UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO ÁCIDO PERACÉTICO NA

ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS ODONTOLÓGICOS

RENAN ANTONIO CERETTA

CRICIÚMA (SC), FEVEREIRO DE 2008

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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA DO ÁCIDO PERACÉTICO NA

ESTERILIZAÇÃO DE EQUIPAMENTOS ODONTOLÓGICOS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientador: Elidio Angioletto Co-orientador: Marcos M. da Silva Paula

CRICIÚMA (SC), FEVEREIRO DE 2008

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AGRADECIMENTOS

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Ao professor dr. Elidio Angioletto que, com paciência, tolerância,

persistência e sabedoria, soube conduzir-me ao término do estudo. Muito obrigado

Professor Elídio.

Ao Professor dr. Marcos Marques Paula, cuja disponibilidade e disposição

incomparáveis, co-orientou este trabalho com muita competência e afinco.

Professor, você faz a diferença no ambiente acadêmico.

Ao Everton Angioletto, bolsista que auxiliou primorosamente no

desenvolvimento das pesquisas de laboratório, os meus agradecimentos especiais

pela compreensão de minhas ansiedades.

Ao colega MSc. Silvio Ávila Junior, que muito solidariamente desenvolveu

estudos valiosos auxiliando-me na finalização de minhas pesquisas.

Ao colega M.Sc. Claus Troger Pich pela disposição, companheirismo,

solidariedade e imensa disposição em colaborar. Obrigado pelas tuas intervenções

primorosas e ricas.

À Universidade do Extremo Sul Catarinense – instituição em que atuo

como docente, pelo seu crescimento e pelo investimento no conhecimento,

promovendo o Curso de Pós-Graduação – nível de mestrado, e aos professores

coordenadores e docentes do Curso de Mestrado.

À FGM – pelo interesse e pelas idéias que possibilitaram o

desenvolvimento deste estudo.

Às prefeituras municipais de Criciúma e de Içara, por acreditarem na

importância do aprimoramento profissional de seus trabalhadores e por cederem os

períodos necessários ao desenvolvimento dos estudos.

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À Vitória Bisognin Ceretta, minha filha – pela compreensão diante das

ausências necessárias ao desenvolvimento dos estudos e por ser a força motivadora

de meus empreendimentos.

Aos meus pais Sílvio e Gema, por me apoiarem sempre em todos os

empreendimentos de minha vida.

À Luciane Bisognin Ceretta, minha esposa, por me estimular a cursar o mestrado.

À Ana Paula Maciel, colega cirurgiã dentista e grande amiga, que tão

prestimosamente cedeu seu consultório para que as pesquisas fossem

desenvolvidas.

À Patrícia Duarte Simões Pires, colega cirurgiã dentista e grande amiga,

pelo auxílio com materiais, com estímulo e com o diálogo amigo.

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“A razão cardeal de toda superioridade humana é, sem dúvida, a vontade. O

poder nasce do querer. Sempre que um homem aplica a veemência e a

perseverante energia de sua alma a um fim, ele vencerá os obstáculos e, se

não atinge o alvo, fará pelo menos coisas admiráveis.”

(JA)

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RESUMO

Avaliou-se a eficiência do ácido peracético, nas concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm, na esterilização microbiológica de materiais odontológicos. Determinou-se, para essas concentrações, se o ácido peracético causa corrosão na instrumentação odontológica, se induz a mutagenicidade, avaliada através do teste cometa e citotoxicidade celular. Verificou-se, ainda, a concentração inibitória mínima (CIM), a concentração bactericida mínima (CBM) através da difusão em Ágar utilizando o método dos poços. A taxa de corrosão, calculada a partir de ensaios potenciodinâmicos, foi de 10-6 cm/ano, indicando que o produto não danifica o instrumental. Também se avaliou a capacidade de esterilização do ácido peracético a 2500 ppm em materiais utilizados nos procedimentos clínicos, pelo período de tempo de exposição de 20 minutos. Os materiais foram coletados em dois consultórios odontológicos, sendo um público e outro privado. Os resultados deste estudo demonstraram a eficiência do ácido peracético na esterilização de equipamentos odontológicos, tornando-se mais uma alternativa para a prevenção das infecções nos consultórios. O teste COMETA indicou atividade genotóxica, para a concentração de 2500 ppm, inferior ao peróxido de hidrogênio. No entanto, o ácido peracético tem um curto tempo de vida não permanecendo sobre o instrumental. Apesar disso a atividade genotóxica indica a necessidade do usuário utilizar equipamentos de proteção, como luvas e jaleco.

Palavras-chave: Ácido Peracético; Esterelização; Microorganismos; Odontologia;

Sanitizante; Contaminação.

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ABSTRACT

The effectiveness of peracetic acid on the microbiological sterilization of dental materials was evaluated at concentrations of 800ppm, 1500ppm, and 2500ppm. At these concentrations, it was determined whether peracetic acid caused corrosion to dental instruments and induced cellular mutagenicity and cytotoxicidity. The minimum inhibitory concentration (MIC), the minimum bactericidal concentration (MBC) and diffusion in Agar, using the well method, were also verified. The corrosion rate, calculated from potentiodynamic assays was 10-6 cm/year, indicating that the product does not damage equipment. The sterilization capacity of peracetic acid at 2500ppm for materials used in clinical procedures exposed for 20 minutes was also evaluated using materials collected at two dental clinics, one public and the other private. The results of this study demonstrated the effectiveness of peracetic acid for sterilizing dental equipment, providing another alternative for the prevention of infections in clinics. The COMET assay indicated genotoxic activity at 2500 ppm.

Key words: Peracetic Acid; Sterilization; Cytotoxicidity; Genotoxic activity; Chemical

agents.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Montagem do experimento do teste de corrosão ......................................39

Figura 2 - Descrição simplificada do teste cometa. ..................................................42

Figura 3 - Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos classes

2 e 3; (c) dano classe 4. ............................................................................................43

Figura 4 - Representação gráfica dos halos inibitórios no teste difusão em Agar. ...49

Figura 5 - Staphylococcus aureus concentração 800ppm........................................49

Figura 6 - Staphylococcus aureus concentração 2500ppm......................................50

Figura 7 - Observa-se a realização do teste da concentração inibitória mínima da

solução Peracet à 1500ppm para a bactéria Salmonella choleraesuis . ...................51

Figura 8 - Perfis potenciodinâmicos de aço inox em ácido peracético. ...................56

Figura 9 - Média do índice de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A

comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH 7,0), sendo

*p<0,05 e **p<0,001...................................................................................................57

Figura 10 - Média da Freqüência de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A

comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH). ....................59

Figura 11 - índice de dano ao DNA celular do Peracet nas concentrações de 800,

1500 e 2500ppm/mL em comparação aos controles negativos (água) e controle

positivo (próxido de hidrogênio).................................................................................60

Figura 12 - Representação gráfica do mínimo de células viáveis frente a diferentes

concentrações............................................................................................................62

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Proporção do pó gerador e neutralizador no preparo das soluções do

ácido peracético .........................................................................................................37

Tabela 2 - Quantidade do princípio ativo distribuído em cada tubo. .........................38

Tabela 3 -Teste de difusão em Agar.........................................................................47

Tabela 4 - Resultados referentes a Concentração Inibitória Mínima . ......................51

Tabela 5 - Concentração do princípio ativo após diluição seriada. ...........................52

Tabela 6 - Resultados obtidos nos testes de concentração bactericida mínima.......53

Tabela 7 - Taxa de corrosão em cm.ano-1 em eletrodos de aço inox nas

concentrações de Peracet de 800, 1500 e 2500 ppm/mL. ........................................55

Tabela 8 - Absorbância do número de células viáveis após exposição ao ácido

peracético...................................................................................................................60

Tabela 9 - Contagem de colônias de MO antes e após esterilização em consultório

público. ......................................................................................................................64

Tabela 10 - Resultados das amostras recolhidas em BHI. .......................................66

Tabela 11 - Contagem das colônias de microrganismos antes e após a esterilização

no consultório particular. ...........................................................................................67

Tabela 12 - Resultados das amostras recolhidas em BHI. .......................................69

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AA - Ácido Acético

ANVISA - Agencia Nacional de Vigilância Sanitária

ATCC - American Type Culture Collection

CBM - Concentração Bactericida Mínima

CEO - Centro de Especialidades Odontológicas

CIM - Concentração Inibitória Mínima

CRO - Conselho Regional de Odontologia

DMSO - dimetil sulfóxido

DNA - Ácido Desoxirribonucléico

EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético

EPI - Equipamentos de Proteção Individual

HP - Peróxido de Hidrogênio

MO - Microrganismos

MTT - Sal de Tetrazolium

PAA - Peróxido de Ácido Acético

PBS - Cloreto de sódio / Cloreto de Potássio / Fosfato de Sódio Dibásico / Fosfato

de Sódio Monobásico

pH - Potencial Hidrogeniônico

PPM - Partes por Milhão

TBE - Tampão Tris / Borato / EDTA

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................13

2 OBJETIVOS............................................................................................................17

2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................17

2.2 Objetivos Específicos...........................................................................................17

3 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................18

3.1. A importância da Esterilização e os Métodos Utilizados.....................................18

3.2 Ácido Peracético...................................................................................................27

3.2.1 Características Físico-Químicas........................................................................27

3.2.2 Atividade Antimicrobiana...................................................................................29

3.2.3 Modo de Ação...................................................................................................30

3.2.4 Subprodutos......................................................................................................30

4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................33

4.1 Etapa Laboratorial................................................................................................33

4.1.1 Microrganismos Utilizados.................................................................................33

4.1.2 Disponibilização do Biocida...............................................................................35

4.1.3 Teste de Difusão em Agar.................................................................................34

4.1.4 Meio de Crescimento e de Cultura....................................................................35

4.1.5 Inoculação dos Microorganismos......................................................................35

4.1.6 Preparação da Solução Teste...........................................................................35

4.1.7 Teste de Concentração Inibitória Mínima..........................................................36

4.1.8 Teste de Concentração Bactericida Mínima......................................................37

4.1.9 Estudo de Eletroquímica...................................................................................37

4.1.9.1 Condição Experimental..................................................................................37

13

4.1.10 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa.....................................................39

4.1.11 Estudos Citotóxidos do Ácido Peracético........................................................42

4.1.11.1 Citotoxicidade Mitocondrial (Ensaio com o Sal de Tetrazolium-MTT)..........42

4.2 Etapa Desenvolvida em Consultórios Odontológicos...........................................43

4.2.1 Unidade de Saúde 24h Próspera (Pública).......................................................44

4.2.2 Consultório Privado...........................................................................................45

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................46

5.1 Teste de Difusão em Ágar....................................................................................46

5.2 Teste de Concentração Inibitória Mínima.............................................................49

5.3 Teste de Concentração Bactericida Mínima.........................................................51

5.4 Ensaios de Corrosão............................................................................................53

5.5 Teste de Genotoxicidade......................................................................................55

5.6 Freqüência de Dano ao DNA...............................................................................57

5.7 Estudo Citotóxico do Ácido Peracético.................................................................59

5.8 Etapa Realizada nos Consultórios Oodontológicos.............................................61

5.8.1 Testes de Esterilização Química com o Ácido Peracético na Concentração de

2500 ppm em Material Odontológico Contaminado...................................................61

6 CONCLUSÃO.........................................................................................................70

REFERÊNCIAS..........................................................................................................71

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1 INTRODUÇÃO

A definição de saúde para a Organização Mundial de Saúde (OMS),

apresenta uma abrangência abstrata e muitas vezes inatingível, configurando-se

uma utopia uma vez que a condicionam os fatores sociais, culturais e psicológicos, e

não apenas a ausência de enfermidades. Tal conceito tem sido alvo de análises e

críticas por muitos estudiosos. No entanto, representa um avanço em relação a um

conceito anterior, que compreende a saúde, unicamente como a ausência de

doenças. Isso porque, o que pode ser definido como um bem estar para uns poderá

não ser para outros (Chaves, 1986). Dentre os fatores de bem estar ou de saúde

estão àqueles relacionados à odontologia e, portanto, à saúde bucal.

