Atividade citotóxica de fungos endofíticos associados à Clusia

Universidade Federal de Ouro Preto

Instituto de Ciências Exatas e Biológicas

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

Atividade Citotóxica de Fungos Endofíticos Associados à Clusia

arrudae Planchon & Triana (Clusiaceae)

Antonio Cesar Corrêa Silva Filho

Ouro Preto

Abril de 2013

Universidade Federal de Ouro Preto

Instituto de Ciências Exatas e Biológicas

Programa de Pós-graduação em Biotecnologia

Atividade Citotóxica de Fungos Endofíticos Associados à Clusia arrudae

Planchon & Triana (Clusiaceae)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Biotecnologia da Universidade

Federal de Ouro Preto, como requisito parcial

à obtenção do título de Mestre em

Biotecnologia.

Orientador: Dr Luiz Henrique Rosa

Co-orientador: Dra. Luciana Maria Silva

Ouro Preto

Abril de 2013

iii

“Todo o futuro da nossa espécie, todo o governo das

sociedades, toda a prosperidade moral e material das nações

dependem da ciência, como a vida do homem depende do ar.

Ora, a ciência é toda observação, toda exatidão, toda verificação

experimental. Perceber os fenômenos, discernir as relações,

comparar as analogias e as dessemelhanças, classificar as

realidades, e induzir as leis, eis a ciência; eis, portanto, o alvo que

a educação deve ter em mira. Espertar na inteligência nascente

as faculdades cujo concurso se requer nesses processos de

descobrir e assimilar a verdade”.

Rui Barbosa

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a DEUS por ter me capacitado e me abençoado. Livrando-me de todo

mal nestas idas e vindas entre as cidades. Obrigado Senhor, Tu és fiel!

Aos meus orientadores, Dr. Luiz Henrique Rosa e Dra. Luciana Maria pela

oportunidade, paciência, confiança, ensinamentos, cobranças, correções, suporte e

incentivos. Obrigado pelos momentos agradáveis e de boa convivência. Sinto muito

honrado em fazer parte da equipe de vocês;

A minha família por sempre me apoiar e incentivar sempre. Obrigado pela paciência,

preocupação e orações. Todas as formas de carinhos foram de grande ajuda. Essa vitória

também é de vocês;

A minha avó Cezaria (minha primeira professora de biologia) e a Dindinha pelo intenso

amor e carinho. Obrigado por tudo, amo vocês!

Ao meu Pai pelo incentivo, orgulho e conselhos;

Lucas e Mariana pela convivência diária, companheirismo e orgulho;

A minha querida princesa Nana, pelo amor, cumplicidade e confiança. Obrigado por me

ajudar a vencer mais uma etapa da minha vida. Te amo! Estamos juntos, mais que perto;

Aos amigos do laboratório de Biologia Celular pelo constante incentivo, conselhos e

momentos de descontração: Aline, Camila, Heloísa, Juliana, Mariana Pedrosa, Milene,

Pedro, Rita, Vinicius;

A Josiane e Letícia pelos ensinamentos em Biologia Molecular de “última hora”;

A Flávia pela amizade, carinho, atenção e presteza;

v

Ao Quarteto Fantástico: Aristeu, Fábio e Mariana Lazarotti. Simplesmente fantástico;

Aqui tem pé e raiz;

Ao professor Carlos Rosa e toda a equipe do Laboratório de Ecologia e Biotecnologia

de Leveduras. Obrigado pelo apoio e ensinamentos técnicos;

A Laura minha “irmã cientifica” por passar pelos mesmos “problemas” que eu;

A Iara pela enorme ajuda na reta final. Além dos conselhos e aprendizados;

A Mirna pela coleta e pelos momentos de descontração ao lado do fluxo;

A República Viracopos pelo acolhimento e momentos de alegria em Ouro Preto;

Aos companheiros de mestrado em Biotecnologia e Ciências Biológicas;

A CAPES, FAPEMIG, CNPQ, UFOP, UFMG e FUNED pela estrutura e apoio

financeiro.

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Hipótese do antagonismo balanceado entre fungos endofíticos e suas plantas

hospedeiras (Schulz & Boyle 2005)....................................................................página 18

Figura 2. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados

para 2012 por sexo, exceto pele não melanoma (INCA, 2012)..........................página 20

Figura 3. Estrutura química da campotecina (KHARWAR et. al., 2011)..........página 24

Figura 4. Estrutura química da vincristina (KHARWAR et. al., 2011)..............página

24

Figura 5. Estrutura química do paclitaxel (KHARWAR et. al., 2011)...............página 25

Figura 6. Estrutura química da podofilotoxina (KHARWAR et. al., 2011).......página 25

Figura 7- Imagens de Clusia arrudae Planchon & Triana. A e B vista geral da planta

mostrando copas e ramificações. C e D - Detalhes dos galhos com frutos imaturos.

..............................................................................................................................página 27

Figura 8. Placa inoculada com fragmentos de caule (A) e folha (B) oriundos da mesma

planta depois de três dias de incubação...............................................................página 30

Figura 9. Fotomicrografia das linhagens celulares testadas nos ensaios de viabilidade

celular...................................................................................................................página 31

Figura 11. Ensaio de viabilidade para a linhagem HUTU utilizando extratos de fungos

endofíticos nas concentrações de 30, 60, 120 e 240μg/mL após 24h de exposição. Este

extrato atingiu CI55 para265,386 µg/mL (A) e para 259,68 µg/mL (B)............página 44

Figura 12. Gráficos de frequência confeccionados a partir do software SPSS versão 19.

Relação dos números de fungo isolados e sua frequência por planta (A). Frequência do

tipo de morfotipos isolados (B). Números de isolados de planta e sua frequência(C).

Frequência dos números de isolados por planta (D). Frequência de números de isolados

vii

no caule(E). Frequência de isolados na folha(F). Software SPSS 19.0 (IBM).

....................................................................................................................página 49

Figura 13. Dendrograma confeccionado a partir do software SPSS 19.0 considerando

os 41 extratos usados nos ensaios de viabilidade celular. Extrato com ação antitumoral,

para a linhagem RKO (seta vermelha), para HUTU (setas verdes). Com ação tóxica para

WI26VA4 (setas azuis). Extrato com ação tóxica e antitumoral para HUTU e WI26VA4

(seta preta)..........................................................................................................página 50

Figura 14. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240 µg/mL

de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae.........................página 61

Figura 15. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem RKO exposta a 240 µg/mL de

extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae.............................página 63

Figura 16. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240µg/mL

de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae usando o kit de

viabilidade LIVE/DEAD....................................................................................página 67

Figura 17. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240 µg/mL


viabilidade LIVE/DEAD.....................................................................................página 69

viii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Ensaio de viabilidade do extrato 5460 frente todas células testadas, HUTU,

RKO e WI26VA4, nas concentrações de 30, 60, 120 e 240 μg/mL após 24 h de

exposição. A linha sombreada mostra a concentração do extrato que tem o perfil tóxico

para a linhagem testada.

..............................................................................................................................página 37




para a linhagem testada.

..............................................................................................................................página 38



exposição. As linhas sombreadas mostram a concentração do extrato que tem o perfil

tóxico para a linhagens testadas.

..............................................................................................................................página 38




para a linhagem testada. .....................................................................................página 39




para a linhagem testada.................................................................................................. 39




para a linhagem testada................................................................................................... 40

ix




para a linhagem testada................................................................................................... 40




para a linhagem testada. ..................................................................................................41

Tabela 9. Relação dos extratos com atividade citotóxica e relação a sua concentração

inibitória a 50% (CI50)..................................................................................página 40

Tabela 10. Relação dos isolados de Clusia arrudae testados, em relação ao órgão de

origem, morfotipo isolado, número de fungos por planta, número de fungos por folha,

números de fungos por caule e número de morfotipos por planta. Software SPSS 19.0

(IBM) ..................................................................................................................página 50

Tabela 11. Cinco melhores sequências alinhadas no BLAST de fungos endofíticos

bioativos de Clusia arrudae, com substrato e origem de cada sequência.............página 51

Tabela 12. Extratos testados que apresentaram toxicidade acima de 50%. As linhas

sombreadas representam os extratos mais promissores................................................64

x

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

%: por cento

ATCC: American Type Culture Collection

BDA: Ágar dextrose batata

BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

cm: centímetro

CTAB: Brometo de cetil trimetilamonio

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNA: Ácido desoxirribonucléico

dNTP: Desoxirribonucleotídeos fosfatados

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

FUNED Fundação Ezequiel Dias

GPS: Global Positioning System

h: Hora

H2O: água

ITS: Região transcrita interna

m: metro

M: molar

MgSO4: Sulfato de magnésio

min: Minuto

mL: Mililitro

mm: Milímetro

mM: Milimolar

NaCl: Cloreto de sódio

xi

NCBI: National Center for Biotechnology Information

nm: Nanômetro

ºC: graus Celsius

OMS: Organização Mundial de Saúde

p/v: peso por volume

PCR: Reação em cadeia da polimerase

PEG: polietilenoglicol

pH: potencial hidrogeniônico

pmol: Pico mol

Q.S.P.: Quantidade suficiente para

r.p.m: Rotações por minuto

rDNA: DNA ribossomal

RNA: Ácido ribonucléico

rpm: Rotações por minuto

s: Segundo

TBE: Tris borato

U: Unidade

UFMG: Universidade Federal de Minas Gerais

UFMGCB: Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas

Gerais.

UFOP: Universidade Federal de Ouro Preto

V: Volts

μg/mL: micrograma/mililitro

μg: Micrograma

μl: Microlitro

xii

RESUMO

Os fungos são organismos capazes de sobreviver isoladamente ou em relações

simbióticas com outros organismos. Nos tecidos vegetais os fungos colonizam espaços

intracelulares de plantas sem causar dano aparente ao seu hospedeiro, os quais são

chamados de endofíticos e por colonizar estes espaços e apresentar constante interação

com seu hospedeiro, estes fungos são capazes de produzir diferentes metabólitos

bioativos. O câncer, ainda hoje, é uma doença que acomete milhares de pessoas ao redor

do mundo. A busca por novos compostos com atividade antitumoral, principalmente

oriundos direta ou indiretamente de vegetais, são importantes para obtenção de

tratamentos mais eficazes e com menos efeitos colaterais. Neste estudo, 30 exemplares

de Clusia arrudae Planchon & Triana tiveram suas folhas e caules coletados e

inoculados em placas de Petri contendo meio Agar Dextrosado Batata (BDA) para

isolamento dos seus fungos endofíticos associados. Um total de 100 isolados de fungos,

agrupados em 21 morfotipos, foram obtidos; destes 63 do caule e 37 das folhas. Os

fungos obtidos foram submetidos à extração etanólica de seus metabólitos, os quais

foram avaliados quanto à capacidade de inibir as linhagens tumorais humanas HUTU

(HTB-40) e RKO (CRL-2579), bem como uma linhagem humana normal WI26VA4

(CCL-951). As linhagens celulares foram expostas aos extratos dos 41 fungos

endofíticos nas concentrações de 240, 120, 60 e 30 µg/mL (p/v) e tiveram sua

morfologia analisada por microscopia utilizando sondas fluorescentes para identificação

do núcleo, citoesqueleto e viabilidade celular. Os ensaios de citotoxicidade,

considerando a Concentração Inibitória (CI50), demonstraram que oito extratos

apresentaram atividade sobre as linhagens celulares analisadas; ao ampliar a linha de

corte para CI55, quatro extratos apresentaram tendência à toxicidade. Os fungos

produtores de extratos bioativos foram identificados por meio do sequenciamento da

região ITS do rDNA gene. Os extratos dos fungos Pleosporales sp. UFMGCB 5502,

Pleosporales sp. UFMGCB 5467, Pleosporales sp. UFMGCB 5485, Xylaria sp.

