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Universidade Tecnológica Federal do Paraná Departamento Acadêmico de Química e Biologia Disciplina: Biologia Celular e Microbiologia Cultivo e Controle de Microrganismos Profa. Lucia Regina R. Martins novembro/2009

Aula5 Cultivo Controle Microrganismos

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Universidade Tecnolgica Federal do Paran Departamento Acadmico de Qumica e Biologia

Disciplina: Biologia Celular e Microbiologia

Cultivo e Controle de Microrganismos

Profa. Lucia Regina R. Martins

novembro/2009

Cultivo de Microrganismosna natureza e em materiais infecciosos os microrganismos existem como culturas mistas

colnia: visvel crescimento a partir de 1 clula vegetativa, 1 esporo ou grupo de microrganismos

Meios de cultura: material nutriente apropriado para o cultivo de microrganismos pode ser preparado em laboratrio ou comercial composio depende das necessidades nutricionais/tipo de microrganismo

Material inoculado no meio de cultura (inculo)

Incubao em estufa microbiolgica

Multiplicao celular

clulas individuais formam grande nmero de clulas = colnia

cultura pura = colnia formada a partir de ancestral nico, caracterstica homognea caracterstica macroscpica da colnia = tpica da espcie

Meios de culturaCritrios: nutrientes necessrios gua ajuste de pH presena de oxignio temperatura tima

-Inicialmente deve ser estril: proliferao apenas de microrganismos do inculo

gar:polissacardeo complexo de algas marinhas, agente solidificante para os meios de cultura no-degradvel pela maioria de microrganismos liquefaz a 100oC, solidifica a 40oC tubo (gar inclinado ou em coluna) e placas de Petri

Meios de culturaI Meios Quimicamente DefinidosComposio definida; Fonte de energia, fatores orgnicos e inorgnicos de crescimento - Organismos exigentes = fastidiosos (ex.: Neisseria gonorrhoeae, Lactobacillus)

II Meios Complexos- nutrientes: extratos de carne, plantas, leveduras, produtos de digesto protica (peptonas) - pequenas variaes na composio qumica exata - usado de forma geral para bactrias heterotrficas e fungos - pode ser: caldo nutriente ou gar nutriente

Meios de cultura e Mtodos para AnaerbiosMeios de cultivo = Redutores: reagentes que retiram oxignio dissolvido (tioglicolato de sdio) recipientes fechados aquecimento dos tubos antes da utilizao (elimina O2 dissolvido) em Placa de Petri: sistema fechado (jarras) retirada de oxignio: reaes qumicas (NaHCO3 + NaBH4) enzima (oxirase) cmara com gs inerte

Tcnicas Especiais de Cultivo- Cultura de clulas: organismos intracelulares obrigatrios (riqutsias e clamdias) - em organismos vivos (ex.: Mycobacterium leprae) - capnoflicos (estufas de CO2 ou jarra com vela, reagentes em embalagens): -Ex.: algumas bactrias patognicas do TGI (Campylobacter)

Meios de cultura1. Seletivo 2. Diferencial utilizados para a determinao da presena de microrganismos especficos

1. MEIOS SELETIVOS- Favorece o crescimento apenas do microrganismo de interesse - ex.: gar sulfeto de bismuto isolamento de Salmonella typhi em fezes gar verde brilhante (corante que inibe Gram-positivas, seletivo para Salmonella) gar Sabouraud dextrose pH 5,6: favorece fungos e inibe bactrias

2. MEIOS DIFERENCIAIS- permite identificao de colnias de bactrias de interesse, em meio a outras espcies - quando cultura pura: reaes caractersticas - ex.: gar sangue identifica bactrias capazes de hemlise Streptococcus so classificados como alfa-hemolticos (halo esverdeado de metemoglobina), beta-hemolticos (halo claro de hemlise ao redor da colnia), no-hemolticos (sem alterao)

beta-hemlise

alfa-hemlise

3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIASfavorece o isolamento e reconhecimento de espcies de interesse requer conhecimento de peculiaridades de cultivo, caractersticas bioqumicas, etc. Staphylococcus aureus tolerncia a NaCl, fermenta manitol produzindo cido Meio gar Sal Manitol 7,5% NaCl = seletivo indicador de pH = diferencial

3. MEIOS SELETIVOS + DIFERENCIAS gar MacConkey:- contm sais biliares e cristal violeta: inibe Gram-positivas (seletivo) - lactose: diferencia Gram-negativas fermentadoras (rosa) de no-fermentadoras (incolor) - caracteriza salmonellas patognicas

