1

Morte Celular Programada I

Profa. Luciana B. ChiariniSala: G2-04,

Instituto de Biofísica Carlos Chagas FilhoCentro de Ciências de Saúde

Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ.

Morte Celular Programada

• Ocorrência• Funções

• Apoptose: características morfológicas e bioquímicas.

- Mecanismos:1) Caspases:- Via extrínseca- Via intrínseca (mitocondrial)

2) Família Bcl-2:- proteínas pró e anti-apoptóticas- controle da expressão de genes da família Bcl-2- controle de proteínas da família Bcl-2 por fosforilação

First recognition that cell death is a normal component of animal development. Glücksmann, A. Cell death in normal vertebrate ontogeny. Biol. Rev. 29, 59-86 (1951).

19511951

‘Programmed cell death’ as a series of events thatculminate in the death of the cell.(1965, Lockshin R.A)

19651965

ANIANICHXCHX

Morte Morte Celular Celular

ProgramadaProgramada

Em 1966...Em 1966...

‘Programmed cell death’as a sequence of events based

on cellular metabolism that lead to cell destruction.

A morte celular programada é necessária para a formação de A morte celular programada é necessária para a formação de estruturas.estruturas.

Morte celular programadaMorte celular programada

InvaginaçãoInvaginação do epitélio ex: formação do tubo neural.do epitélio ex: formação do tubo neural.EvaginaçãoEvaginação do epitélio. Ex: formação da vesícula óptica.do epitélio. Ex: formação da vesícula óptica.

Fusão do epitélio: ex: formação de estruturas como o palatoFusão do epitélio: ex: formação de estruturas como o palato

2

A Morte Celular Programada é A Morte Celular Programada é necessária na destruição de necessária na destruição de

estruturas.estruturas.

Ex: humanos e camundongos: tecido mamário em machos.Ex: humanos e camundongos: tecido mamário em machos.

Controlar o número de célulasControlar o número de células

Células em Células em excesso são excesso são

geradas durante o geradas durante o desenvolvimento desenvolvimento

do sistema do sistema nervoso. Estas nervoso. Estas

células morrem por células morrem por morte celular morte celular programadaprogramada

Excesso de morte celular: doenças Excesso de morte celular: doenças neurodegenerativasneurodegenerativas

Alzheimer

Parkinson Huntington

Doenças de Prion

Inibição da morte celular programada e Inibição da morte celular programada e tumorigênesetumorigênese..

Morte celular Programada: para Morte celular Programada: para eliminação de eliminação de

células com lesão no DNA, células com lesão no DNA, células infectadas por vírus, ... células infectadas por vírus, ...

-- na eliminação na eliminação de célula Anormais de célula Anormais

(lesão no DNA, Infectadas,...)(lesão no DNA, Infectadas,...)

Morte Celular Programada

-- na formação de estruturasna formação de estruturas(dedos, coração, (dedos, coração, palato, retina, ...)palato, retina, ...)

-- na destruição de estruturasna destruição de estruturas( cauda do girino, ( cauda do girino,

Tecido mamário em machos,...)Tecido mamário em machos,...)

-- no controle do número deno controle do número deCélulas (sistema nervoso, Células (sistema nervoso,

CélsCéls. pigmentadas da retina,...). pigmentadas da retina,...)

Ocorrência de MCP durante o desenvolvimento e no adultoOcorrência de MCP durante o desenvolvimento e no adulto

necrose apoptoseNecrose x ApoptoseKerrKerr etet al 1972.al 1972. necrose apoptoseNecrose x ApoptoseKerrKerr etet al 1972.al 1972. necrose apoptoseNecrose

Características da Características da necrose:necrose:-- aumento do volume do aumento do volume do citoplasma;citoplasma;-- destruição de destruição de organelas;organelas;-- rompimento da rompimento da membmemb. . Plasmática com Plasmática com extravasamento do extravasamento do conteúdo intracelular;conteúdo intracelular;-- reação inflamatória.reação inflamatória.

3

Características da apoptose:

• Condensação do núcleo e do citoplasma;

• Formação de circunvoluções na membrana;

• As organelas intracelulares permanecem intactasaté quase o final do processo.