UFMGCB 5500 e Pleosporales sp. UFMGCB 5498. apresentaram toxicidade sobre a

linhagem normal de pulmão WI26VA4. Dos extratos que apresentaram toxicidade,

apenas o extrato do fungo Pleosporales sp. UFMGCB 5502 também apresentou

atividade antitumoral para a HUTU, juntamente com Pleosporales sp. UFMGCB 5478 e

Pleosporales sp. UFMGCB 5533. Para linhagem RKO, somente o extrato do fungo

xiii

Pleosporales sp. UFMGCB5460 exerceu citoxicidade. Considerando o valor de CI55, os

fungos UFMGCB 5534, UFMGCB 5539, UFMGCB 5508 UFMGCB 5489 mostraram

toxicidade para todas as linhagens. Os fungos que causam citoxicidade para a célula

RKO foram predominantemente isolados dos caules e para a célula HUTU das folhas,

independente do morfotipo encontrado. Os fungos obtidos das folhas causaram quebra

do citoesqueleto e as células permaneceram vivas quando analisadas pelo kit de

viabilidade celular. Já os fungos obtidos do caule causaram aglutinação e perda de

adesão celular e indicio de morte. A partir destes resultados podemos concluir que a

comunidade de fungos endofíticos associados a C. arrudae são capazes de produzir

metabólitos com atividade citotóxica em linhagens tumorais humanas in vitro e alguns

extratos também se mostraram tóxicos para células normais.

xiv

ABSTRACT

Fungi are organisms capable of surviving alone or in symbiotic relationships with other

organisms. In plant fungi colonize intracellular spaces of plants tissue without causing

apparent harm to their host, which are called endophytes and colonize these areas and

have constant interaction with its host, these fungi are capable of producing different

bioactive metabolites. Cancer, even today, is a disease that affects thousands of people

around the world. The search for new compounds with antitumor activity, mainly

arising directly or indirectly from plants, are important for obtaining more effective

treatments with fewer side effects. In this study, 30 specimens of Clusia arrudae

Planchon & Triana had their leaves and stems collected and inoculated in Petri dishes

containing Potato Dextrose Agar (PDA) for isolation of endophytic fungi associated

with her. A total of 100 strains of fungi, grouped into morphotypes 21 were obtained; 63

of the stem and leaves 37. The fungi were subjected to ethanol extraction of metabolites,

which were evaluated for their ability to inhibit human tumor cell lines HUTU (HTB-

40) and RKO (CRL-2579), as well as a normal human WI26VA4 line (CCL-951 .) The

cell lines were exposed to extracts of the 41 endophytic fungi at concentrations of 240,

120, 60 and 30 µg / mL (w / v) and their morphology were examined by fluorescent

microscopy using probes for identification of the nucleus, the cytoskeleton and the cell

viability. The cytotoxicity assays, considering the inhibitory concentration (IC50),

showed that eight extracts showed activity against cell lines analyzed, by increasing the

cutting line for CI55, four extracts showed a tendency to toxicity. The fungi that produce

bioactive extracts were identified by sequencing of the ITS region of rDNA gene.

Extracts of the fungus Pleosporales sp. UFMGCB 5502, Pleosporales sp. UFMGCB

5467, Pleosporales sp. UFMGCB 5485, Xylaria sp. UFMGCB 5500 and Pleosporales

sp. UFMGCB 5498. showed toxicity on normal strain WI26VA4 lung. Extracts that

were toxic, only the extract of the fungus Pleosporales sp. UFMGCB 5502 also showed

antitumor activity to the Hutu, along with Pleosporales sp. UFMGCB 5478 and

Pleosporales sp. UFMGCB 5533. For RKO line, only the extract of the fungus

Pleosporales sp. UFMGCB5460 exerted cytotoxicity. Considering the value of CI55,

fungi UFMGCB 5534, UFMGCB 5539, 5508 UFMGCB UFMGCB 5489 showed

toxicity for all strains. The fungi that cause cytotoxic to RKO cells were predominantly

of the isolated stem and leaves the cell Hutu, regardless of morphotype found. The fungi

xv

obtained from the leaves of the cytoskeleton and cause break the cells remained alive

when reviewed by Kit cell viability. Since the fungi obtained from the stem caused

clumping and loss of cell adhesion and hint of death. From these results we conclude

that the community of endophytic fungi associated with C. arrudae are capable of

producing metabolites with cytotoxic activity on human tumor cell lines in vitro and

some extracts were also toxic to normal cells.

16

Sumário

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................................... 18

1.1 FUNGOS ENDOFÍTICOS ................................................................................................................... 18 1.2 CÂNCER ........................................................................................................................................ 20 1.3 METABÓLITOS BIOATIVOS PRODUZIDOS POR FUNGOS ................................................................... 22 1.4 FAMÍLIA CLUSIACEAE (LINDL.) .................................................................................................... 26 1.5 O GÊNERO CLUSIA (PLANCHON & TRIANA, 1860) ........................................................................ 27

2 OBJETIVOS.................................................................................................................................... 29

2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................................. 29 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................................ 29

3 METODOLOGIA ........................................................................................................................... 30

3.1 COLETA DOS ESPÉCIMES DE CLUSIA ARRUDAE ............................................................................. 30 3.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS ...................................................................................... 30 3.3 CULTIVO DOS FUNGOS E PREPARO DOS EXTRATOS ........................................................................ 31 3.4 ENSAIOS BIOLÓGICOS .................................................................................................................... 32

3.4.1 Atividade citotóxica ............................................................................................................ 32 3.4.2 Viabilidade celular ............................................................................................................. 32

3.5 ENSAIO DE FLUORESCÊNCIA .......................................................................................................... 33 3.5.1 Kit Live/Dead ...................................................................................................................... 33 3.5.2 DAPI/Faloidina .................................................................................................................. 33

3.6 IDENTIFICAÇÃO DOS FUNGOS ........................................................................................................ 34 3.6.1 Extração do DNA total ....................................................................................................... 34 3.6.2 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4 ........................................................... 35 3.6.3 Purificação dos amplicons ................................................................................................. 35

3.7 REAÇÕES DE SEQUENCIAMENTO ................................................................................................... 36 3.8 ANÁLISE COMPUTACIONAL DAS SEQUÊNCIAS ............................................................................... 37 3.9 CONSTRUÇÃO DE DENDROGRAMAS E ANÁLISE DE FREQUÊNCIA .................................................... 37

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................... 38

PRODUÇÃO DOS EXTRATOS E ENSAIOS BIOLÓGICOS ................................................................................ 38 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS FUNGOS ENDOFÍTICOS QUE APRESENTARAM ATIVIDADE CITOTÓXICA 54 ENSAIOS DE FLUORESCÊNCIA ................................................................................................................. 58

DAPI/Faloidina ................................................................................................................................ 58 Kit Live/Dead .................................................................................................................................... 64

5 CONCLUSÕES ............................................................................................................................... 70

6 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................................... 71

7 ANEXO ............................................................................................................................................ 80

17

7.1 TABELA DE CLASSIFICAÇÃO DOS MORFOTIPOS ISOLADOS DE CLUSIA ARRUDAE ........................... 80 7.2 FOTOS DOS MORFOTIPOS ISOLADOS .............................................................................................. 81 7.3 GRÁFICOS DOS ENSAIOS DE VIABILIDADE DOS ISOLADOS DE CLUSIA ARRUDAE UTILIZANDO TRÊS

LINHAGENS CELULARES. ......................................................................................................................... 88

18

1 INTRODUÇÃO

1.1 Fungos endofíticos

O termo endofítico significa “na planta” (endon Gr, no interior; phyton, planta).

De acordo com SCHULZ & BOYLE (2005), os endofíticos foram mencionados pela

primeira vez por De Bary (1866) como qualquer micro-organismo (fungos, bactérias,

cianobactérias) presentes em tecidos de plantas. Trabalhos com endofíticos demonstram

que estes organismos apresentam interações simbióticas com o hospedeiro, protegendo-

o dos ataques de insetos, micro-organismos patogênicos e herbívoros (AZEVEDO,

1999). De acordo com Strobel & Dayse (2003), os fungos são os micro-organismos

endofíticos isolados com maior frequência.

Fungos endofíticos habitam tecidos vivos de plantas durante todo seu ciclo de

vida ou parte dele sem causar sintoma aparente de doença ao seu hospedeiro (PETRINI,

1991, BACON & WHITE, 2000, SCHULZ & BOYLE, 2005) e pode ser colonizado

qualquer órgão da planta hospedeira. Os fungos endofíticos podem apresentar

estratégias de colonização variando sapróbios, parasitas, mutualistas ou patógenos

latentes (STROBEL & DAISY, 2003; SCHULZ & BOYLE, 2005; PROMPUTTHA et

al., 2007). A colonização de partes aéreas do hospedeiro vegetal é normalmente

confinada a células individuais ou localizada, enquanto em raízes a colonização é

extensa (WILSON, 1995; TAN & ZOU, 2001; SCHULZ & BOYLE, 2005). A o

número de espécies vegetais catalogadas e de aproximadamente 300 mil e propõe-se

que virtualmente cada uma destas espécies podem abrigar complexas comunidades de

fungos endofíticos (SAIKKONEN et.al. 1998; KHARWAR et. al., 2011).

Fungos endofíticos representam um grupo diversificado de micro-organismos

descritos em plantas de diferentes ambientes tais como Antártico (ROSA et al., 2009),

Ártico (FISHER et al., 1995), desertos (BASHYAL et al., 2005), florestas tropicais

(STROBEL, 2002), manguezais, pântanos (LIN et al., 2008) e florestas costeiras

(SURYANARAYANAN et al., 2005), e encontrado em diferentes tipos de vegetais

(STROBEL & DAISY, 2003). A interação de mutualismo ou comensalismo que fungos

endofíticos exercem em seus hospedeiros requer um balanço delicado entre respostas de

defesa da planta e as necessidades do endofítico, sem caracterizar ausência da resposta

de defesa da planta (KOGEL, 2006). Em 2005, Schulz & Boyle propuseram que a

colonização sem sinais de infecção é resultante de uma reação antagônica balanceada,

19

em que ocorre um equilíbrio entre a virulência do fungo endofítico e a resposta de

defesa da planta. Então, a variabilidade da interação depende não só da adaptação do

fungo a um hospedeiro ou órgão em particular e dos estágios de desenvolvimento dos

parceiros, mas também da virulência inata do endofítico e da resposta de defesa do

hospedeiro (Figura 1).

Figura 1. Hipótese do antagonismo balanceado entre fungos endofíticos e suas plantas

hospedeiros (Schulz & Boyle 2005).

Os fungos endofíticos podem ser classificas em dois grupos principais levando

em consideração as diferenças evolutivas, taxonomia, hospedeiro e funções ecológicas.

O grupo dos clavicipitáceos, são geralmente encontrados em algumas espécies de

gramíneas; já o grupo não-clavicipitaceos, encontrados em tecidos de briófitas,

pteridófitas, gimnospermas e angiospermas (RODRIGUEZ et al., 2009). Endofíticos

clavipitáceos pertencem à família Clavicipitaceae (Hypocreales; Ascomycota) e muitas

espécies são conhecidos por produzir moléculas bioativas (principalmente dos gêneros

Cordyceps, Balansia, Epichloe/Neotyphodium, Claviceps e Myriogenospora). Em

contraste, os não-clavicipitáceos representam um grupo que ainda não bem definido

taxonomicamente, onde a maioria das espécies pertencem aos filos Ascomycota e

Basidiomycota. Espécies diferentes desses dois grupos endofíticos têm sido investigadas

20

devido a sua capacidade de produzir distintas moléculas bioativas e espécies associadas

a plantas tropicais têm se mostrado importantes produtores de metabólitos bioativos.

(ROSA et.al., 2011).

1.2 Câncer

O câncer é uma das doenças que mais causam temor na sociedade, um estigma

de mortalidade e dor (De ALMEIDA et al., 2005). Definido como doença multifacetada

desencadeada por vários fatores, resultante de mutações no genoma. Estas estão

associadas ao descontrole de programas essenciais como proliferação, diferenciação e

morte celular (MELO et al, 2003). As causas do câncer podem ser internas ou externas

ao organismo sendo inter-relacionadas e ligadas à capacidade do organismo de se

defender das agressões externas (INCA, 2009). Algumas destas agressões são mutações

genéticas espontâneas ou induzidas por agentes patogênicos como metais, radiações,

radicais livres, inflamações crônicas e xenobióticos (tabaco, álcool, pesticidas, entre

outros) entre outros os quais promovem desordem no ciclo celular, excesso na taxa de

proliferação e deficiência nas taxas de morte celular. Este processo culmina na

formação de agrupamentos de clones de células neoplásicas. (FERRARI & TORRES,

2002).