Concebemos que saúde e doença são determinadas por fatores sociais,

econômicos e culturais e, também, influenciadas por serviços odontológicos, ou

mesmo por medidas efetivas de controle e prevenção de doenças. Assim, é

fundamental a implementação de políticas, tanto em nível individual quanto

macroestruturais, e dentre elas estão àquelas relacionados ao controle de infecções,

tanto nos serviços odontológicos da rede pública, quanto nos consultórios e clínicas

particulares. Para Gonçalves, (2001), quatro normas são estabelecidas na rotina

diária dentro de um consultório odontológico: 1. anti-sepsia das mãos; 2. limpeza,

desinfecção e esterilização; 3. medidas de proteção do paciente e profissional.

4.manutenção e monitoramento.

Dentre as tantas causas de doenças, estão aquelas que podem ser de

natureza infecciosa (Hardie, 1996). A infecção é um fenômeno microbiano,

caracterizado por uma resposta inflamatória frente à presença de microorganismos

ou a invasão destes nos tecidos (Bone et al, 1992).

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O objetivo prático da microbiologia é controlar os microrganismos, para

utilizar ou estimular aqueles com atividades úteis e inibir ou destruir os que são

nocivos.

Os microrganismos são capazes de sobreviver em ambientes diversos,

existindo, entretanto, limitações da capacidade de sobrevivência de determinados

microrganismos em um meio ambiente desfavorável, as quais foram aproveitadas

pelo homem como recurso para controle dos mesmos. O ambiente de trabalho

odontológico é um local de alto risco de contaminação devido ao tipo de trabalho

que é realizado e aos materiais utilizados nos diferentes procedimentos (Cellini et al,

2001).

As principais razões para se desenvolver o controle de microrganismos

nos consultórios odontológicos são:

a. Prevenir a transmissão de doenças e infecções;

b. Prevenir a contaminação ou crescimento de microrganismos nocivos;

c. Prevenir a deterioração e dano de materiais causados por

microrganismos.

A preocupação do homem em tornar os materiais isentos de

microrganismos data de muito tempo. Ainda anterior a esta preocupação, foi o fato

do homem reconhecer a importância de se proteger de fontes de infecção.

O Processo de esterilização compreende a eliminação de todos os

organismos viáveis, incluindo esporos. Este termo não pode ser usado com sentido

relativo: um objeto ou substância estão ou não esterilizados; jamais poderão estar

meio ou quase esterilizados. Entretanto, deve ser salientado que determinados

instrumentos não podem ser esterilizados utilizando calor, que é um dos métodos

mais indicados também em odontologia. Entre eles podemos citar as canetas de alta

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rotação, cones de guta percha para obturação de canais radiculares, lençóis de

borracha para isolamento absoluto, posicionadores intra-orais para tomadas

radiográficas, dentre outros. Nesses casos, a esterilização química faz-se

necessária. Essa esterilização vem provocando muitas dúvidas nos profissionais,

pacientes e comunidade acadêmica, quanto à eficiência do processo, danos

corrosivos causados no equipamento, e possíveis efeitos colaterais causados pela

presença de resíduos nos equipamentos.

No atendimento ao paciente, geralmente é o cirurgião-dentista e seu

auxiliar que fazem todo o trabalho no consultório: atendem o paciente, limpam e

esterilizam os instrumentos, desinfetam os equipamentos e as dependências do

consultório, agendando consultas e outras atividades. É nesse ambiente que podem

originar-se cadeias e rotas de contaminação de doenças infecciosas.

Os profissionais da saúde estão expostos a uma grande variedade de

microrganismos presentes na saliva e no sangue. Nas clínicas e consultórios

odontológicos a maior concentração de microrganismos encontra-se na boca do

paciente. Diante dessa realidade, as questões relativas ao controle de infecções e

às normas de biossegurança passam a ter um novo enfoque. Procedimentos como

pegar materiais das gavetas, antes considerados inofensivos, devem ser revistos e

corrigidos (Russo e Russo, 2001).

As infecções que podem ocorrer no consultório são semelhantes às

infecções hospitalares, hoje tão estudadas, que representam sérios riscos aos

pacientes em tratamento. O cirurgião-dentista deve obrigatoriamente controlar as

infecções dentro do consultório odontológico com o maior rigor, para que não venha

descobrir, mais tarde, que foi negligente, colocando em risco sua vida, de seus

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pacientes, de seus auxiliares e de seus próprios familiares. Isso porque muitas

doenças podem ser contraídas no consultório dentário.

Neste contexto, torna-se necessário à realização de novas pesquisas que

possam validar a utilização do ácido peracético como esterilizante/desinfetante

químico de instrumentos odontológicos, laboratoriais e médico-hospitalares.

Contudo, seu emprego como agente sanitizante exige que o mesmo seja

eficiente na esterilização, não provoque danos celulares residuais e não cause

corrosão nos diversos materiais metálicos com que possa entrar em contato. Assim,

avaliar a eficiência da esterilização química em equipamentos odontológicos

contaminados, através do àcido peracético se constitui no escopo principal do

presente trabalho.

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2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Realizar estudo experimental sobre a eficiência do ácido peracético, na

esterilização microbiológica de equipamentos odontológicos.

2.2 Objetivos Específicos

� Avaliar em que concentração (800 ppm, 1500 ppm, 2500 ppm) o ácido

peracético é eficiente na esterilização de materiais odontológicos

contaminados;

� Verificar se as concentrações do ácido peracético utilizados (800 ppm,

1500 ppm e 2500 ppm) podem causar ataque corrosivo nos

equipamentos;

� Verificar se o ácido peracético é citotóxico e se seus resíduos que

porventura permanecerem sobre os instrumentais odontológicos,

podem induzir a mutagenicidade celular.

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3 REVISÃO DE LITERATURA

3.1. A Importância da Esterilização e os Métodos Utilizados

O controle das infecções nunca foi tão necessário quanto é hoje, não

somente nos ambientes hospitalares, mas também em outros ambientes

profissionais, como os consultórios odontológicos, clínicas médicas e veterinárias,

cabeleireiros, atelier de tatuagem, laboratórios de indústrias alimentícias e

farmacêuticas entre outros (Kuriki, 1997). O controle da infecção deve ser praticado

onde e sempre que existir um potencial para exposição a vírus, bactérias, fungos ou

outros microrganismos, não bastando somente utilizar o instrumental esterilizado,

mas a conscientização dos profissionais pelo uso de técnicas assépticas e

procedimentos que garantam tanto ao profissional, quanto ao paciente e ao

ambiente um tratamento sem risco de contaminação.

A preocupação do homem em tornar os materiais isentos de

microrganismos data de muito tempo. Ainda anterior a esta preocupação foi o fato

do homem reconhecer a importância de se proteger de fontes de infecção. Assim,

por exemplo, o exército de Alexandre o Grande, fervia a água para beber. Muitas

outras civilizações antigas preservavam os gêneros alimentícios com sal, pela

secagem e por aquecimento.

Lister, (1864 apud Kuriki, 1997), jovem cirurgião inglês, impressionado

com os trabalhos de Pasteur, desenvolveu métodos para impedir o acesso de

microrganismos aos ferimentos cirúrgicos, com a finalidade de evitar infecção

microbiana (sepsia) nos tecidos após cirurgia. Realizando a esterilização

escrupulosa dos instrumentos cirúrgicos, utilização de bandagens com anti-sépticos

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(iodo) e conduzindo a cirurgia sob vaporização de desinfetante para impedir a

infecção pelo ar, conseguiu reduzir grandemente a sepsia cirúrgica.

Lister, (1864 apud Kuriki, 1997), há mais de 100 anos, recomendava aos

cirurgiões: “a contaminação deve obrigatoriamente ser vista com seus olhos mentais

de maneira distinta do que podem fazer seus olhos corporais”.

Para Cottone e colaboradores, (1991), o controle de infecção é uma

filosofia de trabalho e não uma receita ou fórmula a ser seguida, sendo inserida

dentro de um critério de racionalização onde é necessário verificar a eficácia dos

equipamentos utilizados na esterilização, os agentes químicos escolhidos, o controle

e eficácia da esterilização, a qualidade da água, o armazenamento do material

esterilizado, o uso de EPI, o destino do lixo contaminado e a constante capacitação

dos profissionais envolvidos no processo. A cada dia enfrenta-se uma realidade

diferente, e a mudanças freqüentes nos protocolos de atendimento, juntamente com

evolução dos produtos e equipamentos, obrigam os profissionais da área da saúde a

atualizarem-se e transformar suas práticas diárias, restabelecendo normas de

conduta e procedimentos que garantam um tratamento sem riscos de contaminação.

Para Vieira, (2005), a descontaminação é o resultado dos processos de

limpeza, desinfecção e esterilização usados em objetos, superfícies ou pacientes,

utilizando métodos físicos e químicos. Conceituando esterilização, esta é a

destruição ou remoção total de microorganismos e desinfecção é a destruição ou

remoção de microorganismos indesejáveis não incluindo necessariamente os

esporos. Desta forma, considerando as maneiras convencionais de assepsias

existentes nos consultórios e clínicas odontológicas, a esterilização por calor úmido

na autoclave e o calor seco em forno Pasteur (estufa) são as formas mais

difundidas. Uma alternativa para esterilização por calor é a utilização de agentes

21

químicos (Tortora, Funke e Case 2000).

A prática odontológica abrange uma variabilidade de procedimentos,

desde simples profilaxias até cirurgias mais complexas, nas quais há contato com

secreções da cavidade oral e com sangue; Somando-se a isso, equipamentos e

instrumentais contaminados (Konkewicz, 1999). Esses procedimentos geralmente

implicam em contato com secreções da cavidade oral, algumas vezes representados

simplesmente pelo contato com saliva, outras vezes pelo contato com sangue,

secreções orais, secreções respiratórias e aerossóis. Isso tudo acaba resultando em

risco de transmissão de infecções, tanto de paciente para paciente, como dos

profissionais para pacientes ou dos pacientes para os profissionais.

É de fundamental importância que os procedimentos estabelecidos pelas

normas de Biossegurança sejam rigorosamente seguidos e, que a limpeza e

sanitização, tanto do local quanto dos equipamentos e superfícies de trabalho,

devam atender às exigências legais (Veneranda, 2004).

