MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM

DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO DO

BASIDIOCARPO

FRANCIELLY MOURÃO

UMUARAMA 2008

FRANCIELLY MOURÃO ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus... Reservado Biblioteca

(30mm)

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM

DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO DO

BASIDIOCARPO

FRANCIELLY MOURÃO

UMUARAMA 2008

UNIVERSIDADE PARANAENSE

MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA APLICADA À AGRICULTURA

FRANCIELLY MOURÃO

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO DO BASIDIOCARPO

Dissertação apresentada como parte das exigências para a obtenção do grau de mestre no Programa de Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade Paranaense – UNIPAR, sob orientação do Prof. Dr. Nelson Barros Colauto.

UMUARAMA

2008

M929a Mourão, Francielly Atividade biológica de Agaricus brasiliensis em diferentes fases

de maturação do basidiocarpo / Francielly Mourão. – Umuarama: Universidade Paranaense – UNIPAR, 2008.

73p.; Il.

Orientador: Prof. Dr. Nelson Barros Colauto. Dissertação (Mestrado) – Universidade Paranaense, Biotecnologia Aplicada à Agricultura, 2008. 1. Agaricus blazei ss. Heinemann. 2. Antioxidante. 3. Antineoplásica. 4. Basidiocarpo. 5. Glucanas. I. Universidade Paranaense – UNIPAR. II. Título. (21 ed) CCD: 579.6

Elaborado pela Bibliotecária Inês Gemeli CRB – 9/966

Termo de aprovação

FRANCIELLY MOURÃO

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO DO BASIDIOCARPO

Dissertação aprovada como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre no programa de Mestrado em Biotecnologia Aplicada à Agricultura da Universidade Paranaense, pela seguinte banca examinadora:

______________________________________

Prof. Dr. Nelson Barros Colauto (presidente)

______________________________________

Prof.a Dr.a Giani Andrea Linde Colauto (Titular interno)

______________________________________

Prof.a Dr.a Luzia Doretto Paccola-Meirelles (Titular externo)

Umuarama, 25 de agosto de 2008.

Aos meus pais Lúcia e Adelino. As minhas irmãs Huliana e Anniely. Pelo carinho, apoio e compreensão. Mas, principalmente, por estarem presentes em minha vida, como uma família da qual eu me orgulho de fazer parte!

Amo muito vocês!

AGRADECIMENTOS

A Deus, por estar sempre ao meu lado e por permitir que esse sonho se realizasse;

A todos que participaram, de alguma forma, da elaboração deste trabalho, em

especial:

Aos meus pais, por me proporcionarem a oportunidade de me dedicar aos estudos e

também por sempre torcerem por minhas vitórias;

Ao meu orientador, Prof. Dr. Nelson Barros Colauto pela orientação, pelos

ensinamentos, dedicação, correções e pelas cobranças que me fizeram ser uma

pesquisadora mais dedicada e esforçada;

Aos professores Dr.a Giani Andrea Linde Colauto e MSc. Emerson Luiz Botelho

Lourenço pelas conversas (científicas e descontraídas!), pelos ensinamentos e

sugestões;

As alunas de iniciação científica, Suzana Humeo e Tatiane Domingos, por aceitar

fazer um trabalho em conjunto, pela dedicação, esforço, por estar sempre atenta aos

nossos ensinamentos e pelas conversas amigas;

A Huliana e Anniely, queridas irmãs pelas palavras amigas, sempre me incentivando

e não me deixando desistir;

Ao Arquimedes, meu namorado, pelo amor, companheirismo, pela disposição em

me ajudar sempre que precisei, pelos ensinamentos, pelos abraços apertados e

reconfortantes; pelas longas conversa de incentivo e por tentar entender e

acompanhar meu raciocínio e minhas explicações;

Às amigas Talita Mantovani, Keiko Nakamura, Liliana Manetti, Miria Bertelli grandes

companheiras nos congressos, nos momentos alegres e também nos momentos de

desespero!

A Universidade Paranaense-UNIPAR por ceder espaço físico;

A minha turma de mestrado, da qual sempre lembrarei com carinho de todos os

momentos bons e momentos difíceis que passamos;

"Creio que o triunfo é resultado de esforço inteligente, que não depende da sorte, de magia, de amigos, companheiros duvidosos ou de um chefe; creio que tirarei da vida exatamente o que nela colocar" (Gandhi).

ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Agaricus brasiliensis EM DIFERENTES FASES DE

MATURAÇÃO DO BASIDIOCARPO

RESUMO GERAL

Agaricus brasiliensis Wasser et al. (Agaricus blazei ss. Heinemann), popularmente

conhecido no Brasil como Cogumelo Medicinal, Cogumelo-do-sol, é um fungo de

cultivo expressivo no país devido às suas propriedades medicinais, evidenciadas em

diversos trabalhos científicos, que vem ganhando importância em outros países,

principalmente para uso nutracêutico. Os nutracêuticos obtidos de cogumelos

minimamente processados e encapsulados podem ser consumidos como

suplementos dietéticos. São utilizados principalmente devido ao potencial

terapêutico como imunomodulatório e anti-tumoral. As frutificações de A. brasiliensis

são colhidas no Brasil principalmente no estágio imaturo, quando o píleo ainda está

fechado, atendendo aos padrões morfológicos pré-estabelecidos e é nesse estágio

que se obtém maior valor comercial para exportação. A atividade biológica desse

cogumelo é dependente da composição química das frutificações que pode variar

com a maturação, particularmente em relação ao conteúdo de β-D-glucanas que

constituem a parede celular do fungo. No presente estudo, foram utilizadas

frutificações de diferentes linhagens de A. brasiliensis colhidas em diferentes

estágios de maturação – imaturas (basidiocarpo fechado), maduras (basidiocarpo

aberto), a fim de avaliar a atividade antioxidante, atividade sobre a migração celular

em processo inflamatório e atividade antineoplásica. Para a avaliação da atividade

antioxidante foram utilizadas dez linhagens de A. brasiliensis em duas fases de

maturação do basidiocarpo (aberto e fechado). Foram estudadas condições de

extração de solventes (DMSO (dimetilsufóxido), etanol, metanol ou água),

temperatura (15, 30, 45 ou 60 °C) e tempo (15, 30, 45 ou 60 min). A atividade

seqüestradora de radicais foi calculada pela percentagem da descoloração do 1,1-

difenil-2-picrilhidrazil (DPPH). Para cada 0,1 ml de extrato bruto foi adicionado 2,9 ml

de solução metanólica de DPPH (60 µM), preparado no momento do uso. A leitura

foi realizada após 30 min. A absorvância foi medida a 515 nm usando

espectrofotômetro. As diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de

Tukey (p≤0,05). Para a avaliação da atividade de A. brasiliensis sobre a migração

celular em processo inflamatório foi utilizado ratos Wistar macho, de maneira que a

indução da resposta inflamatória foi induzida através da formação de bolsa de ar no

dorso dos animais adicionados de solução aquosa de carragenina (2%), foram

realizados coletas do sangue exsudato em diferentes etapas do experimento (antes

do tratamento, 8 dias após o tratamento, 18 dias de tratamento 6 h após a indução

da resposta inflamatória), sendo determinados a contagem total em câmara de

Newbauer e diferencial das células através de extensões sanguíneas coradas pelo

método clássico de coloração de May Grunwald-Giemsa. Para a avaliação da

atividade antineplásica de A. brasiliensis foram utilizados camundongos fêmeas as

quais foram inoculados com células de Sarcoma 180 no tecido subcutâneo dos

animais, após sete dias da inoculação os animais foram tratados com extratos de A.

brasiliensis. Após 30 dias do início dos experimentos os animais sofreram eutanásia

através de administração de excesso de anestésico, onde foram retirados o baço e a

massa tumoral a fim de serem medidos e calculados. O tumor foi medido por régua

milimetrada e seu volume calculado. A inibição foi calculada considerando o volume

do tumor do grupo Controle como 100%. Os resultados obtidos neste trabalho

demonstram que o cogumelo A. brasiliensis em diferentes linhagens e estágios de

maturação são uma fonte natural de antioxidantes, sendo a linhagem ABL99/29A,

basidiocarpo fechado, aquela que apresentou maior atividade antioxidante. Os

basidiocarpos fechados apresentaram atividade antioxidante, em média, 24% ± 2%

maior quando comparados aos basidiocarpos abertos. Nossos resultados

demonstraram que o extrato aquoso obtido de A. brasiliensis ABL99/25 apresentou

atividade inibitória sobre a infiltração de leucócitos para o foco da lesão. Esta

inibição foi mais acentuada quando foram utilizados basidiocarpos fechados. Foi

constatado efeito antineoplásico do extrato aquoso de A. brasiliensis, porém não foi

observada diferença significativa em função do estágio de crescimento do

basidiocarpo para a linhagem ABL97/11 de Agaricus brasiliensis, sendo a atividade

antineoplásica média dos basidiocarpos de 89,22%.

Palavras chave: Antioxidante, antineoplásica, basidiocarpo, glucanas.

BIOLOGICAL ACTIVITY OF Agaricus brasiliensis ON DIFFERENT BASIDIOCARP

MATURATION STAGES

ABSTRACT

Agaricus brasiliensis Wasser et al. (Agaricus blazei ss. Heinemann), popularly known

in Brazil as Medicinal Mushroom, Sun Mushroom, is a fungus cultivated because of

its medicinal properties, highlighted in several scientific papers, and are gaining

importance in several countries, mainly because of its functional use. The

mushrooms are minimally processed and encapsulated to be consumed as dietary

supplements. They are used mainly due to the potential therapeutic as

immunomodulatory and antitumor activity. The fructifications of A. brasiliensis are

collected in Brazil mainly in the immature stage, when the pileus is still closed, to

attend commercial standard patterns. The biological activity of the mushroom is

dependent on the chemical composition of fructifications, particularly in relation to the

content of β-D-glucan which are the cell wall of the fungus. In this study, it was used

basidiocarps of different collected stages of maturity – immature basidiocarp (closed

pileus), mature basidiocarp (opened pileus) from different strains of A. brasiliensis to

evaluate the antioxidant activity (ABL99/26, ABL99/28, ABL99/29 and ABL99/26 and

ABL99/29A closed basidiocarp, ABL99/28, ABL99/29, ABL99/30 and 99/29A opened

basidiocarp), cell migration in acute inflammatory process activity (ABL99/25, opened

and closed basidiocarp), induced by agent phlogistic, and antineoplastic activity

(ABL97/11, opened and closed basidiocarp). The data obtained in this work shows

that the mushroom of A. brasiliensis strains, on different stages of maturation, can be

included as a natural source of antioxidant food, being the strain ABL99/29A, closed

basidiocarp, the strain with the highest antioxidant activity. Closed basidiocarps have

an average of 24% ± 2% higher antioxidant activity when compared to opened

basidiocarps. It was observed antitumor effect of aqueous extract of A. brasiliensis,

but no significant difference was observed according to the maturation stage of the

basidiocarp for the strain ABL97/11 of Agaricus brasiliensis, and the basidiocarp

average antineoplastic activities were of 89.22%. Our results showed that the

aqueous extract obtained from A. brasiliensis (ABL99/25) presented important

inhibitory activity on the infiltration of leukocytes to the outbreak of the injury, and the

mushroom with closed basidiocarp showed more activity that the opened

basidiocarp.

