Aula Prática Bacteriologia de peixes

BACTERIOLOGIA DE PEIXES

Identificação bacteriana com base em métodos bioquímicos, serológicos e moleculares

Cultura pura

Sub-culturas

IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

Existem vários métodos de identificação bacteriana:

Métodos bioquímicos:

Métodos clássicos;

Sistemas multiprova.

Métodos serológicos;

Métodos moleculares.

IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA TRADICIONAL

IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA

A utilização de métodos de identificação mais avançados, exige quase sempre uma identificação bioquímica prévia;

A identificação bacteriana clássica inicia-se com:

Reacção de Gram, baseada na estrutura da parede celular;

Morfologia e mobilidade;

Oxidase;

Metabolismo oxidativo/fermentativo;

Descarboxilação de aminoácidos;

IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA

São vários os testes bioquímicos utilizados na identificação bacteriana:

Catalase;

Produção de ácido e/ou gás a partir de vários açúcares;

Redução de nitratos;

Hidrólise da ureia (produção da enzima urease);

Utilização de citrato;

Hidrólise da gelatina;

Teste do Vermelho de metilo (MR);

Teste de Voges-Proskauer (VP);

IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA

Testes bioquímicos:

Produção de indol;

Produção de sulfureto de hidrogénio (H2S);

β - Galactosidase (ONPG);

Crescimento a várias concentrações de sal (NaCl);

Crescimento a várias temperaturas;

Sensibilidade a antibióticos.

TESTES BIOQUÍMICOS

GRAM

Teste de Gram:

Primeiro teste a ser efectuado quando se pretende identificar uma bactéria;

Permite dividir as bactérias em 2 grandes grupos: Gram positivas e Gram negativas;

Este teste baseia-se na constituição da parede bacteriana.

COMPOSIÇÃO DA PAREDE BACTERIANA

Constituição da parede de uma bactéria Gram-positiva

Constituição da parede de uma bactéria Gram-negativa

MÉTODOS

Pode ser realizado por dois métodos distintos:

Coloração de Gram tradicional;

Método de Ryu (1938), em que se utiliza uma solução de KOH a 3%.

COLORAÇÃO DE GRAM

Na coloração de Gram, realizam-se em 4 passos:

Cobrir o esfregaço com uma solução de violeta de cristal durante 30 segundos;

Lavar com água e aplicar uma solução de lugol durante 30 segundos;

Lavar com água e aplicar uma solução de acetona;

Lavar com água e aplicar uma solução de safranina durante 30 segundos e voltar a lavar com água.

COLORAÇÃO DE GRAM

Bactérias Gram positivas, possuem um peptidoglicano espesso:

Coram de azul/violeta, já que retêm o violeta de cristal;

Bactérias Gram negativas, possuem um peptidoglicano fino:

Coram de vermelho porque não são capazes de reter o violeta de cristal durante o processo de descoloração, corando com a safranina ;

Gram + Gram -

FORMA

As bactérias têm 3 formas características:

Cocos;

Bacilos;

Espiroquetas - forma de saca-rolhas.

MOBILIDADE

Quanto à mobilidade, as bactérias podem ser:

Móveis:

Devido aos flagelos, que são estruturas proteicas que se estendem para fora da membrana celular de algumas bactérias Gram positivas e negativas;

Imóveis:

Não confundir com os movimentos Brownianos.

CITOCROMO OXIDASE

As bactérias que contêm o sistema citrocromo, produzem uma enzima oxidativa que cataliza a oxidação do citocromo c;

Os organismos que possuem no seu sistema respiratório o citocromo c são oxidase positivos, dando uma cor azul/purpura com o reagente N, N, N’, N’-tetrametil-p-fenilenodiamina;

Os organismos que não possuem citocromo c, são oxidase negativas e não vão oxidar o reagente mantendo a cor original.

CATALASE

Durante a respiração aeróbia, as bactérias produzem peróxido de hidrogénio e em alguns casos ião superóxido:

Estes compostos são moléculas altamente reactivas;

A sua acumulação vai resultar na morte das bactérias, se estas não forem capazes de os degradar enzimaticamente.

A enzima catalase é a responsável pela degradação destes compostos;

CATALASE

A produção da enzima catalase pode ser determinada pela adição de peróxido de hidrogénio a uma cultura bacteriana:

As bactérias capazes de produzirem esta enzima, degradam rapidamente o peróxido de hidrogénio, levando à produção de água e oxigénio, o que corresponde a uma reacção positiva;

A ausência de bolhas de oxigénio corresponde a uma reacção negativa.

