidratos de carbono e lipídios promovidas pela
ingestão de oligossacarídeos contribui com a redução de triglicerídeos e de colesterol,
concentração de fosfolipídios sanguíneo, levando a diminuição de riscos de diabetes e de
obesidade (MUSSATO; MANCILHA, 2007).
A relação da ingestão de FOS e os demais oligossacarídeos funcionais com a
redução dos níveis lipídicos sanguíneos pode ser explicada por meio do processo de
fermentação dos oligossacarídeos no cólon e a produção de ácidos graxos de cadeia curta.
O propionato de etila produzido durante a fermentação do FOS promove a redução da
gliconeogênese, favorecendo a glicólise hepática, a diminuição da concentração de ácidos
graxos no plasma (SABATER-MOLINA et al., 2009) e até a inibição da síntese de
triglicerídeos, provavelmente devido a inibição de enzimas lipogênicos no fígado
(VERNAZZA; RABIU; GIBSON, 2006). No entanto, o acetato presente no fígado já pode
ser lipogênico e colesterogênico (ÖNNING, 2007).
A relação entre a ingestão de oligossacarídeos e redução dos níveis de colesterol
ainda não está bem elucidada, visto que as alterações no metabolismo dos lipídeos podem
49
ser induzidas pela produção de AGCC como consequência de uma adaptação metabólica do
fígado (MUSSATO; MANCILHA, 2007).
Os FOS contribuem também com o aumento da biodisponibilidade de alguns
minerais no intestino como cálcio, magnésio, fósforo e zinco (ALLES, 2012). A relação da
ingestão de FOS com a melhora na absorção de minerais pode se dever a dois fatores. O ser
humano apresenta insuficientes níveis da enzima fitase endógena que é responsável pela
quebra da molécula fitato, os FOS por servirem como substratos a microflora intestinal,
permite a produção de enzimas fitases pelos micro-organismos, contribuindo assim com a
liberação dos minerais complexados ao anti-nutricional fitato, ficando disponíveis para
absorção (SCHOLZ-AHRENS et al., 2007). Além disso, durante a fermentação a redução
do pH no cólon íleo e ceco e a produção de AGCC (PAK, 2006) promovem aumento na
concentração de minerais ionizados, o que facilita a difusão passiva, aumentando a
solubilidade e disponibilidade dos minerais (SABATER-MOLINA et al., 2009).
Em um estudo doses de FOS foram fornecidas a ratos o que promoveu além do
aumento da biodisponibilidade de cálcio, melhora na estrutura óssea (PAK, 2006),
contribuindo na redução ou prevenção de osteoporose e anemia (SABATER-MOLINA et
al., 2009). Outro estudo com animais observaram aumento na absorção de cálcio,
magnésio, fósforo e de elementos traços como zinco, ferro e cobre (ALLES, 2012). E um
com humanos verificou aumento aparente da absorção de cálcio e magnésio com a ingestão
de 15 g de FOS diária (VERNAZZA; RABIU; GIBSON, 2006). A relação entre a absorção
de cálcio e a melhora na estrutura óssea ainda não está totalmente comprovada, entretanto,
sugere-se que ao FOS contribui com a mineralização e a densidade óssea (ALLES, 2012).
A ingestão de FOS estende seus benefícios à prevenção e inibição de câncer de
cólon. Fezes, pH, amônia, p-cresol e indol são alguns fatores que contribuem com o
desenvolvimento de células cancerígenas no intestino (MUSSATTO; MANCILHA, 2007).
O FOS, assim como outros oligossacarídeos, promove a redução do pH que causa a
desintoxicação de genotoxinas no intestino; confere propriedades antineoplásicas que
aumentam a proliferação de células normais e suprimi as transformadas e aumenta a
apoptose de células transformadas. Além disso, o ácido butírico obtido na fermentação do
FOS pode aumentar a secreção de mucina, melhorando a barreira de proteção as células
epiteliais contra o ataque de compostos reativos (PAK, 2006). Além disso, o aumento da
50
biomassa e do bolo do fecal acelera o tempo de trânsito no cólon, reduzindo,
consequentemente, o tempo de exposição da microbiota do cólon aos agentes cancerígenos
(SABATER-MOLINA et al., 2009).
O consumo de FOS incita outros benefícios ao organismo humano, tais como a
redução da pressão sanguínea, alteração do metabolismo de ácidos gástricos, regulação do
metabolismo lipídico, influenciada pela produção de AGCC e aumento da produção de
compostos imuno estimulantes com atividade antitumoral (PASSOS; PARK, 2003).
3.4.2. Malto-oligossacarídeo
O malto-oligossacarídeo (MOS) é um composto formado pela mistura de vários
monossacarídeos de glicose que ao ser hidrolisado gera outras cadeias: G1 – glicose, G2 –
maltose, G3 – maltotriose, G4 – maltotetraose; G5 – maltopentaose, G6 – maltohexaose e
G7 – maltoheptaose, entretanto, somente os G3 – G7 são considerados oligossacarídeos
(YOO et al., 2005).
Essas moléculas apresentam diversas aplicações como ingredientes com funções
tecnológicas na indústria alimentícia e funcional na área da saúde. Uns dos interesses na
indústria se devem a sua capacidade de inibir a alta viscosidade, a retenção de água e a
cristalização em produtos (KUMAR; KHARE, 2012). Além disso, as funções podem variar
de acordo com o tipo de MOS utilizado. Por exemplo, o G5 pode ser usado como agente
antienvelhecimento (YOO et al., 2005); G3 e G5 impedem a migração de umidade a partir
de grânulos de amido, contribuem para a diminuição do processo de retrogradação, inibindo
o realinhamento das cadeias de amilose e de amilopectina (KUMAR; KHARE, 2012).
Como ingrediente funcional os MOS estão envolvidos na redução de índices
glicêmicos e colesterol (YOO et al., 2005), alívio de constipação (QIANG; YONGLIE;
QIANBING, 2009) e promoção do crescimento das bifidobactérias do cólon humano. No
entanto, em relação ao FOS, há poucos estudos sobre esses oligossacarídeos em alimentos.
Estudos têm mostrado que a ingestão de xarope de milho enriquecido com
maltotetraose (G4) promoveu a redução do nível de Clostridium perfringens no cólon. Já
outro estudo utilizando como fonte de carbono malto-oligossacarídeos verificou um
crescimento das cinco estirpes de Bifidobactéria (B. adolescentis, B. infantis, B. lactis, e
duas estirpes de B. longum) (WOOD, 2010).
51
A síntese de MOS pode ocorrer a partir das enzimas amilases produzidas pelas
seguintes bactérias Bacillus stearothermophilus, B. subtilis, Brachybacterium sp. estirpe
LB25 e B. acidicola, no entanto, somente algumas estirpes – B. subtilis e Bacillus sp.
GM8901 – são capazes de produzir maltotrose e maltotetraose (KUMAR; KHARE, 2012).
52
53
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Bioaromas e Compostos
Bioativos do Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de
Alimentos – FEA/UNICAMP, Campinas, Estado de São Paulo, Brasil.
4.1. Obtenção das amostras
O subproduto agroindustrial de goiaba e a fruta goiaba vermelha em grau de
maturação comercial foram cedidos, no mês fevereiro/2014, por uma indústria produtora de
sucos e néctares de frutas (DE MARCHI), localizada na cidade de Jundiaí-SP.
O transporte das amostras foi realizado sob refrigeração até o Laboratório de
Bioaromas e Compostos Bioativos do Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade
de Engenharia de Alimentos – FEA/UNICAMP e congelados até a preparo dos extratos.
4.2. Caracterização das amostras
O subproduto agroindustrial da goiaba, obtido por despolpamento a quente, foi
lavado, peneirado, seco em temperatura ambiente e separados em sementes e
cascas/pedúnculos a fim de se estimar em porcentagem a composição do subproduto em
sementes, cascas/pedúnculos e polpa.
Antes do processamento das amostras para as análises, determinações de pH, acidez
titulável e concentração de sólidos solúveis (°Brix) foram realizadas a fim de se caracterizar
as condições em que as matérias-primas chegaram no laboratório, se estavam aptas para o
consumo.
4.2.1. Determinação do pH
A medida de pH foi realizada em um pHmetro digital Digimed (modelo DM-20,
Brasil), calibrado com soluções tampão de pH 4,0 e 7,0 a 20ºC de acordo com AOAC
(1984).
Pesou-se 5 gramas da amostra em béquer e diluiu-se em 50 mL de água destilada e
mediu-se o pH inserindo os eletrodos do pHmetro diretamente na solução.
54
4.2.2. Análise de acidez total titulável
A acidez total titulável (ATT) foi realizada por titulação de acordo com método
descrito pelo Instituto Adolfo Lutz (1985).
Pesou-se 5 gramas de amostra em frasco Erlenmeyer e adicionou-se 50 mL de água
destilada. Adicionou-se de 4 gotas de solução fenolftaleína, titulando-se com solução de
hidróxido de sódio 0,1M, até coloração rósea.
Com o volume gasto na titulação foi calculada a acidez total titulável da amostra,
sendo expressa em porcentagem, v/m.
4.2.3. Determinação de sólidos solúveis
O teor de sólidos solúveis totais (SST) foi determinado por meio de leitura direta em
refratômetro digital Atago (modelo RX-5000α, Brasil) de acordo com AOAC (1984).
Homogeneizou-se a amostra e transferiu-se 2 gotas, pipetadas com pipeta de
Pasteur, de cada uma das amostras, para o prisma do refratômetro, desprezando-se
partículas grandes. Os resultados foram expressos em °Brix.
4.3. Composição fenólica
4.3.1. Obtenção dos extratos
Os extratos das amostras foram obtidos em triplicata por dois métodos de extração,
com solvente único (hidroetanólica 90%) e sequencial.
4.3.1.1. Extração única
A extração única foi realizada de acordo com o proposto por Côrrea (2010), com
modificações. As amostras frescas (0,5 g) foram agitadas em shaker New Brunswick
Scientific (modelo C76, Edison, NJ, USA) a 180 rpm por 30 minutos em ambiente escuro e
gelado com 3 mL de solvente etanol a 90% (10:90, v.v-1
, água destilada:etanol) depois
centrifugadas em centrífuga Hettich Zentrifugen (modelo Rotanta 460R, Germany) por 15
minutos a 4750 rpm e 4ºC. O resíduo foi re-extraído nas mesmas condições, totalizando 60
minutos de extração. Os sobrenadantes resultantes foram combinados e o volume ajustado
para 10 mL. Os extratos (EE – extrato em solvente hidroetanólica) acondicionados em
55
frasco âmbar foram armazenados a 4ºC por aproximadamente um mês até às análises
subsequentes.
4.3.1.2. Extração sequencial
A extração sequencial foi realizada de acordo com a sugerida por Sun et al. (2002) e
Dewanto, Wu, Liu (2002), com modificações, permitindo a obtenção de três frações. Os
compostos solúveis fenólicos livres (fração 1/ECFL) foram extraídos utilizando 50 g de
peso fresco das amostras homogeneizados com 100 mL de solução hidroacetônica 80%
(v/v) em liquidificador industrial Skymsen (modelo LI-1,5-N, Brasil) durante 5 minutos e
mais 3 minutos em ultra-turrax Poly Tron (modelo PT – MR 2100, Switzerland), sendo
posteriormente centrifugadas a 5°C por 15 minutos a uma velocidade de 5000 rpm. Os
sobrenadantes, compostos por agliconas livres e conjugados solúveis (formas glicosiladas),
foram evaporados em rotaevaporador Büchi (modelo R-210) acoplado em Chiller Büchi
(modelo F108) 45°C até evaporação de cerca de 90% do sobrenadante e ressuspendidos em
água deionizada para um volume final de 50 mL. Nos resíduos obtidos da centrifugação das
amostras foram adicionados 20 mL de solução NaOH 2 N e homogeneizados em shaker à
temperatura ambiente durante 1 hora (200 rpm) para hidrólise das ligações dos compostos
conjugados. Os meios foram acidificados com HCl concentrado até pH 2 e lavados com 25
mL de hexano para remoção da gordura, centrifugados e os sobrenadantes recolhidos para
as análises (fração 2/ECFSH). Os resíduos, obtidos na segunda centrifugação, foram
lavados seis vezes com acetato de etila, centrifugado, evaporado a 45°C até evaporação
completa do solvente e ressuspendidos em água deionizada para um volume final de 10 mL
(fração 3/ECFC – extratos fitoquímicos conjugados). Os extratos foram armazenados em
freezer por aproximadamente um mês até à suas utilizações para as análises.
4.3.2. Determinação de fenólicos totais
A concentração dos compostos fenólicos totais foi determinada em Fluorímetro
NOVOstar (modelo S/N 700-0120, Switzerland) a 760 nm, utilizando reagente Folin-
Ciocalteau, segundo a metodologia descrita por Roesler et al. (2007), com modificações. O
método colorimétrico Folin-Ciocalteau envolve a redução do reagente pelos compostos
56
fenólicos das amostras com concomitante formação de um complexo azul cuja intensidade
aumenta linearmente.
Uma curva de referência nas concentrações de 10 a 70 µg.mL-1
em metanol 50% foi
construída utilizando-se como padrão o ácido gálico (Sigma Aldrich, USA) 100 µg.mL-1
.
Para a determinação de compostos fenólicos, os extratos com concentrações conhecidas
(mg.mL-1
) em metanol 50%, foram homogeneizados em banho ultrassom UltraSonic
Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) por 30 minutos e a partir deles, diluições seriadas em
solução de metanol 50% foram realizadas e, assim, determinada a melhor concentração
para se obter o teor de compostos fenólicos nos extratos (localizada na faixa mediana ao
centro da curva analítica).
Para a reação colorimétrica, uma alíquota 30 µL da solução metanólica de extrato foi
homogeneizada em agitador de placas Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) por 2 minutos
com 120 µL de solução Folin Ciocalteau, posteriormente homogeneizada com 130 µL de
solução de carbonato de sódio 5% e mantida em incubação a 50ºC por 5 minutos em banho-
maria New Brunswick Scientific (modelo C76, Edison, NJ, USA) para desenvolvimento de
cor. O sistema foi resfriado rapidamente em banho de gelo e realizado a leitura em
Fluorímetro a 760 nm a temperatura ambiente (25ºC±2). Um branco foi realizado
substituindo a solução metanólica de extrato por 30 µL de hidrometanólica 50% (v/v). A
quantificação de compostos fenólicos nos extratos foi determinada por meio da curva
analítica e os resultados foram expressos em equivalente de ácido gálico (EAG) - mg de
ácido gálico por g de fruta fresca.
