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ANA ELISA GONÇALVES
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIALZHEIMER DE
DÍMEROS DA TACRINA EM ANIMAIS COM
ALZHEIMER INDUZIDO POR PEPTÍDEO Aβ1-42
Itajaí (SC)
2017
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM FITOQUÍMICA E
ATIVIDADE BIOLÓGICA
ANA ELISA GONÇALVES
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIALZHEIMER DE
DÍMEROS DA TACRINA EM ANIMAIS COM
ALZHEIMER INDUZIDO POR PEPTÍDEO Aβ1-42
Dissertação submetida à Universidade do
Vale do Itajaí como parte dos requisitos
para a obtenção do grau de Mestre em
Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dra. Márcia Maria de
Souza
Itajaí (SC)
Março de 2017
FICHA CATALOGRÁFICA
G586a
Gonçalves, Ana Elisa, 1991-
Avaliação dos efeitos antialzheimer de dímeros da tacrina em animais
com Alzheimer induzido por peptídeo A β1-42 / Ana Elisa Gonçalves,
2015.
119f. ; il.; fig. ; tab.
Cópia de computador (Printout(s)).
Dissertação (Mestrado) Universidade do Vale do Itajaí, Mestrado em
Ciências Farmacêuticas.
“Orientadora : Prof ª . Dra. Márcia Maria de Souza”
Bibliografia : p. 99-117
1. Doenças de Alzheimer. 2. Peptídeos beta-Amiloides. 3.
Dímeros de Tacrina. I. Título.
CDU: 615
CDU: 612.78
Josete de Almeida Burg – CRB 14.ª 293
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à minha querida orientadora, Prof.ª Dr.ª
Márcia Maria de Souza por todas as oportunidades, pela confiança e
principalmente à nossa amizade ao longo destes oito anos. Muito obrigada
pelos ensinamentos, pelas aulas e pelo apoio;
À toda minha família, pelo carinho, compreensão, sacrifícios e
confiança depositados em mim, principalmente à minha mãe, Fátima Maria
Cardoso, por ser meu exemplo de honestidade, dedicação e fé, por toda
compreensão e dedicação. O orgulho que você sente por mim não é maior
que o orgulho que sinto em ser sua filha. Mais uma vez, obrigada!
À Prof.ª Dr.ª Luísa Mota da Silva pela colaboração e ajuda na realização
de alguns experimentos, que pretendo trabalhar em conjunto em novos
projetos;
Às minhas amigas e colegas do PPGCF, pela ajuda inestimável: Priscila
Zimath, Ana Paula Dalmagro, Luísa Bolda, Ana Paula Beber e Marina
Jagielski Goss. Assim como aos alunos de iniciação científica que me
ajudaram nos experimentos: Camila, Ana, Luana, Nilson, Rafael, Taina,
Thais e Sérgio;
Às técnicas dos laboratórios Samantha Santos e Viviane Steimbach por
toda ajuda;
Aos professores Dr. Sérgio Faloni de Andrade e Dr.ª Christiane Meyre
da Silva Bittencourt por comporem a banca de qualificação, pelas correções
e orientações para conclusão deste trabalho;
Aos secretários do PPGCF Juliano Santos (Mano) e Helenize Heyse,
sempre prestativos e dispostos quando precisei de ajuda nas questões
burocráticas, e a todos os professores e funcionários;
E à Capes pela bolsa de estudos concedida, primordial no
desenvolvimento deste trabalho.
“Cada pessoa deve trabalhar para o seu
aperfeiçoamento e, ao mesmo tempo, participar da
responsabilidade coletiva por toda a humanidade. ”
Maria Curie
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTIALZHEIMER DE
DÍMEROS DA TACRINA EM ANIMAIS COM
ALZHEIMER INDUZIDO POR PEPTÍDEO Aβ1-42
Ana Elisa Gonçalves
Março/2017
Orientadora: Márcia Maria de Souza, Doutora.
Área de concentração: Fitoquímica e Atividade Biológica
Número de páginas: 119
A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência no mundo. É uma
doença neurodegenerativa que causa prejuízo cognitivo progressivo. As lesões
características no cérebro de pacientes com DA são depósitos extracelulares de
peptídeo β-amiloide (placas neuríticas), bem como a presença de emaranhados
neurofibrilares. Os pacientes também apresentam neuroinflamação e alteração do
sistema oxidativo. Atualmente o tratamento disponível para DA consiste em
inibidores das enzimas colinesterásicas e um antagonista de receptores NMDA (N-
metil D-Aspartato). Esses medicamentos são paliativos e atuam apenas na melhora da
cognição dos pacientes, porém não ajudam a retardar a progressão da doença. O
objetivo deste trabalho foi investigar o efeito de novos dímeros da tacrina em
camundongos com DA induzida por peptídeo β-amiloide (Aβ1-42), em testes
comportamentais in vivo e análise do sistema oxidativo ex vivo, além de avaliar o
possível efeito hepatotóxico em animais tratados por 15 dias. Para avaliar o efeito do
tratamento sobre o sistema locomotor e exploratório nos animais, foi realizado o teste
do Campo Aberto, e diferentes tipos de memória dos animais foram analisadas através
dos testes de Reconhecimento de Objeto (RO), Esquiva Inibitória (EI) e Labirinto
Aquático de Morris (LAM). Em relação ao efeito dos tratamentos sobre o sistema
oxidativo e neuroinflamatório no córtex e hipocampo dos animais, foram
determinados os níveis de glutationa reduzida (GSH), a atividade da superóxido
dismutase (SOD) e da mieloperoxidase (MPO), além de níveis de hidroperóxidos
lipídicos (LOOH). O efeito do tratamento sobre sistema hepático foi analisado através
da dosagem das transaminases (AST e ALT) no soro dos animais e análises
histológicas do fígado, assim como foi avaliado o efeito dos dímeros sobre a atividade
citotóxica em células de hepatoma humano (HepG2). Todos os dímeros estudados
(DT1, DT2, DT3 e DT4), que são conhecidamente inibidores colinesterásicos,
apresentaram melhora do déficit cognitivo causado pelo peptídeo Aβ1-42 nos testes
RO, EI e LAM. O dímero DT4 apresentou diminuição da locomoção no teste do
Campo Aberto, assim como a própria tacrina. Quanto às análises do sistema oxidativo,
todos os dímeros apresentaram melhora nos níveis de GSH no hipocampo. A atividade
da SOD permaneceu diminuída com os tratamentos dos dímeros DT2, DT3 e DT4.
Todos os dímeros apresentaram diminuição da atividade da MPO. E apenas o dímero
DT4 foi capaz de reduzir dos níveis de LOOH. Em relação ao sistema hepático, os
dímeros DT1 e DT3 elevaram os níveis de AST assim como a tacrina, dados
confirmados com as análises histológicas do fígado dos animais. Os dímeros DT2 e
DT4 parecem ser os que apresentaram menor lesão hepática. Nenhum dímero
apresentou citotoxicidade em células HepG2. Os resultados sugerem que os dímeros
da tacrina estudados apresentara melhora da cognição dos animais com DA induzia
por Aβ1-42, além de ter efeitos adicionais de neuroproteção. Os resultados também
apontam para o dímero DT2 como um alvo farmacológico promissor para o
tratamento da DA.
Palavras-chave: Dímeros. Tacrina. β-amiloide. Doença de Alzheimer.
EVALUATION OF ANTIALZHEIMER EFFECTS OF
TACRINE DIMERS IN ANIMALS WITH PEPTIDE
Aβ142-INDUCED ALZHEIMER
Ana Elisa Gonçalves
March/2017
Advisor: Márcia Maria de Souza, Doutora.
Area of Concentration: Phytochemistry and Biological Activity
Number of pages: 119
Alzheimer's Disease (AD) is the leading cause of dementia in the world. It is a
neurodegenerative disease that causes progressive cognitive impairment. The typical
brain lesions in patients with AD are extracellular β-amyloid peptide deposits, as well
as the presence of neurofibrillary tangles. Patients also present neuroinflammation and
alterations of the oxidative system. Currently, the treatment available for AD includes
inhibitors of cholinesterase enzymes and an NMDA receptor antagonist (N-methyl D-
Aspartate). These drugs are palliative and only improve patients’ cognition, but they
do not help to reduce progression of the disease. The aim of this work is to investigate
the effect of new tacrine dimers on mice with amyloid peptide (Aβ1-42) induced DA,
using in vivo behavioral tests and ex vivo oxidative system analysis, and to evaluate
possible hepatotoxic effects in animals treated for 15 days. To evaluate the effect of
the treatment on the locomotor and exploratory system in animals, the Open Field test
was used, and different types of animal memory were analyzed through the Object
Recognition (OR), Inhibitory Avoidance (IA) and Morris Water Maze (MWM) tasks.
In relation to the effect of treatments on the oxidative and neuroinflammatory system
in the cortex and hippocampus of the animals, the levels of reduced glutathione
(GSH), superoxide dismutase (SOD) and myeloperoxidase (MPO) and the levels of
Lipid hydroperoxide (LOOH) were determined. The effect of treatment on the hepatic
system was analyzed by the measurement of transaminases (AST and ALT) in the
serum of the animals and histological analysis of the liver, as well as the effect of the
dimers on the cytotoxic activity in human hepatoma cells (HepG2). All dimers studied
(DT1, DT2, DT3 and DT4), which are known to be cholinesterase inhibitors, showed
improvement of the cognitive deficit caused by the Aβ1-42 peptide in the OR, IA and
MWM tasks. DT4 dimer showed decreased locomotion in the Open Field test, as did
tacrine itself. Regarding the oxidative system analyzes, all the dimers presented
improvement in the levels of GSH in the hippocampus. SOD activity remained
decreased with the DT2, DT3 and DT4 dimer treatments. All dimers showed a
decrease in MPO activity. Only the DT4 dimer was able to reduce the levels of LOOH.
In relation to the hepatic system, DT1 and DT3 dimers raised AST levels as well as
tacrine, data confirmed by histological analysis of the liver of the animals. DT2 and
DT4 dimers appear to be the ones with the lowest hepatic lesion. No dimer presented
cytotoxicity in HepG2 cells. The results suggest that the dimers studied show
improved cognition of animals with Aβ1-42 induced AD, as well as other additional
neuroprotection effects. The results also correspond to the DT2 dimer as a promising
pharmacological target for the treatment of DA.
Key words: Dimers, Tacrine, β-amyloid, Alzheimer's disease.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Comparação da atrofia cerebral na DA avançada com cérebro
normal ......................................................................................................... 27 Figura 2 – Processo proteolítico da PPA via não-amiloidogênica e via
amiloidogênica. ........................................................................................... 30 Figura 3 – Modelo esquemático do mecanismo de fibrilação Aβ. Setas pretas
representam cadeias β, conforme determinado por dados de estado sólido
RMN ........................................................................................................... 31 Figura 4 – Hiperfosforilação da proteína tau e sua agregação .................... 33 Figura 5 – Esquema da síntese da acetilcolina assistida pela colina
acetiltransferase ........................................................................................... 36 Figura 6 – Esquema da hidrólise de acetilcolina assistida por
acetilcolinesterase ....................................................................................... 36 Figura 7 – Síntese, armazenamento e liberação da ACh, e receptores que atua.
.................................................................................................................... 37 Figura 8 – Representação esquemática da distribuição do sistema colinérgico
no cérebro humano ...................................................................................... 38 Figura 9 – Esquema ilustrativo da peroxidação lipídica causada pelo peptídeo
Aβ42 ............................................................................................................. 42 Figura 10 – Fármacos inibidores da AChE: tacrina (1), rivastigmina (2),
galantamina (3), donezepil (4) e bloqueador de NMDA: memantina (5) .... 45 Figura 11 – Esquema da dimerização da tacrina, bis(7)-tacrina e os dímeros
em estudo (DT1, DT2, DT3 e DT4) ............................................................ 47 Figura 12 - Conformação de ligação do composto DT3 na fenda de TcAChE.