Reacção catalase positiva

METABOLISMO DA GLUCOSE

As bactérias podem utilizar duas vias metabólicas distintas para obterem energia a partir da glucose:

Respiração: na presença de oxigénio, as moléculas de glucose são completamente oxidadas em dióxido de carbono e água;

Fermentação: se o oxigénio não está presente, a glucose é convertida em ácido pirúvico e outros produtos terminais como etanol, ácido acético e butírico, levando a uma acidificação do meio onde se encontram.


Metodologia:

O/F Basal Medium, segundo Hugh & Leifson, suplementado com 1% de glucose;

Utilizam-se 2 tubos, um dos quais é coberto com parafina líquida estéril;

Incubação até 7 dias;

A mudança da cor do meio para amarelo é considerado um resultado positivo.


Bactérias de água salgada:

Suplementar o O/F Basal Medium com 1% de NaCl;

Utilizar ZOF (Lemos et al., 1985).

O/F segundo Hugh & Leifson

A B C

ZOF

A B C

A - Meio não inoculado; B - Reacção negativa; C - Reacção positiva.

A - Meio não inoculado; B - Reacção negativa; C - Reacção positiva.

PROVA DE INDOL

Baseia-se na capacidade das bactérias desdobrarem a molécula de triptofano levando à produção de indol;

O triptofano é um aminoácido essencial;

A sua oxidação origina ácido pirúvico e amoníaco:

As várias enzimas que intervêm neste processo recebem o nome colectivo de triptofanase.

A capacidade de hidrolisar o triptofano, com a produção de indol, não é uma característica de todas as bactérias.

PROVA DE INDOL

A triptofanase catalisa uma reacção de desaminação:

A hidrólise da molécula de triptofano ocorre apenas na sua cadeia lateral;

O anel aromático fica intacto sob a forma de indol.

A presença de indol é detectada pela adição do reagente de Kovacs, que é constituído por p-dimetilamino-benzaldeído, butanol e ácido clorídrico;

PROVA DE INDOL

O indol presente no meio é extraído para a camada de reagente de Kovacs pelo butanol acidificado e nesta, vai reagir com o p-dimetilamino-benzaldeído, adquirindo uma cor vermelho cereja.

Depois da adição do reagente de Kovacs: A - Camada amarela - bactéria indol negativa;

B - Camada vermelho cereja - bactéria indol positiva.

A B

SULFURETO DE HIDROGÉNIO (H2S)

Determinar se ocorre a libertação de sulfureto de hidrogénio a partir de aminoácidos que possuem enxofre na sua constituição;

Aminoácidos que contêm enxofre:

Metionina;

Cisteína.


Na presença de qualquer destes aminoácidos, o enxofre é reduzido por hidrogenação, levando à produção de sulfureto de hidrogénio sob a forma gasosa:

Gás incolor:

É necessário um indicador para a sua detecção;

São vários os compostos que podem funcionar como indicadores:

Ferro, sulfato ferroso, sulfato de amónio ferroso ou férrico, tiosulfato de sódio ou sulfito de bismuto.


Meio SIM, possui como indicadores o sulfato de amónia ferroso e o tiosulfato de sódio;

É necessário a presença dos dois indicadores, já que a detecção do sulfureto de hidrogénio só é possível ao fim de duas etapas:

A bactéria vai reagir com o tiosulfato de sódio, dando origem a sulfato ou sulfito de sódio e sulfureto de hidrogénio;

O sulfureto de hidrogénio vai reagir com o sulfato de amónia ferroso, produzindo um precipitado negro insolúvel, o sulfato de ferro.

Reacção de sulfureto de hidrogénio: A - Reacção positiva; B - Reacção negativa.

A B

UTILIZAÇÃO DO CITRATO

Pretende-se determinar se uma bactéria é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono;

O citrato é um intermediário do ciclo de Krebs;

As bactérias que possuem a enzima citrato-permease vão transportar o citrato para o interior da célula e transforma-lo em piruvato.

UTILIZAÇÃO DO CITRATO

O agar citrato de Simmons possui na sua constituição citrato de sódio como única fonte de carbono e fosfato de amónia como única fonte de azoto;

As bactérias capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono vão degradar o fosfato de amónia em amoníaco ou hidróxido de amónia, levando à alcalinização do meio (passa a azul).

CITRATO DE SIMMONS

A - Resultado negativo B - Resultado positivo

A B

Documents

Aula Prática Bacteriologia de peixes