O Ministério da Saúde, no Manual de Controle de Infecção Hospitalar

(Brasil, 1994), recomendou a classificação de Spaulding para objetos inanimados,

conforme o risco potencial de transmissão de infecção que apresentam. Esta

classificação tem sido utilizada rotineiramente também na Odontologia, já que no

consultório odontológico o contato entre o instrumental e o paciente é constante.

Na classificação de Spaulding, os materiais são considerados como

artigos críticos, semi-críticos e não-críticos. Artigos críticos são todos aqueles que

penetram nos tecidos subepiteliais, no sistema vascular e em outros órgãos isentos

de microbiota própria, bem como todos àqueles que estejam conectados com eles.

Instrumentos que tocam em pele e mucosa não íntegra também são

considerados críticos. Estes artigos devem estar obrigatoriamente esterilizados ao

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serem utilizados. Artigos semi-críticos são todos aqueles que entram em contato

apenas com mucosa íntegra, capaz de impedir a invasão dos tecidos subepiteliais.

Estes artigos também devem estar esterilizados. Para artigos semi-críticos se aceita

desinfecção apenas para àqueles itens que não podem ser esterilizados por

procedimentos físicos. Artigos não-críticos são todos aqueles que entram em contato

com pele íntegra e ainda os que não entram em contato direto com o paciente. Estes

artigos devem sofrer procedimentos de desinfecção (Guimarães Jr., 2001).

Muitos microrganismos presentes na cavidade bucal podem sobreviver por

longos períodos de tempo fora da mesma, representando um risco de contaminação

tanto nos procedimentos realizados diretamente no paciente, como nos

procedimentos realizados em laboratório, pela manipulação ou contato de objetos

contaminados. A exposição ao sangue e a saliva de pacientes durante a realização

de procedimentos odontológicos, leva a possibilidade de aquisição de doenças como

herpes, gripe comum, tuberculose, pneumonia, hepatites B e C, AIDS entre outras.

O vírus da AIDS é viável em plasma seco pelo período de 72 horas,

enquanto o vírus da hepatite B pode sobreviver por uma semana sobre superfícies e

o Mycobacterium tuberculosis pode representar risco de contaminação por semanas

(Golegã et al, 2000).

Como não é possível a percepção de todos os pacientes portadores de

doenças infecciosas, deve-se considerar todo e qualquer paciente como

potencialmente infectado durante a realização dos procedimentos odontológicos.

Fungos, esporos, vírus, microrganismos bacterianos, causadores de doenças

infecciosas, muitas vezes estão presentes em materiais para moldagem bem como

em impressões e peças protéticas e, quando não são devidamente desinfetados

passam a ser a principal via de transmissão de doenças. (Fonseca et al, 1998). Nos

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laboratórios de prótese dentária e clínicas odontológicas, são manuseados materiais

que foram contaminados pelo contato direto com tecidos orais de pacientes

tornando-se potencialmente transmissores de doenças infecciosas.

Guimarães (1992), constatou a sobrevivência de microrganismos em

bancadas e superfícies contaminadas justificando a necessidade da adoção de

medidas de biossegurança, ressaltando o uso de equipamentos de proteção

individual, métodos de desinfecção e esterilização de materiais e instrumentais; fato

este ratificado por Golegã e colaboradores (2000), que mencionam que o uso de IPI

durante os procedimentos odontológicos reduz significativamente a transmissão de

microrganismos conseqüentemente o risco de contaminação e transmissão de

doenças.

As práticas eficazes de controle de infecção devem incluir técnicas

completas de lavagem das mãos com anti-sépticos adequados e outras barreiras

apropriadas como o uso de luvas descartáveis, avental, máscara, proteção para os

olhos inclusive dos pacientes, gorro, em qualquer consulta ao paciente que possa

envolver exposição à saliva, muco ou sangue. A desinfecção dos instrumentos

odontológicos deve iniciar com limpeza vigorosa, secagem e esterilização em calor

úmido, seco, gás ou processo químico. O uso de sanitizantes deve fazer parte de

um protocolo sanitário geral que inclui boa higiene do consultório, desinfecção de

rotina do campo cirúrgico e as superfícies devem ser tratadas com desinfetantes

apropriados (Tortamano, 1997).

Isto é justificável, pois se sabe que 1 mL de saliva pode conter mais de

200 milhões de microrganismos de aproximadamente 250 espécies (Thylstrup;

Fejerskov, 1995), sendo que a cavidade oral é considerada uma fonte primária de

microrganismos potencialmente patogênicos (Cochran; Miller; Sheldrake,1989;

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Medina; Merino e Gorodner, 2002). Juntamente com os procedimentos realizados

nos consultórios odontológicos, existe um contato muito próximo entre paciente e

profissional, podendo estabelecer desta forma uma relação de infecção cruzada,

disseminando agentes patológicos podendo desencadear possíveis doenças entre

indivíduos presentes no local e em outros meios quando os pacientes retornam as

suas atividades de rotina (Pires, 2005).

Recomendações para métodos de esterilização e desinfecção de

instrumentos odontológicos vêm sendo descritos na literatura. Entretanto, existem

muitas variáveis que podem ser encontradas quando da aplicação de tais métodos.

Dessa forma faz-se necessário verificar a eficiência do processo de esterilização de

maneira a levar o profissional de odontologia a escolher os métodos que melhor

cumprem a tarefa sem colocar em risco a saúde dos pacientes, dos profissionais e a

durabilidade dos equipamentos (Conselho Federal de Odontologia, 1999).

Existe assim a necessidade de verificação de eficácia dos processos de

esterilização efetuada nos consultórios dentários. Dentre as variáveis que

influenciam a esterilização torna-se imprescindível verificar se as exigências de

tempo, temperatura e concentração estão sendo cumpridas de forma a garantir que

as bactérias e os esporos bacterianos sejam destruídos.

Em alguns consultórios dentários desinfetantes indicados para

desinfecção de ambientes hospitalares podem ser utilizados erroneamente na

esterilização de equipamentos usados em tratamentos odontológicos.

Em hospitais existem profissionais médicos, enfermeiros e bioquímicos

que têm, dentre as funções desempenhadas, o controle de infecção. Eles estão

encarregados de vigiar as políticas e materiais usados pelo pessoal operacional e

pessoal das centrais de serviços. Nos consultórios dentários esse controle não

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ocorre com a mesma eficácia e o profissional, às vezes, possui dúvidas na eficiência

do controle que está utilizando. Outra dúvida que surge é se o processo de

esterilização não estará danificando o equipamento que o mesmo vem utilizando.

Outra preocupação comum é se esses produtos que esterilizam não prejudicam os

pacientes (efeitos colaterais), causados por possíveis resíduos que permanecem no

equipamento.

Embora esterilização e desinfecção possam parecer procedimentos

simples e diretos, são, entretanto complexos. Assim, torna-se relevante levar aos

dentistas que atuam em clínicas públicas e privadas e não dispõem de pessoas para

controle de infecção, uma avaliação criteriosa dos problemas de esterilização e

desinfecção de instrumentos e dispositivos, para que possam optar pelos métodos

mais seguros.

Os Centros para Controle e Prevenção de Doenças recomendam a

esterilização para todos os artigos críticos reutilizáveis, esses que penetram os

tecidos macios ou os ossos e entram no sistema vascular. Também se inclui nesta

recomendação os equipamentos manuais de alta velocidade e eletrodomésticos

reutilizáveis, ainda que estes não penetrem tecidos.

A ANVISA (2005), classifica os agentes antimicrobianos de acordo com o

nível de descontaminação proporcionado pelos mesmos em: anti-sépticos,

desinfetantes, sanitizantes e esterilizantes. Anti-séptico é um agente químico que

inibe ou elimina o crescimento de microrganismos não sendo tóxico quando utilizado

nos tecidos, para lavar as mãos ou em ferimentos. Os desinfetantes são agentes

físicos ou químicos que destroem ou inativam irreversivelmente a maioria ou todos

os microrganismos patogênicos, mas não inativam esporos ou vírus.

Sanitizante é um agente químico que reduz, mas não elimina os

26

microrganismos de um material ou superfície inanimada. Os esterilizantes químicos

devem eliminar todas as formas de vida microbiana, incluindo os esporos, sendo

agentes utilizados para desinfecção em alto nível. Existem três diferentes níveis de

desinfecção dependendo da efetividade microbiana esperada: De baixo nível, menos

efetiva, reduzindo parcialmente os microrganismos e ineficaz contra Mycobacterium

tuberculosis e esporos; de nível intermediário, eliminando o Mycobacterium

tuberculosis e a maioria dos vírus, excluindo os esporos; e de alto nível capaz de

eliminar fungos, bactérias e vírus, podendo ser esterilizante.

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária, (ANVISA), através da portaria

Nº 15, de 23 de Agosto de 1988 define, classifica, regulamenta e estabelece os

parâmetros de emprego dos sanitizantes com finalidade antimicrobiana:

a. Desinfetantes - formulações que possuem na sua composição

substâncias microbiocidas e apresentam efeito letal para

microrganismos não esporulados (Staphylococcus aureus, Salmonella

choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa, Tricophyton mentagrophytes,

Mycobacterium amegmatis e Myctobacterium bovis).

b. Esterilizantes - formulações que possuem na sua composição

substâncias microbicidas com efeito letal para microrganismos

esporulados Bacillus subtilis (esporo) e Clostridium sporogenes

(esporo).

Para Guandalini e colaboradores (1997), um desinfetante químico ideal

deve preencher certos requisitos como ter ação rápida, alta atividade biocida, ser

efetivo na presença de matéria orgânica, biodegradável, fácil uso, ser econômico,

não tóxico e não corrosivo, entre outros; porém, os produtos disponíveis no mercado

não preenchem esses critérios. Pires (1998), aponta que os agentes químicos mais

27

utilizados para desinfecção são o glutaraldeído a 2% e o hipoclorito de sódio a 1%,

que são produtos com alto poder germicida, porém a manipulação inadequada ou a

hipersensibilidade do usuário podem causar intoxicação, dermatite de contato,

despigmentação da pele e problemas respiratórios.

Rutala e Weber (1999), abordaram sobre os esterilizantes químicos

utilizados para desinfecção em alto nível com o objetivo de facilitar a escolha dos

mesmos; Os autores concluíram que alguns desinfetantes podem até ser

esterilizantes, dependendo do tempo de exposição, como o glutaraldeído, peróxido

de hidrogênio e o ácido peracético.

Dentre os métodos químicos de descontaminação encontram-se os fenóis

e os compostos fenólicos, as biguanidas, os halogênios, os álcoois, os metais

pesados, os ácidos orgânicos, os aldeídos, os esterilizantes gasosos e ainda os

peroxigênios, os quais em sua grande maioria contribuem para o controle de

microrganismos nos serviços de saúde (Williams et al, 2001).

Cabe destacar mais especificamente a classe dos peroxigênios, que são

compostos de ação de largo espectro, possuindo como exemplo clássico o peróxido

de hidrogênio, um antimicrobiano potencial. Além desse, utiliza-se outras formas,

resultados de associações químicas, como o caso do ácido peracético. (Kitis, 2004).

A portaria da ANVISA n° 122/DNT, de 29 de novembro de 1993 inclui na

portaria n° 15 de 23/08/88, sub anexo 1 , alínea l, o princípio ativo do ácido

peracético (peróxido orgânico, fórmula química bruta C2H4O3), para uso nas

formulações de desinfetantes/esterilizantes.