Meios de enriquecimentoestimula o crescimento da bactria de interesse (esto em menor quantidade) normalmente lquido pode ser considerado seletivo transferncia de inculo estgio de crescimento transferncia de inculo ex.: amostras de solo e fezes (caldo enriquecido com fenol) caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens

Obteno de culturas puras:utilizada na obteno de colnias individualizadas caractersticas homogneas permite a caracterizao e identificao mtodo de semeadura fundamental

Mtodo de esgotamento por estrias superficiaisala de inoculao estril e meio nutriente slido padro de espalhamento do inculo aps incubao = colnias isoladas transfere para meio nutriente = cultura pura

Conservao de culturas purascurto perodo (dias) = refrigerador (4 a 10oC) longo perodo: congelamento rpido em lquido (freezer -50 a -95oC) liofilizao (ampolas acondicionadas em temperatura ambiente) retomam a viabilidade pela adio de meio lquido nutriente colees de culturas puras (padro) : American Type Culture Collection (ATCC)

Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianasPode ser representado por grficos de crescimento X tempo nmero de microrganismos: mtodos diretos (contagem) mtodos indiretos (medida da atividade metablica)

Tipos de diviso celular bacteriana:- fisso binria - brotamento - conidisporos (Actinomicetes) - fragmentao de filamentos

Acompanhamento do crescimento de culturas bacterianasTempo de Gerao- o tempo necessrio para uma clula se dividir - nmero de bactrias dobra a cada gerao - nmero de clulas = 2n (n =nmero de geraes) - tempo de gerao mdio = 1 3 horas - nmeros muito grandes usa-se escala logartmica

Escala logartimica X aritmtica para crescimento de populaes bacteriana

Fases do Crescimentodemonstrado pela Curva de Crescimento bacteriano experimentalmente: contagem da populao em intervalos regulares de tempo inculo = pequeno nmero de clulas meio lquido acompanhamento

Fases do Crescimento1. Fase Lag- pouca diviso celular estado de latncia - durao: horas a dias - metabolismo celular ativo enzimas e protenas

2. Fase Log (crescimento exponencial)- diviso celular ativa e intensa - tempo de gerao constante - maior atividade metablica - grande sensibilidade a alteraes ambientais

Fases do Crescimento3. Fase estacionria- velocidade de diviso celular decai - nmero de clulas mortas = nmero de clulas novas - atividade metablica decresce - fatores que contribuem para seu incio: escassez de nutrientes, acmulo de metablitos, alteraes de pH - fermentadores industriais: substituem o meio de crescimento constantemente = fase Log indefinida

4. Fase de declnio (morte celular) nmero de cls mortas > > nmero de cls novas populao se reduz a uma frao mnima ou completamente exterminada

Quantificao do Crescimento Microbianoutiliza amostras pequenas (~ 1 ml de meio lquido, 1 g de meio slido) diluies seriadas de alquotas de material (material concentrado) tamanho total da populao microbiana = extrapolaes matemticas

Mtodos1. Quantificao Direta a) Contagem em Placa b) Mtodo do nmero mais provvel c) Contagem ao microscpio

2. Quantificao Indireta

a) Turbidimetria b) Peso seco c) Atividade metablica

1. Quantificao Direta

a) Contagem em Placa b) Mtodo do nmero mais provvel c) Contagem ao microscpio

Quantificao Direta do Crescimento Microbiano1. Contagem em placa- contagem do nmero de colnias (unidades formadoras de colnias - UFC) - sujeito a erros: considera cada colnia proveniente de 1 bactria - vantagem: quantifica clulas viveis - desvantagem: tempo de espera (~24h) produo de alimentos perecveis - padronizao (FDA): somente placas com 25 250 colnias diluio seriada da amostra

1. Contagem em placa diluio seriada

Quantificao do Direta Crescimento Microbiano1. Contagem em placa tcnicas para semeadura pour plate (em profundidade) espalhamento em placapour plate (em profundidade)gar fundido a 50oC

- volume do inculo: 0,1 - 1,0 mL; - desvantagens: bactrias sensveis ao calor; aspecto das colnias pode auxiliar no diagnstico

1. Contagem em placa tcnicas para semeadura espalhamento em placa

- volume do inculo: 0,1 mL - placa com gar solidificado - espalhamento homogneo com ala de vidro - crescimento apenas superficial

