Validao de metodologia na rea qumicaProcedimento prtico de
validao de mtodos analticos fsico-qumicosShirley Abrantes 14 a 16
de outubro de 2003V Encontro do Instituto Adolfo Lutz-Centro de
Convenes Rebouas-So Paulo/SP e. mail: [email protected]
Contedo 1- Planejamento de validao 2- Como proceder para
determinar as caractersticas de desempenho de mtodos 2.1-
Aplicabilidade 2.2- Faixa de trabalho 2.3- Linearidade 2.4- Faixa
linear de trabalho 2.5- Sensibilidade 2.6-
Homocedasticidade/heterocedasticidade 2.7- Limite de deteco 2.8-
Limite de determinao/quantificao 2.9- Exatido/recuperao 2.10-
Preciso 2.10.1- Repetitividade 2.10.2- Preciso intermediria 2.10.3-
Reprodutibilidade 2.11- Seletividade 2.12- Robustez
Validao
Um processo atravs do qual estudos de laboratrio so utilizados
para garantir que o mtodo em questo atenda s exigncias
desejadas
Tipo de mtodoFDA. International Conference on Validation of
Analytical Procedures: Definitions and Terminology; Availability.
Federal Register. V. 60 (40) p. 11260-11262, March, 1995.
Procedimento analticoExatido Preciso Repetitividade Preciso
Intermediria Especificidade LD LQ Linearidade Faixa
Identificao No
Teste de QuantitativoSim
Impureza Ensaio-limiteNo
Doseamento Sim
NoNo Sim No No No No
SimSim Sim No Sim Sim Sim
NoNo Sim Sim No No No
SimSim Sim No No Sim Sim
Parmetros de desempenho analtico a serem avaliados
Aplicabilidade Faixa de trabalho Linearidade
Homocedasticidade/heterocedasticidade Faixa linear de trabalho
Sensibilidade Limite de deteco Limite de determinao/quantificao
Preciso (repetitividade, preciso intermediria e reprodutibilidade)
Exatido/Taxa de recuperao Seletividade Robustez
Aplicabilidade Determinar qual ou quais matrizes e analito ou
analitos para que o mtodo analtico serviria, Identidade do analito,
incluindo especificao onde apropriado (p. ex: arsnio total), Faixa
de concentrao coberta pela validao (p. ex: 0 50 mg/kg), Uma
especificao da faixa de matrizes do material teste coberta pela
validao (p. ex: frutos do mar), Descrever o equipamento, reagentes,
procedimento (incluir variao permissvel p. ex: aquecer 1005C por
305min), procedimento de calibrao e qualidade e, precauo de
segurana especial necessria, A aplicao pretendida e sua incerteza
crtica (p. ex: anlise de alimento para monitoramento). A incerteza
padro u(c) do resultado c deveria ser < 0,1 x c.THOMPSON, M.,
ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p.
835-855, 2002.
Faixa de trabalho
A faixa de trabalho (FT) pode ser definida entre um dcimo a
dobro do limite de restrio (LR) 0,1 . LR FT 2 . LRFRAUNHOFER
INSTITUT FR LEBENSMITTELTECHNOLOGIE UND VERPACKUNG Guide for
testing of analytical method for the determination of monomers in
foods simulants and polymers. Mnchen. 3p. M&T Project
Development of methods of analysis. Printed papers.
Linearidade a habilidade das respostas analticas serem
diretamente proporcionais s concentraes das substncias em estudo.
Ser verificada analisando em triplicata solues padro com 6 ou mais
concentraes diferentes, dispostas em um intervalo estabelecido pela
faixa de trabalho. Os valores encontrados para confeco da curva
analtica tm que estar livres de valores aberrantes e os mesmos
devem apresentar homocedasticidade.
Clculo do ponto duvidoso na curva analtica
Pode-se verificar se algum ponto de concentrao desvia da
linearidade da curva por meio do clculo dos resduos entre os
valores medidos e os valores calculados a partir da equao da curva.