28

3.2 Ácido Peracético

3.2.1 Características Físico-Químicas

O ácido Peracético, também denominado ácido peroxiacético (PAA), é o

peróxido de ácido acético (AA), e é considerado um forte agente oxidante e

desinfetante. PAA está comercialmente disponível na forma de uma mistura de

equilíbrio quaternário, que contém AA, peróxido de hidrogênio (HP), PAA, e água,

como mostrado pela equação seguinte:

CH3CO2H + H2O2 � CH3CO3H + H2O

Onde:

CH3CO2H = ácido acético

CH3CO3H = ácido peracético H2O2 = peróxido de hidrogênio.

Embora o HP também seja um agente antimicrobiano contribuindo para a

desinfecção, o PAA é um agente antimicrobiano mais potente que o HP, sendo

rapidamente ativo a baixas concentrações contra um espectro grande de

microorganismos. Constatou-se que o HP requer doses muito maiores que o PAA

para o mesmo nível de desinfecção (Wagner et al, 2002).

O PAA combina as características de oxigênio ativo de um peróxido dentro

de uma molécula de ácido acético e pertence à classe de peróxidos orgânicos que

são substâncias químicas artificiais. Peróxidos orgânicos podem conter os radicais

de peróxido (ligação oxigênio-oxigênio), servindo como uma fonte de oxigênio. O

radical de peróxido também promove instabilidade e combustão.

29

O PAA é um líquido claro e incolor sem capacidade de espumar. Tem um

forte odor de ácido acético pungente (ácido acético é o componente principal de

vinagre) e tem um pH ácido menor que dois. Para uma solução contendo 5% PAA,

20% a 24% HP, e 10% a 12% de AA, a massa específica é 1,10 (Solvay Interox ,

2002a). Para uma solução de 12 % de PAA, o ponto de congelamento é de - 40.3 a -

42.0ºC, e a massa específica é 1,11 (Solvay Interox, 2002b). PAA é solúvel em água

em todas as proporções e em solventes orgânicos polares, sendo, entretanto,

ligeiramente solúvel em solventes aromáticos (Solvay Interox, 2002a).

Solução de PAA é produzida da reação de ácido acético ou anidrido

acético com peróxido de hidrogênio na presença de ácido sulfúrico que age como

um catalisador (Block, 1991). Além disso, um estabilizador ou um agente isolado é

empregado durante sua produção.

PAA é consideravelmente menos estável que o HP. Uma solução de 40%

de PAA perde 1% a 2% de seus ingredientes ativos por mês, enquanto o HP (para

uma solução de 30% a 90%) perde menos de 1% ao ano. Soluções diluídas de PAA

são ainda mais instáveis: uma solução de 1% perde metade de sua força por

hidrólise em 6 dias (Block, 1991). Porém, soluções de PAA comercialmente

disponíveis (10% a 15%), como usado na indústria, são muito mais estáveis quando

comparados à soluções com concentrações mais altas e mais baixas.

Para manter a estabilidade, o PAA pode ser armazenado de forma

comum, preferivelmente em local fresco e em recipientes originais. Não é afetado

por vidro e pela maioria dos plásticos. Pode extrair componentes de algumas

formulações de vinil usadas como aditivos, possibilitando o ataque a borrachas

naturais e sintéticas (Dychdala, 1988). Alumínio puro e o aço inoxidável são

30

resistentes ao PAA; mas aço simples, ferro galvanizado, cobre metálico e o bronze

são suscetíveis à reação e corrosão (Schroder, 1984; Fraser et al, 1984).

Soluções de PAA que excedem 15% começam a exibir algum grau de

explosividade, instabilidade e reatividade (Block, 1991). Dessa forma, muitas

aplicações industriais usam soluções de PAA entre 10% e 15% (principalmente

12%). O uso de soluções concentradas de PAA em consultório odontológico

representa risco para o usuário. Isto provavelmente ocorre devido à concentração

reduzida de reagentes e adição de estabilizadores com propriedades para reduzir os

riscos. Os riscos de saúde associados com PAA de 12% são semelhantes aos riscos

de saúde a 50% de peróxido de hidrogênio.

3.2.2 Atividade Antimicrobiana

As propriedades germicidas do PAA foram primeiramente reportadas por

Freer e Novy (1902). Hutchings e Xezones (1949) demostraram que o PAA é o mais

ativo de 23 germicidas testados contra esporos de Bacillus thermoacidurans.

Greenspan e MacKellar (1951) descobriram ser este bactericida a 0,001%, fungicida

a 0,003%, e esporicida a 0,3%.

O PAA também era usado como um desinfetante na produção de animais

livres de germes. (REYNIERS, 1946). Até mesmo na fase de vapor, o PAA

demonstrou possuir a taxa de morte mais alta a uma concentração mais baixa

quando comparado com uma bateria larga de outros desinfetantes disponíveis

(Baldry, 1983). A eficiência de desinfecção utilizando o PAA para microorganismos

pode ser classificada de maneira geral: Bactérias > vírus > Esporos bacterianos >

cistos protozoários. (Liberti e Notarnicola, 1999; Rudd e Hopkinson, 1989).

31

3.2.3 Modo de Ação

Embora poucos trabalhos foram desenvolvidos para pesquisar o modo de

ação de PAA como um agente antimicrobiano, sugere-se que esse funcione como

outros peróxidos e agentes oxidantes. (Block, 1991). Sua atividade de desinfetante

está baseada na liberação de oxigênio ativo (Liberti e Notarnicola, 1999), é provável

que sulfidrilas sensíveis e enxofre unem-se em proteínas ou enzimas. Foi sugerido

que o PAA interfira na função seletiva da membrana citoplásmica lipoprotéica e

ocorra ruptura das paredes das células (Baldry, 1988; Leaper, 1984). Assim, pode

ser que é igualmente efetivo contra a membrana de lipoproteínas, facilitando sua

ação contra células de microrganismos Gram-negativos (Leaper, 1984).

Sua ação na quebra de uma proteína pode ajudar a explicar suas

características como um esporicida e ovicida (Block, 1991). Além disso, PAA

intracelular também pode oxidar enzimas essenciais; assim os caminhos

bioquímicos vitais, ativam transporte por membranas, e níveis intracelulares solúveis

são prejudicados (Fraser et al, 1984). Foi demonstrado que o PAA age nas bases da

molécula de DNA (Tutumi et al, 1973). Uma vantagem importante do PAA é que

pode inativar a catálise de uma enzima conhecida para desintoxicar os radicais livres

de hidroxilas (Block, 1991).

3.1.4 Subprodutos

Os produtos de decomposição de PAA são ácido acético, peróxido de

hidrogênio, oxigênio, e água (Gehr et al, 2002; Wagner et al, 2002). Existem três

32

reações nas quais PAA é consumido em uma solução aquosa: decomposição

espontânea, hidrólise e decomposição transição-metal-catalisada (Gehr et al, 2002).

O pH varia de 5,5 a 8,2 e resulta principalmente em decomposição

espontânea para ácido acético e oxigênio.

Tem sido mostrado que PAA não produz subprodutos tóxicos ou

mutagênicos depois de reação com material orgânico (Monarca et al, 2002). Ácidos

carboxílicos são formados pela oxidação de matéria orgânica natural na água por

PAA. Nenhuma desinfecção de subproduto contendo halogênio (DBPs) foi

observada para água PAA tratada. Desinfetantes à base de cloro resultam na

formação de subprodutos tóxicos e mutagênicos halogenados (clorados e/ou

bromados) depois da reação de cloro com o material orgânico.

Embora PAA na decomposição forme produtos inofensivos e, pouco ou

nenhum subproduto que seja tóxico ou mutagênico, a possibilidade que possa

formar DBPs não pode ser completamente ignorada (Crathorne et al, 1991). Foi

demonstrado que PAA não pôde oxidar cloreto a ácido hipocloroso. Então, foi

proposto que a transformação de fenol para clorofenol ocorra através da geração de

radicais halógenos livres (de cloreto, se presente em quantidades altas como

acontece na água do mar). A eletroquímica do PAA é suficiente para oxidar o

brometo a ácido hipobromoso, subseqüentemente formando orgânicos bromados

(Booth e Lester, 1995).

Embora poucos estudos sugerem a formação de alguns DBPs (com

alguma toxidade) a partir do PAA, a quantidade e espectro destes DBPs são muito

menores que aqueles formados por cloro ou ozônio. Além disso, outros oxidantes,

tais como cloro ou ozônio, também formam os radicais halógenos livres do cloreto

de fundo ou íons de brometo.

33

O PAA, sendo produto final da reação do peróxido de hidrogênio com o

ácido acético, é considerado a forma mais eficaz de esterilização utilizando uma

baixa concentração ativa contra um amplo espectro de microrganismos. Foi

observada ainda ausência de toxicidade ou resíduos persistentes, potencial

mutagênico, pequena dependência do pH no espectro de atuação, exigência de

tempo de contato curto e eficiência para efluentes (Pelkzar et al, 1998).

Uma correta anti-sepsia pré-cirúrgica ou pré-tratamento é altamente

satisfatório, caracterizando uma medida muita eficiente no controle da infecção

cruzada no consultório odontológico. Na anti-sepsia podem ser utilizados: solução

de clorexidina (de 0,12 a 0,2 %), compostos de iodo (povidona- Iodine, PVP-I, de 1 a

1,5 %) e água oxigenada a 10 volumes (Jorge, 2001).

Nos biocidas químicos está a chave da preservação dos produtos tão

diversos quanto alimentos e bebidas, cosméticos e formulações farmacêuticas. Os

biocidas são ainda utilizados em larga escala de aplicações industriais, ambientais e

centros hospitalares, sendo que muitos foram incorporados ao uso comum com um

histórico longo de experimentação. Os estudos sistemáticos de mecanismos de ação

auxiliam em novos projetos e desenvolvimentos futuros, propiciando conhecimento

para ampliação de novos agentes que minimizam os mecanismos da resistência e

os problemas toxicológicos (Denyer e Stewart, 1995).

34

4 MATERIAIS E MÉTODOS

O desenvolvimento da pesquisa foi efetuado em duas etapas: a primeira

etapa foi desenvolvida em laboratório buscando verificar qual das concentrações

testadas o ácido peracético apresenta maior poder inibitório; qual o dano corrosivo

causado pelo produto nos materiais odontológicos e a possível citotoxicidade e

mutagenicidade provocada por uma ação residual. Esses resultados serviram como

base para a realização da segunda etapa dos testes do ácido peracético nos

consultórios odontológicos.

4.1 Etapa Laboratorial

Foram utilizados nesta etapa os seguintes procedimentos e métodos: teste

de difusão em ágar, teste de concentração inibitória mínima, teste de concentração

bactericída mínima, estudo de eletroquímica, estudo de possível mutagenicidade

causada pelo produto (Teste Cometa), estudo de possível citotoxicidade causada

pelo produto (Citotoxicidade mitocondrial _ensaio com o sal de tetrazolium-MTT):

4.1.1 Microrganismos Utilizados

Foram utilizados os seguintes microrganismos: Bacillus subtilis ATCC

6633, Escherichia coli ATCC 8739, Mycobacterium smegatis ATCC 700044,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella choleraesuis ATCC 14028,

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533 e

35

Candida albicans sp ATCC 10231. Os mesmos foram adquiridos junto a fundação

André Toselo. pela empresa FGM Produtos Odontológicos Ltda (Joinville/ SC).

