Autorizo a reproduo parcial ou total desta obra, para fins acadmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO-NA-PUBLICAO

(Biblioteca Virginie Buff Dpice da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo)

T.2720 Guimares, Marta Brito FMVZ Deteco do vrus da Influenza Aviria Paramyxovrus tipo 1 (vrus da Doena de

Newcastle), Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae em aves silvestres e domsticas prximas s granjas avcolas comerciais nas regies de Mogi das Cruzes e Louveira do Estado de So Paulo / Marta Brito Guimares. -- 2012.

134 f. : il.

Tese (Doutorado) - Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia. Departamento de Patologia, So Paulo, 2012.

Programa de Ps-Graduao: Patologia Experimental e Comparada. rea de concentrao: Patologia Experimental e Comparada.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Jose Piantino Ferreira.

1.Influenza aviria. 2. Doena de Newcastle. 3. Paramyxovirus tipo I. 4. Mycoplasma gallisepticum. 5. Mycoplasma synoviae. 6. Aves silvestres. 7. Galinha de subsistncia.

I. Ttulo.

FOLHA DE AVALIAO

Nome: Guimares, Marta Brito

Ttulo: Deteco do vrus da Influenza Aviria, Paramyxovirus tipo 1 (vrus da Doena de

Newcastle), Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae em aves silvestres e

domsticas prximas s granjas avcolas comerciais nas regies de Mogi das Cruzes e

Louveira do Estado de So Paulo.

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em

Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de

Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So

Paulo para a obteno do titulo de Doutor em Cincias

Data: / /

Banca Examinadora

Prof. Dr.

Instituio: Julgamento: ____________

Prof. Dr.

Instituio: Julgamento: _______

Prof. Dr.

Instituio: Julgamento: _______

Prof. Dr.

Instituio: Julgamento: ______

Prof. Dr.

Instituio: Julgamento: ______

Dedicatria

Dedico este trabalho aos pssaros que representam Deus e a liberdade...

Liberdade que nos permite voar, criar, mudar e decidir sem medo os caminhos da vida.

minha famlia, que sem ela nada seria possvel.

AGRADECIMENTOS

Agradeo a todos que participaram deste trabalho direta ou indiretamente e que puderam

contribuir para que esse desafio fosse realizado da melhor forma possvel.

Ao meu orientador Prof. Antonio J. P. Ferreira pelo incentivo, apoio e amizade.

Ao Departamento de Patologia e ao Laboratrio de Ornitopatologia da FMVZ.

Aos responsveis pelas granjas de reproduo, postura e corte de Mogi das Cruzes e Louveira

(Emlia, Alfredo e Renato).

Aos proprietrios das aves de fundo de quintal: Miguel, Renato, Gerardo e Terezinha.

A toda equipe da biblioteca pela dedicao e trabalho surpreendentes.

WCS - Wildlife Conservation Society, patrocinadora do projeto.

ALLEGRETTI, L. A verdade e a alegria sobre tudo.

BELLO, C.P. O humor na hora certa.

CORRAL, L.R. Pacincia e amizade acima de tudo.

CUNHA, M.P.; AZEVEDO, N, P.; DAVIES, Y. O apoio, a ajuda, a amizade e a confiana.

FARIA, M.; ZANETTI, D. O riso e a conversa, essenciais para a sobrevivncia humana.

FERREIRA, C. A. S. Persistncia e organizao. O que um ps-graduando deve ter.

GUIMARES, Ms.Bs. Todos com a gentica do amor.

HURTADO, R. F. Talvez nem o cu seja o limite.

KNBL, T. Persistncia e compreenso. A conquista do sucesso.

MENO, M.C. Pacincia com ensino. Essencial para um excelente mestre.

METTIFOGO, E. Pesquisa e tcnica. Dicas que no esto nas publicaes

MILANELO, L.; FITORRA, L. S. A unio faz a fora.

MORAES, M.E. F, onde quer que ela esteja.

NARANJO, L.; SANTADER, S. Perseverana e dedicao, a essncia desta dupla.

REVOLLEDO, L. Ajuda e amizade.

RODRIGUES, L. Sempre presente na minha vida. Minha admirao pelo seu trabalho.

SANCHES, L. A paz na alma de uma mulher. A ajuda sem fim.

SILVA, L. R. Sempre presente na minha vida. Minha admirao pelo seu trabalho.

SINHORINI, J.A.; SINHORINI, I e S. A fora da alma iluminada, transforma o corpo.

TIMENESKY, J. ; SELMA. A doao sem inteno.

VANTRELLS, R. Sua inteligncia e o meu respeito por ela.

et al. muitas vezes so os que mais nos ajudam e nem mesmo sabemos. So todos aqueles

que me dizem bom dia, do um sorriso ou apenas trocam um olhar de carinho. Obrigada!!

RESUMO

GUIMARES, M. B. Deteco do vrus da Influenza aviria, Paramyxovirus tipo 1 (vrus

da Doena de Newcastle), Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae, em aves

silvestres e domsticas prximas s granjas avcolas comerciais nas regies de Mogi das

Cruzes e Louveira, no Estado de So Paulo. [Detection of Influenzavirus, Paramyxovirus I,

Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in free-ranging birds and backyard

chicken around poultry farms in Mogi das Cruzes and Louveira, So Paulo state]. 2012. 134 f

Tese (Doutorado em Cincias) - Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia,

Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.

Objetivou-se, neste trabalho, detectar o vrus da Influenza aviria, Paramyxovirus tipo 1

(doena de Newcastle), Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae, respectivamente

pelas tcnicas de RT-PCR e PCR, em aves domsticas e aves em vida livre prximas s

granjas avcolas nas cidades de Mogi das Cruzes e Louveira do Estado de So Paulo. As aves

silvestres foram capturadas, anilhadas, submetidas avaliao de estado geral e coleta de

suabes de orofaringe e cloaca. As aves de subsistncia ou fundo de quintal seguiram o

mesmo protocolo com a exceo do anilhamento, e tiveram amostras de sangue coletadas para

a pesquisa de anticorpos contra o vrus da Doena de Newcastle, Mycoplasma gallisepticum e

Mycoplasma synoviae pela tcnica de ELISA indireto. Foram considerados os aspectos da

biodiversidade entre as espcies silvestres capturadas e a biossegurana nas granjas. As aves

silvestres apresentaram resultados negativos nesta pesquisa, no entanto, Mycoplasma

gallisepticum e Mycoplasma synoviae foram detectados pela tcnica da PCR nas aves de

subsistncia, assim como apresentaram ttulos de anticorpos para os agentes acima citados e

para o Paramyxovirus tipo I. Duas granjas no possuam medidas de biosseguridade

adequadas permitindo o contato de animais de vida livre com as aves de fundo de quintal e

com as aves de produo, o que pode facilitar a disseminao de patgenos de interesse para a

sade pblica e para a avicultura comercial.

Palavras-chave: Influenza Aviria. Doena de Newcastle. Mycoplasma gallisepticum.

Mycoplasma synoviae. Aves Silvestres. Galinhas de Subsistncia.

ABSTRACT

GUIMARES, M. B. Detection of Influenzavirus, Paramyxovirus I, Mycoplasma

gallisepticum and Mycoplasma synoviae in free-ranging birds and backyard chicken

around poultry farms in Mogi das Cruzes and Louveira, So Paulo state. [Deteco do

vrus da Influenza aviria, Paramyxovrus tipo 1 (vrus da Doena de Newcastle),

Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae, em aves silvestres e domsticas

prximas s granjas avcolas comerciais nas regies de Mogi das Cruzes e Louveira, no

Estado de So Paulo]. 2012. 134 f. Tese (Doutorado em Cincias) - Faculdade de Medicina

Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.

The aim of this study is to detect avian influenza virus, Newcastle disease virus

(Paramyxovirus I), Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in backyard chicken

and wildlife birds around commercial poultry farms using RT-PCR and PCR. The birds were

captured with mist nets, identified with alluminium leg rings, subjected to the assessment of

clinical conditions and samples were collected by oral and cloacal swabs. The same was done

with backyard chicken without the identification with leg rings. Blood samples were collected

from backyard chicken and tested for antibodies against Mycoplasma gallisepticum,

Mycoplasma synoviae and Paramyxovirus I by indirect ELISA test. This study was conducted

in Mogi das Cruzes and Louveira, So Paulo state, where the commercial poultry is

considered an activity of great importance. The results were negative to wild birds, but we

could detect Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae by PCR and antibodies

titles for Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae and Newcastle disease in

backyard chickens.Two farms didnt have appropriate biosecurity measures, allowing intense

contact with free-living birds, backyard chicken and poultry facilitating spread of pathogens

with concern to human health and poultry farms.

Keywords: Bird Influenza. Mycoplasma gallisepticum. Mycoplasma synoviae. Wild Birds.

Backyard Poultry.

LISTA DE ILUSTRAES

FIGURAS

Figura 1 - Mapa do Estado de So Paulo, destacando os municpios onde foram realizadas as

coletas a campo..................................................................................................................

53

Figura 2 - Mapa com a distribuio das reas de coleta com G1, G2 e G3 representando as

localizaes das granjas em amarelo, e GS1, GS2, GS3 e GS4 representando as

localizaes das criaes das aves de subsistncia em vermelho e a Barragem Ponte

Nova em branco...............................................................................................................

53

Figura 3 - Distribuio dos galpes das granjas: a = G2, b = G3, c = G1.......................................... 54

Figura 4 - Rede de neblina colocada em frente aos arbustos.............................................................. 55

Figura 5 - Rede de neblina colocada prxima ao galpo na granja de postura................................... 56

Figura 6 - Pssaros silvestres nos galpes.......................................................................................... 57

Figura 7 - Galpo de aves para corte.................................................................................................. 58

Figura 8 - Pssaros sobre os comedouros da granja........................................................................... 58

Figura 9- Vista da Barragem Ponte Nova......................................................................... 59

Figura 10 - Galpo de aves de subsistncia GS1.................................................................................. 61

Figura 11 - Galinheiro com diversas raas de aves na criao GS2..................................................... 62

Figura 12 - rea aberta com arbustos e vegetao abundante na criao de aves GS3...................... 63

Figura 13 - Galinheiro da criao de aves GS4.................................................................................... 64

Figura 14 - Columbina talpacoti capturada em rede de neblina........................................................... 65

Figura 15 - Conteno manual e identificao da espcie.................................................................... 68

Figura 16 - Observao de ectoparasitas e anilhamento....................................................................... 68

Figura 17 - Biometria e coleta de suabe de orofaringe......................................................................... 68

Figura 18 - Famlias de aves capturadas nas granjas e BPN................................................................. 83

Figura 19 - Comparao das concentraes sricas de IgG em logaritmo natural (ln) contra a

doena de Newcastle nas aves de subsistncia..................................................................

