AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO E … · basicamente dos processos de transferência e transformações que ocorrem no ambiente (PRIMEL et al., 2005). Juntamente com o crescente

MATHEUS SOUZA SPAGIARI

AVALIAÇÃO DA CINÉTICA DE CRESCIMENTO E

CAPACIDADE DE SOBREVIVÊNCIA DE MICRORGANISMOS

CULTIVADOS EM MEIOS CONTENDO CONTAMINANTES

ORGÂNICOS E INORGÂNICOS

CANOAS, 2011






Trabalho de conclusão apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La salle – Unilasalle como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química.

Orientação: Prof. Dr. Delmar Bizani

CANOAS, 2011






Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química do Centro Universitário La salle - Unilasalle.

Aprovado pelo avaliador em 15 de Dezembro de 2011.

Avaliador:

_______________________________________________

Prof. Dr. Delmar Bizani

A minha família, pelo apoio que me

forneceram durante todo a minha vida

acadêmica.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus por estar sempre me guiando durante toda a minha vida.

Agradeço à minha mãe Lucy, por ter me ensinado a ser uma pessoa com

caráter, empenho e companheirismo em todos os dias da minha vida.

Agradeço a minha avó, por todo carinho e dedicação que teve por mim durante

todos esses anos, sempre acreditando que eu poderia ser uma pessoa com

sucesso.

Agradeço as minhas tias Luciane e Luz Mary, pelo apoio em todas as

dificuldades que tive durante minha maratona acadêmica.

Agradeço aos meus colegas de faculdade que se tornaram meus amigos

durante todo o processo de aprendizagem. Alguns passaram, mas outros continuam

até hoje ao final dessa jornada.

Meus agradecimentos especiais por este trabalho são para as pessoas que me

ajudaram a tornar isso tudo possível, são eles:

Agradeço à Profª. Ana Cunha, que me deu a primeira oportunidade de

conhecer o quanto é grande e, abrangente o mundo da pesquisa e sua

complexidade e, por todo conhecimento passado em minha vida acadêmica.

Agradeço também ao Jéferson, meu grande parceiro de ideias, pelo apoio à

primeira parte desse projeto.

Agradeço à Jéssica, técnica do laboratório de química, por todas as dicas, e

ajudas em que tive nesse período de procedimentos.

Aos professores, pelos conhecimentos obtidos durante todos os anos de

estudo, desde o ensino fundamental até a conclusão da graduação.

Meu agradecimento especial ao Prof. Delmar Bizani, por me mostrar como é

grande e magnifico o mundo da microbiologia, onde seres tão pequenos podem

realizar feitos tão grandes.

Obrigado a todos de coração, pelo apoio e companheirismo durante toda minha

vida de saber.

“O dia está na minha frente esperando para ser o que eu quiser. E aqui estou eu, o escultor que pode dar forma a esse dia.”

(Albert Einstein)

RESUMO

Com o aumento do desenvolvimento tecnológico e industrial, uma grande

quantidade de contaminantes, tanto de caráter industrial, agrícola ou de outro ramo

está aumentando no Brasil nessas últimas décadas. Inúmeras técnicas visam

diminuir essa agressão ao meio ambiente, mas infelizmente essas técnicas por si só

não são suficientes para o controle da degradação sofrida pelos recursos naturais. A

biorremediação pode ser considerada como uma nova maneira para o tratamento de

localidades impactadas mediante o uso de microrganismos capazes de modificar ou

decompor poluentes agressivos ao meio ambiente. O presente trabalho apresenta

um estudo sobre o comportamento fisiológico de microrganismos em solução

aquosa, juntamente com ação de contaminantes, para futuro potencial

biodegradador. Após a contaminação, a solução foi submetida a análises

microbiológicas para caracterização do crescimento microbiano, e averiguar a

atuação dos mesmos sobre essas substâncias. Obtendo-se comportamentos

diferentes perante os contaminantes.

Palavras-chave: Microrganismos, Contaminantes, Crescimento.

ABSTRACT

With increasing technological and industrial development, a large amount of

contaminants, both from an industrial, agricultural or other industry in Brazil is

increasing in these last decades. Numerous techniques aimed at reducing the harm

to the environment, but unfortunately these techniques alone are not sufficient to

control the degradation suffered by natural resources. Bioremediation can be

considered as a new way to treat localities impacted by the use of microorganisms

capable of decomposing pollutants modify or harmful to the environment. This paper

presents a study on the physiological behavior of microorganisms in aqueous

solution, together with the action of contaminants, potential for future biodegraded.

After contamination, the solution was subjected to microbiological analysis to

characterize the microbial growth, and assess the performance of the same on these

substances. Getting up before the contaminants behave differently.

Keywords: Microorganisms, Contaminants, Growth

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 11

2 HERBICIDAS ........................................................................................................... 13

2.1 Imidazolinonas ..................................................................................................... 13

2.2 Imazapic ® ............................................................................................................. 14

2.2.1 Estrutura Química ............................................................................................... 14

2.2.2 Modo de Ação e Toxicidade ............................................................................... 15

2.2.3 Comportamento no ambiente ............................................................................. 15

2.2.3.1 Solo ................................................................................................................. 15

2.2.3.2 Água ................................................................................................................ 16

3 METAIS PESADOS ................................................................................................. 17

3.1.Cromo ................................................................................................................... 17

3.1.1 Toxicidade .......................................................................................................... 17

3.1.2 Cromo no meio ambiente ................................................................................... 18

3.1.3 Legislação .......................................................................................................... 18

3.2 Manganês ............................................................................................................. 19

3.2.1 Toxicidade .......................................................................................................... 19

3.2.1.1 Efeitos Agudos ................................................................................................ 19

3.2.1.2 Efeitos Crônicos .............................................................................................. 19

3.2.2 Manganês no meio ambiente ............................................................................. 20

3.2.2.1 Água ................................................................................................................ 20

3.2.3 Legislação .......................................................................................................... 21

4 FLÚOR ..................................................................................................................... 22

4.1 Toxicidade ............................................................................................................ 22

4.1.1 Efeitos Agudos ................................................................................................... 22

4.1.2 Efeitos Crônicos ................................................................................................. 23

4.2 Flúor no meio ambiente ...................................................................................... 23

4.3 Legislação ............................................................................................................ 24

5 BIODEGRADAÇÃO ................................................................................................. 25

5.1 Mecanismos de Biodegradação ......................................................................... 25

5.1.1 Extensões da biodegradação ............................................................................. 25

5.1.2 Relação da biodegradação para conservação energia e crescimento ............... 26

5.1.3 Os benefícios de contaminantes que servem como doadores ou aceptores de elétrons ........................................................................................................................ 26

5.1.4 Desafios Associados ao Co-metabolismo ......................................................... 27

5.2 Fatores ambientais limitantes a biorremediação em campo ........................... 28

5.2.1 Substrato Primário .............................................................................................. 28

5.2.2 Outros Nutrientes ............................................................................................... 29

5.2.3 Temperatura ....................................................................................................... 29

5.2.4 Umidade ............................................................................................................. 30

6 MICROBIOLOGIA .................................................................................................... 31

6.1 Bactérias .............................................................................................................. 31

6.1.1 Pseudomonas spp. ............................................................................................. 31

6.1.2 Bacillus spp ........................................................................................................ 32

6.1.3 Serratia spp ........................................................................................................ 33

6.2 Fungos ................................................................................................................. 34

6.2.1 Aspergillus spp ................................................................................................... 35

6.2.2 Candida spp ....................................................................................................... 36

6.2.3 Penicillium spp ................................................................................................... 37

6.3 Plasmídeo ............................................................................................................ 38

7 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 39

7.1 Preparação dos contaminantes ......................................................................... 39

7.1.1 Preparação da solução de imazapic® ............................................................... 39

7.1.2 Preparação dos metais e fluoreto ....................................................................... 40

7.2 Planejamento dos experimentos ........................................................................ 40

7.2.1 Imazapic® .......................................................................................................... 40

7.2.2 Metais e fluoreto ................................................................................................. 41

7.3 Preparação dos meios de cultura e inoculação do s microrganismos ........... 42

7.4 Incubação dos microrganismos ......................................................................... 43

7.4.1 Preparação dos frascos ...................................................................................... 44

7.4.2 Preparação dos meios de cultura para a incubação ........................................... 44

7.4.2.1 Imazapic® ....................................................................................................... 44

7.4.2.2 Metais e Fluoreto ............................................................................................. 44

7.4.3 Incubação ........................................................................................................... 45

7.4.3.1 Imazapic® ....................................................................................................... 45

7.4.3.2 Metais e fluoreto .............................................................................................. 46

7.5 Contagem dos microrganismos ......................................................................... 46

8 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................. 49

8.1 Imazapic ............................................................................................................... 49

8.2 Metais e Fluoreto ................................................................................................. 52

9 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 58

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 59

11

1 INTRODUÇÃO

O Brasil demonstra nessas últimas décadas uma maior preocupação em

relação ao meio ambiente, há inúmeras técnicas visam diminuir essa agressão ao

meio ambiente, mas infelizmente essas técnicas por si só não são suficientes para o

controle da degradação sofrida pelos recursos naturais (ABBAS, 2003). Para

assegurar o manejo correto do meio ambiente é necessário que o desenvolvimento

seja de forma sustentável, e que o uso dos recursos naturais seja realizado com

responsabilidade e coerência, preservando e disponibilizando para as futuras

gerações (CARNEIRO; GARIGLIO, 2010).

