AVALIAÇÃO DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA (TAD) NO ... · RESUMO v ABSTRACT vii 1 ... 1.1 Histórico das Leishmanioses 1 1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana: etiologia, morfologia,

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ

CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES

DEPARTAMENTO DE SAÚDE COLETIVA – NESC

MESTRADO EM SAÚDE PÚBLICA

AVALIAÇÃO DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA (TAD) NO D IAGNÓSTICO

DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA)

Recife – PE

2003

ODAIR VIEIRA DA SILVA

AVALIAÇÃO DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA (TAD) NO D IAGNÓSTICO

DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA (LTA)

Dissertação apresentada ao Departamento

de Saúde Coletiva – NESC do Centro de

Pesquisas Aggeu Magalhães – CPqAM da

Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ/MS

para a obtenção de título de Mestre em

Saúde Pública, área de concentração em

Métodos Diagnósticos e controle de

Endemias.

Orientadora: Dra. Otamires Alves da Silva, PhD – Saúde Pública

Recife – PE

2003

Dedico esta obra aos meus pais, Otávio Vieira e

Célia Gomes, que tanto se esforçaram para

a minha formação, por ter me conduzido ao

caminho da honestidade e dignidade.

Aos meus irmãos, Otávio Júnior e Kátia

Maria, pela compreensão, companheirismo e

incentivo prestado a este trabalho.

Por mais difícil que o trabalho possa parecer, difícil mesmo é explicar a solidariedade das pessoas que nos acompanha a cada dia. E difícil mesmo é poder explicar o sentimento de todos aqueles que participaram da execução deste trabalho, após a conquista.

Autor Desconhecido

SUMÁRIO

Pág.

AGRADECIMENTOS i

LISTA DE ABREVIATURAS ii

LISTA DE FIGURAS iii

LISTA DE TABELAS iv

RESUMO v

ABSTRACT vii

1. Introdução 1

1.1 Histórico das Leishmanioses 1

1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana: etiologia, morfologia,

ciclo biológico, epidemiologia

4

1.2.1. Agente etiológico 4

1.2.2. Morfologia 5

1.2.3. Epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar Americana 10

1.2.4. Distribuição geográfica 14

1.2.5. Ciclo Biológico 16

1.3. Relação parasito-hospedeiro e resposta imune 18

1.4. Formas clínicas da leishmaniose Tegumentar Americana 20

1.5. Diagnóstico 22

1.6. Tratamento 27

1.7. Justificativa 28

2. Objetivos 32

2.1. Objetivo Geral 33

2.2. Objetivos Específicos 33

3. Material e Métodos 34

3.1. Casuística de caso 35

3.2. Definição de caso 35

3.3. Amostras de soro 36

3.4. Exames Imunológicos 36

3.4.1. Teste de Imunofluorescência Indireta (IFI) 36

3.4.2. Teste de Aglutinação Direta (TAD) 37 37

3.4.2.1. Cultivo dos parasitos – Preparação do Antígeno 37

3.4.2.2. Protocolo Técnico 38

3.5. Validação do Teste 39

4. Resultados 41

5. Discussão 45

6. Conclusões 48

7. Bibliografia 49

8. Anexos 61

8.1. Artigo enviado para publicação 62

8.2. Resumos apresentados em congressos 68

i

AGRADECIMENTOS

A Deus por me fortalecer a cada dia, permitindo superar os momentos mais difíceis da minha vida.

Ao Dr. Rômulo Maciel, diretor do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães (CPqAM/FIOCRUZ) pela disponibilidade das instalações, materiais e equipamentos. Aos colegas do Departamento de Parasitologia do CPqAM, em especial ao Petronildo Bezerra, pelo convívio e auxilio. À Dra Otamires Silva, pela perseverança, dedicação e orientação no desenvolvimento desta tese. À Coordenação do Curso de Pós-graduação do NESC/CPqAM/FIOCRUZ : diretores, professores, funcionários e colegas, pela presteza e amizade durante o curso de Mestrado. Aos colegas Fábio Brayner e Luiz Carlos, pelo constante apoio e ensinamentos, que contribuíram para o crescimento deste trabalho. Ao Dr. Alexandre Bezerra de Carvalho, ex-diretor do CPqAM/FIOCRUZ, que possibilitou a disponibilidade do laboratório no início deste trabalho. A Ulisses Montarroyos, pela elaboração das análises estatísticas, assim como a todos que compõem o NICC/CPqAM/FIOCRUZ, pela atenção e cooperação cordial nos momentos de dificuldades. Às funcionárias da biblioteca do CPqAM/FIOCRUZ, em especial a Luciana Abrantes e Virgínia Guimarães, pela amizade e efetiva colaboração com as referências bibliográficas. À família Guimarães Vieira, especial ao Dr. Renato, homem simples, humilde e tão sábio a quem tomei como referência humana, pela sua dignidade, solidariedade e honestidade. A todos que direta e indiretamente contribuiram com uma boa e significante parcela particular, para que terminássemos esse grande trabalho.

ii

LISTA DE ABREVIATURAS

mg Miligrama

µl Microlitro

µm Micrômetro

BSA Albumina Sérica Bovina

IRM Intradermoreação de Montenegro

Kg Kilograma

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

IFI Imunofluorescência Indireta

TAD Teste de Aglutinação Direta

LCD Leishmaniose Cutânea-Difusa

LCM Leishmaniose Cutânea-Mucosa

LIT Infuso de Fígado Triptose

LTA Leishmaniose Tegumentar Americana

LV Leishmaniose Visceral

SFB Soro Fetal Bovino

NNN Novy, McNeal e Nicole

NaCl Cloreto de Sódio

PCR Reação em Cadeia da Polimerase

cm Centímetro

Lu Lutzomyia

SFM Sistema Fagocítico Momonuclear

CPqAM Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães

WHO World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)

UFPE Universidade Federal de Pernambuco

FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz

MS Ministério da Saúde

FUNASA Fundação Nacional de Saúde

DNA Ácido Desoxirribonucleíco

iii

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1: Estátua descoberta no Equador (época pré-colombiana): lesões múltiplas do nariz ........................................................................

02

Figura 2: Amastigotas de Leishmania sp. em preparação citológica obtida por biópsia ...................................................................................................

06

Figura 3: Representação esquemática da ultra-estrutura das diferentes fases evolutivas de uma Leishmania.................................................................

08

Figura 4: Flebótomo vetor responsável pela transmissão da doença.......................

12

Figura 5: Leishmaniose Cutânea – Países altamente endêmicos (90%)..................

15

Figura 6: Ciclo Evolutivo da Leishmania spp..........................................................

17

Figura 7: Apresentação das Equações utilizadas para calcular sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN).......

