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Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Físicas e Matemáticas
Departamento de Química
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE PLANTAS
ORNAMENTAIS FRENTE AO TESTE COM Artemia
salina Leach.
Aluna: Karina Zaia Machado
Orientadora: Profa. Dra. Inês Maria Costa Brighente
Florianópolis, julho de 200
Relatório Referente ao Estágio de
Conclusão de Curso – Química
Habilitação Bacharelado
3.
2
Universidade Federal de Santa Catarina
Centro de Ciências Físicas e Matemáticas
Departamento de Química
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE PLANTAS
ORNAMENTAIS FRENTE AO TESTE COM Artemia
salina Leach.
Relatório Referente ao Estágio de Conclusão de Curso – Química
Habilitação Bacharelado, realizado no LQPN no período de
março a julho / 2003
Karina Zaia Machado
aluna
Inês Maria Costa Brighente
orientadora
3
SUMÁRIO
1. RESUMO 1
2. INTRODUÇÃO 2
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3
3.1. Histórico 3
3.2. Plantas Tóxicas 4
3.2.1. Plantas Tóxicas Estudadas 6
3.3. TESTE DE TOXICIDADE FRENTE A Artemia salina 19
4. OBJETIVOS 20
4.1. Objetivos Gerais 20
4.2. Objetivos Específicos 20
5. MATERIAIS E MÉTODOS 21
5.1. Equipamentos 21
5.2. Substâncias utilizadas 21
5.3. Coleta e Identificação das Espécies Vegetais 21
5.4. Obtenção do Extrato Hidroalcoólico Bruto 21
5.5. Teste de Toxicidade Frente a Artemia salina 22
5.6. Investigação Química Preliminar 24
5.7. Estudo Fitoquímico do Extrato de Zantedeschia aethiopica 26
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 29
6.1. Análise do Bioensaio Utilizando Artemia salina 29
6.2. Análise dos Ensaios Qualitativos para a Determinação das Classes de
Produtos Naturais Presentes no Extrato, Através de Marcha Analítica 32
6.3. Análise do Estudo Fitoquímico do Extrato de Zantedeschia aethiopica 31
7. CONCLUSÃO 35
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 36
9. ANEXOS 39
4
1. RESUMO
Plantas tóxicas podem causar sérios danos a seres humanos e animais, com
prejuízos significativos a saúde pública e a pecuária. Segundo o Centro de Informação
Toxicológica do estado de Santa Catarina (CIT-SC), um número restrito de plantas
ornamentais está relacionado com a maioria das intoxicações, sendo que comigo-ninguém-
pode responde sozinho por 30% dos casos. Outras plantas como aroeira, arruda, copo-de-
leite, coroa-de-cristo, espada-de-são-jorge e espirradeira, que serão estudadas neste
trabalho, seguem a lista das principais plantas tóxicas. O bioensaio que utiliza A. salina
apresenta boa correlação com ensaios de toxicidade em geral e anti-tumorais. Sendo assim,
este trabalho utiliza o bioensaio de A. salina na avaliação do grau de toxicidade de algumas
plantas ornamentais, notoriamente tóxicas. Por este bioensaio, toma-se como base para
considerar uma planta tóxica, o valor de DL50 < 1000 ppm.
As espécies ornamentais foram identificadas no Departamento de Botânica-UFSC.
O material botânico foi submetido a secagem com posterior maceração em etanol. Os
extratos obtidos foram concentrados em evaporador rotativo e avaliados quanto a
toxicidade frente a A. salina em concentrações de 50-1000 ppm. Os testes foram feitos em
triplicata, com dez larvas por tubo de ensaio, utilizando K2Cr2O7 como controle positivo
(DL50 = 20–40 ppm). Após 24 hs, foi determinado a % de mortalidade para cada
concentração e a DL50 foi calculada através do gráfico de % de mortalidade em função do
logarítmo da concentração.
Das onze plantas testadas, as que apresentaram maior toxicidade foram Ruta
graveolens (arruda), Sansevieria trifasciata (espada-de-são-jorge), Zantedeschia aethiopica
(copo-de-leite), Hedera helix (hera) e Nerium ollander (espirradeira), sendo que os demais
extratos não apresentaram toxicidade, segundo este bioensaio. Porém, para os extratos
inativos, a toxicidade pode estar relacionada com compostos termo- ou foto-sensíveis, que
não foram detectados por este método.
Finalmente, no extrato de Zantedeschia aethiopica foram feitos alguns estudos
fitoquímicos prévios.
5
2. INTRODUÇÃO A toxicologia das plantas, relacionada à espécie humana, assume aspectos variados
e importantes, interessando diferentes campos, entre os quais destaca-se a medicina,
biologia, botânica e química. A intoxicação aguda, quase sempre por ingestão acidental de
uma planta ou de alguma de suas partes tóxicas, é de incidência preponderante no grupo
pediátrico. Embora de incidência universal, este tipo de intoxicação possui distribuição e
intensidade nitidamente regionais. Entre os adultos, a intoxicação por plantas é muito pouco
freqüente, e quando ocorre, é quase sempre devida a ingestão de uma espécie tóxica que é
confundida com alimento, ou então conseqüente a atividades industriais ou agrícolas, sendo
nesse caso, mais um problema alérgico ou físico do que toxicológico propriamente dito. A
intoxicação crônica conseqüente à ingestão continuada, acidental ou propositada de certas
espécies vegetais, é responsável por distúrbios clínicos muitas vezes complexos e graves.
Assim, as principais medidas preventivas para diminuir o risco de intoxicação com
plantas são: divulgar o máximo possível e por todos os meios de comunicação, as espécies
tóxicas mais comuns; recomendar a necessidade de orientação médica ao se utilizar algum
preparado vegetal para fins medicinais, e finalmente educar a população sobre a
inconveniência de ingerir ou manusear qualquer espécie vegetal desconhecida. Portanto, é
necessário conhecer as plantas perigosas da região, da casa e do quintal, conhecê-las pelo
aspecto e pelo nome (Schavartsman, 1992).
Neste trabalho pretende-se aplicar o teste de toxicidade frente a Artemia salina, a
fim de avaliar o grau de toxicidade de uma variedade de plantas ornamentais,
reconhecidamente tóxicas. A. salina (Artemiidae) é um microcrustáceo que tem sido usado
com sucesso como teste alternativo para determinação da toxicidade de produtos químicos
e naturais (Sam, 1993; Meyer et al., 1982). Sabendo-se que a utilização de plantas
ornamentais que possuem algum efeito tóxico ao homem e animais é muito grande,
objetivou-se inicialmente o estudo de onze espécies tóxicas, entre estas, algumas
registradas como causadoras de intoxicação pelo Centro de Informação Toxicológica em
SC (CIT-SC).
6
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. HISTÓRICO
Ao longo do tempo, plantas tóxicas foram consideradas de modo muito diverso. Nos
primórdios da sua origem e evolução, o homem percebeu que as plantas tinham além da
capacidade de alimentar e curar, a de poder matar.
Ampla utilização é referida na Idade Média, com fins políticos, militares ou
pessoais, como recurso em envenenamentos intencionais. Na Grécia antiga, onde a
produção de gêneros alimentícios era escasso, o governo estabeleceu medidas drásticas para
impedir a fome utilizando-se da "cicuta". Por este motivo indivíduos com mais de 60 anos,
eram eliminados sumariamente, sendo a "cicuta" (Conium maculatum L.) o meio usado
para exterminação das pessoas já alquebradas e inaptas para o trabalho. Sócrates um dos
maiores filósofos da história, quando condenado à morte pelo Sinédrio, teve como agente
da sua sentença, a "cicuta".
Muitas plantas venenosas, como a beladona (Atropa belladona) e a digital ou
dedaleira (Digitalis lanata), fornecem substâncias, que quando usadas na dosagem correta,
possui grande valor terapêutico ou medicinal.
Em épocas remotas, e também no século XX em algumas regiões, plantas tóxicas
exerceram papel importante para prover alimentação, através do uso como veneno de
flechas na caça ou como veneno para peixes. Os caboclos brasileiros usam as espécies do
grupo dos timbós, sapindáceas e leguminosas para envenenar a água dos rios e assim matar
peixes. Esse tipo de pesca, apesar de predatório, permite, com pouco esforço, resultados
imediatos dos mais compensadores.
Os índios por sua vez, envenenavam suas flechas com o curare. Esse extrato, obtido
de certas plantas do gênero Strychnos e de Chondrodendron tomentosum, tem ação
paralisante e é mortífero, por atacar os músculos inspiratórios.
Mais recentemente, ao fim do século XIX e início do século XX, plantas tóxicas
exerceram importante papel como fonte de substâncias ativas capazes de propiciar modelos
moleculares para o desenvolvimento de fármacos.
O homem aprendeu sobre as plantas pelo processo da tentativa e erro. Hoje vivemos
num mundo em que existe certo conhecimento sobre os transtornos que as plantas podem
7
acarretar ao homem. As plantas ornamentais são as que se encontram mais próximas e de
fácil acesso, plantas essas que embelezam e podem trazer sensações agradáveis ao homem
pela sua beleza exterior. Entretanto, elas trazem também danos irreparáveis, pois por trás de
tanta beleza, pode conter na sua constituição química, elementos não apropriados a espécie
humana e dos animais, com prejuízos significativos à saúde pública e à pecuária.
3.2. PLANTAS TÓXICAS
As plantas são seres vivos complexos, e como tais apresentam um extraordinário
metabolismo, que leva à produção de uma grande variedade de substâncias químicas.