Calcular um ponto duvidoso de uma curva analtica pelo valor de t.
tcalculado= resduo sr/nOnde:
resduo = |xmedido - xcalculado| sr =desvio padro dos resduos n =
nmero de pontos da curva
sr = (xmedido xcalculado)2 n-1
Procedimento para determinao da linearidade Como o limite de
restrio estabelecido pela Resoluo 105 de 19-05-1999 da ANVISA/MS de
0,25% m/m de estireno na massa plstica, a faixa de trabalho de
0,025 a 0,50% m/m0,025 FT 0,50% m/m
Procedimento para determinao da linearidade Considerando a massa
tomada da amostra de 300mg, a faixa de concentrao na alquota
analisada seria de 7,5 a 150mg/L. Por praticidade, fez-se a faixa
de 10 a 150mg/L
Preparo da soluo me
Pesou-se 0,1066g de estireno com 99% de pureza. Diluiu-se esta
massa em balo volumtrico de 100mL com n-heptano. Considerando a
pureza do estireno 99%, o procedimento resultou em soluo com
concentrao de 1,055mg/mL
Preparo da solues de trabalho
Solues de trabalho Com pipetas volumtricas, tomou-se alquotas da
soluo me para preparo das solues de trabalho. Todas as alquotas
foram avolumadas a 100mL com n-heptano
Volumes tomados da soluo me e concentrao das solues de
trabalho
Volume Tomado (mL)
0
1
2
5
10
Concentrao (mg/L)
0,00 10,55
21,10
52,75
105,5
Preparo da curva analticaOs pontos de concentrao das solues de
trabalho foram analisados no cromatgrafo. As reas dos picos
correspondentes ao tempo de reteno do estireno em relao aos pontos
de concentrao foram medidos e, uma curva analtica foi construda a
partir das reas com seus correspondentes pontos de concentrao das
solues de trabalho
Determinao da estabilidade da soluo me
De semana em semana retiramos uma alquota de 5mL da soluo me de
estireno em heptano e avolumamos com heptano para 100mL em balo
volumtrico. Tomamos uma alquota desta soluo e injetamos em
cromatgrafo a gs. Observamos se o resultado da concentrao obtida
semelhante ao obtido inicialmente na confeco da curva analtica
Homocedasticidade/heterocedasticidade
a independncia ou dependncia da varincia das respostas com as
concentraes do analito
Determinao da homocedasticidade
Analisou-se em triplicata todos os pontos da curva analtica
(10,55 105,5 mg/L), calculando em seguida as varincias das
respostas de cada ponto de concentrao. Dividiu-se a maior varincia
(S2) pelo somatrio das varincias ( S2). O valor obtido comparado
com o valor tabelado Varincia S2 = 1/n-1 [xi X(mdio)]2
HomocedasticidadeSe o valor calculado for menor que o tabelado
de Cochran, o mtodo homocedstico. Portanto, a curva analtica pode
ser construda pelo mtodo dos mnimos quadrados normaisC cal = S2
maior/ S2
Determinao da faixa de trabalho Faixa de trabalho a faixa de
concentrao do analito na amostra que apresenta resposta linear com
a concentrao
A faixa de trabalho(conc. na alquota de anlise 10,55105,5 mg/L)
possibilitou detectar o estireno dentro dos limites de interesse e
a resposta do detector do cromatgrafo conservou-se linear, que foi
de 0,035 a 0,35 % m/m concentrao na amostra
Sensibilidade Descreve quanto a resposta varia com a variao da
concentrao do analito. Pode ser expressa como a inclinao da curva
analtica (coeficiente angular), expresso pala equao S=dx/dc, onde:
dx=variao da resposta, dc=variao da concentrao medida ao mesmo
tempo que testa a linearidade Depende da natureza do analito e da
tcnica de detecoBRUCE, P. , MINKKINEN, P. , RIEKKOLA, M. L.
Practical Method Validation: Validation sufficient for an Analysis
Method. Mikrochimica ACTA. V. 128, p. 93-106, 1998.
Limite de deteco LD
a mais baixa concentrao da substncia em exame que pode ser
detectada com um certo limite de confiabilidade utilizando um
determinado procedimento experimental
Determinao do limite de deteco O limite de deteco foi
determinado analisando 6 vezes a menor concentrao da curva
analtica, e o desvio padro foi multiplicado por 3, este limite
referente a alquota de anlise. Tem que se considerar o procedimento
do mtodo para se determinar o limite de deteco do mtodo. Desvio
padro: igual a raiz quadrada positiva da varincia e tem a mesma
dimensao da mdia aritmtica S = 1/(n-1)[xi X(mdio)]2THOMPSON, M.,
ELLION, S. R. , WOOD, R. Pure and Applied Chemistry. V. 74, p.
835-855, 2002.
Limite de determinao/quantificao LQ
a mais baixa concentrao da substncia em exame que pode ser
quantificada com certo limite de confiabilidade utilizando um
determinado procedimento experimental
Limite de quantificao LQ
Geralmente o mais baixo ponto da curva analtica no deve ser
determinado por extrapolao
UKAS PUBLICATION ref: LAB 27, United Kingdom Accreditation
Service. www.ukas.com
Preciso Repetitividade Preciso intermediria
Reprodutibilidade
Repetitividade o grau de concordncia entre resultados de anlises
individuais quando o procedimento aplicado repetidamente mltiplas
anlises de uma mesma amostra homognea, em idnticas condies de
teste.
