Preparo, Identificao e

Armazenamento de amostras

Curso de Boas Prticas Laboratoriais

de amostras biolgicas

Silene Peres KeusseyanMaio/2011

Centrifugas

Poucos experimentos so realizados sem pelo menos uma passagem pela centrfuga

Usadas para separar partculas de uma soluo Em laboratrios de pesquisa biolgica: Em laboratrios de pesquisa biolgica: Sangue Clulas Separao de fases Organelas Isolamento de macromolculas (DNA, RNA, vrus,

protenas)

Centrifugao

Qual velocidade? rpm x rfc (g) ? Qual o tipo de separao desejado? Qual centrfuga usar? Qual centrfuga usar? Que temperatura? Qual o tubo apropriado? Qual o rotor? Como centrifugar

Fora centrfugaA fora centrfuga relativa (Rcf) cuja unidade o g gerada quando uma partcula ou conjunto de partculas sujeito a um movimento circular de acelerao

Rcf (g) = 1,12 x 10-5 x R x N2R = raio em centmetros R = raio em centmetros N = velocidade de centrifugao em rpm1 g equivalente acelerao da gravidade na superfcie da Terra

Fora centrfuga

Tipos de centrifugao Centrifugao diferencial (separao de fases)

Amostras centrifugadas a certa velocidade resultam em sobrenadante e plete (baseada no tamanho das partculas)Tamanho maior sedimenta mais rpidoEx: separao do sangue em elementos figurados e plasma / soro, Ex: separao do sangue em elementos figurados e plasma / soro,

Tipos de centrifugao Centrifugao por gradiente de densidade Centrifugao de escala zonal

Separao de partculas com diferentes densidadesEx: separao de mononucleares por Ficoll-HypaqueHemcias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077Hemcias:1095 densidade, mononucleares 1065 e Ficoll 1077Utiliza gradiente de meio viscoso

Sangue diludo

Ficoll-Hypaque

soroplaquetasMononucleares nuvem

eritrcitosgranulcitos

Ficoll-Hypaque

Centrfugas

Centrfuga de bancada Centrfuga de bancada refrigerada Centrfuga de alta velocidade Ultracentrfuga Microcentrfuga Citocentrfuga

Centrfuga de bancada Mltiplos fins: peletizar clulas e bactrias, sedimentao de soro,

urina, clulas e sangue Suporte oscilante: at 3.800g ou 6.000 rpm Capacidade:

normalmente 32 x 5mL ou 16 x 10mL Com ou sem tacometro Controle de tempo Sem freio

Fanem Excelsa Baby mod 206

Centrfuga de bancada refrigerada

Mltiplos fins: peletizar clulas e bactrias, sedimentao de soro, urina,clulas e sangue

ngulo fixo 2 tipos de rotores: 28 x 2 mL mx 14500rpm 17400rcf (g)28 x 2 mL mx 14500rpm 17400rcf (g)10 x 10 mL mx 13500rpm 16900rcf (g) Refrigerao : -8C at +40C Controle de acelerao/desacelerao (alta para peletizao, baixa para gradientes) Memria para programas Sensor tampa fechada Jouan MR 18.22

Centrfuga de alta velocidade refrigerada

Precipitaes de grandes volumes 2 tipos de rotor (R24A e R12A3) ngulo fixoR24A: 8 x 50mL mx 24000rpm 68900rcf (g)R12A3: 6 x 300mL mx 12000rpm 23800rcf (g) Refrigerao: -20C at +40C Controle de acelerao/desacelerao Controle de tempo Sensor tampa fechada

Hitachi Himac CR21

Ultracentrfuga Sedimentao de macromolculas, ribossomos, vrus... ngulo fixo ou suporte oscilante At 100.000rpm - 800000rcf (g) Tubos tamanhos variveis , Cho ou bancada Programvel Sempre refrigerada Cmara fechada vcuo (atrito com ar eleva temperatura

e diminui velocidade) Programvel

Sorvall WX

Microcentrfuga

Volumes pequenos, precipitao de clulas (baixa velocidade), retirada de debris, extraes com etanol e minifenol

ngulo fixo: mx 14000rpm ngulo fixo: mx 14000rpm Capacidade :tubos eppendorf 20 x 2mL Sensor tampa Sem refrigerao

Jouan A14

Citocentrfuga Produo de monocamada de clulas em rea definida Ex: lminas para deteco de Anca Cytofunnel sada nica ou dupla Programvel Capacidade at 12 cmaras Suporte oscilante:200 a 2000rpm Sensor tampa fechada + tampa de segurana

Cytospin 2 Shandon

Rotor

Tubos Seleo do tubo adequado: De acordo com o tipo de rotor Evitar vazamento ou perda da amostra (mecanismo de lacre) Assegura compatibilidade qumica (resistncia) Permite fcil recuperao da amostra (transparncia) Permite fcil recuperao da amostra (transparncia)