• A célula é fragmentada em corpos apoptóticos, não ocorrendo extravasamento do material citoplasmático;

• A célula morta, normalmente, é encontrada entre células vivas e é removida do tecido por células vizinhas ou por fagócitos especializados, pela exposição de sinais de reconhecimento em sua superfície.

Moléculas envolvidas no reconhecimento e fagocitose de células apoptóticas

Somersan e Bhardwaj, 2001

Fragmentação Fragmentação InternucleossomalInternucleossomal do DNA do DNA e condensação da cromatina e condensação da cromatina

Clivagem internucleossomal

do DNAem fragmentos

múltiplos de 180-200

pares de bases.TUNEL

A capacidade de detectar células A capacidade de detectar células apoptóticasapoptóticasimpulsionou os estudos sobre impulsionou os estudos sobre

este tipo de morte celular programada.este tipo de morte celular programada.

Morte Celular Programada não é sinônimo de apoptose.

Apoptose é um tipo de morte celular programada.

Mecanismos moleculares Mecanismos moleculares que controlam a que controlam a

APOPTOSEAPOPTOSE

4

Programa genético para indução de ApoptosePrograma genético para indução de Apoptose

Genes Genes PróPró--apoptóticosapoptóticos

ANIANICHXCHX

ActAct DD

APOPTOSEAPOPTOSE

Genes Genes AntiAnti--apoptóticosapoptóticos

ActAct DD

ANIANICHXCHX

CASPASES:

- cisteína proteases que clivam substratos específicos após resíduos de aspartato.

- a especificidade é determinada por uma sequência de 4aa e pela estrutura tridimensional da proteína alvo.

-Procaspases são divididas em duas classes: Caspases iniciadoras e efetoras

Alvos de Alvos de CaspasesCaspases::

Inibidor de DNAse degradado por caspases(Caspase-Activated DNAse)

Alvos de Alvos de CaspasesCaspases::Ativação de Caspases

EfetorasEfetoras

5

Ativação de CaspasesEfetoras

CaspasesCaspases iniciadoras (iniciadoras (caspasecaspase--9, 9, caspasecaspase--8):8):Ativação por dimerizaçãoAtivação por dimerização

Vias Extrínseca de ativação da Caspases

APOPTOSISAPOPTOSIS

caspase-8

caspase-3

RECEPTORDE MORTE

11

DeathInducingSignallingComplex

Ligante Ligante extracelular extracelular ((FasLFasL, TRAIL, , TRAIL, TNFTNF--alfaalfa).).

Receptor Receptor de Mortede Morte

Proteína Proteína adaptadoraadaptadora

Dímero de Dímero de CaspaseCaspase--88

Formação do complexo DISC com recrutamento e ativação Formação do complexo DISC com recrutamento e ativação de de caspasescaspases iniciadoras.iniciadoras.

Via Intrínseca, mitocondrial, de ativação da Caspases

caspase-3

APOPTOSISAPOPTOSIS

MITOCÔNDRIA

caspase-9CITOCROMO CCITOCROMO C

CITOCROMO C

SMAC/DIABLO

ENDONUCLEASE G

AIF OMI/HTRA2

MITOCÔNDRIA

MOMP (MOMP (mitochondrialmitochondrial outerouter membranemembrane permeabilizationpermeabilization))

6

ApafApaf--1, a 1, a HumanHuman ProteinProtein HomologousHomologous totoC. C. ElegansElegans CEDCED--4, 4, ParticipatesParticipates in in CytochromeCytochrome CC--DependentDependent ActivationActivation of of CaspaseCaspase--33

CellCell. Vol. 90 405. Vol. 90 405--413, August 8, 1997.413, August 8, 1997.