4.1.2 Disponibilização do Biocida

O biocida (àcido peracético) foi disponibilizado pela empresa FGM

Produtos Odontológicos Ltda (Joinville/ SC). O mesmo foi fornecido na forma de pó

gerador e pó neutralizador.

4.1.3 Teste de Difusão em Agar

Para o teste de difusão em ágar modificado, as placas de Petri continham

na sua parte interna dois discos de papel filtro, com o objetivo de absorver a

umidade proveniente da atividade microbiológica tendo em vista a impossibilidade

de virar a placa, quando utilizado o método dos poços.

4.1.4 Meio de Crescimento e de Cultura

Em função do número de amostras, foram preparados os meios de cultura

Ágar Plate Count para as bactérias e, para as leveduras, Ágar Sabouraud com o

objetivo de crescimento dos microrganismos.

36

4.1.5 Inoculação dos Microorganismos

A inoculação foi realizada utilizando a concentração equivalente à

turvação 0,5 da escala Mac-Farland (Pelkzar et al, 1998), ajustou-se através das

diluições seriadas, para uma concentração inicial de 106 colônias por mL, apanhou-

se um “swab” e mergulhou-se no tubo com as bactérias, impregnou-se bem o

algodão, fazendo a haste girar nos dois sentidos. Retirou-se o excesso,

pressionando o “swab“ levemente contra o frasco e então se inoculou por toda a

placa cobrindo a superfície da mesma de maneira uniforme girando a placa 45 graus

toda vez que chegou-se ao final da mesma. Repetiu-se o procedimento por três

vezes.

4.1.6 Preparação da Solução Teste

Na preparação do biocida ácido peracético utilizou-se um pó gerador e um

pó neutralizador diluídos em água destilada, conforme descritos na Tabela 1, para

se atingir as concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm. Primeiramente

mediu-se a água destilada, na qual foi adicionado o pó gerador e com um bastão de

vidro agitou-se por cinco minutos, após essa diluição a solução apresentou-se de cor

rosa; posteriormente se adicionou o pó neutralizador e novamente se agitou com o

bastão de vidro até sua completa diluição, completando a reação formadora do ácido

peracético, que tornou-se incolor.

37

Tabela 1: Proporção do pó gerador e neutralizador no preparo das soluções do

ácido peracético

Concentração da solução.

Pó gerador em gramas.

Pó neutralizador em gramas.

800 ppm 0,17g 0,095g 40 ml

1500 ppm 0,425g 0,2075g 50 ml

2500 ppm 0,52 O,3048 40 ml

Fonte: Medidas fornecidas pela empresa FGM Produtos Odontológicos Ltda de Joinvile, S/C.

4.1.7 Teste de Concentração Inibitória Mínima

Para análise da Concentração Inibitória Mínima (CIM) foram utilizados 10

tubos contendo 10 mL de BHI (Pelkzar et al, 1998). No trabalho foi utilizado

inicialmente 5,77 mL do princípio ativo. Para os tubos subseqüentes essa

quantidade foi dividida por raiz de três (10 mL divididos por raiz de três), conforme

pode ser observada na Tabela 2, a quantidade do princípio ativo utilizado para cada

tubo.

O tubo 10 não contém o princípio ativo e serve como um controle de

crescimento. Os meios, após serem inoculados com os microrganismos, foram

incubados a 35°C durante 24 horas. No final deste período os meios foram

examinados visualmente para comprovar a presença de turvação. A turvação indica

que houve crescimento dos microrganismos, e o primeiro tubo a não turvar indica a

concentração inibitória mínima.

38

Tabela 2: Quantidade do princípio ativo distribuído em cada tubo.

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Quantidade em (mL) 5,77 3,33 1,92 1,11 0,644 0,370 0,213 0,123 0,071 Branco

4.1.8 Teste de Concentração Bactericida Mínima

A concentração bactericida mínima (CBM), em comparação com a CIM, é

a menor concentração em µg/mL, que mata o microrganismo em estudo (Pelkzar et

al, 1998). A solução (meio de crescimento + PAA) após 24h deve ser semeada em

placas (uma placa correspondente a cada tubo). Após as placas devem permanecer

por 24 horas em estufa a 35°C. Depois desse tempo deve ser observado o

crescimento ou não das colônias, sendo que, caso ocorra crescimento, conta-se as

colônias com um contador de colônias. A placa onde não crescem nenhuma colônia

é a correspondente à concentração bactericida mínima.

4.1.9 Estudo de Eletroquímica

4.1.9.1 Condição Experimental

Corpos de prova foram confeccionados a partir de aço inox de

instrumentos odontológicos. Os mesmos foram cortados, embutidos em baquelite e

polidos mecanicamente até grau metalográfico. Ensaios acelerados de corrosão

eletroquímica empregando as técnicas de Ecorr vs. Tempo e Potenciodinâmico foram

39

conduzidos num Potenciostato&Galvanostato EGG&Par 283 em soluções recém

preparadas. Estas técnicas permitem avaliar eventuais danos corrosivos causados

pelo ácido peracético nas concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm. As

medidas foram efetuadas numa célula a três eletrodos típica, conforme ilustrado na

Figura 1. O perfil potenciodinâmico de um eletrodo de área geométrica 0,198 cm2, foi

registrado a uma velocidade de variação de potencial de 1,0 mV.s-1, iniciando num

potencial Ei de -0,5V vs OC (open circuit) até um potencial final Ef de 1,6V. O

programa usado para adquirir e tratar os dados foi o 352 Softcorr lll Corrosin

Measurement software for windows versão 3.05 elaborado pela empresa EG & G

Instruments Inc.

Figura 1: Arranjo experimental para o teste de corrosão

40

4.1.10 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa

Entre os efeitos residuais que sanitizantes podem causar estão a

genotoxicidade e conseqüentemente a mutagênese celular. Foram avaliados os

possíveis danos ao DNA impostos pelo produto em sangue total, em função das

concentrações de 800 ppm, 1500 ppm e 2500 ppm de ácido peracético. O estudo de

genotoxicidade celular foi realizado através do teste Cometa, que é um teste com a

finalidade de detectar possíveis danos ao DNA.

O Teste Cometa ou SCGE (Single Cell Gel Assay), tem sido cada vez

mais utilizado, pois permite a avaliação de danos causados no DNA. O reparo do

mesmo e o potencial genotóxico de substâncias variadas pode ser avaliado pelo

teste Cometa. (Guecheva, Henriques e Erdtmann, 2001). Pode-se realizar o teste

em qualquer organismo vivo ou tipo celular, apresentando algumas vantagens

quando comparado a outros testes para detecção de substâncias que promovem

dano ao DNA. Porém, não é utilizado para detectar mutação, mas sim lesões

genômicas que, após serem processadas podem resultar nesta.

Este método pode ser realizado em tempo que varia de horas a dias,

além de poder ser aplicado a qualquer célula de organismo vivo, tornando-o um

excelente método para avaliações ambientais, de fármacos e produtos químicos

(Silva et al, 2000). Também pode ser avaliado o número de células que tiveram ou

não o seu DNA afetado e este valor, chamado de “freqüência de dano ao DNA”, é

expresso como porcentagem de células que tiveram algum dano mensurável ao seu

código genético.

O teste Cometa em pH alcalino está representado na Figura 2. Para

realização do teste foram coletados 5 mL de sangue de 06 doadores: Após a coleta,

41

o sangue foi colocado em ependorf com 40 µl de eparina. Posteriormente se

preparou as soluções de ácido peracético nas concentrações de 800, 1500 e 2500

ppm; Para cada amostra foram colocados em outro ependorf 100 µl de sangue com

10 µl de solução de ácido peracético pelo período de 20 minutos. As células foram

colhidas e dissolvidas em agarose low-melting point (0,75%) e então plaqueadas

sobre uma lâmina de microscopia com pré-cobertura de agarose (1,5%). As lâminas

foram feitas em duplicata para cada tratamento. As células foram lisadas com uma

solução de lise (2,5 M NaCl, 100 mM EDTA, 10 mM de Tris, 1% Triton X-100 e 10%

DMSO pH 10) por no mínimo duas horas. Após a lise celular, as lâminas foram

colocadas em uma cuba de eletroforese horizontal contendo uma solução tampão

(300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH 13,00-13,50 a 4°C) que permite o

desenrolamento do DNA. Então, as laminas foram incubadas por 20 minutos nessa

solução alcalina feito na hora do uso. Uma corrente elétrica de 300 mA e 25 V foi

aplicada por 15 minutos a 4 °C. As lâminas foram então neutralizadas com 0.4 M

Tris, pH 7.5. Após estarem secas, as lâminas foram fixadas por uma solução

contendo ácido tricloroacético 15%, sulfato de zinco 5% e glicerol 5% e então

coradas com solução de coloração contendo carbonato de sódio 5% mais nitrato de

amônio 0,1%, nitrato de prata 0,1%, ácido tungstosilicico 0,25% e formaldeído

0,15%. A reação foi parada com acido acético 1% (Hartmann e Speit, 1997).

42

Figura 2: Descrição simplificada do teste cometa. Fonte: Silva, Erdtmann e Henriques, (2003). Modificada.

Foram analisados, num total de 100 células para cada grupo teste, 50 por

lâmina, em microscópio óptico NIKON®, com aumento de 400x, onde se observaram

os núcleos contendo DNA intacto, que se apresentam redondos. Nas células

lesadas observa-se migração de DNA para fora do núcleo, apresentando forma

similar a um “cometa”, de onde se origina a nomenclatura do teste (Figura 3). As

células são classificadas visualmente em cinco classes, de acordo com o tamanho

da cauda, sem danos (classe 0), até danos máximos (classe 4). Assim, o índice de

danos de cada grupo estudado pode ir do zero (100x0; 100 células observadas

completamente sem danos) a 400 (100x4; 100 células observadas com dano

máximo) (Erdtmann e Henriques, 2003).

43

Figura 3: Classificação do dano ao DNA. (a) danos classes 0 e 1;(b) danos

classes 2 e 3; (c) dano classe 4.

Fonte: Silva, Erdtmann e Henriques, (2003). Modificada.

4.1.11 Estudos Citotóxidos do Ácido Peracético

4.1.11.1 Citotoxicidade Mitocondrial (Ensaio com o Sal de Tetrazolium-MTT)

Em placa de 96 poços, foi adicionado 1 X 106 macrófagos, que foram

expostos às três diferentes concentrações de Ácido peracético (800 ppm, 1500 ppm

e 2500 ppm). Após a adição das células, a placa foi centrifugada por 10 min a 1.500

RPM. Retirou-se com cuidado de 90-95% do meio e desprezadas as células

aderidas, sendo descartado o sobrenadante. Após este procedimento, foram

adicionados 100 µl de meio RPMI em todos os poços, e 100 µl de Ácido peracético

nas concentrações acima citadas.