Key words: Antioxidant, antineoplastic, basidiocarpo, glucans.

LISTA DE TABELAS Capítulo 1 LISTA DE TABELAS TABELA 1- Efeito das variáveis de extração sobre a atividade antioxidante do basidiocarpo fechado de Agaricus brasiliensis

23

Capítulo 2 TABELA 1- Efeito do tratamento com extrato de basidiocarpos aberto e fechado de A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário antes do estímulo inflamatório

45

TABELA 2- Análise diferencial dos leucócitos demonstrando o efeito do tratamento com A. brasiliensis sobre o perfil dos polimorfonucleares antes e após estímulo inflamatório com carragenina em ratos.

47

Capítulo 3 LISTA DE TABELAS TABELA 1- Avaliação do desenvolvimento de neoplasia em camundongos Swiss inoculados com células de sarcoma 180 tratados extrato aquoso de basidiocarpo de Agaricus brasiliensis Fechado ou Aberto

61

LISTA DE FIGURAS

Capítulo 1 FIGURA 1: Atividade antioxidante de A. brasiliensis em diferentes fases de maturação do basidiocarpo

27

Capítulo 2

FIGURA 1: Esquema do protocolo de indução e acompanhamento da resposta inflamatória em ratos.

42

FIGURA 2: Efeitos do tratamento com extrato de basidicarpos aberto e fechado de A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário total.

46

FIGURA 3: Efeitos dos tratamentos com extratos de A. brasiliensis sobre a mobilização de leucócitos para o tecido subcutâneo inflamado (modelo da bolsa de ar).

49

LISTA DE ABREVIAÇÕES

µ micro

β beta

α alfa

µM micromolar

g/m2 grama por metro quadrado

°C graus Celsius

g grama

g força centrífuga relativa

h hora

min minutos

ml mililitros

kg kilograma

mm3 milímetro cúbico

mm milímetro

π pi

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

INTRODUÇÃO GERAL 17

1. Atividade antioxidante de dois estágios de maturação do basidiocarpo de Agaricus brasiliensis

19

2. Atividade de Agaricus brasiliensis na migração celular em processo inflamatório

38

3. Atividade antineoplásica de Agaricus brasiliensis em diferentes fases de maturação do basidiocarpo

57

CONCLUSÕES GERAIS 71

REFERÊNCIAS GERAIS 72

APÊNDICE(S) 73

17

1. INTRODUÇÃO GERAL

Os representantes do gênero Agaricus pertencem à ordem Agaricales, a

qual é conhecida pela grande variedade na morfologia dos indivíduos e por reunir

os cogumelos propriamente ditos. Os termos cogumelo, basidioma e basidiocarpo

são sinônimos e referem-se à estrutura de reprodução dos indivíduos desse grupo

(corpo de frutificação) (LOPES, 1999).

Agaricus brasiliensis Wasser et al. (A. blazei Murrill ss. Heinemann)

(WASSER et al., 2002), A. subrufescens Peck segundo Kerrigan (2005), é um

Basidiomiceto coloquialmente denominado cogumelo-do-sol, cogumelo piedade,

“kawahiratake”, “himematsutake”, champignon do Brasil entre outros. O Brasil tem

se destacado no cultivo de A. brasiliensis, devido às condições climáticas

favoráveis, sendo mais cultivado nos Estados de São Paulo, Paraná e Minas

Gerais. Outros países produtores são China, Japão e Coréia (EIRA, 2003). A.

brasiliensis tem sido empregado na dieta, principalmente em pratos japoneses,

chineses e até mesmo nos países ocidentais devido à sua forte fragrância

adocicada e por sua excelente textura. Também tem sido utilizado em forma de

chá, no combate ao estresse físico e emocional, estimulante do sistema

imunológico, melhora da qualidade de vida de diabéticos, redução de colesterol,

combate às doenças como úlcera gástrica, osteoporose, além de apresentar um

possível efeito anticarcinogênico e antimutagênico (BELLINI et al., 2003; MENOLI

et al., 2001).

Podemos caracterizar dois estágios importantes no crescimento de

basidiocarpos de fungos que possuem véu, antes e após o rompimento do véu.

Este é o momento que ocorrem as principais mudanças bioquímicas no

basidiocarpo. Antes de romper o véu o basidiocarpo é imaturo e os esporos estão

em fase de desenvolvimento, caracterizado como “cogumelo fechado”. Após o

rompimento do véu o basidiocarpo atinge a maturidade e em seguida inicia o

estágio de senescência, sendo os esporos dispersos. Portanto, após o

rompimento do véu inicia-se o processo de maturação dos esporos (CAMELINI et

al., 2005).

18

As frutificações de A. brasiliensis são colhidas no Brasil principalmente no

estágio imaturo, quando o píleo ainda está fechado, atendendo a padrões

morfológicos comerciais pré-estabelecidos. No entanto, essas frutificações

imaturas ainda não atingiram máxima eficiência da biomassa fúngica, mas é

nesse estágio que se obtém maior valor comercial para exportação. Cada estágio

de crescimento do basidiocarpo apresenta diferenças bioquímicas em relação à

fase de maturação dos esporos e de senescência do basidiocarpo. Basidiocarpos

em diferentes estágios de crescimento da linhagem UFSC 51 de A. brasiliensis

apresentaram aumento da concentração de proteínas e de β-D-glucanas,

consideradas responsáveis pelo efeito biológico (CAMELINI et al., 2005). As β-D-

glucanas são constituintes naturais da parede celular de bactérias, fungos e

plantas, diferindo entre si pelo tipo de ligações e ramificações, características que

lhes conferem estruturas específicas e ações biológicas distintas, sendo, portanto,

a característica estrutural um fator fundamental para a ação das β-D-glucanas

(BETA GLUCAN RESEARCH, 2003; JONG, 2002).

Algumas propriedades e atividades biológicas de A. brasiliensis foram

avaliadas através de bioensaios in vivo e ensaios in vitro visando levantar

informações que dêem suporte à utilização do referido cogumelo na medicina

popular. Esta dissertação de mestrado é composta de três partes que foram

executadas de forma seqüencial. Primeiramente para avaliar a atividade

antioxidante utilizou-se o método espectrofotométrico de inibição do radical livre

de 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) (MOLYNEUX, 2004). Todos os dados

referentes a estas avaliações são descritos no capítulo 1. No segundo capítulo

são apresentados os resultados sobre a atividade de Agaricus brasiliensis na

migração celular em processo inflamatório. No terceiro capítulo são apresentados

os resultados sobre a atividade antineoplásica de A. brasiliensis em diferentes

fases de maturação do basidiocarpo. O artigo resultante deste experimento foi

recentemente submetido à revista Brazilian Journal of Microbiology para

publicação e encontra-se escrito segundo as normas deste importante periódico

internacional.

19

CAPÍTULO 1

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM DOIS ESTÁGIOS DE MATURAÇÃO DO

BASIDIOCARPO Agaricus brasiliensis

RESUMO

Os radicais livres são compostos químicos oxidantes que aceleram o

envelhecimento celular e estão envolvidos com o aparecimento de doenças

degenerativas como o câncer, as cardiopatias e a depressão do sistema

imunológico. Os antioxidantes são substâncias que podem retardar estes

processos oxidativos. O Agaricus brasiliensis é um cogumelo funcional que tem

despertado a atenção da comunidade científica devido as suas características

terapêuticas. A determinação da atividade antioxidante do Agaricus brasiliensis é

importante para verificar seu potencial de uso como fonte de antioxidante na

alimentação humana e animal. Fatores genéticos e fases de maturação do

basidiocarpo podem afetar diretamente a quantidade de antioxidantes produzidos,

basidiocarpo imaturos, sem rompimento do véu, tem sido comercialmente

utilizados para uso humano. O objetivo deste trabalho foi otimizar as condições de

extração dos princípios ativos antioxidantes de A. brasiliensis em dois estágios de

maturação do basidiocarpo. Foram estudados para a extração os solventes

(DMSO (dimetilsufóxido), etanol, metanol ou água), temperatura (15, 30, 45 ou 60

°C) e tempo (15, 30, 45 ou 60 min) em 10 linhagens de A. brasiliensis. A atividade

seqüestradora de radicais livres foi calculada pela percentagem da descoloração

do DPPH. Concluiu-se que a melhor condição para extração dos princípios ativos

antioxidantes pelo método DPPH é o metanol, 60 min, a 60 °C. Linhagens com

basidiocarpo fechado possuem maior atividade antioxidante. Os basidiocarpos

fechados apresentaram em média uma atividade antioxidante 24% ± 2% maior

que a atividade antioxidante dos basidiocarpos abertos.

Palavras-Chave: Absorvância, Atividade biológica, Basidiomiceto, Agaricus

blazei.

20

ABSTRACT

Free radicals are chemical compounds oxidants that accelerate the aging cell and

are involved with the onset of degenerative diseases such as cancer, heart

disease and depression of the immune system. Antioxidants are substances that

can slow these processes oxidative. The Agaricus mushroom brasiliensis is a way

that has attracted the attention of the scientific community because their

characteristics therapies. The determination of the antioxidant activity of Agaricus

brasiliensis is important to ascertain their potential for use as a source of

antioxidant in food and feed. Variations between lines and stages of maturation of

the basidiocarp may directly affect the amount of antioxidant produced and is the

main commercial consumption in the immature stage of basidiocarp with the veil

not broken. The objective of this study was to determine the conditions for the

extraction of active ingredients antioxidant in two stages of maturation of the

basidiocarp of Agaricus brasiliensis. We used nine strains of A. brasiliensis in two

stages of maturation of the basidiocarp (open and closed). We studied conditions

of the solvent extraction (DMSO, ethanol, methanol or water), temperature (15, 30,

45 or 60 C) and time (15, 30, 45 or 60 min). The activity of radical scavengin was

calculated by the percentage of discoloration of DPPH. It was concluded that the

best condition to extract the active ingredients antioxidants by DPPH method is the

methanol, 60 min, 60 ° C. Linhagens with basidiocarp have closed higher

antioxidant activity. The basidiocarps on average had closed an antioxidant activity

24% ± 2% higher than the antioxidant activity of basidiocarps open.