.................................................................................................................... 49 Figura 13 – Rota de síntese adotada para a obtenção dos dímeros de tacrina e
as diaminas utilizadas .................................................................................. 50 Figura 14 – Esquema representativo do uso de animais por dias ................ 53 Figura 15 – Esquema representativo do teste de Reconhecimento de Objetos
.................................................................................................................... 55 Figura 16 – Esquema representativo do teste da Esquiva Inibitória ............ 56 Figura 17 – Esquema do Labirinto Aquático de Morris .............................. 57 Figura 18 – Efeito dos tratamentos sobre a atividade locomotora e atividade
exploratória no Teste do Campo Aberto .................................................... 64 Figura 19 – Efeito dos tratamentos em animais submetidos ao teste de
Reconhecimento de Objetos ........................................................................ 65
Figura 20 – Efeito dos tratamentos sobre a memória aversiva de animais
submetidos ao Teste da Esquiva Inibitória. ................................................. 67 Figura 21 – Efeito dos tratamentos em animais submetidos ao Labirinto
Aquático de Morris durante as sessões de treino ......................................... 69 Figura 22 – Efeito dos tratamentos em animais submetidos ao Labirinto
Aquático de Morris durante as sessões de treino- Gráficos representativos de
cada dia de treino......................................................................................... 70 Figura 23 – Resultado do Probe trial em animais submetidos ao Labirinto
Aquático de Morris...................................................................................... 71 Figura 24 – Efeito dos tratamentos sobre parâmetros: distância percorrida (A)
e velocidade média (B) de animais submetidos ao LAM ............................ 72 Figura 25 – Efeito dos tratamentos sobre os níveis de GSH no córtex e
hipocampo dos animais ............................................................................... 75 Figura 26 – Efeito dos tratamentos sobre a atividade da SOD no córtex e no
hipocampo dos animais. .............................................................................. 76 Figura 27 – Efeito dos tratamentos sobre os níveis de LOOH no hipocampo
dos animais. ................................................................................................. 77 Figura 28 – Efeito dos tratamentos sobre os atividade da MPO no hipocampo
dos animais. ................................................................................................. 78 Figura 29 – Efeito dos compostos e da tacrina sobre os níveis das
transaminases AST e ALT em animais com tratamento subcrônico ........... 79 Figura 30 – Observações histopatológicas do fígado dos animas. .............. 80 Figura 31 – Viabilidade celular de células hepáticas da linhagem HepG2 .. 81
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT3 – receptor de serotonina
Acetil-CoA – Acetil-coenzima A
ACh - Acetilcolina
AChE - Acetilcolinesterase
AChEI – Inibidor da Acetilcolinesterase
AICD – domínio intracelular de PPA
ALT – Alanina aminotransferase
AMPA - receptor ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-5-isoxazolpropiónico
AMPc – Adenosina monofosfato cíclica
APOE – Apolipoproteína E
APOE4 – Apolipoproteína E4
AST – Aspartato transaminase
ATC – ácido tricloroacético
Aβ – Peptídeo β-amiloide
Aβ1-42 – Peptídeo β-amiloide isoforma 1-42
BACE1 – β-secretase
BCh – Butirilcolina
BChE – Butirilcolinesterase
BChEI – Inibidor da Butirilcolinesterase
CEUA – Comissão de ética no uso de animais
ChAT – Colina Acetiltransferase
CI50 – Concentração inibitória 50%
CN – Controle Negativo
CTFs – Fragmentos C-terminais
DA – Doença de Alzheimer
DMEM – Meio de Eagle Modificado por Dulbecco
DMSO – Dimetilsufóxido
DT – Dímeros da tacrina
DTNB - 5,5’-ditiobis 2-ácido nitrobenzoico
d.p. – Desvio padrão
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
EI – Esquiva inibitória
ENFs – Emaranhados Neurofibrilares
EROs – Espécies Reativas de Oxigênio
FDA – Food and Drug Administration
GABA – Ácido Gama-Aminobutírico
GPX – Glutationa Peroxidase
GR – Glutationa Redutase
GS – Glutamina Sintetase
GSH – Glutationa
GST – Glutationa-S-Tranferase
HE – Hematoxilina e eosina
HTAB - Hexadeciltrimetilamônio
HPA – Eixo Hipotalâmico-Pituitário-Adrenal
i.c.v. – Intra cérebro ventricular
iNOS – Óxido nítrico sintase induzível por citocina
i.p. – Intraperitoneal
IR – Índice De Reconhecimento
Ki – Constante inibitória
LAM – Labirinto Aquático de Morris
LOOH – Hidroperóxidos lipídicos
LTP – Long Term Potentiation (Potencialização a longo prazo)
mA – Miliamperes
mAChR – Receptores Muscarínicos
MDA – Malondialdeído
Met-35 – Metionina-35
MetS+ – Radical sulfidrila ligado a Met-25
MPO – Mieloperoxidase
MT – Microtúbulos
MTT – Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
nAChR – Receptores Nicotínicos
nbM – Núcleo basal de Meynert
NADPH – Fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina
NMDA – N-metil D-Aspartato
NO – Óxido Nítrico
NOS – Óxido Nítrico Sintase
OMS – Organização Mundial de Saúde
PBS – Tampão fosfato com salina
PHOX – NADPH oxidase
PNs – Placas neuríticas
PPA – Proteína precursora amiloide
PSEN1 – Presenilina-1
PSEN2 – Presenilina-2
REM – Rápido Movimento dos Olhos
RO – Reconhecimento de Objetos
s.c. – Subcutâneo
SCA – Sítio Catalítico Aniônico
SPA – Sítio Periférico Aniônico
SFB – Soro bovino fetal
SNC – Sistema Nervoso Central
SNP – Sistema Nervoso Periférico
SOD – Superóxido dismutase
t-BuOOH – Hidroperóxido de tert-butila
TCA – Teste Do Campo Aberto
TMB - Tetrametilbenzidina
TNF – Fator de necrose tumoral
v.o. – Via oral
VAChT – Transportador De Acetilcolina Vesicular
W – Watt
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 23 2 OBJETIVOS ........................................................................................... 25 2.1 Objetivo Geral ....................................................................................... 25 2.2 Objetivos Específicos ............................................................................ 25 3 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................. 27 3.1 Doença de Alzheimer: aspectos gerais .................................................. 27 3.2 Sintomas e fatores de risco da Doença de Alzheimer ........................... 28 3.3 Neuropatologia ...................................................................................... 28 3.3.1 Cascata amiloidal .............................................................................. 29 3.3.2 Hiperfosforilação da proteína Tau .................................................... 32 3.4 Neurotransmissão colinérgica ............................................................... 34 3.5 Neuroinflamação ................................................................................... 40 3.6 Estresse Oxidativo ................................................................................. 41 3.7 Tratamento da Doença de Alzheimer .................................................... 43 3.7.1 Híbridos da tacrina ............................................................................ 46 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................... 49 4.1 Dímeros da tacrina ................................................................................ 49 4.2 Animais ................................................................................................. 51 4.3 Grupos experimentais ........................................................................... 51 4.4 Indução do Alzheimer através da administração do peptídeo β-amiloide
(Aβ1-42) via i.c.v. ......................................................................................... 53 4.5 Avaliação comportamental dos animais ................................................ 54 4.5.1 Teste do Campo Aberto (TCA) ........................................................... 54 4.5.2 Teste do Reconhecimento de Objetos (RO) ........................................ 54 4.5.3 Teste da Esquiva Inibitória (EI) ......................................................... 55 4.5.4 Teste do Labirinto Aquático de Morris (LAM) .................................. 56 4.6 Preparação das amostras para avaliação do sistema antioxidante
cerebral ........................................................................................................ 58 4.6.1 Quantificação dos níveis de glutationa reduzida (GSH) .................... 58 4.6.2 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD) ............ 58 4.6.3 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) .......................... 59 4.6.4 Quantificação dos níveis de atividade da enzima mieloperoxidase
(MPO) ......................................................................................................... 59 4.6.5 Dosagem de proteína ......................................................................... 60
4.7 Preparação das amostras para avaliação do sistema hepático dos
animais ........................................................................................................ 60 4.8 Avaliação da viabilidade celular ........................................................... 60 4.9 Análise estatística .................................................................................. 61 5 RESULTADOS ....................................................................................... 63 5.1 Avaliação dos efeitos dos compostos em ensaios comportamentais in vivo
..................................................................................................................... 63 5.1.1 Avaliação da atividade locomotora no Teste do Campo Aberto ........ 63 5.1.2 Efeito dos tratamentos sobre a memória de reconhecimento através do
teste de Reconhecimento de Objeto. ............................................................ 65 5.1.3 Avaliação da memória aversiva dos animais no teste da Esquiva
Inibitória ..................................................................................................... 66 5.1.4 Avaliação da memória espacial dos animais através do teste Labirinto
Aquático de Morris...................................................................................... 67 5.2 Avaliação dos efeitos dos compostos nos modelos bioquímicos ex
vivo .............................................................................................................. 74 5.2.1 Determinação dos níveis de GSH ....................................................... 74 5.2.2 Atividade da superóxido dismutase (SOD) ......................................... 74 5.2.3 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) .......................... 76 5.2.4 Atividade da mieloperoxidase (MPO) ................................................ 77 5.3 Avaliação do efeito dos compostos sobre o sistema hepático dos animais
..................................................................................................................... 78 5.3.1 Quantificação das transaminases AST e ALT .................................... 78 5.3.2 Análise histopatológica ...................................................................... 79 5.4 Avaliação da viabilidade celular ........................................................... 81 6 DISCUSSÃO ........................................................................................... 83 7 CONCLUSÕES ...................................................................................... 97 REFERÊNCIAS ........................................................................................ 99 ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE
ANIMAIS – CEUA/UNIVALI ............................................................... 119
23
1 INTRODUÇÃO
A Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência no mundo,
sendo um dos grandes desafios em termos de saúde pública em indivíduos com
idade avançada no século 21. Em dezembro de 2013, o G8, grupo de países mais
desenvolvidos economicamente do mundo, estabeleceu que a demência passasse
a ser uma prioridade global, necessitando que a cura ou uma terapia satisfatória
estivesse disponível até 2025 (SCHELTENS et al., 2016).
Além da demência e dos déficits comportamentais e cognitivos, os
pacientes com DA apresentam sintomas neuropsiquiátricos como apatia,
depressão, agitação, agressão e psicoses conforme a patologia vai avançando
(MASTERS; MORRIS; ROE, 2015). Esses sintomas representam o aumento da
neurodegeneração no sistema nervoso central (SNC), o que piora o prognóstico,
acelera a progressão da doença, aumenta o uso de serviços de saúde, levando à
institucionalização dos pacientes cada vez mais cedo.
A DA é caracterizada pela combinação de dois achados neuropatológicos
anormais presentes no cérebro: as placas amiloides extracelulares, conhecidas
como placas neuríticas (PNs) e, os emaranhados neurofibrilares (ENFs)
intraneuronais formados pela proteína Tau hiperfosforilada. As placas amiloides
são formadas por peptídeos β-amiloides (Aβ) insolúveis, os quais são
fragmentos da proteína precursora amiloide (PPA) (BLOOM, 2014). Quando a
PPA é clivada pela enzima β-secretase em conjunto com a γ-secretase, libera
fragmentos de peptídeos contendo de 36 a 42 aminoácidos, sendo que a isoforma
contendo 42 aminoácidos (Aβ1-42) é a mais neurotóxica (MOHAMED;
SHAKERI; RAO, 2016).
Os neurônios colinérgicos são o principal sistema de neurotransmissores
envolvidos na DA. A disfunção do sistema colinérgico na DA ocorre em diversos
níveis incluindo a diminuição da atividade da colina acetiltransferase e a redução
da recaptação de colina, os quais culminam na diminuição da síntese da
acetilcolina (ACh) e, alteração dos níveis dos receptores colinérgicos. Estes
neurônios mantêm a atividade cortical, fluxo sanguíneo cerebral local, modulam
a cognição, aprendizado e memória relacionada a atividades. Além disso, o
sistema colinérgico está envolvido no desenvolvimento e/ou neurogênese do
córtex cerebral e na regulação do ciclo do sono (ANAND; GILL; MAHDI,
2014).
Poucos medicamentos estão disponíveis para o tratamento da DA, sendo
que os aprovados pela FDA (Food and Drug Administration) apenas atuam de
24
forma sintomática, não alterando o curso da doença (ANAND; GILL; MAHDI,
2014). Em vista da prevalência e o aumento esperado da incidência da DA, o
desenvolvimento de uma terapia efetiva torna-se importante por questão de saúde
pública.
O primeiro medicamento aprovado pela FDA para o tratamento da DA foi
a tacrina, um inibidor da enzima acetilcolinesterase (AChEI), porém, devido a
sua hepatotoxicidade, esse fármaco foi retirado do mercado farmacêutico
(GUZIOR et al., 2015). Para melhorar seu perfil farmacológico, diversas
estratégias de modificação molecular têm sido adotadas, como a hibridação da
molécula com diferentes ligantes (AQUINO et al., 2013). O desenvolvimento de
moléculas híbridas com capacidade de ligar-se à múltiplos alvos farmacológicos
são de grande interesse atualmente em várias patologias do SNC, sobretudo as
neurodegenerativas como a DA, podendo prevenir os sintomas e a progressão da
doença, ao contrário das terapias tradicionais baseadas somente na inibição
colinesterásica (MOHAMED; SHAKERI; RAO, 2016).
Desta forma nos propomos no presente estudo avaliar os efeitos
farmacológicos de quatro dímeros da tacrina em camundongos com DA induzida
pelo peptídeo Aβ1-42, focando os efeitos sobre o comportamento cognitivo dos
animais, o efeito sobre o sistema oxidativo cerebral e o sistema hepático dos
mesmos, bem como sobre a avaliação da atividade citotóxica in vitro.
25
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar o efeito nootrópico de dímeros da tacrina em camundongos com
DA induzida pelo peptídeo Aβ1-42, em modelos farmacológicos de memória.
2.2 Objetivos Específicos
Avaliar o efeito dos dímeros da tacrina sobre o sistema locomotor dos
animais com DA induzida no teste do Campo Aberto;
Avaliar o efeito dos dímeros da tacrina sobre a memória de
reconhecimento dos animais com DA induzida no teste de
Reconhecimento de Objetos;
Avaliar o efeito dos dímeros da tacrina sobre a memória aversiva dos
animais com DA induzida no teste da Esquiva Inibitória;
Avaliar o efeito dos dímeros da tacrina sobre a memória espacial dos
animais com DA induzida no teste do Labirinto Aquático de Morris;
Comparar os efeitos nootrópicos dos compostos com a tacrina;
Avaliar o efeito dos dímeros da tacrina sobre o sistema de oxidação
cerebral e neuroinflamação dos animais com DA induzida;
Avaliar os efeitos hepáticos dos tratamentos nos animais;
Avaliar a citotoxidade in vitro dos dímeros da tacrina em cultura celular
HepG2.
26
27
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Doença de Alzheimer: aspectos gerais
A DA é uma desordem neurodegenerativa progressiva relacionada à idade,
e é atualmente considerada a forma mais comum de demência em pessoas mais
jovens, geralmente diagnosticados antes dos 65 anos (AMOAH et al., 2015).
Cérebros humanos afetados pela DA apresentam uma perda neuronal bem
difundida e uma grosseira atrofia do córtex e hipocampo (Figura 1). A formação
de emaranhados neurofibrilares e deposição de placas amiloides são
correlacionadas com o declínio cognitivo observado na DA (POOLER; NOBLE;
HANGER, 2014).
Figura 1 – Comparação da atrofia cerebral na DA avançada com cérebro normal
Fonte: http://www.brightstarcare.com/chattanooga/files/2013/11/alzheimers-scan.jpg
É estimado que 40 milhões de pessoas, a maioria acima de 60 anos, tenha
demência no mundo, e esses dados tendem a duplicar a cada 20 anos. A
prevalência de demência antes dos 50 anos é menos de 1 a cada 4000 pessoas,
com aproximadamente 30% dos casos ligados à DA (SCHELTENS et al., 2016).
Estudos de perspectiva epidemiológica preconizam que o nível de incidência de
DA aumenta com a idade, com uma estimativa de 0,08% por ano com idade entre
60-65 anos, e uma incidência de 6,48% em pessoas com mais de 85 anos
(VINTERS, 2014).
Mais de 95% dos casos de DA são aleatórios, sem causa definida. No
entanto, análises de casos raros de DA de origem genética encontraram quatro
genes que codificam a apolipoproteína E (APOE), proteína precursora Aβ (PPA),
28
presenilina-1 e 2 (PSEN1, PESEN2) como responsáveis pelos casos genéticos
(KOSENKO et al., 2014).
3.2 Sintomas e fatores de risco da Doença de Alzheimer
A DA é caracterizada por prejuízo cognitivo progressivo e sintomas
comportamentais e psicológicos de demência. Além da apatia e depressão
observados frequentemente em cerca de 90% dos pacientes com demência média
a moderada, outros sintomas como agitação, agressão, irritabilidade, delírios,
comportamento motor aberrante e psicoses são extremamente desconfortáveis
para pacientes e cuidadores (MASTERS; MORRIS; ROE, 2015). Também tem
sido observado nos últimos anos, anomalias quanto a sensibilidade dolorosa dos
pacientes (STUBBS et al., 2016). Quando tais sintomas ocorrem cedo durante a
evolução da doença, sua frequência e intensidade podem contribuir com a
diminuição da qualidade de vida do paciente bem como, levar ao aumento das
dificuldades no cuidado diário do mesmo (MASTERS; MORRIS; ROE, 2015;
ROUCH et al., 2014).
A doença se desenvolve por longos períodos antes do aparecimento dos
sintomas clínicos, o que levanta a questão sobre os fatores de riscos ao longo da
vida que comprometem o desenvolvimento de alterações patológicas, em vez de
uma relação causal (SCHELTENS et al., 2016). O maior fator de risco é a idade
avançada, assim como outros fatores relacionados ao estilo de vida, histórico
familiar positivo, trauma craniano, gênero feminino, depressão prévia, diabetes
Mellitus, hiperlipidemia e fatores vasculares (ANAND; GILL; MAHDI, 2014,
SCHELTENS et al., 2016).
Enquanto os sintomas clínicos são definidos pelo déficit cognitivo, as
causas que levam ao declínio de memória são fortemente vinculadas a depósito
de agregados de proteínas malformadas necessárias ao processo bioquímico da
mesma (MOHAMED; SHAKERI; RAO, 2016).
3.3 Neuropatologia
Os principais fatores patológicos da DA são o acúmulo de placas amiloides,
ou PNs, contendo depósitos extracelulares de peptídeo Aβ, bem como a presença
de ENFs, os quais são resultantes da proteína Tau hiperfosforilada (AMOAH et
al., 2015).
29
A agregação de oligômeros, fibrilas, e placas β-amiloide é o centro da
patogênese molecular da DA e, atualmente, tem sido o principal foco de
desenvolvimento de novos medicamentos para a doença (BLENNOW et al.,
2015).
3.3.1 Cascata amiloidal
As lesões características no cérebro de pacientes com DA reforçam a
hipótese de que PNs e ENFs desempenham o papel chave no processo da doença.
Além disso, a hipótese predominante que tem guiado a pesquisa científica é a
chamada “hipótese da cascata amiloidal”, primeiramente cunhada por Hardy e
Higgins no início dos anos 90. A hipótese postula que a agregação anormal de
peptídeo β-amiloide (Aβ) no cérebro inicia uma cascata de eventos que resultam
nas mudanças patológicas, na neurodegeneração e no declínio cognitivo (NHAN;
CHIANG; KOO, 2015).
Para compreender a cascata amiloidal e sua ligação com a DA, é preciso
examinar a função da PPA. É uma glicoproteína transmembrana altamente
conservada, expressa nos tecidos neuronais em volta da sinapse. Sua função é
crucial para plasticidade neuronal e formação sináptica (MOHAMED;
SHAKERI; RAO, 2016). Estudos com diferentes modelos de organismos
demonstraram que a PPA regula vários aspectos da neogênese, refletindo na sua
expressão numa fase muito precoce do desenvolvimento do cérebro, até o
estabelecimento de uma sinapse funcional (NICOLAS; HASSAN, 2014).
O peptídeo Aβ é produzido pela quebra sequencial da PPA por três enzimas,
α, β e γ-secretases (BLENNOW et al., 2015). Nos caminhos metabólicos da PPA,
há duas vias chamadas de via não-amiloidogênica e via amiloidogênica (Figura
2). Primeiramente a PPA é clivada pela α-secretase ou β-secretase (BACE1)
liberando derivados PPA extracelulares solúveis (sPPAα e sPPAβ,
respectivamente) e deixando um fragmento ligado à membrada α ou β C-terminal
(CTFs). Os fragmentos α-CTFs e β-CTFs são clivados pela γ-secretase. Na via
amiloidogênica, há liberação de peptídeo Aβ no meio extracelular, e um
fragmento citoplasmático conhecido como domínio intracelular de PPA (AICD)
(HAN et al., 2011, NICOLAS; HASSAN, 2014, MOHAMED; SHAKERI; RAO,
2016).