96

Figura 20 - Comparao das concentraes sricas de IgG em logaritmo natural (ln) contra a

Mycoplasma gallisepticum nas aves de subsistncia.........................................................

96

Figura 21 - Comparao das concentraes sricas de IgG em logaritmo natural (ln) contra a

Mycoplasma synoviae nas aves de subsistncia.................................................................

97

Figura 22 - Mdia da concentrao de anticorpos para DNC (ln) nas aves das diferentes criaes

estudadas............................................................................................................................

97

Figura 23 - Mdia da concentrao de anticorpos para Mg (ln) nas aves das diferentes criaes

estudadas............................................................................................................................

98

Figura 24 - Mdia da concentrao de anticorpos para Ms (ln) nas aves das diferentes criaes

estudadas............................................................................................................................

98

Figura 25- Eletroforese das amostras positivas para Mg e Ms............................................................ 100

QUADROS

Quadro 1 - Segmentos de genes do vrus da influenza A, com as protenas e suas funes................ 30

Quadro 2 - Caractersticas e exames diagnsticos das doenas pesquisadas....................................... 47

Quadro 3 - Valores positivos para Paramyxovirus tipo I, Mg e Ms preconizados pelo Kit IDDEX.. 75

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Composio do Meio Frey .................................................................................................. 67

Tabela 2 Sequncia dos iniciadores, acesso ao GenBank e condies de reao PCR ou RT-PCR

dos agentes estudados..........................................................................................................

74

Tabela 3 Diferenas de produo, biosseguridade, estao do ano e plantel das granjas................. 78

Tabela 4 A riqueza de espcies capturadas, a abundncia aparente e o ndice de diversidade

Shannon de aves capturadas nas granjas e na BPN.............................................................

81

Tabela 5 Presena de Zonotrichia capensis em relao s demais espcies capturadas nos locais

estudados..............................................................................................................................

84

Tabela 6 Presena de Passer domesticus em relao s demais espcies capturadas nos locais

estudados.................................................................................................................... ..........

84

Tabela 7 Condio corporal, idade e presena de caros nas aves silvestres capturadas na granja

G1.............................................................................................................................. ..........

86

Tabela 8 Condio corporal, idade e presena de caros nas aves silvestres capturadas na granja

G2.................................................................................................................................... ....

87

Tabela 9 Condio corporal, idade e presena de caros nas aves silvestres capturadas na granja

G3.................................................................................................................................... ....

89

Tabela 10 Nmero total de indivduos, abundncia aparente, porcentagem de jovens, porcentagem

de aves em condio corporal regular ou ruim e porcentagem de aves com caros de

penas nas trs espcies dominantes nas granjas estudadas..................................................

90

Tabela 11 Ttulos de IgG srica encontrados na reao de ELISA nas aves da criao GS1.............. 92

Tabela 12 Ttulos de IgG srica encontrados na reao de ELISA nas aves da criao GS2.............. 93

Tabela 13 Ttulos de IgG srica encontrados na reao de ELISA nas aves da criao GS3.............. 94

Tabela 14 Ttulos de IgG srica encontrados na reao de ELISA nas aves da criao GS4.............. 94

Tabela 15 Ttulos de anticorpos sricos atravs de ELISA para Newcastle, Mycoplasma

gallisepticum e Mycoplasma synoviae (ln)..........................................................................

95

Tabela 16 Comparao dos resultados da PCR para Mg nas criaes de subsistncia........................ 99

Tabela 17 Comparao dos resultados da PCR para Ms nas criaes de subsistncia........................ 100

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ABEF Associao Brasileira de Exportadores e Produtores de Frango

AVIPA Avicultura Integral e Patologia Animal

BPN Barragem Ponte Nova

DAEE Departamento de guas e Energia Eltrica do Estado de So Paulo

DNA cido Desoxirribonucleico

DNC Doena de Newcastle

CDC Doena Respiratria Crnica

C.V. Coeficiente de Variao

ELISA Ensaio Imunoenzimtico

FAO Food and Agriculture Organization

G Granja

GS Galinha de Subsistncia

HA Hemaglutinina

HI Inibio da Hemaglutinao

IA Influenza Aviria

IAAP Influenza Aviria Altamente Patognica

IABP Influenza Aviria de Baixa Patogenicidade

IBAMA Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica.

IPI ndice de Patogenicidade Intracerebral

MAPA Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento

Mg Mycoplasma gallisepticum

Ms Mycoplasma synoviae

NA Neuraminidase

NP Nucleoprotena

NC Newcastle

OIE Organizao Internacional de Epizootias

PCR Reao em Cadeia pela Polimerase

RNA cido Ribonucleico

RNAm RNA mensageiro

RNP Complexo composto por RNA e NP

SAR Soroaglutinao Rpida

VI Vrus da Influenza

VIA Vrus da Influenza Aviria

VDN Vrus da Doena de Newcastle

UBABEF Unio Brasileira de Avicultura e Associao Brasileira dos Produtores e

Exportadores de Frangos

SUMRIO

1 INTRODUO ........................................................................................................... 18

2 REVISO DE LITERATURA .................................................................................. 22

2.1 INFLUENZA AVIRIA .............................................................................................. 27

2.1.1 Histrico ....................................................................................................................... 27

2.1.2 Caractersticas do Vrus ............................................................................................. 28

2.1.3 Replicao viral ........................................................................................................... 30

2.1.4 Caractersticas da doena .......................................................................................... 31

2.2 DOENA DE NEWCASTLE ...................................................................................... 33

2.2.1 Histrico ....................................................................................................................... 33

2.2.2 Caractersticas do vrus .............................................................................................. 34

2.2.3 Caractersticas da Doena .......................................................................................... 35

2.3 MYCOPLASMA GALLISEPTICUM E MYCOPLASMA SYNOVIAE ................... 38

2.3.1 Histrico ....................................................................................................................... 38

2.3.2 Caractersticas do Micoplasma ................................................................................. 40

2.3.3 Caractersticas da doena .......................................................................................... 41

2.4 EXAMES LABORATORIAIS ..................................................................................... 43

2.4.1 Exames sorolgicos ..................................................................................................... 43

2.4.1.1 Soroaglutinao rpida em placa (SAR) ....................................................................... 44

2.4.1.2 Reao de Inibio da Hemaglutinao (HI) ................................................................ 45

2.4.1.3 Ensaio imunoenzimtico (ELISA) ................................................................................ 46

2.4.2 Reao em cadeia pela polimerase (PCR) ................................................................ 47

3 OBJETIVOS ............................................................................................................... 49

4 MATERIAL E MTODOS ....................................................................................... 51

4.1 REA DE ESTUDO .................................................................................................... 52

4.2 CARACTERSTICAS DAS GRANJAS E DA BARRAGEM PONTE NOVA .......... 54

4.2.1 Granja de reproduo (G1) ....................................................................................... 54

4.2.2 Granja de Postura (G2) .............................................................................................. 55

4.2.3 Granja de Corte (G3) ................................................................................................. 57

4.2.4 Barragem Ponte Nova ................................................................................................ 58

4.3 CARACTERSTICAS DAS CRIAES DE SUBSISTNCIA................................. 60

4.4 CAPTURA E IDENTIFICAO DE ESPCIES DE AVES SILVESTRES ............. 64

4.5 AVALIAO CLNICA E COLETA DE AMOSTRAS BIOLGICAS ................... 65

4.6 COLETA DE AMOSTRAS BIOLGICAS DE AVES DE SUBSISTNCIA ........... 69

4.7 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS PARA OS TESTES MOLECULARES .......... 69

4.7.1 Extrao de DNA ........................................................................................................ 70

4.7.2 Primers utilizados na Amplificao de Mycoplasma gallisepticum e

Mycoplasma synoviae .................................................................................................. 70

4.7.3 Reao em cadeia pela polimerase (PCR) ................................................................ 70

4.7.4 Extrao de RNA utilizando o mtodo de TRIZOL/BRAZOL .............................. 71

4.7.5 Primers utilizados na amplificao dos vrus RNA ................................................. 72

4.7.6 Tcnica da Transcriptase Reversa da Reao em Cadeia pela Polimerase (RT-

PCR) ............................................................................................................................. 72

4.7.7 Eletroforese ................................................................................................................. 73

4.7.8 Ensaio Imunoenzimtico Indireto (ELISA) para VNC, Mg e Ms .......................... 75

4.8 ANLISES ESTATSTICAS ...................................................................................... 75

4.8.1 Anlise estatstica com os dados obtidos das aves silvestres ................................... 76

4.8.2 Anlise estatstica com os dados obtidos das aves de subsistncia ......................... 76

5 RESULTADOS ........................................................................................................... 77

5.1 PREVALNCIA DAS ESPCIES DE AVES SILVESTRES CAPTURADAS ......... 78

5.2 IDENTIFICAO DAS ESPCIES ........................................................................... 79

5.2.1 Comparao das frequncias de espcies mais prevalentes entre as granjas e BPN ........... 84

5.3 AVALIAO DAS AVES SILVESTRES .................................................................. 85

5.4 PCR E RT-PCR EM AMOSTRAS DE AVES SILVESTRES .................................... 91

5.5 PESQUISA DE TTULO DE ANTICORPOS EM AVES DE SUBSISTNCIA ........... 91

5.6 PCR E RT-PCR EM AMOSTRAS DE AVES DE SUBSISTNCIA ......................... 99

6 DISCUSSO ............................................................................................................. 101

7 CONCLUSO ........................................................................................................... 116

REFERNCIAS ........................................................................................................ 118

APNDICE A- TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ............ 133

APNDICE B - FICHA DE CAMPO UTILIZADA PARA AS AVES SILVESTRES .............. 134

1 INTRODUO

19

1 INTRODUO

A avicultura brasileira ocupa o primeiro lugar como pas exportador e mantm a

terceira posio na produo mundial de aves (ABEF, 2008). O Programa Nacional de

Sanidade Avcola (PNSA) normatiza o controle sanitrio do plantel avcola em relao s

doenas de interesse comercial. Os investimentos realizados decorrem principalmente da

preveno e controle de doenas de importncia mundial, como a Influenza Aviria, a Doena

de Newcastle e a Micoplasmose (BRASIL, 2009).

A Influenza Aviria (IA) uma doena sistmica que pode ser altamente letal. As

mortes de seres humanos e de centenas de milhes de aves ocorreram pelo mundo, e

resultaram em enormes prejuzos para a atividade avcola (LIPATOV et al., 2004; GIMENO,

2009). Os sintomas nas aves variaram de acordo com a virulncia do agente. Dessa forma, a

doena recebeu a denominao de Influenza Aviria de Alta Patogenicidade para a forma

mais virulenta do vrus e Influenza Aviria de Baixa Patogenicidade para a forma menos

severa deste (COX; SUBBARAO, 1999).