1. Contagem em placa tcnicas para semeaduraquando a amostra contm poucas bactrias: mtodo de filtrao Ex.: gua - bactrias so concentradas na superfcie de membranas filtrantes especiais - volume amostra: ~100 mL - filtro transferido para Placa de Petri contendo meio nutriente lquido: formao de colnias na superfcie da membrana

1. Quantificao Direta

a) Contagem em Placa b) Mtodo do nmero mais provvel c) Contagem ao microscpio

Quantificao Direta do Crescimento Microbiano2. Mtodo do Nmero Mais Provvel (MNP)- mtodo estatstico (95% de probabilidade) - princpio: no bactrias = no diluies para crescimento negativo - aplicao: bactrias que no crescem em meio slido; uso de meio lquido diferencial

1. Quantificao Direta

a) Contagem em Placa b) Mtodo do nmero mais provvel c) Contagem ao microscpio

Quantificao Direta do Crescimento Microbiano3. Contagem direta ao Microscpio- utiliza lmina especial (Petroff-Hausser) 25 quadrados grande quadriculados - pequeno volume de amotra: preenchimento da cmara (pode utilizar corantes) - contagem em quadrados grandes e mdia - volume no quadrado grande = 1/1,25 X 106 mL - no de bactrias = no contado X 1,25 X 106 (para 1mL de amostra)

desvantagens: bactrias mveis cls. mortas necessrio grande no vantagens: no precisa incubao resultado imediato

Quantificao do Crescimento Microbiano2. Quantificao Indireta a) Turbidimetria b) Peso seco (bactrias/fungos filamentosos) filtrao c) Atividade metablica determinao do metablito

Aplicao: pesquisa e indstria

a) Turbidimetria- proliferao de bactrias em meio lquido = densidade clulas = turbidez - utiliza espectrofotmetro (colormetro): quantidade de bactrias inversamente proporcional quantidade de luz que atinge o detector - pode ser usado para grficos de crescimento bacteriano X tempo (associado contagem) - desvantagem: insensvel a pequena quantidade de bactrias.

Controle do Crescimento MicrobianoMedidas utilizadas para prevenir contaminaes que podem ter consequncias danosas sade...

Voc sabe o que ....Esterilizao? Desinfeco? Degerminao? Sanitizao? Anti-sepsia?

... alguns conceitos:1. Esterilizao:destruio de todas as formas de vida microbiana (vegetativa e esporos) mtodos: aquecimento, filtrao (lquidos e gases), gases esterilizantes (xido de etileno)

2. Esterilizao comercial:no completa; utiliza tcnica para destruir endosporos de Clostridium botulinum (calor) esporos de bactrias termoflicas permanecem

3. Desinfeco:- destri formas vegetativas de microrganismos patognicos em superfcies ou substncias inertes - no atinge esporos - mtodos: substncias qumicas (desinfetante), radiao UV, gua fervente ou vapor

4. Anti-sepsia- destruio de formas vegetativas de microrganismos em tecido vivo - substncias qumicas: anti-sptico Sepse = contaminao bacteriana; Assptico = objeto/rea livre de patgenos

... alguns conceitos:5. Degerminao- remoo mecnica de microrganismos em uma rea delimitada - ex.: limpeza de pele com lcool antes da aplicao de injeo

6. Sanitizao- processo utilizado para reduzir a contagem microbiana a nveis seguros - minimiza chances de transmisso de doenas - ex.: lavagem de talheres, copos e pratos em gua quente ou seguido de aplicao de desinfetante qumico

PRODUTOSBiocida/germicida: substncia que leva destruio de microrganismos fungicida, bactericida, viricida Bacteriosttico, fungisttico: substncia que inibe o crescimento de bactrias

Taxa de Morte Bacteriana- a percentagem de bactrias que morrem por unidade de tempo normalmente: tratamento com substncias antimicrobianas taxa de morte constante

Fatores de Influenciam a efetividade de antimicrobianos:1. Carga microbiana ( no bactrias = tempo) 2. Ambiente: presena de matria orgnica, temperatura, pH 3. Tempo de exposio 4. Caractersticas microbianas

Mtodos de Controle Microbiano1. Fsicos Calor (mido, seco, pasteurizao) Filtrao Baixas temperaturas Alta presso Dessecao Presso osmtica Radiao

2. Qumicos desinfetantes e anti-spticos halognios lcoois, fenis agentes tensoativos compostos quaternrios de amnio conservantes de alimentos antibiticos esterilizantes gasosos agentes oxidantes aldedos