Nas últimas décadas, o câncer ganhou dimensão, um evidente problema de saúde

pública mundial. A Organização Mundial da Saúde (OMS) para o ano de 2030, estima

27 milhões de casos incidentes de câncer, 17 milhões de mortes e 75 milhões de

pessoas vivas, anualmente, com câncer (INCA 2012).No ano de 2012

No Brasil, as estimativas para o ano de 2012 que se aplicam para o ano de 2013

aponta a ocorrência de aproximadamente 518.510 novos casos de câncer, incluindo os

casos de pele não melanoma, corroborando com a magnitude do problema do câncer no

país. Sem considerar casos de câncer da pele não melanoma, estima-se 385 mil novos

casos . Os tipos mais incidentes para o sexo masculino , cânceres de pele não

melanoma, próstata, pulmão, cólon e reto e estômago ; e os cânceres de pele não

melanoma, mama, colo do útero, cólon e reto e glândula tireoide para o sexo feminino.

(INCA, 2012).

21

Estima-se 257.870 novos casos para o sexo masculino e 260.640 para o sexo

feminino. o câncer da pele do tipo não melanoma (134 mil novos casos ) é estimado

como o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (60

mil), mama feminina (53 mil), cólon e reto (30 mil), pulmão (27 mil), estômago (20

mil) e colo do útero (18 mil) (figura 2) (INCA, 2012).

Figura 2. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados

para 2012 por sexo, exceto pele não melanoma (INCA, 2012).

Os principais tratamentos contra o câncer envolvem cirurgia, quimioterapia e

radioterapia; sendo a cirurgia, , o tratamento inicial e de escolha para vários tipos de

cânceres (JOHNSTON & SPENCER, 2003). Mais recentemente tem-se empregado a

terapia de fotorradiação com derivados hematoporfirínico (HTP) (MACHADO, 2000) e

a imunoterapia (SALMONM, 1998), cujos objetivos são erradicar o câncer,

normalmente por meio da terapia combinada, com associação de mais que um tipo de

tratamento. Na quimioterapia convencional são utilizados fármacos que têm como alvo

diversos processos fisiológicos das células que na maioria dos diferentes tipos de

neoplasias têm elevada taxa de mitose..

Alternativo a este tipo de tratamento busca-se novos metabólitos,

principalmente oriundos direta ou indiretamente de vegetais. Baseados no fato de que

desde a antiguidade o mundo tem feito o uso de plantas medicinais no tratamento de

diversas enfermidades. Estudos mais antigos sobre medicina e plantas medicinais foram

originários da China e Egito (ALZUGARAY & ALZUGARAY, 1983), nestes países

diversas culturas utilizavam as plantas medicinais, sendo esta a principal, ou mesmo a

única matéria prima para elaboração de medicamentos (ODY, 1993). No início do

22

século XX, com a demanda por novas drogas, aumentou o interesse por metabólitos

fitoterápicos uma vez que, os compostos orgânicos sintéticos utilizados nos tratamentos

apresentavam muitos efeitos colaterais e alto custo de produção (VOLAK &

STODOLA, 1990). O número de espécies conhecidas, e utilizadas como medicamentos

é irrisório, , em relação à biodiversidade vegetal e a devastação causada pelo homem,

em especial nos séculos XIX e XX (GOTTLIEB & KAPLAN, 1990).

1.3 Metabólitos bioativos produzidos por fungos

Metabólitos secundários, ou produtos naturais, são substâncias que acredita-se

serem dispensáveis para a sobrevivência e desenvolvimento do organismo e

continuamente, modificam-se e adaptam às continuas alterações exercidas pela pressão

seletiva do ambiente. Durante anos, os produtos naturais são utilizados diretamente

como drogas ou como modelos estruturais para o desenvolvimento de fármacos. De

acordo com BÉRDY (2005) e SURYANARAYANAN e colaboradores . (2009),

existem cerca de 200 mil metabólitos naturais com propriedades bioativas e 52% das

novas substâncias introduzidas no mercado mundial entre os anos de 1981 a 2002 tem

produtos naturais ou seus derivados em sua composição (CHIN et al., 2006).

Além de plantas, os micro-organismos constituem importante fonte de recursos

naturais e produtos bioativos. Cerca de 20 mil metabólitos bioativos de origem

microbiana foram conhecidos até o final de 2002 (BÉRDY, 2005). Os fungos estão

entre os grupos de organismos eucarióticos mais importantes cujos metabólitos são

explorados para aplicações clínicas (SURYANARAYANAN et.al, 2009). Novos

produtos naturais com estruturas químicas variadas foram identificados à partir do

metabolismo dos fungos (GRABLEY E SATTLER, 2003; MITCHELL et al, 2008;

STADLER E KELLER, 2008; SURYANARAYANAN et al, 2009). A heterogeneidade,

modo de absorção de nutrientes e capacidade de explorar uma variedade de substratos e

habitats reflete na capacidade sintética e versátil dos fungos (HYDE, 2005;

SURYANARAYANAN E HAWKSWORTH, 2005). Sabe-se que dos estimados 1,5

milhões de espécies de fungos no mundo (HAWKSWORTH, 2004) apenas 7% destes

foram cultivados e selecionados para a produção de drogas (SURYANARAYANAN

et.al, 2009).

23

Fungos endofíticos estão em constante interação com a sua planta hospedeira e

são tidos como excelentes fontes de produtos naturais bioativos, uma vez que podem

ocupar nichos biológicos únicos e crescem em diversos ecossistemas (SCHULZ et al.,

2002). O interesse por metabólitos bioativos produzidos por fungos endofíticos deve-se

à sua importância médica, industrial e agrícola (CALVO et al., 2002). São

considerados fonte promissora de metabólitos bioativos, haja vista dentre os vinte

medicamentos mais comumente descritos na clínica médica, seis são de origem fúngica

(SCHULZ et al., 2002). Segundo Brizuela e colaboradores (1998), os micro-organismos

(incluindo os fungos) constituem, uma das menos estudadas fontes de produtos naturais,

e que oferecem grandes possibilidades para obtenção de novas estruturas e atividades

biológicas, o que corrobora com a desenvolvimento de pesquisas, que visem obter de

acordo com Strobel e Daisy (2003) novos antibióticos, agentes quimioterápicos e

agroquímicos que sejam altamente eficientes, possuam baixa toxicidade e tenham um

menor impacto ambiental.

Extremamente importante, foi a elucidação de que alguns endofíticos são

capazes de produzir metabólitos sintetizados por suas plantas hospedeiras (STERLE

et.al, 1993)

Muitas espécies de fungos endofíticos são frequentemente isoladas de uma

planta hospedeira, e somente alguns isolados são capazes de produzir altos índices de

moléculas com atividade biológicas (STROBEL, 2003). Gomes (2008) sugere que a

ação de algumas plantas medicinais poderia estar relacionada a sua comunidade

endofítica, sendo o responsável pela resposta o micro-organismo não associado a planta

hospedeira, Identificar organismos responsáveis pela produção de metabólitos

eliminaria etapas de plantio, colheita e extração de plantas raras ou de crescimento

lento. Diminuindo assim o custo da produção e área de plantio já que estes podem ser

obtidos por processos fermentativos (STROBEL, 2002). De acordo com Strobel e

colaboradores (2004), ao selecionar as plantas para o isolamento e identificação dos

micro-organismos endofíticos é necessário observar os seguintes critérios:

1- Planta de ambientes peculiares, especialmente aquelas que apresentam

estratégias de sobrevivência pouco comuns;

24

2- Plantas que apresentam um histórico etnobotânico, ou seja, são

tradicionalmente utilizados como medicamento por tribos, grupos étnicos e pela

população de um modo geral. Estas plantas são escolhidas a partir de relatos da

literatura e por meio do contato direto estabelecido com a população que as

utiliza. Recentemente, tem sido verificadas que muitas propriedades medicinais

que eram atribuídas à produção de substâncias ativas pelas plantas, estão, na

realidade, relacionadas aos endófitos que a colonizam;

3- Plantas endêmicas de determinadas regiões que apresentam longevidade

incomum e que estão localizadas em ambientes ancestrais;

4- Plantas cujo desenvolvimento ocorrem áreas de grande biodiversidade, como

florestas temperadas e tropicais.

Algumas das drogas mais importantes usadas na clínica foram isoladas de

fungos (CRAGG et al., 2005). A descoberta de antibióticos, antimicóticos,

imunossupressores e compostos antitumorais são alguns exemplos de substâncias que

têm sido isoladas de fungos endofíticos (STROBEL et al., 2004). Entre estas, destaque

para substâncias como penicilina, cefalosporina, aminoglisídeos, tetraciclinas,

ciclosporina, FK506 e rampamicina . Também foram isoladas de fungos endofíticos

agentes que diminuem o colesterol, como mevastatina e lovastatina, antiparasitárias e

anti-helmínticas, como a ivermectina.

A partir da descoberta do diterpeno paclitaxel, agente anticâncer, produzido pelo

fungo endofítico Taxomyces andreanae, isolado da planta Taxus brevifolia (STIERLE

et al., 1995) estimulou estudos sobre fungos endofíticos como fontes de moléculas

bioativas. Pesquisadores tem reportado o isolamento de vários outros metabólitos

anticâncer de fungos endofíticos incluindo a Campotecina e análogos (PURI et.al.,

2005; REHMAN et.al., 2009; KUSARI et.al., 2009), vincristina (ZHANG et.al., 2000;

LINGQI et.al., 2000; YANG et.al., 2004) e podofilotoxina (PURI et.al., 2006;

EYBERGER et.al., 2006). Campotecina foi inicialmente isolada da madeira de

Camptotheca acuminata (Nyssaceae) uma planta nativa da China, que apresenta

atividade antitumoral. A Campotecina é um alcalóide pentacíclicos quinolina que inibe

a topoisomerase I (topo I), uma enzima envolvida na replicação do DNA (KHARWAR

et. al., 2011) (Figura 3).

25

Figura 3. Estrutura química da Campotecina (KHARWAR et. al., 2011).

Vincristina (Oncovin), também conhecido como leurocristine, é um alcalóide

isolado originalmente da vinca de Catharanthus roseus, um membro da família

Apocyanaceae. Foi isolado por diferentes pesquisadores no fungo Fusarium oxysporum.

A vincristina (Figura 4) tem ação em vários sistemas celulares, se liga de forma

irreversível a microtúbulos e proteínas do fuso na fase S do ciclo celular, a qual interfere

com a formação do fuso mitótico e consequentemente estabiliza células tumorais na

metáfase (ZHANG et.al., 2000; LINGQI et.al., 2000; YANG et.al., 2004).

Figura 4. Estrutura química da Vincristina (KHARWAR et. al., 2011).

Taxol® é o diterpeno protótipo do taxano, isolado pela primeira vez por Wani et

al. em 1971. da casca do Teixo do Pacífico (Taxus brevifolia). Desenvolvido

comercialmente pela Bristol-Myers Squibb com genérico ‘Paclitaxel’ (Figura 5) e

Taxol® (WALL e WANI, 1995). O Taxol® eficaz contra tumores de ovário, próstata,

mama, pulmão apresenta um único modo de ação: liga-se especificamente a beta-

tubulina, e impede a sua despolimerização durante os processos de divisão celular.

26

Figura 5. Estrutura química do Paclitaxel (KHARWAR et. al., 2011).

Outro exemplo de substância bioativa extraída de plantas e que pode ser obtida

por cultivo de fungos endofíticos é a podofilotoxina (Figura 6), sintetizada por espécies

vegetais do gênero Podophyllum, com atividades antitumoral, antiviral, antibacteriana e

imunoestimulante. É também empregada na síntese de inibidores da topoisomerase.

Recentemente, foi relatado que o fungo endofítico Trametes hirsuta, isolado da espécie

P. hexandrum, também é capaz de sintetizar Podofilotoxina e outras lignanas

biologicamente ativas com propriedades antitumoral e antioxidante (PURI et al., 2006).