ZouZou, H. , H. etet alal

AApoptoticpoptotic PProtease rotease AActivatingctivating FFactoractor--11

CellCell Vol 91, 479Vol 91, 479--489, 489, NovemberNovember 14, 199714, 1997CytochromeCytochrome c c andand dATPdATP--DependentDependentFormationFormation of of ApafApaf--1/1/CaspaseCaspase--9 9 ComplexComplexInitiatesInitiates na na ApoptoticApoptotic Protease Protease CascadeCascadePengPeng, Li, Li

ApafApaf--33 waswas identifiedidentified as a as a membermember of of thethe caspasecaspaseFamilyFamily, , caspasecaspase--99..

E16,5

Caspase 3 ativada: rosaBisbenzimida (DNA): azul

BrainBrain HyperplasiaHyperplasia

E 15

Fenótipo semelhante Fenótipo semelhante de de knockoutknockout para para caspasecaspase--3,3,

caspasecaspase--9 ou 9 ou ApafApaf--1.1.

caspase-8

APOPTOSEAPOPTOSE

RECEPTORDE MORTE MITOCÔNDRIA

caspase-9

11

22

caspase-3

VIAS DE ATIVAÇÃO DE CASPASESVIAS DE ATIVAÇÃO DE CASPASES

FilmeFilme

Como ocorre aComo ocorre aliberação de liberação de citocromocitocromo C C

da mitocôndria?da mitocôndria?

Liberação de Liberação de citocromocitocromo C da C da mitocôndria é controlada mitocôndria é controlada

por proteínas da Família por proteínas da Família BclBcl--22

7

Classificação da família Bcl-2: de acordo com domínios conservados

Proteínas Proteínas PróPró--apoptóticasapoptóticas BaxBax e e BakBakformam oligômeros na membrana formam oligômeros na membrana mitocondrialmitocondrial externa externa

permitindo a saída de permitindo a saída de citocromocitocromo C C da mitocôndria para o citoplasmada mitocôndria para o citoplasma

BaxBax

Morte Morte celularcelular

BaxBax BclBcl--22

BaxBax

sobrevivênciasobrevivência

BclBcl--22

BaxBax

BclBcl--2 bloqueou condensação da cromatina induzida 2 bloqueou condensação da cromatina induzida por por tunicamicinatunicamicina

BclBcl--2 bloqueou condensação da cromatina induzida 2 bloqueou condensação da cromatina induzida por por tunicamicinatunicamicina

8

Família Bcl-2 é composta por membros PRO e ANTI-apoptóticos

(anti-apoptóticos)

BH3BH3--onlyonly proteinsproteins triggertrigger cytochromecytochrome c release, c release, butbut howhow??

ArchivesArchives of of BiochemistryBiochemistry andand BiophysicsBiophysics 462 (2007) 150462 (2007) 150--155.155.

GeorgGeorg HäckerHäcker, , ArnimArnim Weber.Weber.

?

Proteínas ‘Proteínas ‘BH3BH3--onlyonly’ são ’ são própró--apoptóticasapoptóticas

BclBcl--22

BaxBax

sobrevivênciasobrevivência

BadBadBadBad

BclBcl--22

BaxBax

Morte Morte celularcelular

Interações dos membros da Família Interações dos membros da Família BclBcl--2 regulam 2 regulam a sobrevivência e morte celulara sobrevivência e morte celular

9

MECANISMOS MOLECULARES DEMECANISMOS MOLECULARES DE

CONTROLE DA FAMÍLIA CONTROLE DA FAMÍLIA BclBcl--22

Proteínas da Família Bcl-2 moduladas por fosforilação

BadBad

PPBadBad

BadBad

BclBcl--XLXL

BaxBax

Morte Morte celularcelular

BadBad

1414--33--33

BclBcl--XLXL

BaxBax

PP

sobrevivênciasobrevivência

AKT/PKBAKT/PKBPKAPKA

Bim Morte celular

Sobrevivência

Foxo3aFoxo3a

BimBim

NeurotrofinasNeurotrofinas,,citocinascitocinas

-- Suporte Suporte TróficoTrófico ativa via da Pi3Kativa via da Pi3K--PDKPDK--PKB/AKTPKB/AKT-- PKB/AKT PKB/AKT fosforilafosforila Foxo3a e o mantém Foxo3a e o mantém inativadoinativado..-- Na ausência de suporte Na ausência de suporte tróficotrófico ocorre ocorre desfosforilaçãodesfosforilação do fator de do fator de transcrição Foxo3atranscrição Foxo3a-- Foxo3a ativa a transcrição de Foxo3a ativa a transcrição de BimBim ((própró--apoptóticaapoptótica).).