4.3.3. Quantificação de flavonoides
A quantificação dos flavonoides foi realizada pelo método colorimétrico descrito
por Zhishen, Mengcheng e Jianming (1999), com modificações em Fluorímetro NOVOstar
(S/N 700-0120, Switzerland) a 510 nm. A curva de referência foi construída utilizando-se
o padrão catequina (Sigma Aldrich, USA) 500 µM nas concentrações de 10 a 200 μmol.
Para a determinação dos flavonoides, extratos com concentrações conhecidas
(mg.mL-1
) em água destilada foram homogeneizados por 30 minutos em banho ultrassom
UltraSonic Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) e a partir deles, diluições seriadas em
57
água deionizada (Milipori Bedford, modelo CT Q3UV, USA) foram realizadas e, assim
determinada a melhor concentração para se obter o teor de flavonoides nos extratos.
A reação colorimétrica ocorreu com a homogeneização de 28 µL do extrato com
110 µL de água destilada em agitador de placas Eppendorf (modelo MixMate, Espanha)
por 30 segundos a 500 rpm, posteriormente outras séries de homogeneização com soluções
foram realizadas – 8 µL de NaNO2 por 2 minutos, 8 µL de AlCl3 por 3 minutos e 56 µL de
NaOH mais 67 µL de água destilada por 30 segundos. Para o branco o extrato foi
substituído por 28 µL de água destilada. As leituras das absorbâncias foram realizadas em
fluorímetro a 510 nm a temperatura ambiente (25ºC±2) e os resultados expressos em
equivalente de catequina - mg de catequina por g de fruta fresca.
4.3.4. Determinação de taninos condensados
A quantificação dos taninos condensados foi realizada pelo método colorimétrico
vanilina descrito por Price, Van Scoyoc e Butler (1978), com modificações em fluorímetro
NOVOstar (S/N 700-0120, Switzerland) a 510 nm. A curva de referência foi construída
utilizando-se o padrão catequina (Sigma Aldrich, USA) nas concentrações de 0,02 a 1,2
mg.mL-1
.
Para a determinação dos taninos condensados, os extratos com concentrações
conhecidas (mg.mL-1
) em metanol foram homogeneizados por 30 minutos em banho
ultrassom UltraSonic Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) e a partir deles, diluições
seriadas em metanol foram realizadas e, assim determinada a melhor concentração para se
obter o teor de taninos condensados nos extratos.
A reação colorimétrica ocorreu com a homogeneização de 50 µL do extrato com
250 µL de reagente vanilina (1% de vanilina + HCl 4% em metanol, 1:1 v/v) em agitador
de placas Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) por 30 segundos a 500 rpm. Para o
branco o extrato foi substituído por 50 µL de metanol em 250 µL de HCl 4%. A
microplaca foi mantida em incubação a 30ºC por 20 minutos em banho-maria New
Brunswick Scientific (modelo C76, Edison, NJ, USA) para desenvolvimento de cor. As
leituras das absorbâncias foram realizadas em fluorímetro a 510 nm a temperatura ambiente
(25ºC±2) e os resultados expressos em equivalente de catequina - mg de catequina por g de
fruta fresca.
58
4.4. Ensaios antioxidantes in vitro
4.4.1. Atividade sequestradora do radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)
O ensaio foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Roesler et al.
(2007) e Thaipong et al. (2006), ambos com modificações, sendo em sistema de
microplacas com leitura das absorbâncias em fluorímetro NOVOstar (S/N 700-0120,
Switzerland). A solução estoque de DPPH 0,004% foi preparada em metanol e banho
ultrassom UltraSonic Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) por 15 minutos em banho de
gelo e ao abrigo da luz. Em seguida, a absorbância da solução foi aferida em microplaca
entre 0,8 a 1,2 a 517 nm em fluorímetro NOVOstar (S/N 700-0120). A curva padrão foi
preparada com o análogo hidrossolúvel da vitamina E, Trolox (Sigma Aldrich, USA) 1500
µmol, dissolvido em metanol, nas concentrações de 10 a 250 μM. Os extratos
homogeneizados em metanol e em ultrassom por 30 minutos foram diluídos em sequência
seriada, agitados em agitador de placas Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) com 250
µL de DPPH 0,004% por 5 minutos e deixados a reagir por 25 minutos em temperatura
ambiente e local escuro. Em seguida, foi realizada a leitura da absorbância a 517 nm. Os
resultados foram expressos em valores de IC50, por meio da construção de curvas lineares
entre a capacidade antioxidante do respectivo extrato e sua concentração para cada
concentração de extrato, obtendo-se regressão linear e a equação da reta para cálculo do
IC50 e em valores de µmol de Trolox equivalente por gramas de amostra fresca.
4.4.2. Atividade antioxidante pelo método de redução do radical ABTS [2,2´-
azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)]
O método de redução do radical ABTS foi realizado conforme metodologia descrita
por Li et al. (2007), com modificações, sendo em sistema de microplacas com leitura das
absorbâncias em fluorímetro NOVOstar (S/N 700-0120, Switzerland). A formação do
radical ABTS•+ foi dada por meio da homogeneização e estocagem por 12 horas em
temperatura ambiente no escuro de ABTS (Sigma Aldrich, USA) 7 mM e persulfato de
potássio 140 mM. A solução então foi diluída em água deionizada (Milipori Bedford,
modelo CT Q3UV, USA) até obtenção de uma absorbância de a 0,7000 ± 0,02 a 734 nm e a
curva padrão foi preparada com o análogo hidrossolúvel da vitamina E, Trolox (Sigma
59
Aldrich, USA) 1500 µmol, dissolvido em água deionizada, nas concentrações de 10 a 250
μmol. Os extratos homogeneizados em água deionizada em banho ultrassom UltraSonic
Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) por 30 minutos foram agitados em agitador de placas
Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) com 250 µL de solução ABTS•+ durante 5
minutos no escuro a 600 rpm. Em seguida, foi realizada a leitura da absorbância a 734 nm.
Os resultados foram expressos em µmol TE equivalente por gramas de amostra fresca.
4.4.3. Determinação da capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC)
O ensaio foi realizado baseado na metodologia apresentada por Dávalos, Gómez-
Cordovéz e Bartolomé (2004), com modificações. As leituras foram realizadas em
fluorímetro NOVOstar (S/N 700-0120, Switzerland), sendo analisados os compostos
fenólicos hidrofílicos e lipofílicos. A curva padrão foi preparada com Trolox (Sigma
Aldrich, USA) 1500 µmol, dissolvido em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4
(hidrofílicos) e solução ciclodextrina metilada randomizada a 7% (RMCD) (Sigma Aldrich,
USA) (lipofílicos), nas concentrações de 50 a 800 μmol. Os extratos homogeneizados nos
solventes tampão fosfato de potássio ou RMCD em banho ultrassom UltraSonic Cleaner
(modelo M/UNIQUE, Brasil) por 30 minutos foram agitados em agitador de placas
Eppendorf (modelo MixMate, Espanha) com 120 µL de solução de fluoresceína no escuro
por 30 segundos a 600 rpm e, em seguida, nas mesmas condições de agitação com 60 µL de
AAPH (Sigma Aldrich, USA) diluído em tampão fosfato de potássio 75 mM, pH 7,4. A
leitura foi realizada nas condições da fluoresceína a 485 nmEX/520 nmEM, a cada 60
segundos em um ciclo igual a 80 (80 minutos) a 37ºC. A determinação da curva de
decaimento da fluorescência de cada reação foi calculada pela fórmula – AUC = 1 + fi/f0
+...fi/f0+...f80/f0, onde f0 corresponde a fluorescência obtida no tempo 0 e fi a fluorescência
nos tempos intermediários entre 0 e 80 minutos. Os resultados foram expressos em µmol
TE por grama de amostra fresca.
60
4.5. Análise de açúcares e oligossacarídeos
4.5.1. Preparo dos extratos
A goiaba in natura foi cortada em cubos e o subproduto agroindustrial de goiaba foi
homogeneizado. As amostras foram congeladas, liofilizadas em lioflizador Terroni (modelo
LS 3000, Brasil), em placas de Petri, moídas em moinhos de facas Marconi (modelo
MA340, Brasil) para obtenção de uma farinha, que foram acondicionadas em sacos de
polietileno (escuro), fechados e mantidos em temperatura de congelamento até a extração
para as análises.
A extração de oligossacarídeos foi realizada de acordo com metodologia proposta
por Ekvall, Stegmark e Nyman (2007) com modificações. Um grama de amostra liofilizada
foi homogeneizado por 30 segundos em agitador de tubos vórtex Merse (modelo Lab
Dancer – IKA, USA) com 10 mL de solução de etanol 50% v/v.
Para avaliar a influência dos mecanismos sobre a extração de açúcares e
oligossacarídeos, três mecanismos distintos foram aplicados – banho de agitação com
velocidade igual a 200 rpm (shaker New Brunswick Scientific modelo C76, Edison, NJ,
USA); banho ultrassom UltraSonic Cleaner (modelo M/UNIQUE, Brasil) e ultra-turrax
Poly Tron (modelo PT – MR 2100, Switzerland), sendo a temperatura e o tempo de
extração dos dois primeiros mecanismos de 25ºC e 1 hora, respectivamente e para o ultra-
turrax de 25ºC e 1 minuto a 11.000 rpm.
Após a aplicação de cada mecanismo, os extratos foram centrifugados (centrífuga
Hettich Zentrifugen modelo Rotanta 460R, Germany) a 5ºC por 15 minutos a velocidade de
10.000 rpm, os sobrenadantes rotaevaporados à 45ºC e ressupendidos em 10 mL de água
deionizada (Milipori Bedford, modelo CT Q3UV, USA) e, em seguida, armazenados em
tubos eppendorfs em freezer até a determinação de oligossacarídeos.
4.5.2. Identificação e quantificação de açúcares e oligossacarídeos
A separação e quantificação dos açúcares e oligossacarídeos foram realizadas
conforme metodologia desenvolvida no Laboratório de Bioaromas e Compostos Bioativos
do Departamento de Ciência de Alimentos da Faculdade de Engenharia de Alimentos
61
(UNICAMP, Campinas), por meio do sistema Dionex ICS-5000 e Software de Automação
Cromatográfica Chromeleon versão 7.0 (Dionex, CHM-1, USA).
Para a separação dos açúcares – glicose, frutose e sacarose o sistema cromatográfico
foi equipado com coluna analítica CarboPac PA-1 de troca iônica (250 x 4 mm, 5 µm de
tamanho de partícula) e pré-coluna CarbonPac PA-1 (50 x 4 mm) e dos oligossacarídeos –
fruto- e malto-oligossacarídeos com coluna analítica CarboPac PA-100 de troca iônica (250
x 4 mm, 5 µm de tamanho de partícula) e pré-coluna CarbonPac PA-100 (50 x 4 mm).
Alíquotas dos extratos foram diluídas em água deionizada (Milipori Bedford,
modelo CT Q3UV, USA) e passadas em filtros de membrana 0,22 µm, sendo transferidas a
vials antes de serem injetadas no equipamento. As condições para a separação foram:
- Monos- e dissacarídeo: Cinquenta (50) µL das amostras foram injetadas por meio do
autoamostrador. A fase móvel foi formada por solução A (NaOH 0,2 M) e B (NaOH 0,18
M), sendo as condições de corrida: vazão da fase móvel de 1 mL.min-1
, temperatura
constante em 30ºC; tempo de corrida de 22 minutos, iniciando com 10 minutos de corrida
isocrática (B), 7 minutos com 100% de A para limpeza da coluna e 5 minutos para
reequilibrar o sistema com as condições iniciais aplicadas na corrida com solução B.
- Oligossacarídeos: Vinte e cinco (25) µL das amostras foram injetadas por meio do
autoamostrador. A fase móvel foi formada por solução A (NaOH 0,1 M) e solução B
(acetato de sódio 0,5 M em NaOH 0,1M) com gradiente de acetato de sódio (NaOAc),
sendo as condições de corrida: vazão da fase móvel de 1 mL.min-1
, temperatura constante
em 30ºC; tempo de corrida de 28 minutos, iniciando com 2 minutos de corrida isocrática
97% (A) e 3% (B), 16 minutos com um gradiente linear de 3 a 40% de (B) e, após cada
corrida, 5 minutos com 100% de B para limpeza da coluna e 5 minutos para reequilibrar o
sistema com as condições iniciais aplicadas na corrida.
Padrões da marca Sigma de frutose, glicose, sacarose, kestose (GF2), nistose (GF3),
frutofuranosil-nistose (GF4), maltotriose (G3), maltotetrose (G4), maltopentose (G5),
maltohexose (G6) e heptahexose (G7) foram utilizados e a curva de calibração para
quantificação foi obtida utilizando-se dez pontos.
A identificação dos açúcares (monos- e dissacarídeo) e dos oligossacarídeos
presentes nas amostras foi realizada por meio da comparação com o tempo de retenção e
ordem de eluição de misturas de padrões autênticos. A quantificação foi realizada por meio
62
de curvas analíticas construídas por meio de uma solução mix de padrões em diferentes
concentrações (0,04 a 4 ppm – açúcares e 0,1 a 1,9 ppm – oligossacarídeos), sendo os
teores expressos em g por 100 g de amostra em base seca para os monos- e dissacarídeo e
em mg por 100 gramas para os oligossacarídeos.
4.6. Análise estatística
A análise estatística foi realizada com três repetições por análise, sendo os
resultados expressos em média±desvio-padrão. As diferenças estatisticamente significativas
entre os extratos e amostras diferentes foram feitas pelo programa STATISTICA,
versão 7.0 (STATSOFT, 2004), sendo a análise de variância (one-way ANOVA) seguida
do Teste de Tukey, ao nível de 5% (n=3; p<0,05). As correlações entre os dados obtidos da
composição fenólica e atividade antioxidante foram calculadas por meio do coeficiente de
correlação de Pearson (r).
63
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. Caracterização das amostras
A goiaba da variedade Paluma utilizada para as análises foi composta por polpa,
casca e semente, ou seja, a goiaba integral na sua forma in natura. Estimou-se que de 100%
de subproduto agroindustrial da goiaba, 18,67% era representado por sementes, 3% por
casca/pedúnculo (Figura 13), tendo maior representatividade de polpa (78,33%) que
durante a etapa de despolpamento acaba sendo descartada.
Figura 13. Subprodutos agroindustriais da goiaba “Paluma” após lavagem e separação.
(A) Subproduto agroindustrial da goiaba; (B) Sementes + casca/pedúnculo; (C) Sementes; (D)
Casca/pedúnculo.
A Tabela 10 apresenta os resultados da caracterização físico-química das amostras
determinados na primeira semana de recebimento.
O teor de sólidos solúveis (ºBrix) é uma medida que indica a maturidade e a
qualidade da fruta, sendo um fator determinante no sabor das frutas (PEREIRA, 2009), pois
originalmente refere-se ao teor de sacarose em uma solução pura, além de outras
substâncias solúveis que também alteram o índice de refração. Assim, era de se esperar que
o subproduto agroindustrial da goiaba apresentasse menor teor de sólidos solúveis totais
(3,8 ºBrix) que a fruta (11,7 ºBrix), visto que apresenta menor teor de polpa em sua
composição.