40

iv

LISTA DE TABELAS

Pág.

Tabela 1. Distribuição por faixa etária dos indivíduos pesquisados

segundo sexo e resultado do Teste IFI....................................................

42

Tabela 2: Tabela de contingência, mostrando a categorização dos

indivíduos estudados, aplicando-se a definição de caso de LTA...........

44

v

RESUMO

As leishmanioses, causadas por diferentes espécies de leishmanias, são uma das

seis doenças declaradas prioritárias pela Organização Mundial de Saúde (OMS).

Os sinais e sintomas de diferentes formas de leishmaniose são confusos e

freqüentemente semelhantes aos de outras doenças. Embora somente os testes

parasitológicos forneçam o diagnóstico de certeza, muitas vezes a escassez de

parasitas na Leishmaniose Tegumentar torna difícil a detecção dos mesmos.

Este trabalho teve como objetivo, avaliar o Teste de Aglutinação Direta (TAD), no

diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) utilizando como

antígeno formas promastigotas de L. (V) braziliensis tratadas com tripsina, fixadas

em formalina e coradas com Coomassie blue. Um total de 100 soros humanos de

diferentes idades, sexos e cor foi utilizado nos testes. Dos 50 soros positivos para

IFI, 49 (98 %) demonstraram títulos a partir de 1:1.600 chegando até 1:51.200,

quando analisados pelo TAD. Dos soros restantes, negativos, apenas 8 (16 %)

apresentaram títulos iguais a 1:3.200, sendo esta também sua maior titulação.

Um ‘’cut-off ’’ de 1:1.600 foi capaz de discriminar 98 % de sensibilidade e 84 %

de especificidade. Os resultados apresentados sugerem que o TAD pode ser

indicado como um instrumento importante no diagnóstico da LTA, uma vez que

seus procedimentos são fáceis de serem executados, tanto no laboratório como no

vi

campo, é de baixo custo, não apresenta reação cruzada com outras doenças e não

necessita de equipamentos sofisticados.

vii

ABSTRACT

Leishmaniasis, caused for different species of leishmanias, is one of the six with

priority declared illnesses for the World Health Organization (WHO). The signals

and symptoms of different forms of leishmaniasis are confused and frequently

similar to the ones of other illnesses. Although the parasitological tests only supply

the certainty diagnosis, many times the scarcity of parasites in the Leishmaniasis

Cutaneous becomes difficult the detention of the same ones.

This work had as objective, to evaluate the Direct Agglutination Test (DAT), in the

diagnosis of American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) using as antigen forms

promastigotas of L. (V) braziliensis treated with trypsina, fixed in formalin and

stained with Coomassie blue. A total of 100 human sérums of different ages, sex

and color was used in the tests. Of the 50 positive sera for IFI, 49 (98 %) had

demonstrated headings from 1:1.600 arriving up to 1:51.200, when analyzed for

the DAT. Of the remaining, negative sera, only 8 (16 %) had presented equal

headings the 1:3.200, being this also its bigger titulation.

One '' cut-off '' of 1:1.600 was capable to discriminate 98 % of sensitivity and 84 %

of specificity. The presented results suggest that the DAT can be indicated as an

important instrument in the diagnosis of the ACL, a time that its procedures are

easy to be executed, as much in the laboratory as in the field, it is of low cost, it

viii

does not present reaction crossed with other illnesses and it does not need

sophisticated equipment.

Silva, O.V Avaliação do Teste de Aglutinação Direta.......................... 1

1. INTRODUÇÃO

1.1 - Histórico das Leishmanioses

No homem, as Leishmanioses representam um complexo de patologias

associadas à infecção de células do Sistema Fagocítico Mononuclear (SFM) por

protozoários do gênero Leishmania. A forma cutânea da leishmaniose já havia

sido descrita no primeiro século da era cristã, com os relatos de feridas na pele

que recebiam o nome de acordo com a região onde ocorriam: botão de Bagdá no

Iraque, botão de Aleppo na Síria, ferida de Balkh no Afeganistão, etc. (Neves,

1998).

Na América, a doença é conhecida desde a época pré-colombiana (400 a

900 d. C.), através de cerâmicas peruanas e equatorianas, que documentam em

potes Mochica e Huaco, faces humanas com mutilações do nariz e dos lábios,

semelhantes às provocadas pela leishmaniose cutâneo-mucosa (Brücker e

Gentilini, 1987) (Figura 1).


Figura 1. Estátua descoberta no Equador (época pré-Colombiana: lesões múltiplas do nariz. Fonte: La Fondation Rhône-Poulenc Santé


Segundo Neves (1998), em 1885, Cunningham observou pela primeira vez

parasitos pertencentes ao gênero Leishmania, em casos de leishmaniose visceral

na Índia. Em seguida, vários outros pesquisadores também passaram a encontrar

e descrever esses parasitos. Em 1903, Ross criou o gênero Leishmania e no

mesmo ano, foi identificado o agente etiológico do botão-do-Oriente,

classificado como Leishmania tropica.

No Brasil, a leishmaniose foi conhecida quando Cerqueira em 1855,

identificou lesões de pele semelhantes ao botão-do-Oriente. A partir de 1908

durante a construção da Estrada de Ferro do Noroeste do Brasil, em São Paulo,

ocorreram numerosos casos, principalmente na cidade de Bauru, originando-se

daí o nome “úlcera-de-Bauru”. Lindenberg, Carini e Paranhos, em 1909,

relataram a presença das leishmanioses furunculosas e de úlceras crônicas em

uma população residente em Baúru, Estado de São Paulo, e ainda identificaram

o parasito causador dessas lesões (Terra, 1913).

Em 1911, Gaspar Vianna, considerando o agente etiológico da “úlcera-de-

Bauru” diferente da Leishmania tropica, propôs o nome de Leishmania

braziliensis. No mesmo ano, Carlos Chagas, durante uma excursão à Amazônia,

suspeita de casos de leishmaniose visceral. (Pessoa e Martins, 1988).


1.2. Leishmaniose Tegumentar Americana: etiologia, morfologia, ciclo

biológico e epidemiologia.

1.2.1. Agente etiológico

Segundo Rey (1992), o gênero Leishmania, Ross 1903, agrupa espécies de

protozoários unicelulares, parasitos pertencentes à família Trypanosomatidae e à

ordem Kinetoplastida. Os organismos desta ordem apresentam de um a dois

flagelos, localizados em uma depressão da membrana plasmática, e uma

organela rica em DNA, o cinetoplasto. Dos nove gêneros da família

Trypanosomatidae, apenas dois, o Trypanosoma e a Leishmania, são de

interesse médico, sendo o primeiro responsável pela Doença de Chagas

(Américas) e pela Doença do sono (África), e o segundo pelas leishmanioses:

cutânea, cutânea-mucosa e visceral.