Mtodos de Controle Microbiano1. Fsicos Calor (mido, seco, pasteurizao) Ao: desnaturao de protenas (enzimas) aplicao: considerar degradao de outras substncias/danos a materiais Resistncia ao calor tem grande variabilidade parmetros para esterilizao: Ponto de Morte Trmica (PMT): menor ToC que destri todos em 10 minutos (susp.lq) Tempo de Morte Trmica (TMT): menor tempo necessrio para a destruio de todos em uma certa ToC (cult. Lq.) Tempo de Reduo Decimal (TRD): tempo necessrio para destruio de 90% das bactrias em uma certa ToC

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Calor mido- Fervura: destri formas vegetativas de bactrias patognicas, fungos (e esporos) e grande parte de vrus em 10 minutos alguns vrus (hepatite) e endosporos resistem por mais tempo... - Autoclave: maior temperatura devido presso (esterilizao efetiva)

1 atm = 14,7 lb/pol2

destri todos os microrganismos e endosporos em 15 min danifica alguns materiais

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Autoclavetempo de esterilizao depende do volume, permeabilidade e contedo do material

Marcadores de esterilizao: etiquetas, marcadores de temperatura e tempo, uso de endosporos.

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Calor mido- Pasteurizao:-objetivo: eliminar microrganismos patognicos; utilizado em alimentos perecveis (leite, sorvete, iogurte, cerveja) - tempo de pasteurizao diferente Pasteurizao do leite: (teste de fosfatase) - clssica: 63oC por 30 min - alta temperatura e tempo curto (HTST): 72oC por 15 s (serpentina) Esterilizao do leite: (armazenagem posterior sem refrigerao) -Tratamento de temperatura ultra-elevada (UHT) - cmara de vapor: de 74oC a 140oC 3 s resfriamento rpido

Tratamentos equivalentes: ToC tempo = mesma eficincia

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Calor secoDestruio por oxidao (combusto direta ou carbonizao lenta) Tipos: - chama direta (bico de Bunsen) - incinerao - em ar quente (estufa): 170oC por 2h

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Filtrao:- Membranas especiais (porosidade): 0,45 m; 0,22 m; 0,01m - uso em materiais sensveis ao calor: meios de cultura, vacinas, enzimas, etc. Para o ar: filtros HEPA (0,3 m)

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Baixas Temperaturas:- Refrigerao comum = bacteriostticos (0 7oC) Listera monocytogenes: bastonete gram-positivo; infecta adultos (assintomtico ou meningite letalidade 50%); transmisso pelas fezes; em gestantes (assintomtico na me, meningite aps nascimento, natimorto)

- Congelamento rpido: formas latentes (ainda viveis) - Congelamento lento: mais letal ciclos congelamento-descongelamento so usados

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Dessecao:-liofilizao: microrganismos permanecem viveis, porm latentes na ausncia de gua - aplicao: preservao de espcies microbianas em laboratrio, conservao de alimentos (caf) - resistncia microbiana dessecao varivel ex.: Mycobacterium tuberculosis (meses) Neisseria gonorrhoeae (1 hora) endosporos: indefinido vrus so resistentes

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Radiao:os efeitos sobre os microrganismos dependem: - comprimento de onda - intensidade - durao da exposio Radiaes esterilizantes: - ionizante - no-ionizante

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Radiao ionizante raios gama, raios X, feixes de eltrons de alta energia comprimento de onda menor que 1nm Poder de penetrao: raios gama (elementos radioativos) > raios X > feixes de eltrons Principal efeito da radiao = ionizao da gua radicais hidroxila reativos e txicos reao com componentes celulares = morte microbiana Tempo de esterilizao: feixes de eltrons (segundos de exposio) > raios gama (horas) Aplicaes: Conservao de alimentos (carnes, vegetais, etc.) Produtos farmacuticos, materiais descartveis de uso odontolgico/mdico: -seringas, luvas, cateteres, suturas...

Mtodos Fsicos de Controle Microbiano

Radiao no-ionizante comprimento de onda acima de 1nm: luz UV mecanismo: danifica estrutura do DNA, inibem a replicao comprimento de onda mais eficaz 260 nm Aplicao: lmpadas germicidas (microrganismos do ar): -Salas cirrgicas, enfermarias, cmaras microbiolgicas desinfeco de produtos mdicos Desvantagem: baixo poder de penetrao: a exposio deve ser direta leso retina humana; exposio prolongada = queimaduras e cncer de pele. Efeito antimicrobiano da luz solar (> 280nm): leva formao de oxignio livre no citoplasma (txico) pigmentos = proteo Microondas: no apresentam efeito direto sobre microrganismos (efeito indireto, pelo calor)