64
Tabela 10. Características físico-químicas da goiaba in natura “Paluma” e do seu
subproduto agroindustrial
Amostra Sólidos solúveis
(ºBrix) a 20ºC
pH Acidez total
titulável (%)
Goiaba in natura 11,7±0,11¹a² 4,4±0,01
b 0,45±0,01
a
Subproduto agroindustrial 3,8±0,15b 4,6±0,01
a 0,42±0,02
a
1 Média de três repetições ± desvio padrão;
2 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na coluna
diferem significativamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey
Para a goiaba in natura o resultado superou os apresentados por Silva, Magalhães e
Gonçalves (2009), 8,18 ºBrix em polpa, por Pereira et al. (2005), 7,4 a 9,20 ºBrix em polpa
com tempo de armazenamento de 1 a 29 dias, respectivamente e se apresentou dentro dos
valores expostos por Mendonça et al. (2007), entre 8 e 12 ºBrix em polpa com tempo de
armazenamento de 2 a 18 dias, respectivamente.
Para subproduto agroindustrial de goiaba não foi encontrado nenhum dado literário
a fins de comparação, no entanto devido sua baixa concentração de sólidos solúveis, este
produto poderia ser aplicado em alimentos de baixo valor calórico.
Fatores como cultivar, clima, solo, grau de maturação e métodos de irrigação podem
influenciar nos teores de sólidos solúveis em frutas (PEREIRA, 2009), refletindo nas
divergências dos resultados.
A goiaba in natura apresentou maior teor de ácidos totais tituláveis (0,45% e 0,42%,
respectivamente) do que o seu subproduto, caracterizando o seu menor pH (4,4 e 4,6,
respectivamente), contudo, somente os resultados do pH tiveram diferença significativa.
A acidez total titulável (ATT) é um parâmetro de avaliação da qualidade dos
alimentos, visto que fatores como palatabilidade, desenvolvimento microbiológico,
métodos de conservação como temperatura de esterilização e tipo de aditivos são
influenciados pelo pH do alimento (BARROS, 2011).
Mendes (2013), analisando o pH de farinha de subproduto de goiaba determinou
valor semelhante ao do presente trabalho, 4,6. Brunini, Oliveira e Varanda (2003)
encontraram valores de ATT para polpa de goiaba “Paluma” armazenada a -20ºC entre
0,405 e 0,51% e pH entre 3,15 a 4,03, já Silva, Magalhães e Gonçalves (2009)
65
determinaram 0,50% de ATT e pH 3,8 em polpa de goiaba “Paluma”, tais resultados
diferem dos apresentados na Tabela 10, possivelmente há fatores que influenciam a
composição da matéria-prima e, consequentemente, a leitura das análises, tais como, tempo
de armazenamento e preparo da amostra (polpa ou integral).
No entanto, apesar das amostras não serem polpa, os parâmetros analisados se
encontram próximos a alguns dos Padrões de Identidade e Qualidade para polpa de goiaba
estabelecido pelo Ministério de Estado da Agricultura e do Abastecimento – teores de
sólidos solúveis mínimo de 7,0ºBrix à 20ºC; pH entre 3,5 a 4,2; ATT mínimo expressa em
ácido cítrico de 0,40 g.100g-1
; (BRASIL, 2000), podendo ser utilizado para alimentação
humana.
A relação entre o teor de sólidos solúveis e o teor de ácidos orgânicos representados
pela ATT é um dos fatores que permite se avaliar a qualidade sensorial das matrizes
alimentares (PEREIRA, 2009; BARROS, 2011) bem como o grau de maturação da fruta
(CAMPOS et al., 2011) – quanto maior a relação mais elevada à doçura do produto
(PEREIRA, 2009; BARROS, 2011) e mais madura a fruta. A goiaba in natura apresentou
uma relação ºBrix/ATT igual a 26, superior ao encontrado por Pereira (2009),
aproximadamente 20. Já no subproduto agroindustrial da goiaba foi encontrada relação
igual a 9, apresentando, portanto, sabor menos adocicado que a fruta.
A Tabela 11 apresenta os resultados obtidos de rendimento após o processo de
liofilização (Figura 14), umidade e matéria seca das amostras.
Tabela 11. Valores de umidade, rendimento e matéria seca da goiaba in natura e do
subproduto agroindustrial após o processo de liofilização
Amostra Umidade (%)* Rendimento após
liofilização (%)
Matéria Seca (%)*
Goiaba in natura 85,91±0,00 17,71 14,09±0,16
Subproduto agroindustrial 64,86±0,00 39,11 35,14±0,02
*Os valores referem-se à média aritmética de três determinações, juntamente com o desvio-padrão
66
Figura 14. Aspecto visual da goiaba in natura e do subproduto agroindustrial antes da etapa de liofilização
(A) e (B), respectivamente e, após a etapa de liofilização e moagem (C) e (D), respectivamente.
O maior teor de umidade da goiaba in natura é caracterizado pela obtenção de
menor rendimento após a liofilização, o que reflete em menor quantidade de matéria seca,
ao contrário do seu subproduto que por apresentar grande quantidade de sementes em sua
composição é caracterizado por menor teor de umidade, maior rendimento após a
liofilização e, consequentemente, maior teor de matéria seca.
5.2. Composição fenólica
A identificação de novas fontes naturais e a quantificação de compostos fenólicos
(CF) em matrizes alimentares é importante por estar correlacionada com a capacidade
antioxidante atribuída ao alimento, sendo a ingestão regular de frutas e vegetais
recomendável devido à presença dos compostos antioxidantes.
Os CF devido à capacidade de doar hidrogênio ou elétrons e quelarem metais atuam
como antioxidantes, conferindo benefícios à saúde humana na prevenção de doenças
crônicas degenerativas tais como diabete, hipertensão, arteriosclerose, doenças cardíacas e
câncer. Além disso, previnem a oxidação de alguns constituintes do alimento, como os
ácidos graxos e os óleos (HAIDA et al., 2011).
A quantificação de CF por análises colorimétricas envolve uma reação de redução
dos reagentes pelos compostos fenólicos presentes na amostra com concomitante formação
67
de complexos com coloração específica cuja intensidade aumenta linearmente no
comprimento de onda do composto analisado, assim, quanto maior a intensidade da reação
maior o teor de analito na matriz.
Os teores de CF, flavonoides (FL) e taninos condensados (TC) dos extratos foram
obtidos por meio das curvas analíticas dos padrões de referência ácido gálico (EAG) – CF e
catequina – FL e TC (Figura 15) construídas de acordo com os valores de absorbância das
diferentes concentrações dos padrões e definida a equação da reta.
Figura 15. Curva analítica – (A) ácido gálico padrão de referência (n=7) para o cálculo do teor de compostos
fenólicos; (B) catequina padrão de referência (n=9) para o cálculo do teor de flavonoides e (C) catequina
padrão de referência (n=8) para o cálculo do teor de taninos.
A partir da equação da reta obtida pode-se determinar o teor de CF, FL e TC
presentes nos extratos da goiaba in natura e seu subproduto agroindustrial obtidos nos dois
diferentes métodos de extração, os quais estão apresentados na Tabela 12.
Com base nos resultados obtidos, verificou-se que houve diferença significativa no
teor de CF entre a goiaba in natura e o seu subproduto agroindustrial para os extratos
ECFSH, ECFC e EE, sendo maior no subproduto agroindustrial nos dois primeiros,
A B
C
68
implicando no teor de CF superior ao da goiaba na extração sequencial (ES). Já para FL,
apenas o ECFC apresentou diferença estatística.
Tabela 12. Teor de compostos fenólicos, flavonoides e taninos condensados de goiaba in
natura e subproduto agroindustrial de goiaba, expressa em base fresca
Extrato CF (mg ácido gálico.g-1
) FL (mg de catequina.g-1
) TC (mg de catequina.g-1
)
Goiaba Subproduto Goiaba Subproduto Goiaba Subproduto
ECFL* 2,06±0,051a2
2,28±0,27a 1,17±0,04
a 1,28±0,12
a 0,004±0,00
b 0,027±0,00
a
ECFSH 0,08±0,00b 0,18±0,00
a 0,13±0,00
a 0,13±0,01
a 0,004±0,00
a 0,003±0,00
b
ECFC 0,02±0,00b 0,14±0,01
a 0,02±0,00
b 0,08±0,01
a 0,0003±0,00
b 0,0005±0,00
a
Total ES
EE
2,16±0,05b
0,93±0,02a
2,60±0,26a
0,56±0,06b
1,32±0,03a
0,66±0,07a
1,49±0,11a
0,74±0,07a
0,0083±0,00b
0,002±0,00b
0,0305±0,00a
0,006±0,00a
*ECFL – extrato de compostos fenólicos livres; ECFSH – extrato de compostos fenólicos solúveis em
hexano; ECFC – extrato de compostos fenólicos conjugados; ES – extração sequencial; EE – extrato
hidroetanólico
1 Média de três repetições ± desvio padrão;
2 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na linha para
mesmo composto analisado diferem significativamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey
O TC se caracterizou como menor representante dos CF nas amostras, sendo o seu
maior teor no extrato ECFL do subproduto agroindustrial determinante na diferença
estatística na ES para as amostras (0,0083 e 0,0305 mg de catequina.g-1
de goiaba e
subproduto agroindustrial, respectivamente).
A maior parte dos CF totais e os analisados de ambas amostras apresentaram maior
afinidade com o solvente acetona 80%, utilizado no método de ES (fração 1 - ECFL). A
acetona é considerada um bom solvente para dissolver compostos lipofílicos com uma
gama relativamente polar (WU et al., 2004) – miscível em água com polaridade relativa
igual a 0,355 (MUROV, 2010), sendo responsável por extrair as agliconas livres e formas
glicosiladas da amostra, caracterizando os compostos fenólicos livres (SUN et al. 2002;
DEWANTO, WU, LIU, 2002).
A aplicação de solução hidroetanólica na extração de CF é uma das mais utilizadas
em frutas e outros alimentos de origem vegetal (ALOTHMAN et al., 2009; CORRÊA,
2010; MELO, 2010; SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011; CHIARI et al., 2012; MARTINEZ et
69
al., 2012; ARAÚJO et al., 2014), devido a sua facilidade de manuseio, baixa toxicidade
quando comparado com outros solventes como metanol e eficiência na extração (CORRÊA,
2010). Entretanto, nas matrizes do presente estudo tiveram menor eficiência de extração
que a acetona utilizada no método de ES.
Determinando o melhor solvente para a extração de CF, na planta Limonium
delicatulum, Medini et al. (2014) verificaram também maior eficiência em acetona 80%,
seguida de metanol 80%, etanol 90%, água e por último hexano para os CF e FL, já para os
taninos (TC) o metanol apresentou maior eficiência do que a acetona. Soares et al. (2008)
analisando o efeito dos solventes metanol, etanol e acetona em diferentes concentrações em
bagaço de maçã observaram que a extração com acetona nas concentrações de 75% e 100%
(v/v) apresentaram maior teor de compostos fenólicos (4,67 mg EAG.g–1
e 522,74 ± 4,02
mg EAG.100 g–1
, expresso em base seca) do que os demais solventes. Concordando com os
resultados obtidos no presente estudo.
A redução do teor dos CF totais e analisados nas frações obtidas na ES (ECFL,
ECFSH e ECFC) pode ser explicada pela solubilidade dos compostos conforme afinidade
com o solvente aplicado, sendo a polaridade em ordem decrescente dos solventes aplicados
na ES são acetona (0,355) > acetato de etila (0,228) > hexano (0,009) (MUROV, 2010).
Dentre os CF livres encontram-se alguns ácidos fenólicos que podem ser extraídos
em soluções aquosas-orgânicas, tais como metanol, etanol ou acetona (MIRA et al., 2008),
podendo os mesmos ácidos estarem conjugados na amostra como indicado por Soares et al.
(2008) que no bagaço de maçã gala verificaram a presença dos ácidos salicílico, gálico,
sináptico e p-cumárico tanto na fração de ácidos fenólicos livres quanto nas frações
conjugadas, sendo o ácido ferúlico, cinâmico, vanílico, caféico e elágico, considerados
nessa última fração.
A composição dos CF nos alimentos varia de acordo com a espécie, variedade,
maturidade e outros fatores, assim, para se determinar a composição exata dos diferentes
extratos fenólicos obtidos na ES, seria necessária a realização de processos cromatográficos
para identificação dos compostos de cada fração.
O teor de fenólicos para a goiaba in natura, no processo de ES, foi de 2,16 mg
EAG.g-1
, valor superior aos encontrados por Lim, Lim, Tee (2007) de 1,71 mg EAG.g-1
(base fresca) e Freire et al. (2013) de 1,24 mg EAG.g-1
(base fresca) e de acordo com
70
Thaipong et al. (2006) que encontraram valores entre 1,70 e 3,45 mg EAG.g-1
(base
fresca), sendo o teor da extração única inferior aos apresentados.
Já para o subproduto agroindustrial da goiaba os valores verificados de 2,60 (ES) e
0,56 mg EAG.g-1
(extração única) superam o exposto por Sousa, Vieira, Lima (2011) de
0,46 mg EAG.g-1
(base fresca) e por Martínez et al. (2012), 0,4 e 2,4 mg EAG.g-1
(base
fresca) em etanol absoluto e metanol:acetona, respectivamente, sendo o teor da extração
única (EU) intermediária à esses pesquisadores.
Chiari et al. (2012) analisando goiaba integral constataram teores de FL em torno de
0,8 e 0,1 mg de quercetina.g-1
em amostra seca extraídos em etanol 70% e água,
respectivamente, valores inferiores ao encontrado no presente trabalho para ES – 1,32
equivalente a 9,37 mg de catequina.g-1
em amostra seca e o valor da EU – 0,66 equivalente
a 4,68 mg de catequina.g-1
em amostra seca intermediário aos autores, apesar de serem
padrões diferentes. Enquanto Gull et al. 2012 determinaram concentrações menores, sendo
entre 0,19 a 0,46 mg de catequina.g-1
em amostra seca. Já para o subproduto agroindustrial
de goiaba, os nossos valores superaram o encontrado por Sousa et al. (2011) de 0,001 mg
de catequina.g-1
em amostra fresca.
As informações acerca de FL nos alimentos ainda são escassas mesmo a nível
mundial, sendo a carência de estudos mais proeminente no Brasil. Assim, a quantificação
desses fitoquímicos é de extrema importância para identificação de fontes naturais (SOUSA
et al., 2011) e, possível aplicação dessas em alimentos. Na goiaba e no seu subproduto
agroindustrial os FL se apresentaram como maiores representantes na composição fenólica.