30
Figura 2 – Processo proteolítico da PPA via não-amiloidogênica e via amiloidogênica.
Fonte: Steele, J. W.; Gandy, S., 2011
Diferenças no tamanho de aminoácidos na parte C-terminal confere
diferentes propriedades bioquímicas do peptídeo resultante. A isoforma mais
longa com 42 aminoácidos (Aβ1-42) é predisposta à agregação e formação de
fibrilas, constituindo um estímulo inicial para deposição e acúmulo de Aβ
formando PNs tóxicas. Além disto, oligômeros solúveis de Aβ1-42 têm
demonstrado efeitos neuronais negativos na fisiologia e função sináptica.
Enquanto isoformas menores de Aβ são menos propensas à agregação e menos
tóxicas (SCANNEVIN et al., 2016).
Ao contrário do peptídeo Aβ, sPPAα promove a sobrevivência da célula,
crescimento de axônio e sinaptogênese. Quando injetado sPPAα nos ventrículos
cerebrais de camundongos, há uma melhora na habilidade cognitiva e redução
nos níveis de danos neuronais causados por trauma craniano. Além disso, AICD
apresenta efeito neuroprotetor, melhorando a memória de animais transgênicos
(HAN et al., 2011).
Achados em cérebros de pacientes com DA revelaram que as PNs não
precedem necessariamente o aparecimento de declínios cognitivos. Em
contraste, depósitos amiloides têm sido observados em pessoas com cognição
sPPAα sPPAβ
31
normal. Essas observações indicam que a formação de PNs podem não ser
totalmente correlacionadas sempre com a DA (FAUCHER et al., 2016). Tem
sido sugerido que espécies oligoméricas solúveis de Aβ, também conhecidas
como protofibrilas (Figura 3), podem ser mais neurotóxicas e responsáveis pelas
disfunções sinápticas do que as próprias PNs, levando às consequências da
fisiopatologia da DA (WANG et al., 2016).
O peptídeo Aβ solúvel altera composição, morfologia e densidade da
espinha dendrítica, que são saliências morfologicamente plásticas, importantes
para o armazenamento de informações sinápticas e de memória (LACOR et al.,
2007). O peptídeo exerce efeito inibitório em receptores excitatórios, incluindo
o receptor ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-5-isoxazolpropiónico (AMPA), e o
N-metil-D-aspartato (NMDA) e, em receptores nicotínicos, comprometendo a
potencialização a longo prazo (LTP ou Long Term Potentiation, em inglês) a
qual é considerada como modelo biológico de memória (LACOR et al., 2007,
REID; EVANS, 2013, WANG et al., 2016).
O peptídeo Aβ também está associado à inflamação e ativação de astrócitos
e micróglias, que topograficamente encontram-se em volta das PNs. Essas
células fazem parte do tecido nervoso com funções biológicas bem definidas e
são ativadas em processos neurodegenerativos. A formação de células gliais em
volta dos depósitos de Aβ podem proteger o tecido cerebral da toxicidade. Porém,
astrócitos e micróglias secretam citocinas e produzem neurotoxinas que podem
induzir a neurodegeneração. O mecanismo pelo qual as protofibrilas Aβ1-42
induzem neurotoxicidade ainda é obscuro. Grandes quantidades de protofibrilas
Aβ1-42 ficam armazenadas nos astrócitos por um longo período, ao invés de serem
degradadas. Esse acúmulo intracelular causa defeitos endossomais/lisossomais
severos que provavelmente reduzem a capacidade de degradação dos astrócitos
mais adiante (SÖLLVANDER et al., 2016).
Figura 3 – Modelo esquemático do mecanismo de fibrilação Aβ. Setas pretas representam
cadeias β, conforme determinado por dados de estado sólido RMN
Fonte: http://www.uni-leipzig.de/~biophys/cms/index.php?id=233
32
Os astrócitos são altamente responsáveis por manter a homeostase do
cérebro, e o seu mau comportamento pode afetar nos processos de suporte
metabólico neuronal, modificação dos sinais sinápticos, reciclagem de
neurotransmissores, regulação da corrente sanguínea e função de barreira
hematoencefálica (SÖLLVANDER et al., 2016).
O acúmulo de Aβ1-42 na DA é devido ao desequilíbrio entre a sua produção
e sua remoção. A hipótese é de que a agregação de Aβ, como as protofibrilas,
dificultem a degradação pelos astrócitos, mais que a forma monomérica da
proteína. A maioria dos pacientes com DA esporádica não apresentam aumento
de produção de Aβ, o que sugere que a causa principal da formação da doença
pode ser a sua insuficiente degradação lisossomal. Além disso, sabe-se que
pacientes com desordens lisossomais geralmente desenvolvem doenças
neurodegenerativas, como DA e Doença de Parkinson (SÖLLVANDER et al,
2016).
Também é reportado na literatura que a DA também pode ocorrer devido
a mutações genéticas. Em um pequeno subconjunto de casos de DA familiar,
mutações têm sido identificadas em genes que codificam a PPA, PSEN1 ou
PSEN2. Em DA esporádica, polimorfismos do alelo E4 da APOE (APOE4) e
outros genes têm sido associados com o aumento de risco de desenvolver a
doença (ITTNER; GÖTZ, 2011).
A hipótese amiloide da DA sugere que o acúmulo de placas Aβ leva à
agregação de Tau hiperfosforilada a ENFs. A distribuição de ENFs no neocórtex
foi mostrada nos primeiros estágios iniciais da doença, principalmente nos lobos
temporais, parietais e frontais de pacientes acometidos. Ambos ENFs e PNs estão
associadas com degeneração neural (principalmente de células piramidais
hipocampais) (REID; EVANS, 2013).
3.3.2 Hiperfosforilação da proteína Tau
Mudanças morfológicas nos dendritos podem levar a hiperfosforilação da
Tau e eventual formação de ENFs (Figura 4), o que propõe um link entre a causa
desses dois tipos de distúrbios na patologia. A hipótese causal é suportada por
evidências de que a proteína Aβ solúvel pode induzir toxicidade na Tau e morte
celular em camundongos tipo-selvagem. Perdas sinápticas pode ser outra
consequência importante de PNs e ENFs (REID; EVANS, 2013).
Imaginava-se que a Tau era uma proteína associada à microtúbulos (MTs),
com função de ligar e estabilizar os MTs de maneira dependente de fosforilação.
33
Mudanças na fosforilação da Tau são conhecidas por induzir perda na função
fisiológica da mesma. Na verdade, há evidências que sugerem papéis adicionais
para a Tau além da estabilização dos MTs, incluindo função de regulação
sináptica e sinais neuronais (POOLER; NOBLE; HANGER, 2014).
A Tau contem três domínios maiores: um domínio amino-terminal, um
domínio carboxi-terminal de ligação de MTs repetidos e uma pequena sequência
caudal. No cérebro humano, existem seis isoformas de Tau. A Tau é
predominantemente encontrada nos axônios, e é também encontrada nos
dendritos, com níveis bem menores. Como reportado anteriormente, a melhor
função estabelecida para a Tau é a estabilização dos MTs e a regulação do
transporte axonal (ITTNER; GÖTZ, 2011).
Figura 4 – Hiperfosforilação da proteína tau e sua agregação
Fonte: Götz; Ittner, 2008
A Tau tem sido reconhecida por enriquecer os axônios, onde liga e
estabiliza os MTs de maneira dependente de fosforilação. Mais recentemente, a
Tau foi encontrada em compartimentos subcelulares adicionais, incluindo a
sinapse, onde pode influenciar diretamente a comunicação neuronal
(KUZNETSOV; KUZNETSOV, 2015). Também tem sido identificada no
complexo de Golgi, retículo endoplasmático rugoso, e na membrana plasmática
(BALOYANNIS, 2014). Juntos, esses estudos sugerem que a Tau pode participar
de um importante papel na distribuição sináptica que pode mudar durante a
doença. Mesmo havendo a hipótese de a Tau induzir toxidade na fisiopatologia
34
da DA, sua presença na sinapse de cérebros saudáveis sugere um papel de
regulação na função sináptica normal (POOLER; NOBLE; HANGER, 2014).
Formas patogênicas da Tau podem se acumular seletivamente em espinhas
dendríticas, onde a mesma pode ter uma influência neurotóxica. Tem havido um
aumento substancial de evidências indicando que a Tau é essencial para a
neurotoxicidade induzida pela Aβ, tanto in vitro quanto in vivo (POOLER;
NOBLE; HANGER, 2014).
A distribuição celular da Tau é regulada pelo desenvolvimento. Em
neurônios jovens, ela se distribui uniformemente no corpo celular e nas neurites.
Mais tarde, quando axônios emergem e os neurônios são polarizados, a Tau
torna-se mais densa nos axônios, com menor predomínio nos dendritos e no
núcleo. A falta de densidade da Tau em dendritos representa um dos primeiros
sinais de neurodegeneração na DA. Uma distribuição diferencial da Tau em
diferentes compartimentos celulares indica que a proteína tem diferentes funções
em diferentes meios (WANG; MANDELKOW, 2016).
3.4 Neurotransmissão colinérgica
O sistema colinérgico está associado ao aprendizado e memória. Estudos
demonstram que a ACh endógena é importante no processo de aquisição,
codificação, consolidação, reconsolidação, extinção e recuperação da memória
(FERREIRA-VIEIRA et al., 2016). O papel da ACh está relacionado com
aprendizado e memória justamente por regular a neurotransmissão
glutamatérgica (RADCLIFFE; DANI, 1998). Não só no processo de cognição, a
interação colinérgica e glutamatérgica está envolvida, o sistema também parece
ter importância nos processos de neuroproteção (O'NEILL et al., 2002,
FERREIRA-VIEIRA et al., 2016). A perda da memória é o sintoma mais
clássico da DA e os medicamentos anti-DA tem seu mecanismo
farmacodinâmico relacionado ao sistema colinérgico, desta forma tem sido
sugerido a hipótese colinérgica para a DA.
A hipótese colinérgica para DA foi formada devido a achados científicos
mostrando perda severa (cerca de 80%) de neurônios colinérgicos no núcleo
basal de Meynert (nbM), uma das principais fontes de inervação colinérgica para
o córtex cerebral (WHITEHOUSE et al., 1982), bem como uma redução na
atividade da Colina acetiltransferase (ChAT) e Acetilcolinesterase (AChE) no
cérebro de pacientes com DA (BARTUS et al., 1982).
35
A ACh participa de diversas funções no organismo. A sua liberação no
cérebro pode ser regulada pelo estresse que após a estimulação do eixo HPA
(hipotálamo-hipófise-adrenal), há ativação de receptores nicotínicos (nAChR)
(NEWMAN et al., 2001). Outra função importante do sistema colinérgico é a
regulação do ciclo do sono REM (período do sono caracterizado por movimento
rápido dos olhos). A entrada colinérgica nos locais de geração de sono REM
serve como reforço na transição do sono não-REM para o sono REM, tornando-
a mais rápida e com menos probabilidade de falha, porém, não é o principal
sistema envolvido (GRACE; HORNER, 2015). Também é evidenciado o
envolvimento da ACh na neurogênese adulta, onde neurônios colinérgicos
projetam-se do prosencéfalo para o córtex cerebral durante o período de
desenvolvimento cerebral e posterior a ele. O sistema colinérgico também atua
regulando a neurogênese hipocampal em adultos, promovendo positivamente a
proliferação, diferenciação, integração e potencializa a sobrevivência de
neurônios recém-nascidos (BRUEL-JUNGERMAN; LUCASSEN; FRANCIS,
2011).
Os principais componentes do sistema colinérgico são: (I) o
neurotransmissor acetilcolina (ACh); (II) acetilcolinesterase (AChE), enzima
que degrada a ACh; (III) colina acetiltransferase (ChAT), enzima que sintetiza
ACh; e (IV) receptores de ACh, especificamente os receptores nicotínicos
(nAChR) e muscarínicos (mAChR) (PAUL et al., 2015).
A síntese da ACh acontece no citoplasma de neurônios colinérgicos. A
enzima ChAT sintetiza ACh a partir de colina e acetil-coenzima A (acetil-CoA)
(Figura 5). Acetil-CoA é gerada pela mitocôndria e a maioria da colina vem da
dieta, já que os neurônios têm capacidade limitada de produzir a própria colina
(PIETROCOLA et al., 2015; SZUTOWICZ et al., 2013). É considerado que a
ChAT está presente em duas formas: solúvel (80-90% da atividade enzimática)
e ligada à membra de forma não-iônica (10-20%) (ODA, 1999). Sua atividade é
regulada pela despolarização neuronal, influxo de Ca2+ e fosforilação por uma
variedade de proteínas quinases (SCHMIDT; RYLETT, 1993).
36
Figura 5 – Esquema da síntese da acetilcolina assistida pela colina acetiltransferase
A ACh é transportada para as vesículas sinápticas pelo transportador de
acetilcolina vesicular (VAChT), que está localizado na membrana da vesícula
(WHITTAKER, 1982). Quando os neurônios colinérgicos são despolarizados,
ACh é exocitada das vesículas e liberadas na fenda sináptica, onde pode ativar
receptores muscarínicos e nicotínicos. A ACh presente na fenda sináptica é
rapidamente hidrolisada pela enzima acetilcolinesterase (AChE), liberando
colina e acetato (Figuras 6 e 7) (WILSON; BERGMANN; NACHMANSOHN,
1950). Neurônios colinérgicos secretam AChE na fenda sináptica, onde a enzima
é normalmente associada com a membrana plasmática (PODLESKI;
CHANGEUX, 1967). A colina que é liberada da hidrólise da ACh na fenda
sináptica é recapturada pelo neurônio colinérgico pré-sináptico por um sistema
de transporte ativo (SCHUBERTH; SUNDWALL; SÖRBO, 1967).
Figura 6 – Esquema da hidrólise de acetilcolina assistida por acetilcolinesterase
37
Figura 7 – Síntese, armazenamento e liberação da ACh, e receptores que atua.
Fonte:http://pharmacology-notes-free.blogspot.com.br/2012/03/acetylcholine.html
Como já reportado, a ACh é um neurotransmissor usado por todos os
neurônios colinérgicos, os quais tem um importante papel no SNC e SNP
(FERREIRA-VIEIRA et al., 2016). No SNC, os neurônios colinérgicos são
amplamente distribuídos, e quase todas as regiões do encefalo são inervadas
evoluindo para uma rede complexa com três componentes principais: (I) a partir
de núcleos de saliências do prosencéfalo basal; estas incluem o núcleo medial do
septo, o nbM, o núcleo vertical da faixa diagonal e o membro horizontal do
núcleo da faixa diagonal, que inervam o hipocampo, a maioria das regiões
corticais e alguns núcleos subcorticais, (II) projeções do pedunculopontino-
lateral dorsal tegumental do tronco cerebral para o tálamo, mesencéfalo e outras
regiões do tronco cerebral e (III) interneurônios no corpo estriado (mais
abundante) e o núcleo acumbens (Figura 8) (SCARR et al., 2013).
38
Figura 8 – Representação esquemática da distribuição do sistema colinérgico no cérebro
humano
Fonte: Hopper et al., 2016
A ACh modula funções do SNC pela ativação de receptores, promovendo
tanto a estimulação quanto a inibição, dependendo do tipo de receptor e
localização neuronal. Os receptores nicotínicos (nAChRs) são canais iônicos
expressos no SNC que respondem a neurotransmissores endógenos como ACh,
e nicotina, uma das drogas de abuso mais difundida. A ativação desses receptores
excita células mediando uma transmissão sináptica rápida em neurônios
autônimos gangliônicos e em algumas áreas cerebrais, principalmente em sítios
pré-sinápticos e pré-terminais onde eles regulam a liberação de
neurotransmissores excitatórios e inibitórios (FASOLI; GOTTI, 2015).
Receptores nicotínicos são proteínas transmembrana pentaméricas que
pertencem a superfamília de canais iônicos “cys-loop” juntamente com
receptores ionotrópicos GABAA, GABAC, glicina e 5-HT3. São compostos de
uma variedade de subunidades α e β, que determinam as propriedades
farmacológicas e cinéticas. As cinco subunidades que compõem o receptor estão
39
em volta de um poro hidrofílico central que medeia o fluxo de K+, Na+ e Ca++.
