Universidade Federal de SergipeCentro de Ciências Biológicas e da Saúde

Departamento de Fisiologia

Manual das aulas práticas de Bioquímica

Professor: Paulo de Tarso Gonçalves Leopoldo Roberta P. Miranda Fernandes

São Cristóvão,2009

Sumário

1. Medidas de segurança, vidraria de laboratório e normas para elaboração

de relatório.

2. Uso de pipetas e medidas de volume utilizadas em bioquímica

3. Preparo de soluções

4. A química de pH e tampões

5. Espectrofotometria

6. Determinação da concentração de proteínas pelo método do Bradford

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Introdução ao laboratório de Bioquímica

Objetivos:

o Desenvolver habilidades para manipulação de reagentes e equipamentos utilizados em Bioquímica;

o Reconhecer por meio das reações efetuadas algumas das propriedades químicas das biomoléculas;

o Ler intruções, executá-las e interpretar resultados experimentais.

Execução dos experimentos

Antes das aulas práticas será feita uma exposição do assunto. Pede-se que o estudante leia e estude o manual das aulas práticas em casa, toda semana antes de vir para a aula prática. Caso contrário executará os experimentos mecanicamente, sem entende-los acarretando um baixo aproveitamento na aula prática.

o Anote os dados experimentais num caderno protocolo.o Anote dados como temperatura em que o experimento foi executado,

pH das soluções, assim como concentração e volumes utilizados.o Anote alterações de cor, formação de precipitados e tempo necessário

para ocorrer o fenômeno.o Anote os resultados, preferencialmente em tabelas curtas.o Faça uma discussão final sobre a prática executada.

Reagentes

o Ao iniciar uma experiência verifique se a concentração da solução é dada em porcentagem, molaridade ou normalidade.

o Verifique a temperatura a ser executada e ordem de adição dos reagentes.

o Após uso o reagente deve ser recolocado no seu lugar para que outro colega possa utilizá-lo.

o Cuidados a serem tomados com os reagentes e soluções, a fim de evitar estragos e contaminações: 1) Não trocar tampas; 2) Não introduzir pipetas sujas;

Material do estudanteCada estudante deverá trazer para a aula prática:

o Avental. Não será permitido assistir a aula sem o avental.o Manual de aulas práticas.o Caderno protocolo.o Pincel atômico para marcar a vidraria.o Lápis, borracha, régua e papel milimetrado.

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Execução dos trabalhos práticos e limpeza

o Para a execução de trabalhos práticos exige-se atenção, rigor técnico, responsabilidade e disciplina.

o Para maior eficiência é necessário que o aluno seja pontual, assíduo, ordeiro, asseado e tenha o prévio conhecimento teórico da prática a ser executada.

o Cálculos e anotações devem ser efetuados no caderno de protocolo.

o Ao finalizar os trabalhos práticos, o aluno deverá proceder a limpeza do seu local de trabalho, deixando-o limpo em condições de ser usado novemente.

o A vidraria usada deve ser colocada em bacias localizadas nas oias do laboratório.

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1a Prática

Medidas de segurança, vidraria do laboratório e regras para elaboração do relatório

1. Objetivos:

Identificar medidas de segurança no laboratório; Identificar e nomear a vidraria de uso corrente no laboratório,

correlacionando-as às suas respectivas funções. Elaborar relatórios das aulas práticas.

2. Normas gerais e medidas de segurança no laboratório

Trate educadamente todas as pessoas que freqüentam o laboratório, comportamentos como este, tornam a convivência mais fácil e agradável;

Não será permitido fumar no laboratório, por causa das substâncias inflamáveis em uso ou em estoque, e também pelo respeito aos não fumantes;

O uso de jaleco é obrigatório, pois esta vestimenta protege a sua pele e a sua roupa, do contato de substâncias que podem respingar sobre você, causando queimaduras, como as substâncias corrosivas, manchas na sua roupa, como os corantes, etc;

É indispensável o seu roteiro para acompanhar as aulas práticas, bem como a leitura da prática com antecedência, para obter um melhor aproveitamento das aulas;

Procure conhecer os reagentes químicos usados no laboratório, isso evitará acidentes. Assim, antes de trabalhar com algum reagente que você não conheça, procure ler seu rótulo ou tire dúvidas com o professor, ou consulte livros especializados, como o Index Merck, que é uma enciclopédia dos reagentes químicos;

Siga sempre as instruções do roteiro e do professor, poupa tempo e material e é mais seguro;

Procure conhecer o nome e a função do material permanente (vidraria e equipamentos) em uso no laboratório;

Mantenha sua bancada sempre limpa e no final da prática descarte o material perecível. Não jogue resíduos sólidos nas pias. Os líquidos usados nos experimentos devem ser despejados na pia com a torneira aberta, bem próximo ao ralo. Isso facilita a diluição e escoamento, evitando assim o risco de corrosão dos canos;

Próximo a chamas, nunca abra nem deixe frascos contendo substâncias inflamáveis (éter, acetona, álcool clorofórmio, etc). substâncias inflamáveis devem ser aquecidas em banho-maria ou chapa elétrica. Nunca as exponha a chama direta;

Nunca leve as mãos à boca ou aos olhos quando estiver manuseando produtos químicos;

Evite o contato de qualquer substância com a pele, seja particularmente cuidadoso quando manusear substâncias corrosivas, como ácidos e bases concentrados;

Evite encostar-se em pias e bancadas, pois resíduos de líquidos corrosivos podem causar danos à pele e vestimenta;

Não se deve usar lentes de contato no laboratório, pois se alguma substância química respingar no seu olho, a possibilidade da lesão causada será aumentada, já que se terá dificuldade em manter o olho aberto para que seja feita sua limpeza;

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Rotule imediatamente qualquer reagente ou solução preparada, isso evita dúvidas ou desperdícios na hora de realizar os experimentos;

Nunca retorne aos frascos restos da solução que deles foram retirados , pois você pode contaminar o reagente original;

Antes de usar uma pipeta, certifique-se de que ela esteja limpa; Não use a mesma pipeta para pipetar soluções diferentes, isso evita a

contaminação dos reagentes; O uso de pipetas é absolutamente individual. Após o uso, elas devem ser

depositadas com o bocal virado para baixo nas provetas (contendo uma solução detergente), distribuídas ao longo das bancadas;

Nunca cheire diretamente qualquer frasco, diversos reagentes do laboratório são tóxicos ou nocivos, muitos podendo mesmo causar sérios danos as mucosas nasal, ocular e oral. Muitos compostos em uso no laboratório podem comprometer o sistema respiratório;

Antes de retirar uma solução de um frasco, agite-o suavemente para homogeneizar o conteúdo;

A tampa do frasco não deve ser colocada sobre a bancada, pois poderá ser contaminada com alguma substância que tenha respingado sobre ela. Segure-a numa das mãos e recoloque-a no frasco imediatamente após a retirada do material;

Tendo qualquer dúvida, solicite ao professor os devidos esclarecimentos; Acostume-se a ter apreço pelas “coisas públicas”, pois elas são um

patrimônio da comunidade; Finalmente lembre-se de que o laboratório é um lugar em que se desenvolvem

trabalhos sérios e não um ambiente para brincadeiras ou bate-papos . Tenha consciência desse comportamento não só para o laboratório de Bioquímica, mas em qualquer laboratório que você venha a freqüentar durante seu curso universitário e carreira profissional.

2.1 Socorros de emergência

Em qualquer acidente no laboratório, identifique a causa e procure imediatamente assistência médica.

a) Substâncias químicas nos olhos:

Solução alcalina (básica): lavar imediatamente com bastante água e depois com solução saturada de ácido bórico 2% ou de ácido pícrico 1%.

Solução ácida: lavar abundantemente com água e depois com uma solução de ácido bórico 2%. O ácido bórico é usado em queimaduras por causa de suas ações bactericida e fungicida.

b) Queimaduras:

Pelo calor: tratar a queimadura com álcool ou com solução de ácido pícrico 1%.Por ácidos: lavar rapidamente com uma solução de bicarbonato de sódio 5% e

depois com água.Por bases: lavar rapidamente com uma solução de ácido acético 5% ou ácido

bórico 2% ( água boricada) e depois com água.

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Estas regras de segurança não devem ser vistas como um manual de proibições, mas como orientações que devem ser observadas para um melhor desempenho do aluno no laboratório.

3. Vidraria de laboratório

É de fundamenta importância para quem trabalha em laboratório distinguir e usar convenientemente cada vidraria. A vidraria de laboratório pode ser usada para armazenar material sólido ou líquido, preparar soluções, fazer reações, medir líquidos, etc.