Poucos estudos em goiaba integral para determinação de TC são encontrados e
nenhum para o subproduto agroindustrial. Jiménez-Escrig et al. (2001) avaliando o teor de
TC em polpa de goiaba e casca determinaram concentrações baixas como as determinadas
no presente estudo, sendo 0,010 e 0,024 mg catequina.g-1
, respectivamente. Possivelmente,
a dificuldade de se encontrar dados de pesquisas relacionadas a taninos em goiaba e
subprodutos se deve a esse teor ínfimo presente nas matrizes quando comparado com outras
frutas como o caju (1,12 a 2,14 mg catequina.g-1
), a pitanga (0,51 a 2,91 mg catequina.g-1
)
(ROCHA et al., 2011) e uva – polpa (1,70 a 2,28 mg catequina.g-1
) e casca (0,87 a 6,55 mg
catequina.g-1
) (POZZAN; BRAGA; SALIBE, 2012). No entanto, a determinação e
identificação de TC são importantes devido às diversas atividades biológicas atribuídas à
71
eles tais como antioxidante e redução de risco de doenças cardiovasculares (TIAN et al.,
2012).
As diferenças dos valores entre os autores se deve a vários fatores tais como o
gênero, a espécie, a cultivar, as condições climáticas, o estágio de maturação, a forma de
armazenamento, à complexidade dos compostos antioxidantes presentes (polaridade e
solubilidade), as metodologias de extração e/ou de quantificação aplicada, ao composto
fenólico utilizado como padrão para a quantificação dos compostos fenólicos, ao tipo de
processamento, ao tempo de estocagem, entre outros fatores.
Como exemplo de metodologia de extração que pode justificar as diferenças de
resultados tem-se condições aplicadas: por Thaipong et al. (2006) para a goiaba integral –
proporção amostra:solvente 3 g para 25 mL de metanol, mecanismo ultra-turrax,
conservação do extrato em 4ºC durante 12 horas e centrifugação a 15.000 rpm por 20
minutos; e por Martínez et al. (2012) para subproduto agroindustrial de goiaba – aplicação
de dois procedimentos, no primeiro proporção 1:20 de amostra em etanol absoluto durante
24 h à temperatura ambiente e no segundo 2,5 g de amostra agitados à temperatura
ambiente durante 60 min com 20 mL de metanol-água-HCl (50:50 v / v, pH 2) e em
seguida o resíduo da centrifugação re-extraído nas mesmas condições com 20 mL de
acetona-água (70:30 v/v), com combinação dos sobrenadantes após centrifugação por 5 min
a 3000 g. Condições totalmente diferentes dos dois tipos de extrações (EU e ES) utilizadas
no presente trabalho.
O perfil dos CF pode variar de acordo com a parte da fruta. De acordo com
Barbalho et al. (2012) os principais compostos fenólicos presentes na goiaba são ácido
ascórbico, ácido gálico, equivalentes de catequina, álcool cinamil, benzoato etílico, ß-
cariofileno, (E) -3-acetato hexenil e α-bisabolene. Já no bagaço pode-se encontrar ácido
isovanílico, ácido vanílico, ácido 2,4-dihidroxibenzóico, ácido m-cumárico, ácido gálico,
epicatequina e quercetina como reportado por Melo et al. (2011).
Os CF podem estar presentes nos alimentos na forma livre ou ligada, como
determinado pela ES. Pouco se pesquisam sobre os compostos fenólicos ligados ou
conjugados nas determinações dos teores dos fenólicos totais, de modo geral, a
determinação de compostos fenólicos totais é mais utilizada.
72
Os fenólicos conjugados são compostos de baixo peso molecular, solúveis em água,
presentes no citosol, ou formas lipossolúveis, relacionadas às ceras da superfície da planta,
podendo ser encontrados sob a forma de ésteres e amidas, raramente ocorrendo como
glicosídeos (MIRA et al., 2008).
Os CF conjugados podem ser liberados dos compostos que estão ligados como a
lignina, pectina e proteínas estruturais, por exemplo (ACOSTA-ESTRADA; GUTIÉRREZ-
URIBE; SERNA-SALDÍVAR, 2014), por meio de processos alcalinos, ácidos ou
tratamentos enzimáticos das amostras (LIYANA-PATHIRANA; SHAHIDI, 2006). Na ES
para a goiaba in natura e seu subproduto agroindutrial foi utilizado solução de NaOH a fim
de se promover a hidrólise das ligações fenólicos-compostos ligantes e assim liberar os
compostos conjugados para mensurar a sua capacidade antioxidante, como sugerido por
Sun et al. (2002) e Dewanto, Wu e Liu (2002).
No ser humano os CF conjugados, por resistirem as ações da acidez do estômago
humano e a digestão no intestino delgado, atingem o cólon de forma intacta, sendo sua
bioatividade melhor aproveitada à saúde (SUN et al., 2002). Alguns estudos mostraram que
os CF conjugados de caráter insolúvel têm demonstrado capacidade antioxidante
significativamente maior em comparação com livres e conjugados solúveis (ACOSTA-
ESTRADA; GUTIÉRREZ-URIBE; SERNA-SALDÍVAR, 2014).
Assim, a determinação tanto dos CF livres quanto dos conjugados permite uma
estimativa mais concisa da composição fenólica, que por métodos cromatográficos poderia
ser caracterizada e se realizar um estudo da importância de cada um.
A goiaba e seu subproduto agroindustrial tiveram maior representatividade de CF de
caráter livre (ECFL) do que conjugados (ECFC) (Tabela 12). Em frutas a forma livre
solúvel tem maior representatividade, resultado obtido por uma pesquisa realizada por Sun
et al. (2002) que determinaram o teor de CF livres e conjugados em maçã, banana, uva
vermelha, laranja, limão, morango, pêssego e pera. Dewanto, Wu e Liu (2002) já
verificaram maior teor de compostos conjugados em milho doce, o que demonstra que cada
matéria-prima é caracterizada por diferentes proporções de compostos fenólicos.
A aplicação de calor na fruta também é outro fator que influencia na composição
dos compostos antioxidantes (CHIPURURA; MUCHUWETI; MANDITSERAA, 2010). O
subproduto agroindustrial utilizado foi obtido da goiaba após selecionada, higienizada,
73
triturada e mantida por alguns minutos em tanque cozedor, onde é realizado o
branqueamento com água potável à temperatura entre 90 a 95ºC, com o objetivo de facilitar
o despolpamento e separação dos “resíduos”.
Granito, Brito e Torres (2007) afirmam que os processos como a cocção podem
promover modificações nos anéis aromáticos dos compostos fenólicos, levando a reações
de polimerização ou degradações estruturais, o que influencia na redução do teor de
fenólicos, o que pode supor que o subproduto agroindustrial pode apresentar maior teor de
compostos fenólicos do que o encontrado.
No entanto, infelizmente não existe um consenso sobre como o processamento
térmico influencia na qualidade dos produtos ricos em CF totais e sua atividade
antioxidante. Diversos estudos demonstraram os efeitos, os quais são variados, por
exemplo, em pimenta pungente (Capsicum annuum), feijão (Phaseolus vulgaris), brócolis
(Brassica oleracea), espinafre (Spinacia oleracea), milho (Zea mays) e berinjelas roxas a
fervura, o cozimento e a ação do micro-ondas promoveram aumento na capacidade
antioxidante e conteúdo fenólico total das matrizes, provavelmente devido o rompimento da
parede celular e liberação dos compostos antioxidantes. Enquanto que em tomate
(Lycopersicon esculentum), alho (Allium sativum) e pimentas não pungentes (Capsicum
annuum) os processos de cozinhar, assar e fritar promoveram efeitos negativos
(CHUMYAM et al., 2013). Já Dewanto, Wu e Liu (2002) verificaram que o tratamento
térmico promoveu aumento no teor dos compostos fenólicos livres e redução nos
conjugados em milho doce, provavelmente a redução pode ser explicada pelo fato do
aquecimento úmido hidrolisar os constituintes celulares da matriz e liberar os compostos
fenólicos e componentes de ligamento, aumentando o teor de CF livres.
De modo geral, o subproduto agroindustrial da goiaba apresentou maior teor de CF
do que a goiaba in natura, com exceção do extrato hidroetanólico. Alguns estudos revelam
que os subprodutos do processamento de certos frutos apresentam maior quantidade de
fitoquímicos antioxidantes do que a polpa (AJILA et al., 2007; NASCIMENTO; ARAÚJO;
MELO, 2010; NURLIYANA et al., 2010; HUBER et al., 2012). Hassimotto, Genovese e
Lajolo (2005) verificaram em goiaba vermelha quantidade de fenólicos totais da polpa de
1,24 mg.g-1
e na casca desta fruta de 4,20 mg.g-1
.
74
Estudos com os CF extraídos de goiaba têm demonstrado que a fruta pode ser
considerada uma fonte natural de antioxidante (HAIDA et al., 2011), sendo, assim, o
subproduto obtido de seu processamento – subproduto agroindustrial, por apresentar teor
considerável de compostos fenólicos, também, pode ser indicado como um produto natural
de antioxidantes. No entanto, há a necessidade de mais estudos para testar a eficácia da
ação antioxidante dos seus compostos fenólicos, principalmente, em estudos in vivo.
5.3. Ensaios de atividade antioxidante
5.3.1. Atividade sequestrante do radical livre DPPH
Os resultados do ensaio DPPH podem ser expressos de três maneiras – IC50, µmol
de Trolox por grama de amostra ou porcentagem de inibição, sendo o IC50 muito expresso
em pesquisas científicas. O IC50 representa a concentração mínima necessária de uma
amostra/extrato com os compostos bioativos de interesse para conduzir a uma redução de
50% dos radicais DPPH• presentes na matriz analisada (PRADO, 2009).
Analisando-se a Tabela 13, verifica-se que o extrato de CF livres (ECFL) do
subproduto agroindustrial da goiaba apresentou o menor valor de concentração necessária
para reduzir em 50% a ação do radical DPPH• (0,90 mg.mL-1
), ou seja, comparado com os
demais extratos apresentou melhor potencial em sequestrar os radicais livres DPPH.
A goiaba é considerada uma planta fitoterápica devido os componentes ativos
presentes em sua composição, sendo várias partes da planta já aplicadas na medicina
tradicional relacionadas a tratamentos contra a malária, gastroenterite, vómitos, diarreia,
disenteria, feridas, úlceras, dor de dentes, tosse, dor de garganta, anti-bacteriano
(Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, e Bacillus cereus), gengivas
inflamadas, diabetes, hipertensão e obesidade (BISWAS et al., 2013). Um estudo com seres
humanos verificou que o consumo da fruta por um período de 12 semanas promoveu a
redução em 8% da pressão sanguínea, em 9% dos níveis de colesterol total e aumentou os
níveis HDL-c (BARBALHO et al., 2012).
Prado (2009) analisando polpa de goiaba verificou que 2,36 mg.mL-1
do extrato
hidroetanólico 80% da polpa liofilizada conduziu a uma redução de 50% dos radicais
DPPH• no ensaio. Já Freire et al. (2013) determinaram um valor de IC50 em extrato
75
acetônico-etanólico de goiaba in natura de 2,57 mg.mL-1
e em extrato acetônico-
metanólico 2,09 mg.mL-1
, expressos em base fresca, tais concentrações mínimas foram
próximas ao encontrado para o extrato ECFL (2,07 mg.mL-1
) e inferiores ao EE (6,93
mg.mL-1
).
Tabela 13. Valor do IC50 (mg.mL-1
) dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial da goiaba, expressa em base fresca
Amostra IC50¹
Goiaba in natura Subproduto agroindustrial
ECFL* 2,07 0,90
ECFSH n.d 193,29
ECFC 1.843,66 38,17
EE 6,93 7,44
*ECFL – extrato de compostos fenólicos livres; ECFSH – extrato de compostos fenólicos solúveis em
hexano; ECFC – extrato de compostos fenólicos conjugados; EE – extrato hidroetanólico; IC50 – concentração
em mg.mL–1
de extrato necessária para inibir 50% dos radicais DPPH.
n.d. = não determinado
1O valor IC50 foi obtido por meio da média de três replicadas de pelo menos sete diferentes concentrações de
extratos
Em subprodutos do processamento de goiaba alguns estudos apontam valores de
IC50 menores que o da fruta, 1,71 mg.mL-1
– goiaba integral (LIM; LIM; TEE, 2007), 0,142
mg.mL-1
– subproduto em base fresca (SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011) e 0,169 mg.mL-1
–
subproduto em base seca (ARAÚJO et al., 2014), indicando que o subproduto apresenta
maior potencial antioxidante, o que condiz com os resultados apresentados na tabela 13,
com exceção do EE, onde a fruta apresentou melhor potencial.
Os IC50 referentes aos extratos ECFC e ECFSH se apresentaram maior ao da
literatura. Pelo fato de serem frações obtidas da ES, devido ao processo de extração
exaustiva a tendência de se extrair os CF com afinidade pelos solventes é reduzida, assim,
espera-se mesmo que sejam necessários maiores teores dos extratos para redução de 50%
dos radicais DPPH•. Devido ao efeito de matriz do ECFSH da goiaba, ou seja, presença de
possíveis substâncias interferentes extraídas com o solvente hexano, tais como carotenoides e
76
lipídeos ou até mesmo a característica de turbidez do extrato, não foi possível se determinar
o seu IC50 desse extrato na goiaba in natura.
Os extratos obtidos pela extração única, também apresentaram maiores
concentrações de extrato para obtenção do IC50 ao da literatura. No entanto, devido a
fatores extrínsecos como tipo de solvente extrator, proporção solvente e amostra, tempo de
extração, mecanismo de extração, número de etapas de extração e fatores intrínsecos como
variedade da amostra e tipo de cultivo e estágio de maturação do fruto a comparação
precisa dos dados obtidos com os apresentados em pesquisas científicas se torna
inadequada.
A atividade antioxidante de extratos também pode ser expressa em função do
Trolox, que é um antioxidante sintético análogo à vitamina E, sendo utilizado como
referência para a capacidade antioxidante de uma mistura complexa. Para o cálculo da
atividade antioxidante dos extratos foi construída uma curva analítica de Trolox (Figura 16)
de acordo com os valores de porcentagem de inibição do radical DPPH• de concentrações
seriadas de Trolox.
Figura 16. Curva analítica do Trolox padrão de referência (n = 11) para capacidade antioxidante de sequestro
do radical DPPH ABTS e seu coeficiente de correlação linear (R²).
A partir da equação da reta gerada pela curva analítica calculou-se a atividade
antioxidante das amostras pelo ensaio DPPH, expressa em µmol de Trolox equivalente por
grama de amostra em base fresca (µmol TE.g–1
), o qual é definido como a concentração de
77
Trolox que apresenta o mesmo percentual de inibição que uma concentração de 1 mM do
composto de referência, desse modo, quanto maior o valor equivalente ao Trolox (TE),
mais forte é a capacidade antioxidante da matriz alimentar (SOUSA; VIEIRA; LIMA,
2011).