No SNC, há oito subunidades α (α2-7, α9, α10) e três subunidades β (β2-β4) que
formam diferentes combinações gerando uma variedade de subtipos de
receptores nAChR com propriedades eletrofisiológicas distintas no cérebro
(LOMBARDO; MASKOS, 2015).
Receptores muscarínicos são receptores ligados à proteína G que são
capazes de modular diversos canais iônicos (DOROFEEVA et al., 2009;
NAVARRO-POLANCO et al., 2011). Foram identificadas cinco isoformas de
receptores muscarínicos até o momento (M1-5) (BONNER et al., 1987; KUBO
et al., 1986). M1, M3 e M5 são ligados à proteína Gαq, enquanto M2 e M4 são
ligados à Gαi. A ativação de Gαq ativa a fosfolipase C e forma fosfato de inositol
e outros segundos mensageiros, que podem promover o fechamento de canais de
K+, o que facilita a excitabilidade celular (HAMMER et al., 1980). Já a ativação
da Gαi leva à inibição da adenilato ciclase e redução dos níveis de adenosina
monofosfato cíclica (AMPc), promovendo a inibição dos canais de Ca2+
voltagem dependentes e, então, diminuindo a excitabilidade celular (EGAN;
NORTH, 1986).
Em termos de localização sináptica, os receptores M1 e M3 estão
localizados principalmente em neurônios pós-sinápticos (LEVEY et al., 1991),
enquanto os receptores M2 e M4 estão geralmente localizados em neurônios pré-
sinápticos, atuando como auto receptores, regulando negativamente a liberação
de ACh (DOUGLAS; BAGHDOYAN; LYDIC, 2001).
Quanto às enzimas responsáveis pela degradação da ACh, além da AChE,
muitos organismos também possuem a butirilcolinesterase (BChE), conhecida
como, pseucolinesterase ou colinesterase plasmática (JOHNSON; MORRE,
2012), enzima relacionada à AChE servindo como uma co-reguladora na
neurotransmissão colinérgica hidrolisando a ACh (ANAND; SINGH, 2013). A
BChE é farmacologicamente diferente da AChE pela sua reação com substratos
e inibidores, e cineticamente por apresentar mais ativação do que inibição de
substratos. Há uma relação muito próxima entre as duas enzimas, onde parecem
funcionar como parceiras, complementando uma a outra em diferentes maneiras
(JOHNSON; MORRE, 2012).
AChE e BChE assemelham-se em mais de 50%, mas as suas funções e
localização no corpo são bem diferentes. AChE e BChE tem habilidades
diferentes em metabolizar substratos. Comparando com a BChE, AChE não é
capaz de hidrolisar ésteres de alto peso molecular, porém a AChE tem mais
afinidade pela acetilcolina e a BChE pela butirilcolina (BCh). Essa diferença na
40
afinidade por substratos é provavelmente devida as mudanças na disposição do
sítio de ligação aromática (POHANKA, 2011). AChE possui um sítio de ligação
aniônico periférico mais desenvolvido e o sítio de ligação aromático é mais
estreito que a BChE. Compostos aromáticos têm maior afinidade para AChE que
para BChE. Alguns inibidores aromáticos de AChE não inibem a BChE, por
exemplo, aflatoxinas (POHANKA, 2014).
AChE é encontrada em vários tipos de tecidos condutores: nervos e
músculos, tecidos centrais e periféricos, fibras motoras e sensoriais, e fibras
colinérgicas e não-colinérgicas. Porém, sua atividade é maior em neurônios
motores que sensoriais. AChE também é encontrada na membrana de hemácias
(ČOLOVIĆ et al., 2013). Tem sido mostrado na literatura, que os níveis de
BChE excedem os de AChE em todos os tecidos, exceto no músculo e cérebro.
No cérebro humano, BChE é expressa em altas concentrações nas células gliais,
principalmente astrócitos, enquanto a AChE é predominante em neurônios.
Mesmo assim, BChE também é encontrada em alguns neurônios presentes na
amígdala, tálamo e hipocampo (JOHNSON; MORRE, 2012). Apesar da
atividade da BChE ser abundante, sua função fisiológica ainda não está
completamente elucidada. Indivíduos com deficiência de BChE são geralmente
saudáveis e não manifestam sinais de doenças (MANOHARAN et al., 2007).
3.5 Neuroinflamação
A neuroinflamação é um processo importante envolvido na patogênese de
muitas doenças neurodegenerativas. Marcadores inflamatórios no plasma, no
líquido cefalorraquidiano e nos tecidos cerebrais post-mortem têm se tornados
características distintivas para DA e Doença de Parkinson junto com outros
marcadores. Isso tem levado a hipótese de que a inflamação no SNC é um fator
importante na contribuição da neurodegeneração, principalmente na DA.
O fator de necrose tumoral (TNF-α) é o mediador inflamatório mais
estudado, o qual encontra-se aumentado em pacientes e/ou modelos animais de
neurodegeneração humana. No encéfalo, o TNF-α é primeiramente sintetizado e
liberado pelas células gliais as quais podem ser ativadas por trauma, infecção
ou, na presença de agregados endógenos anormais, como o Aβ e os corpúsculos
de Lewy (TWEEDIE et al., 2012, ARDESTANI et al., 2017).
A micróglia é uma célula do tecido nervoso com função de fagócito
residente do SNC, é constantemente usada em processos altamente móveis para
proteger as regiões cerebrais afetadas por presença de patógenos e restos
41
celulares, e simultaneamente, fornece fatores que ajudam a manutenção do
tecido. Ao mesmo tempo, a micróglia é importante para a manutenção e
plasticidade de circuitos neuronais, contribuindo para a proteção e remodelação
das sinapses. Uma vez ativada por processos patológicos, como morte neuronal
ou agregados proteicos, a micróglia desloca-se para o sítio da injúria e migra
para a lesão, onde inicia uma resposta imune inata. Na DA, a micróglia é capaz
de ligar-se a oligômeros β-amiloides e fibrilas via receptores de superfície,
começando a produzir citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas. O processo
também envolve a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) que, em
excesso, levam a desregulação da reposta imune, contribuindo para a
neurodegeneração (HENEKA et al., 2015, MINTER; TAYLOR; CRACK,
2016).
Em adição, a ativação direta das citocinas, astrócitos e micróglia estimulam
a síntese de óxido nítrico (NO), que em altas concentrações pode ser tóxico aos
neurônios. Estudos têm demonstrado que a óxido nítrico sintase induzível por
citocinas (iNOS) está aumentada no cérebro de pacientes com DA (BEHAIRI et
al., 2015). Da mesma forma, NADPH oxidase (PHOX) é altamente expressa pela
micróglia na DA, e rapidamente ativada pela inflamação iniciada pelo Aβ,
resultando na produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), que também promove
a ativação de micróglia. Evidências sugerem que o estresse oxidativo ajuda na
formação de espécies Aβ pela nitração do peptídeo Aβ em tirosina 10 levando a
um aumento na propensão da agregação (HENEKA et al., 2015).
3.6 Estresse Oxidativo
Há muito tempo tem sido estabelecido que o estresse oxidativo na DA é um
dos pontos mais críticos na patogênese da doença o qual danifica componentes
da vitalidade da célula, como as proteínas, lipídios e ácidos nucleicos. Estes
danos se não forem controlados, podem ser a principal razão para a eventual
degeneração dos neurônios, possivelmente por meios apoptóticos (SWOMLEY
et al., 2014).
A hipótese de que Aβ induz estresse oxidativos em níveis intracelulares,
especificamente a forma Aβ1-42, é baseada na observação da geração de EROs
pelo peptídeo, quando o mesmo entra em contato com a bicamada lipídica,
iniciando a peroxidação lipídica (Figura 9) (SWOMLEY; BUTTERFIELD,
2015).
42
O peptídeo Aβ1-42 contém um resíduo de metionina-35 (Met-35) que parece
estar associado à toxicidade e ao estresse oxidativo desencadeado
(BUTTERFIELD; SWOMLEY; SULTANA, 2013). Quando o peptídeo Aβ
oligomérico entra em contato com a bicamada lipídica, o meio hidrofóbico leva
à estabilização da oxidação de um elétron do Met-35, já ligado aos radicais livres
sulfidrila (MetS+). A hipótese postulada é a de que este radical livre inicia uma
série de reações em cadeia de radicais livres que tomam lugar da bicamada
lipídica gerando produtos de peroxidação lipídica modificando a funcionalidade
e as características da membrana proteica (SWOMLEY et al., 2014).
Figura 9 – Esquema ilustrativo da peroxidação lipídica causada pelo peptídeo Aβ42
Fonte: adaptado de Swomley e Butterfield, 2015
Muitas doenças como a DA têm em comum a desregulação de níveis
oxidantes que implicam na sua patogênese. As moléculas oxidantes conhecidas
por participar de estados redox são moléculas como H2O2, superóxido (O2-), o
ânion hidroxila (OH-), o radical hidroxila (OH), óxido nítrico (NO), e
peroxinitrito (ONOO-). A perda da homeostase no controle das reações redox,
43
pode ser atribuída a uma alta produção de oxidantes, assim como uma diminuição
dos antioxidantes ou do sistema de defesa. No cérebro, o principal meio de lidar
com o excesso de oxidantes é a glutationa (GSH) e sua enzima de suporte, a
glutationa peroxidase (GPX), glutationa redutase (GR) e a glutationa-S-
transferase (GST) (SWOMLEY; BUTTERFIELD, 2015).
Comparado com outros órgãos, o cérebro parece estar especialmente em
perigo em relação à geração e desintoxicação de EROs. As células do cérebro
humano utilizam 20% do oxigênio consumido pelo corpo, apesar do órgão pesar
apenas 2% do peso corporal. O cérebro é extremamente vulnerável as EROs por
ser rico em lipídeos insaturados, alvos de peroxidação lipídica. Além disso, o
cérebro apresenta baixa atividade de superóxido dismutase (SOD), catalase e
glutationa peroxidase (GPx) comparada com rins e fígado (HUANG; ZHANG;
CHEN, 2016).
Um radical livre na sua forma natural, o -NO, é sintetizado pela L-arginina
endotelial, neuronal, ou induzido pelo óxido nítrico sintase (NOS). O radical -
NO tem efeitos benéficos como mediador biológico em diversos processos
incluindo a vasodilatação e a neurotransmissão, mas pode ser tóxico em altas
concentrações (SWOMLEY et al., 2014).
Outra reação que poder ser neurotóxica é a redução de glicose no cérebro,
o que resulta num aumento das concentrações de amônia cerebral. A amônia
inibe a cadeia de transporte de elétrons e o transporte de melato-aspartato,
diminui a atividade do citocromo c e níveis de glutationa na mitocôndria cerebral.
O acúmulo de amônia no cérebro de pacientes com DA pode ser mediado pela
inibição de glutamina sintetase (GS) NO-dependente. A diminuição da atividade
da GS no cérebro pode levar a consequências sérias na função do ciclo
glutamato-glutamina, e consequente hiperamonemia nas células neuronais, o que
afeta o humor e comportamento, padrão de sono e causa amnésia, confusão e
redução da consciência, sintomas esses considerados marcas da DA (KOSENKO
et al., 2014).
3.7 Tratamento da Doença de Alzheimer
Apesar do conhecimento da DA por um século, quatro inibidores
colinesterásico e um inibidor de receptores NMDA (Memantina) são os únicos
medicamentos aprovados pela FDA para o tratamento dessa doença. Esses
medicamentos apenas fornecem tratamento sintomático e paliativo, sem alterar
o curso da doença (ANAND; GILL; MAHDI, 2014).
44
A maioria dos alvos na pesquisa terapêutica da DA incluem: peptídeo Aβ,
proteína Tau, receptores (colinérgico, glutamatérgico, serotoninérgico,
dopaminérgico, noradrenérgico, histaminérgico) e enzimas (AChE, BuChE, α, β,
γ-secretase, monoamina oxidase, A e B) (MARTORELL et al., 2016). Os agentes
mais promissores envolvem neuroproteção, prevenção do acúmulo de Aβ e
melhora nos efeitos cognitivos dos pacientes (WEST; BHUGRA, 2015).
Há mais de 20 anos (em 1993), foi aprovado pela FDA o primeiro
medicamento para o tratamento da DA: a tacrina (1) (Cognex®). O fármaco age
como um inibidor tanto da AChE (AChEI) como da BChE (BChEI). Este
fármaco foi introduzido na clínica baseado na hipótese colinérgica para DA.
Pacientes com DA que receberam tratamento com a tacrina apresentaram
aumento da liberação e síntese de ACh, aumento dos níveis de metabólitos de
monoaminas, aumento do número de receptores nicotínicos cerebrais,
estimulação do metabolismo da glicose e melhora do desempenho
neuropsicológico (KRAČMAROVÁ; DRTINOVÁ; POHANKA, 2015). Devido
a sua hepatotoxicidade juntamente com os efeitos secundários gastrointestinais
oriundos do aumento das concentrações de ACh, os quais incluíam aumento
pronunciado do peristaltismo gastrointestinal (cólicas) e da ativação da bomba
de prótons, a tacrina foi retirada do mercado. No entanto outros três AChEI foram
aprovados como medicamento antiDA: a rivastigmina (2), galantamina (3) e o
donezepil (4) (Figura 10) (GUZIOR et al., 2015).
A rivastigmina é classificada como agente de ação intermediária ou pseudo-
irreversível devido à sua longa inibição da AChE, que dura até 10 horas. Como
já descrito, o fármaco inibe tanto a AChE quanto a BChE.
A galantamina é um alcaloide obtido da planta Galanthus spp que exibe
dois mecanismos de ação. Ocorre inibição da AChE e simultaneamente, o
fármaco modula alostericamente os receptores nicotínicos (KILGORE et al.,
2014). O donezepil (Aricept®) é um fármaco sintético, inibe seletivamente e
reversivelmente a AChE, além de inibir moderadamente a agregação β-amiloide
e da β-secretase (BACE1), responsável pela síntese da Aβ (GUZIOR et al., 2015;
KRAČMAROVÁ; DRTINOVÁ; POHANKA, 2015).
O tratamento padrão atual para a DA recomenda a combinação de
inibidores da AChE com memantina (5). A memantina (Ebixa), por sua vez, é
um antagonista de receptores NMDA, que protege células neuronais e reduz a
excitotoxicidade (Figura 10) (GUZIOR et al., 2015). Atualmente é o único
medicamento que possui um efeito no retardo do avanço da DA justamente por
agir como antagonista de glutamato, inibindo portanto o processo de
45
excitotoxicidade, o qual também está implicado na patogênese da doença
(OWEN, 2016).
As colinesterases apresentam diversas propriedades associadas a Aβ e
emaranhados neurofibrilares, sendo importantes na DA. AChE forma complexos
com as placas neuríticas, aumentando as chances de formação de fibrilas Aβ.
Ainda, a AChE foi sugerida como protagonista patológica que induz a transição
conformacional da Aβ levando a agregação e a formação de fibrilas. Já é bem
estabelecido o fato do sítio de ligação periférico aniônico da AChE estar
envolvido nesse processo. E, compostos capazes de interagir nesses sítios da
enzima, são chamados inibidores duplos, com potencial de inibição tanto da
AChE como da agregação Aβ (SHAIKH et al., 2014).
A procura por inibidores colinesterásicos com atividade antioxidante
adicional também é uma das maiores tendências no desenvolvimento de uma
terapia efetiva para a DA (RAMPA et al., 2011).
A função da química medicinal é desenvolver e sintetizar novas moléculas
bioativas, e para esse objetivo diferentes estratégias para descobrir novas drogas
são aplicadas. O paradigma de descoberta, “único alvo, única droga, única
doença” que dominava na indústria farmacêutica vem caindo em desuso.
Enquanto na última década, um novo paradigma chamado “múltiplos alvos” ou
“múltiplos ligantes”, tem sido utilizado como nova abordagem dedicada a
doenças complexas (GUZIOR et al., 2015).