Sinais extracelulares regulam a expressão de genes da família Bcl-2

Ausência deAusência desuporte suporte tróficotrófico

PPFoxo3aFoxo3a

Ex: Bim pode ser fosforilada pela ERK

ERK ERK fosforilafosforila BimBim eeNão ocorre apoptoseNão ocorre apoptose

10

Proteínas da Família Proteínas da Família BclBcl--2 Moduladas por Clivagem2 Moduladas por ClivagemCrossCross--talktalk entre via entre via intrinsecaintrinseca e via e via extrinsecaextrinseca

p53p53

Bax

P53 +

Morte celular

PróPró--apoptóticosapoptóticos

Noxa

P53 +

Puma

P53 +

IAPIAP Inibidores de apoptoseInibidores de apoptose

IAPIAP Inibidores de apoptoseInibidores de apoptoseMORTE CELULAR PROGRAMADA MORTE CELULAR PROGRAMADA

ATIVADA PELA MITOCÔNDRIAATIVADA PELA MITOCÔNDRIA

11

CITOCROMO C

SMAC/DIABLO

ENDONUCLEASE G

AIF OMI/HTRA2

MITOCÔNDRIA

MOMP (MOMP (mitochondrialmitochondrial outerouter membranemembrane permeabilizationpermeabilization))

CITOCROMO C

SMAC/DIABLO

ENDONUCLEASE G

AIF OMI/HTRA2

MITOCÔNDRIA

MOMP (MOMP (mitochondrialmitochondrial outerouter membranemembrane permeabilizationpermeabilization))

Morte Celular Programada ativada pela Mitocôndria

CITOCROMO C

SMAC/DIABLO

ENDONUCLEASE G

AIF OMI/HTRA2

MITOCÔNDRIA

MOMP (MOMP (mitochondrialmitochondrial outerouter membranemembrane permeabilizationpermeabilization))

• O AIF leva à condensação do núcleo e

clivagem do DNA em fragmentos de

aproximadamente, 50 Kb. No entanto, o AIF não

cliva diretamente o DNA.

Atividade redox Atividade redox na mitocôndriana mitocôndria

pode serpode serantianti--apoptóticaapoptótica

CITOCROMO C

SMAC/DIABLO

ENDONUCLEASE G

AIF OMI/HTRA2

MITOCÔNDRIA

A endonuclease G degrada o DNA sem ocorrer ativação de CAD (caspase-activated DNAse).

12

caspase-8

APOPTOSEAPOPTOSE

RECEPTORDE MORTE MITOCÔNDRIA

caspase-9

11

22

Caspase-12

33

RETÍCULOENDOPLASMÁTICO

caspase-3

TUNEL

Ausência de caspase-12 bloqueia degeneração induzida por tunicamicina

Caspase 12 -/-Caspase 12 +/-

TunicamicinaTunicamicina, um indutor de estresse de retículo , um indutor de estresse de retículo Endoplasmático, induz morte celular programada nos rinsEndoplasmático, induz morte celular programada nos rins

Em humanos: Em humanos: caspasecaspase--44

(anti-apoptóticos)

Bax e Bak regulados por proteínas da família Bcl-2

- Bax e Bak também podem se localizar no RE.

Via do RE:

MEF

BAX -/- e BAK -/-

Não tem clivagem de procaspase-12Após tratamento com indutores de

estresse de RE

MEF

BAX -/- e BAK -/-+ Expressão de BAK

Restaura a ocorrência de clivagem de procaspase-12

após tratamento com indutores de estresse de RE

caspase-8

APOPTOSEAPOPTOSE

RECEPTORDE MORTE MITOCÔNDRIA

caspase-9

11

22

Caspase-12

33

RETÍCULOENDOPLASMÁTICO

caspase-3