Quanto a exatidão ou não de suas medidas, a vidraria pode ser de dois tipos , a saber: as que são calibradas para transferir um certo volume, aproximado, mas não exato ( exibem a sigla TC, to contain, gravada no vidro) e as que são calibradas para transferir volumes dentro de certos limites de exatidão (exibem a sigla TD, to deliver , gravada no vidro).

Qualquer vidraria apresenta o problema da aderência do fluído nas suas paredes internas, mesmo estando limpa e seca. Por isso, um frasco construído para conter um determinado volume de líquido (TC), sempre escoará um volume menor.

A vidraria do tipo (TD) tem seu volume corrigido para a aderência do fluido, e por essa razão, escoará o volume indicado. Ainda assim é necessário saber que a quantidade do líquido escoado por essa vidraria dependerá, principalmente, da sua forma, de sua limpeza, do tempo de escoamento, da viscosidade e da tensão superficial do líquido.

Antes de passarmos ao conhecimento dos recipientes de vidro do laboratório, é necessário conhecer o significado de três termos freqüentemente aplicados a eles, quais sejam, calibrado, volumétrico e graduado.

Calibrado é um termo que indica a capacidade máxima de volume que uma vidraria é capaz de medir.

Volumétrico refere-se a capacidade da vidraria de fazer medidas de volumes exatas. Pipetas volumétricas e balão volumétrico são exemplos de recipientes volumétricos.

Graduado indica a marcação da fração de volume ao longo da vidraria. Pipetas graduadas, provetas, buretas, beckers e erlenmeyers são exemplos de vidraria graduada.

3.1 Os recipientes mais comumente usados no laboratório são:

Becker - copo de vidro graduado ou não, de vários tamanhos. O becker tem funções diversas como preparar soluções, pesar substâncias sólidas, etc. O becker não é uma vidraria de medida exata, por isso não deve ser usado para fazer medidas precisas de volume.

Balão volumétrico - vidraria volumétrica, possui a forma de uma pêra, um fundo chato, um gargalo longo e é provido de uma tampa de vidro esmerilhada ou de teflon. O gargalo apresenta um traço fino gravado na sua parte superior, que indica até onde o nível do líquido deve ser elevado para completar o volume da solução. É usado tanto na preparação de soluções de concentração conhecida como na diluição de soluções já preparadas.

Erlenmeyer - frasco de vidro de forma cônica, com gargalo, graduado ou não. É usado em titulações, agitação e aquecimento de líquidos; a sua forma evita respingos.

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Pipeta - tubo de vidro graduado de diâmetro reduzido e tamanhos variados, com bico e bocal. É utilizada para medir e transferir pequenos volumes de líquidos, ou seja, pipetar.

Proveta - cilindro de vidro graduado, com pé. É encontrada em tamanhos diversos e serve para medidas exatas de líquidos.

Tubo de ensaio - tubo de vidro de tamanhos variados, fundo redondo ou chato. Alguns possuem tampa rosqueada. É utilizado para fazer reações em pequena escala, ensaios biológicos e cultura de microrganismos.

Kitassato ou kitazato - frasco cônico de vidro, com paredes espessadas e gargalo com saída lateral. É usado em filtração a vácuo.

Vidro de relógio - tipo de "pires" côncavo, de vidro, de diversos tamanhos. É usado para pesar substâncias, receber pequenos organismos e órgãos.

Frasco estoque - frasco de vidro ou de plástico, com tampa esmerilhada ou não. Serve para guardar substâncias químicas e soluções; pode ser claro ou escuro ( este último é adequado para as substâncias e soluções fotorreativas).

Funil de vidro ou de plástico - Serve para filtrações simples e transferir líquidos de um recipiente para outro.

Bastão de vidro - haste de vidro usada para agitar soluções e auxiliar na transferência de líquidos de um recipiente para outro.

Placa de Petri - tipo de prato, de vidro ou de plástico transparente que encaixa com outro um pouco maior. É usada para cultivar microrganismos e em preparações histológicas.

Funil de separação - Utilizada para separar líquidos não miscíveis.

Gral e pistilo - Recipiente e macerador de porcelana. Servem para pulverizar ou macerar sólidos e preparar pastas.

Bureta - Tubo de vidro graduado provido de uma torneira para escoamento controlado do líquido. Serve para medir líquidos com precisão e é usado em titulações.

4. Classificação dos reagentes químicos quanto ao risco que oferecem no manuseio

Corrosivos - substâncias que em contato com os materiais de tubulações, equipamentos e com o tecido vivo (pele, mucosas) exercem uma ação destrutiva. Precaução: ao manipular reagentes corrosivos deve-se evitar o respingo deles em sua vestimenta, pele e olhos. Os reagentes corrosivos são representados por um símbolo de um ácido ativo. Exemplos: Hidróxido de sódio, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico.

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Inflamáveis - substâncias que em temperatura ambiente, podem entrar e combustão espontaneamente em contato com o ar. Em geral emitem gases e vapores. Precaução: ao trabalhar com esse tipo de substância deve-se evitar contato com materias ignitivos (ar, água). As substâncias Inflamáveis são representadas por uma chama ou letra F. Exemplos: Hexano (solvente de extração), etanol, acetona, etc.

Explosivos - substâncias muito sensíveis ao fogo, ao calor e à fricção (choques, atritos). Ao trabalhar com esses reagentes deve-se evitar batida, empurrão, fricção, faísca e calor Exemplos: nitroglicerina metano, propano, butano, etc.

Comburente – são as substâncias que podem acender ou facilitar a combustão, impedindo o combate ao fogo. Ao manipular esses reagentes deve-se evitar o contato deles com materiais combustíveis. Exemplos: oxigênio, nitrato de potássio, peróxido de hidrogênio, etc.

Irritantes substâncias não corrosivas que, por contato imediato, prolongado ou repetido com a pele ou com as mucosas, podem provocar uma reação inflamatória. Precaução: Os gases não devem ser inalados, quanto aos líquidos deve-se evitar respingos dessas substâncias com a pele e olhos. As substâncias irritantes são representadas por uma cruz de Santo André ou pelas letras X i, Exemplos: Cloreto de cálcio, carbonato de sódio, formol, etc.

Nocivo - substâncias que por inalação, ingestão ou penetração através da pele, podem produzir doenças. Precaução: deve ser evitado o contato dessas substâncias com o corpo humano, assim como sua inalação. As substâncias nocivas são representadas por uma cruz de Santo André ou pelas letras Xn. Precaução: Deve-se evitar qualquer contato dessas substâncias com o corpo humano. Exemplos: Clorofórmio, etanal, diclorometano, cloreto de potássio, etc.

Tóxico - são aquelas substâncias químicas que, em determinadas concentrações podem causar danos graves à saúde, podendo inclusive levar uma pessoa à morte. Precaução: Deve-se evitar qualquer contato dessas substâncias com o corpo humano. A representação por pictograma é de uma caveira sobre tíbias cruzadas ou pela letra T. Ex. Metanol, cloreto de bário, monóxido de carbono, etc.

Perigosa para o ambiente – são os reagentes que liberados no meio ambiente, podem provocar danos a curto ou longo prazo. Precaução: devido ao seu risco em potencial, não deve ser liberado em encanamentos, no solo ou no ambiente. Tratamentos especiais devem ser tomados. A representação por pictograma é uma cena mostrando um ambiente degradado em que se vê peixe e árvore mortos. A letra N representa esse risco Exemplos de reagentes que oferecem riscos ao ambiente benzol, cianureto de potássio, o inseticida lindan (hexaclorociclohexano), etc.

4.1 Símbolos de segurança utilizados em reagentes de laboratório

A identificação do grau de risco de um reagente deve ser feita tanto por seus nomes como pelos símbolos, como descrito acima, e ambos descritos em etiquetas ou rótulos dos reagentes. Os símbolos de risco são pictogramas representadas em forma quadrada, impressos em preto e fundo laranja-amarelo, utilizados em rótulos ou informações de produtos químicos. Eles servem para lembrar o risco do manuseio do

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produto, representando nos pictogramas os primeiros sintomas com o contato com a substância.

Tabela 1 representação com pictogramas e letras dos riscos de reagentes de laboratório

Risco Pictograma Letra

Corrosivo C

Inflamável

F

Tóxico T

Irritante Xi

Nocivo Xn

Explosivos E

Comburentes O

Perigosa para o ambiente

N

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11

(1) (2)

(3)

(4)

(5)

(6)

(7) (8)(9)

(10)

Figura 1 – Vidraria comum no laboratório de Bioquímica. 1- Grau e pistilo; 2- Pregador ou pinça de madeira; 3- Balão de fundo chato; 4- Balão volumétrico; 5-Becker; 6- Bureta; 7- Erlenmeyer; 8- Suporte para tubos, bancada ou grade; 9- Proveta; 10- Tubo de ensaio; 11- Funil de Buchner;12- Funil de vidro; 13- Pisseta; 14- Vidro de relógio; 15- Suporte.