Keywords: Absorvância, biological activity, Basidiomycets, Agaricus blazei.

21

INTRODUÇÃO

Os radicais livres são espécies químicas que possuem um elétron

desemparelhado no último orbital, gerando um processo oxidativo. Neste estado,

o radical livre é extremamente instável podendo reagir com estruturas celulares,

afetando o funcionamento do metabolismo celular (ABDALLA, 2002; BIANCHI;

ANTUNES, 1999). Os radicais livres aceleram o envelhecimento celular e estão

envolvidos com o aparecimento de doenças degenerativas como o câncer, as

cardiopatias e a depressão do sistema imunológico. Os antioxidantes são

substâncias que podem retardar estes processos oxidativos, pois reagem com os

radicais livres inibindo a etapa de propagação da reação de oxidação

(BARREIROS et al., 2006, TAKAHASHI et al., 1978; WITSCHI; LOCK, 1978). Tais

agentes antioxidantes tornam-se cada vez mais necessários na prevenção de

doenças, uma vez que têm se ampliado as condições ambientais que ocasionam

maior exposição das pessoas aos efeitos deletérios dos agentes oxidantes.

Antioxidantes sintéticos como hidroxibutilanisol (BHA) e o

butilhidroxitolueno (BHT) são normalmente utilizados nas indústrias de óleos e

derivados lipídicos. Entretanto, estes compostos podem apresentar efeitos

nocivos à saúde como hemorragias diversas e mudanças bioquímicas, podendo

atuar inclusive como agente promotor de desenvolvimento de adenoma

(TAKAHASHI et al., 1978; WITSCHI e LOCK, 1978). Desta forma, nos últimos

anos ocorreu uma busca por substâncias naturais que tenham a mesma função e

eficiência dos antioxidantes sintéticos (MILLAUSKAS et al., 2003; PASSOTTO et

al., 1998).

O Agaricus brasiliensis Wasser et al. (A. blazei Murrill ss. Heinemann),

considerado A. subrufescens por Kerrigan (2005), é um cogumelo funcional que

tem despertado a atenção da comunidade científica. A funcionalidade deste

cogumelo tem sido atribuída, principalmente, as β-D-glucanas, que possuem

atividade antitumoral (TAKASHI et al., 1990), estimulam o sistema imunológico

(LIU et al., 2007; NAKAJIMA et al., 2002) e têm propriedade antidiabética (KIM et

al., 2005), antinfecciosa (BERNARDSHAW et al., 2005), anticarcinogênica (ITO et

al., 1997; KIMURA et al., 2004; MIZUNO et al., 1990ab; OSHIMAN et al., 2002),

22

antimutagênica (AHN et al., 2004; DELMANTO et al., 2001; MENOLI et al., 2001;

SOUZA-PACCOLA et al., 2004), antimetastática (KIMURA, 2004) e antioxidante

(KER et al., 2005). Outros compostos presentes no A. brasiliensis podem atuar de

forma isolada ou sinérgica com as β-D-glucanas, sendo os principais compostos

proteínas (CHO et al., 2004), ergosterol (HIROTANI et al., 2000ab; 2002ab; 2005;

CAMELINI et al., 2005) e lipídeos (CAMELINI et al., 2005). As proteínas

demonstraram atividade regulatória sobre células e ativação de macrófagos e

linfócitos (HO et al., 2004). O ergosterol faz parte da fração lipídica e está

presente na membrana celular de diversos fungos, com ação antiangiogênica,

além de precursor de ergocalciferol (Vitamina D), sendo possíveis que estes

compostos atuem também como agentes antioxidantes (TAKAKU et al., 2001).

A determinação da atividade antioxidante do Agaricus brasiliensis é

relevante para verificar seu potencial como alimento funcional, tanto para a

alimentação humana como animal. Entretanto podem ocorrer variações na

atividade antioxidante em função da linhagem e fases de maturação do

basidiocarpo, já que os estágios de maturação caracterizam-se por mudanças

bioquímicas no basidiocarpo, principalmente pela formação dos esporos. Em

geral, basidiocarpos de A. brasiliensis em diferentes estágios de crescimento

apresentam variação na concentração de proteínas e de β-D-glucanas,

consideradas importantes na atividade biológica (CAMELINI et al., 2005).

Camelini et al. (2005) descreveram o aumento das (1-3)-β-D-glucanas em

frutificações maduras e que as (1-6)-β-D-glucana não sofrem alterações de suas

quantidades. É importante enfatizar que a cadeia linear (1-6)-β-D-glucana extraído

de Penicillium isladicum não apresentou bioatividade, como, descrito por Ohno et

al. (1986). No entanto, as ramificações (1-3)-β-D-glucanas são estruturalmente

importantes e responsáveis pelo aumento da atividade imunomodulatória destes

polissacarídeos (DONG et al., 2002).

Além da possível variação da atividade biológica em função do estágio de

maturação, o mercado consumidor é exigente quanto aos padrões morfológicos

da frutificação, particularmente o estágio de maturação das frutificações,

valorizando frutificações com píleos fechados, ou seja, frutificações ainda

23

imaturas por serem menos frágeis e pela sua maior rigidez; características que

facilitam manter sua estrutura morfológica até o consumidor.

Assim para ampliar o conhecimento desta área e dar suporte ao uso de

alimentos funcionais e comerciais, o objetivo deste trabalho foi determinar as

condições de extração dos princípios ativos antioxidante em dois estágios de

maturação do basidiocarpo do Agaricus brasiliensis e verificar a atividade

antioxidante de linhagens de A. brasiliensis em dois estágios de maturação do

basidiocarpo (aberto e fechado).

MATERIAIS E MÉTODOS

O experimento foi executado no Laboratório de Biologia Molecular da

Universidade Paranaense – Campus Sede Umuarama-PR. Primeiramente foi

realizado a padronização da extração dos princípios ativos antioxidantes do A.

brasiliensis. Para tanto foi utilizado a linhagem ABL99/30, basidiocarpo fechado.

Para avaliação da atividade antioxidante do A. brasiliensis em diferentes fases de

desenvolvimento do basidiocarpo foram utilizados as linhagens ABL99/26,

ABL99/28, ABL99/29, ABL99/29A e ABL99/30 com basidiocarpo com o véu

rompido (aberto) e antes do rompimento do véu (fechado), codificado como 26A,

28A, 29A, 29AA e 30A (basidiocarpo aberto) e 26F, 28F, 29F, 29AF, 30F

(basidiocarpo fechado). Todas as linhagens foram provenientes do Departamento

de Produção Vegetal, Faculdade de Ciências Agronômicas, UNESP, Botucatu-

SP. Os corpos de frutificação foram produzidos pelo método de compostagem

(BRAGA et al., 1998), colhidos, lavados, desidratados em estufa com circulação

de ar a 60 oC, moídos em moinho de facas e armazenado a -70 ◦C.

Padronização do preparo do extrato do basidiocarpo moído

Após desidratação e moagem do basidiocarpo fechado, da linhagem

ABL99/30, 1 g foi homogeneizado com 5 mL de diferentes solventes (metanol,

etanol, dimetilsulfóxido (DMSO) e água) e mantido em diversos tempos (15, 30,

45 e 60 min) e temperaturas (15, 30, 45 e 60 °C). Neste trabalho foi padronizada

temperatura máxima de 60 ºC, pois mostrou-se mais adequada por estar abaixo

do ponto de ebulição do metanol (65 ºC). Após a extração, a mistura foi resfriada

24

imediatamente em banho de gelo por 15 min e centrifugada a 4410 g por 5 min a

5 °C. O sobrenadante foi considerado extrato bruto e utilizado na avaliação da

atividade antioxidante pelo método de 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH)

(SHIMADA et al., 1992).

Após a padronização da metodologia foi avaliada a atividade antioxidante

do basidiocarpo em duas fases de desenvolvimento do basidiocarpo (aberto e

fechado). Os extratos foram preparados de acordo com o melhor resultado obtido

na padronização da extração.

Avaliação da atividade antioxidante

O método de DPPH foi adaptado para a medida da capacidade

seqüestradora de radicais livres para todas as linhagens do fungo com

basidiocarpo aberto e fechado. Para cada 0,1 ml de extrato bruto foi adicionado

2,9 ml de solução metanólica de DPPH (60 µM), preparado no momento do uso

(MENSOR et al., 2001). A leitura foi realizada após 30 min. A absorvância foi

medida a 515 nm usando espectrofotômetro (FEMTO 700 plus). Todos os testes

foram realizados em triplicata, sendo um controle preparado somente com

solvente. As diferenças entre as médias foram avaliadas pelo teste de Tukey

(p≤0,05). A atividade seqüestradora de radicais foi calculada pela percentagem da

descoloração do DPPH usando a equação: %= [(ADPPH _ Aamostra)/ADPPH] x 100

(BARROS et al., 2008). A inibição de radicais DPPH (Shimada et al., 1992) é um

dos métodos mais utilizados para determinação da atividade antioxidante. Este

método é prático, rápido e estável (MOLYNEUX, 2004), sendo muito utilizado

para avaliar a capacidade seqüestradora de radicais livres de produtos naturais

(DUARTE-ALMEIDA et al., 2006).

25

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Tabela 1: Efeito das variáveis de extração sobre a atividade antioxidante do basidiocarpo fechado de Agaricus brasiliensis. Letras diferentes indicam diferenças significativas (p≤0,05).

Solvente

(1:5)

Tempo

(minutos)

Temperatura

(oC)

% Atividade

antioxidante

Desvio-

padrão

Estatística

DMSO 60 60 -34,98 16,51 b

Etanol 60 60 30,61 16,94 a

Metanol 60 60 31,53 2,26 a

Água 60 60 -12,69 2,63 c

Metanol 60 15 15,27 6,67 C

Metanol 60 30 22,28 10,45 CB

Metanol 60 45 28,22 5,36 B

Metanol 60 60 35,93 3,23 A

Metanol 15 60 80,56 5,81 µ

Metanol 30 60 82,38 3,68 β

Metanol 45 60 87,52 3,87 α

Metanol 60 60 82,77 2,51 α

26

Dentre os solventes de extração testados o metanol foi o que apresentou o

melhor resultado (p≤0,05) (Tab. 1). Observa-se ainda que o metanol expressou

maior versatibilidade na extração dos princípios ativos antioxidantes de A.

brasiliensis, uma vez que os valores obtidos foram mais homogêneos quando

comparados com os demais solventes utilizados neste experimento (Tab. 1). Este

comportamento para o metanol pode estar associado à maior solubilidade em

água e a alta afinidade por lipídeos (BADOLATO; DURAN, 2000). Os lipídeos por

sua vez estão intimamente ligados as β-D-glucanas dos fungos, sendo

glicoproteínas da membrana que apresentam diversas atividades biológicas

(BROWN; GORDON, 2001; BETA GLUCAN RESEARCH, 2003). Shibata e

Demiate (2003) relatam uma expressiva fração de apolares, dentre elas os

lipídeos, no basidiocarpo de A. brasiliensis. Outro composto presente na

membrana plasmática é o ergosterol que possui atividade antiangiogênica e

antitumoral (NYLUND; WALLANDER, 1992; WANG et al., 1995), sendo, desta

forma, uma importante região para a presença de princípios ativos. Estas

estruturas possuem áreas polares para interação com a água e regiões apolares

para a interação com os lipídeos de membrana. Assim em função da polaridade

dos solventes utilizados é possível extrair diferentes compostos ativos. Devido a

maior atividade antioxidante do extrato metanólico (p≤0,05) é possível que a

fração de apolares tenha importante ação antioxidante, outra hipótese seria a

maior extração das β-glucanas por interagirem com os lipídeos.