A Influenza aviria (IA) faz parte da lista de doenas notificveis pela Organizao

Mundial de Sade Animal (OIE) que determina os padres de sade e sanitrios para as

doenas de animais (SWAYNE; HALVORSON, 2008).

Os enormes prejuzos econmicos decorrem da dependncia do subtipo do vrus, da

espcie de ave infectada, do nmero de estabelecimentos atingidos, dos mtodos de controle

utilizados e da velocidade de execuo de aes de controle e erradicao. Essas perdas esto

relacionadas s aes de sacrifcio e destruio de aves, custos das atividades de quarentena,

vigilncia e mercados consumidores (SWAYNE; HALVORSON, 2008).

O vrus da Influenza A pertencente famlia Orthomyxoviridae, apresenta maior

ocorrncia em aves aquticas, capacidade de mutao gentica e adaptao a outras espcies

de hospedeiros como a populao humana e espcies animais. A contaminao pode ocorrer

pelo contato direto, indireto, aerossis e exposio de fmites contaminados com o vrus

(WEBBY; WEBSTER, 2003; SWAYNE; HALVORSON, 2008).

Apesar do Brasil no ter ocorrncia de surtos da doena, estudo mostrou que o vrus

est presente em aves silvestres (KAWAMOTO et al., 2005).

A Doena de Newcastle (DNC) considerada uma das maiores causas de perdas

econmicas da avicultura mundial e apresenta distribuio global (ALEXANDER, 2001).

uma enfermidade causada pelo Paramyxovirus tipo I, pertencente ao gnero Avulavirus e

20

famlia Paramyxoviridae (LEIGHTON; HECKERT, 2007; PAULILLO; JNIOR, 2009).

Diferentes graus de severidade da doena podem ocorrer dependendo da virulncia da cepa

viral, ou seja, desde uma infeco subclnica, onde os sintomas so inaparentes ou discretos,

at uma doena fatal (ZANETTI et al., 2005).

A infeco pode ocorrer atravs da inalao ou ingesto de partculas virais presentes

no ar, fezes, carcaa e fmites contaminados. O vrus j foi encontrado em aproximadamente

250 espcies de aves silvestres e de produo (LEIGHTON; HECKERT, 2007), porm, no

Brasil, poucos estudos foram desenvolvidos em aves silvestres (OLIVEIRA-JUNIOR et al.,

2003; SILVA et al., 2006).

A Micoplasmose uma infeco causada por bactrias do gnero Mycoplasma, da

famlia Mycoplasmateceae e ordem Mollicutes. So bactrias procariotas, sem parede celular

e so capazes de sobreviver no ambiente de um (01) a trs (03) dias. Os micoplasmas tm

predileo pelas membranas mucosas e serosas das aves, e provocam comprometimentos

respiratrios, articulares e urogenitais. As leses causadas nas aves de produo reduzem o

ganho de peso, aumentam as condenaes de carcaas, diminuem a produo de ovos, e

ocorre aumento nos gastos com medicamentos, o que torna a doena uma das mais onerosas

da avicultura comercial mundial (NASCIMENTO, 2000; BACK, 2002).

Em 1994, Micoplasma gallisepticum (Mg) emergiu como agente causador de doena

em pssaros silvestres da espcie Carpodacus mexicanus, no leste dos Estados Unidos, e

posteriormente foi diagnosticada na espcie Carduelis tristis (LUTRELL et al., 1998). A

doena nessa espcie se caracterizou principalmente por conjuntivite, secreo nasal e

debilidade. Os estudos mimetizando as condies em vida livre mostraram que a baixa

densidade de pssaros em uma determinada rea, diminua a frequncia de interao entre as

espcies, ocasionando menor estresse e menos propenso reinfeco (DHONDT et al.,

2012).

Micoplasma gallisepticum (Mg) e Mycoplama synoviae (Ms) foram isolados e

detectados em uma grande diversidade de espcies, o que pode representar um risco de

transmisso deste patgeno para as aves de produo comercial (LIERZ et al., 2008).

Os testes sorolgicos para a deteco de anticorpos nas criaes de frangos de corte,

galinhas de postura e aves reprodutoras, devem ser um instrumento para o controle de

micoplasmas na avicultura industrial, pois uma vez que este seja introduzido na granja requer,

na maioria das vezes, a desocupao do ambiente para o sucesso da erradicao do agente

(CARDOSO et al., 2006).

21

Programas de preveno e controle devem incluir monitoria peridica (sorologia,

cultura, isolamento e identificao) e vacinao, alm de medidas de biosseguridade (LEY,

2003).

Influenza aviria (IA), vrus da Doena de Newcastle (VDN), Mycoplasma

gallisepticum (Mg) e Mycoplasma synoviae (Ms) so patgenos economicamente

significativos para o PNSA, no Brasil e os pssaros silvestres podem ser um dos principais

disseminadores dessas doenas para as aves de produo.

Este estudo tem como objetivo contribuir com a investigao desses agentes em aves

silvestres capturadas em reas ao redor de granjas avcolas em Mogi das Cruzes e Louveira e

na rea da Barragem Ponte Nova. Assim como, nas aves domsticas de subsistncia de

criaes da regio de Mogi das Cruzes para que medidas de controle e preveno possam ser

adotadas para garantir a sade pblica e a economia da indstria avcola no pas.

22

2 REVISO DE LITERATURA

23

2 REVISO DE LITERATURA

O Brasil abrange uma rea de 8.512.000 Km2

que ocupa 47,3% da superfcie da

Amrica do Sul, sendo considerado o quinto pas no globo terrestre em extenso territorial

(SICK, 1997). Possui uma das maiores bacias hidrogrficas e florestas do mundo, atingindo

uma enorme multiplicidade de biomas particulares (SIGRIST, 2006). Dentre eles, a Mata

Atlntica que ocorre sob a forma de uma faixa de transio de amplitude varivel, cujos

limites geogrficos entre este e os biomas vizinhos, como o Cerrado e a Caatinga, foram

estabelecidos em 1993, pelo Decreto Federal n 750/93 (BENCKE; MAURICIO, 2006).

A Mata Atlntica considerada a segunda maior floresta da Amrica do Sul, se

destacando pela biodiversidade e alto endemismo. Porm, atualmente, somente 7,5% desta

floresta permanece pouco degradada, sendo considerada o bioma mais susceptvel do pas

(MYERS, 2000; SOS MATA ATLNTICA, 2012).

As questes ambientais se intensificaram nos ltimos anos, com nfase na integrao

dos efeitos da destruio de florestas e a volatilidade do clima, os quais podem oferecer

condies para o aparecimento de doenas emergentes. A identificao dos problemas

relacionados destruio do meio ambiente no Brasil, data do fim do sculo XVIII. No

entanto, apenas em 1937 houve a criao da primeira unidade de conservao pblica

(EPSTEIN, 2002; GOERCKE, 2006).

Um dos maiores desafios para a conservao da Mata Atlntica tm sido a degradao

e a fragmentao de reas. Em consequncia houve a destruio do habitat tanto pela

ocupao humana, quanto pela agricultura e pecuria, incluindo a produo avcola (DEEM;

KARESH; WEISMAN, 2001). A explorao deste ambiente, compromete a riqueza da

biodiversidade das 1.020 espcies de aves, das quais 188 so endmicas desta regio (SOS

MATA ATLNTICA, 2012).

As aves so indicadores de biodiversidade e foram usadas de maneira eficaz na

avaliao da conservao de reas, assim como na identificao de grandes centros de

endemismo terrestre (WEGE; GOERCKE, 2006).

Dentro da Classe Aves, a ordem Passeriformes uma das mais numerosas e

diversificadas em espcies e ocupam uma grande variedade de nichos ambientais pelo mundo

(PERKINS; SWAYNE, 2003). Compreende 5.739 espcies ou 59,1% das espcies de aves

descritas que se distribuem em 45 famlias (SICK, 1997). No Brasil, a diversidade da avifauna

composta por aproximadamente 1.832 espcies (CBRO, 2011).

24

Dentro desta ordem, encontram-se algumas espcies sinantrpicas que so

consideradas excelentes exploradoras de meios urbanos com baixa diversidade de espcies

(MACGREGOR et al., 2010).

No Brasil, o reforo populacional de aves silvestres em diversos biomas tem sido

realizado com a soltura de animais apreendidos pelo trfico. Desde 2008, foi criada a

Instruo Normativa n179 de 25 de junho de 2008 que normatiza o controle sanitrio e a

realizao de exames laboratoriais de doenas que acometem, principalmente, as aves de

produo (IBAMA, 2012). As solturas so realizadas em reas previamente cadastradas pelo

IBAMA e podem estar localizadas em regies de produo avcola.

A avicultura um dos recursos alimentares mais desenvolvidos do mundo, sendo

considerada uma importante fonte de protena animal. No ano de 1995, o consumo mundial

foi de 54,9 milhes de toneladas e no ano de 2000 foi de 65,6 milhes de toneladas, ou seja,

um aumento de 10,7 milhes de toneladas neste perodo. Em 2000, particularmente as

Amricas (Amrica do Sul, Central e Norte) foram responsveis pelo consumo de 28,6

milhes de toneladas, representando 44% da produo mundial (GIMENO, 2009).

O consumo de aves favorecido pelos preos competitivos em relao aos outros tipos

de carne (bovina e suna) e a preferncia do consumidor pela carne branca como fonte de

protena animal. O consumo de carne de frango e ovos aumentou nos ltimos anos quando

comparado ao consumo de qualquer outra fonte de protena animal (FAO, 2012).

O Brasil classificado mundialmente como o maior exportador de carne de frango e o

terceiro maior produtor avcola (ABEF, 2008). Segundo a UBABEF (Unio Brasileira de

Avicultura e Associao Brasileira dos Produtores e Exportadores de Frangos) a produo de

carne de frango atingiu 12,230 milhes de toneladas em 2010. Houve um crescimento de

11,38% em relao a 2009, aproximando-se da China, considerado o segundo maior produtor

mundial (ABEF, 2008a).

Estima-se que 48,1% das exportaes mundiais at 2020, tero origem nacional

(MAPA, 2011). Quanto produo de ovos, no 1 trimestre de 2012 foram produzidas

671.176 milhes de dzias de ovos de galinha. Este valor representa um aumento de 8,2% e

de 1,4%, respectivamente, em relao ao 1 trimestre e ao 4 trimestre de 2011. So Paulo foi

o Estado com a maior produo de ovos de galinha, representando 29,3% do total nacional

(IBGE, 2012a).