Algumas destas substâncias como, por exemplo, proteínas, lipídios, carboidratos e ácidos
nucléicos, originárias do metabolismo primário, são comuns a todos os seres vivos, sendo
usadas no crescimento, na reprodução e na manutenção do vegetal. No entanto, um grande
número de compostos químicos produzidos pelos vegetais serve a outros propósitos. Os
pigmentos (flavonóides, antocianinas e betalaínas) e os óleos essenciais (monoterpenos,
sesquiterpenos e fenilpropanóides) atraem polinizadores, enquanto algumas outras
substâncias como os taninos, as lactonas sesquiterpênicas, os alcalóides e os iridóides, além
de apresentarem sabores desagradáveis, podem ser tóxicas e irritantes para outros
organismos. Estas substâncias, originadas a partir de rotas biossintéticas diversas, e que
estão restritas a determinados grupos de organismos, são produtos do metabolismo
secundário (Vickery & Vickery, 1981). Elas protegem as plantas contra predadores e
patógenos (Poser & Mentz, 2001).
Várias destas substâncias tóxicas podem causar graves envenenamentos em seres
humanos ou em animais domésticos quando plantas que as contenham são ingeridas, ou
quando entram em contato com a pele. No entanto, a simples presença destas substâncias
em uma determinada espécie vegetal parece não ser suficiente para qualificá-la como
tóxica. O primeiro requisito para suspeitar da possível toxicidade de uma planta, é o relato
de uma pessoa que tenha desenvolvido um quadro clínico após a ingestão ou o contato com
a espécie em questão. Todavia, pode acontecer de uma outra pessoa (ou animal nos casos
veterinários) ter o mesmo tipo de contato com a espécie, e não ser observada
sintomatologia aparente. Isto pode ser conseqüência de um, ou da associação de vários
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fatores, tornando incerta a condição de planta tóxica admitida anteriormente. Sendo assim,
para a qualificação de uma planta como tóxica ou não tóxica, é necessário ter em mente as
seguintes variáveis (Schvartsman, 1992): i) Diferentes partes de uma mesma planta (raiz,
caule, flores, frutos e sementes) freqüentemente contêm diferentes concentrações de
substâncias químicas; ii) A idade da planta e o estado de amadurecimento dos frutos
contribuem para a variabilidade das concentrações das substâncias; iii) Clima, solo e
estação do ano alteram a síntese de alguns compostos; iv) Variedades da mesma espécie
podem apresentar constituições químicas diferentes; v) Patologias vegetais como ataques de
fungos, ataques de bactérias e até mesmo a predação por herbívoros, podem induzir o
vegetal a produzir substâncias que normalmente não produz; vi) Indivíduos diferentes
apresentam diferentes taxas de sensibilização a certas substâncias vegetais; vii) A
intoxicação pode estar limitada à quantidade de vegetal ingerido, ou à maneira de ingestão
(bem ou mal mastigado).
A descrição botânica da planta, com fotografia detalhada, nomes vulgares e
científicos e de algumas, até sinônimos estrangeiros, visa ajudar rapidamente os
responsáveis por vidas, como médicos e veterinários, a identificar a planta tida como
tóxica, pois em alguns casos o tempo é fator vital. É fácil saber se a planta é uma erva,
arbusto, árvore ou trepadeira; se apresenta látex ou não, pelos urticantes, espinhos; qual tipo
de folha, cor das flores e forma dos frutos, etc. características estas úteis para a
identificação, pois em casos de emergência as plantas parecidas sempre são da mesma
espécie ou do mesmo gênero, ou, ainda, da mesma família.
O conceito de substâncias tóxicas é bastante relativo, pois depende da dosagem e do
indivíduo. Há substâncias altamente tóxicas que, em dosagens mínimas, entram na
composição de vários remédios.
Na grande maioria das intoxicações por plantas sempre ocorre, em alguma fase de
sua evolução, distúrbios digestivos, incluindo não apenas manifestações gastrintestinais,
tais como vômitos, cólicas abdominais e diarréia, como também comprometimento
hepático, que usualmente é de difícil diagnóstico, além dos distúrbios do trato digestivo
superior, incluindo boca e faringe. A ocorrência de distúrbios gastrintestinais pode ser
devida a vários tipos de agentes tóxicos existentes na planta, entre os quais podem ser
citados: proteínas tóxicas, glicoalcalóides, saponinas, resinas, entre outros.
9
Em algumas obras clássicas (Hoehne, 1978; Kingsbury, 1964), centenas de plantas
são citadas como tóxicas. No entanto, a margem de certeza sobre a toxicidade de uma
planta é limitada por uma série de fatores. Para ocorrer a intoxicação, seja por ingestão de
uma dose tóxica, seja pelo contato através da pele, devem ser vencidos, no processo, os
mecanismos próprios de defesa da cada organismo. Assim, uma planta pode ser
potencialmente tóxica, e apesar disso, não provocar a intoxicação, determinando, nesse
caso, a convicção equivocada de ausência de toxicidade (Simões et al., 1999).
A verificação da toxicidade depende principalmente de experimentos em animais,
que nem sempre reproduzem a toxicidade em seres humanos, ou de relatos sobre
intoxicações acidentais. Infelizmente, a maior parte destes relatos não é acompanhada de
informações quanto a quantidade ou parte do vegetal ingerido, ou ainda, quanto à
identificação da planta através de nomes científicos.
3.2.1. PLANTAS TÓXICAS ESTUDADAS
Alamanda
Allamanda cathartica, planta disseminada por todo país, pertence à família botânica
das Apocynaceas, apresenta-se popularmente sob vários nomes como por exemplo,
Alamanda, Alamanda-amarela, Dedal-de-dama, Orelia, Quatro patacas amarela, Santa
Maria (Correa, 1984).
Trata-se de uma trepadeira arbustiva e lactescente, semi-lenhosa, vigorosa, de folhas
variáveis, brilhantes e espessas, apresentando flores amarelas em forma de funil, freqüente
em jardins (Schvartsman, 1992). Figura 1.
Todas as partes desta planta são consideradas de potencial toxicidade, especialmente
o látex resinoso (Simões et al., 1999).
Estudos fitoquímicos realizados por alguns autores revelaram a presença de
esteróides e triterpenos (Gupta et al., 1969). Akah & Offiah (1992) isolaram do extrato das
folhas substâncias farmacologicamente ativas capazes de estimular os movimentos
peristálticos. Análises cromatográficas deste extrato revelaram a presença de alcalóides,
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saponinas, flavonóides e carboidratos, mas seus papéis específicos nos efeitos purgativos
não foram estudados. Porém, é possível que as saponinas contidas no extrato possam elevar
os efeitos tóxicos, devido às suas propriedades emolientes ou estimulantes (Akah & Offiah
1992). Coppen (1983) e Abdel-Kader et al. (1997) isolaram iridóides de A. cathartica,
sendo que o primeiro cientista relacionou a atividade algicida observada, à presença de
iridóides glicosídicos.
O extrato etanólico de folhas e galhos de A. cathartica apresentou moderada
neutralização do efeito hemorrágico do veneno de cobras da espécie Bothrops atrox (Otero
et al., 2000). Allamadin, um iridóide lactônico com atividade antileucêmica isolado desta
planta teve sua estrutura elucidada por Kupchan et al. (1974). Plumieride, um outro iridóide
glicosídico, apresentou forte fungitoxicidade contra alguns dermatófitos causadores de
micose em animais e seres humanos (Tiwari et al., 2002).
A ingestão desta planta pode ocasionar distúrbios gastrintestinais intensos, com
náuseas, vômitos, cólicas e diarréia (Simões et al., 1999). O tratamento deve ser iniciado
com lavagem gástrica, levando-se em consideração as propriedades cáusticas do vegetal.
As manifestações digestivas exigem apenas tratamento sintomático, complementado por
correção adequada dos distúrbios hidreletrolíticos, que são complicações relativamente
freqüentes (Schvartsman, 1992).
Popularmente, esta planta é usada como purgativa quando em dose mínima, e
também no tratamento contra a sarna (Correa, 1984).
Aroeira
Conhecida popularmente pelos nomes de aroeira-vermelha, aroeira-da-praia e
aroeira-mansa, a espécie Schinus terebinthifolius Raddi pertence à família botânica
Anacardiaceae, sendo muito utilizada em arborização de ruas e parques.
Trata-se de uma árvore de até 10 metros de altura. Possui folhas compostas,
imparipenadas, com pecíolos cilíndricos na parte inferior e mais ou menos alados; folíolos
oblongo-elípticos ou obovados, estreitos na base e obtuso ou agudo ou provido de um
pequeno dente no ápice, cerrados, membranáceos, glabros; flores amarelo pálidas pequenas,
dispostas em panícolos de 5 a 10 cm de comprimento; fruto globoso vermelho pálido
luzidio (Correa, 1984). Figura 2.
11
Esta espécie é bastante utilizada na medicina popular. Contudo, trata-se de uma
espécie tóxica, que deve ser usada com muita precaução.
Segundo Morton (1978), crianças que ingeriram alguns frutos verdes ou maduros
sofreram distúrbios gastrintestinais e, o contato com os frutos, pode originar alergias que
afetam mãos, braços e rosto.
O quadro toxicológico caracteriza-se por dermatite, apresentando eritema, pápulas e
vesículas com prurido intenso. A hipersensibilização pode decorrer do contato direto da
planta com a pele ou, em muitos casos, apenas pela proximidade do vegetal, devido á
presença de substâncias alergizantes voláteis (Simões, 1999). O tratamento pode ser feito
utilizando antissépticos de ação local e, nos casos mais graves, é recomendada a
administração de corticóides e anti-histamínicos (Simões, 1999).