Entre as temperaturas de extração estudadas (15, 30, 45 ou 60 °C), a

temperatura de 60 °C foi a que extraiu maior quantidade de compostos ativos

(p≤0,05) de Agaricus brasiliensis (Tab. 1). Este comportamento pode estar

relacionado com a vibração molecular das estruturas químicas responsáveis pela

atividade antioxidante do fungo. Sabe-se que o aumento da temperatura provoca

o aumento da vibração molecular e consequentemente dos choques entre o

solvente e os solutos, resultando em aumento da extração dos princípios ativos.

Sabe-se também que a temperatura pode ter efeito sinérgico na extração de

compostos ativos, pois pode potencializar sua extração pelo aumento da vibração

molecular, aumentando as passagens dos compostos ativos para o solvente e

velocidade das reações. Entretanto quando muito elevada pode promover a

27

quebra das ligações das moléculas devido ao excesso de vibração molecular

refletindo em redução de sua atividade (DELMANTO et al., 2001). Neste trabalho

observamos que o aumento da vibração molecular é positivo para a extração dos

princípios ativos do cogumelo e que os biocompostos apresentaram resistência

vibracional para esta temperatura. A escolha da temperatura de extração dos

princípios ativos para este trabalho foi em função da temperatura de evaporação

do solvente e da relação entre o aumento do número de choques e da ineficiência

da energia liberada em cada choque para a quebra das moléculas. Temperaturas

mais elevadas (70, 80 e 90 °C) mostraram-se ineficientes, pois ultrapassaram o

ponto de ebulição do solvente metanol (65 °C), provocando assim o desajuste da

concentração do extrato, desta forma padronizou-se temperatura máxima de 60

°C (dados não apresentados).

Entre os tempos de extração avaliados 60 min foi o que apresentou os

maiores resultados (p≤0,05) (Tab. 1). Observa-se ainda que os tempos de

extração menores evidenciam uma extração heterogênea enquanto os tempos de

60 min promovem valores de atividade antioxidante mais homogêneos (Tab. 1).

Este comportamento pode estar associado ao tempo prolongado de ação do

solvente sobre membrana do fungo, promovendo além da maior extração do

princípio ativo maior homogeneidade de extração. Aparentemente, ocorrem

alterações ao nível de parede ou membrana celular que possibilitam, após certo

tempo, a liberação do princípio ativo.

Atividade antioxidante de A. brasiliensis em diferentes fases de

desenvolvimento do basidiocarpo.

A atividade antioxidante do A. brasiliensis variou entre as linhagens do

cogumelo e entre as diferentes fases de desenvolvimento do basidiocarpo (Fig.

1). Apesar de haver variabilidade da atividade, todas as linhagens de A.

brasiliensis testadas apresentaram atividade antioxidante. As linhagens com

maiores atividades foram a 26F e 29AF para o cogumelo fechado e a 29AA para o

cogumelo aberto. A bioatividade dos cogumelos pode ser afetada em função de

algumas variáveis como, substrato, temperatura, luminosidade, variações de pH,

microrganismos presentes em diferentes habitats. Estas variáveis podem interagir

28

e/ou modificar aspectos físico-químicos do cogumelo que irá refletir na variação

de seus produtos metabólicos (SILVA et al., 2004).

Nossos resultados demonstraram diferença da atividade antioxidante entre

as linhagens, apesar de Colauto et al. (2002) relatarem baixa variabilidade

genética para estas mesmas linhagens. É provável que este comportamento seja

reflexo de alterações decorridas por variações ambientais do local de cultivo

original, devido ao baixo controle ambiental de cultivo, principalmente quando o

método de cultivo é no solo ao ar livre, conferindo, dessa forma, características

variáveis sobre sua bioatividade.

Entre as fases de desenvolvimento avaliadas os cogumelos com

basidiocarpo fechado apresentaram melhores resultados (p≤0,05). O grupo

composto por cogumelos fechados apresentou em média uma atividade

antioxidante 24% ± 2% maior que a atividade média do grupo composto por

cogumelos abertos. Bellini et al. (2003) relataram que a redução dos danos

cromossômicos com extrato de A. blazei na fase jovem de desenvolvimento foi

maior que na fase esporulada. Dentre as substâncias ativas dos fungos as

glicoproteínas, principalmente as β-D-glucanas, são os principais responsáveis

pela atividade biológica (BETA GLUCAN RESEARCH, 2003; JONG, 2002). As β-

D-glucanas são constituintes naturais da parede celular diferindo entre si pelo tipo

de ligações e ramificações, características que lhes conferem estruturas

específicas e ações biológicas distintas, sendo, portanto, a característica

estrutural um fator fundamental para sua ação (BETA GLUCAN RESEARCH,

2003; JONG, 2002). É importante ressaltar que existem relatos demonstrando

maior potencial para bioatividade nas β-D-glucanas que dispõem de ramificações

na cadeia principal e elevada massa molecular (CHIARA et al.,1970; MIZUNO,

1999; SAITÔ et al., 1977). O grau dessas ramificações também pode ser um

modulador da bioatividade como demonstrado para Sacharomyces cereviseae

que aumentou a atividade das células do sistema imunológico proporcionalmente

ao aumento no grau de ramificações (CLEARY; GRAHAM; HUSBAND, 1999).

Minato et al. (2001) verificaram nas espécies medicinais de cogumelos como

Lentinula edodes e Grifola frondosa que as concentrações de β-D-glucanas

aumentaram durante a maturação das frutificações, seguida de diminuição ao

29

final da maturação. Também para A. brasiliensis foi demonstrado um aumento no

rendimento das β-Dglucanas durante a maturação das frutificações (CAMELINI et

al., 2005). No estágio maduro houve aumento de (1-3) –β-D-glucana e diminuição

nos cogumelos com basidiocarpo fechado. Segundo Dong et al. (2002) e Mizuno

et al. (1990a), o principal efeito terapêutico do A. blazei está relacionado aos

polissacarídeos, principalmente (1→6)-(1→3)-β-D-glucanas. Entretanto,

Kawagishi et al. (1989) e Mizuno et al. (1990b), demonstraram que o

polissacarídeo solúvel na fração alcalina com maior atividade é o composto

(1→6)-β-D-glucana-proteína. No entanto, Ohno et al. (2001) demonstraram que o

polissacarídeo responsável pela atividade anti-tumoral possuiu cadeia principal

(1→6)-β-D-glucana com ramificações (1→3)-β-D-glucanas.

Nossos resultados relatam que cogumelos com basidiocarpos fechados

apresentaram melhor atividade antioxidante comparado com os cogumelos com

basidiocarpo aberto. Esse dado sugere que a bioatividade das β-D-glucanas

isoladas (somente ramificações) é menor que no seu estado bruto (cadeia

principal com suas ramificações). Sugere-se ainda a ação de outros compostos

(vitaminas, ergosterol, lipídeos) que somados as β-D-glucanas atuam

sinergicamente potencializando sua bioatividade. No caso de A. blazei, foi

demonstrada a atividade anti-angiogênica nas frações lipídicas contendo

ergosterol, administradas por via oral resultando na redução do crescimento

(volume) de tumores em camundongos portadores do tumor Sarcoma-180 Takaku

et al. (2001).

30

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

29A 28A 30A 26A 30F 29AA 28F 29F 26F 29AF

% A

tivi

dad

e an

tioxi

dan

te

Figura 1: Atividade antioxidante de A. brasiliensis em diferentes fases de maturação do basidiocarpo (metanol, 60 min, 60 °C). Letras diferentes indicam diferenças significativas (p≤0,05) pelo teste de Tukey.

CONCLUSÃO

Os dados obtidos neste trabalho demonstram que o A. brasiliensis é uma

fonte natural de antioxidantes. Para extração dos compostos antioxidantes o

metanol possui a melhor capacidade de extração dos princípios ativos

antioxidantes do basidiocarpo desidratado moído de A. brasiliensis a temperatura

de 60 °C por 60 min, as linhagens de A. brasiliensis ABL99/26 e ABL99/29A com

basidiocarpo fechado e ABL29A com basidiocarpo aberto tiveram maiores

atividade antioxidante, basidiocarpos fechados possuem em média 24% ± 2%

atividade antioxidante maior que os abertos.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Universidade Paranaense, Fundação Araucária e CNPq

pelo apoio financeiro.

ac

c

cb b

b ac ac

a a b

31

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38

Capítulo 2

ATIVIDADE DE Agaricus brasiliensis NA MIGRAÇÃO CELULAR EM

PROCESSO INFLAMATÓRIO

RESUMO

Agaricus brasiliensis é um cogumelo nativo no Brasil, conhecido popularmente

como Cogumelo-do-Sol. Este fungo tem sido amplamente consumido em

diferentes partes do mundo, devido às suas propriedades terapêuticas. Entre as

atividades já relatadas a propriedade antiinflamatória carece de comprovação

científica, visando dar suporte ao uso deste cogumelo na promoção da saúde.