As leishmanias são parasitos digenéticos, encontrados nas formas

amastigotas como parasitos de células do SFM de mamíferos e flagelados

promastigotas, no trato digestivo de insetos vetores da família Psychodidae. Sua

transmissão ocorre através da picada do inseto infectado (Neves, 1998).


1.2.2. Morfologia

As formas evolutivas dos parasitos do gênero Leishmania apresentam

grandes semelhanças morfológicas entre suas diversas espécies. As formas

amastigotas são arredondadas, intracelulares, vivem e se multiplicam no interior

de fagolisossomos das células do SFM dos mamíferos. Quando fixadas e

coradas pelos métodos derivados do Romanowski (Giemsa ou Leishman) e

observadas através do microscópio óptico, as amastigotas são identificadas

como organismos ovais ou esféricos, com citoplasma corado em azul-claro, um

único núcleo grande e arredondado que se cora em vermelho-púrpura (Figura 2).

No citoplasma, além de vacúolos, encontra-se uma organela característica,

o cinetoplasto em forma de bastonete, que também se cora em vermelho-púrpura

situando-se próximo ao núcleo, geralmente tangente a este. Não há flagelo livre,

mas apenas um rudimento que dificilmente pode ser visualizado. Os limites

micrométricos dos diâmetros da forma amastigota são de aproximadamente 1,5

a 3,0 x 3,0 a 6,0(m, dependendo da espécie (Rey, 1992; Neves, 1998).

Examinadas na microscopia eletrônica, observa-se que as formas amastigotas,

apresentam uma unidade de membrana plasmática trilaminar.


No hospedeiro, a membrana do parasito é responsável pela aquisição de

nutrientes, secreção, excreção de metabólitos e principalmente, como proteção

dos diversos mecanismos de defesa do hospedeiro (Gottlieb e Dwyer, 1988).

Figura 2. Amastigotas de Leishmania sp. em preparação citológica obtida por biópsia. Fonte: Manual de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana, 2000


Várias moléculas, com diversas funções, têm sido identificadas na

superfície das formas amastigotas de Leishmania. A maioria destas moléculas

está ligada à membrana via âncora de glicosil-fosfatilinositol (Moody, 1993;

McConville, 1996). Sob a membrana plasmática, existe um sistema de

microtúbulos (microtúbulos subpeliculares) em hélice disposto ao redor do

corpo do parasito. Na parte anterior do protozoário, a membrana forma uma

invaginação onde se localiza a bolsa flagelar contendo o pequeno flagelo. Nesta

região, não estão presentes os microtúbulos subpeliculares e são grandes as

atividades de excreção e pinocitose (Neves, 1998; Roberts e Janovy, 1996). São

observados ainda, no citoplasma, o aparelho de Golgi, o retículo

endoplasmático, além de vacúolos e inclusões (Neves, 1998).

As formas promastigotas se apresentam alongadas, extracelulares e são

geralmente encontradas no inseto vetor ou em cultura axênica. As organelas e

estruturas moleculares citadas anteriormente para as formas amastigotas são

essencialmente as mesmas encontradas nas formas promastigotas (Figura 3).


Figura 3. Representação esquemática da ultra-estrutura das diferentes fases evolutivas de uma Leishmania. A = Forma amastigota. B = Forma promastigota. Fonte: Parasitologia Luis Rey, 1992


O tamanho das formas promastigotas pode variar, dependendo da espécie,

entre 16 e 40µm de comprimento e 1,5 a 3µm de largura . Possuem um flagelo

longo e funcional que emerge da parte anterior do corpo, proporcionando

mobilidade ao parasito, além de ajudá-lo a se fixar no epitélio digestivo do

hospedeiro invertebrado (Pessoa e Martins, 1988). A estrutura deste flagelo é

típica de um axonema eucariótico com o característico arranjo 9+2 de

microtúbulos ligados à dineína. Uma estrutura peculiar, o bastão para flagelar, é

encontrado ao longo do axonema do flagelo de alguns organismos, entre eles,

diversas espécies da ordem Kinetoplastida (Bastin et al.,1996). Sua função

parece estar envolvida com a motilidade do parasito (Santrich et al., 1997). As

formas promastigotas metacíclicas são consideradas como estágios infectivos e

encontradas no vetor ou em culturas axênicas em fase estacionária (Sacks, 1988;

Alexander e Russel, 1992). Segundo Sacks (1988), estes estágios só podem ser

realmente identificados ao nível molecular. Formas evolutivas de Leishmania

bastante semelhante às formas promastigotas, são encontradas aderidas, pelo

flagelo, através de hemidesmossomos, ao epitélio do trato digestivo de

flebótomos infectados (Rangel et al.,1992; Neves, 1998).


A multiplicação assexuada das leishmanias, por divisão binária e simples, é

iniciada pela duplicação do cinetoplasto, onde um mantém o flagelo

remanescente enquanto o outro promove a reprodução flagelar. Em seguida, o

núcleo se divide e, em seqüência, o corpo do parasito se fende, no sentido

ântero-posterior (Neves, 1998). Por outro lado, existem diversas evidências de

que o parasito possa sofrer alguma forma de reprodução sexuada, entre elas o

encontro de híbridos na natureza (Kelly et al.,1991; Kreutzer et al., 1994; Belli

et al., 1994).

1.2.3. Epidemiologia da Leishmaniose Tegumentar Americana

Hospedeiros e vetores

O gênero Leishmania é mais complexo do que originalmente se pensava,

possui um número de diferentes espécies que infecta uma larga variedade de

reservatórios (mamíferos silvestre ou não, pertencentes a várias ordens) e

vetores (flebotomíneos do gênero Lutzomyia) (Grimaldi et al.,1993; Marzochi e

Marzochi, 1994; Travi et al.,1998). Sabe-se que os pequenos mamíferos


(roedores e marsupiais), considerados reservatórios naturais do parasito,

raramente a Leishmania produz doença. A infecção geralmente permanece

benigna e inaparente, sugerindo uma antiga e bem balaceada relação parasito-

hospedeiro. Em hospedeiros acidentais, entretanto, incluindo o homem e alguns

animais domésticos como cães e eqüinos, a infecção comumente produz seus

sintomas (Neves,1998). Em 1995 surgiram os primeiros relatos de flébotomos

como vetores das leishmanioses, com a identificação do gênero Phlebotomus

(atualmente vetor da Leishmania do Velho Mundo) como carreador da L. (L)

tropica (Herrer e Christensen,1975). Desde 1992, o gênero Lutzomyia tenha sido

considerado como o responsável pela transmissão da leishmaniose no Brasil e

nas Américas (Pessoa e Martins, 1998). Estes dípteros, pertencentes à família

Psychodidae, subfamília Phlebotominae, são insetos pequenos, medindo de 2 a

4mm de comprimento e possuem o corpo densamente coberto por pêlos. No

Brasil, são conhecidos por vários nomes: birigüi, mosquito-palha, tatuquira, asa-

dura, entre outros. Quando vivos, e em repouso, exibem uma posição

característica com as asas mantidas divergentes e semi-eretas. Apenas a fêmea é

hematófaga. Muito pouco se sabe sobre os locais de desenvolvimento dos

flebotímeos (Neves, 1998). (Figura 4.).