Quando isso não é possível, uma alternativa deve ser utilizada, então os

reparos aos danos ambientais, devem ser feitos de forma rápida e de baixo custo,

porém é uma questão difícil de conciliar, pois os processos de manutenção do

ambiente estão associados a longos períodos e a altos custos. (ABBAS, 2003;

SILVEIRA; SPAREMBERGER, 2004).

Desde o início de seu desenvolvimento, a agricultura está plenamente

envolvida com a aplicação de produtos químicos para controlar as pestes que

atacam os produtos agrícolas, prejudicando as colheitas. A aplicação dessas

substâncias gera, comumente, grandes problemas. Os pesticidas muitas vezes são

tóxicos, podendo ser cancerígenos e mutagênicos, quando aplicados em uma maior

quantidade do permitido. Possuem grande persistência no meio ambiente, além de

gerar sérios problemas na qualidade das águas superficiais e subterrâneas. O efeito

decorrente do uso de produtos para o combate de pragas no ambiente depende

basicamente dos processos de transferência e transformações que ocorrem no

ambiente (PRIMEL et al., 2005).

Juntamente com o crescente desenvolvimento tecnológico e industrial, há uma

constante preocupação no mundo atual com a liberação de resíduos industriais

metálicos, pois podem causar danos em todo o ecossistema (CARLOS et al., 2007).

A utilização de metais nas indústrias de vários segmentos tem influenciado no

aumento de rejeitos industriais altamente tóxicos, que são lançados, na maioria dos

casos, no ambiente terrestre sem um tratamento antecipado. Uma vez no meio

ambiente sob a forma de um contaminante, os metais pesados mostram-se

biodisponíveis a serem utilizados pelos microrganismos (MATHIAS, 2008).

12

A biorremediação pode ser considerada como uma nova estratégia para o

tratamento de locais impactados mediante o uso de microrganismos capazes de

modificar ou decompor poluentes. As estratégias de biorremediação incluem a

utilização de microrganismos autóctones, ou seja, da própria área a ser revitalizada,

a adição de agentes estimulantes como nutrientes, oxigênio e biossurfactantes

(bioestimulação), e a inoculação de consórcios microbianos enriquecidos

(bioaumento). O benefício desses processos é a mineralização do poluente, isto é, a

transformação em gás carbônico, água e biomassa (BENTO et al., 2003).

Por isso a técnica de biorremediação tem sido um processo de crescente

utilidade e uso para o controle de compostos que afetam e prejudicam o meio

ambiente, pois tem como vantagem oferecer um maior aproveitamento e uma menor

agressão ao ambiente em que é utilizada, além de ser uma ferramenta de baixo

custo. (ABBAS, 2003; SANTOS, et al., 2007).

Esse trabalho tem como objetivo avaliar de forma exploratória o potencial da

utilização dos microrganismos Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Serratia

marcenscens, Candida albicans, Aspergillus fumigatius e Penicillium notatum na

degradação de manganês, cromo, fluoreto e do herbicida agrícola imazapic® em

água. Esses compostos foram escolhidos, por apresentarem um histórico de

poluição e contaminação em águas provenientes de áreas de agricultura, e caráter

industrial.

13

2 HERBICIDAS

Herbicidas são compostos químicos que quando aplicados às plantas em

concentrações convenientes, tanto sobre as folhas como na parte subterrânea,

matam ou inibem o seu crescimento normal (DE SOUZA, 2009).

O uso de herbicidas deve visar o controle eficiente das plantas daninhas,

mínimo de fitotoxicidade sobre a cultura, mínimo de agressividade ao meio

ambiente, mínimo de toxicidade aos animais e ser econômico (DE SOUZA, 2009).

Grupos mais modernos de herbicidas como imidazolinonas e sulfoniluréias são

aplicados em doses reduzidas, normalmente menos que 150 g/ha. Apresentam a

grande vantagem de agredir menos o meio ambiente, porém, o agricultor está mais

sujeito a insucesso devido ao fato de que pequenos erros podem levar ao prejuízo

do não controle (erro para menos na dose) ou dano à cultura (erro para mais na

dose) (DE SOUZA, 2009).

2.1 Imidazolinonas

Os herbicidas integrantes do grupo das imidazolinonas são: imazapyr,

imazapic, imazethapyr, imazamox, imazamethabenz e imazaquin, que contêm em

suas moléculas uma estrutura em comum, o imidazol, separando-se em três

subgrupos com base em uma segunda estrutura cíclica (Figura 1). O imazaquin tem

um grupo quinolina; o imazamethabenz, um anel benzeno; e as outras

imidazolinonas, um anel piridina. A este último grupo, piridina imidazolinona,

pertencem quatro moléculas, que se diferenciam por um radical unido ao carbono 5

do anel piridina. O imazapyr apresenta um hidrogênio (H) no lugar do radical (R); o

imazapic, um grupo metil (CH3); o imazethapyr, um grupo etil (CH3-CH2); e o

imazamox, um grupo metoximetil (CH3-O-CH2) (KRAEMER et al., 2009).

14

Figura 1: Estruturas químicas dos herbicidas do grupo das Imidazolinonas: imidazolinona piridina, imidazolinona benzeno e imidazolinona quinilona.

Fonte: KRAEMER et al., 2009

2.2 Imazapic ®

2.2.1 Estrutura Química

O Imazapic®1 pertence ao grupo das Imidazolinonas piridinas, onde possui um

anel piridina ligado ao grupo imidazol. Difere-se dos outros compostos do mesmo

grupo, pelo fato de apresentar o radical metil (CH3), ligado ao carbono 5 do anel

piridina (TU et al, 2001).

O herbicida imazapic possui nomenclatura de (±)-2-[4,5-dihydro-4-methyl-4-(1-

methylethyl)-5-oxo-1H-imidazol-2-yl]-5-methyl-3-pyridinecarboxylic acid, segundo a

IUPAC (TU et al, 2001).

Imazapic possui duas estruturas ao qual se relaciona no ambiente. Uma delas

é na forma de ácido Imazapic, onde possui um radical metil ligado ao anel piridina, e

a outra forma é de um sal amoníaco, onde além de possuir o radical metil ligado ao

radical piridina, há também a presença de um cátion NH4+ ligado ao ânion COO-

(Figura 2) (TU1 et al., 2001).

1 Fabricante Shanghai Tochance Chemicals Co., Ltd.,China.

15

Figura 2: Estruturas do Imazapic no ambiente.

Fonte: TU et al., 2001

2.2.2 Modo de Ação e Toxicidade

A ação do herbicida é resultado da redução dos níveis de 3 (três) aminoácidos

alifáticos de cadeia ramificada (valina, leucina e isoleucina), através da inibição do

ácido hidroxiacético sintetase (AHAS), uma enzima comum na via biosintética

desses aminoácidos. Esta inibição interrompe a síntese protéica, que por sua vez

interfere na síntese de DNA e no crescimento celular (TU et al., 2001).

A taxa de morte da planta é geralmente lenta (várias semanas), e

provavelmente está relacionada à quantidade de aminoácidos armazenados

disponíveis para a planta. Apenas as plantas possuem AHAS, e podem produzir os

aminoácidos valina, leucina e isoleucina. Portanto, o Imazapic é de baixa toxicidade

para insetos, peixes e outros animais (TU et al., 2001).

2.2.3 Comportamento no ambiente

2.2.3.1 Solo

Com bases em estudos de dissipação no campo, Imazapic é moderadamente

persistente em solos com um DT50 (tempo necessário para a concentração do solo

atingir 50 % da concentração inicial média) de 7-150 dias dependendo do tipo de

solo e condições climáticas. Imazapic limitou a mobilidade horizontal do solo, e

geralmente se move de 6 a 12 polegadas, embora possa chegar a profundidades de

16

18 polegadas em solos arenosos. A principal via de degradação do herbicida é

através da ação microbiana (TU et al., 2001).