Como centrifugar

Conhea as limitaes de velocidade da centrfuga e dos rotores

Equilibre todos os tubos com seus suportes, tampas, proteo e pinos

Se usar um tubo para equilibrar, encha-o com material similar ao que vai centrifugar - gua = contrabalancear fora do meio

Utilize tubos, tampas e suportes apropriados (filme plstico)

Preencha os tubos at 1 ou 2 cm da borda Tubos ntegros ( sem rachaduras)

Como centrifugar

Suportes no utilizados podem desequilibrar a centrfuga Materiais infecciosos SOMENTE EM TUBO FECHADO Retire as amostras da centrfuga assim que terminar - Retire as amostras da centrfuga assim que terminar -

amostras paradas = plete disperso Centrfugas refrigeradas: feche a tampa no intervalo das

centrifugaes (evitar queda de temperatura e condensao) e deixe aberta quando terminar (secar)

Limpe com pano macio e hipoclorito/lcool 70% quando acabar de usar

Como equilibrar os tubos Tubos frente a frente = mesmo peso Microcentrfuga ajuste por volume, no por peso Alta velocidade ou ultra centrfuga pesar tubos em duplas

com balana de pratos Suportes de 4 tubos ou mais equilibrar dois conjuntos em

balana de pratos e coloc-los frente a frente Suportes no completos = equilibre na diagonal Amostras estreis equilibre o volume dos pares a olho,se necessrio ajustar suportes use lcool 70% fora do tubo Use o mesmo meio que sua amostra para ajustar tubos

sem par

Armazenamento de amostras

Tubos e caixas apropriados e identificados

Identificao Canetas permanentes e durex sobre o escrito para tubos e caixas NUNCA identifique amostras de pacientes pelas iniciais Ex: MCO = Maria Cristina Oliveira quantas ? Todo material coletado pela disciplina, pertence disciplina , no ao

ps-graduando ps-graduando Material devidamente identificado pode ser utilizado no futuro

001 LESaSPK 03/05/11

Caixa 1De 001 a xxx

LESa ou protocolo YY

NPS ano 2011

Banco de dados

data coleta N ENSAIO RG HSP Nome SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN DNAifi DNA EIA CH100/C2

001 LESaSPK 20/07/2004

data coleta N ENSAIO RG HSP Nome SEXO Idade Sledai ETNIA ACR FAN DNAifi DNA EIA CH100/C220/07/2004 1 1058511 Bruna Suzuki Donoso F 14 6 NC 4 PF 1:320 NEG 101 182U/>100%27/09/2004 2 1485459 Helen Micaela A Aguiar F 6 6 C 9 PF>1:320 NEG 94 161U/6717/08/2004 3 10068367 Fernando de Souza M 16 8 C 5 NEG NEG 50 15014/09/2004 4 10070001 Liliam Bruna O Magalhes F 17a 11m 8 C 6 PF 1:80 NEG 81 263/88%28/09/2004 5 1061544 Juliane B de Oliveira F 18a 11m 12 C 7 PF 1:80 NEG 173 234/>100%19/10/2004 6 10099595 Paula Ferreira F 16 13 C 6 PF1:640 NEG 74 1:640 1/40 505 239/>100%19/04/2005 9 10104632 Jaqueline R S Albuquerque F 11 8 C 5 PG >1:640 NEG 173 277/>100%

Entregue ao orientador ao final da tese

Conservao de amostras

Conservao de amostras Geladeira: material biolgico temporariamente, reagentes e

solues pelo prazo de validade dos mesmos Sangue total: utilizao imediata para ensaios

hemodinmicos e dosagens bioqumicas, geladeira por 1 semana* ou -20C somente para futura extrao de DNAsemana* ou -20C somente para futura extrao de DNA

Soro ou plasma: -20C por tempo indeterminado (selado) Clulas sempre em soluo de tamponamento para morte

celular -70C por tempo limitado, nitrognio lquido (-196C ) por

tempo indeterminado Tecidos ou orgos: -70C

Conservao de amostras

AlquotasPor que fazer?

Prevenir decomposio por congelamentos e Prevenir decomposio por congelamentos e descongelamentos repetidos

Prevenir contaminao por mltiplos usos Por convenincia fsica Para economizar tempo no preparo de uma soluo ou

tempo de descongelamento

Freezers -20 e -70C

S abra a porta quando necessrio e por pouco tempo Se precisar manipular alguns tubos, retire a caixa do freezer

e coloque no gelo enquanto procura Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem Todas caixas ou recipientes colocados no freezer devem

estar devidamente ROTULADOS e TAMPADOS Periodicamente descarte material que no for mais utilizar Mantenha um registro da localizao de seus materiais Respeite os espaos No altere localizao de material alheio Providencie descongelamento quando necessrio (s -20C)

UNIFESP

Disciplina de Reumatologia

Na Bancada - Manual de iniciao cientfica em laboratrio de pesquisas biomdicas, Kathy Baker, Editora Artmed, 2002

Boas Prticas de Laboratrio , Maria de Ftima da Costa Almeida, Editora Difuso, 2008

Centrifugation: Essential Data, by David Rickwood et al, 1994