Os resultados da capacidade de sequestro do radical DPPH de cada extrato exibidos
na Tabela 14 permitem verificar que os extratos referentes ao subproduto agroindustrial da
goiaba apresentaram melhor capacidade de sequestro do radical DPPH• nos extratos
obtidos pelo método de ES do que a goiaba in natura no mesmo método.
Tabela 14. Atividade antioxidante dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial da goiaba, expressa em base fresca, pelo método do sequestro do radical livre
DPPH•
Amostra µmol TE.g–1
Goiaba in natura Subproduto agroindustrial
ECFL* 14,68±0,421b2
23,35±0,24a
ECFSH 0,23±0,03b 0,73±0,02
a
ECFC 0,03±0,00b 0,46±0,00
a
Total ES 14,94±0,42b 24,54±0,23
a
EE 6,36±0,56a 3,84±0,04
b
*ECFL – extrato de compostos fenólicos livres; ECFSH – extrato de compostos fenólicos solúveis em
hexano; ECFC – extrato de compostos fenólicos conjugados; EE – extrato hidroetanólico; ES – soma da
atividade antioxidante dos extratos obtidos da extração sequencial
1 Média de três repetições ± desvio padrão;
2 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na linha diferem
estatisticamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey
Levando-se em consideração que os extratos que obtiveram maior capacidade
antioxidante foram os extratos de compostos fenólicos livres (ECFL) e extrato
hidroetanólico (EE), escolheram-se estes extratos para tornar possível à comparação dos
resultados dos valores de atividade antioxidante obtidos dos extratos entre as amostras,
sendo os resultados apresentados em atividade antioxidantes – % de inibição. As
78
concentrações utilizadas para a comparação entre as amostras de mesmo extrato foi de 3,33
mg.mL-1
(Figura 17).
Figura 17. Atividade antioxidante (%) dos extratos de goiaba in natura e subproduto agroindustrial da goiaba
na concentração 3,33 mg.mL-1
, em base fresca, pelo método do sequestro do radical livre DPPH (média ±
desvio padrão, mínimo n = 3).
ECFL – extrato de compostos fenólicos livres obtido pelo método de extração sequencial; EE – extrato
hidroetanólico; Letras minúsculas diferentes para amostras diferentes em mesmo tipo de extrato diferem
significativamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey.
Conforme na Figura 17, o ECFL do subproduto agroindustrial da goiaba apresentou
melhor atividade frente ao radical DPPH• que o extrato da fruta in natura, sendo próxima a
90%, já na extração com etanol, a goiaba in natura apresentou maior porcentagem de
inibição do DPPH•, o que era de se esperar visto que no EE a goiaba apresentou maior teor
de CF do que seu subproduto.
Melo et al. (2008) classificaram a força da atividade dos extratos de frutas de acordo
com a porcentagem de inibição. Atividades acima de 70% foram consideradas eficazes no
sequestro do radical livre DPPH, entre 50 e 70%, ação moderada e abaixo de 50%, ação
fraca. Na concentração 3,33 mg.mL-1
apenas os extratos ECFL das amostras apresentaram
atividade antioxidante classificada como eficaz no ensaio DPPH, os demais podem ser
considerados com ação fraca. Ongphimai et al. (2013) analisando a capacidade antioxidante
79
de extrato de goiaba por ensaio de radical livre DPPH verificaram também porcentagens de
inibição baixas, sendo de 22% para os CF insolúveis e 20% para os solúveis. Os autores
sugeriram que possivelmente a baixa atividade determinada se deve à lenta taxa de reação
entre as moléculas de DPPH e dos fenólicos de extrato de goiaba.
Alguns estudos comprovaram que o subproduto do processamento da goiaba (casca,
sementes e bagaço) pode ser uma potencial fonte de fitoquímicos com ação preservativa ou
nutracêutica (MELO, 2010), por possuírem também alta capacidade de sequestro de
radicais livres, sendo fontes importantes de agentes antioxidantes primários, contribuindo
com o controle do peso corporal e distúrbios bioquímicos como glicemia, dislipidemia,
hipertensão e outros riscos de doenças cardiovasculares (BARBALHO et al., 2012), além
de atuarem como antimicrobianos (MELO, 2010), sendo de grande importância para a
indústria de alimentos (MELO et al., 2011).
De modo geral, o subproduto agroindustrial da goiaba apresentou maior potencial
antioxidante, visto que para a maioria dos extratos sua capacidade superou ao da goiaba, no
entanto, o tipo de extração alterou o quadro, pois no extrato somente com solução
hidroetanólica a goiaba demonstrou maior capacidade em estabilizar o radical DPPH•.
Apesar do ensaio DPPH ser prático, devido à interação do agente antioxidante com
o radical DPPH ser dependente da conformação estrutural do CF, que influencia na reação
de alguns compostos de forma mais rápida que outros (PRADO, 2009), se torna necessário
a caracterização dos intermediários e os produtos de reação, além da separação e
identificação dos compostos envolvidos na capacidade antioxidante por meio de métodos
cromatográficos, a fim de se obter melhor interpretação dos resultados apresentados.
Deve-se lembrar também de outros fatores que podem influenciar nos resultados da
atividade antioxidante como os fatores extrínsecos e intrínsecos como já citados neste
tópico.
5.3.2. Atividade antioxidante pelo método ABTS
O ensaio antioxidante ABTS apresenta vantagens de aplicação como simplicidade
técnica, reprodutibilidade, diversidade e uso flexível em múltiplos meios para determinar
tanto a capacidade antioxidante hidrofílica e lipofílica de extratos alimentares, devido à
80
solubilidade do reagente/radical em meios aquosos e solventes orgânicos (APAK et al.,
2007).
Utilizando a curva analítica de Trolox padrão referência e a equação da reta gerada
(Figura 18) foram possíveis obter os resultados da atividade antioxidante pelo ensaio
ABTS•+
que estão expressos em µmol TE.g–1
de amostra em base fresca (Tabela 15).
Figura 18. Curva analítica do Trolox padrão de referência (n = 8) para capacidade antioxidante de sequestro
do radical ABTS e seu coeficiente de correlação linear (R²).
Tabela 15. Atividade antioxidante dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial de goiaba, expressa em base fresca, pelo método ABTS
Amostra µmol TE.g–1
Goiaba in natura Subproduto agroindustrial
ECFL* 22,50±1,15¹a2
23,92±0,72a
ECFSH 0,75±0,02a 0,21±0,02
b
ECFC 0,03±0,00b 0,58±0,02
a
Total ES 23,28±1,16a 24,71±0,75
a
EE 6,20±0,21a 3,16±0,26
b
*ECFL – extrato de compostos fenólicos livres; ECFSH – extrato de compostos fenólicos solúveis em
hexano; ECFC – extrato de compostos fenólicos conjugados; EE – extrato hidroetanólico
1 Média de três repetições ± desvio padrão;
2 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na linha diferem
estatisticamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey
81
Diferente da capacidade antioxidante medida pelo ensaio DPPH, os extratos ECFL
da goiaba in natura e do seu subproduto não tiveram diferença significativa e o extrato
ECFSH da goiaba apresentou melhor potencial no sequestro do radical ABTS•+
do que o
subproduto, o que determinou diferença não significativa na ES entre as amostras, 23,28 e
24,71 µmol TE.g–1
, goiaba e subproduto respectivamente.
Verificou-se que no ensaio ABTS a goiaba no processo de ES (23,28 µmol TE.g–1
)
apresentou maior potencial antioxidante do que no ensaio DPPH (14,94 µmol TE.g–1
).
Apesar destes ensaios possuírem o mesmo princípio baseado na transferência de elétrons
pelo antioxidante ao radical livre, pode-se supor que a diferença se deve ao tipo de solvente
e polaridade utilizado em cada ensaio que pode influenciar nessa transferência
(BERGAMASCHI, 2010). O composto ABTS apresenta boa solubilidade em soluções
aquosas e orgânicas. No ensaio ABTS a água deionizada foi utilizada como solvente para
diluição dos extratos prontos, já no DPPH foi o metanol, provavelmente os compostos
hidrofílicos presentes nos extratos apresentaram melhor afinidade com a água (polaridade
igual a 1) do que no metanol (polaridade igual a 0,762) (MUROV, 2010), refletindo no
maior potencial no ensaio ABTS. Entretanto, devido às particularidades dos métodos há
dificuldade quanto à comparação dos resultados entre os diferentes ensaios, assim como
observado por Pazinatto (2008).
Thaipong et al. (2006) determinaram pelo ensaio ABTS atividade antioxidante em
extrato metanólico de polpa de goiaba igual a 31,1 µmol TE.g–1
, expresso em base fresca, já
Freire et al. (2011) encontraram potencial antioxidante em goiaba utilizando extrato
hidroetanólica - 96,10 µmol TE.g–1
e extrato hidrometanólica - 152,79 µmol TE.g–1
. Em
subprodutos agroindustriais de goiaba, Sousa; Vieira; Lima (2011) encontraram valores em
extrato hidroetanólico igual a 421 µmol TE.g–1
e aquoso, a 148 µmol TE.g–1
, expressos em
base fresca, já Martínez et al. (2012), 1,9 µmol TE.g–1
em extrato hidroetanólico e 15,4
µmol TE.g–1
hidrometanólico.
Apesar de alguns desses autores utilizarem o mesmo tipo de solvente na obtenção de
seus extratos, há diferença em seus resultados, visto que o mecanismo de extração, tamanho
da amostra, proporção amostra e solvente e outros fatores intrínsecos a matriz alimentar
(tipo, variedade, grau de maturação, condições edafoclimáticas de cultivo, entre outros)
82
influenciam na extração dos fenólicos envolvidos na ação antioxidante, dificultando a
comparação com nossos resultados.
5.3.3. Ensaio da Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio (ORAC)
O ensaio ORAC em relação aos métodos DPPH e ABTS apresenta a vantagem de se
utilizar o radical peroxila o qual está relacionado com a oxidação lipídica livre, estando
estreitamente envolvido em funções biológicas de quebra de cadeia
(MAHATTANATAWEE et al., 2006).
Para a determinação da atividade antioxidante dos extratos pelo método ORAC foi
necessária à construção de duas curvas analíticas com o padrão de referência Trolox
(Figura 19), por ser um ensaio que permite a determinação da capacidade antioxidante tanto
de compostos hidrofílicos quanto lipofílicos (RIBEIRO, 2011), assim como o ensaio ABTS
por ser solúvel também em solventes aquosos e orgânicos (APAK et al., 2007). As curvas
foram construídas de acordo com os valores de áreas sob a curva de decréscimo (AUC) da
perda de fluoresceína das diferentes concentrações de Trolox.
Figura 19. Curva analítica do Trolox padrão de referência (n = 9) para capacidade antioxidante determinada
pelo ensaio ORAC hidrofílico (A) e lipofílico (B) e seus respectivos coeficientes de correlação linear (R²).
A Tabela 16 apresenta os resultados obtidos por meio da curva de referência sendo
expressos em µmol TE.g-1
. Todos os extratos apresentaram ação antioxidante contra os
radicais peróxidos, sendo a atividade antioxidante dos diferentes extratos do subproduto
agroindustrial da goiaba maior que os da goiaba in natura com exceção do extrato de
A B
83
compostos fenólicos conjugados (ECFC) lipofílico que foi menor e para o hidrofílico não
houve diferença significativa.
Tabela 16. Atividade antioxidante dos extratos de goiaba in natura e subproduto
agroindustrial de goiaba pelo ensaio ORAC, expressos em µmol TE.g–1
, em base fresca
Amostra Goiaba in natura Subproduto agroindustrial
ORAC
hidrofílico
ORAC
lipofílico
ORAC
hidrofílico
ORAC
lipofílico
ECFL* 17,33±1,32¹b² 20,59±0,52
b 27,86±0,00
a 40,23±0,96
a
ECFSH 3,43±0,24b 55,06±4,59
b 8,75±0,18
a 78,66±5,99
a
ECFC 7,84±0,72a 10,07±0,93
a 8,42±0,05
a 7,40±0,07
b
Total ES 28,60±0,66bB
85,72±3,46bA
45,03±0,18aB
126,29±3,53aA
EE 9,84±1,09bA
8,24±0,28bB
13,54±0,19aA
12,67±0,03aB
*ECFL – extrato de compostos fenólicos livres; ECFSH – extrato de compostos fenólicos solúveis em
hexano; ECFC – extrato de compostos fenólicos conjugados; EE – extrato hidroetanólico
1 Média de três repetições ± desvio padrão;
2 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na linha para
mesmo tratamento e distintas amostras, e letras maiúsculas diferentes para mesma amostra e tratamentos
distintos na linha diferem estatisticamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey
Analisando a Tabela 16 observou-se que na ES os fenólicos de caráter lipofílico
demonstraram maior potencial antioxidante frente aos hidrofílicos, ao contrário da extração
com solvente hidroetanólico. De acordo com Deng et al. (2012), casca e sementes de
goiaba apresentam maior composição de componentes fenólicos solúveis em gordura (5,55
e 1,34 mg EAG.g-1
, respectivamente) do que CF hidrofílicos (1,71 e 0,34 mg EAG.g-1
,
respectivamente). O que pode explicar a predominância da ação antioxidante dos
compostos lipofílicos tanto da goiaba in natura quanto do seu subproduto bem como o
maior potencial desses compostos no subproduto (126,29 e 12,67 µmol TE.g–1
, ES e EU,
respectivamente) do que na goiaba (85,72 e 8,24 µmol TE.g–1
, ES e EU, respectivamente),
visto que a proporção de sementes e cascas no subproduto agroindustrial é maior que na
fruta in natura. No entanto, a fim de se afirmar com maior certeza essa relação seria
84
necessário caracterizar a composição fenólica dos nossos extratos por meio de técnicas
cromatográficas.
Os resultados apontados são confirmados pela área da curva de decréscimo da
intensidade de fluorescência (Figura 20).
Figura 20. Área de decaimento da intensidade dos extratos em relação ao branco no ensaio ORAC para
compostos fenólicos hidrofílicos e lipofílicos.
*ECFLR – extrato de compostos fenólicos livres do subproduto de goiaba; ECFLG – extrato de compostos
fenólicos livres da goiaba in natura; EER – extrato hidroetanólico de compostos fenólicos do subproduto de
goiaba; EEG – extrato hidroetanólico da goiaba in natura.