5. Normas para redação do relatório de aulas práticas de bioquímica

A elaboração de um relatório é uma etapa de importância crucial no trabalho científico, pois ele relata os resultados finais do trabalho, quer seja de um estudo de levantamento bibliográfico, de pesquisa laboratorial, etc. Deverá ser um relato completo que possa permitir a qualquer pessoa que o leia adquirir uma visão global do estudo realizado, proporcionando uma consulta fácil e fornecendo de modo objetivo a informação mais relevante. A forma para se redigir o relatório deve ser respeitada, uma vez que a avaliação do mesmo é feita de acordo com esta orientação. Assim todo relatório devera conter os seguintes itens:

5.1 Capa Esse item deverá conter um cabeçalho, em que se identifica a universidade, o

departamento e a disciplina.No centro da página o título da prática e alguns espaços abaixo do título o nome

do aluno. Na margem inferior desta página deve conter o local e ano, sem qualquer

necessidade de especificar dia e mês. A capa desse manual de bioquímica oferece um bom modelo de como deve ser esta capa.

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(11)

(12) (13)

(14)

(15)

5.2 ObjetivosÉ o item do relatório que descreve de forma precisa as metas a que a prática

pretende atingir.

5.3 Introdução

Esse item deve conter informações teóricas sobre o assunto da aula do laboratório explorando várias literaturas que devem ser citadas a medida em que são usadas no texto através de números ou por nome dos autores e relacionadas no item Referências Bibliográficas.

Devem-se usar referências no texto sempre que se cita ou se usa resultados de outros autores. A referência deve ser referenciada apenas pela sua indicação, sem explicitar a palavra referência, exceto quando se usam referências numéricas e se está no início de uma frase:

No meio de uma frase, referencia-se assim [4], sem citar o autor ou a palavra referência. A referência [3], no entanto, mostra que há casos em que se precisa explicitar a palavra referência.

5.4 Materiais e métodos

Descrever os materiais utilizados na prática, quais sejam: a vidraria, os regentes, material biológico e os equipamentos. Neste item descreve-se de forma detalhada os procedimentos executados na realização da prática. Essa descrição deve ser precisa, de forma que alguém que veia a ler o que está escrito seja capaz de repetir a prática

5.5 Resultados e discussão:

O item resultados é parte do relatório em que se apresenta de forma concisa os resultados obtidos nos experimentos práticos. Os resultados podem ser apresentados em forma de texto descritivo, figuras, tabelas ou gráficos. Eles são numerados seqüencialmente e em seguida discutidos. Quando possível os resultados experimentais obtidos devem ser comparados com dados de literatura e suas diferenças (quando houver) discutidas. Uma boa discussão necessita de bases teóricas (pode-se utilizar referências bibliográficas) e devem ser relacionadas aos resultados obtidos avaliando a prática com relação aos objetivos propostos. Um erro freqüentemente cometido na discussão é repetir dados teóricos constantes da introdução. A discussão exige que os seus dados sejam comparados ao de outros grupos de pesquisa, publicados na literatura, o que dessa forma enriquece os seus resultados. Em diversos trabalhos científicos como artigo científico, dissertação, tese, a discussão é um item à parte.

5.6 Conclusão:

Nesse item deve-se destacar de modo claro e objetivo as conclusões que puderam ser observadas da aula pratica. . Muito comumente a conclusão vem descrita na forma de itens. Atenção, a conclusão não deve ser confundida com um resumo dos resultados do trabalho.

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5.7 Referências bibliográficas:

Nesse item se deve mencionar toda a bibliografia consultada, descrita de acordo com as normas da ABNT. Os exemplos abaixo descrevem como deve ser feita a referência bibliográfica.

Como citar referências de artigos de periódicos, revistas científicas: Descreve-se primeiro os nomes dos autores pelos últimos sobrenomes, seguidos das iniciais dos primeiros nomes e dos sobrenomes intermediários. Escreve-se em seguida o título do artigo e em seguida o nome abreviado da revista, o ano da publicação, número do volume e as páginas do artigo.

Costa VP, Vasconcelos JP, Comegno PEC, Jose NK. O uso de mitomicina C em cirurgia combinada. Arq Bras Oftalmol 1999;62:577-84.

Como citar referências de livros: Descreve-se o nome do autor pelo ultimo sobrenome, seguido das iniciais do primeiro nome e dos sobrenomes intermediários. Escreve em seguida o título do livro, logo após o nome da cidade de publicação e a editora, seguido do ano da publicação.

Bicas HEA. Oftalmologia: fundamentos. São Paulo: Contexto; 1991.

Capítulos de livros. Descreve-se o nome dos autores pelos últimos sobrenomes, seguidos das iniciais dos primeiros nomes e dos sobrenomes intermediários. Em seguida o título do livro, logo após o nome da cidade de publicação e a editora, seguido do ano da publicação e das páginas do capítulo.

Gómez de Liaño F, Gómez de Liaño P, Gómez de Liaño R. Exploración del nino estrábico. In: Horta-Barbosa P. editor. Estrabismo. Rio de Janeiro: Cultura Médica; 1997. p. 47-72.

Documentos Eletrônicos:

Monteiro MLR, Scapolan HB. Constrição campimétrica causada por vigabatrin. Arq Bras Oftalmol [periódico online] 2000 [citado 2001 Jan 31]; 63(3): [9 telas]. Disponível em: URL: http://www.cbo.com.br/abo/abo63511.htm

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2a Prática

Uso da pipeta e medidas de volume usadas em bioquímica

1. Objetivos:

Familiarizar o aluno com os diversos tipos de pipetas usadas no laboratório;

Diferenciar pipetas graduadas ao décimo de pipetas graduadas ao centésimo;

Utilizar a técnica correta no uso de pipetas; Conhecer as medidas de volume utilizadas no laboratório em

Bioquímica.

2. Fundamentação teórica:

Uma das técnicas mais comumente utilizadas nos laboratórios, é a de pipetar líquidos, ou seja, fazer transferências quantitativas de líquidos de um recipiente para outro, utilizando a pipeta. Sendo indispensável o domínio dessa técnica no laboratório, é importante conhecer seus princípios, para um melhor desempenho das atividades laboratoriais.

As pipetas são tubos de vidro com as extremidades afiladas, em que se recolhe, por sucção, um líquido, para medir-lhe com exatidão o volume. Se a transferência de um volume específico e acurado é necessária, algum tipo de pipeta calibrada deve ser usada. As pipetas calibradas são de dois tipos a saber, volumétrica e graduada.

3. Pipetas volumétricas. São tubos de vidro expandido cilindricamente na parte central. Elas não são graduadas e trazem a marca de calibração gravada na sua parte superior, acima do bulbo (às vezes essa marca vem gravada no bulbo). São utilizadas para transferência de volumes específicos, em ensaios em que se necessitam de medidas precisas de volumes. Essas pipetas podem transferir volumes em mililitros de: 1, 2 , 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50 e 100 mL. Para usar essa pipeta, deve-se introduzi-la no recipiente que contém o líquido a ser transferido. Faz-se a sucção com a boca ou com um dispositivo de segurança ( pêra ou bulbo de sucção), a depender da substância que se vai pipetar, preenchendo-a com o líquido até 2 ou 3 cm acima da marca “0”(zero), gravada na extremidade superior da pipeta. Deixe o líquido em excesso escorrer até o menisco chegar a essa marca. Prenda a extremidade superior da pipeta com seu dedo indicador para o líquido não escoar. Seque a ponta da pipeta com um pedaço de papel limpo (lenço de papel), leve-a para o recipiente em que se deseja transferir o líquido. Para deixar o líquido escorrer basta afrouxar o dedo indicador que obstrui a extremidade superior da pipeta. Toque a ponta da pipeta no interior do recipiente, para que a última gota escorra. Algum líquido pode ficar ainda na ponta da pipeta, mas não é necessário soprá-la, pois a maioria das pipetas volumétricas vem calibrada como TD (to deliver), que significa que o volume transferido já vem corrigido para essa quantidade que resta na pipeta. O tempo de escoamento do líquido é de 5 a 10 segundos.