Programas governamentais brasileiros foram criados para prevenir a sade da

populao humana e avcola. Assim como, garantir a segurana sanitria do comrcio

internacional (GIMENO, 2009). Segundo as Portarias n193 de 19 de setembro de 1994 e o

25

Programa Nacional de Sanidade Avcola (PNSA) tem como objetivo orientar o controle do

estado sanitrio das aves de produo. Em 2006, foi aprovada a Instruo Normativa n17 que

instituiu o Plano Nacional de Preveno da Influenza Aviria e de Controle e Preveno da

Doena de Newcastle, cuja notificao obrigatria (BRASIL, 2009).

Por outro lado, aparte ao desenvolvimento da indstria avcola, ocorre a explorao

extensiva de aves de fundo de quintal em funo da predominncia de alguns fatores sociais

como a mudana no consumo de alimentos e no investimento econmico. fato que a

produo de aves de subsistncia no apresenta fiscalizao ou acompanhamento

governamental e desta forma, os registros destas criaes so desconhecidos (BUCHALA et

al., 2006a; GIMENO, 2009).

As aves de fundo de quintal so criaes adotadas como prticas que podem

apresentar diversas finalidades como: exposio, hobby e companhia at para o consumo e

venda local de carne e ovos (SMITH et al., 2012; HAMILTON-WEST et al., 2012).

No Chile, aps a avaliao dos proprietrios dessas criaes atravs de questionrios

constatou-se que o perfil desses indivduos era de pessoas que mantinham as aves como

tradio familiar (HAMILTON-WEST et al., 2012).

Esses animais so expostos a uma grande variedade de infeces concomitantes ou

no, causadas por vrus, bactrias ou parasitas. A infeco por parasitas ocorre nas aves mais

debilitadas, tornando-as susceptveis s outras infeces (AWAN; OTTE; JAMES, 1994;

HERNANDEZ-DIVERS et al., 2006).

O aumento da densidade de criaes de aves em proximidades com as populaes

humanas podem favorecer o risco de transmisso de doenas entre as populaes de aves e

das aves para os seres humanos (XAVIER et al., 2011; SMITH et al., 2012).

Os mercados de aves vivas se encontram em vrias partes do mundo e servem de

alimento para as populaes locais, as quais muitas vezes preferem o consumo de carne

fresca. As aves podem se tornar fontes de infeco de diversos agentes, principalmente IA,

pois as aves saudveis ou doentes podem desempenhar o papel de carreadoras deste agente

(VAN DEN BERG, 2009).

Nos Estados Unidos, desde 1986 esses mercados foram reconhecidos como

importantes reservatrios do vrus da Influenza. Neste ano foi encontrado o mesmo subtipo do

vrus de baixa patogenicidade (H5N2) tanto em aves comerciais como nas aves encontradas

nos mercados do nordeste dos EUA (SENNE et al., 2003; SENNE, 2007).

26

Na sia, os mercados de aves vivas foram fontes do vrus da Influenza Aviria de Alta

Patogencidade (IAPP) H5N1 com a transmisso para 18 pessoas e a morte de seis delas

(SIMS, 2007; SELWOOD, 2010). A interao de aves de diferentes idades e espcies, por

exemplo, frangos com aves aquticas, uma prtica comum na maioria dos pases do sul da

frica, o que facilita a disseminao do vrus. Dessa forma, esses mercados possibilitam a

proximidade de aves domsticas e selvagens em cativeiro, aumentando o risco de infeco

cruzada (VAN DEN BERG, 2009).

Na sia e frica foram identificadas cepas lentognicas, mesognicas e velognicas

do vrus da Doena de Newcastle (VDN) em aves de subsistncia, assim como a presena do

vrus da influenza H5N1 (ALEXANDER, 1988; VAN DEN BERG, 2009).

Em Chancay, no Peru, as aves mortas foram utilizadas como alimento para sunos em

15% das granjas pesquisadas e revelou ser este um potencial mecanismo para a adaptao do

vrus da influenza a outra espcie (MCCUNE et al., 2012).

No estudo de Soos, et al. (2008), as galinhas de subsistncia apresentavam idades

diferentes e as medidas de biossegurana raramente eram empregadas nas criaes.

A falta de divulgao aliada movimentao humana entre as criaes de aves de

subsistncia e as aves de produo, propicia a transmisso de doenas relevantes como a

Influenza aviria para as aves comerciais (BURNS et al., 2011).

No Brasil, a atual legislao sobre o controle sanitrio de aves domsticas de

subsistncia ou de fundo de quintal ainda est em desenvolvimento pelos rgos

competentes de Defesa Sanitria Animal, cujo programa de sade animal deveria ser capaz de

garantir e assegurar a explorao avcola em escala industrial. Buchala et al. (2006a) citaram

que deve ser prioritria a preservao dos plantis de multiplicao gentica, e que estes

devem estar livres dos patgenos responsveis por enfermidades que representem importncia

para a sade humana e animal.

Na lista de doenas de notificao obrigatria preparada pela Organizao Mundial da

Sade Animal se encontram a Influenza Aviria, a doena de Newcastle (Paramyxovirus tipo

I), Mycoplasma gallisepticum e Mycoplasma synoviae (OIE, 2012a). O estudo destas doenas

avirias de grande importncia, pois podem acometer aves silvestres, aves domsticas de

subsistncia e de produo, com vasto interesse para a sade pblica e a economia avcola

mundial.

27

2.1 INFLUENZA AVIRIA

2.1.1 Histrico

Na histria da humanidade existem relatos de diversas pandemias, cujas descries

sugerem o vrus da influenza como agente da infeco. Em 412 a. C., Hipcrates descreveu a

ocorrncia de uma epidemia de febre, rapidamente disseminada, com surtos de doena

respiratria febril e alta taxa de mortalidade (SELLWOOD, 2010). No sculo XX, as

pandemias de 1918, 1957 e 1968 afetaram a populao humana levando morte mais de 40

milhes de pessoas (ALEXANDER; BROWN, 2000; MORAES; SALLE; CARON, 2009;

SELLWOOD, 2010). No Brasil, o surto ocorreu no incio da primavera e coincidiu com a

segunda onda global da pandemia em outubro de 1918 (SELLWOOD, 2010).

A influenza Aviria tambm conhecida como peste aviria foi descoberta em 1878 por

Edoardo Perroncito, na Itlia e foi uma das primeiras doenas descritas apresentando um

agente etiolgico ultra filtrvel (ALEXANDER, 2009).

As aves pertencentes as ordens Anseriformes e Charadriiformes so consideradas

potenciais reservatrios e participam da perpetuao do vrus da IA na natureza

(LEBARBENCHON et al., 2010; VERHAGEN et al., 2012).

Nas aves silvestres, o primeiro isolamento do vrus da influenza ocorreu em 1961,

proveniente de andorinhas do mar (Sterna hirundo), na frica do Sul (BECKER, 1996).

No Brasil, o vrus da Influenza aviria foi isolado pela primeira vez em 1980, de fezes

de irers (Dendrocygna viduata) e de aves exticas no Estado do Rio de Janeiro (SALCEDO,

1980).

As aves silvestres apresentam diferenas de sintomatologia e prevalncia de

mortalidade dependendo da espcie envolvida e do subtipo do agente encontrado.

Em 2005, mais de 600 aves aquticas de vida livre morreram infectadas com o vrus

IAAP H5N1 no lago da reserva natural de Qinghai, na China. Este vrus foi isolado, em 2006,

de dois (02) casos fatais em humanos, na Turquia (SELLWOOD, 2010).

Em pssaros Acrocephalus arundinaceus e Turdus pallidus foram observadas

diferenas de manifestaes clnicas aps a inoculao do vrus da influenza H5N1. Este

ocasionou a mortalidade de 100% das aves da primeira espcie e sobrevivncia da segunda

por mais de oito (08) dias, com eliminao contnua do vrus. Desta forma, compreendeu-se

28

que as aves apresentavam respostas diferentes frente aos desafios com o vrus da IA

(FUJIMOTO et al., 2010).

Os estudos filogenticos com o vrus da influenza aviria estabeleceram uma

correlao entre o vrus encontrado em galinhas e pssaros. A identificao das cepas

A/Chicken/Vic/1/85 (H7N7) e A/Starling/Vic/5156/85 (H7N7) demonstraram uma

proximidade na sequncia gentica que ocasionou alta mortalidade das aves envolvidas na

doena (NESTOROWICZ et al., 1987).

No sul da Frana, o vrus da IA no foi detectado em amostras de 713 aves capturadas

no inverno e 237 aves capturadas na primavera pertencentes ordem Passeriformes mesmo

coabitando o ambiente das aves aquticas (LEBARBENCHON et al., 2010).

Fuller et al. (2010) consideraram que a vigilncia sobre os pssaros deveria ser maior

em relao s epizootias, pela capacidade dessas aves exercerem o papel de carreadoras na

transmisso dos vrus dentro da cadeia epidemiolgica da Influenza Aviria, assumindo a

mesma importncia que aves aquticas e domsticas.

Atualmente, cinquenta e um pases relataram casos de IAAP (influenza aviria

altamente patognica) H5N1 em aves domsticas ou de vida livre, entre 2003 e 2012. No final

de novembro de 2011 houve 596 casos em humanos com 334 relatos de morte humana pelo

vrus de alta patogenicidade H5N1(OIE, 2012b).

2.1.2 Caractersticas do Vrus

A Influenza aviria (IA) causada pelo vrus da influenza do tipo A, pertencente

famlia Orthomyxoviridae (MORAES, 2009), que apresenta genoma segmentado, de senso

negativo e fita nica de RNA. Existem cinco gneros desta famlia: Influenzavirus A,

Influenzavirus B, Influenzavirus C, tambm denominados influenza tipos A, B e C,

Thogotovirus e Isavirus. Somente os vrus do gnero Influenzavirus A infectam as aves

(ALEXANDER, 2007; HAAHEIM, 2010).

Os vrus influenza tipo A foram divididos em subtipos de acordo com as relaes

antignicas das glicoprotenas de superfcie, definidas como hemaglutininas (HA) e

neuraminidases (NA). Existem 16 subtipos de HA (H1 a H16) e nove subtipos de NA (N1 a

N9), sendo que o vrus apresenta a combinao de um antgeno HA e um antgeno NA. Todos

29

os subtipos do vrus influenza A foram isolados de espcies avirias aquticas.

(ALEXANDER, 2007; SELLWOOD, 2010; HAAHEIM, 2010).

Os vrus da Influenza Aviria Altamente Patognica (IAAP) foram caracterizados

pelos subtipos H5 e H7. No entanto, nem todos os vrus com estes subtipos so classificados

como vrus altamente patognicos, podendo ser considerados como vrus da Influenza Aviria

de Baixa Patogenicidade (IABP) (ALEXANDER, 2007). Se uma nica clula animal for

infectada simultaneamente com dois subtipos diferentes de vrus, podero emergir novas

combinaes de protenas HA e NA (STALKNECHT et al., 2007).