Os frutos de S. terebinthifolius possuem efeito inibitório sobre a fosfolipase A2
(Jain et al., 1995), podendo assim, ser útil no controle de processos inflamatórios tal como
artrite reumatóide, asma e psoríase (Waite, 1987; Wong & Dennis, 1990).
Arruda
Planta originária da Europa e comumente cultivada em nossos jardins, a Ruta
graveolens, é bastante conhecida desde a antiguidade principalmente por estar ligada às
superstições populares. Pertencente à família Rutaceae, é conhecida popularmente pelos
seguintes nomes vulgares: Arruda-comum, arruda-dos-jardins, arruda-fedorenta, ruta, ruta-
de-cheiro-forte, arruda-doméstica, erva-arruda.
Apresenta-se como sub-arbusto, de cheiro forte e desagradável, ramificado desde a
base, possui folhas alternadas e flores verde-amarelas (Correa, 1984). Figura 3.
Esta planta é usada desde a antiguidade para proteger as pessoas de mau-olhado.
Com os seus ramos asperge-se água benta sobre as multidões. Muitas pesquisas
fitoquímicas foram desenvolvidas com R. graveolens.
Toda a planta, principalmente os brotos terminais e as flores, possuem entre outras
substâncias, albumina vegetal, “inulina” e um óleo volátil, “rutina”, amarelo-esverdeado,
espesso, amargo, de cheiro forte e desagradável, ao qual são atribuídas em grande parte as
suas virtudes medicinais (Correa, 1984).
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R. Graveolens é considerada tóxica. Administração oral de 5g/Kg de peso corporal
de folhas desta planta a caprinos causou tremor, dispinéia, diurese frequente,
descoordenação de movimentos, ataxia e paralisia com morte após 1 a 7 dias (Agraa et al.,
2002). Foi reportado que R. graveolens causou dermatite fototóxica. Os componentes
fototóxicos pertencem ao grupo de furano-cumarina e furano-quinolina (Schempp, et a.,
1999). O extrato de éter de petróleo de R. graveolens mostrou um significativo efeito
citotóxico. Neste extrato foi encontrado biflavonóides (Trovato, et al., 1996). Conway &
Slocumb (1979) descreveram que esta planta é usada como emenagoga e abortiva.
Esta planta pode ser perigosa quando ingerida em grandes quantidades, mas possui
também propriedades medicinais. Ruta graveolens é uma espécie promissora na produção
de furano-cumarinas, muito usadas na dermatologia (Milesi et al., 2001).
Ruta graveolens faz parte da composição de alguns fitoterápicos na forma de
infusão, sendo usado para normalização das funções do ciclo menstrual, fragilidade dos
capilares sanguíneos, combate a calvície, ansiedade e insônia, incontinência de urina e
prisão de ventre. A extração dos princípios ativos com azeite comestível origina um extrato
oleoso que é usado como vermífugo. Para combater a sarna e piolhos, é usada na forma de
tintura e para aplicar nas varizes e sarar flebites, é usada na forma de cataplasma
(http://www.Plantastoxicas.cjb.net)
Comigo-ninguém-pode
Comigo-ninguém-pode é o nome popular dado a duas espécies do gênero
Dieffenbachia: D. picta Schott e D. seguine Schott, ambas pertencentes à flora Amazônica.
As duas são polimorfas e dificilmente distinguíveis na prática. De modo geral, apresentam
caule espesso e ereto, folhas grandes, oblongas, vistosas, pecioladas, verde-escuras, com
manchas esbranquiçadas de vários aspectos (Schvartsman, 1992). Figura 4.
Rizzini & Occhioni (1957, apud Scavone & Panizza,1980), relatam as seguintes
características distintivas: 1- as folhas de D. picta apresentam máculas numerosas, muitas
vezes confluentes, espalhadas por toda a superfície; 2 – D. seguine geralmente apresenta
folhas completamente verdes, e suas nervuras são mais proeminentes.
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Estas espécies são freqüentemente cultivadas como ornamentais, principalmente na
decoração de ambientes interiores devido a sua resistência à baixa luminosidade (Simões et
al., 1999). Esta é uma das folhagens mais populares e um poderoso amuleto contra inveja e
mau olhado.
A natureza química das substâncias responsáveis pela toxicidade de Dieffenbachia
ainda não foi completamente esclarecida. Essas plantas, assim como outras da família
Araceae, têm como uma das características anatômicas a presença de um grande numero de
cristais de oxalato de cálcio, na forma de agulhas, denominadas ráfides, e estão contidos
dentro de células injetoras denominadas idioblastos (Carneiro et al.,1985).
O mecanismo da reação alérgica foi estudado experimentalmente, tendo sido
demonstrado que a ação desencadeada não é apenas mecânica, mas sim mediado pela
presença de substâncias de natureza lipídica constituídas de ácidos graxos insaturados que
atuariam como substâncias irritantes juntamente com os cristais de oxalato de cálcio
(Carneiro et al., 1989). Foi apontado a presença de enzimas proteolíticas envolvidas no
mecanismo de intoxicação (Rauber, 1985).
Os casos de intoxicações mais freqüentes ocorrem com crianças, devido à ingestão
ou contato com a mucosa oral. Os sintomas se desenvolvem rapidamente, ocorrendo
irritação com sensação de queimadura, salivação intensa, edema dos lábios, língua e
garganta, podendo dificultar ou impedir a fala e causar distúrbios respiratórios. O contato
com a seiva do vegetal, de forma direta ou indireta, pode provocar severa irritação da pele
ou inflamação ocular, acompanhada de edema e fortes dores, as quais podem durar até
algumas semanas. Algumas vezes, ocorrem distúrbios gastrintestinais, com cólicas
abdominais, náuseas e vômitos (Simões et al.,1999).
O tratamento é sintomático, com administração de líquidos gelados (águas, chás,
sucos) ou emolientes (leite, gelatina), para proporcionar alívio. Caso necessário, são
administrados analgésicos, antiinflamatórios e anti-histamínicos, para combater a dor e o
edema. Não é recomendado fazer lavagem gástrica nem provocar vômito, devido à
presença das microagulhas (ráfides). Áreas irritadas por contato, como pele e olhos, devem
ser lavadas com grande quantidade de água corrente e utilização de colírios antissépticos,
no caso dos olhos (Simões et al., 1999).
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Figura 1 – Allamanda cathartica Figura 2 - Schinus terebinthifolius (alamanda) (aroeira)
Figura 3 – Ruta graveolens Figura 4 – Diefembachia spp. (arruda) (comigo-niguém-pode)
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Copo-de-leite
Em função do quadro toxicológico e quimiotaxonomia, idêntico ou semelhante às
espécies Dieffenbachia, essa espécie será sumariamente descrita a seguir.
O copo-de-leite é originário do sul da África e cultivado como ornamental,
ocorrendo também como espontâneo em locais encharcados (Simões et al., 1999).
Conhecida cientificamente por Zantedeschia aethiopica, é uma planta ornamental
muito apreciada pela sua inflorescência. Possui espata muito branca irregularmente
campanulada, espádice cilíndrico e amarelo. Grandes folhas cordiformes-sagitadas
(Schvartsman, 1992). Figura 5.
Toxicidade, formas de intoxicação, efeitos clínicos potenciais e tratamento são
semelhantes aos descritos para comigo-ninguém-pode.
A partir do extrato acetato de etila e metanólico de Z. eathiopica foram isolados dois
triterpenos cicloartane, 10 esteróides com o núcleo colesteno, três lignanas e dez
fenilpropanóides. Ensaios anti-alga mostraram boa atividade para alguns dos compostos
aromáticos (Della Greca et al., 1998).
Coroa-de-Cristo
A espécie Euphorbia milii, conhecida pelos nomes populares coroa-de-cristo,
martírio, coroa-de-espinhos, colchão-de-noiva, dois irmãos, bem casados martírios, é muito
cultivada no Brasil, como ornamental e como cerca viva.
Apresenta grande número de espátulas rígidas e pontiagudas e pequenas flores de
coloração avermelhada. Produz uma seiva abundante e muito leitosa (Schvartsman, 1992).
Figura 6.
As espécies do gênero Euphorbia, apresentam potencial efeito moluscicida.
Teoricamente estas plantas podem ser uma solução de baixo custo e ecologicamente correta
no controle de vetores da esquistossomose (Oliveira-Filho & Paumgartten, 2000). Porém,
as propriedades tóxicas inviabilizam o uso destas espécies (Cruz et al., 1996).
Das partes aéreas do vegetal foram isolados diterpenos denominados miliaminas de
A a I, responsáveis pela ação irritante (Uemura & Hirata, 1973). Esse grupo de compostos
foi bastante estudado em função da sua ação co-carcinogênica (Marston & Hecker, 1983).
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Os casos de intoxicação mais freqüentes são devido ao contato do látex com a pele e
mucosas, podendo causar sérias irritações. As lesões caracterizam-se inicialmente por
edema e eritema, evoluindo para a formação de vesículas e pústulas, normalmente
pruriginosas e doloridas. O contato do látex ou dos dedos contaminados com os olhos,
pode provocar conjuntivite e, em casos mais graves, cegueira temporária (Simões et al.,
1999). O tratamento é sintomático.
Espada-de-são-jorge
Sansevieria trifasciata pertence a família Agavaceae. Herbácea rizomatosa perene
da África, de 70-90 cm de altura com folhas espessas. São cultivadas diversas variedades de
folhas com margens creme-amareladas, de folhas curtas com manchas verde-claro
transversais, de folhas acinzentadas com manchas amareladas nas margens, entre outras.