4. Pipetas graduadas. São tubos cilíndricos com uma escala numerada por todo o tubo, de cima a baixo, até a sua capacidade máxima.. Podem ser também usadas para

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transferir frações de seu volume total. As pipetas graduadas são de dois tipos: Pipeta de Mohr e pipeta sorológica.

4.1 As pipetas de Mohr são encontradas de duas formas a saber, as de ponta longa e as de ponta curtas. As de pontas longas são úteis em transferência de volumes de um frasco de abertura estreita para outro de igual forma. Todas as pipetas de Mohr são TD e têm capacidade para transferir líquidos de: (0,1-10,0mL). Elas podem ser graduadas ao décimo ( as subdivisões são 0,1) ou ao centésimo ( as subdivisões são 0,01). A escolha do tamanho da pipeta é fundamental. Por exemplo, não tente pipetar 0,2 mL com uma pipeta de 5 ou 10 mL graduada ao décimo.

Para pipetar volumes entre 0 e 1mL, deve-se usar pipetas de 1mL graduada ao centésimo.

Para pipetar volumes entre 1e 2 mL, deve-se usar pipetas de 2 mL graduada ao centésimo.

Para pipetar volumes entre 2 e 5 mL, deve-se usar pipetas de 5 mL graduada ao décimo.

Para pipetar volumes entre 5 e 10 mL, deve-se usar pipetas de 10 mL graduada ao décimo.

O líquido no interior da pipeta forma menisco. A leitura deve ser feita na parte inferior do menisco e na altura dos olhos.(ver figura )

O uso da pipeta de Mohr é idêntico ao da pipeta volumétrica. Para preenchê-la com líquido, deve-se introduzi-la no recipiente que contém o líquido a ser transferido. Faz-se a sucção com a boca ou com um dispositivo de segurança ( pêra), a depender da substância que se vai pipetar, preenchendo-a com o líquido até 2 ou 3 cm acima da marca “0” (zero) gravada na extremidade superior da pipeta. Deixe o líquido em excesso escorrer até o menisco chegar a essa marca. Prenda a extremidade superior da pipeta com seu dedo indicador para o líquido não escoar. Seque a ponta da pipeta com um pedaço de papel limpo (lenço de papel), leve-a para o recipiente em que se deseja transferir o líquido. Para deixar o líquido escorrer basta afrouxar o dedo indicador que obstrui a extremidade superior da pipeta. Não preencha a pipeta de forma que a solução medida ultrapasse a última marca graduada na parte inferior da pipeta. Para que a última gota escorra, não é necessário soprar. Toque a ponta da pipeta no interior do recipiente.

4.2 Pipetas sorológicas. são graduadas até a ponta da pipeta. São encontradas na forma TD, que não precisam ser sopradas no final da titulação e na forma TC, calibrada para ser soprada no final da pipetagem. Para preenchê-la com o líquido deve-se usar o mesmo procedimento usado na pipeta de Mohr. Se a pipeta não for TD, deve-se deixar escoar o líquido que restou na pipeta e soprar após 15 a 20 segundos do líquido ter escorrido.

5 Pipetas Pasteur. Utilizadas para transferência não quantitativa de uma pequena quantidade de volume de líquido( 1 a 10mL) de um recipiente para outro. As pipetas Pasteur são disponíveis em dois tamanhos ( 15 e 23cm). Elas transferem cerca de 2 mL, sendo conveniente para transferência de quantidades não medidas de um tubo de ensaio para outro. Como as pipetas Pasteur têm uma ponta de vidro muito longa e fina, é conveniente usar uma proteção de borracha nela para evitar que ela se quebre. Deve-se usar também uma pêra no bocal para fazer a sucção e o escoamento do líquido.

6. Pipetas automáticas. Utilizadas em transferências quantitativas de líquidos, principalmente transferências idênticas de pequenos volumes. Essa pipeta permite transferências acuradas, precisas e rápidas de volumes de 1 a 10.000l. As pipetas automáticas podem ser de dois tipos:

6.1 Volume fixo. Calibradas para medir um volume determinado. Por exemplo um pipeta de 10l só irá medir 10l.

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6.2 Volume ajustável Calibradas para medir volumes variáveis, dentro de uma faixa pré-determinada. Por exemplo uma pipeta de 200l é usada para se medir volumes de 20l a 200l.

7. Uso da pipeta automática

Para pipetar líquidos com uma pipeta automática é necessário acoplar uma ponteira de plástico (tip) na parte inferior da pipeta e pressionar o êmbolo localizado na parte superior da pipeta quando ela estiver imersa no recipiente contendo o líquido que se vai pipetar. O êmbolo deve ser apertado de uma só vez para a sucção do líquido. Durante a sucção solta-se lentamente o botão. Para transferir o líquido pipetado da ponteira para um tubo de ensaio, por exemplo, deve-se pressionar o êmbolo mais uma vez, até sentir que ele chega a um obstáculo. Dessa forma o líquido vai escoar da ponteira para o tubo de ensaio.

8. Medidas de segurança no uso de pipetas

O uso do bulbo de sucção (ou pêra) não é necessário para pipetar substâncias inofensivas à saúde, como por exemplo, uma solução de NaCl 0,15M. Nesses casos, o líquido pode ser aspirado com a boca. Entretanto, como precaução e por uma questão de hábito, deve-se incentivar o uso do bulbo de sucção nas práticas de laboratório.

Há situações em que o uso de um dispositivo de segurança é indispensável quando for usar a pipeta, por isso deve se usar uma pêra ou uma pipeta automática quando estiver trabalhando com as seguintes substâncias:

1. Líquidos biológicos que oferecem riscos de contaminação como por exemplo, o sangue de animais e urina, quando ingeridos.

2. Ácidos e bases fortes, pois são corrosivos, e quando aspirados pela boca pode causar lesões no trato digestivo, se ingeridos.

Exemplo: H2SO4 98% , HCl 38%, NaOH, KOH, etc.3. Metais pesados, como o chumbo, mercúrio, entre outros, podem causar

intoxicação, quando ingeridos. Exemplo : acetato de chumbo.4. Radioisótopos. Eles podem causar radiações ionizantes em células humanas.

Exemplo: Fósforo 32 (32P).

Tabela 1: Unidades de volume

Unidades de volume

Abreviatura Fator de multiplicação( relativo ao litro)

Litro L 1Decilitro dL 10-1

Mililitro mL 10-3

Microlitro L 10-6

Para converter mililitro em microlitro, multiplica-se o valor do mililitro por 1000.Exemplo: 2 mL correspondem a 2000l ( 2 x 1000 = 2000).

Para converter microlitro em mililitro, dividi-se o valor do microlitro por 1000.Exemplo: 2000l correspondem a 2 mL ( 2000 /1000 = 2).

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3a Prática

Preparo de soluções e diluições

1. Objetivos:

Expressar corretamente a concentração das soluções; Efetuar cálculos de normalidade, molaridade e porcentagem e diluições; Utilizar a técnica e a vidraria corretas no preparo de soluções e de

diluições.

2. Soluções

As soluções são, provavelmente, o mais comum dos sistemas químicos encontrados em laboratórios. As soluções são definidas como misturas homogêneas de duas ou mais substâncias puras, em geral, o componente de uma solução presente em maior quantidade é chamado de solvente e o que está em menor quantidade, de soluto. Entretanto, esses termos podem ser trocados quando for necessário. Este é o caso das soluções de sólidos em líquidos, em que o líquido é tomado, comumente, como solvente e o sólido como soluto, independente das proporções relativas de cada um. Assim, podemos ter soluções de sacarose em água a 10% e 60%, e em ambos os casos, a água é considerada como solvente e a sacarose como soluto.

3 Maneiras de expressar a concentração das soluções

A concentração de uma solução pode ser expressa em função da quantidade de soluto num volume definido de solução, ou como a quantidade de soluto numa massa definida de solução ou solvente. As convenções mais comuns são definidas abaixo:

3.1 Molaridade (M) é o número de moles de soluto por litro de solução, ou seja, o número de moles é igual ao peso (em grama) do soluto/ PM. O Peso Molecular(PM) é a soma de todos os pesos atômicos dos átomos da molécula.

Concentrações molares são normalmente expressas entre colchetes, por exemplo, a concentração molar do íon hidrogênio é representada dessa forma, [H+].

Soluções diluídas são representadas em termos de milimolaridade, micromolaridade, nanomolaridade, picomolaridade, etc.