Adicionou-se 10 µl de MTT (10% do volume, isto é, 10 µl de MTT para

cada 100 µl de meio em todos os poços) e misturou-se com muito cuidado. Incubou-

se por 3 horas em estufa a 37° (com CO2), esperando a precipitação das células

que ficam caracterizadas pela opacidade do fundo do poço.

Centrifugou-se por 10 min a 1.500 rpm, retirou-se o sobrenadante que foi

desprezado. Posteriormente adicionou-se o mesmo volume de álcool isopropílico; a

44

seguir agitou-se vigorosamente com uma pipeta poço por poço para o MTT se

dissolver no álcool; posteriormente centrifugou-se por 5 min a 2000 rpm, retirou-se o

sobrenadante e transferiu-se para outra placa e procedeu-se a leitura. A leitura foi

realizada a 540 nm em leitor de placa ELISA automático.

4.1 Etapa Desenvolvida em Consultórios Odontológicos

Foram avaliados materiais e equipamentos contaminados de dois

consultórios odontológicos, sendo um público e o outro privado.

As soluções de ácido peracético foram preparadas para formar 1000 mL

de solução na concentração de 2500 ppm. Foram utilizados “saches” previamente

pesado pela FGM e misturados a um litro de água, adicionando primeiramente o pó

gerador e após o pó neutralizador.

O preparo da solução foi conduzido por diferentes pessoas (dentistas e

auxiliares), após breve explanação sobre as recomendações do fabricante para a

utilização do produto. A preparação da solução ocorreu antes da primeira

esterilização do dia e as coletas foram realizadas após o primeiro, terceiro e sexto

atendimento, independentemente do procedimento clínico a ser realizado.

A coleta foi realizada da seguinte forma: Utilizaram-se quatro tubos de

ensaio, onde três continham 5 mL de solução salina e um 5 mL de BHI, devidamente

esterilizados. Após o atendimento odontológico o material utilizado foi lavado de

maneira convencional com água e sabão e seco em toalhas de tecido.

Posteriormente com um swab estéril friccionou-se por trinta segundos o material.

Após, este swab era imerso no meio (salina ou BHI) e vedado. Findo o sexto

atendimento, os tubos foram levados ao laboratório, onde foram incubados na estufa

45

a 35 graus Celsius por 24 horas. Das amostras com solução salina foram retirados

100 microlitros e semeados em uma placa contendo plate count agar utilizando uma

alça de Drigalski.

Para comprovar a contaminação do material utilizado nos consultórios

odontológicos, procedeu-se da seguinte forma. Os materiais foram totalmente

submersos em uma solução de ácido peracético na concentração de 2500 ppm por

vinte minutos. Decorrido este tempo, com uma pinça estéril o material foi removido

da solução e secado com gase estéril. O procedimento de coleta e condução

laboratorial das amostras foi semelhante aos descritos antes da esterilização. Após

24 hs foi feita a contagem nas placas. As datas das coletas estão na Tabela 1.

Vale destacar que os instrumentais utilizados nos testes foram submetidos

ao procedimento habitual de esterilização do consultório após a coleta prevista no

experimento.

4.2.1 Unidade de Saúde 24h Próspera (Pública)

A unidade de saúde 24 hs Próspera está localizada no bairro Próspera

onde se localiza o CEO ( Centro de Especialidades Odontológicas) que conta com o

apoio de serviços odontológicos clínicos gerais com um consultório, dois cirurgiões

dentistas e um assistente de consultório dentário, realizando atendimento clínico de

três horas, no período matutino (08:00h às 11:00h) e vespertino (13:00h às 16:00h).

Nesta unidade são realizados atendimentos clínicos de ordem geral (exames para

diagnóstico, tartarectomias, restaurações, extrações, drenagem de abscessos e

46

atividades preventivas (profilaxias, aplicações tópicas de flúor e orientações quanto

à higiene oral).

4.2.2 Consultório Privado

O consultório odontológico que foi avaliado está localizado na rua Coronel

Pedro Benedet, nº 225, sala 306, Ed. Galeria Becker, Criciúma-Centro; o referido

consultório pertence à Cirurgiã Dentista Ana Paula Maciel que concordou com o

experimento. Nesse consultório são realizados os procedimentos de rotina de um

cirurgião dentista com destaque para os procedimentos cirúrgicos de endodontia

(tratamento de canal), pois a mesma é especialista nesta área de atuação

odontológica. O atendimento clínico é realizado no período das 14hs às 20hs de

segunda a sexta-feira; atuam nesse consultório um cirurgião dentista e uma auxiliar

de consultório dentário.

47

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste capítulo serão apresentados e discutidos os resultados obtidos no

desenvolvimento deste trabalho.

5.1 Teste de Difusão em Ágar

Nos testes laboratoriais os resultados obtidos nos testes de difusão em

ágar são apresentados na Tabela 3. Os resultados representam as médias

aritméticas.

Tabela 3: Teste de difusão em Agar

TESTE DIFUSÃO EM ÀGAR

Primeira Amostra Segunda Amostra Terceira Amostra

Bactérias

800 1500 2 500

800 1500

2500

800 1500 2500

S.a 22,5mm 25,5mm 32,5mm 25mm 25,5mm 30mm 20mm 20mm 22mm

E.c 11 mm 14mm 14,5mm 12,5mm 13,5mm 18mm 11,5mm 14,5mm 22mm

T.m 14,5mm 17mm 21mm 12mm 17mm 17,5mm 13mm 15mm 18,5mm

S.c 8,5mm 14mm 20mm 12,5mm 15,5mm 21mm 11,5mm 14mm 19mm

B.s 10mm 14mm 21,5mm 9,5mm 13mm 24,5mm 8mm 13,5 17mm

P.a 6mm 10mm 14,5mm 6,5mm 11,5mm 14mm 7,5mm 14,5mm 14,5mm

M.s 12,5mm 16,5mm 24mm 11,5mm 15mm 20,5mm 13mm 15mm 19mm

C.a 22,5mm 25mm 23mm 19,5mm 22,5mm 30mm 23mm 22mm 23mm

48

Conforme pode ser visualizado na Tabela 3 e na Figura 4, os halos

inibitórios mantiveram para todos os microrganismos, uma escala crescente de

acordo com o aumento na concentração do agente antimicrobiano.

Observa-se que para o microrganismo, Pseudomonas aeruginosa, mesmo

na concentração de 2500 ppm, o halo de inibição médio foi menor entre todos os

microrganismos testados. Já para o Staphylococcus aureus o teste apresentou o

maior halo de inibição. Essa diferença possivelmente seja decorrente das diferenças

fisiológicas dos microrganismos. O Staphylococcus aureus é uma bactéria gram

positiva enquanto a Pseudomonas aeruginosa, é uma bactéria gram negativa que

possui uma camada adicional de proteína em sua membrana celular, dificultando a

ação do ácido peracético, tornando o microrganismo menos susceptível.

Podemos observar que para todos os microrganismos testados o ácido

peracético apresentou ação bactericida, sendo mais eficiente na concentração de

2500 ppm.

A figura 4 apresenta os valores dos halos de inibição ao crescimento

bacteriano frente a três concentrações diferentes do ácido peracético (Teste de

difusão em ágar).

49

S a E c T m S c B s P a M s C a0

5

10

15

20

25

30

Hal

o de

inib

ição

em

mm

C o n c e n tra çã o à c id o p e ra c é tic o

8 0 0 p p m 1 5 0 0 p p m 2 5 0 0 p p m

Figura 4: Representação gráfica dos halos inibitórios no teste difusão

em Agar.

As figuras 5 e 6 exemplificam a diferença visual e significativa da inibição

do crescimento existente entre duas concentrações do ácido peracético frente a

mesma espécie de microrganismo (Staphylococcus aureus).

Figura 5: Halos de inibição de Staphylococcus aureus, àcido peracéticonas concentrações 800ppm.

50

Figura 6: Halos de inibição de Staphylococcus aureus, àcido

peracético nas concentrações 2500 ppm.

Os dados analisados apresentam significância estatística entre as

concentrações à nível de significância de 5%- ANOVA.

5.2 Teste de Concentração Inibitória Mínima

Conforme pode ser visualizado na Figura 7, a Concentração Inibitória

Mínima ocorre no tubo No 01, que se apresenta límpido. Nos demais tubos

observam-se que ocorreu turvação indicando o crescimento dos microrganismos.

51

Figura 7: Teste da concentração inibitória mínima da solução Peracet

à 1500 ppm para a bactéria Salmonella choleraesuis .

Na Tabela 4 apresentam-se os resultados referentes à concentração

Inibitória mínima.

Tabela 4: Respostas de crescimento dos microrganismos em diferentes concentrações de

àcido peracético

10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 10^-8 10^-9 10^-10

S.a (Gram +) 800

1500 2500

N N N

N N N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S S

S S S

E.c (Gram -) 800

1500 2500

S S N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S S

S S S

S S S

S S S

T.m (levedura) 800

1500 2500

N N N

N N N

S N N

S N N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S S

S.c (Gram -) 800

1500 2500

S N N

S S N

S S N

S S N

S S S

S S S

S S S

S S S

S S S

S S S

B.s (Gram +) 800

1500 2500

N N N

N N N

S S N

S S N

S S S

S S S

S S S

S S S

S S S

S S S

P.a (Gram -) 800

1500 2500

S N N

S S N

S S N

S S N

S S S

S S S

S S S

S S S

S S S

S S S

M.s (levedura) 800

1500 2500

N N N

N N N

N N N

N N N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S N

S S S

C.a (levedura 800

1500 2500

S S N

S S N

S S N

S S N

S S N

N S N

N S N

N S N

N S N

S S S

Legenda: N – Não turvou e não cresceu S – Turvou e cresceu

52

As concentrações indicadas na Tabela 4 não correspondem às

concentrações finais obtidas após a diluição. Estas são apresentadas na Tabela 5.

Observa-se que para concentração inicial de 2500 ppm nenhuma espécie de

bactéria sobreviveu, indicando que esta concentração nos garante o efeito

bactericida.

Conforme pode ser observado na Tabela 5 a concentração inicial que

correspondia a 2500 ppm após a diluição corresponde a 897,5 ppm. Isso é um

indicativo de que o PAA 800 ppm será eficiente como bactericida para todos os

microrganismos testados. Salienta-se que a concentração inicial que era 800 ppm

após a diluição passou para 287 ppm. Esta concentração mostrou-se ineficiente

para três dos microrganismos que foram testados.

Tabela 5: Concentração do princípio ativo após diluição seriada.

Concentração Concentração Concentração

Diluição VL (ml) Relação 800 ppm 1500 ppm 2500 ppm

10-1 5,77 0,359 287 538,5 897,5

10-2 3,33 0,249 200 373,5 622,5

10-3 1,92 0,161 128,8 241,5 402,5

10-4 1,11 0,099 79,2 148,5 247,5

10-5 0,644 6,05 x 10-2 48,4 90,7 151,2

10-6 0,370 3,567 x 10-2 28,5 53,5 89,17

10-7 0,213 2,08 x 10-2 16,64 31,2 52,0

10-8 0,123 1,215 x 10-2 9,72 18,22 30,4

10-9 0,071 7,049 x 10-3 05,63 10,573 17,6

10-10 branco 0 0 0 0

5.3 Teste de Concentração Bactericida Mínima

Observando os resultados apresentados na Tabela 6 percebe-se que,

para Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 e a Salmonella choleraesuis ATCC

53

14028, nas concentrações de 800 ppm e 1500 ppm quando semeados os mesmos

ainda desenvolveram colônias.