Como a perda da intensidade da fluoresceína não é linear com o tempo e sim
exponencial utiliza-se a área sob a curva de decréscimo (AUC) para esse ensaio
(PEREIRA, 2009). O maior tempo de retardamento da queda da intensidade da
fluorescência no ensaio indica maior eficiência do antioxidante em transferir átomos de
hidrogênio ao radical peroxila e, assim, inibir a velocidade de reação de perda da
intensidade da fluoresceína. Adotando-se apenas os extratos de CF livres das amostras que
obtiveram maior atividade antioxidante que os demais extratos obtidos da ES e os extratos
hidroetanólicos das amostras, a efeito de comparação, verificou-se melhor atividade
antioxidante nos extratos de CF livres do subproduto do processamento da goiaba (ECFLR)
que a partir dos 40 minutos começou a ter maiores decréscimos da fluorescência, tanto no
ensaio hidrofílico como lipofílico.
85
Observou-se grande diferença entre as atividades antioxidantes determinadas nos
extratos nos diferentes ensaios – DPPH, ABTS e ORAC. Devido os diferentes princípios,
tipos de solventes, proporções extrato e solvente, e afinidades químicas entre radicais e
antioxidantes as variações podem ser justificadas. No entanto, pode-se afirmar que o ensaio
ORAC apresentou resultados mais expressivos, visto que o uso de solventes – tampão
fosfato de potássio 75 mM e RMCD 7% - como solventes dos extratos permitem a quantificação
de CF hidrofílicos e lipofílicos, respectivamente, presentes nas amostras, o que explica a
maior atividade antioxidante determinada pelo ensaio, sendo de grande importância à
aplicação do método ORAC em análises in vitro, além dos demais métodos de
determinação antioxidante visto que utiliza fonte radical relevante à biologia humana
(peroxila), o qual está envolvido em sistemas biológicos, assim como o oxigênio atômico, o
superóxido, e espécies reativas de nitrogênio (WU et al., 2004), possuindo eficácia como
antioxidantes em análises in vivo (HAYTOWITZ; BHAGWAT, 2010).
Um estudo publicado pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
(USDA, 2007) mostrou que a goiaba vermelha apresenta atividade antioxidante de 19,90
µmol TE.g-1
determinada pelo ensaio ORAC. Mahattanatawee et al. (2006) determinaram
menor atividade, 16,7 µmol TE.g-1
, já Thaipong et al. (2006) reportaram valor igual a 21,3
µmol TE.g-1
em polpa goiaba. Tais valores se apresentaram inferiores aos encontrados no
presente estudo para goiaba in natura, provavelmente devido à parte da amostra, preparo da
amostra, determinação apenas dos compostos hidrofílicos, entre outras variáveis. Para
subproduto do processamento de goiaba nenhum estudo foi encontrado.
Desse modo, mais uma vez verifica-se grande dificuldade em comparar tanto os
resultados de diferentes métodos quanto de mesmo ensaio visto à complexidade e
diversidade dos compostos antioxidantes e as peculiaridades das metodologias que diferem
quanto ao solvente, mecanismo de reação, diferentes condições de análise, como já
discutido. Além disso, de acordo com Oliveira et al. (2011) a comparação do potencial
antioxidante dos métodos realizados não pode ser realizada em valores absolutos visto que
cada método tem uma escala de valores específicos, sendo necessários padronização e
estabelecimentos de critérios para obtenção de resultados possíveis de comparação tais
como aplicação de moléculas biologicamente relevantes; adaptabilidade do método para
86
ensaios de antioxidantes hidrofílicos e lipofílicos; boa reprodutibilidade; e mecanismos
químicos bem definidos.
Assim, devido a essa diversidade de fundamentos, tipos de compostos e ensaios
antioxidantes nenhum método isolado permite a obtenção exata da atividade antioxidante
total de um extrato ou matriz alimentar, sendo a realização de duas ou mais técnicas melhor
para inferir com maior segurança o potencial do extrato ou alimento.
5.3.4. Influência do tipo de extração na obtenção de compostos antioxidantes
As propriedades biológicas dos CF bem como efeitos funcionais à saúde
intensificaram esforços de investigação de métodos mais eficazes de extração, separação e
identificação a partir de fontes naturais para aplicação desses compostos em alimentos,
sendo a extração uma etapa de extrema importância no estudo dos compostos, os quais
podem determinar os resultados obtidos nas etapas (quantificação, atividade antioxidante)
posteriores a essa.
No processo de extração diversos fatores podem influenciar nos teores dos
compostos obtidos tais como temperatura, proporção líquido-sólido, taxa de fluxo do
tamanho de partícula, tipo de composto (IGNAT et al., 2011).
Devido às diversidades de CF e suas diferentes interações com os solventes não há
um único método e padrão universal adequado para extração dos CF em plantas.
A solubilidade dos CF em um solvente é uma característica do composto bioativo
vinculada ao seu peso molecular (PELLEGRINI et al., 2007), a polaridade dos fenólicos,
além do grau de polimerização, da interação com outros constituintes (APAK et al., 2007) e
ao tipo de grupos funcionais como –OH e –COOH e, é devido à diversidade desses
compostos nos alimentos com distintas propriedades que os métodos para avaliar o
potencial antioxidante dos alimentos são fortemente influenciados pelos solventes
utilizados durante a extração (PELLEGRINI et al., 2007).
Algumas classes de compostos fenólicos, como ácidos fenólicos e ácidos
hidroxicinâmicos, flavonoides e carotenoides, para serem extraídos necessitam da aplicação
de ordem decrescente de polaridade do solvente, podendo a combinação de polaridades
distintas ser aplicada para fins específicos (APAK et al., 2007).
87
Os solventes mais utilizados para a extração de CF em alimentos por ordem de
polaridade decrescente são água, metanol 80% ou etanol a 70%, 80%, acetona e acetato de
etila (APAK et al., 2007). A concentração e sua eficácia dependem de fatores como a
polaridade dos fitoquímicos presentes na amostra, do grau de polimerização e da interação
com outros constituintes (CAETANO et al., 2009).
Para a extração de CF dois tipos podem ser realizados – a extração única (EU) e a
extração sequencial (ES). Nos procedimentos de EU, o metanol é o solvente mais eficiente
para extração de CF, entretanto, o etanol por ser mais seguro que o metanol a saúde
humana, tem maior preferência na indústria de alimentos (IGNAT et al., 2011), o que
conduziu a aplicação do etanol na extração única realizada no presente trabalho.
No entanto, levando-se em consideração que os vegetais apresentam classes de CF
variadas com estruturas químicas e polaridades distintas, o método de ES por utilizar a
mesma amostra para extração dos fenólicos com solventes de diferentes graus de polaridade
possibilita uma melhor e mais eficiente extração dos compostos diferentes de forma
exaustiva (CAETANO et al., 2009) – compostos livres e conjugados (DEWANTO; WU;
LIU, 2002; SUN et al., 2002), ou seja, uma melhor estimativa dos teores dos CF presentes
na matriz alimentar, principalmente de alguns dos compostos que se apresentam ligados em
compostos nas plantas, sendo muitas vezes sua quantificação excluída de análises de
extração única, resultando num teor de fenólicos subestimados (BALASUNDRAM;
SUNDRAM; SAMMAN, 2006).
Fato comprovado nos resultados apresentados no presente estudo, onde a ES
mostrou maior eficiência na extração dos compostos fenólicos analisados presentes na
goiaba e em seu subproduto agroindustrial, culminando na maior atividade antioxidante
avaliada pelos ensaios DPPS, ABTS e ORAC (Figura 21), visto que abrange maior gama de
CF presentes nas matrizes, o que mostra a importância de extrair o máximo possível os
compostos bioativos de polaridade diferentes por esse tipo de extração (MELO et al.,
2008).
88
Figura 21. Teor de (A) compostos fenólicos e (B) flavonoides (C) taninos e atividade antioxidante pelos
ensaios (D) DPPH, (E) ABTS e (F) ORAC em goiaba in natura e subproduto agroindustrial de goiaba, em
base fresca (média ± desvio padrão, mínimo n = 3).
¹ Média da soma dos extratos do ensaio ORAC hidrofílico e lipofílico; Extração sequencial – soma dos
extratos de compostos fenólicos livres (ECFL), de compostos fenólicos solúveis em hexano (ECFSH) e de
compostos fenólicos conjugados (ECFC); Extração única – extração com etanol 90% (v/v); Letras minúsculas
diferentes entre as extrações distintas da mesma amostra diferem significativamente (p ≤ 0,05) pelo teste de
Tukey.
Existem várias combinações de solventes orgânicos para a ES. Para a obtenção de
CF em maçã liofilizada foram utilizados hexano para remoção carotenóides, metanol para
A B
D
E F
C
89
ácidos orgânicos e CF de baixo peso molecular e acetona aquosa para polifenóis
polimerizados (DAI; RUSSELL; MUMPER, 2010). Aparício-Fernandez et al. (2005) já
apresentaram uma avaliação mais profunda da composição fenólica em variedades de
feijão, separando os polifenóis por cromatografia líquida a vácuo em sílica gel com éter de
petróleo, éter de petróleo + acetato de etila; acetato de etila; 16 combinações diferentes de
acetato de etila + metanol/água; metanol/água; metanol e água, obtendo 6 frações principais
por recombinação adjacentes de subfrações de composição similar, as quais possuíam a
seguinte composição: F2 – proantociandinas (85% de catequinas e epicatequinas), F3 –
proantociandinas (61,9%), antiocianinas (12,6%) e flavonóides (16,6%), F4 –
proantociandinas (17,5%), antiocianinas (56,2%), F5 – proantociandinas (7,3%),
antiocianinas (17,7%) e F6 – 8,2% de proantociandinas e 16,5% de antocianinas.
A ordem de eficiência de solvente na extração dos CF para o ES em goiaba e
subproduto agroindustrial foi acetona 80% > hexano > acetato de etila, sendo o teor obtido
na extração única com etanol 90% entre hexano e acetona 80%.
A eficiência da acetona, na extração de fenólicos totais, também foi constatada por
Caetano et al. (2009) ao evidenciarem que, em subproduto agroindustrial de acerola, a
acetona 80% extraiu a maior quantidade destes compostos, quando comparada com
metanol, 80%, etanol 80% e água. Entretanto, se a ordem de aplicação dos solventes for
alterada, é possível que a maior eficiência da solução de acetona na extração possa ser
diferente.
Alothman et al.(2009) ao quantificarem o teor de CF em polpa de goiaba com
diferentes solventes (metanol, etanol, acetona e água) e em diferentes concentrações (50, 70
e 90%) verificaram que a acetona 90% conseguiu extrair com maior eficiência os CF
presentes na amostra (1,91 mg EAG.g-1
), seguida do etanol 90% (1,85 mg EAG.g-1
), do
metanol 70% (1,55 mg EAG.g-1
) e da água (1,53 mg EAG.g-1
), condizendo com os
resultados obtidos no presente trabalho. O solvente acetona utilizado no estudo teve
concentração de 80% o que pode explicar a diferença do teor CF ao comparar com o
resultado dos autores, além dos fatores como mecanismo de extração, tempo de extração,
relação amostra e solvente, cultivar da matéria-prima, entre outros.
Alguns estudos verificaram resultados diferentes em vegetais, sendo a ordem de
eficiência etanol > metanol > acetato de etila > acetona 80% > acetona > hexano
90
(ZARENA; SANKAR, 2009) e etanol > metanol > água > acetona > éter de petróleo >
butanol > clorofórmio > cloreto de metileno > hexano (MOHSEN; AMMAR, 2009). As
diferenças obtidas de interação solvente-analito podem ser devido aos distintos tipos de
compostos presentes nas matrizes vegetais e parte do vegetal analisado e ordem de
aplicação do solvente.
A influência dos solventes e tipo de extração dos CF obtidos nos extratos de goiaba
e no subproduto agroindustrial expressaram a mesma ordem na atividade antioxidante nos
ensaios DPPH e ABTS, sendo as maiores atividades determinadas nos extratos ECFL
(acetona 80%) e as menores atividades nos extratos ECFC (acetato de etila).
Zarena e Sankar (2009) para o ensaio ABTS determinaram atividade antioxidante
em mangostão na ordem etanol > metanol > acetato de etila > acetona 80% > acetona >
hexano condizendo com os teores obtidos em cada extrato, já para o ensaio DPPHIC50 a
ordem foi hexano > etanol > metanol > água > acetona > acetato de etila. O que leva a
supor que a composição fenólica dos extratos influencia na atividade antioxidante de forma
diferente aos vegetais.
No entanto, existem outras famílias de compostos bioativos presentes nos extratos
que influenciam na eliminação de radicais livres tais como carotenoides, tocoferois
(vitamina E), vitamina C, clorofilas entre outros (PELLEGRINI et al., 2007), que
necessitariam ser mensurados por influenciarem na atividade antioxidante.
5.3.5. Correlação entre compostos fenólicos e atividade antioxidante
Os CF apresentam importante ação na redução da oxidação lipídica, contribuindo
não apenas com a conservação dos alimentos, mas também por estarem incorporados na
alimentação humana, diminuem o risco de desenvolvimento de patologias, como doenças
cardiovasculares, câncer, diabetes, processos inflamatórios e infecções (JORGE et al.,
2009).
No entanto, para que os CF sejam considerados antioxidantes é necessário que
mesmo presentes em baixas concentrações apresentem a capacidade de impedir, retardar ou
prevenir a auto-oxidação ou oxidação promovidas pelos radicais livres e que o produto
formado após a reação seja estável (SOARES et al., 2008). Os resultados obtidos para os
compostos fenólicos de modo geral demonstraram que os extratos mesmo em baixas
91
concentrações apresentaram atividades antioxidantes nos diferentes ensaios realizados,
principalmente, no subproduto agroindustrial da goiaba.
Estudos verificaram correlações diretas entre os CF e atividade antioxidante, sendo
esses os componentes de maior ação antioxidante em frutas (MELO et al., 2011;
OLIVEIRA et al., 2011; VIEIRA et al., 2011). A goiaba in natura e seu subproduto por
meio dos ensaios de atividade antioxidante se mostraram importantes fontes de CF, assim
como demonstrado na literatura.
Correlações positivas entre a atividade antioxidante pelos ensaios realizados e os
CF, bem como os FL e TC foram determinadas, por estarem próximas de 1 (Tabela 17),
sendo a correlação realizada por meio dos resultados totais para goiaba in natura e seu
subproduto nos dois tipos de extração realizados – ES e EU.