Determinao da repetividade Um mnimo de 9 determinaes cobrindo a
faixa especfica para o procedimento (p. ex: 3 concentraes/3
replicatas cada, menor, intermediria e maior); ou Um mnimo de 6
determinaes a 100 % de concentrao teste Calcular o desvio padro, o
desvio padro relativo ou coeficiente de variao ou a
varincia.GUIDANCE FOR INDUSTRY Q2B. Validation of Analytical
Procedures: Methodology U.S. Department of Health and Human
Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation
and Research, Center for Biologics evaluation and Research,
November 1996 ICH.
Preciso intermediria Expressa as variaes dentro de um
laboratrio, como: dias diferentes, analistas diferentes, mtodos
diferentes, ou equipamentos diferentes, sobre uma mesma amostra ou
padro, definindo exatamente quais as condies a variar (uma ou
mais)
Determinao da preciso intermediria Os resultados dos dados
obtidos em dias alternados, por um mesmo analista, usando um mesmo
equipamento, mesmas concentraes e mesma metodologia, devero ser o
mesmo: pode ser comprovado por teste t, onde a hiptese a ser
afirmada que o resultado obtido em diferentes dias so
significativamente iguais. Hiptese a ser testada: Ho: 1= 2 Teste t
T=( - xmed)/s.(n)-1 onde: =valor de referncia, xmed=mdia dos
valores dos resultados de anlise, n=nmero de resultados de anlise e
s=desvio padro O valor crtico (tabelado) varia em funo do grau de
liberdade () e do nvel de confiana, sendo que. = n 1 Se: ttab >
tcalcHo aceita ttab< tcalcHo rejeitada
Reprodutibilidade o grau de concordncia entre os resultados das
medies de um mesmo mesurando, efetuadas sob condies variadas de
medio(VIM). A reprodutibilidade no um componente de validao de
mtodo executado por um nico laboratrio, obtido em relao aos dados
de validao obtidos atravs de comparao interlaboratorial (INMETRO,
2002).INMETRO. Orientaes sobre validao de mtodos de ensaio qumicos.
DOQ-CGCRE-008, reviso:00-outubro 2002.VIM Vocabulrio Internacional
de termos Fundamentais e Gerais de Metrologia, 1995.
Exatido
a concordncia dos valores experimentais com o valor verdadeiro
X
Taxa de Recuperao a relao entre o resultado experimental obtido
depois da anlise de uma amostra, fortificada com uma quantidade
conhecida do analito, e o valor terico desta quantidade
fortificada
Determinao da taxa de recuperao
A taxa de recuperao ser calculada pela diviso entre o resultado
da concentrao mdia experimental e a concentrao terica multiplicada
por 100. Taxa recuperao=[conc. Exp./conc. Teor] x 100.
Seletividade a interferncia por outra substncia, que no seja o
analito de interesse, na medio pelo detector
Determinao da seletividade Analisa-se trs vezes a soluo de
estireno em heptano na concentrao de (10,55mg/L) e depois
analisa-se trs vezes uma amostra que apresente na alquota de anlise
uma concentrao prxima a concentrao de (10,55mg/L) e depois
calcula-se o teste de igualdade de duas mdias de amostras
independentes (t)
Determinao da seletividadeO clculo do valor de t quando se
comparam mdias de duas amostras diferentes dado pela expresso
t=
x1 - x 2 Sa 1 / n1 + 1 / n2
Determinao da seletividadeSa a estimativa do desvio padro
agregado, calculado a partir das estimativas dos desviospadres das
duas amostras
Sa
=
(n1 -1)S + (n2 -1)S n1 + n2 - 22 1
2 2
Robustez
a capacidade de um mtodo de no ser afetado por uma pequena e
deliberada modificao em seus parmetros
Determinao da robustez Resultados das amostras a 48 e 120 hDEHA
% m/m 48 120 h DEHP % m/m 48 120 h
0,286 0,306 0,270 0,325 0,276 0,329
9,43 9,13 9,28
10,12 10,95 10,99
Determinao da robustez pelo teste t Resultados da mesma amostra
nos tempos de contato de 48 e 120 horas
Plastificantes Desvio padro das diferenas (%m/m) Teste de
igualdade de duas mdias (%m/m) T tabelado
DEHA 0,020 3,760 4,303
DEHP 0,624 3,910 4,303