Inflorescências longas com flores pequenas de importância secundária. É cultivada em
vasos, no sol ou a sombra. Resiste bem a solos áridos e multiplica-se por divisão de
touceiras. Figura 7 (Byrd, 1995; Lorenzi & Souza, 1981).
Entre os supersticiosos, acredita-se que esta planta traga felicidade e fartura a quem
a cultiva.
A maceração das folhas em álcool é eficaz em fricções contra o reumatismo.
Cortando-se suas folhas em pedacinhos e levando-as a fervura, obtém-se uma solução para
lavar os cabelos o que provoca uma melhor circulação do sangue no couro cabeludo. Ainda
pode ser usada para banhar o corpo todo, causando ação benéfica sobre a pele (Körbes,
1995). Contudo o uso desta planta não é indicado para fins medicinais principalmente
domésticos, pois trata-se de uma planta reconhecidamente tóxica.
Análise fitoquímica da planta inteira resultou no isolamento de quatro glicosídeos
pregnânicos (Mimaki et al., 1997). Estes mesmos autores isolaram também, doze saponinas
esteroidais (Mimaki et al., 1996). González et al. (1972) isolaram ainda, do extrato
etanólico não hidrolisado de S. trifasciata, β-sitosterol e cinco sapogeninas espirostano.
Apesar destes estudos fitoquímicos, são poucos os estudos farmacológicos para esta
espécie. A espécie S. glauca foi considerada tóxica a A. salina no teste de toxicidade frente
a A. salina (Franssen et al., 1997).
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Espirradeira
Espirradeira, Oleander, Loandro, Loandro-da-índia, Loureiro-rosa, Flor-de-são-josé,
são alguns nomes populares conhecidos para a espécie Nerium oleander L. da família
Apocynaceae.
Planta herbácea que chega a atingir 2 a 4 m de altura; caule cilíndrico com ramos
cinzentos acastanhados; folhas opostas, pecioladas, lanceoladas, nervura principal impressa
na face superior e saliente na face inferior; inflorescências terminais, flores geralmente
rosadas, corola grande vistosa. Frutos contendo numerosas sementes revestidas de pêlos
(Schvartsman, 1992). Figura 8.
Entre as várias plantas extremamente venenosas conhecidas e que se acham em
íntimo contato com o homem e os animais domésticos, esta ocupa lugar saliente por ser
vivaz e rústica, sem maiores exigências de clima e solo, constituindo o ideal das plantas
ornamentais, por associar a elegância do porte, a abundância da floração e o perfume
agradável das flores (Correa, 1984).
As propriedades tóxicas desta planta são conhecidas há séculos, desde a época dos
hebreus e egípcios. Todas suas partes são venenosas para o homem, sendo seus efeitos mais
importantes devido à presença de numerosos glicosídios, alguns cardioativos (Siddiqui et
al., 1986), como a oleandrina, rosagenina, neriina D, neriina F, cortenerina, etc..
Rosagenina, extraída da casca, é considerada extremamente tóxica, de propriedades
semelhantes às da estricnina. Da planta foram extraídos também óleos voláteis, vitamina C
e glicosídies cianogênicos (Schvartsman, 1992).
Oleandrina, de fórmula C31H48O9, tem estrutura química semelhante às dos
glicosídios digitálicos e é encontrada no vegetal na proporção de 0,08% (Schvartsman,
1992). Smith et al. demonstraram que o glicosídeo cardiotônico, oleandrina, é eficaz em
inibir o câncer de próstata, in vitro.
O quadro tóxico inicia-se com manifestações gastrintestinais incluindo náuseas,
vômitos, cólicas abdominais, diarréia. Distúrbios neurológicos precedem ou são
concomitantes aos cardíacos e compreendem tontura, alterações do equilíbrio, midríase,
sonolência, torpor e coma. O óbito pode ocorrer por parada cardíaca em sístole.
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Figura 5 - Zantedeschia aethiopica Figura 6 – Euphorbia milli (copo-de-leite) (coroa-de-cristo)
Figura 7 – Sansevieria trifasciata Figura 8 – Nerium ollander (espada-de-são-jorge) (espirradeira)
19
Hera
Originária da Europa, Norte da África, Ásia e Ilhas das Canárias, Hedera helix L.
pertencente a família Araliáceae é conhecida popularmente pelo nome de hera. Seu maior
valor é ser uma preciosa planta de adorno, graças à sua aderência às rochas, aos muros,
paredes e árvores, tornando-se muito empregada na jardinocultura. Estende-se pelo chão
cobrindo-o com sua densa folhagem ou prende-se aos muros e árvores por meio de raízes
adventícias. Possui folhas alternas, lustrosas, verde-escuras ou manchadas de branco-
acinzentado; flores pequenas, verde-amareladas; o fruto é uma baga preta (Schvartsman,
1992). Figura 9.
A hera está incluída no grupo das plantas produtoras de saponinas (Bedir et al.,
2000), substâncias que de um modo geral tem efeitos irritantes, produzem lesões celulares e
modificam a permeabilidade celular. A absorção intestinal é lenta e difícil, por isso são
pouco freqüentes as manifestações sistêmicas, caracterizadas principalmente por hemólise
eritrocitária (Schvartsman, 1992).
Da hera extrai-se um glicosídeo específico “hederina” (Guiraud-Dauriac et al.,
1997), que é particularmente abundante nos frutos e tem efeito, em pequenas doses, como
vaso-constritora e como hemolítico.
As folhas podem ser usadas, internamente, contra o catarro crônico das vias
respiratórias entre outras aplicações medicinais (Correa, 1984). Tintura preparada a partir
do extrato seco de H. helix é usada para várias doenças do trato respiratório, tal como
infecções crônicas e agudas e ainda para aliviar a tosse (Trute & Nahrstedt, 1994).
Os frutos são notoriamente venenosos e ingeridos em certa quantidade provocam
febre, com forte aceleramento do pulso, delírio (Correa, 1984).
Jibóia
A espécie Scindapsus pictus, é bastante cultivadada como planta ornamental. É uma
planta semi-herbácea vigorosa, ascendente das Ilhas Salomão, com folhas espessas,
coriáceas, variegadas de amarelo ou branco, grandes nas folhas idosas. Nas plantas ainda
jovens, de ramagem fina, as folhas são pequenas, sem variegação, o mesmo acontecendo
quando crescendo na sombra. As folhas jovens podem atingir de 8-10 cm, enquanto as
20
adultas podem alcançar 60 cm de comprimento. Costuma ser cultivada apoiada em
suportes, a pleno sol e como forração em locais sombreados. Nesta última situação, mantém
as folhas pequenas. Dado o seu crescimento impestuoso, se apoiada em palmeiras, pode
sufocá-la, levando-as a morte. Multiplica-se facilmente por estacas que enraízam mesmo na
água (Lorenzi & Souza, 1981). Figura 10.
Poucos estudos fitoquímicos foram feitos com esta planta. Em algumas espécies de
Scindapsus foi encontrado flavona C-glicosídeos, quercetina (flavonol) e chrysoeriol
(flavona) (Williams et al., 1981).
Figura 9 – Hedera helix L. Figura 10 – Scindapsus sp. (hera) (jibóia)
Mamona
Originária da Ásia Meridional e facilmente encontrada em todo o Brasil, a espécie
Ricinus communis que pertence a família Euforbiaceae é bastante conhecida como planta
venenosa. É chamada popularmente de mamona, mamoeiro, Carrapateiro, Palma-cristi.
Trata-se de um arbusto com cerca de 2m de altura, possui caule nodoso, ramificado,
folhas alternas, palmatiformes, longamente pecioladas, inflorescências terminais, alternas,
parecendo feixes de filetes reunidos. O fruto é uma noz redonda, geralmente espinhosa que
aloja as sementes (Correa, 1984). Figura 11.
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O óleo de mamona ou óleo de rícino, devido a alta viscosidade e estabilidade, tem
amplo emprego industrial e também é utilizado em alguns medicamentos como purgante
drástico (Simões et al., 1999). A semente contém uma toxalbumina, a ricina que contém
duas cadeias polipeptídicas presas por uma ligação de dissulfeto, e um corpo cristalino
nitrogenado, de fórmula C8H8O2N2, chamado ricinina, que tem algumas características dos
alcalóides (Schvartsman, 1992). A ricina possui diversos efeitos tóxicos nas células de
diferentes órgãos viscerais. Esta proteína induz o stress oxidativo, provocando toxicidade
renal (Kumar et al., 2003).
A ricina é muito estável em condições normais, não se deteriorando após meses,
mas por ação do calor ou da luz sua ação tóxica diminui. Após ingestão da semente
mastigada, a ricina é rapidamente absorvida. Seu metabolismo ainda não é bem conhecido.
(Schvartsman, 1992).
A intoxicação por ingestão das sementes caracteriza-se por vômitos, diarréia, cólicas
violentas, lesões renais, distúrbios neurológicos, letargia, apnéia e coma (Simões et al.,
1999). O tratamento deve ser rápido e enérgico. A estimulação de vômitos e lavagem
gástrica deve ser imediata, seguida da administração de eletrólitos, grande quantidade de
líquidos, controle renal, sanguíneo e das funções hepáticas. Se necessário, transfusão
sanguínea (Simões et al., 1999).
Figura 11 – Ricinus communis L. (mamona)
22
2.3. TESTE DE TOXICIDADE FRENTE A Artemia salina
O teste de letalidade in vivo em organismos animais simples, tal como o teste de
letalidade contra Artemia salina, desenvolvido por Meyer et al. (1982), pode ser usado para
determinar a toxicidade de diferentes produtos químicos e naturais. Este bioensaio geral
detecta uma ampla faixa de atividades biológicas e uma diversidade de estruturas químicas.