Tabela 17. Coeficiente de correlação linear de Pearson (r²) entre os compostos fenólicos e
flavonoides e os ensaios de atividade antioxidante de goiaba in natura e seu subproduto
Determinações analíticas Coeficiente de correlação (r²)
DPPH ABTS ORAC
Compostos fenólicos 0,969 0,990 0,970
Flavonoides 0,948 0,960 0,998
Taninos 0,908 0,713 0,888
Os coeficientes de correlação confirmam os resultados expostos no trabalho. O
extrato sequencial do subproduto do processamento de goiaba com maior concentração de
CF foi justamente o extrato com maior atividade antioxidante, tanto pelos ensaios de
transferência de elétrons (DPPH e ABTS) quanto de transferência de átomos de hidrogênio
(ORAC). A forte correlação indica que a contribuição dos CF nesse modelo é relevante,
principalmente, dos CF totais e FL, confirmando relatos de outros autores
(MAHATTANATAWEE et al., 2006; PEREIRA, 2009; SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011).
Estudos da USDA-ARS (United States Departament of Agriculture - Agriculture
Research Service) determinaram o coeficiente de correlação para DPPH e CF igual a 0,92
(ROESLER et al., 2007). No presente estudo, verificou-se relação positiva entre o
conteúdo de fenólicos totais e a atividade antioxidante total nos extratos de CF da goiaba in
92
natura e do seu subproduto (r = 0,969), ou seja, concentrações maiores de compostos
fenólicos resultaram em maior atividade antioxidante total, assim como para os demais
compostos – FL e TC.
Este resultado está conforme estudos anteriores que mostram relação direta entre a
concentração de CF e a capacidade de sequestrar radicais livres DPPH dos extratos de
frutas, indicando que esses fitoquímicos podem ser os principais contribuintes na atividade
antioxidante (ROESLER et al., 2007; MELO, 2010; ONGPHIMAI et al., 2013; SEO et al.,
2014). No entanto, compostos como o ácido ascórbico e carotenoides presentes nas
amostras também podem contribuir no sequestro do radical DPPH (ROESLER et al., 2007),
sendo neste estudo não mensurados.
Rufino (2008) analisando a correlação entre os CF e o ensaio ABTS encontrou forte
correlação positiva (0,92), já para DPPH a correlação foi negativa (-0,72). Zheng e Wang
(2003) em “berries” determinaram correlação de 0,99 entre o ensaio ORAC e os CF, já
Silva et al. (2007) reportaram moderada correlação (0,70) em diversas plantas da região
amazônica (PAZINATTO, 2008).
A relação entre os CF e a atividade antioxidante pode depender de fatores como
método escolhido e também das características hidrofóbicas ou hidrofílicas do sistema teste
e dos antioxidantes testados (ROESLER et al., 2007; OLIVEIRA et al. 2011), diferenças na
composição fenólica entre extratos de plantas e variação na resposta de CF diferentes para o
reagente de Folin-Ciocalteu, o que pode explicar a variação nas correlações, já que
correlação linear negativa entre o teor total de CF e atividade antioxidante já foi
determinada (HASSIMOTTO; GENOVESE; LAJOLO, 2005).
Verificou-se também correlação linear forte e positiva entre os ensaios (Tabela 18).
Tabela 18. Coeficiente de correlação linear de Pearson (r²) entre os ensaios de atividade
antioxidante de goiaba in natura e seu subproduto agroindustrial
Coeficiente de correlação (r²)
DPPH/ABTS ABTS/ORAC DPPH/ORAC
0,929 0,952 0,982
93
A correlação forte positiva já era de se esperar visto que os ensaios demonstraram
comportamentos semelhantes na avaliação da atividade antioxidante das amostras
analisadas.
Correlações positivas entre o ensaio DPPH e ABTS realizados em frutas são
reportadas na literatura – 0,90 (SOUSA; VIEIRA; LIMA, 2011) e 0,85 (THAIPONG et al.,
2006). Entre o ensaio DPPH e ORAC também se verificaram correlação positiva de 0,91
(MAHATTANATAWEE et al., 2006). Apesar do ORAC ser um ensaio com princípio
distinto do DPPH e ABTS, a correlação pode existir devido aos mecanismos de reação
semelhante, no entanto, nem sempre está em acordo totalmente, visto que os ensaios
utilizam diferentes radicais, espécies de frutas e apresentam composição fenólica
diversificada.
Os resultados sugerem claramente que o subproduto obtido do processamento da
goiaba in natura apresenta ótimo potencial na estabilização de radicas livres, assim como a
fruta, em alguns extratos superando a capacidade da goiaba. No entanto, a atividade
antioxidante de um extrato não pode ser explicada apenas com base em seu teor de
fenólicos totais, sendo necessária a caracterização do perfil dos compostos bioativos
presentes na matriz e estudo de sua estrutura, além de estudos in vivo.
5.4. Caracterização de açúcares e oligossacarídeos
5.4.1. Identificação e caracterização
A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC) tem sido
muito aplicada na identificação de compostos bioativos presentes em pequenas
concentrações em matrizes alimentares (GUIMARÃES; COLLINS, 1997; CECCHI, 2003;
JARDIM; COLLINS; GUIMARÃES, 2006), sendo o sistema de troca iônica (CLAE-TI)
com coluna CarboPac® e detector de triplo pulso amperométrico (DPA) na identificação de
oligossacarídeos e outros açúcares de cadeia menor responsáveis na obtenção de uma linha
de base mais estável e uma melhor resolução dos picos que os demais tipos de
cromatografia, ou seja, de alta seletividade (RODRIGUES, 1998).
Os carboidratos são moléculas não ionizadas que ao entrarem em contato com um
meio alcalino sofrem diferentes graus de dissociação, assumindo cargas negativas. As
94
espécies aniônicas resultantes podem ser separadas por mecanismos de troca de ânion
(RODRIGUES, 1998). Por isso, realizou-se a aplicação da fase móvel aquosa de hidróxido
de sódio (NaOH) e acetato de sódio (NaOAc), sendo o NaOAc utilizado para obtenção de
um gradientes de concentração o qual facilitou a eluição dos oligossacarídeos de forma
seletiva ao detector amperométrico, permitindo a identificação e quantificação dos açúcares
e oligossacarídeos nos extratos de goiaba in natura e subproduto agroindustrial de goiaba
(Figura 22) de acordo com o tipo de mecanismo de extração realizado.
Figura 22. Perfil HPLC ilustrando os mono- e dissacarídeo na goiaba in natura (A) e seu subproduto
agroindustrial (B) e oligossacarídeos na goiaba in natura (C) e seu subproduto agroindustrial (D) extraídos
pelo mecanismo Ultrassom: GF2: 1-kestose, GF3: nistose, GF4: 1F-β fructofuranosylnystose, G3: maltotriose,
G4: maltotetriose, G5: maltopentaose, G6: maltohexaose, G7: maltoheptaose.
Em frutas, os mono- e dissacarídeos atuam basicamente como agentes de sabor
(doçura). A Tabela 19 apresenta os teores desses açúcares presentes na goiaba in natura e
em seu subproduto.
A frutose foi o açúcar de maior representatividade na goiaba e no seu subproduto
agroindustrial. Apesar da ingestão de um grama desse açúcar conferir o mesmo valor
calórico que a sacarose (4 kcal), devido ao seu poder de doçura superior (117% contra 70%
95
da glicose e 100% da sacarose) o consumo de quantidade desse açúcar como adoçante se
torna menor que o da sacarose, fornecendo menor aporte calórico (VIGGIANO, 2003).
Tabela 19. Composição de mono- e dissacarídeo em goiaba in natura e subproduto
agroindustrial de goiaba, expressa em base seca, obtidos por diferentes mecanismos de
extrações
1 Média de três repetições ± desvio padrão;
2 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na linha para
mesmo mecanismo de extração diferem significativamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey
De acordo com a National Food Institute (2009) o teor de glicose, frutose e sacarose
da goiaba é igual a 1,3, 2,6 e 0 g.100 g-1
(base fresca), respectivamente, valores inferiores
aos determinados no estudo (2,0, 3,46 e 0,44 g.100 g-1
, média dos teores dos mecanismos
convertidos para base fresca), sendo as diferenças devido a fatores intrínsecos e extrínsecos
a matéria-prima. Já para subproduto agroindustrial de goiaba não se encontrou dados a fim
de comparação.
A goiaba apresentou maior teor de açúcares que o subproduto agroindustrial, o que
já era esperado, uma vez que sua concentração de sólidos solúveis (ºBrix) foi superior (11,7
e 3,8 ºBrix, respectivamente) (Tabela 10). De acordo com Manica et al. (1998) os teores de
sólidos solúveis totais são utilizados como uma determinação aproximada dos teores de
açúcares, influenciando na manutenção do sabor e aroma da goiaba e produtos derivados.
Desse modo, devido à baixa concentração de sólidos solúveis relacionada ao baixo teor de
açúcares do subproduto agroindustrial da goiaba pode-se sugerir que este subproduto
apresenta a vantagem ao ser aplicado em alimentos de baixo valor calórico referente a
açúcares.
g por 100 gramas de amostra expressa em base seca
Shaker Ultra-Turrax Ultrassom
Goiaba Subproduto Goiaba Subproduto Goiaba Subproduto
MONOSSACARÍDEO
Glicose 12,00±0,55¹a² 2,37±0,08b 14,60±0,39a 2,73±0,22b 16,04±1,04a 2,77±0,07b
Frutose 21,01±0,89a 4,15±0,09b 24,93±0,65a 4,70±0,37b 27,40±1,77a 4,80±0,12b
Total MONO- 33,01±1,44a 6,52±0,16b 39,53±1,08a 7,43±0,42b 43,44±2,81a 7,57±0,19b
DISSACARÍDEO
Sacarose 2,57±0,10a 0,19±0,02b 3,24±0,09a 0,15±0,02b 3,48±0,21a 0,16±0,02b
96
Os benefícios vinculados à inserção dos carboidratos não digeríveis na dieta
alimentar são inúmeros (GIESE et al., 2011), sendo o envolvimento na promoção do
crescimento de bactérias benéficas no cólon que os caracteriza como prebiótico, o mais
citado.
Devido aos benefícios da ingestão de oligossacarídeos a busca por fontes, pesquisas
de extração, produção e aplicações nas áreas de alimentos, rações animais, fármacos,
cosméticos a fim de aproveitar suas propriedades biológicas, funcionais e tecnológicas tem
se intensificado.
Os FOS são os oligossacarídeos mais pesquisados e citados pelo seu efeito
prebiótico. Em ambas as amostras foram identificadas os três tipos de FOS – 1-cestose
(GF2), Nistose (GF3) e 1-frutosil-nistose (GF4), exceto o GF2 no subproduto agroindustrial
(Tabela 20). A goiaba in natura apresentou maior teor de FOS do que o subproduto
agroindustrial, o que já era de se esperar, visto que a fruta apresentou maior concentração
de sólidos solúveis (11,7±0,11 ºBrix) que o subproduto (3,8±0,15 ºBrix) (Tabela 10).
Khalili, Abdullah e Manaf (2014) determinaram em polpa de mamão papaia teor
total de FOS de 0,12 mg.100g-1
e em sua casca de 0,02 mg.100g-1
, sendo uma proporção de
1:6. Para as amostras analisadas a proporção de FOS fruta:subproduto foi igual aos dos
autores.
O GF3 foi o oligossacarídeo de maior predominância nas amostras, representando
mais de 50% da composição dos FOS, em seguida o GF4 em torno de 25% e por último o
GF2 em torno de 20%.
Para se obter o efeito bifidogênico dos FOS alguns pesquisadores estimam que a
ingestão diária deve ser entre 2 e 10 g para adultos, outros autores consideram que no
mínimo 4 g por dia, mas, preferencialmente, 8 g para elevar de forma significativa o
número de células de bifidobactérias no intestino humano (MUSSATO; MANCILHA,
2007).
FOS também foi encontrado em quantidades substanciais em vegetais como a
alcachofra de Jerusalém, cebola, raiz de chicória, alho, aspargo e alguns cereais como trigo
e cevada (MUSSATO; MANCILHA, 2007).
Não há dados publicados sobre o conteúdo de oligossacarídeos em goiaba e seu
subproduto agroindustrial para comparação de teores. Jovanovic-Malinovska; Kuzmanova;
97
Winkelhausen (2014) quantificaram pequenas concentrações de FOS em 32 frutas, onde 5
delas apresentaram os três tipos de FOS. O conteúdo total em ordem decrescente foi
nectarina > melancia > pera > framboesa > maçã (890, 810, 560, 510 e 290 mg.100g-1
, em
base seca), teores superiores aos encontrados para a goiaba e o seu subproduto que
apresentaram em média de 31,41 e 7,08 mg.100 g-1
em base seca, respectivamente.
Em todos os extratos foram identificados todos os malto-oligossacarídeos (MOS),
com exceção dos extratos do subproduto agroindustrial da goiaba obtidos pelos
mecanismos ultra-turrax e ultrassom, não sendo determinado o GF4.
Os MOS G3 e G5/G6 apresentaram maior representatividade nos extratos da goiaba
in natura e do seu subproduto, respectivamente. Analisando mamão papaia, pitaia de polpa
vermelha e branca Khalili, Abdullah e Manaf (2014) encontraram os 5 tipos de MOS tanto
nas polpas quanto nas cascas, sendo os teores de G3, G4, G5 mais significativos de acordo
com os autores. Os teores desses MOS na polpa do mamão papaia foi de 0,30, 0,77 e 0,11
mg.100g-1
, respectivamente, já na casca da fruta foi igual a 0,025, 0,007 e 0,087 mg.100g-1
,
o que condiz com nossos resultados, mostrando que a fruta possui maior teor de MOS que o
seu subproduto.
De acordo com Jovanovic-Malinovska; Kuzmanova; Winkelhausen (2014) alguns
fatores podem influenciar nos níveis de oligossacarídeos em alimentos, tais como variedade
de alimentos, a maturidade, a variação sazonal, clima, processo de extração, tempo de
armazenamento e temperatura de armazenamento, bem como método analítico para
determinação de oligossacarídeos, como constatado na comparação do nível de FOS na
nectarina (890 mg.100g-1
) encontrada em sua pesquisa que superou o descrito por Muir et
al. (590 mg.100g-1
), e o relatado por Khalili, Abdullah e Manaf (2014) que determinaram
maior teor de G6, G7 e FOS na polpa de pitaia do que na casca contradizendo os resultados
expostos por Wichienchot, Jatupornpipat e Rastall (2010) para a mesma fruta.