Figura 6. Estrutura química da Podofilotoxina (KHARWAR et. al., 2011).

1.4 Família Clusiaceae (Lindl.)

A família Clusiaceae (Lindl.) inclui 50 gêneros e 1200 espécies distribuídas

principalmente nas regiões tropicais do globo. Entretanto, alguns gêneros se

desenvolvem com grande facilidade nas regiões norte de zonas temperadas. Esta família

engloba árvores, arbustos, lianas e ervas de interesse econômico pela produção de frutos

comestíveis, madeiras, derivados químicos de interesse farmacêutico e tintas. A maioria

27

das espécies está distribuída em três gêneros: Hypericum L. (350 spp.), Clusia L. (200

spp.) e Garcinia L. (200 spp.) (JUNIOR et.al., 2005).

1.5 O gênero Clusia (Planchon & Triana, 1860)

O gênero Clusia Planchon & Triana (1860) ocorre na região neotropical e reúne

cerca de 250 espécies semi-epífitas, trepadeiras, arbustivas e arbóreas (BITTRICH &

AMARAL 1996, 1997), entre as quais 67 ocorrem no Brasil. A espécie escolhida

(Clusia arrudae Planchon & Triana) é endêmica do Brasil e, após pesquisas em

diferentes bancos de dados, não foram encontrados quaisquer relatos quanto sua

atividade biológica antitumoral.. Clusia arrudae é uma planta dióica, de porte arbóreo

com distribuição nas serras de Minas Gerais e Rio de Janeiro sendo comum no campo

rupestre da Serra da Calçada. Suas flores são brancas, com oito pétalas. As flores

femininas possuem estigmas dilatados e amarelos, que podem variar de cinco a oito, em

uma mesma planta. O número de estigmas corresponde sempre ao número de carpelos

no ovário de cada flor. As flores masculinas possuem inúmeras anteras esbranquiçadas,

densamente distribuídas em torno de estigmas não funcionais que, também, variam

entre cinco e oito por flor. Os frutos são deiscentes, esféricos, podendo conter até nove

sementes por lóculo. As sementes, quando maduras, são avermelhadas e medem até 0,7

cm de diâmetro (CARMO & FRANCESCHINELLI, 2002).

Na literatura existem poucos registros de metabólitos com atividade antitumoral

nas espécies de Clusiaceae . Entretanto, após análises experimentais com diferentes

extratos vegetais realizados no Serviço de Biologia Celular da Fundação Ezequiel Dias

(FUNED), extratos originados do caule e da folha de Clusia arrudae foram ativos sobre

linhagens tumorais de origem gastrointestinal: HUTU-80(ATCC # HTB-40):

Adenocarcinoma de duodeno; RKO AS45-1(ATCC # CRL-2579): Carcinoma de colón

humano; MKN-45 (ATCC # 57584): Adenocarcinoma gástrico. Assim, para

caracterização de fungos endofíticos, iniciamos o estudo com Clusia arrudae ,

baseados em ensaios de viabilidade utilizando seu extrato bruto pois já se tem

conhecimento de que alguns micro-organismos endofíticos produzem substâncias

idênticas ou semelhantes às das plantas hospedeiras (TAN & ZOU, 2001).

28

Figura 7- Imagens de Clusiae arrudae (Planchon & Triana). A e B vista geral da planta

mostrando copas e ramificações. C e D - Detalhes dos galhos com frutos imaturos.

29

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Determinar a atividade antitumoral de extratos de fungos endofíticos associados

à Clusia arrudae Planchon & Triana (Clusiaceae) sobre a proliferação celular de

linhagens humanas de tumores gastrointestinais.

2.1 Objetivos específicos

- Coletar amostras de Clusia arrudae para isolamento de sua comunidade de fungos

endofíticos;

- Incluir todos os fungos obtidos na Coleção de Micro-organismos e Células da UFMG

para preservação ex situ da biodiversidade de fungos tropicais;

- Preparar extratos etanólicos de todos os fungos obtidos;

- Depositar os extratos fúngicos e vegetais obtidos em uma extratoteca para estudos de

bioprospecção;

-Realizar ensaio de viabilidade celular utilizando o método de exclusão por MTT nas

linhagens humanas:

HUTU-80 (ATCC # HTB-40): Adenocarcinoma de duodeno;

RKO AS45-1(ATCC # CRL-2579): Carcinoma de colón humano;

WI-26 VA4 (ATCC# CCL-95.1): Fibroblasto de pulmão.

-Realizar análise morfológica das linhagens estudadas após tratamento com os extratos

utilizando sondas fluorescentes que identificam o citoesqueleto;

- Identificar em nível específico os fungos endofíticos bioativos;

30

- Determinar a CI50 para atividade citotóxica dos extratos ativos;

3 METODOLOGIA

3.1 Coleta dos espécimes de Clusia arrudae

As amostras de Clusia arrudae (Planchon & Triana) foram coletadas na Serra da

Moeda, no município de Brumadinho, Minas Gerais (20º05’36”S e 4º59’00”W, a 1.480

m de altitude.). A vegetação predominante no local é campo rupestre sobre solo de

“canga”. A coleta ocorreu em abril 2010 e para o acesso a estas amostras foram

respeitadas as normas de coleta de exemplares vegetais. Folhas e cascas de 30

indivíduos aparentemente saudáveis foram coletadas para o estudo. A localização dos

indivíduos foi determinada por coordenadas geográficas obtidas pelo Global

Positioning System (GPS), e uma exsicata representativa do material vegetal foi

depositada no herbário da UFOP e da EPAMIG. As amostras coletadas foram

armazenadas em sacos plásticos e processadas no mesmo dia. Utilizaram-se três folhas e

três cascas de cada indivíduo, sendo que cinco fragmentos de cada folha e de cada casca

foram plaqueados para isolamento dos fungos endofíticos.

3.2 Isolamento dos fungos endofíticos

Inicialmente ao processo de desinfestação, as folhas e cascas coletadas foram

limpas superficialmente com detergente neutro e enxaguadas abundantemente com água

corrente. Em seguida, com auxílio de tesoura e pinça esterilizada, retiraram-se

fragmentos de aproximadamente cinco mm das folhas e cascas que foram desinfestados

superficialmente com Extran 2%, álcool 70% (1 minuto), hipoclorito de sódio com 2%

de cloro ativo (3 minutos) e água destilada estéril (2 minutos) (COLLADO et al., 1996).

Após este processo de desinfecção superficial, os fragmentos foram transferidos para

placas de Petri contendo Ágar Dextrose Batata (BDA/Difco) suplementado com

200mg/L de cloranfenicol (Sigma/EUA), utilizado para inibir o crescimento de bactérias

epifíticas ou endofíticas contaminantes. Alíquotas da água destilada esterilizada

utilizada no processo de desinfestação também foram plaqueadas como controle para

assegurar que somente os fungos endofíticos foram isolados. As placas foram incubadas

a 25-28ºC por um período de até 60 dias (Figura 8).

31

Figura 8. Placa inoculada com fragmentos de caule (A) e folha (B) oriundos da mesma

planta depois de três dias de incubação.

Os isolados foram transferidos para placas de Petri com BDA para purificação.

Os isolados de fungos endofíticos obtidos foram preservados em glicerol 15% em ultra

freezer a –80ºC e também mantidos por repiques sucessivos em placas de Petri

contendo BDA. Todos os isolados obtidos durante o estudos foram depositados na

Coleção de Micro-organismos e Células da UFMG.

3.3 Cultivo dos fungos e preparo dos extratos

Os fungos filamentosos obtidos foram cultivados em placas de Petri contendo

meio BDA a 28ºC com umidade de 70-80%. Após 15 dias de crescimento, o meio de

cultura com o crescimento micelial foi transferido para tubos cônicos de 50 mL. Para

obtenção dos extratos brutos foram adicionados aos tubos 35 mL de etanol PA (Mark) e

então macerados com auxílio de um bastão de vidro. Os tubos foram incubados a 10ºC e

após 48 horas, o sobrenadante (etanol) de cada tubo foi transferido para frascos de vidro

de 30 mL e para tubos de 1,5 mL. Estes foram secos em centrífuga a vácuo “Speed

Vac” (Savant) com temperatura inferior a 35ºC. Os extratos obtidos foram dissolvidos

em dimetilsufóxido (DMSO) na concentração de 240 µg/mL e mantidos a -80°C até

utilização nos ensaios biológicos.

32

3.4 Ensaios biológicos

3.4.1 Atividade citotóxica

Estes estudos da atividade citotóxica foram realizados no Serviço de Biologia

Celular da Fundação Ezequiel Dias (FUNED). Foram escolhidas duas linhagens de

células provenientes do sistema gastrointestinal estômago para serem testadas: HUTU-

80 ATCC#HTB-40 (adenocarcinoma de duodeno), RKO AS45-1 ATCC #CRL-2579

(carcinoma de colón humano), e linhagem normal de fibroblasto de pulmão WI26VA4

ATCC# CCL951 cultivadas em estufa com atmosfera úmida a 37° com 5% de CO2.

Todas as células foram cultivadas em meio de cultura EMEM suplementado com 10 %

de soro fetal bovino (Figura 9).

Figura 9. Fotomicrografia das linhagens celulares testadas nos ensaios de viabilidade

celular.

3.4.2 Viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada usando o ensaio de MTT (brometo de 3-

[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). As células foram semeadas na

concentração de 1X105 células/poço em uma placa de 96 poços e colocadas em uma

estufa para crescimento celular, 37ºC com a atmosfera umidificada contendo 5% de

CO2, por 24horas depois da adição do extrato (solubilizado em DMSO na concentração

de 240μg/mL de meio específico de cada linhagem testada e depois uma diluição

seriada para 120μg/mL 60μg/mL e 30μg/mL). Para o ensaio as amostras foram

empregadas em quadruplicatas (100µl por poço). Transcorridos às 24 horas o meio foi

retirado da placa e está lavada com PBS 1X (100 µl/poço). O MTT foi adicionado e

diluído em nove mL de meio EMEM com 1% de soro fetal bovino (SFB). As placas

HUTU RKO WI26VA4

33

foram incubadas por 3horas a 37°C e centrifugadas a 1000rpm por 10 minutos para a

precipitação do formazan. O meio com MTT foi aspirado e adicionado 50µl de DMSO

para solubilização do formazan. Para avaliação da viabilidade celular os resultados

foram obtidos em leitor de microplacas Espectramax M5e (Molecular Devices, USA).

Para todas as amostras a viabilidade e toxicidade foram medidas através das

fórmulas:

𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 =(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜𝑠)

(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 𝑑𝑜𝑠 𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑑𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑑𝑎)× 100%

𝑇𝑜𝑥𝑖𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 = 100% − [𝑣𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑜 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜(%)]

3.5 Ensaio de fluorescência

Foram realizados ensaios de fluorescência das linhagens celulares controle,

linhagens teste e identificado CI50 e em diferentes intervalos de tempo.

3.5.1 Kit Live/Dead

Em uma placa de 48 poços foi semeado 1,0X 105 células /poço. As placas foram

incubadas em estufa de CO2 a 37°C onde permaneceram por 24 horas. Após período de

incubação os poços foram lavados com sal de Hans. A solução dos poços foi aspirada e

adicionou-se solução Live/Dead (2,0 µM EthD-1 e 1,0 µM Calcein AM). A placa foi

incubada por 30 min. a temperatura ambiente protegido da luz. Após este período a

placa foi centrifugada a 1000 rpm por 5 min. A solução Live/Dead foi aspirada e a

placa lavada com sal de Hans duas vezes. A placa foi centrifugada a 1000 rpm por 5

min. e adicionado PBS 1X para visualização no microscópio Axiovert 200, Zeiss.