1 mmol = 10-3 moles1 mol = 10-6 moles1 nmol = 10-9 moles1 pmol = 10-12 moles

Portanto:1 mM = 10-3 moles = 1mmol/litro = 1mol/mL1 M = 10-6 moles = 1Mol/litro = 1nmol/mL1 nM = 10-9 moles = 1nmol/litro = 1pmol/mL

3.2 Normalidade(N) é o número de equivalentes do soluto por litro de solução. Para calcular a normalidade precisamos conhecer o peso do soluto dissolvido e seu

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equivalente-grama, ou seja, seu número de equivalente. O número de equivalentes é igual ao peso do soluto(em grama)/ Eq.g.

Equivalente-grama (Eq.g ) de um ácido é o peso molecular do mesmo que contém um átomo-grama de hidrogênio substituível. Por exemplo, o Eq.g do HCl é igual ao mol (mol é PM expresso em gramas) e do H2SO4 é igual ao mol/2.

Eq.g = PM nem que n é o número de H+ ou OH- substituíveis por molécula, isso para ácidos

ou bases, respectivamente, Eq.g, o equivalente grama e PM, o peso molecular

A molaridade e a normalidade são relacionadas por; N = n x M. Em que n é o número de H+ ou OH- substituíveis por molécula, isso para ácidos ou bases, respectivamente, N, a normalidade e M, a molaridade.

Por exemplo, uma solução 0,01M de H2SO4 corresponde a uma solução 0,02N.

3.3 Porcentagem peso/volume (% p/v) é o peso em grama de um soluto por 100 mL de solução. Exemplo:

Uma solução de NaCl 0,9% contem 0,9 g de NaCl em 100 da solução

3.4 Porcentagem peso/peso (% p/p) é o peso em grama de um soluto por 100g de solução. Exemplo: Os ácidos comerciais como HCl e H2SO4 estão disponíveis com concentração em peso/peso.

Uma solução de HCl 37% contem 37g de HCl em 100g da solução.

3.5 Porcentagem volume/volume (% v/v) é o volume em mililitro (mL) do soluto em 100 mL de solução. Exemplo:

Uma solução hidroalcoólica 70% contém 70 mL de álcool etílico absoluto (100%) em 30 mL de água destilada.

Tabela 2: Unidades de massa

Unidades de massa Abreviatura Fator de multiplicação( relativo ao grama)

Quilograma Kg 103

Grama g 1

Miligrama mg 10-3

Micrograma g 10-6

Nanograma ng 10-9

Picograma pg 10-12

Para converter miligrama em micrograma, multiplica-se o valor do miligrama por 1000.

Exemplo: 2 mg correspondem a 2000g ( 2 x 1000 = 2000).Para converter micrograma em miligrama dividi-se o valor de micrograma por

1000.Exemplo: 2000g correspondem a 2mg( 2000 /1000 = 2).

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4. Diluição

Diluição é uma técnica utilizada para preparar soluções, em que se adiciona um diluente a uma solução estoque, para diminuir a sua concentração. Solução estoque é uma solução com concentração conhecida e a partir dela pode-se preparar outras.

4.1 Diluição de soluções com concentração expressa em molaridade

Para diluir soluções cujas concentrações são expressas em molaridade, deve-se usar umas das seguintes fórmulas abaixo:

M1 x PM = 1000 x d x T

Sendo:M1 - é a molaridade da solução estoquePM - é o peso molecular do soluto1000 - é o fator de conversão da densidade expressa em g/mL para g/LT - é o título percentual da soluçãod = é a densidadeEsta fórmula é utilizada para encontrar o valor da molaridade da solução

estoque, M1. Em seguida utiliza-se a fórmula de diluição abaixo:

M1 x V1 = M2 x V2

Sendo:M1 é a molaridade da solução estoqueV1 é o volume que deve ser retirado da solução estoqueM2 é a molaridade da solução que se quer prepararV2 é o volume da solução que se quer preparar

4.2 Diluição de soluções com concentração expressa em normalidade

Para diluir soluções cujas concentrações são expressas em normalidade, deve-se usar umas das seguintes fórmulas abaixo:

N1 x Eq-g = 1000 x d x T

Sendo:N1 - é a normalidade da solução estoqueEq-g - é o equivalente grama do soluto1000 - é o fator de conversão da densidade expressa em g/mL para g/lT - é o título percentual da soluçãod = é a densidade

Esta fórmula é utilizada para encontrar o valor da normalidade da solução estoque, N1. Em seguida utiliza-se a fórmula de diluição abaixo:

N1 x V1 = N2 x V2

Sendo:

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N1 é a normalidade da solução estoqueV1 é o volume que deve ser retirado da solução estoqueN2 é a normalidade da solução que se quer prepararV2 é o volume da solução que se quer preparar

4.3Diluição direta

Podemos obter diretamente diluições altas de uma solução com concentração conhecida sem que seja necessário fazer diluições seriadas ou sucessivas, como por exemplo diluir uma solução 100 vezes. Para isto basta pipetar 10l da solução desejada em 990l de água.

5. Exercícios de preparo de soluções

1) Que massa de NaCl deve ser pesada para preparar 250 mL de uma solução de NaCl 1,5M? PM NaCl = 58,45

2) Que volume da solução estoque de HCl 37% (p/p) deve ser retirado para preparar 500 mL de uma solução de HCl 2,3N ?

Dados – PM HCl =36,6, densidade (d) = 1,19g/mL

3) Quantos mililitros de H2SO4 5M são necessários para preparar 200 mL de uma soução de H2SO4 1,5M? Expresse os seus resultados também em normalidade.

4) O Ácido Clorídrico (HCl) encerra 37 % de HCl em peso e tem uma densidade de 1,19 g/mL.

a) Calcular a molaridade do ácido concentrado.b) Descrever a preparação de 400 mL de HCl 3 Mc) Descrever a preparação de 300 mL de HCl 1,5N

5) Que massa de glicose deve ser pesada para preparar 30 mL de uma solução de glicose 0,13 mM? PM da glicose = 180.

6) Que massa de NaOH deve ser pesada para preparar 600 mL de uma solução de NaOH 2,5N? PM NaOH =40

7) Que volume da solução de NaOH 10N deve ser retirado para preparar 900 mL de uma solução de NaOH 0,3N?

8) Que volume da solução de HCl 5N deve ser retirado para preparar 500 mL de uma solução de HCl 0,7N?

9) Que massa de NaCl deve ser pesada para preparar 1L de uma solução de NaCl 0,9%. (p/v)?

10) Que volume de etanol absoluto (100%) deve ser retirado, para preparar 70mL de uma solução hidroalcoólica a 70% (v/v)?

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11) Que volume de etanol absoluto (100%) deve ser retirado, para preparar 250 mL de uma solução hidroalcoólica a 40% (v/v)?

12) Que massa de ácido pícrico deve ser pesada para preparar 100 mL de uma solução de ácido pícrico 2% (p/v)?

13) Descreva a diluição de 45 vezes de uma solução do corante cristal de violeta em 300 mL de água destilada.

14) Qual o volume da solução de ácido pícrico 1% deve ser usado para se preparar uma solução 10 vezes mais diluída num volume final de 100 mL.

15) Converter em Normalidade das seguintes soluções:

a) NaOH 0,5M b) HCl 2 M c)H2SO4 5M

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4a Prática

A Química de pH e tampões

1. O produto iônico da água e pH

O químico dinamarquês S. L. P. Sorenson propôs uma forma de representar a concentração de H+ de soluções. Ele definiu o logaritmo negativo da concentração de hidrogênio como pH.