Figura 4 – Flebótomo vetor responsável pela transmissão da doença.


Espécies de hábitos silvestres como Lutzomyia wellcomei são altamente

antropofílicas, picando avidamente o homem. Outros como o Lu. whitmani,

adaptaram-se ao ambiente peridomiciliar ou mesmo intra-domiciliar

(Neves,1998). As diversas características epidemiológicas dos vetores e

hospedeiros vertebrados tais como habitat, horário de atividade, etc.,

determinam como se processa o ciclo de transmissão da doença é

essencialmente silvestre, devido ao fato dos mamíferos hospedeiros serem

animais selvagens. Os seres humanos geralmente se infectam apenas quando

penetram na floresta, embora possa haver o risco da doença atingir a zona

periurbana de cidades próximas à áreas de desflorestamento (Marzochi e

Marzochi, 1994). Por outro lado no calazar, doença causada pela L. (L.) chagasi,

pode existir um ciclo silvestre, com a participação da raposa (Cerdocyon thous)

e talvez, de marsupiais (Travi et al., 1998), e um ciclo doméstico, onde o cão

parece ser o reservatório principal do parasito onde o homem é geralmente

infectado (Courtenay et al., 1994). O vetor Lu. Longipalpis, parece ser bem

adaptado tanto à floresta quanto ao peridomicílio. O papel do homem como

reservatório do calazar não deve ser destacado (De Andrade,1997).


1.2.4. Distribuição geográfica

As leishmanioses acompanham a distribuição do inseto vetor, pertencente a

sub-família Phlebotominae, podendo ser encontradas praticamente em todo o

mundo. Atualmente, as leishmanioses estão presentes em quatro continentes e

são endêmicas em 88 países, atingindo aproximadamente 12 milhões de pessoas

e com um número estimado de 1,5 a 2 milhões de casos por ano. Destes, 1 a 1,5

milhões são casos de leishmaniose cutânea e 500.000, de leishmaniose visceral

(WHO,1998). Aproximadamente 37 milhões de pessoas estão sob risco de

contrair a doença (Ivens e Smith,1997). (Figura 5.).

Grande parte dos países americanos, inclusive os Estados Unidos relatam

casos autóctones de leishmaniose (McHugh et al.,1996). Segundo a OMS, o

Brasil está entre os países onde ocorrem a maioria dos casos de leishmaniose no

mundo, tanto na forma cutânea como visceral. Tanto a Leishmaniose Visceral

(LV) como as Leishmanioses Tegumentar Americana (LTA): cutânea, cutâneo-

mucosa e cutâneo-difusa, são doenças de notificação compulsória em todo

território nacional.


Figura 5. Leishmaniose cutânea Países altamente endêmicos (90%) - Fonte: WHO/TDR, 1996


1.2.5. Ciclo biológico

Os hospedeiros vertebrados são infectados quando formas promastigotas

infectantes (metacíclicas) são inoculadas, pelas fêmeas dos insetos vetores,

durante o repasto sanguíneo. Ao ser inoculado no vertebrado, o parasito

necessita superar o ambiente hostil personificado pelas defesas orgânicas do

hospedeiro.

Os promastigotas, ao entrarem no macrófago através de um vacúolo

endossômo, gradativamente se transformam em amastigotas imóveis e

arredondadas. Dentro do vacúolo fagocitário, os amastigotas multiplicam-se por

divisão binária até ocupar todo o citoplasma do macrófago. Esgotando-se sua

resistência, é pressuposto que a membrana do macrófago se rompe

mecanicamente liberando os amastigotas no tecido onde são novamente

fagocitadas (Figura 6). No entanto, é possível que moléculas produzidas pelo

parasito, como a leishporina, promovam a ruptura da membrana do macrófago

(Horta, 1997).


Ciclo de vida da Leishmaniose spp

Os promastigotas entram no macrófago e se transformam em

amastigotas

O hospedeiro vertebrado é infectado com

promastigotas, após ser picado pelo inseto vetor

Dentro do inseto vetor os amastigotas

transforma-se em promastigotas

O vetor ingere macrófagos

infectados durante a hematofagia

O tipo de Leishmaniose (i.e., cutânea, visceral, etc) é determinada

pela localização primária dos macrófagos infectados

O macrófago se rompe, os amastigotas são liberados e vão infectar outros macrófagos

Figura 6. Ciclo Evolutivo da Leishmania spp.

Fonte: Ohio State University, 2000


O curso da infecção nos hospedeiros vertebrados, incluindo o homem, é

bastante variável e dependendo da espécie do parasito, esta poderá ficar restrita

à pele ou visceralizar, tornando-se sistêmica. A infecção no vetor se dá através

da eventual ingestão de macrófagos contendo parasitos no seu interior, por

fêmeas de flebótomos, durante seu repasto sanguíneo no vertebrado (Roberts e

Janovy, 1996).

1.3. Relação parasito-hospedeiro e resposta imune

O desfecho da relação parasito-hospedeiro, seja no sentido da cura ou na

produção de formas clínicas as mais diversas, depende de fatores genéticos do

parasito ou do hospedeiro, bem como das interações que se desenvolvem entre

as populações de células hospedeiras (macrófagos) e outras células

imunocompetentes (T e B) envolvidas em mecanismos de estimulação ou de

modulação das reações imunológicas.

O parasito, uma vez inoculado no organismo vertebrado, é fagocitado pelos

macrófagos através da interação entre receptores CR3 com glicoconjugados e

lectinas da Leishmania, como a Gp63 (proteinase dependente de zinco) e os


lipofosfoglicanos (LPG), glicolipídeos presentes na membrana, iniciando assim

seu estágio de desenvolvimento intracelular (Mosser, Springer & Diamond,

1992). O parasito produz alterações nas células infectadas, nas quais

eventualmente sobrevivem e se multiplicam no organismo hospedeiro, que

paralelamente desenvolve suas respostas à infecção. Na infecção, o encontro dos

antígenos parasitários com as células imunocompetentes possivelmente ocorre

durante os breves períodos extracelulares do parasito, quando são inoculados, ou

no momento da ruptura dos macrófagos infectados, com liberação parasitária.