Os rearranjos do vrus da Influenza so comuns em populaes de vida livre. Estes

representam um mecanismo em potencial para a insero de genes de subtipos de vrus de IA

(incluindo novos subtipos de HA) dentro dos vrus da influenza existentes em animais ou

humanos. Esse processo de rearranjo no apresenta possibilidade de correo pelas

polimerases celulares e denominado de shift antignico.

Alm disso, o vrus da Influenza susceptvel s mutaes genticas espontneas que

podem ocorrer nas sequncias das protenas HA e NA. Estas mutaes podem alterar a

antigenicidade dessas protenas de superfcie, cujo processo denominado de drift

antignico (STALKNECHT, et al., 2007; MORAES, 2009).

Os virions da Influenza geralmente so esfricos ou pleomrficos, podendo ocorrer

como formas filamentosas. Apresentam entre 80 e 120 nm de dimetro e envelopes que so

derivados dos lipdios da membrana plasmtica da clula hospedeira (SWAYNE;

HALVORSON, 2008). Possuem nucleocapsdeo segmentado com simetria helicoidal e

podem ter tamanhos que variam entre 30 e 120 nm de comprimento (NODA et al., 2006). O

genoma tem oito (08) segmentos separados que codificam 10 protenas, das quais oito so

estruturais (quadro 1). O comprimento destes segmentos podem variar entre 874 e 2.396

nucleotdeos e o tamanho do genoma pode diversificar entre 10 e 14,5 Kb (STALKNECHT et

al., 2007; HAAHEIM, 2010).

30

Quadro 1 - Segmentos de genes do vrus da influenza A com as protenas e suas funes.

Fonte: Haaheim (2010)

2.1.3 Replicao viral

O vrus inicia a sua replicao com a adsoro da partcula viral membrana da clula

hospedeira. Este se liga especificamente nos receptores contendo cido silico (SA) 2-3Gal,

presente, principalmente, nas clulas do trato intestinal das aves. As cepas de influenza

humana se ligam preferencialmente aos receptores SA 2-6 Gal presentes nas clulas

epiteliais do trato respiratrio (STALKNECHT et al., 2007).

Em humanos, os receptores SA 2-3 Gal esto presentes no trato respiratrio, porm

parecem ser menos acessveis, pois esto localizados mais profundamente nas via areas

Segmento Protena Funo

1 PB2 Complexo polimerase. Replicao viral

2 PB1(-F2)

3 PA

4 HA Hemaglutinina. Protena de superfcie glicosilada. Inicia a

infeco pela ligao aos receptores celulares.

Antigenicamente altamente varivel. Existem 16 subtipos.

5 NP Nucleoprotena que encapsula os segmentos de RNA. O

complexo RNA-NP denominado RNP

6 NA Neuraminidase. Protena de superfcie glicosilada. Enzima

que divide o vrus a partir da clula hospedeira.

Antigenicamente varivel. Existem nove subtipos.

7 M1

M2

Protena matriz. Localizada abaixo da camada de superfcie

lipdica. Antigenicamente muito estvel.

Canal de on, existem poucas cpias na membrana viral.

Antigenicamente muito estvel.

8 NS1

NS2(NEP)

Protena no estrutural, a funo no bem entendida.

Acredita-se que inibe a sntese de interferon pelo

hospedeiro.

Auxilia na exportao do complexo RNA com a NP para o

citoplasma.

31

inferiores, o que explica a restrio de replicao de vrus avirios em humanos (SHINYA,

2006).

A adeso do vrus da influenza clula ocorre pela hemaglutinina do envelope viral.

Esta protena um trmero que deve ser clivado por proteases orgnicas transformando o

precursor desta molcula, denominada H0, em subunidades da hemaglutinina H1 e H2, para

que as partculas virais se tornem infecciosas (STALKNECHT, 2007; ALEXANDER, 2009).

O pH de 5 ou 6 auxilia na adsoro do vrus. A capacidade de clivagem pelo hospedeiro

determina a patogenicidade do subtipo viral (MORAES et al., 2009; HAAHEIM, 2010).

No trato respiratrio e digestrio existem baixas concentraes de proteases tripsina-

like que clivam os vrus no patognicos. No entanto, as proteases subtilisina-like que clivam

amostras patognicas se encontram em vrias clulas de diferentes tecidos e permitem a

disseminao do vrus no organismo (ALEXANDER, 2009).

Aps a adeso, o vrus perde o capsdeo no citoplasma da clula e o RNA viral migra

para o ncleo celular, onde ocorrer a transcrio e a sntese de RNAm. Posteriormente, o

RNAm migrar para o citoplasma, ser traduzido no retculo endoplasmtico para a sntese

das protenas virais. As protenas produzidas nos ribossomos sero transportadas para o

complexo de Golgi onde podero sofrer modificaes ps traducionais (SWAYNE;

HALVORSON, 2008).

Os RNAs recm produzidos migram com as protenas e se organizam para a sada da

clula pelo processo de brotamento. Neste momento, a glicoprotena neuraminidase permite a

eluio viral ou o rompimento das ligaes dos vrus pela hemaglutinina com os receptores de

membrana (MORAES et al., 2009; HAAHEIM, 2010).

2.1.4 Caractersticas da doena

A transmisso do vrus em aves de vida livre ocorre pela via fecal/oral e trato

respiratrio (STALKNECHT et al., 2007), porm, os vrus da influenza altamente

patognicos causam morte muito rpida nas aves e possvel que poucos vrus sejam

excretados durante o curso da infeco (ALEXANDER; SENNE, 2008).

Em pssaros Acrocephalus scirpaceus infectados com H5N1 foi demonstrada que a

eliminao viral pelo trato respiratrio era maior do que pelo trato intestinal (FUJIMOTO et

32

al, 2010). Bertran et al. (2012), sugeriram que falces poderiam adquirir o vrus da IAAP e/ou

IABP atravs da ingesto de presas infectadas.

Os sinais clnicos podem ser classificados de acordo com a cepa envolvida e a

susceptibilidade do hospedeiro. O vrus da influenza aviria de baixa patogenicidade (IABP)

comum em aves de produo. Tambm pode ser encontrado em outras espcies avirias

apresentando sinais clnicos como: baixa produo de ovos, inapetncia, penas eriadas,

edema de cabea, sinais respiratrios moderados incluindo dispneia, secreo ocular e nasal

(KENT et al., 2006; SELLWOOD, 2010).

A influenza aviria de alta patogenicidade (IAAP) se caracteriza pela rpida

disseminao, morte sbita, com mortalidade de 100% das aves. Pode causar sinais

respiratrios, acompanhados por hemorragia interna, cianose, diarreia e morte (SELLWOOD,

2010). Falces inoculados como o vrus da IAAP podem manifestar sinais neurolgicos antes

do bito (BERTRAN, 2012). Nesta doena se encontram leses necrticas e hemorrgicas em

diversos rgos, alm de edema de face, cabea, pescoo e patas podendo estar acompanhada

de hemorragias, petquias e equimoses. Nos rgos internos foram descritos quadros

hemorrgicos e necrose em mucosas e serosas (SWAYNE; HALVORSON, 2008).

Os achados patolgicos so variveis de acordo com o patotipo do vrus. Na doena

provocada pelo vrus da IABP foram descritos inflamao fibrinopurulenta em seio nasal,

traqueia, sacos areos e brnquios, alm de exsudatos inflamatrios no oviduto de fmeas.

Esporadicamente rins e pncreas podiam estar acometidos (SWAYNE; HALVORSON,

2008).

Os vrus podem estar protegidos pela matria orgnica das prprias aves como

secrees nasais, oculares e fezes. Temperaturas frias e condies de umidade favorecem a

longa sobrevivncia do vrus em ambientes ocupados por aves reservatrios (FULLER et al.,

2010; SWAYNE; HALVORSON, 2008). Os virions so sensveis ao calor, solventes

lipdicos, detergentes (aninicos, catinicos ou neutros), formaldedo, irradiao e agentes

oxidantes (STALKNECHT et al., 2007).

33

2.2 DOENA DE NEWCASTLE

2.2.1 Histrico

A doena recebeu este nome por ter ocorrido o primeiro surto na primavera de 1926,

em uma granja prxima a cidade de Newcastle-on-Tyne, na Inglaterra. No entanto, outros

relatos da doena foram descritos na ilha de Java, Indonsia (maro de 1926) e em outras

localizaes como: ndia, Sri Lanka, Coreia e Japo (KRANEVELD, 19261, DOYLE, 1927

2

apud ALEXANDER, 1988, p. 2).

Nas aves silvestres, os primeiros casos de isolamento do vrus da doena de Newcastle

ocorreram em bigus, Phalacrocorax aristotelis em 1949, na Esccia, e em Phalacrocorax

carbo, em 1974. Em 1956, a doena havia sido sugerida nestas duas espcies por

Macpherson, pois apresentavam os mesmos sinais clnicos e a mesma localizao geogrfica

que as aves de produo, durante a epidemia de DNC em 1897-1898 ou em 1949-1951

(KUIKEN, 1999; LEIGHTON; HECKERT, 2007).

O VDN foi descrito em uma variedade de espcies, compreendendo 27 das 50 ordens

de aves. Embora tenha sido provado que a maioria das cepas isoladas de aves aquticas no

era patognica para galinhas, as aves silvestres foram consideradas reservatrios do VDN

(ZHU et al., 2010).

O VDN foi identificado no Brasil, em 1953, nos Estados do Par e Amap pela

importao de carcaas de aves contaminadas dos Estados Unidos (SANTOS, 1954).

Desde ento, a doena foi descrita esporadicamente no pas, com a ltima ocorrncia

em 2006 diagnosticados em criao de galinhas de fundo de quintal no Estado do Rio Grande

do Sul, Mato Grosso e Amazonas (SILVA et al., 2008).

Em aves do Zoolgico Municipal e de propriedades particulares no Rio de Janeiro, no

Brasil, foi estudada a presena de anticorpos para o VDN pela tcnica da inibio da

hemaglutinao (HI). Encontraram em 12 aves silvestres de 837 aves domsticas no

vacinadas, ttulos de anticorpos para esta doena (OLIVEIRA-JNIOR, 2003). Nesta cidade,

foi isolada a cepa mesognica do vrus da Doena de Newcastle em patos domsticos com

1 KRANEVELD, F.C. A poultry disease in Dutch East Indies. Ned.-Indisch Bl. Diergeneesk, n.38, p.448-451,

1926. 2 DOYLE, T.M. A hitherto unrecorded disease of fowls due to a filter-passing virus .Journal Comparative

Pathology and Therapeutics, n.40, p. 144-169, 1927.