Neste sentido, o presente trabalho avaliou o efeito do extrato aquoso de A.

brasiliensis, colhido em duas fases de maturação (aberto e fechado), na migração

celular durante processos inflamatórios em ratos. Foi utilizada a linhagem ABL

ABL99/25, com basidiocarpo aberto e fechado. O extrato foi preparado utilizando

25 g do cogumelo em pó misturado em 500 mL de água destilada mantido em

banho-maria a 60ºC por 60 min. Os animais foram divididos em cinco grupos:

grupo controle tratados com salina, dois grupos tratados na dose de 55 mg/kg e

110 mg/kg de extrato do cogumelo aberto ou fechado com 11 animais em cada

grupo. O tratamento ocorreu por 18 dias. Após o 8° dia de tratamento foi realizada

a formação da bolsa de ar no tecido subcutâneo dos animais, decorridos 10 dias

foi injetado agente flogístico na bolsa de ar. Para a avaliação da migração celular

nos diferentes momentos do experimento a coleta de sangue foi realizada antes

do tratamento, no 8°, e 18° dias. A coleta do exsudato da bolsa de ar previamente

formada, também foi realizada ao final do experimento. Os animais tratados com

os extratos de A. brasiliensis, nas diferentes doses e fases de maturação do

basidiocarpo, não alteraram o número de leucócitos no sangue periférico após o

estímulo com carragenina (2%). Entretanto o extrato inibiu (p≤0,05) a migração

celular para o foco da lesão nas doses de 55 e 110 mg/kg para o basidiocarpo

fechado e 110 mg/kg para basidiocarpo aberto, comprovando maior atividade do

basidiocarpo fechado. Estes resultados indicam que o A. brasiliensis apresenta

importante atividade inibitória sobre a infiltração de leucócitos para o foco da

39

lesão, sugerindo uma possível atividade moduladora da resposta antiinflamatória

no modelo utilizado.

Palavras-chave: A. blazei, basidiomiceto, células sanguíneas, atividade biológica.

40

ABSTRACT

A. brasiliensis mushroom is a native Brazil, popularly known as mushroom-of-Sun.

This fungus has been widely consumed in different parts of the world, due to its

therapeutic properties. Among the activities already reported the ownership

antiinflammatory lacks scientific proof, to support use of this mushroom in

promoting health. Accordingly, the present study assessed the effect of aqueous

extract of A. brasiliensis, collected at different stages of maturity (open and

closed), in cell migration during inflammatory processes in mice. It was used to

line ABL99/25, with basidiocarp opened. The treatement was prepared using 25

grams of mushroom powder mixed in 500 ml of distilled water held in water bath at

60 º C for 60 min. The animals were divided into five groups: control group treated

with saline, two groups treated at a dose of 55 mg / kg of extract open or closed

and two groups treated with 110 mg / kg of extract open or closed with 11 animals

in each group. The treatment was for 18 days. After the 8 th day of treatment was

carried out the formation of exchange of air in the subcutaneous tissue of animals,

within 10 days was injected phlogistic agent in exchange of air. For the evaluation

of cell migration in the various moments of the trial the collection of blood was

performed before treatment, in 8, and 18 days, the collection of exudation was

also held at the end of the experiment. The animals treated with the extracts of A.

brasiliensis, in doses and different stages of maturation of the basidiocarp, did not

alter the number of leukocytes in peripheral blood after stimulation with

carrageenan (2%). However the extract inhibited (p≤0.05) cell migration to the

outbreak of the injury at doses of 55 and 110 mg/kg for basidiocarp closed and

110 mg/kg for basidiocarp open, showing increased activity of basidiocarp closed.

These results indicate that A. brasiliensis presents important inhibitory activity on

the infiltration of leukocytes to the outbreak of the injury, suggesting a possible

modulation response antiinflammatory activity in the model used.

Keywords: basidiomycets, leukocytes, antiinflammatory activity, exudation.

41

INTRODUÇÃO

A inflamação é um processo de defesa do organismo contra uma lesão

tecidual, causada por agentes físicos, químicos, ou biológicos. Neste processo,

células imunologicamente competentes migram para o local agredido para

destruir o agente invasor e remover substâncias irritantes. Apesar de necessário,

este processo de defesa pode ocasionar uma resposta excessiva, que pode

causar lesão tecidual progressiva (ZANINI; OGA,1994). Em tais casos, fármacos

antiinflamatórios ou imunossupressores podem ser necessários para modular o

processo antiinflamatório, diminuindo ou até mesmo inibindo a migração celular

para o local agredido. No entanto, tais fármacos exibem efeitos colaterais

indesejáveis como reações cutâneas, distúrbios renais, hepáticos e

gastrointestinais (RANG et al., 2007).

Dentro deste contexto, a população tem grande interesse pelo uso de

substâncias naturais que possuem efeitos biológicos e que ofereceram menores

efeitos colaterais. Dessa maneira o interesse por produtos naturais com

propriedades medicinais vem aumentando ao longo dos anos, e muitos destes

produtos têm sido frequentemente utilizados na dieta alimentar, particularmente

os cogumelos, incluindo o Agaricus blazei Murrill (LOHAMN et al., 2001). O

Agaricus brasiliensis Wasser et al. (=A. blazei Murrill ss. Heinemann) (WASSER et

al., 2002), considerado A. subrufescens Peck por Kerrigan (2005) é um

Basidiomiceto, freqüentemente utilizado como alimento ou na forma de chás, que

tem sido alvo de vários estudos em relação a sua atividade antitumoral (BRAGA

et al., 1998; KAWAGISHI et al., 1990; MIZUNO et al., 1990), imunomoduladora

(NAKAJIMA et al., 2002; AHN et al., 2004), antidiabética (KIM et al., 2005),

antiinfecciosa (BERNARDSHAW et al., 2005), anticarcinogênica (ITOH et al.,

1997; KIMURA et al., 2004; MIZUNO et al., 1990; OSHIMAN et al., 2002),

antimutagênica (AHN et al., 2004; MENOLI et al., 2001; SOUZA-PACCOLA et al.,

2004), antimetastática (KIMURA, 2004) e antioxidante (KER et al., 2005).

Entre os constituintes químicos presentes no A. brasiliensis destacam-se

os polissacarídeos e as glicoproteínas, ambos presentes principalmente na

parede celular (ASPINALL, 1982). O desenvolvimento do corpo frutífero do A.

42

brasiliensis pode influenciar na composição química e estrutura de seus

polissacarídeos. De maneira geral, a maior parte dos polissacarídeos presentes

são β-D-(1-6) glucanas; já a quantidade de glucanas β-D-(1-3) é pequena em

corpos frutíferos imaturos (basidiocarpo fechado) e aumenta durante sua

maturação (basidiocarpo aberto) (CAMELINI et al., 2005). A partir do extrato do

corpo frutífero verificou-se também a presença de cadeias β-D-(1-4) nos

polissacarídeos (KAWAGISHI et al., 1990; MIZUNO et al., 1990 a,b; MIZUNO et

al., 1995; ITO et al., 1997; MIZUNO et al., 1999a,b; GONZAGA et al., 2005). As β-

D-(1-3) glucanas são relatadas como importantes na atividade biológica do A.

brasiliensis (DONG et al., 2002), desta forma a fase de desenvolvimento do

basidiocarpo pode afetar a atividade biológica do cogumelo, já que basidiocarpos

abertos possuem maior quantidade de β-D-(1-3) glucanas. Por outro lado,

basidiocarpos fechados são mais valorizados no mercado devido a facilidade de

manuseio e os supostos potencializadores da atividade biológica (CAMELINI et

al., 2005; BELLINI et al., 2003).

Segundo Ereno (2004) as propriedades farmacológicas do A. brasiliensis

ainda estão sendo estudadas para a comprovação dos relatos populares sobre os

benefícios proporcionados pela utilização deste cogumelo. Assim, apesar da

quantidade de informações presentes na literatura, não foram encontrados relatos

sobre a atividade do A. brasiliensis na modulação da resposta inflamatória sobre a

migração celular, e nem sobre o efeito da fase de desenvolvimento do

basidiocarpo sobre esta atividade. A atividade modulatória de produtos naturais é

comumente realizada através da utilização da carragenina, um polissacarídeo

polissulfatado, cujo efeito fisiológico inclui a indução de um processo inflamatório

(HAMBLETON et al., 1989; SATO, et al., 1980; SEDGWICH et al., 1986).

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar em ratos, o efeito do tratamento

com extrato aquoso de A. brasiliensis, com basidiocarpo aberto e fechado, sobre

a migração celular ocorrida em processos inflamatórios induzido por carragenina.

43

MATERIAIS E MÉTODOS

Preparação do extrato aquoso de A. brasiliensis

A. brasiliensis, linhagem ABL99/25, com basidiocarpo aberto e fechado foi

obtido da Micoteca do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade

Paranaense – Campus Sede – Umuarama – PR. O corpo de frutificação do A.

brasiliensis por compostagem foi previamente desidratado em estufa com

circulação de ar a 60 oC, moído em moinho de facas e armazenado a -70 oC.

O extrato foi preparado pela mistura do pó desidratado de A. brasiliensis

(25 g à água destilada (500 mL) e mantido em banho-maria a 60 ºC por 60 min

(BARBISAN, 2002). Em seguida, a mistura foi filtrada (papel filtro Qualy, 80 g/m2,

espessura 205 µm, porosidade 14 µm) e armazenado em alíquotas de 10 mL em

freezer a -70 °C.

Tratamento dos ratos com o extrato aquoso de A. brasiliensis

Foram utilizados ratos Wistar machos com quatro meses de idade, com

massa média de 207 g ± 20 g, provenientes do Biotério da Universidade

Paranaense – UNIPAR – Umuarama -PR. Os animais foram adaptados ao local

do experimento por sete dias, e mantidos em caixas plásticas convencionais a 22

°C ± 2 °C, no biotério setorial do Laboratório de Farmacologia, com ciclo de 12 h

claro/escuro e com livre acesso à ração e água. Os animais foram divididos em

cinco grupos de 11 animais: grupo controle (Ctl), tratado com solução salina 0,9%

e os grupos experimentais A55, F55, A110 e F110 tratados na dose de 55 e 110

mg/kg de extrato aberto ou fechado, respectivamente. Durante 18 dias foi

administrado diariamente por gavagem 1 mL dos extratos ou da solução salina. A

massa corpórea dos animais foi registrada antes e após os tratamentos, conforme

Fig. 1.

44

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Figura 1. Esquema do protocolo de indução e acompanhamento da resposta

inflamatória em ratos.

Resposta inflamatória no tecido subcutâneo

A resposta inflamatória no tecido subcutâneo foi desenvolvida conforme

descrito por Edward et al. (1981). No 8º dia de tratamento foram injetados 20 mL

de ar estéril no tecido subcutâneo do dorso depilado dos animais, formando uma

bolsa de ar para indução do processo inflamatório. No 15º dia, a bolsa de ar foi

reforçada com a injeção de mais 20 mL de ar estéril.