(pH = - log[H+]) ( 1 )

Uma solução de HCl 0,01M, apresenta um valor de pH:

pH = -log [10-2] ( 2 )pH = 2 ( 3 )A equação 1 não pode ser aplicada na determinação do pH de uma solução

0,001M de NaOH, base forte que apresenta a seguinte ração de dissociação:

NaOH Na+ + OH ( 4 )

No entanto, a concentração do íon hidroxila (OH-) pode ser relacionada com a de H+, através da equação de dissociação da água:

H2O H+ + OH- ( 5 )

A constante de equilíbrio para essa reação é:

Nas equações (6 e 7) o colchete significa concentração molar. Como a concentração molar da água é 55,5M, ela pode ser substituída nessa equação: Multiplicando os termos da equação 7 teremos:

55,5M x Keq = [H+] [OH-] (8)A constante de equilíbrio da água é conhecida, sendo determinada a partir de

medidas da sua condutividade elétrica, dada pelos íons H+ e OH-. Portanto, a Keq é = 1 x 10-18. Substituindo esse valor na equação 8 teremos:

55,5M x 1 x 10-18 = [H+] [OH-] (9)Multiplicando os termos obteremos:

99,9 x 10-16 = [H+] [OH-] (10)

Aproximando o resultado obteremos::

0,999 x 10-14 = [H+] [OH-] ou 1,0 x 10-14 = [H+] [OH-] (11)

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Esse é o valor que corresponde ao produto iônico da água, o Kw. Como o

produto de [H+] [OH-] é 1,0 x 10-14 , a concentração de cada um deles é encontrada elevando-se a concentração de [H+] ou [OH-] ao quadrado , conforme descreve a equação 13 abaixo:

[H+] [OH-] = Kw = 1 x 10-14 (12)[H+]2 =1,0 x 10-14 Portanto: (13)[H+] = 1,0 x 10-14 = 1,0 x 10-7 (14)

[OH-] = 1,0 x 10-14 = 1,0 x 10-7 (15)Como esses números são de difícil manuseio, Sorenseon estabeleceu a escala do

pH, que é uma forma mais conveniente de se lidar com a concentração de H+ em líquidos, então:

pH = log 1,0 x 10-7 (16)pH = 7,0 (17)

A partir do valor do Kw podemos calcular agora o valor do pH da solução NaOH 0,01M, uma vez que [H+] [OH-] = Kw

[H+] [OH-] = 1 x 10-14

(18) pH = 12 (21)

2. A Escala do pH

Soluções que apresentam pH = 7,0 são neutras, as que apresentam pH abaixo de 7,0 são ácidas e as que têm pH acima de 7,0 são alcalinas ou básicas. A figura abaixo descreve a escala de pH, destacando o valor de pH de algumas soluções.

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3. Conceito de Ácidos e Bases

Muitas das reações químicas que ocorrem nas células são influenciadas pelos íons H+ e OH-, oriundos da hidrólise da molécula de água. Variações nas concentrações celulares desses íons podem alterar diversos processos biológicos, como a desnaturação de proteínas e ácidos nucléicos. Os organismos multicelulares desenvolveram estratégias químicas sofisticadas para evitar essas alterações, através da ação dos tampões, que são sistemas químicos que mantêm o valor do pH constante. Antes de entendermos a ação dessas substâncias, é necessário compreender o conceito de ácidos e bases definidos por Bronsted e Lowry. Um ácido é um doador de H+ enquanto a base é um aceptor de H+. Portanto:

1) AH A- + H+

2) A- + H+ AH

Na reação 1 AH é o ácido, pois se dissocia liberando + H+ e na reação 2 A- é a base, pois capta H+ , formando AH. As reações 1 e 2 podem ser combinadas, dando uma terceira reação:

3) AH A- + H+, AH e A- formam o par ácido base conjugado.

Utilizando agora a dissociação de uma substância química, o ácido clorídrico (HCl), temos: HCl H+ + Cl- , em que o H+ é o ácido e o íon cloreto (Cl-) a base. De acordo com o grau de dissociação em seus íons, os ácidos e bases são classificados em fortes e fracos. Os ácidos e bases fracas são os que parcialmente dissociam em seus íons, enquanto os fortes estão completamente dissociados em seus íons, quando em solução. O HCl se dissocia completamente em H+ + Cl- , portanto, é um ácido forte. O hidróxido de sódio (NaOH) é uma base forte porque é dissociado totalmente em seus íons: Na+ e OH. A tabela 1 abaixo apresenta alguns exemplos dos ácidos e bases fracos.

Tabela 1: Ácidos e bases fracos

Ácidos Bases conjugadasCH3COOH (ácido acético) CH3COO -(íon acetato)H2CO- 3 (ácido carbônico) HCO- 3 (íon bicarbonato)NH4

+ (íon amônio) NH3 (amônia)

4. Tampões e ação tamponante

Os fluidos celulares apresentam um pH constante e específico, geralmente próximo de 7,4. Nos organismos multicelulares, o pH dos líquidos extracelulares (sangue, por exemplo) é também estreitamente regulado através da ação dos tampões biológicos.

Tampões são misturas de ácidos fracos e suas bases conjugadas, que evitam variações bruscas de pH de em soluções, quando são adicionadas quantidades relativamente pequenas de ácido (H+) ou base (OH-). Por exemplo, quando se adiciona 1 mL de uma solução de HCl 0,1N a 99mL de água destilada o pH cai abruptamente Se fizermos um outro experimento, adicionando 1mL de NaOH 0,1N a 99mL de água destilada, observaremos que o pH se elevará consideravelmente.

Se experimentarmos agora adicionar 1mL da solução de HCl 0,1N a 99mL da solução tampão de acetato de sódio, que consiste de uma mistura de ácido acético e acetato, verificaremos que o pH dessa solução não se alterará, devido a forma básica

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desse tampão (CH3COO-) captar o íon H+, como demonstra o esquema abaixo. Quando se adicionar 1mL da solução de NaOH 0,1N a 99mL da solução tampão de acetato de sódio, o pH dessa solução não se alterará, devido a forma ácida do tampão (CH3COOH) liberar o íon H+, que reagirá com a hidroxila (OH-), produzindo H2O. Portanto o papel de um sistema tampão é neutralizar as ações de H+ e OH-, conforme o a equação 22 :

5. Tampões Fisiológicos – O tampão bicarbonato

O sangue apresenta valores de pH em torno de 7,4 rigidamente controlados, graças a ação de três sistemas de tampão: o bicarbonato (HCO -

3/CO2-), o fosfato

(H2PO-4/HPO2-

4) e o tampão protéico hemoglobina. O tampão bicarbonato atua no líquido extracelular e é um dos mais importantes tampões sangüíneos, já o tampões fosfato e hemoglobina são intracelulares.

Se o pH sangüíneo cair para valores em torno de 7, 2, como pode acontecer logo após o término de uma corrida de 100 metros ou em pessoas que apresenta uma diabetes não tratada, verifica-se um aumento na concentração do íon H+. Nesse caso o íon bicarbonato (a forma básica) capta o H+, corrigindo assim a sua variação de concentração. O ácido carbônico formado é dissociado, liberando H2O. e CO2, que por sua vez é exalado na respiração. Se o pH sangüíneo atingir valores em torno de 7, 6, ocorrerá um aumento na concentração do íon hidroxila (OH -). Nesse caso o ácido carbônico libera um H+, que reagindo com a hidroxila formará água, corrigindo assim a sua variação de concentração, conforme demonstra a equação 23:

O tampão bicarbonato é único, por que a forma ácida dele é eliminada pelos pulmões na forma do gás carbônico CO2, como também a concentração de CO2 e do íon bicarbonato podem ser reguladas na célula. Esses fatores explicam o fato desse ser o mais importante tampão sangüíneo.

6. Determinação potenciométrica do pH

As medidas mais exatas na determinação do pH são feitas através de técnicas potenciométricas, em que se utiliza o pH metro, instrumento que consiste de: um eletrodo de referência, um eletrodo de vidro, cujo pH depende da solução em que ele está imerso e um sistema para medida de voltagem, que é capaz de medir diferenças potenciais mínimas num circuito de resistência extremamente elevada.

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A função básica do eletrodo de referência é manter um potencial elétrico constante contra o qual variações podem ser medidas. Os dois eletrodos de referência mais largamente utilizados são o de calomelano (cloreto mercuroso em contato com solução saturada de KCl) e o de prata metálica-cloreto de prata. Esse último é o mais freqüentemente utilizado em instrumento. Ele consiste de uma peça de prata metálica envolvida por cloreto de prata, imersa numa solução saturada de cloreto de potássio. O potencial desse sistema é derivado da reação :

A equação 24 demonstra que o potencial de referência é dependente da concentração do íon cloreto (Cl-). Para manter sua concentração constante, em condições instáveis de umidade, uma solução saturada de cloreto de potássio (KCl) é utilizada. Se a umidade diminuir, pode ocorrer evaporação do eletrodo do vidro , acarretando em precipitação do excesso de cloreto; por outro lado, se a umidade se elevar, ocorrerá pequeno aumento no volume da solução e o cloreto de potássio se dissolverá.

A função do eletrodo de vidro é estabelecer um potencial elétrico que responda a variações na atividade do íon hidrogênio da solução a ser testada. Ele consiste de um tubo de vidro de alta resistência, apresentando na extremidade um bulbo, cujo vidro é delgado e de baixa resistência. Somente a porção do bulbo detecta variações de pH. O tubo é preenchido por uma solução de HCl 0,1N que entra em contato com o eletrodo de referência. Quando esse eletrodo é imerso em uma solução de concentração hidrogenada (H+) desconhecida, cria-se um potencial entre as soluções interna e externa. Como a voltagem do eletrodo de referência é constante, a diferença de potencial entre os dois eletrodos é diretamente relacionada com a concentração de íons hidrogênio da solução desconhecida.