3.5.2 DAPI/Faloidina

Em uma placa de seis poços foi adicionado uma lamínula de microscopia onde

as células cresceram. Em cada poço foi semeado 1,0X105 células/poço, a placa foi

incubada em estufa de CO2 a 37°C por 24 horas. Após incubação as células foram

lavadas com sal de Hans. Adicionou-se formaldeído 4% com tempo de contato de 1 h e

as placa lavadas duas vezes com sal de Hans. Foi adicionado PBS Tween 0,1% por 10

min. e após este período a placa foi lavada por três vezes com PBS 1X. Foi adicionado

34

400 µL de Faloidina 488 (Invitrogen # A12379) 1:20 nos poços por 20 min. As

amostras foram lavadas três vezes com PBS 1X e em seguida adicionado 400 µl de

DAPI (Invitrogen # D1306) com tempo de contato de 5 minutos. Após este processo a

placa foi incubada por 1 hora a temperatura ambiente protegida da luz. Decorrido o

tempo de incubação a placa foi lavada por três vezes com PBS 1X. As lamínulas

presentes no fundo dos poços da placa foram retiradas para a confecção de lâminas de

microscopia para visualização no microscópio Axiovert 200, Carl Zeiss.

3.6 Identificação dos fungos

As colônias dos isolados de fungos foram fotografadas (frente e verso) e

agrupadas de acordo com as seguintes características macromorfológicas: cor da colônia

(frente e verso), textura da superfície (frente e verso) e aspecto da borda. Selecionou-se

um isolado de cada morfotipo para identificação molecular por meio do sequenciamento

da região transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2) do gene do DNA ribossomal.

3.6.1 Extração do DNA total

A extração de DNA total foi realizada de acordo com metodologia descrita por

Rosa et al. (2009). Os fungos filamentosos foram crescidos por sete dias em BDA, e

então fragmentos de micélio foram colocados em tubo de 1,5mL acrescidos de 400 μL

de tampão de lise (Tris-HCl – trishidroximetilaminometano 0,05 M, EDTA – ácido

etilenodiamino tetra-acético 0,005 M, NaCl 0,1 M e SDS – sódio dodecil sulfato 1%) e

incubados a – 20ºC por aproximadamente 10 minutos. O micélio foi triturado com

auxílio de um pistilo e foram acrescentados 5 μL de Proteinase K (50 μg/mL). Após

homogeneização, colocou-se o tubo por 30 minutos a 60ºC em banho-maria. Em

seguida, foram adicionados 162 μL de CTAB (Tris 2M, NaCl 8,2%, EDTA 2M e CTAB

0,2%), seguido de homogeneização e incubação por 10 minutos a 65ºC. Posteriormente,

foram acrescentados 570 μL da mistura clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Após

homogeneização, o tubo foi incubado por 30 minutos em gelo. Em seguida, o conteúdo

foi centrifugado a 13.200 rpm por 10 minutos e o líquido sobrenadante transferido para

um novo tubo de 1,5mL. Ao novo tubo foram acrescentados 10% do volume de uma

solução de acetato de sódio 3M. O tubo foi vertido para homogeneização, incubado a

0ºC por 30 minutos e centrifugado a 13.200 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi

desprezado por inversão e em seguida, adicionados 200 μL de etanol (Merck) 70% p/v e

a suspensão foi gentilmente homogeneizada. A amostra foi centrifugada a 13.200 rpm

35

por 5 minutos e o sobrenadante desprezado por inversão, seguido por homogeneização

com etanol 70% p/v. A amostra foi reservada overnight para secagem e adicinou-se 50

μL de Tris-EDTA (Tris-HCl 0,01 M e EDTA 0,001 M). A amostra foi incubada a 65ºC

por 60 minutos para hidratação do DNA e posteriormente foram armazenados à -20ºC.

3.6.2 Amplificação utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4

Os iniciadores ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4

(TCCTCCGCTTATTGATATGC) foram utilizados para amplificação da região

transcrita interna (ITS1-5.8S-ITS2) do gene do rRNA, conforme descrito por White et

al. (1990). A PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foi realizada com volume final

de 50 μL contendo 5,0 μL de tampão 10X (Fermentas), 3,0 μL de MgCl2 25mM

(Fermentas), 2,0 μL de dNTP 0,05 mM (Invitrogen, EUA), 1,0 μL de cada iniciador

ITS1 e ITS4 10 μmol-1 (Invitrogen, EUA), 0,2 μL de Taq DNA polimerase 1,25U

(Fermentas), de 1,0 a 5,0 μL de DNA, de acordo com a dosagem do DNA total,

podendo variar de 50 a 500 ng/µL; e o volume final completado com água deionizada

autoclavada. As reações de PCR foram realizadas utilizando o termociclador PCR

Express (Thermo Hybaid). O programa consistiu de uma desnaturação inicial a 94ºC

por 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94ºC, 1 minuto de

anelamento a 55ºC e 1 minuto de extensão a 72ºC, e uma extensão final por 5 minutos a

72ºC. Os produtos de amplificação foram aplicados em gel de agarose (Pronadisa,

Espanha) a 1% em tampão TBE 0,5% (54 g de Tris Base, 27,5 g de ácido bórico, 20 mL

de EDTA 0,5 M, pH 8,0) a 120 V para a obtenção de bandas. Os géis foram corados

com solução de Gelred (Biotium, EUA) e visualizados sob luz ultravioleta (UV) por

meio de um sistema de captação de imagem (Vilber Lourmat, França).

3.6.3 Purificação dos amplicons

Os amplicons gerados pela reação de PCR foram purificados mediante técnica

com polietilenoglicol (PEG). Ao produto de PCR foi adicionado o mesmo volume de

solução de polietilonoglicol 20% em NaCl 2,5 M, e deixado em banho-maria a 37ºC por

15 minutos. O tubo foi centrifugado a 13.500 rpm por 15 minutos, o sobrenadante foi

retirado e descartado. Em seguida, foi adicionado 125 μL de etanol 70-80% resfriado a

4ºC. O tubo foi novamente centrifugado a 13.500 rpm por dois minutos e então retirou-

se o etanol. Este passo foi repetido e a amostra novamente centrifugada a 13.200 rpm

36

por um segundo. O tubo foi deixado à temperatura ambiente para evaporação de todo o

excesso de etanol. Foram adicionados 10 μL de água deionizada estéril e o conteúdo do

tubo homogeneizado em vórtex por 15 segundos. Em seguida, o tubo foi incubado em

banho-maria a 37ºC por 40 minutos. O produto obtido foi dosado em NanoDrop ND

1000 (NanoDrop Technologies) com comprimento de onda de 260nm, e então utilizado

nas reações de sequenciamento.

3.7 Reações de sequenciamento

O sequenciamento foi realizado utilizando-se o Kit DYEnamicTM (Amersham

Biosciences, USA) em combinação com o sistema de sequenciamento automatizado

MegaBACETM 1000, no Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular (LBEM

- UFMG). Para as reações de sequenciamento foram utilizados 80-120 ng do DNA

purificado e os reagentes presentes no Kit DYEnamicTM (Amersham Biosciences,

USA). A reação de PCR foi realizada com volume final de 10 μL contendo 4 μL do

pré-mix (presente no kit de sequenciamento), 1 μL do iniciador (5 μmol-1), de 1 a 5 μL

de DNA e o volume final foi completado com água deionizada autoclavada. O programa

consistiu de 36 ciclos de uma desnaturação inicial a 95ºC por 25 segundos, seguido por

15 segundos de anelamento a 50ºC e 3 minutos de extensão a 60ºC. Em seguida, os

produtos da reação foram transferidos para uma placa de sequenciamento de 96 poços e

então precipitados.

Para precipitação das reações de sequenciamento, 1 μL de acetato de amônio 7,5

M foi adicionado em cada poço da placa de 96 poços. A solução de acetato de amônio

foi dispensada na parede lateral dos poços e a placa levemente batida sobre a bancada

para que as gotas do acetato de amônio se misturem à reação. Em seguida foram

adicionados 28 μL de etanol absoluto (Merck). A placa foi submetida à agitação em

vórtex e incubada por 20 minutos à temperatura ambiente, protegida da luz.

Após período de incubação, a placa foi centrifugada por 45 minutos a 4.000 rpm. O

sobrenadante foi descartado virando-se a placa sobre um papel absorvente. Em seguida,

foram adicionados 150 μL de etanol 70% (Merck). A placa foi centrifugada por 15

minutos a 4.000 rpm e o sobrenadante descartado. Para remoção do excesso de etanol, a

placa foi vertida sobre um papel absorvente, e submetida a um pulso em centrífuga a

900 rpm durante 1 segundo. Em seguida, a placa foi mantida em repouso durante 20-40

minutos, protegida da luz, para evaporação do etanol.

37

O DNA das amostras precipitado em cada poço foi então ressuspendido em 10

μL de “tampão de corrida” (presente no kit de sequenciamento). A placa foi submetida à

agitação em vórtex por 2 minutos, centrifugada por 1 segundo a 900 rpm e armazenada

a 4ºC, protegida da luz, até injeção das amostras no sistema automatizado

MegaBACETM 1000.

3.8 Análise computacional das sequências

As sequências de DNA foram comparadas com as sequências de culturas

depositadas no GenBank, utilizando o programa BLASTn (Basic Local Alignment

Serch Tool – versão 2.215 do BLAST 2.0) disponível no portal NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/), desenvolvido pelo National Center For

Biotechnology e disponível no portal NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). Os

isolados que apresentaram sequência com identidade ≥ a 98% em relação às sequências

de fungos depositadas no GenBank, foram considerados como pertencentes à mesma

espécie ou gênero. Os que apresentaram sequências com identidade entre 93 e 97%

somente o gênero foi aceito, para sequências com identidade <93% os isolados foram

identificados como espécies desconhecidas ou identificados em família, classe, ordem

(ROSA et al., 2010).

3.9 Construção de dendrogramas e análise de frequência

Para a construção de dendrogramas e análise de frequência de isolados foi

utilizado o software SPSS® versão 19.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/

38

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Produção dos extratos e ensaios biológicos

Do total de 100 extratos etanólicos obtidos, 41 foram avaliados sendo expostos a

duas linhagens de células provenientes do sistema gastrointestinal, HUTU-80 ATCC #

HTB-40 (adenocarcinoma de duodeno), RKO AS45-1 ATCC #CRL-2579 (carcinoma

de colón humano), e linhagem normal de fibroblasto de pulmão WI26VA4

ATCC#CCL951.

Em uma primeira análise foram considerados citotóxicos extratos que, causaram

às células testadas, viabilidade inferior a 50% e toxicidade superior a 50%. Foram

considerados com ação antitumoral os extratos tóxicos para HUTU e RKO, e para

WI26VA4 estes foram considerados apenas tóxicos. Também foram analisados os

extratos que atingiram o CI55, pois pretendia-se avaliar se outros extratos apresentavam

tendência à toxicidade. Considerando o CI50, para todas as linhagens testadas, apenas o

extrato do isolado UFMGCB 5460 exerceu atividade antitumoral para a linhagem

tumoral RKO (tabela 1).




para a linhagem testada. UFMGCB* 5460

Concentração do extrato (µg/mL) Linhagem celular Toxicidade (%)

30 HUTU 0

30 RKO 28

30 WI26VA4 4

60 HUTU 0

60 RKO 22

60 WI26VA4 8

120 HUTU 0

120 RKO 18

120 WI26VA4 30

240 HUTU 44

240 RKO 51

240 WI26VA4 34

*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de

Minas Gerais.

Para a linhagem tumoral HUTU três extratos apresentaram atividade

antitumoral. UFMGCB 5478 (tabela 2), UFMGCB 5502 (tabela 3) e UFMGCB 5533

(tabela 4). Os isolados UFMGCB 5467 (tabela 5) UFMGCB 5485 (tabela 6), UFMGCB

39

5498 (tabela 7), UFMGCB 5500 (tabela 8) e UFMGCB 5502 (tabela 3) foram tóxicos

para a linhagem normal WI26VA4. Apenas o extrato UFMGCB5502 se mostrou toxico

para duas linhagens celulares distintas, HUTU e WI26VA4.






30 HUTU 14

30 RKO 0

30 WI26VA4 0

60 HUTU 27

60 RKO 0

60 WI26VA4 0

120 HUTU 37

120 RKO 0

120 WI26VA4 0

240 HUTU 58

240 RKO 16

240 WI26VA4 0


Minas Gerais.



exposição. As linhas sombreadas mostram a concentração do extrato que tem o perfil

tóxico para a linhagens testadas.