Artemia salina Leach é um microcrustáceo marinho comumente conhecido por
larva de camarão ou “nauplius”, pertence à subclasse Branchiopoda, ordem Anostraca. Os
ovos deste crustáceo podem ser facilmente adquiridos em lojas de animais marinhos, e as
larvas desenvolvem-se rapidamente em água salgada artificial, constituindo uma facilidade
para a cultura do organismo.
Este bioensaio baseia-se na premissa de que compostos bioativos são tóxicos em
altas doses. Devido a grande sensibilidade de A. salina, este bioensaio está estreitamente
relacionado com a atividade biológica geral, pois todo o composto que possui alguma
atividade, também apresenta certa toxicidade. Além disso, este método tem boa
reprodutibilidade e apresenta boa correlação com ensaios de citotoxicidade e antitumorais,
servindo também de “pré-screen” antitumoral (Hamburger & Hostettmann, 1991). O
bioensaio apresenta ainda correlação com testes de atividades larvicida e inseticida
(McLaughlin, 1991), antifúngica, viruscida e antimicrobiana (MacRae et al., 1988),
parasiticida (Sahpaz et al., 1994) e tripossomicida (Zani et al., 1995), podendo então, ser
usado como “pré-screen” para monitorar o fracionamento de extratos potencialmente
tóxicos, com a vantagem de não requerer técnicas assépticas, podendo ser realizado no
próprio laboratório de fitoquímica.
23
4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GERAL
Este projeto visa o estudo de uma variedade de plantas ornamentais, notoriamente
tóxicas, a fim de avaliar o grau de toxicidade frente ao bioensaio utilizando A. salina.
4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
i) Fazer uma pesquisa bibliográfica envolvendo plantas ornamentais tóxicas;
ii) Coletar e identificar o material vegetal;
iii) Obter o extrato bruto de cada planta coletada por maceração em etanol;
iv) Realizar o teste de toxicidade frente a A. salina nos extratos obtidos, a fim de
avaliar o grau de toxicidade (valores de DL50) das diversas plantas;
v) Realizar ensaios qualitativos para a determinação das classes de produtos
naturais presentes no extrato, através de marcha analítica;
vi) Analisar através de estudos fitoquímicos o extrato de Zantedeschia
aethiopica (copo-de-leite).
24
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Equipamentos
Para o bioensaio utilizou-se de garrafas plásticas e transparentes de refrigerante,
bombinha de aquário, placas para os testes e pipetas automáticas com as seguintes
capacidades: 5-50 µL e 50-200 µL.
Já para o fracionamento, utilizou-se a vidraria adequada e o auxílio de um
rotaevaporador.
5.2. Substâncias utilizadas
Os solventes utilizados, como o etanol e dimetilsulfóxido (DMSO) entre outros, e o
tween 80 (polioxietilensorbitano monooleato), foram obtidos comercialmente.
O sal usado no controle positivo, dicromato de potássio, é de grau de pureza P.A.. O
sal marinho utilizado para a produção do mar artificial foi obtido na loja de aquários
Botiquário. Juntamente com o sal marinho, adquiriu-se os cistos de Artemia salina, que
foram armazenados em local seco à temperatura ambiente.
5.3. Coleta e identificação das espécies vegetais
As espécies aqui em estudo, foram coletadas em Florianópolis, entre os meses de
maio e dezembro de 2002, e identificadas no Departamento de Botânica da Universidade
Federal de Santa Catarina - UFSC, pelo professor Daniel de Barcellos Falkenberg.
5.4. Obtenção do Extrato Hidroalcoólico Bruto
Para a obtenção dos extratos hidroalcoólicos brutos foram utilizados cerca de 500 g
de material vegetal picado e macerado em álcool etílico de grau comercial, e
acondicionados em frascos de vidro à temperatura ambiente durante quinze dias. O
macerado foi filtrado e evaporado em evaporador rotatório sob pressão reduzida
25
(temperatura ~ 65 °C ). Os extratos brutos obtidos foram conservados em câmera fria
inferior a 4°C e protegidos da luz.
5.5. Teste de toxicidade frente a Artemia salina
Como meio de cultura utilizou-se uma solução de sal marinho ou salina (cerca de 20
g de sal marinho por litro água destilada), onde filtrava-se a solução a fim de se obter a
solução saturada de salina.
Para a eclosão dos cistos utilizou-se uma garrafa plástica e transparente de
refrigerante com o fundo cortado, como aquário e outra, como suporte. Fez-se uso também
de uma bombinha de aquário, Figura 12. Em um litro de salina colocou-se meia colher de
café de cistos. As larvas encontravam-se prontas para os teste de toxicidade 72 horas após
os cistos serem colocados em meio aquoso.
Os teste de toxicidade frente a Artemia salina seguiu a metodologia de Meyer
(1982) com pequenas modificações.
Figura 12 – Sistema simulando o ambiente marinho da Artemia salina.
26
Os extratos brutos eram dissolvidos em solventes apropriados, a fim de se obter uma
concentração final de 10.000 ppm, então, diluições eram feitas com o objetivo de se obter a
concentração desejada para o teste.
Em uma placa contendo 24 pocinhos colocava-se 1 mL da salina com 1% (v/v)
tween 80 em cada pocinho e de 7 a 10 larvas, que eram coletadas do meio salino utilizando
pipeta automática. Para facilitar a coleta das larvas era aproximado uma fonte luminosa
devido ao fototropismo das mesmas.
Inicialmente, cada extrato bruto era testado nas seguintes concentrações, 100, 500 e
1000 ppm (µg/mL). Para cada concentração fazia-se três repetições e estas eram
acompanhadas do controle positivo e negativo. Depois da análise destes dados preliminares
as concentrações eram ajustadas conforme a necessidade. Cada extrato era testado pelo
menos duas vezes para que o resultado fornecido fosse mais confiável.
A leitura dos testes sempre foi feita 24 horas após o início dos mesmos. As larvas
mortas foram contadas com ajuda de uma lupa em oposição a um fundo escuro. A
concentração letal para matar 50% das larvas após 24 hs de exposição, a DL50 crônica foi
determinada através de um gráfico de mortalidade (%) em função do logarítimo da dose.
O controle negativo consiste em aplicar, na mesma concentração que o extrato
testado, apenas o solvente utilizado na dissolução da amostra. Já o controle positivo foi
feito com um sal de metal pesado, dicromato de potássio (K2Cr2O7), cuja toxicidade está
entre 20 e 40 ppm (Sam, 1993).
Utilizou-se o método descrito por Reed-Muench (Ipsen e Feigl, 1970; Miya et al.,
1973), para calcular a DL50 com intervalo de confiança de 95%. Este método assume que
um animal que sobrevive a uma determinada dose também sobreviverá a uma dose menor,
conseqüentemente, um animal que morre com uma certa dose também morrerá com uma
dose maior. Assim, as informações de uma dada concentração podem ser somadas aos
dados de outra dose testada, mostrando que existe uma relação entre a dose testada e a
mortalidade, no sentido de quanto maior a dose, maior será a letalidade das larvas.
Este método permite o uso da fórmula para a estimativa do erro padrão, SE DL50.
SE DL50 = (0,79.h.R/n)1/2
27
Onde h = média dos intervalos entre as doses (usando o logaritmo da dose). R =
faixa interquartílico (DL75 – DL25) e n = média do número de animais. O limite de
confiança de 95% pode ser derivado da seguinte fórmula: log DL50 ± 2xSE DL50
5.6. Investigação química preliminar
Atendendo ao estudo dos possíveis princípios ativos presentes nas espécies aqui em
estudo, foram realizados os ensaios qualitativos preliminares, a partir dos extratos brutos,
seguindo a marcha analítica (Domínguez, 1973; Matos, 1988; Souza, 1991), conforme
Figura 13. Esta marcha analítica permite detectar classes de metabólitos secundários de
plantas como alcalóides, flavonóides, terpenos, entre outros.
Identificação de alcalóides:
• Meyer: Dissolve-se 1,36 de cloreto de mercúrio em 60 mL de água destilada. Depois,
adiciona-se a uma solução de 5,0g de KI e 10 mL de água destilada. Completa-se a 100
mL com água.
• Dragendorff: Dissolve-se 8,0g de subnitrato de bismuto BI(NO3)3.5H2O em 20 mL de
HNO3 e 27,2 g KI em 50 mL de água. Misturam-se as duas soluções e deixa-se
repousando por 24 horas, completa-se com 100 mL de água destilada.
• Beltrand: Dissolve-se 5,0g de ácido sílico-tungstico são dissolvidos em uma solução de
ácido sulfúrico 6N de 100 mL.
Estes ensaios dão reações positivas, quando se observa a formação de um precipitado
ou turbidez no tubo de ensaio.
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Identificação de esteróides, fitoesteróides, glicosídeos esteroidáis e triterpênicos:
• Prova de Liebermann-Burchard: Mistura-se 1,0 mL de anidrido acético com 1,0 mL de
clorofórmio, resfria-se e adiciona-se uma gota de ácido sulfúrico concentrado. A reação
é positiva quando aparece uma coloração laranja.
• Prova de Rosenheinn: Uma solução clorofórmica da substância se põe em contato com
ácido tricloroacético 90% em água destilada. É positivo para coloração violeta intensa,
que depois de 20 minutos muda para azul.
Identificação de flavonóides e flavonóides glicosídeos:
• Os extratos alcoólicos incolores ou ligeiramente amarelos de um vegetal, se tratados
com limalhas de magnésio e três gotas de ácido clorídrico concentrado, observa-se
imediatamente uma coloração laranja, roxo-azulado ou violeta.