Os antígenos processados, ao serem apresentados às células T, dependendo da

espécie de Leishmania e da susceptibilidade do hospedeiro, determinarão a

resposta do tipo Th1 ou do tipo Th2, que podem ser diferenciadas pelo seu

padrão de produção de citocinas (Reed & Scott, 1993).

As leishmanioses consistem em um complexo de doenças, que tanto do

ponto de vista imunológico, como do ponto de vista clínico, podem ser

enquadradas em três principais categorias: cutânea, mucocutânea e visceral. Nas

formas cutâneas, exemplificada pela doença causada por L. major e L.tropica no

Velho Mundo e L. mexicana e L. braziliensis no Novo Mundo, a recuperação


espontânea geralmente ocorre e caracteriza-se por reação do tipo

hipersensibilidade retardada aumentada, resposta anticórpica de baixa

intensidade e resistência à reinfecção. Na leishmaniose mucocutânea, causada

por L. braziliensis, a recuperação ocorre eventualmente, apesar de ser muito

lenta. Tanto as reações de hipersensibilidade retardada, como a resposta

anticórpica estão presentes.

Na leishmaniose visceral, causada por espécies do complexo L. donovani, a

recuperação espontânea é rara e as infecções são caracterizadas por fraca reação

de hipersensibilidade retardada e intensa produção de anticorpos.

1.4. Formas clínicas da Leishmaniose Tegumentar Americana

Existem várias formas de leishmaniose tegumentar americana.

a) Leishmaniose cutânea (LC) consiste em lesões ulceradas que podem

apresentar três formas: localizada, caracterizada pela lesão única; disseminada,

contendo numerosas lesões em várias regiões do corpo e a forma difusa, que é

nodular.

As lesões ulceradas cutâneas manifestam-se com quinze dias ou mesmo


após vários anos de infecção. Estas úlceras variam de tamanho, podendo medir

0,25 cm a 30 cm de diâmetro. Classicamente, a lesão tem bordos elevados, em

moldura, fundo granulomatoso, com ou sem exsudação. Observam-se também

outros tipos de lesões como: úlcero-crostosa, impetigóide, úlcero-vegetante,

verrucosa, tuberosa, linquenóide e outras. Nestas formas, na fase inicial,

freqüente a linfangite e/ou adenopatia satélite, que poderia preceder a lesão de

pele (Pessoa & Barreto, 1948; Marsden, 1986).

Na forma difusa, as lesões são papulosas ou nodulares, distribuem-se

amplamente na superfície corporal, são deformantes e muito graves,

semelhantes às lesões manisfestadas na hanseníase virchowiana. Uma das

características da forma difusa é que os indivíduos afetados são anérgicos e a

enfermidade é crônica recidivante, não existindo cura. Toda as lesões são ricas

em parasitas. Supõe-se que haja uma deficiência imunológica específica do

hospedeiro em combinação com um parasita relativamente não imunogênico.

b) Leishmaniose mucocutânea (LMC), compreende as formas infiltrativas

iniciais, ulcerosas, vegetantes e úlcero-vegetante. Acomete a região

nasofaríngea, laringe e cavidade oral. É de natureza metastática, pode ou não


acompanhar os quadros cutâneos e apresentar-se até 24 horas após a lesão

inicial.

O diagnóstico diferencial inclui outras doenças crônicas de lesões ulceradas

ou não ulceradas tais como: as lesões cutâneas, devem ser excluídas as úlceras

traumáticas, as úlceras de estase, a úlcera tropical, úlceras de membros inferiores

por anemia falciforme, piodermites, paracoccidioidomicose, esporotricose, lúpus

vulgaris, sarcoidose, cromomicoses cutâneas, sífilis, tuberculose cutânea,

blastomicose, donovanose e epiteliomas. A hanseníase virchowiana deverá ser

excluída, pincipalmente no diagnóstico diferencial da leishmaniose cutânea

difusa e nas lesões mucosas, o diagnóstico diferencial deve ser feito com a

paracoccidioidomicose, hanseníase virchowiana, rinoscleroma, bouba, sífilis

terciária, granuloma médio facial e neoplasias (Molyneux & Ashford, 1983).

1.5. Diagnóstico

O diagnóstico da leishmaniose pode ser feito a partir de um conjunto de

abordagens: a) manifestações clínicas compatíveis associadas à procedência de

uma área endêmica; b) resposta à terapêutica específica; c) detecção do parasita


em material de biópsia, através de observação histológica de formas amastigotas

ou através de cultura de amostras clínicas para a detecção de promastigotas ; d)

detecção do DNA do parasita, particularmente DNA de cinetoplasto; e)

imunodiagnóstico (detecção de anticorpos específicos, detecção de antígenos

parasitários e detecção de imunidade por células) (Kar, 1995).

Os sinais e sintomas de diferentes formas de leishmaniose são confusos e

freqüentemente são semelhantes aos de outras doenças. Nessas circunstância, o

diagnóstico é dado com base no conjunto de dados disponíveis sobre o caso.

Classicamente, a detecção do parasita é feita pela observação direta ao

microscópio de preparados citológicos corados pelo Giemsa, que é um

procedimento sensível e rápido, podendo diagnosticar mais de 50% dos

pacientes com lesões recentes (Lane et al., 1994). Na leishmaniose tegumentar,

a demonstração das formas amastigotas pode ser feita também por técnicas

imunocitoquímicas em tecidos de lesão e em “imprints” do tecido ou aspirado de

lesão colocados sobre papel de nitrocelulose. Na identificação dos parasitas tem

sido utilizados os anticorpos policlonais e monoclonais (Salinas et al., 1989).

A biópsia histopatológica é utilizada como técnica diagnóstica em estudo

de processo ulcerativo desconhecido. A menos que se observem as formas


amastigotas, os fragmentos histopatológicos são freqüentemente semelhantes

aos de outras enfermidades deramtológicas inflamatórias ou granulomatosas.

Dado que sua sensibilidade é baixa devido à escassez de parasitas ou distorção

dos amastigotas ao fixar o tecido, a biópsia de pele é muito mais útil para

diagnóstico diferencial, já que estabelece outras etiologias (Weigle et al., 1987).

Um dos métodos diagnósticos mais específicos para a leishmaniose tegumentar

americana consiste no isolamento do parasita em cultura a partir de material

obtido por punção aspirativa ou biópsia das lesões de pacientes.