7. Instruções que devem ser observadas no uso do pH Metro

1. Antes de utilizar o pH metro, lave o eletrodo com água deionizada e seque-o, cuidadosamente, com um lenço de papel.

2. Ajuste o botão da temperatura para o mesmo valor de temperatura das soluções padrões de pH, utilizadas para calibrar o aparelho e da solução em que se vai medir o pH.

3. Calibre o aparelho mergulhando o eletrodo na solução padrão de pH 7,0. Mude a chave do pH metro para a função pH. Se o valor registrado não for igual ao pH da solução padrão, gire a chave de ajuste até que seja atingido o pH 7,0. Repita o mesmo procedimento para calibrar o aparelho com uma solução de pH 4,0. O eletrodo deve ser lavado e secado, quando for mergulhado em soluções diferentes.

4. Antes de tirar o eletrodo da solução, o potenciômetro deve ser desligado.5. Lave e seque o eletrodo e em seguida mergulhe-o na solução em que se vai

medir o pH, girando a chave para a função de pH. Registre o valor, mude a chave da função pH, para o modo “Standby". Lave e seque o eletrodo.

6. Após o uso do aparelho, lave o eletrodo e deixe-o mergulhado num recipiente contendo água destilada limpa. A chave do pH deve estar no modo “Standby” e em seguida desligue o aparelho.

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08. Exercícios

1. Dada uma solução de HNO3 0,002 M, responda as questões a baixo:

a) Qual a concentração de H+?b) Qual a concentração de OH-?c) Qual o pH da solução-?d) Qual o pOH da solução-?

2. Calcule o valor de pH quando 1,0 mL de HCl 0,1M é adicionado a 99,0 mL de água pura. Considere em sua resposta a concentração final de HCl 0,1M em 100 mL da solução.

3. Calcule o valor de pH quando 1,0 mL de NaOH 0,1M é adicionado a 99,0 mL de água pura. Considere em sua resposta a concentração final de NaOH 0,1M em 100 mL da solução. Dado: Kw = 1 x 10-14.

4. Calcule o valor de pH de uma solução de HCl 10-8 M.

5. Qual a concentração de HNO3 numa solução cujo pH é 3,4 ?

6. Quantas vezes o pH do suco gástrico é mais ácido do que o :

a) vinagre b) sangue c) Coca-Cola d) alvejantes domésticos

7. Usando a equação de Henderson-Hasselbalch (pH = pKa + log [ aceptor H+]/ [doador H+])calcule o pKa do ácido láctico numa solução pH 4,8 em que a concentração de ácido láctico é 0,010M e a de lactato 0,087M.

8. Um tampão contém 0,010 mol de ácido láctico (pKa = 3,86) e 0,050 mol de sodium lactato por L. Calcule o pH deste tampão. Use a equação de Henderson-Hasselbalch

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5a Prática

Espectrofotometria

1. Introdução:

A espectrofotometria (medida da absorção ou transmissão de luz) é uma das mais valiosas técnicas analíticas de que dispõem os bioquímicos. Essa técnica consiste no uso do espectro radiante na inspeção de sistemas biológicos, especialmente soluções. Um feixe de energia atravessa a solução, e a sua absorção oferece tanto informações qualitativas como quantitativas dos componentes do sistema.

Figura 1 – Representação esquemática do espectro eletromagnético.

Compostos desconhecidos podem ser identificados por seus espectros característicos ao visível, ultravioleta ou infravermelho. As concentrações de soluções de compostos conhecidos podem ser determinadas medindo-se a absorção de luz em comprimentos de ondas específicos. As reações enzimáticas podem ser freqüentemente seguidas medindo-se no espectrofotômetro o aparecimento de produtos ou desaparecimento de substrato.

O instrumento usado nas medidas de absorbância ou transmitância é o espectrofotômetro que apresenta os seguintes componentes:

a - Fonte de luz - Para medida de absorbância no ultravioleta (250 - 340 nm) usa-se uma lâmpada de deutério ou de hidrogênio; no visível (340 - 800 nm) usa-se uma lâmpada de tungstênio-halogênio.

b - Colimador ou dispositivo de focalização - Sistema óptico com que se colima um feixe de raios luminosos, ou seja torna-os paralelos, transmitindo assim um intenso feixe de luz. c - Monocromador (prisma ou grade) - Tanto a lâmpada de deutério quanto a de tungstênio-halogênio produzem emissões contínuas de todos os comprimentos de onda correspondentes a suas faixas. Para se trabalhar com um comprimento de onda determinado, o espectrofotômetro dispõe de um dispositivo óptico para selecionar o comprimento de onda. O monocromador é um prisma que divide o raio de luz nos seus comprimentos de ondas respectivos.

d - Dispositivo para seleção do comprimento de onda desejado -e - Compartimento no qual é colocada a amostra - A amostra a se

inspecionada é colocada numa cubeta de vidro ou de quartzo e posicionada num compartimento apropriado de maneira que por ela possa atravessar o feixe de luz que é emitido por uma fenda localizada na parte interna do espectrofotômetro.

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f - Detector fotoelétrico - A intensidade da luz que passa através da amostra sob estudo depende da quantidade de luz absorvida pela amostra. A intensidade é medida por um detector sensível à luz, usualmente um tubo fotomultiplicador. O fotomultiplicador detecta pequena quantidade de energia luminosa, amplifica

g - Um medidor elétrico para registrar as saídas do detector

3 - A Lei de Lambert-Beer

Muitos aspectos da espectrofotometria são baseados em duas leis a de Lambert e Beer. A lei de Lambert afirma que a fração de luz incidente que é absorvida por uma solução depende do comprimento do caminho óptico (da cubeta), enquanto a lei de Beer afirma que a absorção de luz é dependente da concentração do composto que a absorve na solução e da natureza química deste composto. A transmitância de luz não é uma função linear, e sim exponencial. A relação entre a concentração, o comprimento do caminho ótico e a quantidade de luz absorvida por uma certa substância é expressa matematicamente pela equação de Lambert-Beer .

A quantidade de luz que atravessa a solução [transmitância (T)] ou a luz que é absorvida pela amostra [absorbância (A)] são detectadas pelo espectrofotômetro.

Transmitância = I % transmitância = I X 100 Io IoAbsorbância = log Io = 1 A (D.O) = -log T Log Io = acl I T IEm que: Io feixe de luz incidente

I feixe de luz emergente (transmitida) a absorbância c concentração l espessura da cubeta

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Fonte de luz Monocromador Cubeta com detector branca (grade de difração) amostra com mostrador digital

Figura 2 – Esquema de um espectrofotômetro.

4 - Ilustrando a Lei de Lambert-Beer

A natureza exponencial da transmitância da Lei de Lambert-Beer é ilustrada na situação descrita em seguida. Considere um raio de luz atravessando uma cubeta de 1 cm contendo um composto na concentração de 1 m que absorve luz. Suponha que 80% da luz incidente seja transmitida e 20% dela absorvida.I0 = 1,0 - [c=1mg/l] I1 = 0,8

Se uma segunda cubeta, nas mesmas condições da primeira for colocada no mesmo caminho luminoso, diretamente atrás da primeira cubeta, qual será a intensidade de luz transmitida através das duas cubetas? A Lei de Lambert-Beer não é uma relação linear. Assim I2 não é 0,6. Cada centímetro do comprimento do caminho óptico não absorve uma quantidade constante de luz, mas 20% da luz incidente.

PortantoI0 = 1,0 - [c=1mg/l (1cm)] I1 = 0,8 - [c=1mg/l (1cm)] I2 =0,64

De modo semelhante, se colocarmos três cubetas de 1 cm em série, cada uma absorve 20% da luz incidente e transmite 80%I0 = 1,0 - [c=1mg/l (1cm)] I1 = 0,8 - [c=1mg/l (1cm)] I2 = 0,64 [c=1mg/l (1cm)] I3 =0,512

Poderíamos obter o mesmo resultado se usássemos cubetas únicas com 2 e 3 cm I0 = 1,0 - [c=1mg/l (2cm)] 0,64I0 = 1,0 - [c=1mg/l (3cm)] 0,512ou se aumentássemos a concentração do composto que absorve luz, mantendo o comprimento óptico constanteI0 = 1,0 - [c=1mg/l (1cm)] I1 = 0,8I0 = 1,0 - [c=2mg/l (1cm)] I2 = 0,64I0 = 1,0 - [c=3mg/l (1cm)] I3 = 0,512

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5. Determinação do espectro visível ou do ultravioleta e o seu comprimento de onda máximo

Para determinar a concentração de uma substância a luz de um comprimento de onda deve ser escolhida, para isso é necessário o espectro de uma substância pura, ou seja sua absorbância como função do comprimento de luz deve ser determinada. Isto é obtido no espectrofotômetro medindo a absorbância da amostra em diversos comprimentos de onda.