Identificação de taninos:
• Cloreto Férrico: Adiciona-se 1 gota de FeCl3 1% dissolvidos em água destilada sobre
0,2 mL de solução aquosa da substância (em tubo de ensaio). A reação é positiva, se
aparecer uma coloração verde, azul ou pardo escuro.
Identificação de sesquiterpen-lactonas:
• Prova de Baljet: Prepara-se 2 soluções de volumes iguais, misturadas antes de usar.
Solução A (1,0g de ácido pícrico em 100 mL de etanol) e solução B (10g de hidróxido
de sódio em 100 mL de água destilada). Para 2-3 mg de composto adiciona-se 3 a 4
gotas do reativo. A reação é positiva ao observar a formação de coloração laranja ou
vermelho escuro.
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Identificação cumarinas:
• Aplica-se uma gota da solução etérea sobre um papel filtro, onde o mesmo é exposto à
luz ultravioleta (365nm). O teste é considerado positivo com o desenvolvimento de
fluorescência.
Identificação de leucoantocianidinas:
• A 0,2 mL da solução a se analisada adiciona-se 2-3 gotas de HCl concentrado e leva-
se a ebulição em bico de Bunssen. A reação é positiva com o aparecimento de uma
coloração vermelha.
Identificação de ácidos orgânicos:
• Evaporar 10 mL de solução até a secura e adicionar 5 mL de água destilada.
Determinar o pH da solução, se for ácido confirma-se a presença de ácidos orgânicos.
Identificação de grupos fenólicos:
A 2 mL da solução aquosa obtida acima, adiciona-se 2 gotas de solução de FeCl3
1%. O desenvolvimento de coloração azul ou vermelha confirma a presença de fenóis
5.7. Estudo fitoquímico do extrato de Zantedeschia aethiopica (copo-de-leite)
O extrato bruto de Z. aethiopica foi submetido a cromatografia em coluna de sílica
gel onde utilizou-se 5 g de extrato bruto, que foi dissolvido com um mínimo de acetona e
misturado com 10 g de sílica gel para formar uma pastilha contento todo o material
adsorvido à sílica. A eluição da coluna foi realizada utilizando o seguinte sistema de
eluentes em ordem crescente de polaridade, hexano / acetato de etila / etanol, conforme
tabela 1. As sub-frações foram coletadas e concentradas em um evaporador rotativo sob
30
pressão reduzida e transferidas para frascos menores. As frações foram analisadas por
cromatografia em camada delgada.
As frações que apresentaram precipitado, receberam um tratamento diferenciado, na
tentativa de isolamento dos possíveis compostos. Estas frações foram estudadas pela análise
conjunta de dados espectroscópicos, tais como infravermelho (IV), cromatografia gasosa
(CG), ressonância magnética nuclear de próton (RMN 1H) e carbono 13 (RMN 13C).
Tabela 1 – Frações eluídas através da coluna cromatográfica
Hexano (%) Acetato de Etila (%)
Etanol (%) Frações eluidas
100 --- --- 1-2 95 5 --- 3-5 90 10 --- 6-12 85 15 --- 13-25 80 20 --- 26-31 70 30 --- 32-35 60 40 --- 36-37 50 50 --- 38-59 20 80 --- 60-63 --- 50 50 64-69 --- --- 100 Final de coluna
31
1- MeOH/H2O 1:1 1- HCl 1% H2O 2- HCl pH = 1 2- Filtrar em celite 3- Extração c/ éter
1-CHCl3 NH4OH, pH=10 2- Na2SO4 ext. c/ CHCl3
1- Na2SO4
2- Secar 1- Secar 2- H2O HCl 10% PH = 2.5 - 3 Ext. c/ CHCL3:EtOH 3:2 1- Na2SO4 2- Secar EtOH
Extr. Bruto Seco
Sol. etérea Resíduo + Taninos FeCl3
Fenóis
Sesquiterpenlactonas (Prova de Baljet)
Cumarinas
Ác. orgânicos
Extr. CHCl3
(C)
Fitoesteróides • Liebermann-Burchard • Prova de Rosenheim
Filtrado ácido (B)
Sol. CHCL3 Sol. aq. (D)
Esteróides
Alcalóides - Meyer - Dragendorff - Bertrand
Alcalóides
Ext. CHCl3 (E)
Sol. aq. (F)
Flavonóides Glicosídeos Leucoantocianidinas
Glicosídeos esteróides e triterpênicos Alcalóides Flavonóides
(HCl conc. + limanhas de magnésio)
Leucoantocianidinas (HCl conc., ebulição)
Figura 13 - Fluxograma da marcha analítica
32
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As plantas tóxicas são importantes fontes de substâncias ativas, pois podem causar
intoxicação em seres humanos ou em animais, com prejuízos significativos à saúde pública
e a pecuária. Segundo o Centro de Informação Toxicológica do estado de Santa Catarina
(CIT-SC), um número restrito de plantas ornamentais está relacionado com a maioria das
intoxicações, sendo que comigo-ninguém-pode responde sozinho por 30% dos casos.
Plantas pertencentes a família Araceae (copo-de-leite, jibóia, costela-de-adão, antúrio) e da
família Euphorbiaceae (coroa-de-cristo, mamona, nogueira) seguem a lista das principais
plantas tóxicas.
Estudou-se onze plantas ornamentais, notoriamente tóxicas, quanto a classificação
botânica, toxicidade frente a A. salina e pesquisa das principais classes de metabólitos
secundários encontrados. Na Tabela 2, encontram-se listadas as espécies de plantas
identificadas, seu nome popular e científico e a Família botânica a qual pertencem.
Tabela 2 - Plantas tóxicas estudadas.
NOME POPULAR NOME CIENTÍFICO FAMÍLIA
Alamanda Allamanda cathartica Apocynaceae Aroeira Shinus terebinthifolius Raddi Anacardiaceae Arruda Ruta graveolens L. Rutáceas Comigo-ninguém-pode Dieffenbachia sp. Araceae Copo-de-leite Zantedeschia aethiopica Araceae Coroa-de-cristo Euphorbia milii Euphorbiaceae Espada-de-são Jorge Sansevieria cf. trifasciata Agavaceae Espirradeira Nerium ollander L. Apocynaceae Hera Hedera helix Araliaceae Jibóia Scindapsus aureus Araceae Mamona Ricinus communis Euphorbiaceae
6.1. Análise do Bioensaio utilizando A. salina
O bioensaio que utiliza Artemia salina Leach é um procedimento simples, de baixo
custo e apresenta boa correlação com outros ensaios biológicos.
Os extratos estudados neste trabalho mostraram resultados interessantes quanto a
letalidade frente a A. salina, que é um bioensaio usado com sucesso para detectar
33
toxicidade de compostos ou extratos de plantas. Por este bioensaio, toma-se como base para
considerar uma planta tóxica, o valor DL50 < 1000 ppm (Meyer et al., 1982).
Na Tabela 3 encontram-se listados os valores de DL50 e o limite de confiança de
95% das espécies estudadas, assim como a parte da planta utilizada para fazer o extrato.
Dessas plantas, as que apresentaram maior toxicidade frente ao bioensaio com A. salina,
foram Ruta graveolens (arruda), Sansevieria trifasciata (espada-de-são-jorge),
Zantedeschia aethiopica (copo-de-leite), Nerium ollander (espirradeira) e Hedera helix
(hera).
Tabela 3- Resultados obtidos frente ao bioensaio com Artemia salina dos extratos brutos das plantas tóxicas.
Nome popular
Partes utilizadas da planta
Valores de DL50 (ppm)
Limite de confiança 95%
Alamanda
Folhas e caules Superior a 1000 ---------
Aroeira
Folhas e caules Superior a 1000 ---------
Arruda
Folhas e caules 741,3 660,7-831,7
Comigo-ninguém-pode
Folhas e caules Superior a 1000 ---------
Copo-de-leite
Flores 870,3 729,5-1039,9
Coroa-de-cristo
Folhas e caules Superior a 1000 ---------
Espada-de-são-jorge
Folhas e caules 389,0 375,8-421,7
Espirradeira
Folhas e caules 794,3 609,5-1035,1
Hera
Folhas e caules 912,0 860,1 – 966,3
Jibóia
Folhas e caules Superior a 1000 --------
Mamona
Folhas, caules e sementes Superior a 1000 ---------
Os extratos de Alamanda cathartica, Schinus terebinthifolius, Euphorbia milli,
Dieffenbachia sp., Scindapsus sp. e Ricinus comunis foram os que apresentaram atividade
pouco significante (DL50 > que 1000 ppm), mostrando menor toxicidade diante deste
método. Isto não significa que estes extratos sejam menos tóxicos, pois a toxicidade pode
estar relacionada com compostos termo- ou foto-sensíveis, que não foram detectados por
34
este método. Um exemplo é a mamona que apresenta uma proteína, a ricina que exerce
intensa ação irritante sobre a mucosa gastrintestinal, e esta pode ter sofrido desnaturação
durante o processo de evaporação do solvente. A coroa-de-cristo e comigo-ninguém-pode
que causam dermatite através do contato com a planta, também não se mostraram tóxicos
para A. salina.
6.2. Análise dos ensaios qualitativos para a determinação das classes de produtos
naturais presentes no extrato, através de marcha analítica.
A marcha analítica preliminar aplicada aos extratos brutos das espécies estudadas
mostrou que a arruda e coroa-de-cristo foram as mais ricas na diversidade de compostos
secundários. Na tabela 4 encontram-se os resultados dos ensaios qualitativos realizados
para a determinação das classes de produtos naturais presentes nos extratos obtidos.
6.3. Análise do estudo fitoquímico do extrato de Zantedeschia aethiopica (copo-de-
leite).