Um outro método diagnóstico consiste em inocular animais susceptíveis,

sendo o hamster o mais usado para o cultivo in vivo de aspirado ou homogenato

de tecidos infectados. Além de ser falho algumas vezes, a cultura de biópsias

requer pessoal e estrutura laboratorial especializados, não sendo adequada para

rastreamentos epidemiológicos em grande escala. Existe muita discrepância

quanto ao êxito deste procedimento e a positividades das culturas podem variar

entre 13 a 90% (Cuba, Marsden & Barreto, 1981; Weigle et al., 1987; Navin,

Arana & Mérida, 1990). Entre os fatores que determinam esta variabilidade,

podem estar as diferenças nas técnicas utilizadas para obter as amostras,


diferenças entre os meios de cultivo empregados e diferenças entre as espécies

de leishmanias envolvidas.

Com o avanço das técnicas, a biologia molecular vem proporcionar a

identificação de Leishmania em casos de doenças subclínicas, casos com poucos

parasitas e no acompanhamento do tratamento. A detecção do DNA do parasito

pode ser feito por hibridação “in situ” ou pela reação em cadeia da DNA

polimerase (PCR). A amplificação de seqüências específicas de DNA parasitário

por PCR permite a detecção de pouquíssima quantidade de parasitos em

diversos tipos de material (Wilson, 1995). A hibridização é feita com o uso de

sondas que permitem a distinção de complexos e mesmo espécies parasitárias.

Foram descritas sondas específicas para L. major, L. tropica, L. donovani e L.

braziliensis e “primers”para PCR específicos para L. donovani e L. braziliensis

(Barker, 1989; Rogers, Poper & Wirth, 1990; De Bruijn & Barker, 1992;

Grimaldi &Tesh, 1993). Devido à sua grande sensibilidade, potencial e

capacidade de distinguir entre infecções passadas e ativas de LTA, a PCR

poderá futuramente se tornar uma ferramenta importante para o diagnóstico de

infecções subclínicas e na avaliação da resposta terapêutica. Contudo, são

abordagens dispendiosas, complexas, requerendo estrutura especializada,


dificilmente encontradas nas zonas endêmicas.

A intradermorreação pelo teste de Montenegro (IRM) é um dos testes mais

utilizados no imunodiagnóstico, devido à sua sensibilidade e especificidade,

apresentando-se positiva na grande maioria dos casos de LTA. Pode ser negativa

nos casos em que as lesões são recentes (seis semanas ou menos), assim como

nos casos de leishmaniose cutânea difusa e visceral (Marzochi et al., 1980).

Entretanto, em áreas de alta endemicidade é muito freqüente encontrar

reatividade a esta prova na população, de tal forma, que esta não é útil no

diagnóstico de lesão ativa. Shaw & Lainson (1975) relataram 84 e 100% de

positividade para as lesões cutâneas simples e mucocutâneas, respectivamente.

Nos casos de leishmaniose cutânea difusa, o teste de Montenegro se mostrou

não reativo, podendo ser útil quando os parasitas são escassos nas lesões e no

diagnóstico de visitantes após retorno de áreas endêmicas (Kar, 1995).


1.6. Tratamento

Apesar dos esforços recentes na pesquisa de novas drogas para o

tratamento específico das leishmanioses, os antimoniais pentavalentes

permanecem como as drogas de eleição. São eles antimoniato de meglumina

(Glucantime®) e stibogluconato de sódio (Pentostam®). Estas drogas são

administradas por via parenteral, na dose de 10 a 20 mg/kg/dia durante 30 dias,

em até 3 séries consecutivas de tratamento com intervalo de 10 dias entre uma

série e outra. Se não houver cicatrização após 3 meses do término do tratamento,

o esquema deverá ser repetido.

Não havendo resposta satisfatória ao tratamento com antimoniais

pentavalentes, as drogas de segunda escolha são: a) Anfotericina B

(Fungizon®), administrada via endovenosa, gota-a-gota, na dose diária de 0,2

mg/kg até o máximo de 50 mg, dissolvidos no soro glicosado 5% com tempo de

infusão de 3 a 4 horas; b) Pentamidina de 4mg/kg/dia, via intra muscular, de 2

em 2 dias (WHO, 1996).


1.7. Justificativa

Apesar do diagnóstico conclusivo da leishmaniose depender da detecção do

parasito em amostras biopsiadas de tecidos infectados, da detecção de

amastigotas em amostras coradas ou da detecção de promastigotas através de

cultura de biópsias em meio de cultura, muitas vezes os resultados são

negativos. Os parasitos são escassos em pacientes com mais de um ano de

evolução e, além disso, em áreas rurais e pequenos vilarejos não existe estrutura

para inocular os parasitos em meios de cultura ou animais. Nesta situação, o

sorodiagnóstico parece, portanto, ser uma alternativa válida de diagnóstico de

infecção leishmaniótica em áreas de baixa endemicidade e no diagnóstico em

visitantes recentemente expostos a áreas endêmicas. Um estudo mais elaborado,

no sentido de caracterizar a resposta humoral, pode ser útil para uma melhor

compreensão dos mecanismos imunes envolvidos na resposta protetora, além de

possibilitar a identificação de antígenos fortemente reativos que poderão ser

úteis na elaboração de testes diagnósticos mais eficientes e aprimorados.


A baixa sensibilidade detectada no método sorológico convencional de IFI

para diagnóstico de uma infecção leishmaniótica e a alta reação cruzada com

pacientes chagásicos nos chama a atenção para analisar na rotina de diagnóstico

da LTA métodos mais sensíveis e específicos, como o Teste de Aglutinação

Direta (TAD), acompanhados de um diagnóstico clínico e sorológico diferencial

entre Leishmanias especialmente nas zonas onde coexistem os vetores de ambas

enfermidades (Pozzoli et al ,1997).

O Teste de Aglutinação Direta (TAD), na sua versão aperfeiçoada, tem sido

empregado com sucesso no diagnóstico da leishmaniose visceral ou Calazar. Ele

permite um diagnóstico extraordinariamente preciso, com elevada sensibilidade

e sem reações cruzadas (Harith et al., 1987). É um método que dispensa a

utilização de equipamentos sofisticados, é de baixo custo e seus procedimentos

são simples de serem executados. Do ponto de vista técnico, uma das maiores

vantagens que apresenta é a não utilização de um conjugado de imunoglobulina

espécie-específico, podendo ser útil em casos de infecções naturais e

experimentais de mamíferos (Garcez et al., 1996). Além disso, o antígeno tem

uma longa duração quando bem acondicionado.


Vários autores descreveram a utilização do Teste Aglutinação Direta de

parasitas, comparando com os resultados do Teste de Imunofluorescência.

Vattuone e Yanowsky (1971), uitlizando uma suspensão de formas

epimastogotas de T. cruzi, tratadas em enzimas e fixadas pelo formol, obtiveram

boa sensibilidade na detecção de anticorpos na fase aguda da doença de Chagas.

Alain e Kagan, em 1975, chamam a atenção da necessidade da realização

de tratamento das leishmanias com tripsina e preservação em formalina durante

a preparação do antígeno para evitar auto-aglutinação.