2.2.3.2 Água

Imazapic é solúvel em água com uma concentração de 2200 mg L-1 à 25oC, e

não degrada-se hidroliticamente em solução aquosa, no entanto, rapidamente

fotodegradado pela luz solar, com um tempo de meia-vida de 1-2 dias (TU et al.,

2001).

17

3 METAIS PESADOS

Por definição, metais pesados são elementos que têm peso específico maior

que 5 g cm-3. A expressão metal pesado também é usada para designar os metais

classificados como poluentes do ar, água, solo, plantas e alimentos, ou seja, do

meio ambiente. Alguns deles são benéficos em pequenas concentrações para os

microrganismos, plantas e animais; porém, em quantidades mais altas do que o

normal, tornam-se perigosos, pois são introduzidos na cadeia alimentar, podendo

contaminar os alimentos consumíveis pelo homem (JORDÃO et al., 2000).

3.1 Cromo

O cromo é um metal pesado, obtido através do minério da cromita (FeCr2O4).

Na tabela periódica está localizado no grupo VI-B, onde no estado fundamental os

elétrons ocupam os níveis mais baixos de energia. Pode ser encontrado em alguns

estados de oxidação, sendo os estados mais importantes o Cr(II) (redutor), Cr(III)

(mais estável) e o Cr(VI) (oxidante) (CONCEIÇÃO, 2006).

No ambiente pode encontrar-se naturalmente como Cr(III) ou Cr(VI) ou pela

contaminação gerada por resíduos de curtimento de peles, do refino de petróleo, da

indústria metalúrgica ou do tratamento da madeira. A forma mais agressiva é a

hexavalente, geralmente ligada ao oxigênio. Devido a sua menor solubilidade, a

forma trivalente e menos tóxica e pode ser achada como óxidos, hidróxidos ou

sulfatos (CONCEIÇÃO, 2006).

3.1.1 Toxicidade

Milhares de pessoas estão comumente expostas ao cromo em seus locais de

trabalho. A exposição ao Cr(III) e ao Cr(VI) torna-se mais grave quando há risco de

inalação. Outras fontes de contaminação são os cigarros, fumaça de automóveis,

emissões vulcânicas, alimentos e água contaminada. Entre as lesões causadas pela

intoxicação por cromo, pode-se citar câncer na cavidade nasal, hemorragia nasal,

irritação da mucosa nasal e úlceras. A manipulação de compostos contendo cromo

18

pode causar úlcera de pele e forte alergia, sendo considerado o metal que mais

causa alergias em humanos (CONCEIÇÃO, 2006).

3.1.2 Cromo no meio ambiente

A produção mundial de cromo está na contagem de 10 milhões de toneladas

por ano, sendo usado em vários segmentos industriais. Esta grande demanda pode

tornar o cromo um sério agente poluidor do ar, água e solo. A concentração média

deste metal em água doce não poluída é de 0,1 a 0,5 mg L-1 e em oceanos de

0,0016 a 0,05 mg L-1, porém efluentes industriais lançados no ambiente, que não

possuírem um tratamento antecipado, podem conter concentrações muito elevadas

de cromo (CONCEIÇÃO, 2006).

O cromo é o sétimo elemento mais abundante na terra, sendo que sua

concentração média nos solos varia de 5 a 250 mg Kg-1. Por ser um forte agente

oxidante da matéria orgânica, o Cr(VI) tem sido considerado um elemento estável

em solos ácidos, por ser rapidamente reduzido a Cr(III) (CONCEIÇÃO, 2006).

O Cr(III) é encontrado em muitos suplementos alimentares. É considerado um

micronutriente necessário para a atividade biológica da insulina e para o

metabolismo de carboidratos em seres humanos (CONCEIÇÃO, 2006).

3.1.3 Legislação

A resolução CONAMA nº 357 determina que o limite máximo de lançamento de

cromo total em efluentes, possua uma concentração máxima de 0,5 mg L-1

(CONAMA, 2005).

3.2 Manganês

O manganês é um metal de transição do grupo VII-b da tabela periódica. Como

os outros elementos de transição, devido à sua configuração eletrônica, possui

algumas propriedades características, como possuir várias formas e estados de

oxidação (0 a +7) e pode formar vários compostos coloridos e paramagnéticos. É o

metal de transição mais abundante após o ferro e o titânio e os compostos mais

comuns são formados nos estados de oxidação +2, +3 e +7 (WHO, 1981).

19

O manganês é um metal que tem estabilidade normal. Geralmente, forma

óxido-compostos como produtos de combustão e decomposição térmica e, quando

em concentração suficiente, na forma de finas partículas dispersas, tem potencial de

incêndio moderado, podendo formar misturas explosivas no ar (WHO, 1981).

3.2.1 Toxicidade

3.2.1.1 Efeitos Agudos

A toxicidade oral e dérmica do manganês é pouco significativa devido à baixa

solubilidade do metal. Estudos sugerem que exposição a altas concentrações

ambientais pode ocasionar inflamação nos pulmões (pneumonia química). Alta

incidência de pneumonia tem sido associada a concentrações acima de 210 mg m-3

de Mn, no ambiente de trabalho (BARCELOUX, 1999).

3.2.1.2 Efeitos Crônicos

O risco de doenças pulmonares originadas da exposição ambiental é pequeno,

mas existem evidências de um aumento de prevalência e sintomas respiratórios que

ocorrem próximos às fontes de Mn, tais como as indústrias de ferromanganês

(BARCELOUX, 1999).

Em pessoas expostas ao Mn, o manganismo ou loucura mangânica, é

caracterizado pela deterioração da função neurológica que se inicia com sintomas

inespecíficos e sinais neurológicos subclínicos. Estes sintomas incluem anorexia,

apatia, artralgia, astenia, dor de cabeça, irritabilidade, letargia e fraqueza nas

extremidades (BARCELOUX, 1999).

3.2.2 Manganês no meio ambiente

O manganês é um elemento amplamente distribuído na crosta terrestre, água e

atmosfera, na forma particulada. Esse elemento é o 5º metal e o 12º elemento mais

abundante na crosta terrestre, sendo o principal componente metálico nos nódulos,

que são pontos ou cavidades nos quais há uma concentração de minerais,

20

depositados nos oceanos. É, também, um elemento abundante nas rochas ígneas,

sedimentárias e metamórficas (MENA, 1980).

No solo, suas concentrações dependem das características geotérmicas, das

transformações ambientais dos compostos de manganês naturalmente presentes,

da atividade de microrganismos e da incorporação pelas plantas (WHO, 1981). A

erosão do solo é uma das mais importantes fontes naturais de manganês. O

manganês ocorre em quase todos os tipos de solo, na forma divalente ou

tetravalente, nos quais a concentração varia de 40 a 900 mg kg-1, dependendo da

atividade de mineração, pode-se atingir níveis em torno de 7000 mg kg-1

(BARCELOUX, 1999).

3.2.2.1 Água

O conteúdo aquático de manganês é proveniente do solo e das rochas. Nos

oceanos, o manganês é encontrado, principalmente, na forma de dióxido (MnO2),

produzido através da ação de bactérias sobre os sais do metal. O transporte do

manganês é favorecido, principalmente, pelas variações de pH e estudos

demonstram que em meio ácido, circula na forma livre podendo atingir águas

subterrâneas e se precipitar, quando níveis médios de pH são atingidos, resultando

num aumento de manganês no sedimento (WHO, 1981).

O material particulado suspenso na água pode conter concentrações

consideráveis de manganês. Nos oceanos, as concentrações de partículas são

menores que as concentrações do metal dissolvido. Todavia, nos rios são maiores

as quantidades encontradas devido à possibilidade de ressuspensão do material no

leito (WHO, 1981).

Pesticidas e fertilizantes são identificados como principais fontes de

contaminação do solo que se somem à carga de Mn naturalmente presente nas

águas doce e salgada (BARCELOUX, 1999).

3.2.3 Legislação

A resolução CONAMA Nº 357 determina que o limite máximo de lançamento de

manganês dissolvido em efluentes, possua uma concentração máxima de 1,0 mg L-1

(CONAMA, 2005).

21

4 FLÚOR

O flúor deriva do fato de ser encontrado no mineral fluorespato, que é

basicamente o fluoreto de cálcio (CaF2), usado como fundente (fluxo) em soldas

(PEIXOTO, 1998).

O flúor é o 13º elemento mais abundante na crosta terrestre e, também, o mais

eletronegativo dos halogênios, grupo que inclui ainda o cloro, o bromo e o iodo

(NARVAI, 2000). Possui grande capacidade de reagir com outros elementos

químicos, formando compostos orgânicos e inorgânicos, e é raramente encontrado

em seu estado rudimentar, geralmente está na forma iônica, eletrovalente ou

covalente (ELLWOOD; FEJERSKOV, 2005).