Tabela 6: Resultados obtidos nos testes de concentração bactericida mínima

5,77µl 3,33µl 1,92µl 1,11µl 0,644µl 0,370µl 0,213µl 0,123µl 0,071µl Branco

800 A A C C C C C C C C

S.a 1500 A A C C C C C C C C

2500 A A A A A A A A C C

800 A A A A C C C C C C

E.c 1500 A C C C C C C C C C

2500 A A A A A A C C C C

800 A A C C C C C C C C

T.m 1500 A A A A A A C C C C

2500 A A A A A A A A A C

800 C C C C C C C C C C

S.c 1500 C C C C C C C C C C

2500 A A A A C C C C C C

800 A A A C C C C C C C

B.s 1500 A A A A C C C C C C

2500 A A A A C C C C C C

800 C C C C C C C C C C

P.a 1500 C C C C C C C C C C

2500 A A A A C C C C C C

800 A A A A C C C C C C

M.s 1500 A A A C C C C C C C

2500 A A A A A A A A C C

800 C C C C C C C C C C

C.a 1500 A A A A A C C C C C

2500 A A A A A A A C C C

54

Os resultados obtidos no teste da concentração bactericida mínimo, em

concordância com os resultados obtidos no teste de concentração inibitória mínima,

levam a concluir que as concentrações menores (800 e 1500 ppm) possibilitaram o

crescimento de alguns dos microrganismos testados. Em função destes resultados

a concentração de 2500 ppm tornou-se a mais indicada para os testes nos

consultórios odontológicos.

5.4 Ensaios de Corrosão

Um aspecto importante que deve ser levado em consideração na

esterilização química é a degradação corrosiva dos equipamentos, decorrente do

emprego de agentes físicos e/ou químicos. Diversos produtos, embora eficientes no

aspecto microbiológico, apresentam forte ação corrosiva, inviabilizando seu

emprego. O ácido peracético, um agente oxidante in-natura apresenta

características corrosivas, como esperado. No sentido de minimizar este efeito foi

adicionado um agente neutralizante.

Antes de cada ensaio potenciodinâmico, registrou-se o potencial de

circuito aberto (OC) durante 30 minutos, a fim de estabilizar a interface substrato //

meio. As curvas de Ecorr vs. Tempo não são apresentadas. A Tabela 7 sumariza os

principais resultados obtidos a partir dos perfis potenciodinâmicos de substratos de

aço inox de instrumentos odontológicos, cobre e platina, registrada em diferentes

concentrações de ácido peracético pode ser visualizada os principais resultados do

ensaio potenciodinâmico. Verifica-se que a taxa de corrosão do aço inox, calculada

a partir das inclinações de Tafel, cresce com o aumento da concentração de ácido

peracético. Entretanto, os valores são muito baixos, isto é, 21,58 x 10-6 cm.ano-1, XX

55

e YY, para as concentrações de 800, 1500 e 2500 ppm, respectivamente. Estes

valores representam taxas muito baixa, indicando que o produto pode ser usado

com segurança, no que tange a resistência à corrosão.

Tabela 7: Taxa de corrosão em cm.ano-1 em eletrodos de aço inox nas

concentrações de Peracet de 800,1500 e 2500 ppm/mL.

Concentração (ppm)

Eletrodos Parâmetro

ICORR (nA)

800

22,27

1500

180,5

2500

256,70

ECORR (mV) -99,70 -113,5 -196,70

Aço Inox TxCORR (cm/ano)

ICORR (µA)

21,58 x 10-6

88,4

183,24 x 10-6

52,15

248,82 x 10-6

46,95

Cobre ECORR (mV) -128,13 -18,22 -108,4

ICORR (µA) 10,98 12,16 15,42

Platina

ECORR (mV) -51,9 123,32 -195,7

A Figura 8 corresponde à sobreposição dos perfis potenciodinâmicos para

corpos de prova de aço inox em ácido peracético nas concentrações de 800, 1500 e

2500 ppm, registrados a uma velocidade de varredura de 1 mV.s-1. Observa-se que

abaixo de Ecorr todos os perfis são similares, com diminuição gradual na densidade

de corrente, a medida que o potencial varia da região catódica para anódica.

Entretanto, o Ecorr torna-se mais negativo, a medida que a concentração do ácido

peracético aumenta em ocorre uma taxa de corrosão muito baixa com os eletrodos

em estudo (aço inox). Acima de Ecorr, não se verifica tendência a passivação, em

toda a faixa de potencial investigada. Adicionalmente, as densidades de corrente

são progressivamente superiores em função do aumento de concentração, o que

está de acordo com as taxas de corrosão calculadas.

56

- 1 4 - 1 2 - 1 0 - 8 - 6 - 4 - 2- 1 0 0 0

- 5 0 0

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

E(

mV

)

l o g ( I ) ( l o g ( A ) )

8 0 0 p p m 1 5 0 0 p p m 2 5 0 0 p p m

Figura 8: Perfis potenciodinâmicos do aço inox em ácido peracético.

O produto, portanto, pode ser utilizado com segurança para assepsia de

instrumentos fabricados com material similar ao testado, sem ocasionar dano

corrosivo considerável.

5.5 Teste de Genotoxicidade

Na Figura 9 são apresentados os resultados de 06 amostras em duplicata

do teste Cometa, onde estão representados os possíveis danos ao DNA em

comparação aos controles positivo e negativos.

Nessa figura observa-se a média do índice de dano ao DNA causado pelo

Ácido Peracético em varias concentrações, quando incubado com sangue total

periférico de seis (6) indivíduos humanos em cultura por 90 minutos.

57

85,16778,66767,667

50,000

32,667

0

20

40

60

80

100

120

Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2Tratamento

ìndi

ce d

e da

no a

o D

NA

***

85,16778,66767,667

50,000

32,667

0

20

40

60

80

100

120

Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2Tratamento

ìndi

ce d

e da

no a

o D

NA

***

Figura 9: Média do índice de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético. A

comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS pH

7,0), sendo *p<0,05 e **p<0,001.

Na concentração de 800 ppm o índice de dano foi de 50,00±16,50; na

concentração de 1500ppm foi de 67,667±29,12; na concentração de 2500 �ppm o

índice de dano ao DNA foi de 78,667±25,74; e na incubação com Peróxido de

Hidrogênio (H2O2) o índice observado foi de 85,167±15,38.

É importante salientar que a incubação com H2O2, é realizado para

verificar a funcionalidade do teste, onde se utiliza 150 µM de H2O2 para indução do

dano ao DNA.

A diferença estatística é notada na concentração de 1500 ppm com

p<0,05 e na concentração de 2500 ppm com p<0, 01, tendo como referência para

comparação o controle negativo contendo Tampão PBS pH 7,0.

O índice de dano ao DNA varia de 0 (0, classificação de dano ao DNA) x

100 (Referente ao número de células observadas) a 400 (100 (quantidade de células

observadas) x 4(Dano ao DNA).

58

5.6 Freqüência de Dano ao DNA

A figura 10 representa a média da freqüência de dano ao DNA causado

pelo Ácido Peracético em varias concentrações, quando incubado com sangue total

periférico de seis (6) indivíduos humanos em cultura por 90 minutos.

Na concentração de 800ppm foi observado uma freqüência de

37,167±13,14; na concentração de 1500ppm� a freqüência observada foi de

44,167±11,65; na concentração de 2500ppm� 51,667±11,98 foi a freqüência

observada e 55,167±7,22; foi freqüência observada para o tratamento com 150 µM

de H2O2.

A diferença estatística é notada na concentração de 2500ppm com p<0,

05, tendo como referência para comparação o controle negativo contendo Tampão

PBS pH 7,0.

É importante salientar que a freqüência de dano ao DNA é observada

pela soma de células danificadas no teste cometa. Esta descrição varia de 0 a 100,

0 é dado quando todas as células observadas não apresentam dano ao DNA e 100

é o número dado quando todas as células observadas pelo teste cometa são

lesadas, independente se o índice de dano é classificado de 1, 2, 3 ou 4.

59

55,16751,66744,167

37,167

29,333

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2Tratamento

% d

e da

no a

o D

NA

*55,16751,667

44,16737,167

29,333

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2Tratamento

% d

e da

no a

o D

NA

*

Figura 10: Média da Freqüência de dano ao DNA causado pelo Ácido Peracético.

A comparação foi realizada tendo como referencia o controle (PBS

pH).

Observa-se na figura 11 que o ácido peracético em contato direto com as

células pode causar danos no DNA; salientamos que como esterilizante químico não

entra em contato direto como as células dos tecidos. Em concentração menor 800

ppm/mL o seu efeito é menor do que na concentração de 2500 ppm/mL. Salienta-se

que possíveis resíduos que entrarem em contato com o tecido após o enxágüe do

material estarão diluídos diminuindo consideravelmente seu efeito de dano ao DNA.

Além disso, o produto sofre rápida degradação gerando H2O2 e ácido acético.

Portanto, a possibilidade do produto entrar em contato com as células da cavidade

bucal são muito baixas.

60

85,16778,66767,667

50,000

32,667

0

20

40

60

80

100

120

Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2Tratamento

ìndi

ce d

e da

no a

o D

NA

***

85,16778,66767,667

50,000

32,667

0

20

40

60

80

100

120

Controle 800ppm 1500ppm 2500ppm H2O2Tratamento

ìndi

ce d

e da

no a

o D

NA

***

Figura 11: Índice de dano ao DNA celular do Peracet nas concentrações de 800,

1500 e 2500ppm/mL em comparação aos controles negativos (água)

e controle positivo (próxido de hidrogênio).

5.7 Estudo Citotóxico do Ácido Peracético

O teste de citotoxicidade foi realizado com intuito de aproximar os

resultados às condições operacionais na esterilização de material odontológico

utilizando o ácido peracético. A principal diferença quando comparado ao teste de

genotoxicidade está no fato do material nuclear estar protegido pela membrana

celular.

Na Tabela 8 são apresentados o número de células viáveis após a

exposição ao ácido peracético nas diferentes concentrações e contagem realizada

em leitor de ELISA automático. A absorbância do controle positivo foi de 0,589.

61

Tabela 8: Absorbância do número de células viáveis

após exposição ao ácido peracético.

Concentração 800 ppm 1500 ppm 2500 ppm

Leitura 1 0,624 0,526 0,420

Leitura 2 0,497 0,469 0,403

Leitura 3 0,607 0,445 0,411

Leitura 4 0,444 0,400 0,340

Média 0,543 0,460 0,3935

Variança 0,00752 0,00275 0,00132

A análise estatística do teste T com nível de significância de 0,5% obteve-

se os valores t= -1,63734 e p= 0,15267. A conclusão é que a comparação entre as

concentrações de 800 ppm e 1500 ppm não apresentam diferença significativa.

O teste T entre as concentrações de 1500 ppm e 2500 ppm apresenta t= -

2,08364 e p= 0,08232. A conclusão é que para um nível de significância de 0,5%

não apresenta diferença significativa.