Figura 10 – Fármacos inibidores da AChE: tacrina (1), rivastigmina (2), galantamina (3),
donezepil (4) e bloqueador de NMDA: memantina (5)
46
3.7.1 Híbridos da tacrina
Como reportado anteriormente, a tacrina foi o primeiro medicamento
inibidor de colinesterases aprovado para tratar DA. É conhecida por ter uma
estrutura útil no desenvolvimento de novas moléculas com propriedades
antiagregação de β-amiloide. Híbridos da tacrina têm sido desenhados como
inibidores de colinesterases e agregação amiloide. Estas moléculas podem atuar
como inibidores bivalentes de AChE com habilidade de ligar em ambos sítios
catalítico e aniônico periféricos da enzima. Estudos também reportam que esses
compostos são capazes de prevenir a agregação amiloide induzida (MOHAMED;
SHAKERI; RAO, 2016).
Como também reportado previamente, no processo de agregação Aβ
(Figura 3) diversas espécies intermediárias são formadas como dímeros,
trímeros, tetrâmeros, oligômeros, protofibrilas e fibrilas, que exibem variados
níveis de toxicidade (ITTNER; GÖTZ, 2011). Moléculas com propriedades
antiAβ-agregante podem ligar-se a essas espécies e reduzir sua toxicidade por
mecanismos como: (I) bloquear o processo de agregação e/ou, (II) causar
mudança conformacional do peptídeo Aβ reduzindo sua toxicidade, e/ou, (III)
promover uma conversão rápida de agregados solúveis em fibrilas menos tóxicas
(MOHAMED; SHAKERI; RAO, 2016).
A estrutura da tacrina é amplamente usada como parte farmacofórica no
desenvolvimento de novos fármacos com atividade inibitória contra
colinesterases e formação de fibrilas Aβ (GUZIOR et al., 2015). Nos últimos
anos, bis(7)-tacrina (Figura 11) tem sido reportada como um dímero promissor
no tratamento da DA com base da sua inibição da AChE, capacidade de melhorar
a memória, e potente atividade neuroprotetora. Vários inibidores de AChE têm
sido descobertos como ativadores da via não-amiloidogênica reduzindo
produção de Aβ, indicando que inibidores de AChE podem afetar a expressão
e/ou metabolismo do processo PPA, que é essencial para geração de Aβ
(MILELLI et al., 2017).
Como confirmado por dados de raio-X, quando um dímero da tacrina se
liga ao alvo, os anéis tricíclicos se posicionam numa região conhecida como sítio
catalítico aniônico (SCA) perto da tríade catalítica enzimática, enquanto o outro
componente de anéis tricíclicos da tacrina é posicionado numa região da enzima
definida como sítio periférico aniônico (SPA). O SPA é responsável pelo efeito
adicional da AChE na conversão de moléculas Aβ não-amiloidogênicas em
amiloidogênicas (RYDBERG et al., 2006).
47
Há vários estudos com dímeros de tacrina examinando o efeito que a
variação do espaçador tem com a potência em inibir a enzima e sua cinética
(ESLAMI et al., 2016; MINARINI et al., 2012; TONG et al., 2013; QIAN et al.,
2014). Considerando a importância dessa classe de substâncias, Aquino e
colaboradores (2013) sintetizaram 15 novos dímeros da tacrina, determinaram a
constante inibitória, valores de CI50, mecanismo cinético e realizaram docking
molecular de quinze novos dímeros de tacrina em relação à colinesterases, com
efeitos promissores. Quatro desses compostos sintetizados foram escolhidos para
explorar seu efeito in vivo, no presente estudo (Figura 11).
Figura 11 – Esquema da dimerização da tacrina, bis(7)-tacrina e os dímeros em estudo
(DT1, DT2, DT3 e DT4)
A nomenclatura dos dímeros em estudo são:
DT1: (N-[4-(2-{4-[(1,2,3,4-tetraidroacridin-9-il)amino]fenil}etil)fenil]-
1,2,3,4-tetraidroacridin-9-amina)
48
DT2: (N-[4-({4-[(1,2,3,4-tetraidroacridin-9-il)amino]fenil}metil)fenil]-
1,2,3,4-tetraidroacridin-9-amina)
DT3: (N-(4-{4-[(1,2,3,4-tetraidroacridin-9-il)amino]fenil}fenil)-1,2,3,4-
tetraidroacridin-9-amina)
DT4: (1-N,4-N-bis(1,2,3,4-tetraidroacridin-9-il)benzeno-1,4-diamina)
Suas características cinéticas estão apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 – Perfil cinético dos dímeros da tacrina
Ki ± d.p (nM) hAChE
CI50 ± d.p (nM) hAChE
Tacrina 23,2 ± 3,04 122 ± 7,46
DT1 30,8 ± 2,99 196 ± 2,31
DT2 3,18 ± 0,77 8,94 ± 0,42
DT3 2,67 ± 0,21 54,8 ± 23,9
DT4 19,8 ± 1,68 117 ± 25,4
Nota: Constante inibitória (Ki) e Concentração que inibe a taxa de atividade enzimática
em 50% (CI50). Acetilcolinesterase humana (hAChE).
Fonte: Aquino et al., 2013
O estudo de docking molecular realizado por Aquino (2014) para os
dímeros da tacrina mostra um padrão de ligação característico de ligantes com
poder de alterar atividades enzimáticas. Além da interação com os sítios SPA e
SCA que expressa por Ki como capacidade inibitória dos compostos (Tabela 1),
há interações do tipo π stacking entre o espaçador aromático dos dímeros e os
resíduos aromáticos presentes na meia-fenda das enzimas colinesterásicas como
mostra o exemplo da Figura 12.
Apesar do componente aromático no espaçador diminuir a flexibilidade da
molécula, podendo atrapalhar na interação que ocorre em SPA e SCA, Aquino
(2014) encontrou melhores resultados quando o ligante apresentou habilidade de
combinar as interações em SPA/SCA com a região na meia-fenda, e de fato, a
maior rigidez dos dímeros com espaçadores aromáticos não supera a sua
habilidade como ligante de interagir com a enzima. Grupos rígidos no espaçador
dificultam o ajuste do ligante à enzima, porém ainda ocorre alterações estruturais
na enzima que são significativas.
Os compostos DT1, DT2, DT3 e DT4 apresentam distância adequada entre
os anéis tricíclicos da tacrina para interação simultânea com SPA e SCA. Aquino
49
(2014) também analisou que a correlação entre a potência inibitória dos dímeros
e a distância estimada entre os nitrogênios piridínicos mostra que os menores
valores de Ki são observados para os dímeros com 14,5 a 16 Å de distância entre
as unidades hidroacridínicas.
Figura 12 - Conformação de ligação do composto DT3 na fenda de TcAChE1.
Fonte: Aquino, 2014
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Dímeros da tacrina
1 Acetilcolinesterase de Torpedo californica
50
Os compostos foram sintetizados e gentilmente fornecidos por Aquino
(2014) do Departamento de Química da Universidade Federal de Minas Gerais,
sob coordenação do Dr. Ângelo de Fátima.
Para a síntese dos dímeros da tacrina utilizou-se uma rota de síntese em
duas etapas descrita por Aquino (2014) conforme ilustrado na Figura 13:
Figura 13 – Rota de síntese adotada para a obtenção dos dímeros de tacrina e as diaminas
utilizadas
Fonte: adaptado de Aquino (2014)
Na primeira etapa o ácido antranílico (1) é posto em reação com uma
ciclocetona (2) em POCl3. Na segunda etapa o composto do tipo
cloroidroacridina reage com diferentes diaminas (4-7) gerando os dímeros da
tacrina que foram nomeados de DT1, DT2, DT3 e DT4 (Figura 11), com fórmula
molecular e massa molecular descritas na Tabela 2.
51
Tabela 2 – Fórmula molecular e massa molecular dos dímeros da tacrina em estudo
Composto Fórmula molecular Massa molecular
DT1 C40H38N4 574,7720 (g/mol)
DT2 C39H36N4 560,7450 (g/mol)
DT3 C38H34N4 546,7180 (g/mol)
DT3 C32H30N4 470,6200 (g/mol)
4.2 Animais
A espécie de animal utilizada nos experimentos foi camundongos Swiss
machos de 10 a 12 semanas de idade pesando entre 25 a 35 g, procedentes do
biotério central da UNIVALI. Os animais foram retirados do biotério pelo menos
3 dias antes da realização do experimento para ambientação no biotério do
laboratório 209 do bloco F6. Os mesmos foram mantidos em caixas de
polipropileno, contendo maravalha, as quais foram higienizadas, trocadas a cada
dois dias e, quando necessário. A sala foi mantida com temperatura média de 22
± 2ºC e com ciclos controlados (claro/escuro 12 horas cada), umidade de 60%,
com ração e água ad libitum.
O tratamento dos animais (ração e água) durante o período de ambientação
foi feito pela técnica responsável pelo biotério conforme procedimento usual da
UNIVALI. Após os experimentos comportamentais os animais foram
eutanasiados pelo método da guilhotina para retirada do encéfalo para prosseguir
as análises bioquímicas. As carcaças foram acondicionadas em sacos plásticos
adequados para descarte de material biológico e incineradas, conforme normas
da UNIVALI. Os procedimentos experimentais apresentados nesta dissertação
foram aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais –
CEUA/UNIVALI, sob parecer número: 11/16 (ANEXO A).
4.3 Grupos experimentais
Para a investigação farmacológica os animais foram divididos em oito
grupos experimentais, sendo eles:
I) Grupo Naive é composto de animais (n = 10) que não receberam nenhum
tipo de tratamento, assim como também não receberam a injeção i.c.v., a fim de
comparação comportamental entre animais normais e animais com Alzheimer
induzido pelo peptídeo β-amiloide via i.c.v.;
52
II) O grupo Sham é composto de animais (n = 10) que não receberam
nenhum tipo de tratamento via oral, porém, receberam o veículo utilizado para
solubilizar o peptídeo β-amiloide (salina), 3 µL via i.c.v.. Esse grupo de animais
é importante para mostrar que a injeção i.c.v. não causa lesão hipocampal
interferindo no resultado comportamental e bioquímico;
III) O grupo Controle Negativo (n = 10) recebeu a injeção i.c.v. do peptídeo
Aβ1-42 (3 µl, 400 pmol/animal) para indução da Doença de Alzheimer e como
tratamento via oral por 15 dias, o veículo utilizado na solubilização dos dímeros
(2% de DMSO em água destilada);
IV) O grupo Controle Positivo (n = 10) recebeu a injeção i.c.v. do peptídeo
Aβ1-42 (3 µL, 400 pmol/animal) e como tratamento via oral por 15 dias recebeu
um fármaco de referência no tratamento da Doença de Alzheimer, a tacrina na
sua dose usual (50 µmol/kg, v.o.), dissolvida em água. A escolha da dose da
tacrina foi baseada em estudos prévios que obtiveram resultados positivos em
testes comportamentais com administração oral de tacrina na dose de 10 mg/kg
em camundongos (BARAL et al., 2015), o que equivale a 50 µmol/kg;
V – VIII) Os grupos DT1, DT2, DT3 e DT4 (n = 10) receberam a injeção
i.c.v. do peptídeo Aβ1-42 (3 µl, 400 pmol/animal) e como tratamento via oral por
15 dias receberam compostos dímeros da tacrina sintetizados (DT1, DT2, DT3,
DT4), na dose molar equivalente a dose usual da tacrina (50 µmol/kg),
dissolvidos com 2% de DMSO em água destilada.
O tamanho de amostra utilizado foi baseado em estudos estatísticos prévios
e também, baseado em artigos publicados pelo grupo de pesquisa ao longo dos
anos de experiência nesta área, os quais descrevem suas metodologias utilizando
esse número de animais por grupo de tratamento.
O esquema do uso de animais por dia está representado na figura a seguir,
e mais detalhes descritos ao longo da metodologia deste estudo:
53
Figura 14 – Esquema representativo do uso de animais por dias
TCA: Teste do Campo Aberto; RO: Reconhecimento de Objetos; EI: Esquiva Inibitória;
LAM: Labirinto Aquático de Morris
4.4 Indução do Alzheimer através da administração do peptídeo β-amiloide
(Aβ1-42) via i.c.v.
O peptídeo β-amiloide (Aβ1-42) foi administrado usando a via i.c.v.. Para
isso os camundongos foram devidamente anestesiados (Xilazina + Ketamina, 10
+ 100 mg/kg, i.p.). Após detectar a perda dos reflexos posturais, foi injetado na
região superior da cabeça o anestésico local contendo agente vasoconstrictor
(Xylestesin 2%, s.c.) seguido de uma incisão para remoção de tecidos cutâneos
a fim de obter a exposição da calota craniana. Após a cirurgia os animais foram
mantidos em caixa pós-cirúrgica sob iluminação (40W) até total recuperação
com intuito de controle da hipotermia induzida pela anestesia. Foi administrado
dipirona (100 mg/kg, via i.p.) nos animais como analgésico pós-cirúrgico
conforme instrução obtida do manual de Procedimentos para Anestesia de
Animais de Laboratório – CREAL/2013 (http://www.ufrgs.br/creal/animais-e-
alojamento-1/procedimentos-para-anestesia/at_download/file). Após
recuperação, os animais foram transferidos para caixas moradias (10 indivíduos
por caixa).
No dia seguinte 3µl de Aβ1-42 (400 pmol/camundongo) foi administrado
pela via i.c.v. utilizando micro seringa Hamilton acoplada a sistema de micro
cânula com uma agulha na extremidade. O procedimento ocorreu inserindo a
agulha sob o crânio dos camundongos unilateralmente, 1 mm da fissura craniana
central e perpendicular ao plano do crânio. O procedimento foi realizado
conforme descrito por Prediger et al. (2007) e padronizado em nossos
laboratórios por Amoah e colaboradores (2015).
54
4.5 Avaliação comportamental dos animais
4.5.1 Teste do Campo Aberto (TCA)
Com o objetivo de verificar se o tratamento com os compostos poderia
afetar o sistema motor dos animais e, comprometer os resultados referentes ao
comportamento de cada um dos mesmos nos experimentos comportamentais,
utilizou-se o teste do Campo Aberto. O teste foi executado conforme descrito por
Rodrigues (1996) e adaptado em nossos laboratórios por Gonçalves et al. (2012),
em uma caixa de madeira medindo 40 x 60 x 50 cm. O chão da caixa foi dividido
em 9 quadrantes iguais. Decorridos 7 dias após a injeção i.c.v. do peptídeo β-
amiloide os animais foram transferidos 60 min após os tratamentos para o
aparato, e os parâmetros comportamentais de cruzamento entre os quadrantes e
o número de atividades exploratórias (levantadas), onde o animal fica sobre as
duas patas traseiras com o intuito de levantar o corpo para explorar o ambiente ,
foram observados por 6 minutos. A redução dos parâmetros comportamentais
relacionados à atividade locomotora e exploratória observados durante o
experimento é indicativa de efeitos depressores com possível efeito no sistema
motor dos animais (GONÇALVES et al., 2012).
Os animais permaneceram no aparato por 15 minutos complementando a
ambientação necessária para o próximo experimento a ser realizado.
4.5.2 Teste do Reconhecimento de Objetos (RO)
O teste de reconhecimento de objetos (RO) baseia-se no princípio de que,
em um ambiente familiar, os roedores utilizados em laboratório mostram uma
atração instintiva para a novidade, ou preferência por um novo objeto, não
familiar. Esta preferência é utilizada como um indicativo de memória em relação
ao objeto familiar. O procedimento foi realizado de acordo com Izquierdo e
colaboradores (1998) e adaptado em nosso laboratório. A tarefa consiste em
colocar o animal inicialmente frente a um objeto e, após 24 horas, expor
novamente este mesmo animal ao objeto apresentado anteriormente juntamente
com um novo objeto. A memória de reconhecimento é avaliada comparando o
tempo gasto pelo animal explorando cada objeto durante a segunda tentativa.
Com o tempo gasto em cada objeto calcula-se o índice de reconhecimento (IR)
(Tempo B x / Tempo A + Tempo B).
55
Conforme ilustrado na Figura 15, no sétimo dia após a injeção i.c.v. do
peptídeo β-amiloide, os animais foram expostos ao aparado do Campo Aberto
sem qualquer objeto, por 15 minutos para ambientação no aparato. No 8º dia os
animais foram colocados no mesmo aparato com a presença do objeto A, por um
período de 10 minutos (sessão treino). No 9º dia eles foram submetidos à
avaliação da memória de reconhecimento (sessão teste). Nesta sessão, os animais
foram novamente expostos ao aparado por 10 minutos, na presença de dois
objetos: o objeto A e o novo B. Foram considerados satisfatórios os IRs com
valores maiores de 0,5 (B>A).