4.1 Toxicidade

4.1.1 Efeitos Agudos

Como a maioria dos materiais solúveis, compostos de flúor são prontamente

absorvidas pelo estômago, intestino e excretado pela urina. Vestígios são

incorporados no osso. A urina tem sido utilizada para determinar as taxas de

excreção, a fim de definir os limites máximos de exposição a compostos de flúor e

associados aos efeitos prejudiciais à saúde. A ingestão de fluoreto primeiramente vai

interagir localmente na mucosa intestinal, onde se forma o ácido fluorídrico no

estômago. Posteriormente, este se liga ao cálcio e interfere em várias enzimas

(NOCHIMSON, 2008).

A intoxicação vem da ingestão de uma grande quantidade de flúor em um curto

período de tempo. Ingerir 3–5 mg kg-1 pode causar que os sintomas apareçam,

enquanto que a dose letal estimada é de 5-10 g (32–64 mg kg-1) em adultos e 16 mg

kg-1 em crianças. A severidade dos sintomas depende da quantidade de flúor

ingerida. Estes incluem dor abdominal, diarreia, disfagia, hipersalivação, lesão da

mucosa, náuseas, vómito. Os sintomas neurológicos incluem dor de cabeça,

fraqueza muscular, hiperreflexia, espasmos musculares, convulsões de parestesias,

contrações tetânicas, e tremores. Em casos graves, falência de órgãos múltiplos

poderá ocorrer. Morte normalmente resulta de paragem cardíaca, choque e

ocorrência de várias arritmias (NOCHIMSON, 2008).

22

4.1.2 Efeitos Crônicos

O flúor ingerido em baixas doses, por período prolongado, está relacionado

com alterações dentárias e ósseas. O íon fluoreto atua de maneira tóxica

precipitando o cálcio, elemento essencial a várias funções fisiológicas, em particular

aos tecidos musculares e nervosos. Na toxicidade crônica do flúor, pela sua

afinidade com os fosfatos, forma a fluorapatita; e com o cálcio forma o fluoreto de

cálcio, pouco solúvel. Sendo assim, os tecidos ósseo e dentário, portadores de uma

elevada porcentagem de cálcio e fosfato, podem sofrer os efeitos tóxicos do flúor,

resultando em alterações dentárias, como fluorose; e óssea, como a

hipercalcificação ou calcinose (CHIOCA et al., 2009).

4.2 Flúor no meio ambiente

O flúor é amplamente conhecido como poluidor do meio ambiente e uma das

fontes são as fábricas de fertilizantes. A poluição por fluoreto, nas proximidades

dessas fábricas, tem sido intensamente estudada nos diferentes meios como: ar,

águas, plantas e solos. A maioria dessas contribuições aborda os efeitos das

emissões industriais sobre o desenvolvimento de plantas terrestres, no entanto, não

se encontram estudos sobre a distribuição de fluoreto em águas (MIRLEAN, 2002).

4.3 Legislação

A resolução CONAMA Nº 357 determina que o limite máximo de lançamento de

flúor, sob a forma de fluoreto total em efluentes, possua uma concentração máxima

de 10 mg L-1 (CONAMA, 2005).

23

5 BIODEGRADAÇÃO

5.1 Mecanismos de biodegradação

Muitos contaminantes do ambiente estão sujeitos a reações de caráter químico

ou fotoquímico. Entretanto, organismos biológicos – particularmente microrganismos

– desempenham um importante papel na remoção de compostos orgânicos

perigosos ao meio ambiente. Transformações termodinamicamente viáveis de

poluentes, muitas vezes não acontecem na ausência de um catalisador biológico,

devido a limitações cinéticas, mas são facilitadas por microrganismos, que através

de enzimas reduzem a energia de ativação, que precisa ser superada, para uma

reação aconteça (MITCHELL; GU, 2010).

5.1.1 Extensões da biodegradação

O termo biodegradação é utilizado para descrever a transformação biológica de

contaminantes orgânicos em outros compostos que possuam uma energia livre mais

baixa. Assim, a biodegradação refere-se a reações de biotransformação que

resultam em apenas pequenas alterações nas estruturas dos contaminantes, bem

como a mineralização, que é a conversão de compostos orgânicos em seus

constituintes inorgânicos (H2O, CO2, NO3-, SO4

2-, PO43- e Cl-). Em muitos casos, as

reações de biotransformação geram produtos que tenham níveis de toxicidade

semelhante ou superiores dos componentes primários. Em contraste, os produtos

inorgânicos da mineralização normalmente não apresentam riscos para a saúde na

concentração produzida através da biodegradação (MITCHELL; GU, 2010).

5.1.2 Relação da biodegradação para a conservação de energia e crescimento

A transformação de contaminantes e desintoxicação é muitas vezes

relacionada com a capacidade de um organismo de conservar energia e crescer

através de uma reação de biodegradação. Mineralização completa de um

contaminante é frequentemente o resultado de um processo metabólico e está

ligada à conservação de energia e síntese de biomassa. Em contraste,

24

biotransformações podem causar apenas pequenas alterações na estrutura do

contaminante, e são muitas vezes o resultado de processos co-metabólicos, que não

geram energia livre de carbono ou que podem ser usados pelas células para a

realização de reações. Embora existam definições alternativas, o termo co-

metabolismo é geralmente aplicado para ambas às reações que ocorram apenas na

presença de um substrato de crescimento, bem como as reações que ocorrem sem

o crescimento concomitante dos organismos (MITCHELL; GU, 2010).

Compostos que suportam o crescimento microbiano são conhecidos como

substratos primários. Os substratos co-metabólicos são chamados de substratos

secundários, porque eles não sustentam o crescimento. Alguns compostos podem

servir como substratos primários em concentrações relativamente altas, mas pode

agir como substratos secundários, quando eles estão presentes em níveis abaixo

Smin, o limiar de concentração necessária para suprir o organismo com energia

suficiente para o crescimento líquido (MITCHELL; GU, 2010).

5.1.3 Os benefícios de contaminantes que servem como doadores ou aceptores de

elétrons

A biorremediação é a técnica que consiste na aplicação de processos

biodegradáveis no tratamento de resíduos para recuperar e regenerar ambientes

(principalmente água e solo) que sofreram impactos negativos, mantendo o

equilíbrio biológico em ecossistemas. Também é chamada de biotecnologia

ambiental, por usar, de forma controlada, processos microbiológicos que ocorrem

normalmente na natureza para remover poluentes. Especificamente, a

biorremediação atua através da introdução de processos biológicos adicionais para

a decomposição dos resíduos que favorecem e incrementam a velocidade do

processo natural de degradação. A grande maioria dos compostos orgânicos

conhecidos, de origem animal ou vegetal, bem como muitos agentes químicos

tóxicos, pode ser biodegradável através de técnicas de biorremediação (MITCHELL;

GU, 2010).

A biorremediação é facilitada por processos de biodegradação metabólica. O

tamanho médio da população microbiana influencia a taxa em que ocorre à reação

de biodegradação. Assim, processos de biodegradação metabólica tendem a ser

autocatalíticos (ou seja, aumentando a população, a taxa de biodegradação tende a

25

crescer sobre o contaminante). As populações que podem realizar reações de

biodegradação metabólica selecionam os contaminantes que servem como

substratos para o seu crescimento. Em contraste, os substratos para o crescimento

necessários para manter ou aumentar as populações realizam biotransformações

co-metabólicas, que geralmente não enriquece especificamente essas populações, e

também podem ser utilizados por microrganismos que não contribuem para a

remoção dos contaminantes. Ambos compostos, que sejam doadores e receptores

de elétrons devem ser fornecidos às populações que realizam biotransformações co-

metabólicas, porque os contaminantes não preenchem qualquer um destes papéis

nutricionais. Nas reações metabólicas de biodegradação, o contaminante serve tanto

como doador de elétrons ou aceptor, portanto, em geral, apenas os substratos de

crescimento complementares devem estar disponíveis para garantir que a

biodegradação ocorra (MITCHELL; GU, 2010).

5.1.4 Desafios associados ao Co-metabolismo

Em muitos casos, o co-metabolismo pode ser prejudicial para as células,

porque desvia a energia de crescimento e/ou gera produtos que são altamente

reativos e, portanto, tóxicos para as células (MITCHELL; GU, 2010).

Transformações co-metabólicas não podem ser mantidos sem o substrato(s)

necessários para sustentar o crescimento do organismo e, em muitos casos, para

induzir a enzima. Ao mesmo tempo, o substrato de crescimento, muitas vezes,

compete com o substrato co-metabólico pela enzima. Como resultado desses efeitos

de inibição competitiva, produtos de reação tóxica e/ou as demandas de energia de

reações co-metabólicas, a taxa máxima de uma reação co-metabólica pode ser de

10 a 100 vezes menor que a do substrato de apoio ao crescimento. Assim,

numerosos desafios devem ser superados para gerenciar o crescimento microbiano

e a biodegradação de contaminantes e implementar com sucesso, a biorremediação

com base nas reações co-metabólicas (MITCHELL; GU, 2010).