34

sinais clnicos respiratrios, neurolgicos e mortalidade de aproximadamente 100 aves

(OLIVEIRA-JNIOR et al., 2005).

Pardais (Passer domesticus) capturados em granjas de frangos de corte e granjas de

reproduo no Estado do Pernambuco apresentaram trs (03) aves positivas (n=103) na prova

de HI. Houve o isolamento viral de cepas provavelmente vacinais, demonstrando o contato

dos pssaros com as aves de produo (SILVA et al., 2006).

Na costa brasileira e regio Amaznica foram detectadas, pela tcnica de PCR em

tempo real, cepas lentgenicas de VDN em sete amostras de aves silvestres (0,7%),

migratrias ou no, e domsticas de um total de 1.022 aves estudadas, ocorreu o isolamento

viral, demonstrando a possibilidade desses animais se tornarem carreadores e reservatrios do

vrus DNC de baixa patogenicidade (THOMAZELLI et al., 2012).

2.2.2 Caractersticas do vrus

O vrus pertence ordem Monegavirales, famlia Paramyxoviridae, a qual dividida

em duas sub-famlias: a sub-famlia Pneumovirinae composta pelos gneros Pneumovirus e

Metapneumovirus e a sub-famlia Paramyxovirinae composta pelos gneros Morbillivirus,

Respirovirus, Rubulavirus, Henipavirus e Avulavirus (LEIGHTON; HECKERT, 2007;

PAULILLO; JNIOR, 2009).

O gnero Avulavirus apresenta nove subtipos de Paramyxovirus avirios, sendo a

Doena de Newcastle causada pelo Paramyxovirus tipo I (ALEXANDER, 1988; PAULILLO;

JNIOR, 2009).

As partculas virais do Paramyxovirus tipo I so pleomrficas e com formatos

arredondados de dimenses que variam entre 100 a 500 nm de dimetro. Tambm podem se

apresentar como formas filamentosas de aproximadamente 100 nm de comprimento

(ALEXANDER, 1988).

O vrus consiste de RNA envelopado, o qual mostra assimetria no capsdeo helicoidal

e possui um genoma no segmentado, de fita simples e polaridade negativa (ALEXANDER,

1988).

Dentro do envelope reside um nucleocapsdeo helicoidal central contendo o RNA

genmico com 15.186 nucleotdeos, compreendendo seis genes. Estes codificam seis

polipeptdeos: as protenas do nucleocapsideo (NP), fosfoprotenas (P), grande polimerase

35

RNA-dependente (L) que inicia a replicao intracelular do vrus (MILLAR; CHAMBERS;

EMMERSON, 1988; LAMB, 2007), protena hemaglutinina-neuraminidase (HN) e protena

de fuso (F). Entre o envelope e o ncleo existe uma protena da matriz (M) que compe a

arquitetura viral e liberada durante a entrada do vrus na clula hospedeira (MILLAR;

CHAMBERS; EMMERSON, 1988).

Os virions possuem um envelope lipdico onde esto inseridas projees tpicas, em

forma de espcolas (maiores e menores) que cobrem toda a sua superfcie.

As espculas maiores apresentam aproximadamente 8 nm de comprimento e possuem

uma glicoprotena HN com atividade hemaglutinante e neuraminidase (PAULILLO;

JNIOR, 2009). As espculas menores possuem a glicoprotena F, que est associada

capacidade do envelope em se fundir s membranas celulares do hospedeiro, para que haja a

introduo do material gentico na clula e ocasionar a fuso das clulas infectadas,

resultando no efeito citoptico in vitro, com a formao de sinccio (PAULILLO; JNIOR,

2009).

A virulncia do VDN em galinhas determinada pela composio de aminocidos da

protena de fuso (F) presente na superfcie do vrus. Assim como, pela presena de enzimas

celulares do hospedeiro capazes de clivar esta protena. Para que o processo de infeco viral

ocorra necessrio que a protena F0 seja clivada nas protenas F1 e F2, pelas proteases do

hospedeiro, que interagem com um grupo especfico de aminocidos no ponto de clivagem da

protena F (LEIGHTON; HECKERT, 2007).

A virulncia deste patgeno ser determinada pela composio de aminocidos

encontrados no ponto de clivagem da protena F0. Quando houver poucos aminocidos no

ponto de clivagem, somente as enzimas encontradas nos tecidos do trato respiratrio ou

intestinal do hospedeiro sero capazes de agir nestes aminocidos. As sequncias de

aminocidos no ponto de clivagem foram descritas entre as posies 113 a 117 da protena.

(ALEXANDER, 2011).

2.2.3 Caractersticas da Doena

Vrios fatores podem estar envolvidos na manuteno da infeco e a sua transmisso,

como: a presena de aves de produo carreadoras, a introduo constante de aves

susceptveis, a presena de outras espcies de aves de produo, aves silvestres, condies de

36

ambiente favorvel e a heterogeneidade do vrus da Doena de Newcastle (AWAN; OTTE;

JAMES, 1994).

A patogenicidade do vrus varia de acordo com a cepa e a espcie do hospedeiro

envolvida, sendo mais estudada em aves de produo. Em geral, o perodo entre a infeco e a

presena dos sinais clnicos ocorre entre 2 a 6 dias, mas pode ser at de 15 a 21 dias

(LEIGHTON; HECKERT, 2007).

O vrus capaz de infectar experimentalmente ou naturalmente mais de 241 espcies

de aves, representando 27 das 50 ordens de aves existentes (LEIGHTON; HECKERT, 2007;

PAULILLO; JNIOR, 2009; ALEXANDER, 2011). Os sinais clnicos podem variar quanto

severidade da doena dependendo da cepa viral, na dependncia da espcie aviria, do estado

de imunidade do hospedeiro, a idade e as condies em que so encontradas e se h a

presena ou no de outros agentes concomitantes (ALEXANDER, 2011). Ocorrem diferenas

entre os sinais clnicos e a severidade da doena nas espcies hospedeiras, com diferentes

cepas e isolados do VDN. Um sinal clnico caracterstico em aves de postura a formao de

ovos sem casca ou com casca mole (ALEXANDER, 2011).

O vrus transmitido entre as aves susceptveis, podendo ser eliminado pelas fezes,

secrees corpreas e ovos (LEIGHTON; HECKERT, 2007).

As aves clinicamente doentes so consideradas as principais fontes de infeco, entretanto as

aves infectadas, e as sobreviventes a infeces naturais podem albergar o agente e atuar como

reservatrios (AWAN; OTTE; JAMES, 1994).

O vrus foi isolado de diversas aves aparentemente saudveis, indicando que a

eliminao deste agente pode ocorrer por longos perodos e as aves podem ser potencialmente

transmissoras para outras aves (LEIGHTON; HECKERT, 2007).

A participao de vetores mecnicos como a mosca (Musca domestica) na transmisso

da doena foi demonstrada pelo estudo que detectou o vrus vacinal da cepa LaSota em

tecidos digestivos de moscas, pelo teste de hemaglutinao em at 72 horas aps a exposio

vacinal (BARIN et al., 2010).

Os vrus isolados da DNC foram divididos em cinco patotipos: a) velognico

viscerotrpico, caracterizado por cepas que promovem a forma da doena altamente virulenta,

na qual as leses hemorrgicas so caractersticas no trato intestinal e trato respiratrio; b)

velogncia neurotrpica, que causa alta mortalidade, aps ocorrer os sinais clnicos

respiratrios e nervosos; c) mesognica, cuja cepa causa sinais respiratrios e ocasionalmente

sinais clnicos neurolgicos, porm com baixa mortalidade; d) lentognica que causam sinais

37

clnicos medianos ou ausentes no aparelho respiratrio e entrica assintomtica onde a cepa

provoca infeces entricas inaparentes (PAULILLO; JNIOR, 2009).

Os vrus altamente virulentos podem produzir infeces agudas em todas as aves

susceptveis, com quadros de mortalidade sbita. Alm disso, podem ser encontrados os sinais

tpicos da doena como: depresso, prostrao, diarreia, edema de cabea e sinais nervosos. A

mortalidade pode chegar a 100% e em geral menor em aves mais velhas.

Embora os anticorpos sricos contra o vrus de NC no informem a qual cepa do vrus

a ave foi exposta, estes so importantes porque indicam se as aves silvestres estiveram

expostas a este agente.

Existe uma variedade de testes sorolgicos, como a imunodifuso radial simples,

hemlise radial simples, imunodifuso em gel de gar, neutralizao viral, soroaglutinao

rpida em placa (SAR), inibio da hemaglutinao (HI) e ensaio imunoenzimtico (ELISA)

(LEIGHTON; HECKERT 2007; PAULILLO; JNIOR, 2009). Destes, os mais usados na

avicultura comercial so a SAR, a HI e o ELISA (LEIGHTON; HECKERT, 2007).

Em aves comerciais foi demonstrada ocorrncia tanto da resposta imunolgica celular

como a humoral contra o VDN, sendo que os anticorpos podem ser detectados no soro entre 6

a 10 dias aps o contato com o vrus (LEIGHTON; HECKERT, 2007).

Um dos objetivos da Organizao Mundial da Sade Animal (OIE) facilitar o

comrcio de animais e seus produtos entre os pases membros. Dessa forma, foram

estabelecidas algumas definies para se caracterizar a Doena de Newcastle, cuja notificao

obrigatria.

A doena de Newcastle definida como uma infeco de aves causada pelo

Paramyxovirus avirio sorotipo 1 (PMV-1) que deve ter os seguintes critrios de virulncia

(ALEXANDER, 2011):

a. o vrus ter um ndice de patogenicidade intracerebral (IPI) em aves (Gallus

gallus), de um dia de idade, de 0,7 ou maior ou;

b. ter sido demonstrado a presena de mltiplos aminocidos bsicos (no mnimo

trs resduos de argininas ou lisinas entre os resduos 113 e 116), na regio carboxi terminal

da protena F2 e fenilalanina no resduo 117 na regio amino terminal da protena F1 do vrus.

O vrus sensvel a solventes lipdicos e instvel em pH muito alto ou baixo, alm de

mostrar instabilidade, especialmente, em temperaturas acima de 40C, luz solar e luz

ultravioleta ( PAULILLO; JNIOR, 2009).

38

Pode apresentar estabilidade e permanecer infectante por semanas, quando em

temperaturas baixas e na condio de estar protegido por matria orgnica, sobrevivendo no

lixo, gua, solo, carcaas, ovos e penas (LEIGHTON; HECKERT, 2007).