A indução da migração celular foi realizada no 18º de tratamento. Para tanto

nos animais, previamente anestesiados com Tiopental 50 mg/kg, foi injetado na

bolsa de ar 1,0 mL de solução aquosa de carragenina 2%. Após seis horas, os

animais foram novamente anestesiados e sacrificados por dose letal de Tiopental

(150 mg/kg). A bolsa de ar foi aberta com auxílio de bisturi e o exsudato foi lavado

com 5 mL de tampão fosfato-salina (PBS) pH 7,2 (NaCl = 137 mmol, KCl = 2,7

mmol e tampão fosfato = 10 mmol) e recolhido com auxílio de pipeta Pasteur. O

exsudato foi centrifugado a 177 g por 10 min, sendo o sobrenadante desprezado.

O precipitado foi ressuspenso em 1,0 mL de PBS e realizada a contagem total de

leucócitos.

-Início dos

tratamentos

- Coleta de sangue

- Indução da bolsa

de ar (20 mL)

- Reforço

da bolsa de

ar (20 mL)

- Aplicação do

agente

flogístico

Coleta de

sangue e

exsudato

45

Os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa

Envolvendo Experimentação Animal (CEPEEA) da Universidade Paranaense –

Umuarama – PR.

Análises de sangue e exsudato

Para avaliar a resposta do tratamento com os extratos de A. brasiliensis

sobre a migração celular foi realizado a contagem do número de leucócitos totais

presentes no sangue circulante antes e após o tratamento com extratos de A.

brasiliensis (antes da formação da bolsa de ar). Da mesma forma, com a intenção

de avaliar se, sob estímulo inflamatório (injeção de solução aquosa de

Carragenina 2%), o tratamento experimental interferiria com a capacidade de

mobilização das células brancas, dos compartimentos de reserva para a

circulação, foi determinado o número de leucócitos totais presentes no sangue

circulante no 18° dia de tratamento 6 h após a injeção do agente flogístico

(carragenina 2%) na bolsa de ar previamente formada. A coleta de sangue foi

realizada do plexo orbital, local mais acessível para coleta em roedores, com

auxílio de capilares de vidro embebidos em EDTA (10%), para tanto os animais

foram anestesiados com Tiopental (50 mg/kg).

A contagem de leucócitos totais foi realizada em câmara de Neubauer,

utilizando-se líquido de Turk 1:20 (LIMA et al., 1997). Para avaliar o tipo celular

predominante no sangue periférico, após a indução do estímulo inflamatório no

18° dia de tratamento 6 h após a injeção do agente flogístico (carragenina 2%), foi

realizada a contagem diferencial das células do sangue circulante. O número

diferencial de leucócitos foi determinado com a preparação de extensões

sangüíneas preparadas após a coleta do sangue e coradas pelo método clássico

de coloração de May Grunwald-Giemsa (ROSENFELD, 1947).

Análise estatística

Os resultados foram expressos como a média ± e.p.m. (erro padrão da

média). A significância estatística foi determinada através do teste “t” de Student e

foram considerados estatisticamente significantes valores de p≤0,05. Os gráficos

46

foram elaborados com o programa Prisma for Windows versão 4.0 (GraphPad

Software, San Diego, CAN, USA).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

O período de tratamento adotado no presente estudo foi determinado com

base na cinética da produção e maturação para a série granulocítica, pois neste

estudo foi enfocada a capacidade da migração celular após o tratamento com A.

brasiliensis em diferentes fases de maturação do basidiocarpo onde os

polimorfonucleares são participantes do processo. Os granulócitos humanos são

produzidos na medula óssea e passam por diferentes etapas de maturação que

se prolongam por cerca de 14 dias. A partir de então, já maduros, os

polimorfonucleares são mobilizados para o sangue periférico. Nesta localização

circulam por 6 a 7 h, e migram, subseqüentemente, para tecidos adjacentes, onde

permanecem por aproximadamente dois dias e em seguida, são fagocitados por

células competentes no interstício (macrófagos e células dendríticas) (RYAN,

2001a,b).

Os animais dos diferentes grupos experimentais não mostraram variações

significativas na medida da massa corporal após 18 dias de tratamento (dados

não apresentados). É importante considerar que os tratamentos não provocaram

danos aparentes aos animais, uma vez que não foram verificados prejuízos no

ganho de massa corporal e/ou alterações comportamentais.

A realização do leucograma mostrou que o número total de leucócitos entre

o início dos experimentos e no 8º dia de tratamento não apresentou variações

significativas (Tabela 1). Este dado é positivo, pois, demonstra que o extrato

aquoso de A. brasiliensis não provoca alterações na produção nem na migração

de células sanguíneas. Apesar de haver aumento do valor médio dos leucócitos,

não houve diferença significativa. Este pequeno aumento ocorreu devido à

variabilidade do número de leucócitos totais que são diferentes de um animal para

outro.

47

Tabela. 1 - Efeito do tratamento com extrato de basidiocarpos aberto e fechado

de A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário antes do estímulo inflamatório. (n=11)

Tratamento Número células

(mm3)

Ctl(AT) Controle no dia zero, antes do início do tratamento 5475 ± 1131

Ctl(DT) Controle após 8 dias de tratamento com solução

salina

6850 ± 887,6 NS

A55 Após 8 dias de tratamento com extrato de

basidiocarpo aberto (55 mg/kg)

7357 ± 1153 NS

A110 Após 8 dias de tratamento com extrato de

basidiocarpo aberto (110 mg/kg)

8036 ± 1202 NS

F55 Após 8 dias de tratamento com extrato de

basidiocarpo fechado (55 mg/kg)

7421 ± 1105 NS

F110 Após 8 dias de tratamento com extrato de

basidiocarpo fechado (110 mg/kg)

8264 ± 1352 NS

Legenda: NS= Não significativo em relação ao Ctl(AT) Controle antes do

tratamento; Ctl(DP) Controle depois do tratamento.

Na Figura 2 são apresentados os resultados dos leucócitos circulantes

antes e após o estímulo inflamatório. Pode-se observar que os animais tratados

com os extratos de A. brasiliensis, nas diferentes doses e fases de maturação do

basidiocarpo, não alteraram o número de leucócitos no sangue periférico após o

estímulo com carragenina (2%), quando comparados aos valores basais (sem

estímulo). Entretanto, o grupo controle tratado apenas com solução salina,

apresentou um aumento significativo de leucócitos em decorrência da resposta

inflamatória induzida pela carragenina. Vale ressaltar que o incremento no

48

número de leucócitos circulantes, predominantemente de polimorfonucleares

(PMN), é evento característico em respostas inflamatórias agudas induzidas por

diferentes agentes flogísticos (SASSON et al., 1998; ORDENEZ et al., 2000).

Apesar de haver uma tendência no aumento dos leucócitos circulantes (Figura 2)

não houve diferença significativa. Mais uma vez, esse pequeno aumento é

decorrente da variabilidade do número total de leucócitos que são diferentes entre

os animais. Este dado ressalta o efeito benéfico da utilização do cogumelo A.

brasiliensis em processos inflamatórios, uma vez que a resposta celular

exacerbada pode provocar prejuízos severos e irreversíveis ao indivíduo (ZANINI;

OGA,1994).

Ctl (A

T)

Ctl Sal

ina

(AEI)

A 55

A 110

F 55

F 110

0

2500

5000

7500

10000

12500

*

Leu

cóci

tos

tota

is (

mm

3 )

Figura. 2 - Efeitos do tratamento com extrato de basidicarpos aberto e fechado de A. brasiliensis sobre o perfil leucocitário total. *Diferença significativa pelo teste t de Student. Ctl(AT)= Controle antes do tratamento; Ctl(AEI)= Controle tratado com salina após o estímulo inflamatório.

A Tabela 2 apresenta os resultados da análise diferencial dos leucócitos

antes e após o estímulo inflamatório. A análise diferencial de leucócitos mostrou

que, após a indução da resposta inflamatória houve aumento de leucócitos

segmentados no sangue periférico, tanto no grupo controle quanto nos grupos

Dia 18 - Após o estímulo inflamatório

Dia 0 – Antes do estímulo inflamatório

49

experimentais (Tabela 2). Esse resultado reflete a maior mobilização de leucócitos

segmentados nas fases finais de maturação na medula óssea. Interessantemente

não foi verificado comprometimento na produção dessas células, pois em nenhum

momento foi visualizada a presença de células imaturas (bastonetes, blastos).

Este dado demonstra que o aumento de leucócitos segmentados observado em

ambos os grupos (tratados e não tratados) foi em decorrência da resposta

inflamatória aguda induzida pela carragenina, evento característico. E que os

extratos de A. brasiliensis não exercem interferência na produção e maturação

dessas células na medula óssea. Da mesma forma, não foram observadas

variações significativas no número de células mononucleares após 18 dias de

tratamento (dados não mostrados), pois, o mecanismo de defesa mediado pelas

células mononucleares é evento tardio presentes em processos inflamatório

crônico, diferente do protocolo utilizado nesse experimento (AL-SARIREH;

EREMIN, 2000).

Tabela 2. Análise diferencial dos leucócitos demonstrando o efeito do tratamento com A. brasiliensis sobre o perfil dos polimorfonucleares antes e após estímulo inflamatório com carragenina em ratos.

POLIMORFONUCLEARES

Tratamento Número

células

(mm3)

Ctl(AT) Controle no dia zero, antes do início do tratamento 1876 ± 344

Ctl(AEI) Controle ao final do experimento com solução salina,

após o estímulo inflamatório

3326 ± 660*

A55 Final do experimento com extrato de basidiocarpo

aberto (55 mg/kg)

2871 ± 387*

A110 Final do experimento com extrato de basidiocarpo

aberto (110 mg/kg)

3513 ±497**

50

F55 Final do experimento com extrato de basidiocarpo

fechado (55 mg/kg)

4251 ±

393***

F110 Final do experimento com extrato de basidiocarpo

fechado (110 mg/kg)

4112 ± 576**

Legenda: Ctl(AT) Controle antes do tratamento; Ctl(AEI)=Controle após estímulo

inflamatório.

Os dados apresentados na Figura 3 mostram a variação do influxo

leucocitário para o tecido subcutâneo inflamado em animais tratados com o

extrato aquoso de A. brasiliensis nas diferentes doses e estágio de

desenvolvimento do basidiocarpo em relação ao controle. Pode-se observar que

em relação ao grupo controle, os animais tratados com extrato de A. brasiliensis

apresentaram redução (p≤0,05) na migração celular, enquanto que os grupos

tratados com extrato com basidiocarpo aberto na dose de 55 mg/Kg não

apresentaram redução. Os valores obtidos demonstraram que o tratamento com

A. brasiliensis alterou a capacidade de migração de leucócitos para o foco da

lesão, uma vez que o número total de células foi menor (p≤0,05) nos animais

tratados com os extratos de A. brasiliensis em relação aos animais controle

(tratados com salina). Esse dado reforça mais uma vez a importância da utilização

do A. brasiliensis nos processos inflamatórios, pois além de atenuar a migração

leucocitária dos compartimentos de reserva para o espaço vascular (corrente

circulatória) os extratos de A. brasiliensis também demonstraram capacidade

inibitória sobre a migração celular para o local da lesão, não permitindo que a

resposta celular exacerbada ofereça prejuízos ao indivíduo.