26

5.2 Fatores ambientais limitantes a biorremediação em campo

5.2.1 Substrato primário

Se a concentração de um contaminante é muito baixa para suportar o

crescimento (ou seja, S < Smin), ou pode não suportar o crescimento por algum outro

motivo, deve ser degradado como um contaminante secundário. Por outro lado, altas

concentrações de um contaminante que é usado como substrato primário, pode ser

inibitória ou fazer com que o substrato de crescimento complementar e/ou nutrientes

se torne limitante. Por exemplo, altas concentrações de hidrocarbonetos que servem

como um doador de elétrons em solo ou água subterrânea pode rapidamente

consumir o oxigênio dissolvido na água ou de gás presentes em poros. É importante,

porque alguns contaminantes são apenas biodegradados sob condições aeróbias,

enquanto muitas taxas de biodegradação de contaminantes são mais rápidas em

condições aeróbias do que em anaerobiose. Como resultado, muitas tecnologias de

biorremediação focam na adição de oxigênio (MITCHELL; GU, 2010).

Um número de receptores de elétrons que não seja oxigênio está muitas vezes

presente no meio ambiente de subsuperfície e muitos compostos orgânicos podem

ser biodegradados anaerobicamente. Depois do consumo do oxigênio, altos níveis

de contaminação também podem esgotar rapidamente a esses receptores de

elétrons anaeróbicos, e a taxa natural de reposição tende a ser muito lenta. Assim, o

acoplamento de transporte de massa pelo fluxo de águas subterrâneas e a reação

microbiana é provável que resulte em gradientes das concentrações do receptor de

elétrons. Com base na energia livre liberada durante a respiração, uma progressão

em condições redox pode ocorrer ao longo do caminho do fluxo de água subterrânea

se afastando de uma zona contaminada, com os microrganismos heterotróficos

previstos para uso em sequência a sucessão seguinte de receptores de elétrons:

oxigênio, nitrato, Mn(IV) e Fe(III), sulfato e dióxido de carbono (MITCHELL; GU,

2010).

5.2.2 Outros nutrientes

Microrganismos quimiotróficos exigem macronutrientes, elementos menores e

traços, e fatores de crescimento para a síntese de materiais celulares. Se todos os

27

requisitos nutricionais celulares não são satisfeitos, a biodegradação pode parar, no

entanto, o foco é geralmente na disponibilidade de N e/ou P. Doses de N e P

apropriadas podem ser calculadas usando estequiometria, e em aplicações de

biorremediação in situ muitas vezes incluíram a adição de nutrientes inorgânicos.

Enquanto muitos estudos de laboratório indicam que adições de nutrientes

aumentam as taxas de degradação, muitas vezes pouco efeito é observado no

campo (MITCHELL; GU, 2010).

5.2.3 Temperatura

As temperaturas do solo e águas subterrâneas flutuam sazonalmente a uma

profundidade de aproximadamente 10 m, abaixo do qual a temperatura da água

subterrânea é determinada em grande parte pela região, e é a temperatura média

anual. Temperatura é um fator-chave que afeta o crescimento microbiano e as taxas

de biotransformação. Em geral, as taxas de biodegradação diminuem com a

temperatura, no entanto, os efeitos da temperatura podem ser complexa

(MITCHELL; GU, 2010).

5.2.4 Umidade

Níveis de umidade inadequada pode severamente restringir a biodegradação

em solos superficiais, que estão sujeitos à secagem aos níveis de qualidade inferior,

principalmente quando o fluxo de ar ocorre em solos insaturados. O nível de

umidade ideal para uma determinada situação é uma função das propriedades do

solo, características de contaminantes e necessidades de oxigênio. Quando os

níveis de umidade são altos, o nível de oxigênio diminui e logo se torna anaeróbico,

devido à baixa taxa de difusão de oxigênio através da água. No entanto, as taxas de

degradação também diminuem se os níveis de umidade ficar demasiado baixo

(MITCHELL; GU, 2010).

28

6 MICROBIOLOGIA

6.1 Bactérias

As bactérias são seres unicelulares aclorofilados, microscópicos, que se

produzem por divisão binária. Elas são células esféricas ou em forma de bastonetes

curtos com tamanhos variados, alcançando às vezes micrômetros linearmente. Na

maioria das espécies, a proteção da célula é feita por uma camada extremamente

resistente, a parede celular, havendo imediatamente abaixo uma membrana

citoplasmática que delimita um único compartimento contendo DNA, RNA, proteínas

e pequenas moléculas (UFSC, 2003).

A habilidade em dividir-se de maneira rápida possibilita populações de

bactérias a se adaptar às mudanças de ambiente. In vitro, por exemplo, uma

população de bactérias mantida em uma dorna de biorreator evolui dentro de poucas

semanas por mutações de seleção natural para utilização de novos tipos de

carboidratos como fonte de carbono e de energia (UFSC, 2003).

6.1.1 Pseudomonas spp.

Pseudomonas é o gênero incluído nas γ-proteobactérias pertencentes à família

Pseudomonadaceae. São bastonetes gram-negativos que podem ser móveis por

flagelos polares ou imóveis. Diversas espécies de Pseudomonas podem ser isoladas

de habitats naturais (água, solo, plantas) e, devido a sua ampla distribuição no

ambiente e facilidade de cultivo, esse gênero constitui-se em dos grupos bacterianos

melhor estudados. Os papéis desempenhados por Pseudomonas no ambiente

incluem a biodegradação de compostos naturais e xenobióticos, promotores de

crescimento de plantas e patógenos de plantas. Pseudomonas é ainda um gênero

de grande importância em processos industriais envolvendo biotransformação. No

gênero Pseudomonas encontramos, ainda, P.aeruginosa, que é um patógeno

humano oportunista que pode causar sérias infecções (PEIXOTO, 2008).

A seguir a figura 3 apresenta o gênero Pseudomona spp.

29

Figura 3: Pseudomonas spp

Fonte: Pseudomonas Genoma Data, 2011

6.1.2 Bacillus spp

O Gênero Bacillus pertence a microrganismos gram – positivos aeróbicos ou

facultativos, formadores de endósporos que podem ser isolados do solo e plantas de

todo o mundo, sendo capazes de sintetizar e excretar diversas enzimas proteolíticas

durante sua fase de crescimento e esporulação. Eles crescem bem em um meio

simples e produzem as enzimas hidrolíticas, como as proteases, mananases e

glucanases, independente do meio de cultura usado. Nunca foi reportado sobre a

patogenicidade dos microrganismos deste gênero, que tem sido utilizado

extensivamente na produção industrial de exoenzimas (PALLADINO, 2008).

Espécies de Bacillus geralmente crescem bem em meios definidos contendo

várias fontes de carbono. Muitos Bacillus produzem enzimas hidrolíticas

extracelulares que degradam polímeros complexos, como polissacarídeos, ácidos

nucléicos e lipídeos, permitindo aos organismos utilizarem esses produtos como

fontes de carbono e doadores de elétrons. Vários Bacillus produzem antibióticos

como, por exemplo, a bacitracina, poliximina, tirocidina, gramicidina e circulina. Na

maioria dos casos, a produção de antibióticos está relacionada ao processo de

esporulação (PALLADINO, 2008). A seguir a figura 4 apresenta o gênero Bacillus sp.

30

Figura 4: Bacillus spp.

Fonte: Pseudomona Genoma Data, 2011.

6.1.3 Serratia spp

Serratia é um gênero de bactéria gram-negativa, anaeróbia facultativa. É um

bacilo da família Enterobacteriaceae cuja espécie mais comum é a S. marcescens,

que normalmente causa infecção nosocomial (ANI, 2007).

A Serratia é reconhecida como um patógeno importante, com propriedades

invasivas e alta resistência a muitos antibióticos utilizados na atualidade. Em

determinada ocasião, essa bactéria foi utilizada como comensal inócuo para detectar

contaminação, a princípio devido à característica pigmentação vermelha de algumas

cepas, de fácil detecção em meios de cultura (MENEZES, 2004).

A Serratia pode ser implicada em várias doenças infecciosas e podem ser

isoladas de qualquer amostra recebida em laboratório clínico. Os pacientes

imunocomprometidos ou debilitados são altamente susceptíveis às infecções

adquiridas no hospital, após colonização com cepas ambientais ou contaminação a

partir de procedimentos invasivos. Podendo causar pneumonia, bacteremia e

endocardite, sobretudo em usuários de narcóticos ou drogas e pacientes

hospitalizados (MENEZES, 2004).