A análise ANOVA por uma via apresenta os valores de f= 5,80421 e p=

0,02404. A um nível de significância de 0,5% os resultados mostram diferença

significativa.

Para uma melhor visualização apresenta-se na figura 12 os dados obtidos.

62

Figura 12: Representação gráfica da absorbância de células viáveis

frente a diferentes concentrações.

A comparação de redução celular na concentração de 800 ppm pra o

controle positivo foi de 7,8%. Quando comparado à concentração de 1500 ppm a

redução foi de 21,9%. A concentração de 2500 ppm apresentou uma redução de

33,28%. Dados da literatura apontam que uma redução de até 10% não é

considerada citotóxico. Acima deste valor passa a ser significativo.

5.8 Etapa Realizada nos Consultórios Odontológicos

5.8.1 Testes de Esterilização Química com o Ácido Peracético na Concentração

de 2500 ppm em Material Odontológico Contaminado

Os testes de verificação da eficácia de esterilização do ácido peracético

foram realizados na concentração de 2500 ppm, pois nesta concentração os

resultados na etapa laboratorial mostraram-se mais eficientes.

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Abs

orbâ

ncia

de

célu

las

viáv

eis

Concentração de Ácido Peracético

C2500 C1500 C800

63

Na Tabela 9 são transcritos o número de colônias de microrganismos das

72 amostras em solução salina antes e após a esterilização com o ácido peracético

na concentração de 2500 ppm; a semeadura foi realizada em PCA. Observa-se

ainda, que após o atendimento odontológico o material utilizado se apresenta

contaminado e que a imersão deste material em solução de ácido peracético na

concentração de 2500 ppm por 20 minutos promoveu sua completa esterilização em

todas as coletas efetuadas, comprovando sua eficácia na esterilização desses

materiais. Pode ser observado, ainda, que em uma coleta o material antes da

esterilização não apresentou microrganismos, sendo desconhecido o fator que

causou tal resultado. Possivelmente a lavagem prévia do material tenha sido

efetuada de maneira eficiente, retirando o biofilme formado e demais sujidades,

deixando o material com alto nível de limpeza.

64

Tabela 9: Contagem de colônias de MO antes e após esterilização em consultório

público.

Coleta 1

09/05/06

Nº

colônias

antes

Nº

colônias

depois

Coleta 2

09/05/06

Nº

colônias

antes

Nº

colônias

depois

Coleta 3

09/05/06

Nº

colônias

antes

Nº

colônias

depois

Amostra1 10 00 07 00 06 00

Amostra 2 03 00 02 00 05 00

Amostra 3 06 00 05 00 07 00

Coleta 1

12/05/06

Coleta 2

12/05/06

Coleta 3

12/05/06

Amostra1 03 00 10 00 22 00

Amostra2 05 00 07 00 07 00

Amostra3 00 00 15 00 12 00

Coleta 1

16/05/06

Coleta 2

16/05/06

Coleta 3

16/05/06

Amostra1 02 00 02 00 00 00

Amostra2 01 00 05 00 01 00

Amostra3 00 00 10 00 03 00

Coleta 1

18/05/06

Coleta 2

18/05/06

Coleta 3

18/05/06

Amostra1 02 00 17 00 07 00

Amostra2 05 00 13 00 05 00

Amostra3 00 00 08 00 11 00

Coleta 1

22/05/06

Coleta 2

22/05/06

Coleta 3

22/05/06

Amostra1 10 00 10 00 02 00

Amostra2 18 00 00 00 01 00

Amostra3 15 00 05 00 05 00

Coleta 1

25/05/06

Coleta 2

25/05/06

Coleta 3

25/05/06

Amostra1 33 00 25 00 14 00

Continua =>

65

Amostra2 17 00 10 00 12 00

Amostra3 11 00 15 00 07 00

Coleta 1

31/05/06

Coleta 2

31/05/06

Coleta 3

31/05/06

Amostra1 23 00 09 00 14 00

Amostra2 40 00 00 00 21 00

Amostra3 18 00 12 00 06 00

Coleta 1

02/06/06

Coleta 2

02/06/06

Coleta 3

02/06/06

Amostra1 00 00 03 00 12 00

Amostra2 00 00 15 00 17 00

Amostra3 00 00 09 00 07 00

Na Tabela 10 são apresentados os resultados de 24 amostras em BHI

antes e após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500 ppm

em material odontológico contaminado na unidade de saúde 24 hs Próspera-

Criciúma S/C.

Continuação

66

Tabela 10: Resultados do crescimento microbiano das amostras em BHI. Coleta 1

09/05/06

Turvou Não

turvou

Coleta 2

09/05/06

Turvou Não

turvou

Coleta 3

09/05/06

Turvou Não

turvou

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

12/05/06

Coleta 2

12/05/06

Coleta 3

12/05/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

16/05/06

Coleta 2

16/05/06

Coleta 3

16/05/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

18/05/06

Coleta 2

18/05/06

Coleta 3

18/05/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

22/05/06

Coleta 2

22/05/06

Coleta 3

22/05/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

25/05/06

Coleta 2

25/05/06

Coleta 3

25/05/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

31/05/06

Coleta 2

31/05/06

Coleta 3

31/05/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

02/06/06

Coleta 2

02/06/06

Coleta 3

02/06/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

67

Na Tabela 10 observa-se claramente que o material, antes da exposição

ao ácido peracético na concentração de 2500 ppm, estava contaminado. Os dados

contidos na tabela 10 ratificam os resultados apresentados na tabela 09 mostrando a

eficácia da esterilização do ácido peracético na concentração de 2500 ppm nas

amostras coletadas em BHI, onde se verifica a ausência total de crescimento

bacteriano após a esterilização do material.

Na Tabela 11 observa-se a ação bactericida do ácido peracético na

concentração de 2500 ppm no consultório odontológico localizado na rua Coronel

Pedro Bennedet 226/306 - Criciúma S/C. O tempo de exposição ao produto foi de 20

minutos. Os resultados da análise bactericida no consultório odontológico particular

são semelhantes aos do consultório público comprovando a efetividade da

esterilização do ácido peracético, obtendo-se um resultado absoluto de esterilização.

Tabela 11: Contagem das colônias de microrganismos antes e após a esterilização

no consultório particular.

Coleta 1

27/06/06

Nº colônias

antes

Nº colônias depois

Coleta 2

27/06/06

Nº colônias

antes

Nº colônias depois

Coleta 3

27/06/06

Nº colônias

antes

Nº colônias depois

Amostra 1 03 00 03 00 05 00

Amostra 2 02 00 01 00 03 00

Amostra 3 01 00 02 00 07 00

Coleta 1

03/07/06

Coleta 2

03/07/06

Coleta 3

03/07/06

Amostra 1 07 00 03 00 04 00

Amostra 2 12 00 00 00 03 00

Amostra 3 05 00 05 00 03 00

Coleta 1

05/07/06

Coleta 2

05/07/06

Coleta 3

05/07/06

Amostra 1 00 00 05 00 12 00

Continua =>

68

Amostra 2 00 00 07 00 23 00

Amostra 3 00 00 00 00 17 00

Coleta 1

10/07/06

Coleta 2

10/07/06

Coleta 3

10/07/06

Amostra 1 22 00 13 00 22 00

Amostra 2 14 00 16 00 17 00

Amostra 3 03 00 11 00 05 00

Coleta 1

13/07/06

Coleta 2

13/07/06

Coleta 3

13/07/06

Amostra 1 00 00 09 00 17 00

Amostra 2 05 00 12 00 21 00

Amostra 3 02 00 17 00 15 00

Coleta 1

20/07/06

Coleta 2

20/07/06

Coleta 3

20/07/06

Amostra 1 30 00 00 00 13 00

Amostra 2 22 00 00 00 22 00

Amostra 3 17 00 00 00 09 00

Coleta 1

27/07/06

Coleta 2

27/07/06

Coleta 3

27/07/06

Amostra 1 07 00 32 00 19 00

Amostra 2 15 00 34 00 05 01

Amostra 3 31 00 45 00 08 00

Coleta 1

13/09/06

Coleta 2

13/09/06

Coleta 3

13/09/06

Amostra 1 44 00 21 00 08 00

Amostra 2 32 00 13 00 09 00

Amostra 3 23 00 17 00 06 00

No dia 27/07/06 houve o crescimento de uma colônia bacteriana após a

esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500ppm, que pode ter

Continuação

69

ocorrido por contaminação durante o experimento, portanto essa amostra foi

desprezada.

Na Tabela 12 são apresentados os resultados de 24 amostras em BHI

antes e após a esterilização com o ácido peracético na concentração de 2500 ppm

em material odontológico contaminado localizado na Rua Coronel Pedro Bennedet

226/306.

Tabela 12: Resultados das amostras recolhidas em BHI

Coleta 1

27/06/06

Turvou Não Turvou

Coleta 2

27/06/06

Turvou Não Turvou

Coleta 3

27/06/06

Turvou Não Turvou

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

03/07/06

Coleta 2

03/07/06

Coleta 3

03/07/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

05/07/06

Coleta 2

05/07/06

Coleta 3

05/07/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

10/07/06

Coleta 2

10/07/06

Coleta 3

10/07/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

13/07/06

Coleta 2

13/07/06

Coleta 3

13/07/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 2

20/07/06

Coleta 2

20/07/06

Coleta 2

20/07/06

Antes x Antes x Antes x

Continua =>

70

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

27/07/06

Coleta 2 27/07/06

Coleta 3 27/07/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

Coleta 1

13/09/06

Coleta 2

13/09/06

Coleta 3

13/09/06

Antes x Antes x Antes x

Depois x Depois x Depois x

A Tabela 12 ratifica os resultados observados na tabela 11, demonstrando

a eficiência na esterilização do ácido peracético na concentração de 2500 ppm em

materiais odontológicos contaminados, após o atendimento clínico. Na coleta

efetuada no dia 20/07/2006 não houve turvamento da segunda amostra (antes e

após a esterilização).

Continuação

71

6 CONCLUSÃO

Durante os testes efetuados a esterilização foi efetiva em todas as

amostras utilizando o ácido peracético na concentração de 2500 ppm/ml.

A técnica de preparo da solução de PAA é simples e não surgiram

dificuldades durante o manuseio; Um ponto negativo observado durante o preparo é

o tempo de diluição de cinco minutos do pó gerador.

Uma vantagem a ser apontada neste processo é a esterilização de

materiais termo-sensíveis.

O tempo de esterilização é inferior ao da estufa e de autoclave. Em 20

minutos observou-se ausência total de crescimento de microrganismos nos materiais

odontológicos contaminados.

As pessoas que usaram o ácido peracético 2500 ppm na esterilização do

material observaram que o mesmo apresentava manchas escuras que são

características de corrosão.

O teste de citotoxicidade apresentou alterações significativas nas

concentrações de 1500 ppm e 2500 ppm. No entanto, os resíduos do PAA que

podem permanecer sobre instrumentais esterilizados são o H2O2 e ácido acético,

portanto, não representam risco.

O resultado de citotoxididade e genotoxicidade indicam a necessidade do

uso de EPI (equipamentos de proteção individual) por parte do usuário.

Procedimento que inclusive já faz parte dos procedimentos habituais em consultórios

odontológicos.

72

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