Foi escolhido para um estudo fitoquímico preliminar, o extrato hidroalcoólico das
flores do copo-de-leite, por apresentar atividade frente a A. salina e possuir pouco estudo
fitoquímico.
O fracionamento através de coluna cromatográfica e análise através de
cromatografia em camada delgada levou a separação das frações 1, 6, 7, 9 e 10, as quais
foram analisadas através de espectroscopia de Infra Vermelho (IV), Ressonância Magnética
Nuclear (RMN 1H e 13C) e Cromatografia Gasosa (CG).
A fração 1, tinha uma aparência engordurada de cor esbranquiçada. Sua análise
através de cromatografia em camada delgada, revelada em iodo, mostrou apenas uma
mancha, sendo assim esta seria uma fração interessante, que mereceria a realização de
outras análises mais detalhadas. Foi realizada análise por cromatografia gasosa (Anexo 1), e
seu cromatograma detectou muitos picos, mostrando a presença de vários compostos
diferentes, que podem ser hidrocarbonetos e ésteres de ácidos graxos de cadeia longa.
35
Como o espectrômetro de Espectrometria de Massa encontra-se desativado, não será
possível no momento, dar continuidade ao estudo desta fração.
As frações 6 e 7 apresentaram-se na forma de um semi-sólido de cor laranja
bastante parecidas, e foram reunidas por apresentarem semelhança em suas
cromatografias em camada delgada. Esta nova fração (6+7), foi submetida à análise em
cromatografia gasosa, que detectou três picos bem definidos que confirmam a presença
de três compostos majoritários, e outros pequenos picos que podem ser compostos
minoritários ou apenas contaminação na amostra. Anexo 2.
A fração 8 também estava na forma de um semi-sólido, porém de cor laranja mais
intensa do que as frações 6 e 7. Esta foi analisada em cromatógrafo gasoso (Anexo 3),
onde foi detectado a presença de um composto majoritário. Sendo assim, a fração
apresenta um grau de pureza considerável, sendo merecedora de um estudo mais
detalhado.
As frações 9 e 10, apresentaram suas cromatografias em camada delgadas muito
semelhantes, sendo assim reunidas, originando uma nova fração (9+10). Esta foi
submetida às técnicas de infravermelho (Anexo 4) e cromatografia gasosa (Anexo 5). O
espectro de infravermelho mostra uma absorção em 3422,82 cm-1 característica da
deformação axial de O-H, parecendo existir a sobreposição de duas bandas de O-H. A
absorção em 3009,55cm-1 é característica da deformação axial da ligação carbono de
dupla ligação. Duas bandas intensas absorvem na região 2856,53 cm-1 e 2928,73 cm-1,
são características de vibrações de deformação axial de C-H (CH3, CH2 e CH). A banda
em 1738,72 cm-1 indica a presença do grupo funcional carbonila que sugere a presença
de éster. Há uma banda de intensidade moderada a fraca que absorve em
aproximadamente em 1630 cm-1, que corresponde a vibrações de deformação axial de
C=C de alcenos não-conjugados. As absorções em 1458,81 cm-1 e 1376,10 cm-1 também
são características da deformação da ligação C-H. A absorção em 1170,78 cm-1
caracteriza a deformação axial da ligação C-O, que pode ser de álcool ou de éter.
Através da cromatografia gasosa constatou-se a presença de três compostos majoritários.
Esta fração (9+10), foi purificada após ter seu sobrenadante separado, e sua
recristalização, apresentou um precipitado de leve coloração laranja. Uma nova análise
de cromatografia gasosa (Anexo 6), detectou não mais uma mistura de três compostos
36
majoritários, mas uma fração de maior pureza, representada por um pico mais intenso e
bem mais definido, além de vários outros menos intensos. Também foi realizada uma
nova análise de infravermelho (Anexo 7), que mostrou-se muito parecido ao anterior,
salvo uma maior diferença na intensidade entre a banda característica de carbonila (que
sugere ser de éster, 1740,02 cm-1) e as bandas duas bandas que absorvem na região
2854,11 cm-1 e 2927,38 cm-1, características de vibrações de deformação axial de C-H
(CH3, CH2 e CH).
A ressonância magnética nuclear de próton, mostrou a presença de hidrogênio
ligado a carbono de dupla trissubstituída em 5,36 ppm, hidrogênio ligado a C-O em 3,73
ppm. Em 2,11 ppm e 2,01 ppm observa-se picos relativos a hidrogênios alílicos e alfa-
carbonílicos, respectivamente. A presença de grande quantidade de sinais na região entre
1,53 a 0,67 ppm é indicativo da presença de hidrogênios de CH, CH2 e CH3 (Anexo 8).
A análise por ressonância magnética nuclear de 13C (Anexos 9.1 e 9.2) mostra um
pico em 174,6 ppm relativo a carbonila de éster e no intervalo de 122,4 ppm – 141,4
ppm a existência de 8 átomos de carbono que representam carbonos com dupla ligação.
Na região entre 62,1 ppm até 72,5 ppm aparecem cinco picos que representam o
deslocamento químico da ligação C-O, que pode ser de éster ou álcool. Percebe-se
também a presença de vários átomos de carbono do tipo CH3, CH2 e CH.
O espectro, DEPT 90 (Anexo 10), mostra a presença de 18 átomos de carbono CH,
sendo que destes, oito fazem dupla ligação e outra informação importante é a presença
de três átomos de carbonos ligados a oxigênio (CH-O). O DEPT 135 (Anexo 11), mostra
a presença de três átomos de carbono terminais ligados a oxigênio (CH2-OH).
Considerando que estudos fitoquímicos realizados no extrato de Zantedeschia
aethiopica foram isolados diferentes esteróides das frações menos polares (Della Greca,
1998), as análises espectroscópicas de IV, RMN 1H e RMN 13C , sugerem a presença de
esteróis na fração analisada. A presença do grupo CH2-OH no espectro de DEPT 135,
mostra a possível presença de um esterol diferente dos isolados ateriormente (Della
Greca, 1998). Portanto, mais estudos são necessários no sentido de isolar e identificar
este composto, com aplicação posterior do teste de toxicidade frente a Artemia salina.
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TABELA 4 – Resultados dos ensaios qualitativos realizados para a determinação das classes de produtos naturais presentes nos extratos obtidos.
Classes de produtos naturais
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Taninos + + + + + + - - + - + Sesquiterpen-
lactonas + + + - - + - - + - +
Cumarinas + - + + - + - + + + + Ac.
Orgânicos + + + + + + + + + + +
Fenóis + + + - + + - - + - + Fitoesteróis + + + + + + + + + + +
Esteróides (CHCl3)
+ - - - - + + + - - -
Alcalóides (CHCl3)
- - - - - - - - - - -
Alcalóides (aq.)
- - - - - - - - - - -
Flavonóides (aq.)
- - - - + + - - - - -
Leucoanto- cianidinas
(aq.)
- - - - - - - - - - -
Flavonóides Glicosídeos
(CHCl3)
+ - + - - - - - - - +
Leucoanto-cianidinas (CHCl3)
- - + + - + - - - - -
Glicosídeos esteróides e triterpênicos
- + + - - + + + - - -
Alcalóides (CHCl3)
- - - - - - - - - - -
1 = Alamanda, 2 = Aroeira, 3 = Arruda, 4 = Comigo-ninguém-pode, 5 = Copo-de-leite, 6 = Coroa-de-cristo, 7 = Espada-de-são-jorge, 8 = Espirradeira, 9 = Hera, 10 = Jibóia, 11 = Mamona, (+) = Presença, (-) = Ausência.
38
7. CONCLUSÕES O bioensaio utilizando o teste de letalidade de Artemia salina Leach, como
parâmetro para a avaliação da toxicidade geral, apresentou-se viável, barato, rápido e
simples, pois não são necessárias técnicas assépticas, equipamentos ou treinamento
especial.
Das onze plantas submetidas a este bioensaio, apenas cinco apresentaram valor
significativo de toxicidade frente a A. salina, foram estas: Ruta graveolens (arruda),
Sansevieria trifasciata (espada-de-são-jorge), Zantedeschia aethiopica (copo-de-leite),
Nerium ollander (espirradeira) e Hedera helix (hera).
Os extratos de Alamanda cathartica, Schinus terebinthifolius, Euphorbia milli,
Dieffenbachia sp., Scindapsus sp. e Ricinus comunis, não mostraram toxicidade diante do
bioensaio com A. salina. Porém, para estes extratos inativos, a toxicidade pode estar
relacionada com compostos termo- ou foto-sensíveis, que não foram detectados por este
método. A inatividade pode estar associada ainda, a sazonalidade, a idade e parte usada
destas plantas.
O ensaio qualitativo, feito através da marcha analítica pode servir no auxílio de
posteriores análises fitoquímicas mais avançadas dos extratos vegetais.
As análises fitoquímicas preliminares de Zantedeschia aethiopica, em conjunto com
análises espectroscópicas sugeriram a presença de esteróis nas frações menos polares da
cromatografia em coluna.
39
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abdel-Kader, M.S. Wisse, J., Evans, R., van der Werff H., Kingston D.G.I. Journal Natural Products 60, 1294-1297, 1997.
Agraa, S.E.I., Badwi, S.M.A., Adam, S.E.I.,Tropical Animal Health and Production, 34, 271-281, 2002.
Akah, P.A. & Offiah, V.N. International Journal of the Pharmacognosy, 30, 213-217, 1992.
Bedir, E., Kirmizipekmez, O., Sticher, O., Cali, S., Phytochemistry, 53, 905-909, 2000.
Byrd, A., Color Cyclopedia of exotic Plants and Trees. 2ª Ed. pp. 256, 1995.