As espécies de Serratia produzem as enzimas lipase, gelatinase e Dnase que

são importantes fatores de sua patogenicidade. A resistência à colistina e à

cefalotina é uma característica diferencial adicional. O gênero Serratia é considerado

atualmente uma bactéria emergente, causando infecções hospitalares graves

(MENEZES, 2004). A seguir a figura 5 apresenta o gênero Serratia sp.

31

Figura 5: Serratia spp.

Fonte: Science photo library, 2011.

6.2 Fungos

Os fungos são seres heterótrofos, incapazes de produzir substâncias orgânicas

a partir de elementos inorgânicos; não possuidores de clorofila ou qualquer outro

pigmento que lhes permita utilizar luz como fonte de energia. Armazenam glicogênio

e não formam tecidos verdadeiros assim, para seu desenvolvimento, exigem sempre

fonte orgânica de carbono para suas necessidades estruturais e energéticas. Suas

células são extremamente individualizadas, sendo capazes de liberarem exoenzimas

para decomposição e obtenção de nutrientes, capazes de produzir metabólitos

complexos como exotoxinas e, se isoladas, reproduzem-se para formação de uma

nova colônia. São aeróbios, tendo metabolismo respiratório que exige a presença de

oxigênio como aceptor de íons hidrogênio, o que explica a prevalência de

desenvolvimento em superfícies corpóreas ou sua localização em extratos

superficiais do solo. Os fungos de interesse clínico apresentam polimorfismo, ou

seja, podem alterar sua morfologia de acordo com o ambiente em que estão se

desenvolvendo (ZAMPRONHA et al., 2005).

Os fungos, em sua maioria, quando cultivados a 25oC em meios comuns,

crescem sob a forma filamentosa ou de bolores. No hospedeiro ou em meios

específicos a 37ºC, podem adquirir a forma de levedura. Sendo desprovidos de

clorofila e da capacidade de realizar digestão intracelular, os fungos são obrigados a

viver de matéria orgânica em saprofitismo ou em parasitismo no organismo do

homem e de outros animais (ZAMPRONHA et al., 2005).

32

6.2.1 Aspergillus spp

Os fungos filamentosos são microrganismos eucarióticos heterotróficos.

Caracterizam-se por formarem um micélio, que é um conjunto de estruturas

filamentosas denominadas hifas. A reprodução dos fungos, normalmente ocorre por

meio de esporos, podendo ser assexuada ou sexuada (PAMBOUKIAN, 1997).

Aspergillus é um fungo filamentoso muito importante economicamente, sendo

utilizado em fermentações industriais para a produção de ácido cítrico, ácido

glicônico, glicoamilase e várias enzimas. Esse fungo se reproduz por meio de

esporos (conídias), formando micélios compostos por hifas septadas e ramificadas

(PAMBOUKIAN, 1997). A seguir a figura 6 apresenta o gênero Aspergillus.

Figura 6: Aspergillus spp.

Fonte: Mar Vista Animal Medical Center, 2009.

6.2.2 Candida spp

O gênero Candida pertence à família Crytococcaceae, da classe Ascomycetes

e filo Ascomycota e é caracterizado por leveduras que apresentam formas

arredondadas ou ovais que medem aproximadamente de 2,0 a 4,0 µm e

reproduzem-se por brotamento ou gemulação. Algumas espécies, como C. albicans,

produzem brotos que não se separam uns dos outros; estes brotos formam uma

cadeia de células chamada de pseudo-hifa, forma esta necessária para invadir

tecidos mais profundos nos quadros de infecção. Esta transição entre os dois

fenótipos pode ser induzida in vitro em resposta a variações do ambiente como pH e

33

temperatura, ou determinadas substâncias como N-acetilglucosamina ou prolina. No

entanto, o mais importante critério para a patogenicidade é a indução para a forma

micelial por macrófagos e componentes do soro. Associado a isso, o grande

interesse biológico do dimorfismo é a capacidade do microrganismo mudar de forma

e isso esta associada diretamente a sua patogenicidade (PORTELA, 2006). A seguir

a figura 7 apresenta o gênero Candida spp.

Figura 7: Candida spp.

Fonte: Optimal Healthy Network, 2003.

6.2.3 Penicillium spp.

Penicillium é um gênero de fungos de maior importância ambiental, bem como

a produção de alimentos e remédios. Ele produz a penicilina, uma molécula que é

usada como antibiótico, que mata ou impede o desenvolvimento de certos tipos de

bactérias (CANNON et al., 2008).

O gênero Penicillium é composto por espécies pouco exigentes

nutricionalmente, capazes de crescer em qualquer ambiente com uma fonte de sais

minerais e qualquer fonte de carbono exceto as mais complexas, numa gama vasta

de condições físico-químicas. Muitas espécies são psicrófilas, capazes de crescer a

temperatura abaixo de 0o C, mas algumas espécies são capazes de crescer até

40oC. Eles apresentam hifas septadas e os conidióforos na forma de pincéis. Seus

esporos assexuados produzem uma estrutura típica do gênero designada de

“penicillus” (pincel) (FASANELLA, 2008). A seguir a figura 8 apresenta o gênero

Penicillium spp.

34

Figura 8: Penicillium spp.

Fonte: University Minnesota, 2010.

6.3 Plasmídeo

A resistência e a capacidade de utilizar certos compostos químicos em seu

metabolismo se devem aos plasmídeos, que são DNA extra cromossomais, que

podem ser transferidos de bactérias de geração a geração, levando informações

genéticas e novas características às bactérias receptoras. Os plasmídeos estão

presentes em várias bactérias (UNIPAR, 1994).

Os plasmídeos podem ser pequenos com baixo peso molecular, ou grandes

com alto peso molecular, quanto maior o peso molecular do plasmídeo, menor será

o número de cópias possíveis de serem realizadas, cerca de três cópias. Já os

plasmídeos de baixo peso molecular podem realizar até cem cópias por células

(UNIPAR, 1994).

Sua constituição é feita pela estrutura denominada RTF, que é um conjunto de

genes necessários para transferência, pelo determinante, que é a estrutura

responsável pelas características do plasmídeo, e pelo elemento IS, que é uma

estrutura sequencial de DNA, responsável pela sua inserção no código genético da

célula receptora (UNIPAR, 1994).

Existem vários tipos de plasmídeos:

- Plasmídeo F e F’: são responsáveis pelo fator de fertilidade bacteriana;

35

- Plasmídeo R (ou RTF): responsável pelos fatores de resistência bacteriana a

antimicrobianos;

- Plasmídeo COL (ou fator colicinogênico);

- Plasmídeos responsáveis pela fixação do nitrogênio do solo;

- Plasmídeos que degradam metais pesados;

- Plasmídeos codificadores de toxinas bacterianas.

36

7 MATERIAIS E MÉTODOS

Os seguintes materiais foram utilizados na pesquisa:

a) Vidrarias e equipamentos:

Erlermeyers de 500 mL, 250 mL, 100 mL, para a incubação dos

contaminantes, eppendorfs de 1 mL, micropipetadores automáticos (0,01-10

mL), placas de Petry, estufa De léo, bico de bunsen, autoclave Bio Eng A30,

alça de platina, alça de Drigalski, contador de colônias mecânico Phoenix CP

602, balão de fundo redondo de 100 mL, Beckers de 2 L, 1 L, 500 mL,

SHAKER Nova Estima.

b) Culturas, meios de cultivo e reagentes:

Foram utilizados água deionizada e destilada, bactérias Bacillus subtilis,

Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, fungos Candida albicans,

Aspergillus fumigatus, Penicillium notatum, PCA (Plate Count Agar), MH

(Mueller-Hinton), caldo BHI (Brain Heart Infusion), ágar sabouraud dextrose,

padrão do herbicida imazapic, fluoreto de sódio, óxido de cromo VI, sulfato de

manganês.

c) Análises:

As análises de incubação e contagem dos microrganismos foram realizadas

no laboratório de microbiologia do UNILASALLE.

7.1 Preparações dos contaminantes

7.1.1 Preparação da solução de Imazapic®

Para a realização do experimento foi utilizado um padrão do herbicida imazapic

da seguinte maneira: uma solução estoque do herbicida com concentração

conhecida de 500 mg L-1 em acetona foi primeiramente utilizada. A partir dessa

solução cada inóculo foi preparado utilizando-se 5 mL do padrão de 500 mg L-1,

obtendo-se uma concentração final do herbicida nos inóculos de 5 mg L-1.

37

7.1.2 Preparação dos metais e fluoreto

Para o experimento foi utilizada uma massa de 300 mg de sais inorgânicos,

sendo os compostos: óxido de cromo VI, fluoreto de sódio e sulfato de manganês.