98
Tabela 20. Composição de oligossacarídeos em goiaba in natura e subproduto agroindustrial de goiaba, expressa em base seca,
obtidos por diferentes mecanismos de extrações
*l.d.b – Limite de detecção baixo
1 Média de três repetições ± desvio padrão;
2 Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na linha para mesmo mecanismo de extração diferem
significativamente (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey
mg por 100 gramas de amostra expressa em base seca
Shaker Ultra-Turrax Ultrassom
Goiaba Subproduto Goiaba Subproduto Goiaba Subproduto
FRUTOOLIGOSSACARÍDEO
1-cestose (GF2) 7,50±0,60 1,03±0,08 9,79±0,26 l.d.b* 9,07±0,47 0,74±0,03
Nistose (GF3) 14,58±0,22 4,44±0,59 15,75±0,62 3,99±0,30 16,50±0,24 4,67±0,11
1-frutosil-nistose (GF4) 5,91±0,13 1,77±0,22 7,68±0,54 1,93±0,19 7,46±0,11 2,45±0,13
TOTAL FOS 27,99±0,281a2
7,24±0,78b 33,22±1,38
a 5,92±0,37
b 33,03±0,48
a 7,86±0,23
b
MALTOOLIGOSSACARÍDEO
Maltotriose (G3) 8,29±0,10 0,61±0,01 10,81±0,50 0,75±0,07 10,61±0,43 0,75±0,01
Maltotetraose (G4) 2,23±0,03 0,26±0,03 2,81±0,14 l.d.b 2,78±0,11 l.d.b
Maltopentaose (G5) 4,49±0,05 1,49±0,03 5,34±0,30 1,35±0,10 5,27±0,22 1,53±0,05
Maltohexaose (G6) 3,78±0,04 1,40±0,13 4,90±0,26 1,36±0,08 4,83±0,23 1,45±0,03
Maltoheptaose (G7) 0,25±0,02 0,09±0,01 0,30±0,03 0,09±0,02 0,37±0,01 0,22±0,01
TOTAL MOS 19,04±0,18a 3,85±0,19
b 24,16±1,21
a 3.55±0,20
b 23,86±0,86
a 3,95±0,09
b
TOTAL DE OLIGOSSACARÍDEO
47,03±0,13a
11,09±0,93b
57,38±0,26a
9,47±0,48b
56,89±1,33a
11,81±0,26b
99
Provavelmente, outros tipos de oligossacarídeos podem estar presentes na goiaba e
em seu subproduto, visto que nos cromatogramas mais picos foram detectados, no entanto,
a sua identificação não foi possível devido à falta de padrões de outros tipos de
oligossacarídeos.
Os oligossacarídeos já são aplicados em molhos para salada, assados, produtos de
baixo teor de gordura queijo, chocolate e confeitaria, devido as suas funções prebióticas,
por contribuírem com a promoção do crescimento e seletividade de bactérias benéficas
presentes no trato intestinal, por aumentarem a disponibilidade de minerais, por
apresentarem baixo valor calórico, entre outras ações que estão relacionados à redução de
risco de infecção, diarreia e câncer intestinal e a melhora na resposta do sistema
imunológico, bem como a prevenção de outras patologias (ROBERFROID; SLAVIN,
2000).
Desse modo, a identificação e quantificação dos oligossacarídeos na goiaba e no seu
subproduto agroindustrial abrem portas para se estudar a aplicação dos extratos das
matrizes em produtos alimentícios a fim de se aproveitar o benefício dos oligossacarídeos
presentes nelas, sendo o processo de extração uma das etapas importante na obtenção
máxima dos compostos nas matrizes.
5.4.2. Efeito dos mecanismos de extração de açúcares e oligossacarídeos
Os parâmetros mais variáveis em pesquisas de extração dos oligossacarídeos em
matrizes vegetais são tempo, temperatura, tipo e concentração do solvente (EKVALL;
STEGMARKB; NYMAN, 2007; WICHIENCHOT; JATUPORNPIPAT; RASTALL, 2010;
JOVANOVIC-MALINOVSKA; KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2015).
A água é muito indicada como solvente na extração de carboidratos de baixo peso
molecular, como os oligossacarídeos, entretanto, outros compostos com ótima solubilidade
em água (proteínas, polissacarídeos, por exemplo) podem ser interferentes durante a
extração, desse modo, a utilização de soluções alcoólicas se mostra mais viável para esse
tipo de extração (EKVALL; STEGMARKB; NYMAN, 2007), pois podem aumentar o
rendimento da extração, como demonstrado por Wichienchot, Jatupornpipat e Rastall
(2010) que verificaram rendimento de 27,4% da extração de oligossacarídeos em pitaia
com etanol 80% contra 15,1% de extração com água.
100
O etanol em diferentes concentrações (20%, 50%, 80, 85%) tem sido muito aplicado
em estudos de otimização de extração de oligossacarídeos (EKVALL; STEGMARKB;
NYMAN, 2007; WICHIENCHOT; JATUPORNPIPAT; RASTALL, 2010; JOVANOVIC-
MALINOVSKA; KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2015), sendo sua eficiência
variável, de acordo com a matriz analisada.
Ekvall, Stegmarkb e Nyman (2007) analisando a melhor concentração de solução
hidroetanólica para a extração de oligossacarídeos em ervilhas, em especial rafinose,
verificaram que a concentração de 80% promove à desnaturação de algumas proteínas,
sendo a formação de precipitado um fator limitante na difusão do oligossacarídeo da matriz
à solução extratora, ao contrário da concentração 50% que se mostrou mais eficiente, fato
que determinou a escolha dessa concentração em nossos estudos.
Tanto temperatura ambiente, como acima de 50ºC, foram utilizadas para a extração
de oligossacarídeos. Analisando o conteúdo de oligossacarídeos em pitaias de polpa
vermelha e branca por 1 hora a temperatura ambiente Wichienchot, Jatupornpipat e Rastall
(2010) encontraram um teor total de 8960 e 8620 mg.100g-1
, respectivamente, já Khalili,
Abdullah e Manaf (2014) durante o mesmo tempo de extração mas à 50ºC determinaram
valores de 1,66 e 1,08 mg.100g-1
, respectivamente. Devido à proporção solvente, amostra,
método de extração e outros fatores intrínsecos às amostras, tais como espécie, cultivo e
maturidade, diferenças de resultados entre autores são comuns. Ekvall, Stegmarkb e Nyman
(2007) estudando a influência da temperatura ambiente e de 50ºC na extração de alguns
oligossacarídeos em ervilha verificaram pouco ou nenhum efeito sobre o rendimento da
extração dos compostos, apesar de afirmar que a temperatura mais alta provavelmente
implicará na aceleração da extração com o solvente hidroetanólico (50%), a temperatura de
ebulição com etanol poderia ser afetada devido à formação de proteínas precipitadas.
De acordo com a literatura, o período mais citado para extração de oligossacarídeos
corresponde à 1 hora (WICHIENCHOT; JATUPORNPIPAT; RASTALL, 2010;
JOVANOVIC-MALINOVSKA; KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2014; KHALILI;
ABDULLAH; MANAF, 2014; JOVANOVIC-MALINOVSKA; KUZMANOVA;
WINKELHAUSEN, 2015). Ekvall, Stegmarkb e Nyman (2007) ao avaliarem três tempos
de extração diferentes em ervilhas (15, 30 e 60 minutos) verificaram que com tempos
superiores a 30 minutos maior eficiência na extração de oligossacarídeos pode ser obtida.
101
Nos estudos citados a extração sempre é realizada em shaker (banho-maria com
agitação). Como o tipo de mecanismo também é um fator que influi na eficiência da
extração dos compostos, o presente estudo avaliou três diferentes mecanismos para
averiguar qual apresentaria melhor eficiência na extração dos oligossacarídeos nas matrizes
estudadas.
Os mecanismos ultra-turrax (UT) e ultrassom (US) mostraram-se mais eficientes na
extração de açúcares e oligossacarídeos na goiaba, não diferindo estaticamente entre si
(Figura 23), com exceção para os oligossacarídeos no subproduto agroindustrial (Figura
23B). Já para o subproduto agroindustrial de goiaba, o mecanismo ultrassom apresentou
maior eficiência na extração de FOS e na soma dos oligossacarídeos (FOS + MOS), no
entanto não houve diferença de eficiência do processo de shaker (SK), sendo que esse
também não apresentou diferença estatística do mecanismo UT (7,86, 7,24 e 5,92 mg.100g-
1, para FOS e 11,81, 11,09 e 9,47 mg.100g
-1 oligossacarídeos totais, respectivamente).
O UT como mecanismo de extração e formação de microemulsões em pesquisas
tem sido muito aplicado. Basicamente, o mecanismo consiste na força de cisalhamento da
amostra por meio da alta velocidade de um rotor, levando a formação de partículas de
tamanhos menores e diferenciados de acordo com a intensidade do cisalhamento, o que
facilita a interação composto e solvente extrator (KAUSHIK; SINGH, 2011; ZHAO et al,
2013), sendo um processo de cavitação (FANGUEIRO et al., 2012). No entanto, poucas
informações encontram-se sobre a sua ação e eficiência na extração de compostos bioativos
comparado com outros tipos de mecanismos.
Estudos têm mostrado que a aplicação de US na extração de compostos bioativos
em alimentos é um mecanismo mais vantajoso na obtenção de melhores rendimentos do
que mecanismos convencionais como o SK (CHEMAT; HUMA; KHAN, 2011;
JOVANOVIC-MALINOVSKA; KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2015),
caracterizando-o como método eficaz na obtenção de oligossacarídeos (JOVANOVIC-
MALINOVSKA; KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2015).
102
Figura 23. Teor de (A) açúcares (glicose, frutose e sacarose) e (B) oligossacarídeos em goiana in natura e
subproduto agroindustrial de goiaba de acordo com os mecanismos de extração.
Letras minúsculas diferentes em entre os mecanismos para mesma amostra diferem significativamente (p ≤
0,05) pelo teste de Tukey.
A
B
103
A eficiência do US pode estar atribuída ao fenômeno físico vinculado ao químico
(CHEMAT; HUMA; KHAN, 2011), os quais promovem a ruptura da parede celular,
reduzindo o tamanho das partículas a fragmentos de baixo peso molecular, o que melhora a
transferência de massa do conteúdo da célula para o solvente provocada pelo colapso das
bolhas produzidas pela cavitação, facilitando a interação do solvente com os compostos
extraíveis (DAI; MUMPER, 2010; JOVANOVIC-MALINOVSKA; KUZMANOVA;
WINKELHAUSEN, 2015).
Além do maior rendimento, a aplicação de US traz as vantagens de reduzir o tempo
de extração e os perigos físicos, bem como o volume de solvente extrator utilizado no
processo (CHEMAT; HUMA; KHAN, 2011; JOVANOVIC-MALINOVSKA;
KUZMANOVA; WINKELHAUSEN, 2015).
Jovanovic-Malinovska, Kuzmanova e Winkelhausen (2015) analisando o
mecanismo de US versus o método convencional (banho-maria) nas frutas nectarina,
melancia, framboesa e mirtilo verificaram diminuição significativa do tempo de extração de
50 minutos (10 min de US contra 60 min de banho-maria), sendo as diferenças dos teores
de oligossacarídeos totais (FOS, rafinose e estaquiose) significativas entre os mecanismos
convencionais e US – para mirtilo e framboensa próximos de 500 e 1000 mg.100g-1
e
melancia e nectarina próximos de 1000 e 2000 mg.100g-1
, respectivamente.
Desse modo, partindo-se do princípio que o conteúdo de açúcares e oligossacarídeos
quantificados pelo mecanismo de US não diferenciou do UT, para a maioria dos compostos
analisados, supõe-se que a realização de processo de otimização levando-se em
consideração os parâmetros variáveis concentração solvente e mecanismo (US e UT) seria
uma das alternativas mais viáveis a fim de se determinar as melhores condições de
extração, principalmente, de oligossacarídeos em goiaba in natura e seu subproduto
agroindustrial e, assim, aproveitar de forma mais eficiente este prebiótico para estudos e
aplicação como ingrediente em produtos alimentícios com alegação funcional.
104
105
6. CONCLUSÕES
O subproduto agroindustrial de goiaba apresentou maiores teores de compostos
fenólicos, flavonoides e taninos do que a goiaba para a maioria dos extratos, refletindo no
maior potencial antioxidante determinado pelos ensaios in vitro, os quais determinaram
diferentes respostas dos compostos em cada um dos métodos devido os seus distintos
princípios, uso de solventes e comprimento de onda, sendo alguns fatores que determinam
os tipos de compostos analisados.
A extração sequencial se mostrou mais eficiente na recuperação dos compostos
antioxidantes, visto que a aplicação de solventes de diferentes polaridades em uma amostra
permite a interação diferente dos vários fenólicos presentes na matriz, possibilitando até a
quantificação de compostos conjugados que por extração única não é possível se
determinar.
A técnica de HPLC-TI permitiu a identificação e quantificação dos açúcares, FOS e
MOS na goiaba e em seu subproduto agroindustrial, sendo os teores de oligossacarídeos na
goiaba superior ao do subproduto agroindustrial, visto que é uma matriz com menor
porcentagem de sólidos solúveis.
O ultra-turrax e o ultrassom podem representar um mecanismo de extração de ótimo
potencial na recuperação de oligossacarídeos em goiaba e subproduto, sendo a elaboração
de processo de otimização na extração importante na obtenção de melhores resultados do
que o obtido em estudo.
As informações apresentadas de oligossacarídeos na goiaba e seu subproduto
agroindustrial representam grande oportunidade para a inserção em banco de dados de
composição de alimentos.
Assim, a menor concentração de açúcares (mono- e dissacarídeo) no subproduto
agroindustrial de goiaba permite a aplicação deste como ingrediente em produtos com
baixo valor calórico e aliado ao seu ótimo potencial antioxidante mostra que a matriz deve
ser alvo de mais pesquisas visando o isolamento e o estudo mais profundo dos compostos
analisados e de outros bioativos presentes nela a fim de viabilizar o melhor aproveitamento
de seus benefícios funcionais como ingrediente em alimentos e contribuindo com a redução
da contaminação ambiental por resíduos industriais.
106
107
7. PERSPECTIVAS FUTURAS
Caracterizar o subproduto de goiaba com o teor de fibras solúveis e insolúveis, visto
que atuam como prebióticos, assim como os oligossacarídeos e, o subproduto de frutas
terem uma boa composição de casca e sementes;
Determinar o teor de carotenoides (licopeno, principalmente) e vitamina C, compostos
também envolvidos na atividade antioxidante de vegetais;
Verificar por cromatografia líquida a composição fenólica das frações obtidas na
extração sequencial da goiaba e do seu subproduto para se caracterizar e estudar a
importância dos compostos na saúde humana;
Analisar a composição de oligossacarídeos por cromatografia utilizando-se outros
padrões de identificação;
Utilizar cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas a fim se identificar
com maior precisão os oligossacarídeos presentes na goiaba e no seu subproduto
agroindustrial;
Realizar um planejamento experimental de otimização do processo de extração de
oligossacarídeos levando-se em consideração os mecanismos ultra-turrax e ultrassom e
a concentração solvente hidroetanólica como parâmetros variáveis, a fim de se obter o
máximo possível de oligossacarídeos nos extratos das matrizes;
Aplicar o subproduto agroindustrial de goiaba em alguma formulação de produto para
se avaliar a sua viabilidade nutricional, funcional, sensorial e econômica.
108
109
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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