Os constituintes químicos majoritários do A. brasiliensis (glucanas) podem

ser diferentes segundo a fase de maturação do cogumelo, refletindo assim em

sua atividade biológica. Sugere-se que o princípio ativo responsável pela inibição

da mobilização celular do A. brasiliensis encontra-se em maior quantidade nas

fases imaturas do cogumelo (basidiocarpo fechado). Fato que justifica a razão do

51

extrato com basidiocarpo aberto em sua menor concentração (55 mg/kg) não

provocar inibição da migração celular após indução da resposta inflamatória.

Ctl (s

alin

a)

A 55

A 110

F 55

F 110

0

5000

10000

15000

* * *

Cél

ula

s ex

sud

ato

(m

m3)

Figura 3 - Efeitos dos tratamentos com extratos de A. brasiliensis sobre a mobilização de leucócitos para o tecido subcutâneo inflamado (modelo da bolsa de ar). *Diferença significativa pelo teste t de Student.

O tratamento com A. brasiliensis acarretou uma diminuição significativa da

migração dos leucócitos para o exsudato em relação ao controle (salina), assim,

os resultados obtidos neste estudo sugerem uma atividade moduladora na

resposta inflamatória por atenuar a migração celular para o foco da lesão,

entretanto, a afirmativa de uma cabal resposta antiinflamatória não pode ser

confirmada com exatidão, pois outros eventos presentes nos processos

inflamatórios (dor, formação de secreção, edema) necessitariam ser avaliados

para comprovar tal atividade. Neste sentido, a participação de moléculas de

adesão no efeito observado pode ser postulada, pois drogas antiinflamatórias

clássicas (glicocorticóides) reduzem a migração celular para o foco da inflamação

interferindo com a externalização ou a expressão destas moléculas (VINEGAR et

al., 1979). Da mesma forma, um provável efeito inibitório sobre a vasodilatação

mediada por prostaglandinas poderia contribuir para este efeito, pois os extratos

52

empregados neste estudo apresentaram uma atividade de maneira similar à

observada por Vigil et al. (2008) com a utilização da indometacina, um clássico

inibidor da síntese de prostaglandinas.

Pesquisas adicionais se mostram necessárias para o melhor entendimento

dos processos envolvidos na resposta inflamatória em ratos tratados com extratos

de A. brasiliensis. Estudos que envolvam diferentes etapas do tratamento, além

dos mediadores inflamatórios envolvidos na mobilização e resposta celular

observada seriam importantes para o esclarecimento do papel dos compostos

presentes no extrato aquoso de A. brasiliensis. Desta forma, o entendimento dos

mecanismos envolvidos na resposta imunológica de animais tratados com extrato

aquoso de A. brasiliensis se mostra de grande importância e indispensável para a

garantia da eficácia e segurança do uso do cogumelo na terapêutica.

CONCLUSÃO

O presente trabalho sugere que o extrato aquoso obtido de A. brasiliensis

apresenta um ou mais constituintes químicos capazes de modular significamente

a resposta inflamatória inibindo o influxo de leucócitos para o sítio da lesão, sem

mostrar sinais agudos e subcrônicos de toxicidade. A inibição da migração celular

para o foco da lesão foi diferente em fase da maturação do basidiocarpo, sendo

que a fase imatura apresentou melhores resultados. Assim, estudos posteriores

podem confirmar a atividade aqui relatada possibilitando o uso seguro e eficaz

deste cogumelo no tratamento de processos inflamatórios, evidenciando, inclusive

os mecanismos moleculares envolvidos nesta resposta.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Universidade Paranaense, Fundação Araucária e CNPq

pelo apoio financeiro.

53

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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57

CAPÍTULO 3

ATIVIDADE ANTINEOPLÁSICA DE BASIDIOCARPOS DE Agaricus brasiliensis

EM DIFERENTES FASES DE MATURAÇÃO

RESUMO

O fungo Agaricus brasiliensis é um Basidiomiceto estudado em relação às suas

substâncias imunomoduladoras e antitumorais. O objetivo deste trabalho foi verificar a

atividade antineoplásica in vivo de Agaricus brasiliensis, em diferentes estágios de

maturação do basidiocarpo, em camundongos implantados com células de Sarcoma 180.

Após sete dias da implantação das células tumorais, os camundongos foram tratados via

oral, diariamente, no grupo um, com solução salina 0,18% (controle), no grupo dois, com

extrato de basidiocarpo com píleo fechado e no grupo três, com extrato de basidiocarpo

com píleo aberto. Após 30 dias do início do tratamento os animais sofreram eutanásia,

sendo o baço utilizado para determinação do índice esplênico e o tamanho da massa

tumoral mensurada. Concluiu-se que não há diferença significativa de inibição do

crescimento tumoral em função da maturação do basidiocarpo para a linhagem de Agaricus

brasiliensis, sendo a atividade antineoplásica média in vivo dos basidiocarpos de 89,22%.

Palavras chave: corpo de frutificação, princípio ativo, antitumor, extrato fúngico.

58

ABSTRACT

The fungus Agaricus brasiliensis is a Basidiomycete studied because of its

immunomodulation and/or antitumor substances. The objective of this research was to

verify the antineoplasic activity in vivo of Agaricus brasiliensis in different basidiocarp

maturation phases on mice implanted with Sarcoma 180 cells. Sarcoma cells were

implanted in Swiss mice and after seven days mice were divided in three groups. Control

group was treated with saline solution, a second group was treated with opened basidiocarp

extract solution and a third group was treated with closed basidiocarp extract solution.

After 30 days of being daily orally treated with these three solutions all animals suffered

euthanasia. It was determined the esplenic rate of the spleen and measured the volume of

the tumor size. It was concluded that there is no significant differences of the tumor growth

inhibition in function of the different basidiocarp maturation phases for the Agaricus

brasiliensis strain, being the in vivo basidiocarp antineoplasic activity average of 89.22%.

Key words: Agaricus blazei, basidiome, active principle, antitumor, fungus extract.

59

INTRODUÇÃO

Agaricus brasiliensis Wasser et al. (A. blazei Murrill ss. Heinemann) (25), que é A.

subrufescens Peck segundo (10), é um Basidiomiceto que tem sido alvo de vários estudos

em relação às suas substâncias antitumorais (2, 9, 16). Estudos demonstraram que a

utilização do extrato aquoso do basidiocarpo de Agaricus blazei promoveu a indução da

produção de células citotóxicas específicas, como linfócitos T e natural killer, bem como

interferon-gama, com conseqüente inibição do crescimento do tumor em roedores (22, 27).

Menoli et al. (14) relataram a redução da freqüência micronuclear na presença do extrato

aquoso do A. blazei e Rodrigues et al. (21) relataram a ação bioantimutagênica do fungo,

sugerindo uma ação sobre um ou mais sistemas de reparo de danos do DNA. Liu et al. (12)

realizaram estudo sobre a atividade imunoestimulatória de extrato do corpo de frutificação

de A. brasiliensis em voluntários humanos e verificaram ação estimulatória sobre o sistema

imunológico nos pacientes, o que evidencia que os modelos de atividade antineoplásica

utilizados em roedores são adequados para este fungo.

A capacidade antineoplásica do A. brasiliensis, para o modelo de células tumorais

de Sarcoma 180, tem sido relatada como proveniente tanto do micélio (16), quanto do

basidiocarpo (18). Entretanto é natural haver variações entre linhagens da mesma espécie

de fungo e entre diferentes fases de crescimento do basidiocarpo de uma mesma linhagem.

Cada estágio de crescimento do basidiocarpo apresenta diferenças bioquímicas, sendo que

basidiocarpos de diferentes linhagens de A. brasiliensis, em diferentes estágios de

crescimento apresentaram modificações da concentração de proteínas e de β-D-glucanas,

consideradas as responsáveis pelo efeito antineoplásico (4).

Durante as fases de maturação do basidiocarpo de fungos, com ausência de véu

universal e presença de véu interno, podemos verificar duas fases distintas e importantes:

60

antes e após o rompimento do véu interno. Este é o momento que ocorrem as principais

mudanças bioquímicas no basidiocarpo. Antes de romper o véu interno o basidiocarpo está

imaturo, com esporos em fase de formação, sendo o basidiocarpo caracterizado como

“cogumelo fechado”. Após o rompimento do véu interno o basidiocarpo está maduro, com

esporos formados e prontos para serem dispersos, iniciando a senescência do corpo de

frutificação (4, 15).

Comercialmente os basidiocarpos desidratados são colhidos antes do rompimento

do véu (cogumelo fechado) devido principalmente às características sensoriais e a maior

firmeza do basidiocarpo que facilita a colheita e reduz fragmentação durante o

processamento (2). Além disto, basidiocarpos colhidos antes do rompimento do véu têm

um visual mais agradável para o consumidor devido a sua coloração mais clara, pois os

esporos do A. brasiliensis têm uma coloração escura dando aparência de sujo ao

basidiocarpo. No entanto Camelini et al. (4) e Firenzuoli et al. (7) sugerem que cogumelos

com basidiocarpo aberto possuem uma melhor atividade biológica por possuírem maior

concentração e diversidade de glucanas e proteínas.

Enquanto que os princípios ativos de alguns Basidiomicetos são extraídos de

micélio ou basidiocarpos imaturos, como o Lentinula edodes (8), Pleurotus ostreatus (1) e

o Agaricus blazei (4), outros como o Ganoderma lucidum são extraídos principalmente de

esporos onde há maior concentração do princípio ativo (13). Pinheiro et al. (20) avaliaram

a quimioprevenção de basidiocarpos moídos de A. blazei, com píleo aberto e fechado, em

células de fígado de ratos e relataram que a atividade quimiopreventiva estava relacionada

à linhagem e ao estágio de crescimento do basidiocarpo. Entretanto, não há relatos

conclusivos sobre a eficiência antineoplásica de basidiocarpos de A. brasiliensis, em

diferentes fases de maturação, sobre o sarcoma 180.

61

Desta forma, devido à importância funcional deste fungo e a ausência de trabalhos

comparando a atividade biológica in vivo do fungo em diferentes fases de maturação do

basidiocarpo para o sarcoma 180, o objetivo deste trabalho foi verificar a atividade

antineoplásica de Agaricus brasiliensis em diferentes estágios de maturação do

basidiocarpo em camundongos implantados com células de sarcoma 180.