Essa quantidade foi acrescentada em 1 litro de meio mínimo mineral, obtendo uma

concentração final de 300 mg L-1 de cada contaminante.

7.2 Planejamento dos experimentos

7.2.1 Imazapic®

No planejamento do experimento, o primeiro fator que observado foi a escolha

das condições para a melhor realização do procedimento.

As variáveis e níveis utilizados foram os seguintes:

a) Temperatura de incubação: 32oC;

b) Microrganismos: Bactérias (Pseudomonas, Bacillus, Serratia). Fungos

(Candida, Aspergillus, Penicillium).

O experimento teve a seguinte estrutura em relação aos seus componentes:

Tabela 1: Distribuição dos frascos contendo o herbicida de acordo os

microrganismos testado.

Fonte: Autoria Própria, 2011

FRASCOS COMPONENTES

1 Contaminado BA

2 Contaminado PS

3 Contaminado SE

4 Branco BA

5 Branco PS

6 Branco SE

7 Contaminado Asp

8 Contaminado Pen

9 Contaminado Cand

10 Branco Asp

11 Branco Pen

12 Branco Cand

38

Onde:

BA: Bacillus;

PS: Pseudomonas;

SE: Serratia;

Asp: Aspergillus;

Pen: Penicillium;

Cand: Candida.

7.2.2 Metais e Fluoreto

Para esse procedimento os fatores utilizados, seguiram a mesma ordem em

relação ao contaminante anterior, com apenas a exclusão dos fungos nesse

experimento.

O procedimento obteve a seguinte estrutura em relação a todos os

contaminantes desse grupo de estudo.

Tabela 2: Distribuição dos frascos contendo o fluoreto de acordo o

microrganismo testado.

FRASCOS COMPONENTES

1 Contaminado BA Contagem (150 mL)

2 Contaminado PS Contagem (150 mL)

3 Contaminado SE Contagem (150 mL)

4 Branco BA

5 Branco PS

6 Branco SE

39


Onde:

BA: Bacillus;

PS: Pseudomonas;

SE: Serratia.

7.3 Preparação dos meios de cultura e inoculação do s microrganismos

Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de

compostos químicos que fornecem os nutrientes necessários para desenvolvimento

(cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural (UFBA).

Pesou-se 3,4g de caldo BHI, e adicionou-se 100 mL de água deionizada para

cada erlenmeyer de 250 mL. Foi utilizado um total de 6 frascos (Imazapic) e 3

frascos (metais e fluoreto), pelo fato de termos o mesmo número de organismos.

Tampou-se com papel alumínio juntamente com papel pardo. Colocou-se na

autoclave à 120ºC, pelo intervalo de tempo de 10 minutos, para que não houvesse à

presença de nenhum outro organismo nesse meio. A figura 9 apresenta os meios de

cultura.

7 Contaminado BA Quantificação

(500 mL) 8 Contaminado PS

Quantificação (500 mL)

9 Contaminado SE Quantificação

(500 mL)

40

Figura 9: Meios de Cultura


Retirou-se uma fração de colônias isoladas dos organismos Bacillus,

Pseudonomas, Serratia, Candida, Aspergillus e Penicillium que se encontravam em

placas de petry e foram transferidos para os erlenmeyers contendo o caldo BHI.

Tampou-se com camada dupla de papel alumínio e papel pardo, após foi

encaminhado para a estufa numa temperatura constante de 32ºC, ficando em

incubação pelo intervalo de tempo de um dia.

7.4 Incubação dos microrganismos

A seguir estão descritas as etapas que envolveram a incubação dos

microrganismos.

7.4.1 Preparação dos frascos

Vinte e um erlenmeyers de 500 mL e doze erlenmeyers de 150 mL foram

lavados com água, sabão e água deionizada, para evitar o máximo possível a

presença de outro organismo do meio externo.

41

7.4.2 Preparação dos meios de cultura para a incubação

7.4.2.1 Imazapic®

Em cada erlenmeyer foi adicionado 300 mL de água deionizada, 10,2 g de

caldo BHI, 2,5 g de peptona, 12 g de glicose. Os erlenmeyers foram fechados com

papel alumínio e papel pardo e colocados na autoclave por 15 minutos a 120oC e 1,0

atm.

7.4.2.2 Metais e Fluoreto

Foi realizado o preparo do meio mínimo mineral, que possuía constituição para

cada litro do meio sintético: Na2HPO4 (3,50 g), KH2PO4 (1,50 g), MgSO4.7H2O (0,20

g), CaCl2.2H2O (0,01 g) e sulfato ferroso (0,01 g).

Foi adicionado esse meio em 12 erlenmeyers de 150 mL e 9 erlenmeyers de

500 mL, após essa etapa os frascos foram fechados com papel pardo e alumínio e

levados para a autoclave num período de tempo de 10 minutos à 120oC e 1,0 atm.

7.4.3 Incubação

7.4.3.1 Imazapic®

Foi adicionado em seis erlenmeyers (contaminados) 5 mL de solução padrão (5

mg/L) de Imazapic, juntamente com o volume de 195 mL de água e 500 µL da

solução da respectiva bactéria ou fungo (concentração inicial 104). Nos brancos não

foram adicionados o padrão de pesticida.

7.4.3.2 Metais e Fluoreto

Nos erlenmeyers de 500 mL, o volume de meio mínimo utilizado foi de 400 mL

(quantificação dos compostos). Nos erlenmeyers de 150 mL, o volume foi

preenchido até a importância de 100 mL (contagem dos microrganismos), e o

volume de bactérias utilizadas foi de 5 mL (concentração inicial de 1011). Nos

brancos não foram adicionados os contaminantes.

42

7.4.4 Incubação das amostras

As amostras foram cultivadas em incubadora orbital tipo Shaker na temperatura

de 32oC e sob agitação de 60 ciclo/min., no caso dos metais e fluoreto, com a

finalidade de proporcionar uma temperatura ideal, para que os organismos possam

desenvolver-se adequadamente, e de uma maneira mais semelhante em relação ao

meio ambiente. A figura 10 demonstra as amostras em incubação.

Figura 10: Incubação dos microrganismos


7.5 Contagem dos microrganismos

Este procedimento foi realizado em placas de Petry pelo método das diluições.

Este método tem por característica a colocação de um inoculo pertencente a uma

cultura com quantidade de células a ser determinadas em uma placa com meio de

cultura especifico para cada tipo microrganismo. Contando as colônias que

cresceram após a incubação das placas, obteremos o número de Unidades

Formadoras de Colônias (UFCs/mL) da cultura que estamos observando e

estudando. Porém, como pretendemos contar as células de culturas de crescimento

total, torna-se necessário realizar diluições do inoculo, a fim de que se torne

evidente nas placas um número final de colônias, que possibilite a aproximação ideal

da população real do inóculo em questão.

Foram realizadas três contagens, em torno de cada experimento realizado e foi

obedecido o mesmo procedimento.

43

Foi utilizada a alíquota de 100 µL de amostra em eppendorfs com 900 µL de

água deionizada, e a diluição teve a seguinte sequência.

Procedeu-se diluição seriada até 10-6. A figura 11 mostra a sequência de

diluição.

Figura 11: Diluição dos Microrganismos

Fonte: Autoria Própria, 2011.

Após este procedimento, as alíquotas com concentração igual a 10-6, foram

transferidas para placas de Petry com PCA (Plate Count Agar), para contagem das

colônias. Foi utilizada uma alíquota de volume igual à 20 µL, e após o volume foi

dispersado com o auxilio de uma alça de Drigalsky, flambada para distribuir a

solução na placa.

As placas foram transferidas para estufa à 37ºC por 24 h, após esse intervalo

de tempo foram contadas as populações microbianas resultantes, utilizando-se o

Contador de Colônias Mecânico CP602. A figura 12 apresenta os microrganismos

nas placas para a contagem.

44

Figura 12: Placas de contagem de microrganismos


45

8 RESULTADOS E DISCUSSÕES

8.1 Imazapic®

Realizou-se quatro contagens de crescimento dos microrganismos a cada 7

dias, para averiguar o comportamento dos microrganismos na presença do pesticida

imazapic. O resultado das contagens encontra-se nas tabelas a seguir.

Tabela 3: Resultados da primeira contagem

Microrganismos Contaminado Branco

Bacillus 1,7 X 108 UFC/mL 2,9 X 108 UFC/mL

Pseudomonas 1,2 X 108 UFC/mL Incerto

Serratia 2,5 X 108 UFC/mL 3,0 X 108 UFC/mL

Aspergillus Sem crescimento 3,0 X 107 UFC/mL

Penicillium Sem crescimento 5,3 X 107 UFC/mL

Candida 1,1 X 107 UFC/mL 2,1 X 107 UFC/mL

Fonte: Autoria própria, 2011.