Harith e colaboradores em 1986, modificaram a técnica para utilização no

diagnóstico sorológico da leishmaniose visceral adicionando-se à preparação do

antígeno o azul brilhante de Coomassie, possibilitando a visualização de títulos

superiores a 1:51.200. O título indicativo de leishmaniose visceral foi

considerado superior a 1:1.600 com sensibilidade de 100% e especificidade de

99,3%.

Em 1987, Harith e colaboradores padronizaram o teste de microaglutinação

de formas epimastigotas de T.cruzi, tratadas com tripsina e coradas pelo

Comassie Blue. O tratamento dos soros com 2-mercaptaetanol foi fundamental


para a eliminação de anticorpos inespecíficos obtendo altos índices de

sensibilidade e especificidade.

Neste nosso, estudo procuramos avaliar o TAD como método utilizado no

auxílio ao exame clínico e epidemiológico da LTA associada à L. braziliensis

com o propósito de contribuir e facilitar o diagnóstico na áreas endêmicas.


2. OBJETIVOS _________________________________________


2.1. Objetivo Geral

Analisar a validade do Teste de Aglutinação Direta (TAD) no diagnóstico

da Leishmaniose Tegumentar Americana Humana, em comparação com a

técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI).

2.2. Objetivos Específicos

Verificar a importância do TAD como indicador da prevalência da doença,

observando a sensibilidade e a especificidade do teste diante do convencional.

Investigar a infecção por Leishmania com finalidade de poder distinguir as

manifestações clínicas entre as leishmanioses (LTA e LV) e a doença de

Chagas, por acaso existentes na mesma área.


3. MATERIAL E MÉTODOS _________________________________________


3.1. Casuística e métodos

Os soros utilizados neste estudo fazem parte da soroteca do Laboratório de

Leishmaniose do Departamento de Parasitologia/CPqAM/FIOCRUZ, utilizados

em projetos anteriores submetidos à Comissão se Ética Médica da Universidade

Federal de Pernambuco/UFPE e posteriormente à Comissão de Ética Médica do

Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/CPqAM/FIOCRUZ. Ambos os projetos

foram aprovados pelas respectivas comissões.

3.2. Definição de caso

A definição de caso de leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) foi

baseada nos seguintes critérios;

1 - Presença de lesões tegumentares típicas e antecedentes epidemiológicos.

2 - Positividade nos testes diagnósticos seguintes:

sorologia (IFI) e exame histopatológico.


3.3. Amostras de soro

A amostra consistiu de 100 soros de indivíduos de ambos os sexos, idades

variadas, residentes em área endêmica para LTA (Município de Primavera/PE),

com confirmação através da sorologia (IFI) ou exame histopatológico.

- Foram distribuídos da seguinte maneira:

50 soros positivos (sorologia e histopatológico positivos)

50 soros negativos (sorologia negativa)

3.4. Exames Imunológicos

3.4.1. Teste de Imunofluorescência Indireta (IFI)

(Leishmaniose Humana - kit Bio-Manguinhos).

A IFI foi utilizada para detecção de anticorpos circulantes específicos

contra Leishmania sp. em soros humanos essencialmente de acordo com


Camargo (1966). Foi utilizado o Kit-IFI-Leishmaniose humana produzido por

Bio-Manguinhos-FIOCRUZ, seguindo as instruções do fabricante. Foram

utilizados dois soros padrão (positivo e negativo) na diluição de 1:40, tendo sido

considerados positivos aqueles que apresentaram fluoreescência das leishmanias

na lâmina a uma diluição sérica de 1:40.

3.4.2. Teste de Aglutinação Direta (TAD).

3.4.2.1. Cultivo dos Parasitas – Preparação do antígeno

Promastigotas de Leishmnania (V.) braziliensis (MHOM/BR/75/M-2903)

foram cultivadas em meio LIT (suplementado com 10% de SFB e 1% de

Streptomicina/Penicilina), NNN com fase sólida ágar sangue, e na fase líquida o

RPMI 1640 com soro fetal bovino. Foram utilizadas na produção de antígenos

(para obtenção do antígeno total), segundo o método de Harith et al (1988); os

parasitos foram lavados em solução de Locke (pH 7,7) a 4oC, tratados com

tripsina (1:250, Gibco, Detroit, USA) a 0,4% em solução de Locke por 45 min a

37oC, e fixados por 20h a 4oC com formalina a 1% em solução de Locke. Após


lavagem em salina-citrato (0,15M cloreto de sódio + 0,056M citrato de sódio,

pH 7,4), os parasitos foram corados com azul brilhante de Coomassie a 0,1% em

salina por 90 min, sob agitação. Os parasitos, após corados, foram lavados em

salina-citrato e ressuspensos com formalina a 1% em salina-citrato. A

suspensão foi filtrada em filtro Millipore (41µm/dm. de porosidade) e a

concentração de parasitas foi ajustada para 2x108 parasitos/ml em formalina. A

preparação foi mantida no escuro a 4°C até sua utilização.

3.4.2.2. Protocolo técnico

Para a realização do teste, diluições seriadas de 1:50 até 1:51.200 dos 100

soros foram feitas com NaCl a 0,9% suplementado com 1% de albumina sérica

bovina (BSA) e 2-mercaptoetanol 0,1M (SIGMA). Os soros diluídos foram

colocados em microplacas de fundo em “V”, começando a partir da segunda

coluna. A primeira coluna, contendo diluente + antígeno, foi usada como

controle da reação. Após a distribuição dos soros, foi adicionado 50µl do

antígeno em cada poço. As placas foram então incubadas durante 24h à

temperatura ambiente e lidas em seguida. O título de aglutinação foi


determinado como sendo o do poço anterior àquele onde se observava um

“botão” idêntico ao observado no poço controle da 1a coluna..

3.5. Validação do Teste :

Os parâmetros sorológicos (sensibilidade e especificidade) do Teste de

Aglutinação Direta realizados com antígeno de promastigotas de L. (V)

braziliensis da cepa MHOM/BR/75/M-2903, foram estimados de acordo com

Guimarães (1985), Ferreira & Ávila (2001), utilizando uma tabela de dupla

entrada. (Figura 7).


Figura 7. Apresentação das equações utilizadas para calcular sensibilidade,

Teste

Doença Presente

Doença Ausente

Positivo

Positivos verdadeiros

a

Positivos falsos

b

Negativo

Negativos falsos

c

Negativos verdadeiros

d

Total

a + c

b + d

Sensibilidade = a Especificidade = b _______ _______ a + c b + d

VPP = a VPN = d ________ ________ a + b c + d


especificidade, valores preditivo positivo (VPP) e negativo (VPN).