Carneiro, C.M.T.S., Neves, L.J., Pereira, N.A. Anais da Academia Brasileira de Ciências, 57, 392-393, 1985.
Carneiro, C.M.T.S., Neves, L.J., Pereira, E.F.R., Pereira, N.A. Revista Brasileira Farmacêutica, 70, 11-13, 1989.
Conway, G.A. & Slocumb, J.C., Journal of Ethnopharmacology, 1, 241-261, 1979.
Coppen, J.J.W. Phytochemistry, 22, 179-182, 1983.
Correa, M.P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal, Rio de Janeiro, 1984.
Cruz, C.M., Kasper, P., Cataldo, A., Zamith, H. P., Paumgartten, F. J., Brazilian Journal of Medical and Biological Reserach, 29, 1519-1523, 1996.
Della Greca, M., Ferrara, M., Fiorentino, A., Mônaco, P., Previtera, L., Phytochemistry, 49, 1299-1304, 1998.
Domínguez, X.A., Metodos de Investigacion Fitoquimica, Centro Regional de Ayuda Técnica, AID, Bueno Aires, 1973.
Franssen, F.FL.J., Berger, I., Medinilla Aldana, B.E., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 41, 1500-1503, 1997.
Guiraud-Dauriac, H. Ghachou, C.M., Laget, M., De Méo, M., Duménil, G., Mutation Research, 379, S131, 1997.
González, A.G., Freire, R., García-Estrada, M.G., Salazar, J.A., Suárez,E., Tetrahedron, 28, 1289-1297, 1972. Gupta, N.C., Singh, B., Bhakuni, D.S. Phytochemistry 8, 791-792, 1969.
Hamburger, M. & Hostettmann, K.; Phytochemistry 30, 3864-3868, 1991.
Hoene, F.C. Plantas e substâncias vegetais tóxicas e medicinais. 2º Ed., São Paulo, Imprensa Novos Horizontes, 1978.
http://www.Plantastoxicas.cjb.net Ipsen, J. & Feigl, P., Bancroft Introdution to Biostatistics, 2nd ed., Harper & Row, New York, 1970, cap, 15.
Jain, M. K., Yu, B-Z., Rogers, J. M., Smith, A. E., Boger, E. T. A., Ostrander, R. L., Rheinglod, A. L., Phytochemistry, 39, 537-547, 1995.
40
Kingsbury, J.M. Poisonos plants of the United States and Canadá. Englewood Cliffs, Prentice Hall, 1964.
Körbes, V.C. Ir., Plantas Medicinais, 48 ed., Francisco Beltrão: Associação de Estudos, Orientação e Asssistência Rural, 1995.
Kumar, O., Sugendran, K., Vijayaraghavan, R., Toxicon, 41, 333-338, 2003. Kupchan, S.M., Desserti, A.L., Balylock, B.T., Bryan, R.F. Journal Organic Chemistry 39, 2477-2482, 1974.
Lorenzi, H., Sousa, H.S.. Plantas Ornamentais no Brasil arbustivas, herbáceas e trepadeiras, Ed. Plantaum LTDA, pp. 173, 1981.
Marston, A. & Hecker, E. Planta Médica, 47, 141-147, 1983.
Mclaughin, J.L., Methods in Plant Biochemistry. Hostettmann, K., Ed.; Academic Press, London, 1991, vol. 6, pp.1.
McRae, W.D., Hudson, J.B., Towers, G.H.N., Jounal of Ethnopharmacology 22, 143-146, 1988. Meyer, B. N.; Ferrigni, N. R.; Putnam, J. E.; Jacobsen, L. B.; Nichols, B.; Mclaughlin, J. L. Planta Médica, 45, 31-36, 1982.
Milesi, S., Massot, B., Gontier, E., Bourgaud, F., Guckerrt, A., Plant Science, 161, 189-199, 2001.
Mimaki, Y., Inoue, T., Kuroda, M., Sashida, Y., Phytochemistry, 44, 107-111, 1997.
Mimaki, Y., Inoue, T., Kuroda, M., Sashida, Y., Phytochemistry, 43, 1325-1331, 1996. Miya,T.S., Holck, H.G.O., Yim, G.K.W., Mennear, J.H., Spratto, G.R. Laboratoty Guide in Pharmacology. 4ª ed., Burgess Publishing, Minneapolis, 1973, pp. 127.
Morton, J.F., Fla. State Hort. Soc., 71, 372-380, 1978.
Oliveira-Filho, E.C. & Paumgartten, F.J. Ecotoxicology and Environmental Safety, 46, 342-350, 2000. Otero, R., Núñez, V., Barona, J., Fonnegra, R., Jiménez, S.L., Osório, R.G., Saldarriaga, M., Díaz, A. Ethnopharmacology, 73, 233-241, 2000.
Rauber, M.D. Clinical Toxicology, 23,79-90, 1985.
Sahpaz, S. Planta Medica 60, 538-541, 1994.
Sam, T. W. Toxicity testing using the brine shrimp: Artemia salina. In: Bioactive natural products. Colegata, S. M. e Molyneuse, R. J. EUA: Ed. CRC Press, 1993.
Scavone, O. & Panizza, S. Plantas tóxicas. CODAC-USP, São Paulo, 1980.
Schempp, C.M., Schöpf, E., Simon, J.C., Der Hautarzt; Zeitschrift Fur Dermatologie, Venerologie, Und Verwandte Gebiete, 50, 432-434, 1999.
Schvartsman, S. Plantas Venenosas, São Paulo, Sarvier, 1992.
Simões, C.M.O., Farmacognosia: Da Planta ao Medicamento. Porto Alegre/Floriánopolis, UFRS/UFSC,1999, cap. 35.
Smith, J.A., Madden, T., Vijjeswarapu, M., Newman, R.A., Biochemical Pharmacology, 62, 309-321, 2001.
41
Siddiqui, S., Hafeez, F., Begum, S., Siddiqui, B. Phytochemistry, 26, 237-241, 1986. Tiwari, T.N., Pandey, V.B., Dubey, N.K. Phytotherapy Research, 16, 393-394, 2002.
Trovato, A., Monforte, M.T., Rossitto, A., Forestieri, A.M., Bollettino Chimico Farmaceutico, 135, 263-266, 1996.
Trute, A & Nahrstedt, A., European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2, 126, 1994.
Uemura, D. & Hirata, Y. Tetrahedron Letters, 11, 881-884, 1973. Waite, M. The Phospholipases, Plenum Press, New York, 1987.
Williams, C.A., He, J.B., Mayo, S.J. Phytochemistry, 20, 217-234, 1981.
Wong, P.Y.K. & Dennis, E.A. Phospholipase A2: Role and Function in Inflamation. Plenum Press, New York, 1990.
Vichery, M.L. & Vichery, B. Secondary Plant Metabolismo. The Macmillan Press Lta., Hong Kong, 1981.
Zani, C.L., Chaves, P.P.G., Queiroz, R., Mendes, N.M., Oliveira, A.B., Cardoso, J.E., Anjos,
A.M.G., Grandi, T.S. Phytomedicine, 2, 47, 1995.
42
9. ANEXOS
Figura 14 (anexo 1) – Cromatografia gasosa da fração 1. Condições de análise: Coluna CBP20; temperatura da coluna: 200ºC; temperatura do detector:
235ºC; temperatura do injetor: 235ºC; temperaturas inicial e final: 60ºC – 295ºC (10ºC/min.); solvente: Diclorometano.
Figura 15 (anexo 2) – Cromatografia gasosa da fração (6+7). Condições de análise: Coluna CBP20; temperatura da coluna: 200ºC; temperatura do detector:
235ºC; temperatura do injetor: 235ºC; temperaturas inicial e final: 60ºC – 295ºC (10ºC/min.); solvente: Diclorometano.
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Figura 16 (anexo 3) – Cromatografia gasosa da fração 8. Condições de análise: Coluna CBP20; temperatura da coluna: 200ºC; temperatura do detector:
235ºC; temperatura do injetor: 235ºC; temperaturas inicial e final: 60ºC – 295ºC (10ºC/min.); solvente: Diclorometano.
Figura 17 (anexo 4) – Infravermelho da fração (9+10), em pastilha de KBr.
44
Figura 18 (anexo 5) – Cromatografia gasosa da fração (9+10). Condições de análise: Coluna CBP20; temperatura da coluna: 200ºC; temperatura do detector:
235ºC; temperatura do injetor: 235ºC; temperaturas inicial e final: 60ºC – 295ºC (10ºC/min.); solvente: Diclorometano.
Figura 19 (anexo 6) – Cromatografia gasosa da fração purificada (9+10) . Condições de análise: Coluna CBP20; temperatura da coluna: 200ºC; temperatura do detector:
235ºC; temperatura do injetor: 235ºC; temperaturas inicial e final: 60ºC – 295ºC (10ºC/min.); solvente: Diclorometano.
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Figura 20 (anexo 7) – Infravermelho da fração purificada (9+10), em pastilha de KBr.
Figura 21 (anexo 8) – Ressonância Magnética Nuclear de 1H da fração purificada (9+10), em CDCl3.
46
Figura 22 (anexo 9.1) – Ressonância Magnética Nuclear de 13C da fração purificada (9+10), 200
MHz em CDCl3.
Figura 23 (anexo 9.2) – Ressonância Magnética Nuclear de 13C da fração purificada (9+10), 200
MHz em CDCl3.
47
Figura 24 (anexo 10) – DEPT 90 da fração purificada (9+10), em CDCl3.
Figura 25 (anexo 11) – DEPT 135 da fração purificada (9+10), em CDCl3.
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