UFMGCB* 5502


30 HUTU 10

30 RKO 0

30 WI26VA4 0

60 HUTU 19

60 RKO 0

60 WI26VA4 0

120 HUTU 25

120 RKO 0

120 WI26VA4 28

240 HUTU 52

240 RKO 15

240 WI26VA4 68


Minas Gerais.

40






30 HUTU 0

30 RKO 17

30 WI26VA4 4

60 HUTU 16

60 RKO 16

60 WI26VA4 0

120 HUTU 45

120 RKO 17

120 WI26VA4 0

240 HUTU 56

240 RKO 17

240 WI26VA4 24


Minas Gerais.






30 HUTU 5

30 RKO 0

30 WI26VA4 0

60 HUTU 3

60 RKO 0

60 WI26VA4 25

120 HUTU 19

120 RKO 0

120 WI26VA4 45

240 HUTU 47

240 RKO 37

240 WI26VA4 82


Minas Gerais.

41






30 HUTU 7

30 RKO 0

30 WI26VA4 11

60 HUTU 10

60 RKO 0

60 WI26VA4 14

120 HUTU 15

120 RKO 0

120 WI26VA4 27

240 HUTU 36

240 RKO 10

240 WI26VA4 69


Minas Gerais.






30 HUTU 0

30 RKO 32

30 WI26VA4 0

60 HUTU 0

60 RKO 31

60 WI26VA4 0

120 HUTU 0

120 RKO 24

120 WI26VA4 0

240 HUTU 30

240 RKO 25

240 WI26VA4 80


Minas Gerais.

42






30 HUTU 3

30 RKO 3

30 WI26VA4 46

60 HUTU 9

60 RKO 10

60 WI26VA4 24

120 HUTU 21

120 RKO 15

120 WI26VA4 46

240 HUTU 0

240 RKO 24

240 WI26VA4 51


Minas Gerais.

Dentre os 41 extratos, oito extratos foram tóxicos para as células testadas,

correspondendo a 19,5% dos extratos testados. Apenas o extrato do fungo UFMGCB

5502 foi tóxico para duas linhagens celulares (HUTU E WI26VA4). Vale ressaltar que

os extratos tóxicos para WI26VA4 (exceto o extrato do fungo UFMGCB5502), em

análise prévia, não apresentaram ação antitumoral, pois esta é uma linhagem normal o

que permitiu apenas avaliar a toxicidade dos extratos sobre sistemas normais. Esta

análise é importante, por permitir que droga em estudo tenha sua toxidade declarada in

vitro antes de chegar aos testes com animais. Contudo não se pode descartá-lo como

fonte de metabólitos de interesse em outras enfermidades e também deve-se considerar

que os testes envolvem extratos brutos, que é uma mistura complexa de vários

metabólitos, sendo imprescindível o emprego de etapas de purificação para isolamento

de substâncias como perspectivas de elucidação de novos extratos tóxicos. O extrato do

fungo UFMGCB5502 apresentou ação tóxica e antitumoral, caracterizada pela perda de

viabilidade para linhagem tumoral (HUTU) e para linhagem normal (WI26VA4). Os

extratos dos fungos UFMGCB 5460, UFMGCB 5478, UFMGCB5502 e UFMGCB

5539 apresentou ação exclusivamente antitumoral, tóxico apenas em linhagens

tumorais (HUTU e RKO), caracterizando uma possível fonte de metabólitos com ação

tóxica em tumores. Os valores de CI50 de todos os extratos tóxicos estão representados

na tabela 9.

43

Tabela 9. Relação dos extratos com atividade citotóxica e relação a sua concentração

inibitória a 50% (CI50) Extratos dos fungos

UFMGCB*

Célula testada Equação da reta CI50** (µg/mL)

UFMGCB 5460 RKO y = 0,1112x+24,287 231,23

UFMGCB 5478 HUTU y = 0,1981x+11,852 192,57

UFMGCB 5502 HUTU y = 0,1911x+5,1668 234,61

UFMGCB 5533 HUTU y = 0,2865x-5,1477 192,49

UFMGCB 5467 WI26VA4 y = 0,366x-3,1879 145,32

UFMGCB 5485 WI26VA4 y =0,2884x-2,2503 181,17

UFMGCB 5498 WI26VA4 y = 0,4496x-35,922 191,11

UFMGCB 5500 WI26VA4 y = 0,0664x+34,295 236,52

UFMGCB 5502 WI26VA4 y = 0,389x-29,54 204,47


Minas Gerais.

** CI50= Concentração inibitória em 50%

Ao aumentar a linha de corte para IC55 é possível considerar mais quatro extratos

ativos, e totalizar 12 extratos tóxicos para as três linhagens testadas. Este aumento pode

ser explicado pela proximidade da toxicidade destes extratos e pelo perfil de dose

resposta que estes apresentaram. Para a célula RKO somente o extrato do fungo

UFMGB 5489 (Figura 10) foi tóxico. Para HUTU os extratos dos fungos UFMGCB

5508 (Figura 11 A) e UFMGCB 5534 (Figura 11 B) foram tóxicos. Considerando o IC55

temos para WI26VA4 o extrato do fungo UFMGCB 5510 (Figura 12).

44

Figura 10. Ensaio de viabilidade para a linhagem RKO utilizando extratos de fungos


extrato atingiu CI55 de 282,78µg/mL.

Figura 11. Ensaio de viabilidade para a linhagem HUTU utilizando extratos de fungos


extrato atingiu CI55 para 237,53 µg/mL (A) e para 259,68 µg/mL (B).

45

Encontramos na literatura diversos trabalhos com produtos naturais empregados

na busca de metabólitos bioativos. A resistência das bactérias às drogas, o

aparecimento de novas doenças virais, os problemas recorrentes de doenças em

pacientes submetidos a transplantes de órgãos e o aumento da incidência de infecções

fúngicas na população demonstram a importância da elucidação de novas drogas

(STROBEL & DAISY, 2003). Além dissosão poucos os trabalhos com fungos

endofíticos que visam exclusivamente produtos com atividade atitumoral.

Em 2010 Rosa e colaboradores realizaram ensaios de bioprospecção utilizando

extratos de fungos endofíticos associados às plantas bioativas brasileiras. Além de

avaliar a atividade leishmanicida e tripanosomicida, estes pesquisadores analisaram a

viabilidade celular utilizando as linhagens celulares UACC-62 (melanoma humano),

MCF-7 (adenocarcinoma de mama) e TK10 (carcinoma renal humano). Dos 121

extratos testados, 17 (14%) inibiram o crescimento celular em 60% para pelo menos

uma linhagem celular testada. Os CI50 variaram de >0,2 a 25 µg/mL.

Semelhante aos nossos resultados, Lu e colaboradores em 2011 identificaram 17

fungos endofíticos associados à planta Actinidia macrosperma com capacidade de

produzir metabólitos antitumorais. Estes autores utilizaram as linhagens celulares

HepG2 (carcinoma hepatocelular), MCF-7 (adenocarcinoma de mama), A549

(adenocarcinoma de pulmão humano), SGC-7901 (câncer gástrico humano), HeLa

(câncer de colo uterino). Entre os 17 fungos endofíticos isolados , 14 (82,4%)

apresentaram atividade positiva (IC50 <100 µg/mL) sendo estes valores semelhantes aos

encontrado no nosso trabalho. A porcentagem de isolados com atividade antitumoral

variou para cada linhagem celular. Aproximadamente 76,5% das culturas de fungos

endofíticos apresentou atividade antitumoral em HepG2, MCF-7, e SGC-7901, e 82,4%

das culturas de fungos endofíticos exibiram atividade antitumoral para as linhagens

A549 e HeLa. Todos estes testes foram feitos com incubação de 24 horas.

Santiago e colaboradores em 2012 testaram a atividade leishmanicida e

tripanosomicida de fungos endofíticos isolados associados as angiospermas antárticas,

Deschampsia antarctica e Colobanthus quitensis. Avaliaram a viabilidade celular

utilizando as linhagens UACC-62, MCF-7 e TK10. De 564 isolados, verificou-se

citoxicidade em seis extratos, quatro para MCF-7, um para TK7 e um para UACC-62.

Os valores de CI foram <82 µg/mL para as linhagens testadas.

46

Para melhor compreensão dos resultados encontrados, o software SPSS 19.0

(Chicago) foi utilizado para análises descritivas, gráficos e agrupamento hierárquico

(dendrograma) considerando todas as variáveis deste trabalho, estão expostos na Tabela

10.

47

Tabela 10. Relação dos isolados de Clusia arrudae testados, em relação ao órgão de origem, morfotipo isolado, número de fungos por planta,

número de fungos por folha, números de fungos por caule e número de morfotipos por planta. Software SPSS 19.0 (IBM)

UFMGCB* PLANTA ORGÃO MORFOTIPO

NÚMEROS DE

FUNGOS POR

PLANTA

NÚMERO DE

FUNGOS POR

FOLHA

NÚMERO DE

FUNGOS POR

CAULE

NÚMERO DE

MORFOTIPOS POR

PLANTA

5443 2 FOLHA 9 4 2 2 3

5449 24 CAULE 1 7 1 6 4

5450 24 CAULE 4 7 1 6 4

5453 4 CAULE 6 1 0 1 1

5455 15 CAULE 4 7 4 3 5

5459 26 FOLHA 4 2 2 0 2

5460 28 CAULE 1 1 0 1 1

5461 13 CAULE 1 3 0 3 2

5465 13 CAULE 1 3 0 3 2

5467 6 CAULE 1 5 1 4 3

5468 24 CAULE 1 7 1 6 4

5469 23 CAULE 1 4 0 4 1

5473 14 CAULE 1 3 0 3 2

5474 22 CAULE 1 3 0 3 3

5476 3 FOLHA 1 9 4 5 3

5478 18 FOLHA 1 4 2 2 3

5480 25 FOLHA 1 2 1 1 1

5484 3 CAULE 1 9 4 5 3

5485 30 CAULE 1 5 5 1 2

5486 10 CAULE 4 6 1 5 2

48

UFMGCB* PLANTA ORGÃO MORFOTIPO

NÚMEROS DE

FUNGOS POR

PLANTA

NÚMERO DE

FUNGOS POR

FOLHA

NÚMERO DE

FUNGOS POR

CAULE

NÚMERO DE

MORFOTIPOS POR

PLANTA

5489 12 CAULE 1 1 0 1 1

5495 2 CAULE 1 4 2 2 3

5498 3 CAULE 1 9 4 5 3

5500 3 CAULE 1 9 4 5 3

5501 24 CAULE 2 7 1 6 4

5502 9 CAULE 1 6 1 5 3

5504 10 CAULE 1 6 1 5 2

5508 10 CAULE 4 6 1 5 2

5510 6 CAULE 1 5 1 4 2

5511 16 FOLHA 4 3 3 0 2

5512 2 FOLHA 6 4 2 2 3

5513 16 FOLHA 4 3 3 0 2

5514 27 FOLHA 4 2 2 0 1

5515 27 FOLHA 4 2 2 0 1

5516 3 FOLHA 1 9 4 5 3

5521 18 FOLHA 18 4 2 2 3

5525 2 CAULE 1 4 2 2 3

5532 6 CAULE 1 5 1 4 2

5533 5 FOLHA 1 4 4 0 3

5534 30 FOLHA 4 5 1 4 2

5539 5 FOLHA 4 4 4 0 3

*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais.

49

Os isolados de Clusia arrudae foram agrupados em 21 morfotipos considerando

cor, aspecto da colônia e textura. Os morfotipos 1 e 4 foram os mais frequentes(Figura

13). Análise somente dos extratos testados nos ensaios de viabilidade, a considerar a

frequência de números de morfotipos por planta (Figura 12), observa-se que o número

médio de morfotipos isolados em cada planta foi de 3 morfotipos e que os fungos do

morfotipo 1 e 4 foram mais presentes nos ensaios de viabilidade (Figura 13B). Na figura

13 C, relacionamos as plantas cujos fungos isolados foram utilizados nos ensaios de

viabilidade, com destaque para as plantas 2, 3 e 24. Não obtivemos fungos endofíticos

em nenhum dos órgãos de coleta oriundo da planta 1. A média de fungos isolados por

planta foi de 4 fungos(Figura 13 D). Considerando ainda o órgão de coleta é possível

verificarmos que foram isolados mais fungos do caule (Figura 13 E) do que de folha

(Figura. 13 F).