Figura 15 – Esquema representativo do teste de Reconhecimento de Objetos
4.5.3 Teste da Esquiva Inibitória (EI)
A esquiva inibitória é um teste comumente usado para estudar processos de
aprendizagem e memória em roedores. Durante o treino, os animais recebem um
estímulo aversivo, que no caso é um choque nas patas quando o animal se
posiciona num local do aparato. A retenção do aprendizado durante a sessão
treino é testada usualmente 24 horas depois. A maior latência do animal é
interpretado como indicativo de que melhor é a memória (ATUCHA;
ROOZENDAAL, 2015). Trata-se de um aprendizado adquirido em uma única
tentativa, tornando-se ideal para o estudo de processos iniciados no treino
(IZQUIERDO; MEDINA, 1997).
No presente estudo os animais foram submetidos à um teste de esquiva
inibitória realizado de acordo com Izquierdo e Dias (1983), com algumas
modificações conforme ilustrado na Figura 16. Os animais foram gentilmente
colocados sobre uma plataforma de 2,5 cm de altura, 7,0 cm de profundidade e
25,0 cm de largura do lado esquerdo de um aparato de 50 x 25 x 25 cm, com chão
feito de barras de aço inoxidável paralelas com calibre de 0,1 cm e a 1 cm de
distância uma da outra. A iluminação do aparato é feita com uma lâmpada de 15
A A B
56
W, enquanto a sala permanece escura. Durante a sessão treino, a latência de
descida com as quatro patas na grade foi cronometrada, e imediatamente foi
acionado um choque nas patas de 0,4 mA por 2,0 segundos. Na sessão teste, o
processamento foi idêntico ao da sessão treino com omissão do choque, onde
após 24 horas depois do treino, foi cronometrado o tempo de latência de descida,
com limite máximo para 180 s.
Figura 16 – Esquema representativo do teste da Esquiva Inibitória
4.5.4 Teste do Labirinto Aquático de Morris (LAM)
O Teste do Labirinto Aquático de Morris (LAM) é um teste utilizado para
avaliar a memória espacial de animais através de treinamentos em um ambiente
aquático com pistas geográficas.
Morris (1982) descreveu uma metodologia chamada de “pista distal”, onde
uma plataforma fica submersa na água e colocada em uma posição fixa relativa
às pistas que estão fora do labirinto. O animal, para aprender a localização da
plataforma, tem que utilizar pistas ambientais fora do labirinto para navegar até
a plataforma. Esta versão com pista distal força o uso de estratégias de
mapeamento espacial. A utilização do labirinto aquático de Morris, oferece
vantagens quando comparado a outros testes de memória espacial, pois não é
necessária a utilização de privação de alimento, ou reforços, para motivar o
comportamento dos animais durante o procedimento de aprendizagem espacial.
Para a realização desse experimento foi utilizado um labirinto aquático
semelhante ao utilizado por Morris (1982). O labirinto aquático consiste em um
tanque circular de polietileno, de 100 cm de diâmetro e 50 cm de altura,
preenchido com água mantida a uma temperatura de 25 °C (± 1 °C). O labirinto
aquático foi dividido em quatro quadrantes imaginários, numerados em sentido
horário. Uma plataforma circular de 12 cm de diâmetro e 25 cm de altura foi
colocada a 1,5 cm abaixo da superfície da água, no centro de um dos quadrantes,
57
onde os animais tiveram que procurar. Nas paredes da sala foram fixadas pistas
visuais como figuras (Figura 17). Uma câmera de vídeo foi fixada acima do
labirinto aquático para registar todo o experimento para análise posterior que foi
realizado pelo software ANY-Maze (Stoelting Co.)
Os treinamentos iniciaram a partir do 10º dia após a injeção i.c.v. do
peptídeo β-amiloides, por 5 dias. Os animais foram treinados para aquisição da
tarefa no LAM com uma sessão diária. Cada animal foi colocado no centro de
um dos quadrantes, de costas para o centro do labirinto e permitindo nadar para
encontrar a plataforma por 60 segundos. Quando o animal encontra a plataforma
pode permanecer no local por 15 segundos; quando não encontra, ele é colocado
sobre a plataforma manualmente onde pode permanecer por 30 segundos. Ao
término de cada sessão diária, os animais retornaram para suas caixas para serem
testados novamente no dia seguinte. O tempo que cada animal levou para
encontrar a plataforma em cada tentativa foi registrada para análise, através de
captura de imagem. Este tempo é denominado latência de fuga e é esperado que
ocorra uma diminuição do tempo em que o animal leva para localizar a
plataforma espacialmente.
No 6º dia foi realizado o Probe trial, com a retirada da plataforma do
labirinto aquático e o animal teve 60 segundos de natação livre. O tempo gasto
em cada quadrante foi registrado para análise. No Probe trial é avaliada a
precisão de aprendizagem espacial do animal, representado pelo tempo gasto no
quadrante onde a plataforma se localizava nas sessões de treino. Esta análise é
um indicativo de que o animal utilizou uma estratégia de orientação espacial para
localizar a posição da plataforma em relação às pistas visuais do ambiente
(BLOKLAND; GERAERTS; BEEN, 2004).
Figura 17 – Esquema do Labirinto Aquático de Morris
Fonte: http://www.augusta.edu/core/labs/sabc/morriswatermaze.php
58
4.6 Preparação das amostras para avaliação do sistema antioxidante
cerebral
Para os ensaios das enzimas antioxidantes foi retirado o encéfalo, separado
córtex e hipocampo, ambos foram pesados e imediatamente congelados a -80 °C.
Após o descongelamento foi preparado o homogenato de cada amostra em
solução tampão fosfato de potássio 200 mM (pH 6,5). A quantidade utilizada foi
de 6 vezes o volume em relação ao peso de cada tecido. O homogenato obtido
foi imediatamente utilizado para a quantificação dos níveis de glutationa
reduzida (GSH) e hidroperóxidos lipídicos (LOOH), posteriormente foi
centrifugado por 20 minutos a 11.000 rpm a 4 °C utilizando uma micro
centrífuga, com o supernadante foi mensurado a atividade da SOD e com o
precipitado foi determinado a atividade da MPO.
A preparação do homogenato e todos os procedimentos bioquímicos
descritos a seguir foram realizados em banho de gelo (4°C).
4.6.1 Quantificação dos níveis de glutationa reduzida (GSH)
Os níveis de GSH no córtex e no hipocampo foram determinados
através do método de Sedlak e Lindsay (1968). Em eppendorf foram adicionados
50 μL do homogenato de cada amostra preparado conforme item anterior (4.6) e
40 μL de ácido tricloroacético (ATC) 12%, os tubos foram agitados em vórtex e
centrifugados por 15 minutos a 4.000 rpm 4 °C.
Em placa de 96 poços foram acrescidos 20 μL do sobrenadante, 280 μL
de tampão TRIS 0,4M (pH 8,9) e 5 μL de solução 3,96 mg/mL de DTNB (5,5’-
ditiobis 2-ácido nitrobenzoico) em metanol. Após 15 minutos realizou-se a
leitura espectrofotométrica em 405 nm. Os valores individuais foram
interpolados numa curva padrão de GSH (0,05 – 0,21 μg) e expressos em μg
GSH/g tecido.
4.6.2 Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD)
A determinação da atividade da SOD foi realizada de acordo com a
metodologia descrita por Marklund e Marklund (1974). Foi adicionado em cada
eppendorf 442,5 µL de tampão TRIS HCl-EDTA (pH 8,5) e 20 µL do
sobrenadante da amostra. Posteriormente agitou-se em vórtex e adicionou-se 25
µL de Pirogallol (1 mM). A amostra foi incubada em temperatura ambiente por
59
20 min. A reação foi parada com 12,5 µL de HCl 1N, e os eppendorfs foram
centrifugados por 4 min a 14000 rpm.
Em microplaca de 96 poços, 300 µL do sobrenadante foi lido em
espectrofotômetro a 440 nm, e a atividade da SOD foi expressa em U/mg de
proteína
4.6.3 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH)
O total de hidroperóxidos lipídicos (LOOH) no córtex e no hipocampo foi
mensurado conforme metodologia de Jiang et al. (1991). Em tubos de micro
centrífuga foram adicionados 10 μL de metanol e 100 μL do homogenato,
posteriormente os tubos foram agitados em vórtex e centrifugados a 11.000 rpm
por 20 minutos a 4 °C em ultra centrífuga.
Em placa de 96 poços foram colocados 30 μL do sobrenadante e 140 μL de
meio reacional (Xilenol laranja 100 mM, Ferro II 250 mM e hidroxitolueno
butilado 4 mM solubilizados em metanol) incubados por 30 minutos a
temperatura ambiente ao abrigo da luz. A leitura foi realizada em
espectrofotômetro a 560 nm e, a concentração de LOOH foi determinada em
µmol/mg de tecido.
4.6.4 Quantificação dos níveis de atividade da enzima mieloperoxidase (MPO)
O homogenato obtido foi centrifugado a 10000 rpm durante 20 min e,
posteriormente, o precipitado obtido foi ressuspendido com 500 µL de tampão
fosfato de potássio 80 mM na presença de 0,5% de hexadeciltrimetilamônio
(HTAB). Após homogeneização, as amostras foram novamente centrifugadas
(11000 rpm, 20 min a 4 °C) em micro centrífuga refrigerada e duplicatas de
alíquotas de 30 μL do sobrenadante de cada amostra foram acrescidas de 200 μL
de uma solução reacional (100 μL de tampão fosfato 80 mM, 85 μL de tampão
fosfato 22 mM e 15 μL de H2O2 0,017%) em placas de 96 poços.
A reação foi iniciada com a adição de 20 μL de tetrametilbenzidina (TMB),
um substrato enzimático que resulta num produto colorido, em cada poço. As
amostras foram então incubadas por 3 min a 37 ºC, e a reação foi interrompida
pela adição de 30 μL de acetato de sódio 1,46 M (pH = 3,0) em cada poço.
A absorbância foi mensurada em espectrofotômetro a 620 nm. Os
resultados foram expressos como unidade de milidensidade óptica (mD.O)/ mg
de proteína.
60
4.6.5 Dosagem de proteína
Para calcular a atividade da MPO é necessário dosar proteínas, e para isso,
as concentrações de proteína foram determinadas pelo método de Bradford
utilizando albumina de soro bovino como padrão (1,0 – 0,0625 μg/kg).
Em placa de 96 poços, foram colocados 5 µL do sobrenadante das amostras com
200 µL de reagente Bradford. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 560
nm.
4.7 Preparação das amostras para avaliação do sistema hepático dos animais
Para as análises bioquímicas da função hepática, o sangue dos animais foi
coletado durante o sacrifício pelo método da guilhotina, e com heparina foi
centrifugado a 3000 rpm a 4 °C por 10 min para analisar os níveis de AST e ALT
no soro. As amostras foram analisadas pelo método cinético enzimático realizado
pelo Laboratório Solução.
As amostras de tecido hepático foram fixadas com solução de formalina a
10%, desidratado e incorporado em parafina usando um processador de tecido
automatizado. Em seguida, as secções de 5 µm foram coradas com hematoxilina
e eosina (HE) e examinadas ao microscópio. As fotografias foram tiradas com
uma ampliação de 400 x.
4.8 Avaliação da viabilidade celular
Para avaliação da citoxicidade dos dímeros da tacrina foi realizado o teste
de brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazólio (MTT),
empregando a linhagem celular de hepatoma humano HepG2. O número de
células viáveis é determinado pela habilidade da mitocôndria em converter MTT
em formazan. As células foram obtidas comercialmente e mantidas em cultura
de DMEM contendo 10% de SFB, a 37 °C. O efeito dos dímeros da tacrina na
citotoxicidade foram testados pelo tratamento das células (1 x 105) com os
dímeros da tacrina e a tacrina na dose de 300 µM, dissolvidos em DMSO, as
células foram incubadas por 24 horas a 37 °C em atmosfera umidificada contendo
5% de CO2 em placas de 96 poços. Depois de 24 horas, 10 µl de solução de MTT
(5 mg/mL) foi adicionado diretamente no meio de cada poço, e a placa foi
incubada a 37°C por 4 horas. O meio foi totalmente aspirado e substituído por
61
DMSO (100 µL/poço) e a absorbância foi medida a 570 nm usando leitor de
microplacas.
4.9 Análise estatística
Para a análise estatística os resultados obtidos foram submetidos a análises
de variância (ANOVA), quando necessário, foi utilizado o teste de múltiplas
comparação post hoc, utilizando o software GraphPad INSTAT®. Os resultados
são apresentados como média ± desvio padrão (d.p.). Foram considerados
estatisticamente significativos os valores de p menor do que 0,05 (p < 0,05).
62
63
5 RESULTADOS
5.1 Avaliação dos efeitos dos compostos em ensaios comportamentais in vivo
5.1.1 Avaliação da atividade locomotora no Teste do Campo Aberto
O tratamento com a tacrina diminuiu a atividade locomotora (número de
cruzamentos) dos animais comparado com o grupo controle negativo em 31,14%
(96,4 ± 23,7 quadrantes vs 140 ± 29,9; p < 0,01), assim como o grupo tratado
com DT4 teve uma redução de 23,57% (107 ± 11,2 vs 140 ± 29,9; p < 0,05) [F
(7, 56) = 3,233; p < 0,01, Figura 18A]. Porém, não houve diferença estatística
entre os grupos no parâmetro de exploração (número de levantadas) [F (7, 56) =
1,640; p = 0,1434, Figura 18B].
64
Figura 18 – Efeito dos tratamentos sobre a atividade locomotora e atividade exploratória
no Teste do Campo Aberto
Nú
me
ro
de
cr
uz
am
en
tos
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
**
A
(A 1 -4 2 , 4 00 p m ol/an im a l, i.c .v .)
*
(50 m o l/k g , v .o .)
Nú
me
ro
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va
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s
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
B
(A 1 -4 2 , 4 00 p m ol/an im a l, i.c .v .)
(50 m o l/k g , v .o .)
As barras indicam a média ± d.p. (n = 8) dos grupos Naive, Sham, Controle Negativo
(CN), tacrina e os dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3, DT4). Painel A: número de
cruzamentos nos quadrantes do aparato Campo Aberto. Painel B: número de levantadas
no aparato Campo Aberto. Asteriscos indicam diferença estatística comparada com o
grupo CN (* p < 0,05; ** p < 0,01; ANOVA de múltiplas comparações seguida do teste
post hoc de Tukey).
65
5.1.2 Efeito dos tratamentos sobre a memória de reconhecimento através do
teste de Reconhecimento de Objeto.
No teste que avalia memória de reconhecimento a longo prazo, (Figura 19)
os animais do grupo controle negativo (CN), que receberam apenas Aβ1-42,
apresentaram déficit cognitivo comparados com os animais normais (Naive),
tendo uma diminuição de 29% no índice de reconhecimento do objeto antigo que
já lhe era familiar (0,43 ± 0,08 vs 0,6 ± 0,06; p < 0,001). Este déficit cognitivo
causado pelo Aβ1-42 foi revertido nos grupos tratados com tacrina (0,59 ± 0,08) e
os dímeros da tacrina (DT1: 0,56 ± 0,1; DT2: 0,56 ± 0,09; DT3: 0,6 ± 0,06 e
DT4: 0,58 ± 0,1) [F (7, 72) = 4,436, p< 0,001], com aumento de 27,1; 23,2; 23,2;
28,3 e 25,8%, respectivamente, no índice de reconhecimento do objeto antigo.
Figura 19 – Efeito dos tratamentos em animais submetidos ao teste de Reconhecimento
de Objetos
Ín
dic
e d
e R
ec
on
he
cim
en
to
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
* * * * * * ** ** * *
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
* * * * * *
As barras indicam a média ± d.p. (n = 10) dos grupos Naive, Sham, Controle Negativo
(CN), tacrina e os dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3, DT4), quanto ao índice de
reconhecimento do objeto antigo. Asteriscos indicam diferença estatística comparado com
o grupo CN (** p<0,01 e *** p<0,001; ANOVA de múltiplas comparações seguida do
teste post hoc de Dunnett).