MATERIAIS E MÉTODOS

O cogumelo utilizado para o experimento foi o Agaricus brasiliensis (Agaricus

blazei ABL97/11) do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade Paranaense. O

cogumelo foi colhido em diferentes fases de crescimento do basidiocarpo: antes de romper

o véu interno (cogumelo fechado) e após rompimento do véu interno (cogumelo aberto).

Os cogumelos foram lavados com água corrente com auxílio de esponja e desidratados em

estufa com circulação de ar a 65 oC. Em seguida o cogumelo foi moído em moinho de

facas, ensacado em plástico duplo de polipropileno, fechado com termoseladora e mantido

em freezer a -70 °C.

Uma mistura de cogumelo moído com água ultra-pura na proporção de 1 : 10 foi

mantida em frasco de vidro com tampa de rosca fechada, imerso à 90 °C, durante 12 h.

Após este período a solução foi filtrada em papel filtro de gramatura 80 g/m2, espessura

205 µm, porosidade 14 µm da marca Qualy. A solução filtrada foi armazenada em

alíquotas diárias em geladeira (4 °C).

As células de sarcoma murino, linhagem TG180, foram obtidas do peritôneo de

camundongos previamente inoculados, mantidos por dez dias, conforme Desmonts e

Remington (5). A concentração de células foi determinada por contagem em câmara de

Newbauer, sendo ajustada para 106 ml-1com solução salina isotônica (NaCl 0,18%).

62

Camundongos Swiss, fêmeas, com 21 dias de idade e 25 g ± 5 g, oriundas do

biotério da UNIPAR – Campus Umuarama, foram inoculadas por via subcutânea, no

dorso, com 106 ml-1células de sarcoma 180. Os roedores foram mantidos em caixas

plásticas convencionais, em sala com controle de temperatura de 24 oC ± 2 oC, sob regime

alternado de 12 h de luz e 12 h de escuro. Após sete dias os roedores foram divididos em

três grupos: o grupo “Controle” com oito camundongos que receberam solução de NaCl

0,18%; grupo “Fechado” com oito camundongos que receberam solução do extrato do

cogumelo “fechado” e o grupo “Aberto” com oito camundongos que receberam solução do

extrato do cogumelo aberto. As soluções foram retiradas diariamente da geladeira e

permaneceram em temperatura ambiente (cerca de 26 °C) por 30 minutos antes do uso.

Diariamente administrou-se oralmente 0,1 mL de cada solução por camundongo

diariamente.

Após 30 dias do início do tratamento os animais sofreram eutanásia pela

administração de excesso de anestésico em câmara saturada de vapor de éter, sendo o baço

(para determinação do índice esplênico) e a massa tumoral retirados e mensurados. O

volume do tumor foi medido por régua milimetrada e calculado considerando seu diâmetro

mínimo (a) e o máximo (b) (volume do tumor = 4/3 π (a2 b)/2). A inibição foi calculada

considerando o volume do tumor do grupo Controle como 100% (11). O índice esplênico

foi calculado considerando a massa do baço pela massa corporal dos animais. Os grupos

foram testados entre si pela Análise de Variância e a diferença entre as médias determinada

pelo Teste de Tukey, considerando um nível de significância de 0,05. Os experimentos

foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo Experimentação Animal

(CEEPA) da Universidade Paranaense em reunião realizada em 07/06/2004.

63

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Um camundongo do grupo Fechado e dois do grupo Aberto não apresentaram

formação de massa tumoral subcutânea, sendo os dados destes animais desconsiderados na

verificação de inibição de crescimento tumoral. Os resultados do índice esplênico, massa,

largura, comprimento e volume tumoral são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Avaliação do desenvolvimento de neoplasia em camundongos Swiss inoculados

com células de sarcoma 180, tratados via oral com solução salina 0,18% (Controle) ou

extrato de basidiocarpo de Agaricus brasiliensis Fechado ou Aberto (n= 8).

Medidas do tumor Controle Fechado Aberto

Índice esplênico 0,0134a ± 0,0033 0,0064a ± 0,0004 0,0108a ± 0,0014

Massa (g) 3,0400a ± 1,1492 0,2180b ± 0,0557 0,9333b ± 0,4228

Largura (mm) 1,4400a ± 0,2298 0,7200b ± 0,0567 0,7017b ± 0,0744

Comprimento (mm) 2,3286a ± 0,3519 1,1040b ± 0,0793 1,3667ab ± 0,2297

Volume (mm3) 13,9248a ± 5,0425 1,2804b ± 0,2953 1,7213b ± 0,7219

*Valores de médias seguidos de letras diferentes indicam diferenças significativas do teste

de Tukey (p ≤ 0,05) entre os grupos na horizontal.

64

Não houve diferença significativa do índice esplênico entre os grupos

experimentais (Tabela 1). Isto sugere que o baço não teve participação na atividade

antineoplásica. O baço é o maior órgão linfóide do organismo e principal local de resposta

imune a antígenos presentes no sangue. Este órgão apresenta grandes quantidades de

linhagens mono-macrofágicas, envolvidas na endocitose e degradação de moléculas

estranhas, quando ocorre aumento de sua atividade (28).

O volume tumoral nos grupos Fechado e Aberto, tratados com extratos de A.

brasiliensis, foi significativamente (p ≤ 0,05) menor que o grupo Controle, porém não

houve diferença significativa entre os grupos Aberto e Fechado (Tabela 1). O grau de

inibição do crescimento tumoral em comparação ao grupo Controle foi de 90,80% no

grupo Fechado e de 87,64% no grupo Aberto, com média entre estes dois grupos de

89,22%. Isto evidencia que a opção comercial de colheita de cogumelos mais jovens

(fechado) é indiferente em relação à eficiência do princípio ativo, prevalecendo outras

vantagens comercias relacionados às características sensoriais e de processamento.

Outro aspecto relevante é que se não há diferença entre cogumelo aberto e fechado,

isto sugere que a maior concentração dos princípios ativos não se encontram nos esporos,

como ocorre com o Ganoderma lucidum (13). Isto sugere que outros estudos sobre a

produção de micélio, por meio líquido, seja avaliada para a produção de princípios ativos,

ao invés de basidiocarpos.

Camelini et al. (4) e Firenzuoli et al. (7) relatam diferenças nas quantidades de

glucanas e proteínas de A. brasiliensis, conforme o estágio de crescimento do basidiocarpo

(Aberto ou Fechado), sugerindo que cogumelos com píleo aberto teriam maiores

quantidades de princípio ativo e, provavelmente, maior atividade antineoplásica.

Entretanto, segundo nossos resultados as diferenças de maturação do basidiocarpo não

65

foram suficientes para afetar in vivo a atividade antineoplásica do fungo (Tabela 1). Isto

sugere que a beta-glucana, mesmo em maior quantidade em basidiocarpos abertos (4), não

seja a principal responsável pela atividade biológica do fungo. É possível que outros

fatores possam desempenhar papel concomitante quer ajudando ou interferindo as

substâncias responsáveis pela atividade antitumor de A. brasiliensis.

Zang et al. (26) relatam que a presença de proteína ou de manose implica em maior

ação imunomoduladora contra neoplasias de sarcoma 180. Mizuno et al. (17), Wang et al.

(24) e Eo et al. (6) relatam que diversos compostos biologicamente ativos de fungos como

polissacarídeos, glicoproteínas e glicopeptídeos atuam sinergicamente na atividade

imunomoduladora. Ainda Walton et al. (23) relatam que basidiocarpos do gênero Agaricus

apresentam a substância Agaritine, com potencial ação cancerígena quando extraída por

infusão a frio, porém sem relatos desta substância no micélio vegetativo.

Camelini et al. (4) relatam que há maior quantidade e diversidade estrutural de

glucanas quando o basidicarpo esta aberto, sendo que a estrutura química das glucanas

fúngicas esta relacionada à atividade biológica no sistema imune (3, 19), sugerindo que

cogumelos abertos seriam mais indicados para encontrar glucanas com maior atividade

antineoplásica. Entretanto, segundo Mizuno et al. (16) a atividade antitumor esta

relacionada a maior quantidade de glucanas solúveis em água, sendo que este aspecto não

esta necessariamente relacionado a uma determinada fase de maturação do basidiocarpo.

Conforme nossos resultados não foi possível confirmar uma melhor atividade

antineoplásica in vivo em função da maior maturidade do basiodiocarpo para o tumor

estudado (Tabela 1). Aparentemente há uma tendência contrária de diminuição da

atividade antineoplásica em basidiocarpos abertos, diferentemente do que sugere Camelini

et al. (4) e Firenzuoli et al. (7). Desta forma, sugere-se que novos estudos sejam realizados

66

para verificar a associação entre a atividade biológica in vivo e a quantidada de beta-

glucana, proteína e outras substâncias como triterpenos, em diferentes estágios de

maturação do basidiocarpo e diferentes linhagens de A. brasiliensis, ampliando os estudos

nesta área.

Em conclusão, nossos resultados sugerem que não existem diferenças significativas

de inibição do crescimento tumoral, em função das diferentes fases de maturação do

basidiocarpo para a linhagem ABL97/11 de Agaricus brasiliensis, sendo a atividade

antineoplásica média in vivo dos basidiocarpos de 89,22%. Estes resultados contribuirão

para o desenvolvimento de novas pesquisas sobre a atividade biológica de linhagens de

Agaricus brasiliensis.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Universidade Paranaense, Fundação Araucária e CNPq

pelo apoio financeiro.

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4. CONCLUSÕES GERAIS

Este trabalho comprovou importantes informações sobre a otimização de

extração dos princípios ativos e atividades biológicas atribuídas ao cogumelo A.

brasiliensis.

O metanol possui a melhor capacidade de extração dos princípios ativos

antioxidantes do cogumelo A. brasiliensis, sendo a temperatura de 60 °C e o

tempo de 60 minutos em banho as condições ideais de extração.

Houve diferença entre as fases de desenvolvimento do basidiocarpo sobre

a atividade antioxidante.

As linhagens ABL26 e ABL20A apresentaram maiores atividade

antioxidante do grupo dos cogumelos com basidiocarpo fechado.

A linhagem ABL29A apresentou maior atividade antioxidante do grupo dos

cogumelos com basidiocarpo aberto.

Houve diferença entre as fases de desenvolvimento do basidiocarpo sobre

a migração celular em processos inflamatórios para a linhagem ABL99/25.

Extrato do cogumelo com basidiocarpo fechado de A. brasiliensis mostrou

maior capacidade de inibição da migração celular para o foco da lesão.

Não houve diferença significativa para a inibição do crescimento tumoral

em função do estágio de crescimento do basidiocarpo para a linhagem ABL97/11.

A atividade antineoplásica média in vivo dos basidiocarpos foram de

89,22%.

72

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APÊNDICE