A maioria dos pases que mantm aves de produo emprega o uso de programas de

vacinao, com o objetivo de manter suas aves protegidas. Entretanto, a doena de Newcastle

endmica representa o maior fator limitante para o aumento da produo avcola em muitos

pases, incluindo a Unio Europeia que apresenta a ocorrncia de surtos espordicos

(ALEXANDER, 2011).

As vacinas vivas atenuadas e/ou mortas de VDN so de cepas lentognicas (baixa

virulncia) do vrus de NC e tm sido usadas com grande sucesso. No entanto, tais cepas,

especialmente a La Sota e Hitchner B1, podem provocar a doena clnica, caracterizada por

sinais respiratrios quando administradas a plantis infectados com outros agentes

respiratrios, principalmente Mycoplasma gallisepticum (SILVA et al., 2008). Com o objetivo

de se evitar essas reaes, para primeira vacinao recomenda-se o uso das estirpes B1,

Ulster, ou VG-GA (PAULILLO; JNIOR, 2009).

2.3 MYCOPLASMA GALLISEPTICUM e MYCOPLASMA SYNOVIAE

2.3.1 Histrico

Os micoplasmas pertencem classe Mollicutes, ordem I Mycoplasmatales, famlia

Mycoplasmataceae e gnero Mycoplasma, com aproximadamente 180 espcies que se

distribuem entre o homem, mamferos, aves, peixes, insetos e plantas (RIVERA-TAIPA;

CEDILLO-RMIREZ; JUREZ, 2002; KLEVEN; FERGUSON-NOEL, 2008;

TIMENESKY, 2009).

Dentre as 25 espcies de micoplasmas descritos em aves, 17 foram encontradas em

aves silvestres (LUTTRELL; FISCHER, 2007). No entanto, apenas Mycoplasma

gallisepticum (Mg), Mycoplasma synoviae (Ms), Mycoplasma iowae (Mi) e Mycoplasma

meleagridis (Mm) apresentam importncia econmica, pois afetam as aves de produo e se

distribuem mundialmente (GIMENO, 2009; METTIFOGO; BUIM, 2009, NASCIMENTO et

al., 2005).

39

Em 1898, Nocard e Roux, na Frana, isolaram os micro-organismos da

pleuropneumonia contagiosa de bovinos. Durante dcadas os micoplasmas foram isolados de

animais e humanos, doentes ou no, e foram denominados de organismos pleuro pneumonia-

like (TIMENESKY, 2009; NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

Em aves, a primeira descrio da doena ocorreu em perus, em 1905, na Inglaterra e

recebeu a denominao de pneumoenterite epizotica (LEY, 2008). Em 1935 um cocobacilo

presente no exsudato nasal de galinhas foi identificado, sendo isolado de perus com quadro

clnico de sinusite, denominada em 1938, de sinusite infecciosa dos perus (LEY, 2008;

NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

A doena foi denominada de Doena Respiratria Crnica pela evoluo lenta e

carter crnico dos sinais clnicos (METTIFOGO; BUIM, 2009), sendo posteriormente

definido o patgeno como Mycoplasma gallisepticum (NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

No Brasil, a micoplasmose aviria foi relatada pela primeira vez em 1955, por Reis e

Nbrega, a partir de casos de aerossaculite em galinhas e sinusite infecciosa em perus

(METTIFOGO; BUIM, 2009).

Mycoplasma synoviae foi descrito por Olson, em 1954, como o agente causador da

Sinovite Infecciosa em perus. Nas dcadas de 50 e 60, as granjas avcolas de frango de corte

apresentaram as manifestaes articulares. Em 1970, foi descrita a forma respiratria

associada a outros agentes como E. coli e DNC (NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

Um surto de micoplasmose causada por uma cepa de Mg genotipicamente diferente

das cepas encontradas nas aves de produo (LEY; BERKHOFF; LEVISOHN, 1997), foi

descrito em tentilhes (Carpodacus mexicanus), nos EUA e Canad, que apresentaram sinais

clnicos de conjuntivite (LUTTRELL; FISCHER, 2007). Esta doena reduziu a populao

desta espcie de ave em mais de 60%. Entre outras causas, em consequncia transmisso do

patgeno por via direta, de ave para ave, e indireta, por meio dos comedouros instalados em

reas pblicas (DHONDT; DHONDT; LEY, 2007). Alm disso, as aves doentes apresentaram

alteraes de comportamento, o que influenciou na disseminao do patgeno, como por

exemplo, o tempo de alimentao nos comedouros (HAWLEY; DAVIS; DHONDT, 2012).

Dhondt et al. (2007) demonstraram que sementes contaminadas poderiam ser dispersadas

quando os pssaros fossem remover as cascas antes do consumo, e estas poderiam espalhar

Mg pela poeira, infectando novos hospedeiros pela exposio ao agente.

Nos estudos epidemiolgicos de Mg em pssaros Carpodacus mexicanus foi

enfatizado por States, Hochachka e Dhondt (2009) que a prevalncia da doena dentro de uma

populao, poderia ser maior ou menor na dependncia da abundncia e das interaes entre

40

hospedeiros primrios e hospedeiros alternativos dentro da comunidade de aves. Esses

pssaros quando doentes poderiam transmitir a bactria pela mudana de comportamento com

a diminuio de movimentao, manuteno mais prolongada nos comedouros externos

encontrados em ambientes caseiros, parques e permanecendo em pequenos grupos

(HAWLEY, DAVIS, DHONDT, 2007).

No Brasil, os estudos epidemiolgicos referentes ao Mg e Ms relacionaram-se

basicamente s aves de produo, uma vez que pela legislao brasileira, as aves reprodutoras

tm que ser livres de Mg, Ms e Ms independente da espcie de aves da criao. As criaes

tercirias que produzem frangos de corte e poedeiras comerciais no so contempladas com

essa exigncia (SILVA et al., 2008).

2.3.2 Caractersticas do Micoplasma

Os micoplasmas so seres procariontes, com ausncia de parede celular, considerados

os menores micro-organismos de vida livre capazes de auto replicao (RIVERA-TAPIA;

CEDILLO-RAMREZ; JUREZ, 2002; LEY, 2008). Em razo desta ausncia, so resistentes

a antibiticos que agem na parede celular como, por exemplo, as penicilinas (NASCIMENTO

et al., 2005). Possuem conformaes estruturais pleomrficas, como pequenos bacilos ou

cocobacilos Gram negativos, formando colnias com caracterstica de ovo frito (LEY,

2008; METTIFOGO; BUIM, 2009; NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

As dimenses variam entre 200 a 300 nm de dimetro e podem possuir o formato de

uma garrafa ou pera pela protruso de membrana (MIYATA; OGAKI, 2006). Em sua

membrana existem projees similares a fimbrias que possuem a funo de motilidade,

quimiotaxia e aderncia aos receptores das clulas do hospedeiro (TAJIMA; NUNOYA;

YAGIHASHI, 1979; LEY 2008; NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

Em funo do reduzido genoma, apresentam capacidade limitada de biossntese dos

componentes necessrios ao seu metabolismo e crescimento (METTIFOGO; BUIM, 2009).

A membrana plasmtica trilaminar, sendo constituda por mais de dois teros de

protenas, 20 a 30% de lipdios e uma pequena quantidade de carboidratos. As protenas de

membrana de Mg podem ser divididas em duas classes: as integrais e as perifricas. O alto

grau de variabilidade na expresso de antgenos de superfcie entre as cepas de Mg foram

41

demonstrados com a utilizao de anticorpos monoclonais no sistema western blot

(METTIFOGO; BUIM, 2009).

As protenas de aderncia s clulas do hospedeiro podem variar entre as bactrias,

sendo a pMGA (hemaglutinina), MGC1, MGC2 e PVpA as que mais sofreram alteraes nas

cepas de Mg, enquanto nas cepas de Ms foram as protenas MSPA e MSPB. A principal

protena da membrana de Mg a pMGA (p67). Essa protena formada por trs eptopos

variveis que podem ser expressos ou no pelas diferentes cepas existentes (METTIFOGO;

BUIM, 2009, NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

Na superfcie do Ms existe um grupo de protenas, com pesos moleculares entre 45-50

KDa, dominantes na cepa WVU-1853. Estas protenas no se expressavam de forma

constante, foram classificadas como grupo MSPA e grupo MSPB e estavam relacionadas com

a interao com hemcias. Foi demonstrado que a MSPA uma hemaglutinina. Essas

protenas so codificadas por um nico gene, denominado vlhA, que possui alto grau de

identidade com o gene pMGA 1.7 de Mg (KLEVEN; FERGUSON-NOEL, 2008).

O sistema imune do hospedeiro estimulado pela ativao de macrfagos, moncitos,

clulas T helper e clulas NK, levando sintese do fator de necrose tumoral (TNF-),

interleucina 1 (IL-1), IL-2, IL-6, interferon , interferon e interferon (NASCIMENTO et

al., 2005). No entanto, o micoplasma possui a capacidade de variar os antgenos presentes na

membrana e, desta forma, se evadir do sistema imunolgico dos hospedeiros levando

colonizao dos tecidos do organismo (METTIFOGO; BUIM 2009; NASCIMENTO;

PEREIRA, 2009).

O micoplasma pode se manter em forma latente, dentro das clulas. Quando ocorre um

estado de debilidade do organismo, ocasionado de forma espontnea ou por presses

ambientais, como a presena de antimicrobianos no tecido dos hospedeiros, este pode se

manifestar (RAZIN; YOGEV; NAOT, 1998).

2.3.3 Caractersticas da doena

Os micoplasmas podem ser transmitidos por aerossis, atravs da cpula, transmisso

vertical pelo ovo, por contgio direto com outras aves ou indireto por meio de pessoas, rao,

gua e fmites. Dhondt et al. (2007) sugeriram que os comedouros para as aves de vida livre

poderiam ser fonte de contaminao de Mg para os pssaros.

42

O perodo de incubao da doena pode variar entre seis (06) e 21 dias

(NASCIMENTO; PEREIRA, 2009).

O Mg responsvel pela doena crnica respiratria em galinhas e pela infeco por

sinusite em perus (LEY, 2008). Nas aves de produo, causa a reduo do ganho de peso, a

diminuio da eficincia da converso alimentar, o aumento da taxa de mortalidade e o

aumento da condenao das carcaas (MACHADO et al., 2012). Em reprodutoras e aves de

postura, a doena pode causar uma diminuio da produo de ovos e o aumento da

mortalidade embrionria (NASCIMENTO et al., 2005; LEY, 2008).