66
5.1.3 Avaliação da memória aversiva dos animais no teste da Esquiva
Inibitória
Para determinar a atividade dos dímeros da tacrina sobre a memória
aversiva dos animais, foi avaliado o parâmetro de latência de descida no teste de
Esquiva Inibitória. Os resultados são apresentados na Figura 20. Como esperado,
a administração i.c.v. de Aβ1-42 (400 pmol/camundongo) em camundongos swiss
resultou em declínio de 56,5% na função cognitiva, como demonstrado pela
diminuição na latência de descida na sessão teste do grupo controle negativo
(CN) comparada com animais normais (Naive) (77,6 ± 9,8s vs 178,3 ± 5,4s) [F
(7, 65) = 14,37 p < 0,0001, Figura 20]. Já o tratamento com a tacrina (156,3 ±
22,2s), e os dímeros da tacrina (DT1: 145,0 ± 39,1s; DT2: 168,6 ± 22,9s; DT3:
157,8 ± 21,7s e DT4: 166,4 ± 26,2s) reverteram o déficit cognitivo, com melhora
de 50,3; 46,5; 53,1; 50,8 e 53,4%, respectivamente, na latência de descida na
sessão teste comparada com a sessão teste do grupo CN. Em relação a sessão
treino, não houve diferença estatística entre os grupos [F (7, 65) = 1,549 p =
0,1666, Figura 20].
67
Figura 20 – Efeito dos tratamentos sobre a memória aversiva de animais submetidos ao
Teste da Esquiva Inibitória.
La
tên
cia
de
De
sc
ida
(s
)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
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* * * * * * * ** * * *
* * * * * * * ** * * *
* * * *
a aa
a a aa a
b b
b
b bb
bb
(A 1 -4 2 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
As barras indicam a média ± d.p. da latência de descida da plataforma da esquiva inibitória
em segundos, dos grupos Naive, Sham, Controle Negativo (CN), tacrina e os dímeros da
tacrina (DT1, DT2, DT3, DT4). As barras “a” indicam a sessão treino, e as barras “b”
indicam a sessão teste. Asteriscos indicam diferença estatística entre a sessão teste dos
grupos e a sessão teste do grupo CN (**** p < 0,0001; ANOVA de duas vias seguida do
teste post hoc de Tukey).
5.1.4 Avaliação da memória espacial dos animais através do teste Labirinto
Aquático de Morris.
Neste experimento, avaliou-se a memória espacial dos camundongos.
Como descrito anteriormente, os animais foram treinados no labirinto durante 5
dias consecutivos. Vinte e quatro horas depois do último treino, os animais foram
submetidos ao Probe trial, no qual a plataforma de escape foi retirada. A seguir
segue a descrição dos resultados obtidos durante os dias de treino. Devido à
grande quantidade de grupos estudados, optou-se por apresentar diferentes
gráficos para melhor compreensão.
Na Figura 21 e na Tabela 3 são apresentados os resultados de latência para
encontrar a plataforma com todos os grupos durante todos os dias de treino, em
68
forma de gráfico e os valores de média ± desvio padrão. A análise feita por
ANOVA de duas vias, mostra a diferença de cada grupo comparado com o grupo
CN em cada dia. No Dia 1, os grupos Naive e Sham encontraram a plataforma
mais rápido que o grupo CN (p < 0,01). No Dia 2, foram os grupos Sham e DT2
que encontraram a plataforma mais rapidamente (p < 0,01 e p < 0,05).
No terceiro dia de treino, todos os grupos foram melhores que o grupo CN
(p < 0,0001), sendo que o grupo tacrina foi 70% mais rápido em encontrar a
plataforma, o DT1, DT2, DT3 e DT4 foram 61, 67, 60 e 83% sugerindo que de
fato, o grupo CN, teve um déficit cognitivo apresentado já no terceiro dia de teste.
Assim como no quarto dia, todos os grupos tiveram quase a mesma performance,
com melhora em relação ao grupo CN. O grupo tacrina foi 57% mais rápido em
encontrar a plataforma, o DT1, DT2, DT3 e DT4 foram 79, 66, 66 e 67%. No
quinto dia de treino, o grupo tacrina foi 80% mais rápido que o grupo CN, e os
grupos DT1, DT2, DT3 e DT4 foram 52, 59, 77 e 66%.
Já na Figura 22, cada gráfico representa um dia de treinamento com todos
os grupos.
69
Figura 21 – Efeito dos tratamentos em animais submetidos ao Labirinto Aquático de
Morris durante as sessões de treino L
atê
nc
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e E
sc
ap
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D ia 1 D ia 2 D ia 3 D ia 4 D ia 5
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* (D T 2 ) * * * * ( N a iv e )
* * * * ( S h a m )
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* * * * (D T 1 )
* * * * (D T 2 )
* * * * (D T 3 )
* * * * (D T 4 )
* (N a iv e )
* * (S h a m )
* (T a c r in a )
* * (D T 1 )
* (D T 3 )
* (D T 4 )
* (D T 2 )
* (S h a m )
* * (T a c r in a )
* (D T 4 )
* * (D T 3 )
Média ± d.p. da latência, em segundos, para encontrar a plataforma dos grupos Naive,
Sham, Controle Negativo (CN), tacrina, e os dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3, DT4)
em cinco dias de treinamento. Asteriscos indicam diferença estatística comparado com o
grupo CN (* p < 0,05; ** p < 0,01 e **** p < 0,0001; ANOVA de múltiplas comparações
seguida do teste post hoc de Dunnett).
Tabela 3 – Latência de escape dos animais submetidos ao teste do Labirinto Aquático de
Morris durante as sessões de treino
Representação numérica da Figura 21 em média ± d.p. da latência, em segundos, para
encontrar a plataforma em cinco dias de treinamento. Asteriscos indicam diferença
70
estatística comparado com o grupo CN (* p < 0,05; ** p < 0,01 e **** p < 0,0001;
ANOVA de múltiplas comparações seguida do teste post hoc de Dunnett).
Figura 22 – Efeito dos tratamentos em animais submetidos ao Labirinto Aquático de
Morris durante as sessões de treino- Gráficos representativos de cada dia de treino.
D IA 1
La
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cia
de
Es
ca
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N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
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N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
2 0
4 0
6 0
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*
D IA 3
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cia
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N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
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6 0
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********
********
****
****
D IA 4
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*
*** * *
D IA 5
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N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
-2 0
0
2 0
4 0
6 0
8 0
***
***
Cada gráfico representa um dia de teste, com a latência de escape em segundos (média ±
d.p.). A análise estatística é a mesma apresentada na Figura 20. Asteriscos indicam
diferença estatística comparado com o grupo CN (* p < 0,05; ** p < 0,01 e **** p <
0,0001; ANOVA de múltiplas comparações seguida do teste post hoc de Dunnett).
A Figura 23 apresenta os resultados do Probe trial, ou seja, o tempo que
cada grupo permaneceu no quadrante alvo durante 60 s.
Comparando com o grupo de animais normais (Naive), o grupo CN
permaneceu menos tempo no quadrante alvo (6,8 ± 0,9s vs 17,3 ± 2,5s; p <
0,0001), sugerindo um déficit na cognição espacial. O grupo tacrina permaneceu
19,5 ± 8,3s do tempo total no quadrante alvo, os grupos DT1, DT2, DT3 e DT4
permaneceram 14,8 ± 2,5; 16,5 ± 2,8; 13,1 ± 2,8 e 17,9 ± 3,0s, sendo todos
significativamente melhores que o grupo CN (Figura 23).
71
Figura 23 – Resultado do Probe trial em animais submetidos ao Labirinto Aquático de
Morris
P r o b e tr ia l
Te
mp
o n
o q
ua
dr
an
te a
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(s)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
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* * * *
* * *
* * * *
* * * *
* * * *
* * ** *
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
As barras indicam a média ± d.p. do tempo, em segundos, em que os animais
permaneceram no quadrante alvo, dos grupos Naive, Sham, Controle Negativo (CN),
tacrina e os dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3, DT4). Asteriscos indicam diferença
estatísticas comparado com o grupo CN (* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 e **** p
< 0,0001; ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste post hoc de Dunnett).
Como complemento dos resultados, a Figura 24 mostra a distância total
percorrida durante o Probe trial (A), e a velocidade média dos animais (B).
Conforme observado, não houve diferença estatística entre os grupos.
72
Figura 24 – Efeito dos tratamentos sobre parâmetros: distância percorrida (A) e
velocidade média (B) de animais submetidos ao LAM
Dis
tân
cia
pe
rc
or
rid
a (
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N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
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A
(A 1 -4 2 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
Ve
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ida
de
mé
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N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0 .0
0 .1
0 .2
0 .3
0 .4
B
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
Painel A – distância, em metros, percorrida pelos animais durante o Probe trial do teste
do Labirinto Aquático de Morris. Painel B – velocidade média, em metros por segundo,
de natação dos animais durante o Probe trial do mesmo teste. Os dados são apresentados
em média ± d.p.
A seguir é apresentado um quadro representativo do percurso feito pelos
animais durante os treinos e o Probe trial. As imagens foram construídas pelo
programa Any-maze (Quadro 1).
73
Quadro 1 – Imagem do percurso realizado pelos animais durante os dias de treino e o
Probe trial.
Treino Dia 1
Naive Sham CN Tacrina DT1 DT2 DT3 DT4
Treino Dia 2
Naive Sham CN Tacrina DT1 DT2 DT3 DT4
Treino Dia 3
Naive Sham CN Tacrina DT1 DT2 DT3 DT4
Treino Dia 4
Naive Sham CN Tacrina DT1 DT2 DT3 DT4
Treino Dia 5
Naive Sham CN Tacrina DT1 DT2 DT3 DT4
Probe trial
Naive Sham CN Tacrina DT1 DT2 DT3 DT4
74
5.2 Avaliação dos efeitos dos compostos nos modelos bioquímicos ex vivo
5.2.1 Determinação dos níveis de GSH
Na figura 25 estão representados os resultados referente aos efeitos dos
tratamentos sobre os níveis de GSH no hipocampo e córtex cerebral dos animais.
Os níveis de GSH encontrados na região do córtex cerebral não demonstraram
diferenças estatística entre os grupos [F (7, 66) = 0,9942; p = 0,4434] (Figura
25A). Entretanto, no hipocampo, o grupo controle negativo (CN) e tacrina
apresentaram uma diminuição de 36,6 e 36,3%, respectivamente, comparado
com o grupo Naive [F (7, 66) = 40,12; p < 0,0001] (Figura 25B), enquanto os
tratamentos com os dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3 e DT4) produziram
aumento dos níveis de GSH em 19; 29; 29 e 33%, respectivamente, em relação
ao grupo tacrina.
5.2.2 Atividade da superóxido dismutase (SOD)
Na Figura 26 estão expressos os resultados das atividades da enzima SOD
no cérebro dos animais submetidos aos diferentes tratamentos. Os resultados
demonstram que no córtex cerebral não houve diferença estatística entre os
grupos [F (7, 67) = 1,487; p = 0,1869]. Porém, no hipocampo os grupos CN,
tacrina e DT1 tiveram um aumento de 28; 28,9 e 27%, respectivamente, da
atividade da enzima, comparados com o grupo de animais normais, Naive. Os
grupos tratados com DT2, DT3 e DT4 apresentaram uma diminuição de 30,4;
33,1 e 33,7%, respectivamente, comparados com o grupo tacrina [F (7, 52) =
26,09; p < 0,0001].
75
Figura 25 – Efeito dos tratamentos sobre os níveis de GSH no córtex e hipocampo dos
animais
C ó r te x
GS
H (
g/m
g d
e t
ec
ido
)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
2 0
4 0
6 0
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
A
H ip o c a m p o
GS
H (
g/m
g d
e t
ec
ido
)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
2 0
4 0
6 0
8 0
***
**** ********
****
****
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
B
As barras indicam a média ± d.p. dos níveis de GSH, em µg / mg de tecido, dos grupos
Naive, Sham, Controle Negativo (CN), tacrina e dos dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3
e DT4). Painel A: análise do córtex; Painel B: análise do hipocampo. Asteriscos indicam
diferença significativa comparadas com o grupo CN (*** p < 0,001 e **** p < 0,0001,
ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste post hoc de Tukey).
76
Figura 26 – Efeito dos tratamentos sobre a atividade da SOD no córtex e no hipocampo
dos animais.
C ó r te xS
OD
(U
/mg
pr
ote
ína
)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0 .0 0 0
0 .0 0 1
0 .0 0 2
0 .0 0 3
0 .0 0 4
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
A
H ip o c a m p o
SO
D (
U/m
g p
ro
teín
a)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0 .0 0 0
0 .0 0 1
0 .0 0 2
0 .0 0 3
0 .0 0 4
********
**** **** ****
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
B
As barras indicam a média ± d.p. da atividade da superóxido dismutase (SOD), em µg /
mg de tecido, dos grupos Naive, Sham, Controle Negativo (CN), tacrina e dos dímeros da
tacrina (DT1, DT2, DT3 e DT4). Painel A: análise do córtex; Painel B: análise do
hipocampo. Asteriscos indicam diferença significativa comparadas com o grupo CN
(**** p < 0,0001, ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste post hoc de
Tukey).
5.2.3 Determinação de hidroperóxidos lipídicos (LOOH)
Devido a injeção do peptídeo Aβ1-42 ter sido na região no hipocampo e as
análises anteriores mostrarem que não houve alterações bioquímicas no córtex,
as próximas análises seguirão apenas no hipocampo.
77
Os níveis de LOOH estão apresentados na Figura 27. Os grupos CN,
tacrina, DT1, DT2 e DT3 tiveram aumento de 68,2; 66,8; 68,7; 72,5 e 72,2%,
respectivamente em relação aos animais normais. Enquanto o dímero DT4
apresentou níveis 71,2% menores que o grupo tacrina [F (7,58) = 25,47 p <
0,0001]
Figura 27 – Efeito dos tratamentos sobre os níveis de LOOH no hipocampo dos animais.
LO
OH
(
mo
l/m
g d
e t
ec
ido
)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
1 0
2 0
3 0
**** ********
H ip o c a m p o
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
As barras indicam a média ± d.p. de hidroperóxidos lipídicos em µmol / mg de tecido, do
hipocampo dos grupos Naive, Sham, Controle Negativo (CN), tacrina e dos dímeros da
tacrina (DT1, DT2, DT3 e DT4). Asteriscos indicam diferença significativa comparadas
com o grupo CN (**** p < 0,0001, ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste
post hoc de Tukey).
5.2.4 Atividade da mieloperoxidase (MPO)
A atividade da MPO está apresentada na Figura 28. No hipocampo, o CN e
a tacrina aumentaram em 34,4 e 26,9% a atividade da enzima em relação aos
animais normais, Naive. Enquanto os dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3 e
DT4), tiveram uma diminuição de 25,7; 31,1; 33,7 e 26,8% em ralação ao grupo
tacrina [F (7, 58) = 8,100; p < 0,0001].
78
Figura 28 – Efeito dos tratamentos sobre os atividade da MPO no hipocampo dos animais.
H ip o c a m p oM
PO
(m
D.O
./m
g p
ro
teín
a)
N a iv e S h a m C N T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0 .0 0 0 0
0 .0 0 0 5
0 .0 0 1 0
0 .0 0 1 5
***** *** **
***
(A 1 -42 , 4 0 0 p m o l/a n im a l, i .c .v .)
( 5 0 m o l/k g , v .o .)
As barras indicam a média ± d.p. da atividade da mieloperoxidase (MPO), em mD.O. /
mg de proteína, dos grupos Naive, Sham, Controle Negativo (CN), tacrina e dos dímeros
da Tacrina (DT1, DT2, DT3 e DT4). Painel A: análise do córtex; Painel B: análise do
hipocampo. Asteriscos indicam diferença significativa comparadas com o grupo CN (* p
< 0,05; ** p < 0,01 e *** p < 0,001, ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste
post hoc de Tukey).
5.3 Avaliação do efeito dos compostos sobre o sistema hepático dos animais
5.3.1 Quantificação das transaminases AST e ALT
Para determinar se a tacrina, assim como os dímeros da mesma exibiam
algum efeito no sistema hepático, foi quantificado os níveis de AST e ALT no
sangue dos animais após quinze dias de tratamento. A tacrina, o DT1 e o DT3
produziram um aumento significativo de AST comparado com Sham e CN [F (7,
114) = 4,003; P < 0,001, Figura 29]. Por outro lado, não houve nenhuma alteração
nos níveis de ALT em nenhum dos tratamentos.