Tabela 4: Resultados da segunda contagem



Pseudomonas 3,2 X 108 UFC/mL 5,2 X 109 UFC/mL

Serratia 3,6 X 108 UFC/mL 4,1 X 108 UFC/mL





46

Tabela 5: Resultados da terceira contagem




Serratia Contaminação no meio Contaminação no meio





Tabela 6: Resultados da quarta contagem




Serratia Contaminação no meio Contaminação no meio





Os microrganismos Pseudomonas e Candida foram os que demonstraram um

maior crescimento e aceitação a esse meio. Os outros organismos não

apresentaram uma mesma forma de crescimento e obtiveram um desenvolvimento

inadequado a esse meio, possibilitando uma inibição ou lise do organismo perante o

contaminante em que se encontravam. A figura 13 apresenta o crescimento dos

microrganismos durante o tempo de incubação, em escala logarítmica nas amostras

contaminadas.

47

Figura 13: Crescimento nas amostras contaminadas


A bactéria Serratia e os fungos Aspergillus e Penicillium não obtiveram valores,

pois apresentaram algum tipo de contaminação ou lise sobre os organismos.

Os microrganismos Pseudomonas e Candida, podem ter sobrevivido a esse

contaminante por apresentarem em sua estrutura algum gene que possa utilizar

compostos orgânicos no seu metabolismo celular. Mas, outras espécies dos

mesmos gêneros citados acima, poderão não apresentar uma mesma forma de ação

perante o mesmo constituinte químico, pois podem não ter recebido de gerações

passadas o gene específico para que a degradação e metabolismo dessas

substâncias sejam viáveis.

Entretanto a degradação desse composto não poderá ser confirmada, pois a

quantificação do pesticida não foi realizada, por não obtermos equipamento

adequado para que houvesse a análise da substância.

Portanto, sugere-se para trabalhos futuros a realização da quantificação do

pesticida imazapic, para podermos obter uma resposta sobre o comportamento dos

microrganismos perante o contaminante em seu meio de crescimento.

A figura 14 apresenta o crescimento dos microrganismos em escala

logarítmica, no mesmo intervalo de tempo sem a presença do contaminante.

48

Figura 14: Crescimento nas amostras sem contaminante

Fonte: Autoria Própria, 2011. Os microrganismos Pseudomonas e Serratia não foram apresentados os

valores de crescimento na amostra sem contaminante, pois apresentaram algum tipo

de interferência no seu crescimento, como contaminação do meio, ou incerteza na

contagem.

8.2 Metais e Fluoreto

Realizaram-se três contagens do crescimento dos microrganismos a cada 6

dias, para averiguar o comportamento dos microrganismos na presença dos

contaminantes. O resultado das contagens encontra-se nas tabelas a seguir.

Tabela 7: Crescimento em Cromo

Microrganismos T0 T1 T2

Bacillus 4,5 x 106 9,3 x 103 7,5 x 102

Pseudomonas 2,0 x 108 1,2 x 105 Zero

Serratia 1,3 x 109 2,0 x 104 6,0 x 102


49

A figura 15 apresenta os valores do tempo de incubação das amostras com

cromo em escala logarítmica.

Figura 15: Crescimento em cromo


Os microrganismos nas amostras contendo o contaminante cromo

apresentaram uma intolerância ao agressor. Essa característica pode estar

relacionada ao fato desses microrganismos não obterem a enzima capaz de

degradar o composto, ou a substância inibir algum metabolismo da célula

bacteriana, como o transporte de substratos do meio externo para o interno,

prejudicando assim a reprodução celular.

A tabela 8 averigua o comportamento na presença de manganês.

Tabela 8: Crescimento em Manganês


Bacillus 1,1 x 108 1,1 x 108 1,8 x 108

Pseudomonas 6,4 x 107 1,0 x 108 9,0 x 108

Serratia 1,2 x 109 5,4 x 107 2,4 x 108


50

A figura 16 demonstra o crescimento dos microrganismos em escala

logarítmica na presença de manganês.

Figura 16: Crescimento em manganês


Os microrganismos obtiveram comportamentos diferentes na presença de

manganês. A bactéria Bacillus apresentou a mesma quantidade de ciclos

bacterianos durante todo o processo, fazendo com que não houvesse crescimento

em sua população. O mesmo não ocorreu com os gêneros Pseudomonas e Serratia,

que durante o tempo de incubação demonstraram oscilações em suas populações

bacterianas. Essas divergências em quantidades de colônias pode ser um indício de

que a substância esteja sendo utilizada de alguma forma, no metabolismo celular

dos microrganismos estudados.

Na tabela 9, o comportamento dos microrganismos foram os seguintes.

Tabela 9: Crescimento em Fluoreto


Bacillus 1,6 x 108 1,6 x 108 1,6 x 108

Pseudomonas 2,0 x 108 3,1 x 109 5,6 x 108

Serratia 8,8 x 109 3,6 x 109 1,2 x 108


51

A figura 17 apresenta os valores em escala logarítmica para o crescimento na

presença de fluoreto.

Figura 17: Crescimento em fluoreto


O mesmo comportamento foi observado em relação ao íon fluoreto. O gênero

Bacillus manteve-se igual em todo o processo e os outros microrganismos

mostraram-se uma oscilação na incubação. A divergência em relação ao processo

anterior dá-se, por causa da bactéria Serratia, que apresentou um declínio em suas

populações.

A tabela 10 demonstra o crescimento dos microrganismos sem a presença de

contaminantes.

Tabela 10: Crescimento no Branco


Bacillus 1,6 x 108 3,2 x 108 1,1 x 108

Pseudomonas 2,0 x 108 3,0 x 109 4,8 x 108

Serratia 8,8 x 109 3,4 x 109 4,8 x 108


52

A figura 18 demonstra o comportamento dos microrganismos em escala

logarítmica sem a presença de contaminantes.

Figura 18: Crescimento sem contaminantes


O comportamento dos microrganismos sem a presença de nenhum

contaminante obteve valores semelhantes aos mesmos organismos, na presença do

componente químico fluoreto. Possibilitando definir que o íon fluoreto não demonstra

grande interferência no metabolismo e crescimento das células bacterianas.

Um dado observado durante os procedimentos foram às colorações diferentes

da bactéria do gênero Pseudomonas, que apresentaram cor vermelha na presença

de manganês e coloração castanha na presença de fluoreto. A figura 19 apresenta o

gênero Pseudomonas com duas colorações.

53

Figura 19: Colônias de Pseudomonas


A bactéria Pseudomonas aeruginosa tem por característica a produção de um

composto de caráter toxico denominado piocianina (azul), pioverdina (verde), e os

hidrossolúveis piorrubina (vermelho) e piomelanina (marrom a preto), que são

responsáveis pela cor brilhante da célula bacteriana e pode ser considerado um

indicador, para a ação do microrganismo frente a agressão do contaminante perante

as colônias.

54

9 CONCLUSÕES

O uso de microrganismos com capacidade para a degradação de compostos

agressores ao meio ambiente é uma maneira eficaz, e de baixo custo econômico

para a resolução e diminuição dos problemas que estão evoluindo nos dias de hoje,

com o aumento da produção em alta escala industrial e do manejo de novas

técnicas de produção.

Este trabalho comprovou que os microrganismos dependendo do ambiente, e

dos fatores que são submetidos reagem de forma específica em relação a

substância presentes. Fatores ambientais como disponibilidade de água e oxigênio,

temperatura e disponibilidade de nutrientes inorgânicos influenciaram na

sobrevivência e a atividade dos microrganismos.

A Atividade de Água (Aw) do meio é um fator decisório na fisiologia de muitas

bactérias, pois é essa água, considerada como disponível para utilização em

reações químicas e crescimento nos microrganismos. Em ambiente cuja água possui

dissolvido elementos, que por sua vez possam ser nocivos ao microrganismo,

haverá uma limitação no crescimento ou até comprometimento da sua manutenção.

Isso implicaria num gasto maior de energia, pois o microrganismo alteraria o seu

metabolismo enzimático como contrapartida para a neutralização.

Bactérias de mesmo gênero, mas de espécies diferentes, podem produzir

reações diversas na presença dos contaminantes, como o caso da bactéria

Pseudomonas, que possuiu colorações diferentes em dois compostos. Essa

adversidade na presença de contaminantes desiguais pode ser pela ação de certo

tipo de gene capacitado, para a degradação das substâncias em questão.

Para próximos trabalhos sugere-se fazer a quantificação final em todas as

amostras, comprovando a biodegradação dos compostos pela ação metabólica dos

microrganismos.

55

REFERÊNCIAS

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