Figura 12. Gráfico de frequência pelo número de morfotipos. Observa-se que os

morfotipos 1 e 4 foram mais isolados entre todos (setas). Software SPSS 19.0 (IBM)

Freq

uên

cia

50

Figura 13. Gráficos de frequência. Relação dos números de fungo isolados e sua

frequência por planta (A). Frequência do tipo de morfotipos isolados (B). Números de

isolados de planta e sua frequência(C). Frequência dos números de isolados por planta

(D). Frequência de números de isolados no caule (E). Frequência de isolados na

folha(F). Software SPSS 19.0 (IBM).

A partir destas variáveis, fez-se uma análise de cluster hierárquico e um

dendrograma foi confeccionado (Figura 15). Ao analisarmos os agrupamentos gerados

percebe-se que os extratos tóxicos para as células testadas pertencem a grupos distintos

o que permitiu inferir considerações sobre as relações ecológicas entre os fungos e a

toxicidade apresentada. Os extratos tóxicos para WI26VA4 e RKO foram

51

predominantemente de fungos isolados do caule e do morfotipo 1. Estes extratos

diferem quanto a toxicidade para RKO de um fragmento de caule que só teve 1 fungo

isolado, enquanto que para a WI26VA4 o extrato tóxico foi oriundo de fragmentos do

caule onde foram isolados em média 3 morfotipos diferentes, conforme demonstrados

na Tabela 10. Os trabalhos encontrados na literatura, que envolvem o isolamento de

fungos endofíticos não os diferem quanto à origem do órgão coletado e o número de

morfotipos isolados. O que inviabiliza a interpretação de nossos resultados

correlacionados a dados de outros pesquisadores. No dendograma, podemos observar

que o grupo ao qual pertencem os extratos tóxicos para RKO está distante do grupo de

extratos tóxicos para HUTU, de acordo com a semelhança entre os grupos. Análises

estatísticas deverão ser realizados para verificar a significância entre as relações

ecológicas e a toxicidade apresentada pelos extratos.

Neste trabalho obtivemos estes dados uma vez que as relações ecológicas entre

indivíduos poderiam sugerir informações sobre a possibilidade de produção de

metabolitos de inibição por estes fungos. Sendo assim, quando verificamos que a

toxicidade para determinada linhagem tumoral, neste caso RKO ocorreu pelo extrato

que só teve um isolado, propõe-se que este fungo exerça pressão negativa produzindo

metabolitos secundários de inibição, responsáveis pela toxicidade. A síntese de

metabólitos secundários parece garantir ao fungo vantagem em habitats no qual este

necessita competir com outros micro-organismos. O que permite concluir que muitos

desses metabólitos apresentam efeitos tóxicos ou inibitórios em outros organismos. Por

estas propriedades, muito destes tem sido adotados para uso farmacêutico como

antibióticos, agentes hipocolesteromeantes, imunossupressores e inibidores de tumor

(KHALDI et. al., 2010).

Para HUTU os extratos com ação antitumoral foram isolados em sua maioria de

folhas pertencentes também ao morfotipo 1. Neste caso a toxicidade também ocorreu

para extratos que apresentaram menor número de morfotipos isolados, semelhante ao

ocorrido com a RKO, sendo que a principal diferença foi o órgão de coleta.

Estes resultados sugerem que as linhagens tumorais RKO e a HUTU possuem

mecanismos de mortes diferentes, embora sejam oriundas do sistema gastrointestinal e

que os extratos possuem moléculas com ações distintas, tendo em vista que os órgãos de

coleta têm funções diferentes na planta.

52

Estas diferenças de sensibilidade dos tumores às drogas fortalecem a busca por

novos alvos terapêuticos nas terapias de câncer bem como esforços na investigação dos

mecanismos básicos envolvidos na via de sinalização para a morte (apoptose) e para o

crescimento celular.

53

Figura 14. Dendrograma confeccionado a partir do software SPSS 19.0 considerando

os 41 extratos usados nos ensaios de viabilidade celular. Extrato com ação antitumoral,

para a linhagem RKO (seta vermelha), para HUTU (setas verdes). Com ação tóxica para

WI26VA4 (setas azuis). Extrato com ação tóxica e antitumoral para HUTU e WI26VA4

(seta preta).

54

Identificação molecular dos fungos endofíticos que apresentaram atividade citotóxica

A avaliação da diversidade microbiana representa um grande desafio da

microbiologia moderna, devido ao grande número de espécies microbianas já

conhecidas ou que se acredita existir (GAMBOA et al., 2002). Aly e colaboradores

(2011) sugerem que exista um certo grau de variabilidade na composição da

comunidade endofítica de plantas hospedeiras de um táxon, mesmo dentro de um nicho

aparentemente homogêneo, dada à influência fisiológica. As plantas são confrontadas

com diferentes fatores ambientais, devido à sua localização geográfica (ARNOLD

2007). Esta diversidade de fatores externos e internos pode influenciar a riqueza de

espécies de fungos endofíticos residentes (VEGA et al., 2010). Assim, algumas

espécies de plantas superiores podem praticamente hospedar centenas de espécies

de fungos endofíticos em um tipo de tecido, entretanto, a maioria das comunidades são

normalmente dominados por poucas espécies (SIEBER 2007; VEGA et al 2010;

BOTELLA & DIEZ 2011).

A identificação molecular dos fungos endofíticos neste trabalho foi realizada

apenas para os extratos dos isolados que apresentaram toxicidades para as linhagens de

células testadas. Os isolados UFMGCB 5467 e 5478 tiveram o mesmo perfil de

alinhamento quando comparadas com sequências depositadas no GenBank, os quais

apresentaram 100% de identidade com Pleoporales sp. (GU509025). Estes fungos

também apresentaram 99% de identidade para Corynespora sp. (JN198482) e

Pyrenochaeta sp. (JF502447) juntamente com os isolados UFMGCB 5485 e 5533 que

apresentaram 99% de identidade com fungos do gênero Pleosporales sp. (GU595025).

O isolado UFMGCB 5500 apresentou 99% de identidade para fungos do gênero Xylaria

sp. (GU324749) e o isolado UFMGCB 5502 demonstrou alinhamento satisfatório para

qualquer classe taxonômica (Tabela 11).

55

Tabela 11. Cinco melhores sequências alinhadas no BLAST de fungos endofíticos bioativos de Clusia arrudae, com substrato e origem de cada

sequência.

UFMGCB* Descrição dos melhores alinhamentos [no. de

acesso no GenBank]

Identidade (%) Substrato e origem

5467 Pleosporales sp. H4179[GU509025] 100 Endofítico de Coffea arabica, EUA

Pleosporales sp. VegaE3-63 [EU002939] 99 Endofítico de Coffea arabica, EUA

Corynespora sp. Z1 [JN198482] 99 Endofítico de Taxus chinensis var. mairei, China

Pyrenochaeta sp. 1-38 [JF502447] 99 Endofítico de Lindera glauca, China

Pleosporales sp. H4179[GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China

5478 Pleosporales sp. H4179[GU509025] 100 Endofítico de Coffea arabica, EUA



Pleosporales sp. H4179 [GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China


5485 Pleosporales sp. H4179 [GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China




Pleosporales sp. E7410b [HM855221] 90 Endofítico de Calycophyllum spruceanum, Equador

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/157741934?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=KTU394GT01S

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/157741934?report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=KTU394GT01S

56

5500 Xylaria berteri [GU324749] 99 Madeira, Taiwan

Xylariaceae sp. [HQ117853] 99 Endofítico de Besleria quadrangulata, Equador

Xylariaceae sp. [EU009985] 99 Endofítico de Coffea arabica, EUA

Xylaria sp. [EU009986] 99 Endofítico de Euterpe precatoria, Equador

Xylaria enteroleuca [AM084368] 99 Fungo obtido de paciente com sinusite, Brasil

5502 Uncultured Pezizaceae [FJ788744] 85 Raiz de Corycium Esobanchoides, Inglaterra

Fungal endophyte sp. UFMGCB 1270

[FJ605261]

82 Endofítico da orquídea Octomeria sp., Brasil

Fungal sp. ARIZ AZ0498 [HM123222] 80 Talo do líquen Punctelia hypoleucites, EUA

Uncultured fungus [FM999684] 79 Esporocarpo, EUA

Peziza badioconfusa voucher 11414 [JF908532] 80 Não determinado

5533 Pleosporales sp. H4179 [GU595025] 99 Endofítico de Rhizophoraceae, China




Pleosporales sp. E7410b [HM855221] 90 Endofítico de Calycophyllum spruceanum, Equador

*UFMGCB = Coleção de Micro-organismos e Células da Universidade Federal de Minas Gerais.

57

Pleosporales é a maior ordem da classe dos Dothideomycetes. De acordo com

Kirk e colaboradores (2008) esta classe compreende 23 famílias, 332 gêneros e mais de

4.700 espécies. Membros do gênero Pleosporales podem ser endofíticos ou epifíticos

(HUANG et al. 2008), parasitas de folhas verdes e hastes (SOLOMON et al., 2006) e

liquenícolas (Calatayud et al., 2001).

A família Xylariaceae tem distribuição mundial, ocorrem como os principais

representantes de plantas tropicais investigadas (BAYMAN et al. 1998). Entretanto, as

funções ecológicas desempenhadas por este grupo de fungos ainda não foram até o

momento exploradas em detalhes (DAVIS etal., 2003). Alguns trabalhos demonstraram

que fungos endofíticos da família Xylariacea podem proporcionar efeitos benéficos

para seus hospedeiros in vivo (ARNOLD et al,. 2003). Fungos endofíticos do gênero

Xylaria, Phoma, Hypoxylon e Chalara são fungos representativos de produtores de

alcalóides do grupo das citocalasinas (WAGENAAR et al., 2000). Muito destes

metabólitos possuem atividade antitumoral e devido a sua toxicidade celular não tem

sido empregado em produtos farmacêuticos (STROBEL DAISY, 2003). Strobel e

colaboradores em 2004 descreveram um fungo da família Xylareaceae, a espécie

Muscodor albus como um produtor de uma mistura de compostos orgânicos voláteis

(COV) com efeito tóxico à vários organismos testes incluindo fungos patógenos de

planta, leveduras e bactérias. Em 2010 Silva e colaboradores obtiveram fungos

endofíticos do gênero Xylaria isolados de Piper aduncum. Neste trabalho, foi realizado

fracionamento dos extratos dos fungos do gênero Xylaria em cromatográfico e obtive-se

citocalasinas tóxicas para HeLa (tumor de colo de útero humano) e CHO (ovário de

hamster chinês). Rosa e colaboradores (2010) isolaram os fungos endofítico

UFMCB 899 e UFMGCB 903 que apresentaram 96 e 97% de identidade para Xylaria

sp., respectivamente. O extrato UFMGCB899 exerceu inibição de 43% para UACC-62,

66% para MCF-7 e 84% para a linhagem TR10. O extrato UFMGCB 903 inibiu o

crescimento da linhagem UACC-62 em 73%, MCF-7 em 96% e TR-10 em 94%. Estes

trabalhos demonstram a potencialidade de produção de metabólitos com atividade

antitumoral por endofíticos do gênero Xylaria. No presente trabalho também

identificamos esta atividade, pois este fungo deste gênero mostrou-se tóxico para as

linhagem normal WI26VA4,confirmando sua toxicidade e evidenciando a necessidade

58

de isolamento destes metabólitos para uma possível fonte de moléculas para o

tratamento de tumores com menor efeito colateral em células normais.

Ensaios de fluorescência

DAPI/Faloidina

Foram testadas as linhagens HUTU e RKO após exposição aos extratos fúngicos

utilizando sondas que marcam citoesqueleto de actina e núcleo. Podemos verificar no

controle de vida a morfologia característica da célula testada e sua organização. Não foi

verificado amontoados de células para o ensaio fluorescente como em cultura, as células

crescem em monocamada. Nas figuras que ilustram os ensaios de fluorescência

verificamos o núcleo da célula (azul) e a organização dos filamentos de actina (verde).