Os sinais clnicos causados pela infeco por Mg so caracterizados pelo

comprometimento do sistema respiratrio, sendo que estes podem variar desde um edema

facial, at as secrees em traqueia, estertores em sacos areos. As leses anatomopatolgicas

exibem exsudatos aderidos parede da traqueia, acmulo de material caseoso em pulmes,

congesto e hemorragia pulmonar. Pode ocorrer tambm salpingite, perihepatite e pericardite,

resultando na condenao da carcaa em abatedouros (ISLAM, 2011).

A infeco crnica das vias areas inferiores na DRC (Doena Respiratria Crnica)

ocasiona morbidade e mortalidade, principalmente, em aves que esto concomitantemente

infectadas com outros vrus e bactrias (SILVA et al., 2008; ISLAM, 2011).

Nas infeces por Ms o sistema locomotor acometido, com edema articular em

membros plvicos, resultando em formao calosa na regio peitoral pelo apoio constante

desta regio. Ms pode ocasionar tambm aerossaculite, porm de forma assintomtica. A

queda na produo de ovos pode estar associada tanto a Mg como a Ms (NASCIMENTO;

PEREIRA, 2009; SILVA et al, 2008; ISLAM et al., 2011).

Mg e Ms podem ser diagnosticados por vrias tcnicas como a necropsia, o cultivo

bacteriano, e testes sorolgicos para se determinar a presena de anticorpos especficos ou

PCR (TIMENETSKY, 2009).

A heterogeneidade antignica pode comprometer os exames sorolgicos, uma vez que

as cepas utilizadas como antgenos podem no ser capazes de detectar os anticorpos induzidos

por Mg atpicos que estejam circulando no campo. Dificulta tambm a eficcia de novas

vacinas que possam induzir proteo contra diferentes isolados de campos (METTIFOGO;

BUIM, 2009).

Geralmente, a concentrao de anticorpos circulantes pode estar relacionada com a

reduo da gravidade das leses, porm no de forma eficaz, sendo sugerido que a proteo

pode ocorrer, principalmente, pela resposta local de IgG e IgA (YAGIHASHI; TAJIMA,

1986; ELLAKANY et al., 1998).

43

Os micoplasmas so sensveis maioria dos desinfetantes comuns (amnia

quaternria, compostos iodados, fenlicos, lcool). Assim como, aos antimicrobianos que

interferem na sntese dos aminocidos, cidos nuclicos e metabolismo dos lipdios, no

entanto, mostram resistncia a penicilina (LEY, 2008; KLEVEN, 2003; METTIFOGO;

BUIM, 2009). Christensen et al. (1994) demonstraram que Mg, Ms e M. iowae sobreviveram

nas penas de aves por dois (02) a quatro (04) dias e Mg foi capaz de permanecer no cabelo

por trs (03) dias, comprovando a resistncia destas bactrias fora do hospedeiro.

As cepas vacinais podem induzir s leses em aves expostas, o que tem acontecido

principalmente com vacinas vivas. O uso de antibiticos potentes como tetraciclinas,

macroldeos, quinolonas e tiamulina podem comprometer o diagnstico etiolgico de Mg e

Ms pela reduo da resposta imunolgica e dificuldade de isolamento bacteriano e deteco

por PCR (NASCIMENTO et al., 2005).

A instruo normativa n 44 de 23/08/2001 do PNSA, determina as medidas de

monitoramento da micoplasmose causada por Mg, Ms e Mm nas granjas de reproduo

(linhagens puras, bisavs e avs), produo de aves e de ovos frteis, de galinhas e perus.

Granjas que realizam o comrcio ou a transferncia nacional e internacional de seus produtos

destinados reproduo e produo de aves e ovos frteis. No caso do comrcio

internacional, os estabelecimentos avcolas devem estar certificados como livres de

micoplasmose aviria (Mg, Ms e Mm). A referida instruo normativa ainda prev a mesma

conduta para os estabelecimentos avcolas de matrizes de perus, entretanto, para matrizes de

galinhas, estabelece apenas aes de vigilncia para M. synoviae (BRASIL, 2009).

2.4 EXAMES LABORATORIAIS

2.4.1 Exames sorolgicos

Os mtodos sorolgicos so ferramentas laboratoriais de grande importncia na

medicina aviria, uma vez que possibilita o diagnstico de doenas e a monitoria do plantel

avcola. Esta deve fazer parte de um programa de monitoramento e preveno na indstria

avcola, pois os resultados podero contribuir para que medidas de segurana sejam instaladas

de forma a impedir que uma infeco se espalhe no plantel (SANTOS, 2009).

O monitoramento sorolgico de lotes de aves gera informaes sobre a prevalncia da

enfermidade pesquisada e permite avaliar a resposta imunolgica das vacinas que so usadas

44

(BERMUDEZ; STEWART-BROWN, 2003). Existe uma variedade de reaes sorolgicas

que podem ser utilizadas, de acordo com os objetivos da pesquisa diagnstica pretendida.

O programa de monitoria vlido quando um nmero adequado de amostras

avaliado e quando as anlises so realizadas durante um perodo de tempo. Desta forma,

possvel correlacionar o ttulo obtido com os problemas associados s criaes avcolas

(INOUE; CASTRO, 2009).

Diante das situaes de desafio, a deteco de anticorpos no soro torna-se possvel

entre uma a trs semanas aps a exposio ao agente infeccioso. Assim, a coleta pareada de

amostras obtidas tanto na fase aguda como na fase de convalescncia, so essenciais para o

diagnstico de uma enfermidade. Os resultados de uma nica coleta de soro apenas indicam

que o lote foi exposto ao agente infeccioso em algum momento da sua vida (INOUE;

CASTRO, 2009).

A utilizao de reaes para a triagem, seguidas de reaes para a confirmao do

agente so determinantes para o sucesso do diagnstico.

A reao de triagem deve apresentar elevada sensibilidade, baixo custo, alta

velocidade de processamento e possibilidade de automatizao. Os casos positivos devem ser

submetidos confirmao com testes que apresentem maior especificidade diagnstica,

maiores custos, baixa velocidade de processamento e impossibilidade de automatizao

(RITCHTZENHAIM; SOARES, 2007).

Os exames mais utilizados nos diagnsticos sorolgicos em aves de produo e

preconizados pelo MAPA consistem na soroaglutinao rpida em placa (SAR), inibio da

hemaglutinao (HI) e ensaio imunoenzimtico (ELISA). A sensibilidade e especificidade

apresentam variaes entre estes ensaios (LUCIANO et al., 2011). A presena de reao falso

positivo decorre da variao dos antgenos utilizados na preparao do teste e daqueles

encontrados nas cepas de campo, afetando a sensibilidade do teste sorolgico na dependncia

da prova utilizada (FEBERWEE et al., 2005, ASGHARZADE et al., 2012).

2.4.1.1 Soroaglutinao rpida em placa (SAR)

A soroaglutinao rpida em placa qualitativa, sensvel e de especificidade varivel.

utilizada na triagem para a pesquisa de ttulos contra Mg e Ms. Esta apresenta baixo custo e

de fcil execuo, ou seja, pode ser realizada em qualquer local, sem a necessidade de um

laboratrio (CARDOSO, 2009; SANTOS, 2009).

45

A reao de aglutinao envolve a interao entre partculas insolveis (bactria) que

contm os determinantes antignicos em sua superfcie e imunoglobulinas que apresentam, no

mnimo, dois stios de combinao ao antgeno. Quando ocorrem concentraes ideais destes

reagentes existir a formao de grumos ou reao de aglutinao positiva

(RITCHTZENHAIM; SOARES, 2007).

uma prova de eleio para a triagem de infeces por Salmonella spp. e

Mycoplasma spp.(CARDOSO, 2009). No entanto, a dificuldade na produo de antgenos

especficos pode resultar em reao falso positiva, sendo necessria uma prova

comprobatria.

Para Mg e Ms, os ttulos maiores ou iguais a 1:10 so considerados positivos, 1:5 so

considerados suspeitos e abaixo de 1:5 so considerados negativos (LUCIANO et al., 2011).

2.4.1.2 Reao de Inibio da Hemaglutinao (HI)

As glicoprotenas (hemaglutininas) de superfcie de alguns agentes infecciosos se

ligam a receptores mucopolissacardeos de membranas encontrados em eritrcitos, ocorrendo

a hemaglutinao. No entanto, para que ocorra esse processo necessrio que alm da

especificidade estrutural, o pH, a composio inica do meio e a temperatura estejam

adequados (SANTOS, 2009).

Alguns agentes como o vrus de Newcastle, influenza aviria, bronquite infecciosa,

sndrome da queda de postura, e bactrias como M. gallisepticum, M. synoviae e

Avibacterium paragallinarum apresentam a capacidade de hemaglutinao. Esta prova tem a

finalidade de titular a presena de anticorpos no soro que inibem a ao destes agentes

hemaglutinantes (CARDOSO, 2009).

O teste de HI uma prova sorolgica menos sensvel e mais especfica do que a

soroaglutinao rpida em placa e apesar de ser uma tcnica amplamente utilizada, pode no

detectar no teste, variantes antignicos que diferem das cepas usadas como antgeno

(FEBERWEE et al., 2005).

No caso de infeces por Mg pode-se considerar que ttulos iguais ou maiores que

1:80 so positivos, entre 1:20 e 1:40 so considerados suspeitos e abaixo de 1:20 so

negativos (LUCIANO et al. , 2011).

46

2.4.1.3 Ensaio imunoenzimtico (ELISA)

O teste ELISA foi desenvolvido nos anos 70, sendo utilizado incialmente na medicina

humana e posteriormente na medicina animal (SANTOS, 2009).

Esta reao utiliza um anticorpo marcado com uma enzima, que apresenta

especifidade ao fragmento Fc de uma imunoglobulina. Este anticorpo denominado de

conjugado. A enzima presente no conjugado reage com seu substrato e cromgeno,

produzindo cor. A intensidade de cor medida em espectofotmetro e quando esta intensa

indica que ocorreu uma reao entre o antgeno e o anticorpo (CARDOSO, 2009; SANTOS,

2009). Esta prova pode ser muito sensvel ou muito especfica, ou ambos na dependncia de

cada teste (CARDOSO, 2009). ELISA indireto usado para a deteco de anticorpos

presentes em um soro sanguneo. Neste ensaio, antgenos especficos so adsorvidos em pH

alcalino a uma fase slida (microplaca de poliestireno, com 96 cavidades). O antgeno

excedente removido atravs de lavagens e adicionado o soro no qual se quer detectar a

presena de anticorpos. Novas lavagens so realizadas para a retirada do excesso de

anticorpos e o conjugado adicionado. Novamente a placa lavada para a remoo do

conjugado e o substrato cromgeno so acrescentados para que se determine a concentrao

de anticorpos especficos presentes no soro sanguneo (RITCHTZENHAIN; SOARES, 2007;

SANTOS, 2009).

Assim como, na reao de inibio da hema