Todas as medidas de absorbância devem ser feitas em relação a um branco, que é uma solução que contém todos os componentes do meio reacional, exceto o composto que está sendo medido. A cada mudança do comprimento de onda, deve ser feita uma leitura com o branco e só depois mede-se a absorbância da amostra. O comprimento de onda que der a absorbância máxima é usado para obter as medidas mais acuradas de variações de absorbância de acordo com a concentração.

6 - Aplicações da espectrofotometria do ultravioleta e do visível

A mais comum das aplicações da espectroscopia do ultravioleta e do visível é a determinação da concentração de uma substância em solução, se o coeficiente de extinção molar é conhecido e a Lei de Lambert-Beer é obedecida. O limite de sensibilidade dessas análises é determinado pelo valor do coeficiente de extinção. Quanto mais alto este for mais baixa é a concentração que pode ser medida. Se o coeficiente for 10.000 l.mol-1 e a absorbância mínima detectável é 0,01 em uma cubeta de 1 cm a concentração molar mínima que pode ser medida é de 1,0 x 10-6 M.

A atividade de uma enzima pode ser determinada através da medida da quantidade de produto formado ou da quantidade de substrato que desapareceu. Por exemplo a -galactosidase catalisa a hidrólise do o-nitrofenil--D-galactopiranosídeo, que é incolor, resultando no o-nitrofenol, que possui cor amarela, e absorve luz maximamente a um comprimento de onda 405nm e pode dessa forma ser determinado através do espectrofotômetro.

Medidas de absorbância pode ser usado na identificação de substâncias. Por exemplo, as proteínas absorvem luz em 280 nm, os ácidos nucléicos em 260 nm e a forma reduzida NADH em 340 nm.

7 - Como utilizar o Espectrofotômetro

7.1 - Ligue o aparelho em tomada de (observar a voltagem se 220 ou 110V) 7.2 - Após a estabilização do aparelho, selecione o comprimento de onda com que se

vai fazer as medidas espectrofotométricas, pressionando a tecla comprimento de onda (wavelength). A faixa de visível de 325-1000 nm.

7.3 - Selecionar as operações TRANSMITÂNCIA ou ABSORBÂNCIA, 7.4 - Calibrar o aparelho, ou seja, deixar a TRANSMITÂNCIA em 100% e a ABSORBÂNCIA com leitura 0.000.7.5 - Para fazer as medidas espectrofotométricas do Branco, selecione a função absorbância. Preenche-se a cubeta com o conteúdo do Branco e leva-a para o aparelho para registrar o valor encontrado. Aperte a tecla 0ABS/100%, para evitar que a leitura do Branco seja adicionada a das suas amostras. Em seguida lave a cubeta e seque-a cuidadosamente, evitando tocar na parte por onde passa o feixe de luz, a que apresenta vidro transparente.

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7.6 - Para fazer as medidas espectrofotométricas das amostras selecione a função absorbância. Coloca-se o conteúdo das amostras na cubeta e registra-se o valor encontrado. Para ganhar tempo, evitando lavar a cubeta a cada medida feita, faça as análises partindo da amostra mais diluída para a mais concentrada.7.7 - Após a prática, desligue o aparelho, lave as cubetas e entregue-as ao professor. Se tiver alguma dúvida no uso do espectrofotômetro, solicite do professor esclarecimentos, isso evitará que você possa cometer erros na prática ou avaria ao equipamento. Tenha muito cuidado no manuseio das cubetas, pois esse material é caro. 7.8.– Ao terminar a prática deixe o aparelho e as cubetas limpas, seja cuidadoso ao manusear o aparelho e cubetas, pois são materiais caros e de difícil aquisição. Evite brincadeiras na hora do trabalho, isso vai evitar que você cometa erros, ou que possa cometer alguma avaria.

8 - Protocolo experimental 8.1. Equipamentos e Vidrarias- Espectrofotômetro com cubetas- Pipetas de 5 mL graduadas- Estante com tubos de ensaio

8.2. Reagentes- Alaranjado de Metila: Concentração: 0,001%- Azul de Bromofenol : Concentração: 0,0001%

8.3. Procedimento:A. Coleta de dados para a construção do espectro de absorção do Alaranjado deMetila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo).Usando água destilada como referência, efetuar as leituras de Absorbância (ou D.O.) doAlaranjado de Metila ( nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480,500, 520, 550, 600, 650 e 700 nm) e o Azul de Bromofenol (nos seguintescomprimentos de onda: 400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm)

Preencher os dados da tabela 1 abaixo, de acôrdo com o corante escolhido pelo grupo:Alaranjado de Metila Azul Bromofenolλ (nm) T (%) Absorbanc. λ (nm) T (%) Absorbanc.400 400420 440440 490460 520480 540500 565

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520 580550 590600 620650 660700 700

Utilizando os dados da tabela acima preparar um gráfico ( x = comprimento de onda nm) e (y = leitura em absorbância), encontrando qual o comprimento de onde refere-se ao pico de absorção do corante usado em aula.

Qual o comprimento de onda correspondente ao Pico de absorção da luz?

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6a - Prática

Determinação da concentração de proteínas pelo método do Bradford

5.1 Introdução

Há diversos métodos na literatura utilizados na dosagem de proteínas em solução, entre eles destacamos o de Bradford, o do Biureto e o de Lowry. Todos eles apresentam vantagens e desvantagens. A escolha pelo melhor método é dependente de vários fatores como: a quantidade de material de que se dispõe para fazer a dosagem, o tempo requerido para realizar o ensaio e as substâncias que interferem com o ensaio.

5. 2. Método de Bradford

O método de Bradford é um dos mais rápidos e sensíveis na quantificação de proteínas. O limite de detecção da concentração protéica desse método é de 0-20 ug de proteína. Ele se fundamenta na ligação da proteína ao corante Coomassie brilliante blue G-250, ligação essa que causa a mudança na absorbância máxima do corante de 495 nm para 595 nm. É por isso que as leituras de absorbâncias devem ser feitas nesse comprimento de onda (595nm). Este ensaio é bastante reproduzível , apresentando boa estabilidade de cor por cerca de 1 hora. Existe pouca ou nenhuma interferência de cátions como sódio ou potássio. Os principais componentes que causam interferência de cor neste ensaio são: Dodecilsulfato de sódio (SDS), triton X-100 e detergentes comerciais.

5.3 - Preparo do reagente de Bradford

I - Pesar 142,85mg do corante Coomassie brilliante blue G-250 e dissolver em 50 mL álcool etílico 95% agitando até completa dissolução.II - Transferir para proveta para observar se houve diminuição do volume do álcool, que deve ser completado com álcool etílico 95% para um volume final de 50 mL.III - Transferir a solução do item II para um balão volumétrico e adicionar 100 mL de ácido fosfórico e completar o volume para 1000 mL com água destilada.IV - Filtrar a solução do item III duas vezes ou mais, caso ela apresente precipitado

5.3 - Elaboração da curva padrão de BSA

Construa uma curva padrão utilizando concentrações conhecidas de BSA (albumina bovina sérica ). Para tanto, é necessário preparar uma solução estoque de 1mg/1mL, ou seja, pesa-se 1mg de BSA e o dissolve em 1mL de água destilada ou uma solução de NaCl 0,15M. A concentração desta solução em micrograma por microlitro é 1000 g de BSA em 1000 L de água destilada.

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BSA(μg/100μL)

Água destilada(L)

Solução estoque de BSA (L)

Reagente de Bradford (mL)

A595nm

0 100 - 2,5

10 90 10l 2,5

20 80 20l 2,5

30 70 30l 2,5

40 60 40l 2,5

50 50 50l 2,5

A partir das leituras de absorbâncias encontradas, deve-se construir uma curva padrão no programa Excel. Plotar no eixo X as concentrações de proteína e no eixo Y as absorbâncias correspondentes. Adicionar a linha de tendência linear, equação da reta e R2.

5.4 - Ensaio de Bradford

- Proceder como para a curva padrão, no entanto adicionar 100 μl de amostra. Se necessário fazer diluições da amostra.

- Após ter feito a leitura das absorbâncias, determina a concentração de proteínas presentes na amostra (leite ou outro produto qualquer que apresente proteína) usando a equação da curva padrão.

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