Os núcleos das células do controle de vida da HUTU (figuras 18 A e B)

apresentam tamanho em torno de 11µm e dimensões celulares de acordo com a

organização dos filamentos de actina (verde) em torno de 26 µm. Figuras 18 C e D são

da linhagem HUTU após exposição a 240µg/ml do extrato UFMGCB5478, onde

podemos perceber redução do tamanho do citoplasma (16µm) e quebra do citoesqueleto

de actina, sendo este reduzido a pontos fluorescentes evidenciados pelas marcações por

setas na figura. Resultado indica que este extrato provavelmente possui ação de

despolimerização dos filamentos de actina, fenômeno semelhante ao que acontece com

o Paclitaxel, que extraído de um fungo endofítico, age sobre a despolimerização de

microtúbulos, impedindo a divisão celular e por isso tornou-se um poderoso

quimioterápico (WANI et.al., 1971; STROBEL & DAISY 2003; KHARWAR , 2011).

O mesmo fenômeno pode ser percebido na Figura 18 E e F, para o extrato

UFMGCB5489, onde o citoesqueleto de actina desta célula também foi desorganizado,

o citoplasma reduzido e dimensões celulares em torno de 13 µm.

O Taxol® é amplamente utilizado na clínica médica, com excelentes resultados

contra tumores, mas um grande obstáculo à sua utilização é sua oferta limitada

(HOLTON et al., 1995a). Vários métodos têm sido desenvolvidos para a produção de

paclitaxel. A síntese química total do fármaco não é considerada economicamente

viável devido ao custo elevado e baixo rendimento. Estes problemas podem ser

59

solucionados através da biopropecção de fungos endófiticos que podem desempenhar

um papel importante na biossíntese do paclitaxel (LI & TAO, 2008).

Os núcleos das células do controle de vida para RKO apresentam tamanho em

torno de 15µm (azul) e dimensões celulares de acordo com sua a organização dos

filamentos de actina (verde) em torno de 29 µm, (Figuras 16A e B). As figuras 16 C e D

são da linhagem RKO após exposição a 240µg/ml do extrato UFMGCB5460, onde

podemos perceber, como ocorreu com as outras linhagens celulares, a redução do

tamanho do citoplasma (14µm) e quebra do citoesqueleto de actina. O mesmo fenômeno

percebemos na Figura E e F, para o extrato UFMGCB5489, onde o citoesqueleto de

actina desta célula também foi desorganizado, com citoplasma reduzido e dimensões

celulares em torno de 20 µm.

60

Figura 15. Fotomicrográfica de fluorescência da linhagem HUTU exposta a 240µg/mL

de extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae. As células foram

marcadas com Faloidina (verde) que identifica filamentos do citoesqueleto de actina e

por DAPI (azul) que identifica o núcleo. Na coluna da direita imagem de fluorescência e

na coluna da esquerda, imagens de DIC do mesmo campo visual. A e B- Controle de

vida; C e D- Células expostas ao extrato UFMGCB 5478 e E e F ao extrato UFMGCB

5502, podemos evidenciar, para ambos os extratos, que estes causaram alterações

morfológicas como quebra completa do citoesqueleto de actina reduzindo a marcação a

apenas um ponto de aglomeração citoplasmática (seta); E e F- Células expostas ao

extrato UFMGCB 5502, evidenciando alterações morfológicas de extrato.

61

FALOIDINA/DAPI DIC

UFMGCB 5478

Controle de vida

UFMGCB 5502

UFMGCB 5533

G

E F

H

A B

C D

62

Figura 16. Fotomicrografia de fluorescência da linhagem RKO exposta a 240µg/mL de

extratos de fungos endofíticos associados à Clusia arrudae. As células foram marcadas

com Faloidina (vermelho) que identifica filamentos do citoesqueleto de actina e por

DAPI (azul) que identifica o núcleo. Na coluna da esquerda, imagens de fluorescência e

na coluna da direita, imagens de DIC do mesmo campo visual. A e B- Controle de vida;

C e D- Células expostas ao extrato UFMGCB 5460, evidenciando alterações

morfológicas com perda da adesão celular e desorganização do citoesqueleto de actina;

E e F- Células expostas ao extrato UFMGCB 5489, evidenciando alterações

morfológicas de extrato cuja dose utilizada atingiu CI55.

63

64

Estes resultados para as linhagens HUTU e RKO evidenciam que estes extratos são

fontes promissoras de moléculas bioativas com ação antitumoral por agirem sobre o

citoesqueleto celular, fazendo com que as células percam sua organização, reduzindo as

dimensões citoplasmáticas a metade, e perda da capacidade de adesão levando-as a

morte (tabela 12), além da ausência de toxicidade para as células da linhagem normal

WI24VA4. Fenômeno semelhantemente a ação do Paclitaxel, que causam

despolimerização e agregação dos microtúbulos a partir dos dímeros de tubulina,

resultando na inibição da dinâmica normal de reorganização da rede de microtúbulos

essencial para as funções celulares (KHARWAR et. al., 2011). Os extratos Pleosporales

sp. UFMGCB 5478 e Pleosporales sp. UFMGCB 5502 mostraram capacidade de

quebra do citoesqueleto de actina da linhagem HUTU de maneira mais evidente do que

o extrato Pleosporales sp. UFMGCB 5460 para linhagem RKO. Estes extratos

reduziram a metade o tamanho do citoplasma destas células.

Tabela 12. Extratos testados que apresentaram toxicidade acima de 50%. As linhas

sombreadas representam os extratos mais promissores.

UFMGCB* Identificação Toxicidade

para WI26VA4

Antitumoral Quebra do

citoesqueleto

5460 Pleosporales sp. Não RKO Sim

5467 Pleosporales sp. Sim Não -

5478 Pleosporales sp. Não HUTU Sim



5500 Xylaria sp. Sim Não -

5502 Sem identifição Sim HUTU Sim

5533 Pleosporales sp. Não HUTU Não

Kit Live/Dead

Este ensaio também é conhecido como viabilidade celular, marca as células

vivas de verde e as células mortas de vermelho. Este kit é composto pela Calcein AM

que é hidrolisado por esterases a um produto fluorescente verde em células vivas e pelo

Ethidium homodimer-1, um produto fluorescente vermelho que atravessa a membrana

de células mortas e possui afinidade pelo núcleo. Pode-se observar que o extrato

UFMGCB 5533 (Figura 17, E e F) na concentração de 240µg/mL matou algumas

células (setas) e causou perda de adesão celular. Para o extrato de UFMGCB 5533

65

causou uma morte celular mais evidente (setas), sem perda da adesão celular. Para a

linhagem RKO foi testado o extrato UFMGCB 5460 (Figura 18, E e F) onde ficou

evidente a perda de adesão celular, além de provocar morte celular (setas). Analisando

esta microfotografia fica evidenciado que os extratos testados com o Kit de

LIVE/DEAD, têm efeito tóxico para as células, mas não e possível precisar o evento

que causou a morte destas células. O extrato UFMGCB 5533 mostrou ser capaz de

causar perda de adesão celular evidenciado pelo baixo número de células remanescentes

(Figura 21, G).

Estas análises foram apenas qualitativas, pelo inviável estudo detalhado das

populações celulares mortas e vivas, ensaios futuros utilizando este kit deverão ser

realizados associados a tecnologia de citometria de fluxo.

66



viabilidade LIVE/DEAD. Na coluna da esquerda, imagens de fluorescência e na coluna

da direita, imagens de DIC do mesmo campo visual.

67

UFMGCB 5533

Controle de

vida

Controle de

morte

UFMGCB 5478

LIVE/DEAD DIC

A

C

E

B

D

F

G H

68



viabilidade LIVE/DEAD.

69

Controle de vida

Controle de morte

UFMGCB 5460

LIVE/DEAD DIC

A

C

E

B

D

F

70

5 CONCLUSÕES

Clusia arrudae possui fungos endofíticos capazes de produzir extratos com

atividade antitumoral para adenocarcinoma de duodeno (HUTU), carcinoma de

colón humano (RKO) e atividade tóxica para a linhagem normal de fibroblasto

de pulmão (WI26VA4).

Os isolados agrupados no morfotipo 1 foram mais abundante, mas sua ação

tóxica pode estar relacionada ao órgão de coleta, número de morfotipo isolado

por órgão e a sensibilidade da célula testada.

A ação antitumoral dos fungos endofíticos de Clusia arrudae pode estar

relacionada à produção de metabólitos de inibição.

Usando técnicas de fluorescência foi possível observar que os extratos ativos de

Pleosporales sp. UFMGCB 5478 e UFMGCB 5502 mostraram ser capazes de

quebrar citoesqueleto para a linhagem HUTU; o extrato Pleosporales sp.

UFMGCB 5460 também exerceu quebra de citoesqueleto para RKO de maneira

menos evidente. Isso sugere que estes extratos podem apresentar, de maneira

semelhante, o que ocorre no mecanismo de ação do paclitaxel (Taxol®).

Novos ensaios deverão ser realizados para elucidar os mecanismos de morte

celular para as linhagens tumorais e vias de sinalização de genes ligados a

apoptose.

Os resultados obtidos neste trabalho abrem novas perspectivas para estudos mais

detalhados em relação a comunidade de fungos endofíticos associados a C.

arrudae.

71

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80

7 ANEXO

7.1 Tabela de classificação dos morfotipos isolados de Clusia arrudae

Tabela 13.

Morfotipo

Cor principal (frente)

Cor secundaria (frente)

Textura

Aspecto da borda

Cor do verso da cultura

1 Cinza esverdeada --------- Aveludado Rugoso Verde escuro

2 Branco Roxo Cotonoso Liso Branco

3 Laranja --------- Cotonoso Liso Amarelado

4 Branco --------- Cotonoso Liso Esbranquiçado

5 Branco Marrom Cotonoso Liso Amarelado

6 Branco Pontos pretos Aveludado Liso Branco com pontos pretos e laranja

7 Branco Preto (micélio) Cotonoso Liso Laranja com alguns pontos negros

8 Branco Vermelho Cotonoso Liso Vermelho

9 Branco Laranja Cotonoso Liso Laranja

10 Verde --------- Cotonoso Liso Preto

11 Branco Amarelado Cotonoso Rugoso Laranja

12 Branco Laranja Aveludado Liso Laranja

13 Branco Cinza Cotonoso Liso Branco

14 Marrom --------- Aveludado Liso Preto

15 Cinza Branco Aveludado Liso Laranja

16 Branco --------- Aveludado Rugoso Branco

17 Preto --------- Aveludado Liso Preto

18 Cinza --------- Cotonoso Liso Preto e branco

19 Rosa Branco Aveludado Liso Laranja

20 Branco --------- Aveludado Liso Branco

21 Verde --------- Aveludado Liso Preto

81

7.2 Fotos dos morfotipos isolados

Figura 19. Morfotipos isolados de Clusia arrudae. Morfotipos frente e verso.

Morfotipo 1

Morfotipo 2

Morfotipo 3

Frente Verso

Imagem não disponível

82


Morfotipo 4

Morfotipo 5

Morfotipo 6

Frente Verso

83


L

M

Morfotipo 7

Morfotipo 9

Morfotipo 8

Frente Verso

84


Morfotipo 11

Morfotipo 10

Morfotipo

12

Frente Verso

85


Morfotipo

13

Morfotipo

14

Morfotipo

15

Frente Verso

86


Morfotipo

18

Morfotipo

16

Morfotipo

17

Frente Verso

87


Morfotipo

19

Morfotipo

20

Morfotipo

21

Frente Verso

88

7.3 Gráficos dos ensaios de viabilidade dos isolados de Clusia arrudae utilizando três

linhagens celulares.

Figura 23. Ensaio de viabilidade para a célula RKO.


89



90



91


Figura 32.Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.

92

Figura 33. Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.


93



94

Figura 37 Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.

Figura 38 Ensaio de viabilidade para a célula HUTU.

95

Figura 39. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4.

Figura 40. Ensaio de viabilidade para a célula WI26VA4

96



97



98


Documents

Atividade citotóxica de fungos endofíticos associados à Clusia