4. RESULTADOS

Um total de 100 soros de indivíduos de ambos os sexos, na faixa etária de 0

a 65 e mais (Tabela 1), residentes em área endêmica para LTA (Município de

Primavera/PE), com confirmação através da sorologia (IFI) ou exame

histopatológico.

Dos 50 soros positivos para IFI, 49 (98%) demonstraram títulos a partir de

1:1.600 chegando até 1:51.200. Dos soros restantes, negativos, apenas 8 (16%)

apresentaram títulos iguais a 1:3.200, sendo esta também sua maior titulação.

A distribuição dos soros em relação aos seus títulos está demonstrada na

figura 8. Um “Cut-off” de 1.1600 foi capaz de discriminar 98% de sensibilidade

e 84% de especificidade (Tabela 2). Os resultados obtidos com o TAD neste

estudo indicam a possibilidade do deste teste sorológico como mais um

diagnóstico.


Tabela 1. Distribuição por faixa etária dos indivíduos pesquisados segundo

sexo e resultado do teste IFI

Sexo

Faixa Feminino

Masculino

Etária (em anos)

Positivo

Negativo

Positivo

Negativo

n

%

n

%

Total

n

%

n

%

Total

Total

0 a 5

01

4,8

00

0,0

01

02

6,9

00

0,0

02

03

6 a 12 04 19,0 03 17,6 07 03 10,3 12 36,4 15 22

13 a 19 03 14,3 04 23,5 07 05 17,2 05 15,2 10 17

20 a 39 07 33,3 05 29,4 12 10 34,5 05 15,2 15 27

40 a 65 06 28,6 04 23,5 10 06 20,7 09 27,3 15 25

65 e mais 00 0,0 01 5,9 01 03 10,3 02 6,1 05 06

Total

21

100,0

17

100,0

38

29

100,0

33

100,0

62

100


Figura 8. Distribuição dos títulos do teste de aglutinação direta de uma

amostra de 100 soros humanos com diagnósticos positivos e negativos para

Leishmania (V) braziliensis.

0

5

10

15

20

25

30

800 1600 3200 6400 12800 25600 51200

Diluições do soro

nº d

e in

diví

duos

NegativoPositivo


Tabela 2. Tabela de contigência, mostrando a categorização dos indivíduos

estudados, aplicando-se a definição de caso de LTA.

IFI

+

-

TAD

+

49

8

-

1

42

TOTAL

50

50


5. DISCUSSÃO

O diagnóstico laboratorial da leishmaniose é tradicionalmente feito através

da identificação de amastigotas em amostras teciduais ou esfregaços, e cultura in

vitro de parasitos presentes em biópsias, associado ao teste cutâneo do tipo

hipersensibilidade retardada. A pesquisa direta do parasito, ou o seu isolamento

através de cultura não são testes muito sensíveis e o sucesso é variável (De

Bruijn et al., 1993).

A discordância dos resultados entre a doença e os diferentes métodos

sorológicos existentes, leva ao questionamento sobre a validade da sorologia

nos inquéritos epidemiológicos para LTA. Os resultados sorológicos só

permitem a análise com maior facilidade quando são utilizados no diagnóstico

diferencial juntamente com outros parâmetros ou no acompanhamento

terapêutico (Sanchez et al., 1992).

Para a análise técnica e estatística de um exame sorológico são empregados

como parâmetros fundamentais a sensibilidade e a especificidade apresentada


pelo referido teste. A especificidade do teste sorológico pode ser influenciada

por inúmeros fatores que levam a falsos resultados.

Indivíduos poliinfectados por parasitas intestinais apresentam um

somatório de anticorpos que cruzam com inúmeros antígenos-alvos dos testes

sorológicos.(Ferreira & Ávila, 2001). As reações sorológicas de

imunofluorescência indireta (IFI) e o teste imunoenzimático “enzyme linked

imunosorbent assay” (ELISA) são de utilidade no diagnóstico de forma clínica

de lesões extensas, múltiplas e nas lesões mucosas secundárias e primárias

(Mendonça et al., 1988). No entanto, apresentam reações cruzadas com

leishmaniose visceral e doença de Chagas (causadas por organismos próximos

filogeneticamente).

Quando promastigotas de Leishmania são utilizados como antígenos em

IFI, a reatividade cruzada entre espécies relacionadas (como Trypanosoma

cruzi) e não relacionadas (Mycobacterium tuberculosis) pode ser observada

(Carmago & Rebonato, 1966; Matossian, Kurban & Malwk, 1975; Anthony,

Christenson & Johnson, 1980).


No caso específico das leishmanioses, um fator que contribui para

dificuldade de implementação de testes mais eficazes é a grande diversidade de

agentes etiológicos e os casos clínicos associados.

Torna-se imperativo a necessidade de desenvolvimento e validação de

testes diagnósticos mais sensíveis e com maior acurácia (Rodrigues, 2000).

Dentro deste cenário o TAD com antígeno L.(V.) braziliensis revelou

98% sensibilidade e 84% de especificidade, tendo como referência um limiar

de reatividade de 1:1600. Esses resultados estão de acordo com outros obtidos

por Harith e col (1987), Garcez et al (1996), Bezerrra et al (1996), Nielsen

(1992) que utilizaram o TAD com a finalidades diagnósticas semelhantes.

O nível de especificidade obtido neste estudo sugere que o TAD pode ser

usado como diagnóstico para LTA, principalmente nas regiões onde se possa

excluir a leishmaniose visceral e a doença de Chagas.

Fica demonstrado também neste estudo que o TAD, por sua facilidade de

realização, bem como baixo custo, podetá ser usado no diagnóstico da

infecção por Leishmania.


6. CONCLUSÕES

O Teste de Aglutinação Direta (TAD) demonstrou um bom desempenho

no sorodiagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), comparável

àquele observado em IFI. A sua utilização em ampla escala para o diagnóstico

da doença é indicada, desde que monitorada por um laboratório de referência

que possa garantir a qualidade dos antígenos utilizados.

As observações realizadas neste estudo contribuíram para o entendimento

dos procedimentos da técnica e elucidaram aspectos, não descritos por outros

autores, relacionados às dificuldades inerentes à produção de antígenos.

Um dos pontos mais importantes abordados neste estudo refere-se à

utilização do TAD em casos de Leishmaniose Visceral e doença de Chagas

como diagnóstico diferencial, bem como para outras patologias de pele com

formas clínicas semelhantes a LTA.


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8. ANEXOS


8.1 Artigo enviado para publicação

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AVALIAÇÃO DO TESTE DE AGLUTINAÇÃO DIRETA (TAD) NO ... · RESUMO v ABSTRACT vii 1 ... 1.1 Histórico das Leishmanioses 1 1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana: etiologia, morfologia,