79
Figura 29 – Efeito dos compostos e da tacrina sobre os níveis das transaminases AST e
ALT em animais com tratamento subcrônico
U/L
A S T A L T
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
N aive
S ham
C N
T acrina
D T 1
D T 2
D T 3
D T 4
** **
*
As colunas representam a média ± d.p. dos níveis de ALT e AST, em U / L, dos grupos
Naive, Sham, Controle Negativo (CN), tacrina, DT1, DT2, DT3 e DT4. Asteriscos
indicam diferença significativa de grupos comparados com Sham e CN (* p < 0,05 e ** p
< 0,01, ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste post hoc de Tukey).
5.3.2 Análise histopatológica
A análise histopatológica do fígado dos animais está representada na Figura
30. É visível que o grupo Naive e Sham, não apresentam sinais histológicos de
hepatotoxicidade (Figura 30A e 30B). O grupo CN apresenta alterações mínimas
(Figura 30C). Enquanto o grupo tacrina (Figura 30D) apresenta perda de limites
celulares com ruptura de membranas, contração do núcleo e regiões de
degeneração dos hepatócitos. Os mesmos parâmetros são observados no grupo
DT1 (Figura 30E). O grupo DT2 (Figura 30F) apresenta perda de limites
celulares com ruptura de membranas e contração do núcleo. O grupo DT3
(Figura 30G) apresentou além de degeneração e ruptura de membranas, acúmulo
de glicogênio nos hepatócitos. O grupo DT4 (Figura 30H) apresentou menor
sinal de hepatotoxicidade, apenas com algumas áreas de ruptura de membranas
e contração do núcleo.
80
Figura 30 – Observações histopatológicas do fígado dos animas.
Cada figura representa um grupo, sendo: A – Naive; B – Sham; C – CN; D – tacrina; E –
DT1; F – DT2; G – DT3 e H – DT4. Seta preta: perda de limites celulares com ruptura de
membranas. Seta verde: contração do núcleo. Seta azul: acúmulo de glicogênio.
Retângulo: regiões de degeneração dos hepatócitos. Aumento de 400x e coloração HE.
81
5.4 Avaliação da viabilidade celular
Na Figura 31 é apresentada a porcentagem de viabilidade celular de células
hepáticas da linhagem HepG2 tratadas com os dímeros da tacrina (DT1, DT2,
DT3 e DT4) e a tacrina na dose de 300 µM. As células tratadas com os dímeros
apresentaram comportamento de crescimento celular, sendo não tóxico, ao
contrário da tacrina que apresentou em média apenas 40% de viabilidade celular,
confirmando sua citotoxicidade semelhante ao controle positivo DMSO, com
viabilidade celular média de 22%.
Figura 31 – Viabilidade celular de células hepáticas da linhagem HepG2
Via
bil
ida
de
ce
lula
r (
%)
B a s a l D M S O T a c r in a D T 1 D T 2 D T 3 D T 4
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
300 M
**
# #
#
# #
# # #
As colunas representam a média ± d.p. da porcentagem de células viáveis no ensaio do
MTT. Asteriscos indicam diferença significativa de grupos comparados com o grupo
Basal (** p < 0,01; ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste post hoc de
Tukey) e cerquilhas indicam diferença significativa comparados com o grupo tacrina (# p
< 0,05; ## p < 0,01 e ### p < 0,001; ANOVA de múltiplas comparações seguido do teste
post hoc de Tukey.
82
83
6 DISCUSSÃO
O envelhecimento tem se tornado um dos maiores desafios do século XXI.
Com as crescentes melhoras na medicina moderna, a expectativa de vida humana
aumenta a cada dia, e por isso a prevalência de doenças cujo fator de risco é a
idade avançada também tem aumentado nos últimos tempos, destacando-se entre
elas a DA (MASTERS; MORRIS; ROE, 2015). Descrita em 1907 por Alois
Alzheimer, a DA é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por um
comprometimento inicial do sistema colinérgico, o que leva a um quadro clínico
de perda progressiva da memória e das demais funções cognitivas (JARVIK;
GREENSON, 1987).
Geralmente, a primeira estrutura cerebral atingida pela DA é o hipocampo,
o qual desempenha papel-chave nos processos de memória recente.
Posteriormente, com a progressão da doença outras estruturas cerebrais são
afetadas levando aos sintomas da demência, além de manifestações
neuropsiquiátricas como a depressão, ansiedade e a esquizofrenia. Como já
reportado anteriormente, a DA é a principal causa de demências em indivíduos
de meia-idade e idosos (IQBAL; LIU; GONG, 2016).
De acordo com a OMS, estima-se que em 2020, cerca de 30 milhões de
pessoas sejam afetadas com DA. Milhões de dólares tem sido gastos
mundialmente em estudos para determinar o porquê de certas pessoas
desenvolverem a DA e, como tratá-las adequadamente. Porém, ainda não existe
terapia efetiva que previna ou cure a doença (WIMO et al., 2016). Os dados a
respeito da incidência da DA no Brasil são quase inexistentes, entretanto, estima-
se que um milhão de pessoas sofram desta doença no país. (FALCO et al., 2016).
Há uma estimativa de gasto total mundial com demência, com base em uma
população de 34,4 milhões de pessoas com este mal, onde 422 milhões de dólares
foram destinados para os gastos com doença em 2009. Porém, há falta de
informações sobre os custos diretos com DA no Brasil (GUTIERREZ et al.,
2014). Desta forma, o estudo de novos alvos terapêuticos para o tratamento da
doença, bem como, desvendar os processos patogênicos envolvidos no seu
surgimento torna-se uma necessidade.
A administração central do peptídeo Aβ1-42 em animais de laboratório vem
mostrando ser um modelo bastante útil para o estudo da DA e possíveis novas
intervenções neuroprotetoras (McLARNON; RUY, 2008, BALDUCCI;
FORLONI, 2014). O modelo mimetiza a formação do principal achado
histológico da DA, a sua deposição extracelular, formando as placas neuríticas,
84
que juntamente com eventos ligados a hiperfosforilação da Tau culminam no
aparecimento da excitotoxidade, estresse oxidativo e apoptose neuronal
(BALLARD et al., 2016). Este modelo vem sido utilizado para estudos de
substâncias antialzheimer como demonstrado por vários autores ao longo dos
anos. No presente estudo, foi demonstrado que a infusão i.c.v. do peptídeo Aβ1-
42 em camundongos swiss causou prejuízos na memória, estresse oxidativo e
neuroinflamação no hipocampo dos animais, corroborando e, complementando
estudos prévios, como os de Mishra et al., (2013), Fu et al., (2014), Chang et al.,
(2014), Chen et al., (2015), Jiang et al., (2015), Yu et al., (2015) e Shen et al.,
(2016) os quais encontraram resultados similares.
Alguns medicamentos aprovados para o tratamento da DA são inibidores
da enzima acetilcolinesterase (AChE), como a tacrina, rivastigmina, donezepil e
galantamina. Tais medicamentos produzem efeito através da inibição da enzima
que hidrolisa a ACh, aumentando os níveis cerebrais da mesma (BACHURIN;
BOVINA; USTYUGOV, 2017). Entretanto, estes fármacos apresentam uma
terapêutica paliativa e limitada porque apenas melhoram os déficits de memória
no estágio inicial da doença, mas não interrompem o processo
neurodegenerativo. Outros fatores relevantes são as respostas positivas ao
tratamento, que dependem da integridade dos neurônios pré-sinápticos, além da
série de efeitos adversos provenientes do aumento dos níveis de ACh periférico
e centrais tais como: distúrbios gastrointestinais (vômitos, náuseas, cólicas
abdominais, diarreia e anorexia), hipotensão, bradicardia, dores de cabeça,
cãibras, disfunção hepática, etc. (GARCÍA-LÓPEZ; GUARDADO-
SANTERVÁS, 2001). Para alguns pacientes, os efeitos adversos muitas vezes
são tão intensos levando-os a não adesão ao tratamento.
Como reportado anteriormente, a tacrina foi aprovada pela FDA em 1993
como o primeiro medicamento para tratar a DA, sendo um inibidor
colinesterásico. É descrito na literatura, que o tratamento com a tacrina além de
melhorar a habilidade cognitiva, tem como efeito colateral central, disfunções
motoras extrapiramidais, conhecida como Parkinsonismo, que pode ser
exacerbada pela estimulação colinérgica e aliviada com antagonismo
muscarínico (CARRIERO et al., 1997). Devido sobretudo a sua
hepatotoxicidade, a tacrina foi retirada do mercado. Entretanto, com a introdução
da tacrina na terapêutica da doença, novos alvos de pesquisa na área da química
medicinal foram surgindo. Híbridos da tacrina têm sido desenhados como
inibidores de colinesterases e de agregação amiloide. Estas moléculas podem
85
atuar como inibidores bivalentes de AChE, além de ter uma importante função
de neuroproteção contra estresse oxidativo (AQUINO et al., 2013).
Um dos objetivos desse estudo foi avaliar o comportamento locomotor dos
animais tratados com a tacrina e os dímeros em estudo, uma vez que a tacrina
pode apresentar a disfunções motoras extrapiramidais (CARRIERO et al., 1997).
Para isso, utilizou-se o teste do Campo Aberto para avaliar os níveis de atividade
locomotora e exploratória dos roedores. O teste do Campo Aberto é uma
ferramenta útil para avaliar o comprometimento locomotor em animais com
doenças neuromusculares e/ou, se os compostos administrados podem afetar
outros sistemas (TATEM et al., 2014). Os resultados do presente estudo
demonstraram que o tratamento com a tacrina e o dímero DT4 promoveu uma
redução da atividade locomotora de camundongos avaliada no teste do Campo
Aberto. Corroborando com nossos resultados, alguns pesquisadores também
encontraram redução dose-dependente da atividade locomotora em roedores
tratados com tacrina em única administração (CARRIERO et al., 1997; PAN et
al., 2006; PAN et al., 2011a; PAN et al., 2011b).
O principal objetivo do estudo foi avaliar o efeito dos dímeros da tacrina
sobre a memória de camundongos com DA induzida pelo peptídeo Aβ1-42.
Segundo Izquierdo (2011), a memória é a capacidade de adquirir, armazenar e
recuperar informações. Trata-se de um processo biológico de fundamental
importância para o indivíduo, e está presente em praticamente todo o reino
animal independente da arquitetura cerebral que o mesmo apresenta
(IZQUIERDO, 2011). Algumas desordens neuropsiquiátricas, como a DA,
podem afetar algumas formas de memória, deixando outras intactas (AU et al.,
2016, SHRESTHA; KLANN, 2016). E, estes diferentes tipos de memória podem
ser avaliados em animais em diferentes tarefas comportamentais utilizadas em
laboratórios (SHRESTHA; KLANN, 2016, AMOAH et al., 2015).
Para entender melhor como cada tarefa funciona, é importante compreender
que a memória é classificada em diferentes formas. Uma forma é a memória
explícita, onde o indivíduo tem a habilidade de lembrar ou reconhecer
conscientemente informações processadas recentemente e em longo prazo. Esta
memória também é conhecida como memória declarativa (COHEN; SQUIRE,
1980) e pode ser caracterizada como episódica (conhecimentos relacionados ao
contexto do indivíduo, por exemplo, lembrar-se da festa de seu casamento) e
semântica (conhecimentos gerais como idiomas, fatos históricos). Este tipo de
memória (declarativa) está sob o controle do hipocampo e conexões do lobo
temporal, regiões essenciais para a formação de novas memórias episódicas. É
86
justamente esse o tipo de memória que está altamente prejudicada em pacientes
com DA e é usualmente um dos primeiros sintomas de demência (MACHADO
et al., 2009).
Em relação a memória declarativa em humanos, especialmente a memória
episódica e não a semântica, é mediada primeiramente por receptores
muscarínicos (M1). Há poucos estudos relatando o envolvimento dos receptores
nicotínicos e parece que esses receptores são pouco relevantes nesse tipo de
memória. O teste de memória de reconhecimento, avaliada no teste de
reconhecimento de objetos, também avalia a memória declarativa em animais.
Em contraste com os estudos em humanos, a investigação da memória
declarativa em roedores parece ser mediada por receptores nicotínicos (KUTLU;
GOULD, 2016), ao invés dos receptores muscarínicos. Pode ser que essa
diferença entre humanos e roedores quanto ao recrutamento bioquímico dos tipos
de receptores colinérgicos no processo de cognição seja uma consequência das
restrições éticas de estudos em humanos para buscar o subtipo específico de
ligante nos testes de memória (GRAEF et al., 2011).
Como já reportado, em pacientes com DA, a memória episódica é um dos
primeiros sinais de declínio cognitivo (SMALL et al., 2003). Então a avaliação
de possíveis alvos farmacológicos na terapêutica da DA sobre esse tipo de
memória é de fundamental importância. O teste de Reconhecimento de Objetos
fornece a base experimental para o estudo de uma ampla gama de processos
cognitivos e neuropsicológicos em ratos e camundongos. O modelo envolve
vários protocolos experimentais. Num teste de reconhecimento de objetos de
apenas uma tentativa, os animais são expostos a dois objetos diferentes onde
devem identificar como novo ou familiar baseado na memória de uma
experiência recente com um dos objetos. A memória envolvida nesse tipo de
reconhecimento é a memória declarativa episódica, que é suscetível a alterações
e perda rápida (DERE; HUSTON; DE SOUZA SILVA, 2005).
O reconhecimento de um objeto experimental envolve a memória do objeto
familiar, e a detecção e processamento da memória de um novo objeto
(ENNACEUR, 2010). Para o teste de reconhecimento de objetos algumas áreas
cerebrais como hipocampo, lobo temporal, córtex pré-frontal e córtex pré-
límbico, estão envolvidas no processamento de memórias de curta e longa
duração, declarativa e não-associativa (KIM et al., 2014; PEZZE et al., 2015;
CHAO et al., 2016; KESNER et al., 2016). Acredita-se que a formação de
memórias e o aprendizado envolvam alterações na atividade neural, através de
eventos plásticos que modificam a comunicação entre os neurônios. Estes
87
eventos plásticos podem incluir alterações na estrutura, na distribuição, no
número de sinapses e também resultar em alterações morfológicas (RUSAKOV
et al., 1997; GEINISMAN, 2000).
O paradigma de reconhecimento de objetos de apenas uma tentativa provou
ser uma ferramenta útil na pesquisa de memória neurobiológica tanto em ratos
quanto em camundongos. Desde sua introdução em 1985 por John P. Aggleton,
o potencial desse paradigma para abordar questões críticas sobre a neurobiologia
da aprendizagem e da memória é cada vez mais aceito (DERE et al., 2007). No
presente estudo, os animais com DA induzida pelo peptídeo Aβ1-42 tratados
apenas com veículo (grupo CN) apresentaram um baixo índice de
reconhecimento do objeto familiar comparado com animais normais, ou seja,
teve um índice de reconhecimento cerca de 29% menor. Por outro lado, o
tratamento com a tacrina e os dímeros da tacrina reverteram o efeito amnésico
do peptídeo, com aumento no índice de reconhecimento, passando a explorar
mais o novo objeto, sendo que o composto DT3 teve o maior aumento em relação
ao grupo CN. Também no presente estudo, o tipo de memória avaliada foi a de
longa duração, onde o objeto novo foi apresentado 24h após o primeiro objeto.
Apesar da memória episódica se erradicar rapidamente, mantendo apenas
informações específicas do episódio, os animais mantiveram um índice de
reconhecimento estatisticamente significante. De acordo com os achados
científicos referentes a consolidação das memórias, o hipocampo armazena
experiências por um curto período de tempo antes da informação ser transferida
para o armazenamento prolongado no córtex (WILTGEN et al., 2004;
FRANKLAND; BONTEMPI, 2005). Tem sido demonstrado que a tacrina
aumenta a liberação de ACh tanto no córtex quanto no hipocampo no teste de
reconhecimento de objetos (SCALI et al., 1997), desta forma pode-se sugerir que
os dímeros da tacrina avaliados no presente estudo possam atuar de forma
semelhante em relação a liberação de ACh nas regiões cerebrais envolvidas.
Outra forma de memória é a memória implícita, também conhecida como
memória não-declarativa. Este tipo de memória permite ao indivíduo ter a
capacidade de melhorar o desempenho de tarefas. Ela reflete no efeito
inconsciente de experiências anteriores, envolvendo o reconhecimento
inconsciente de um objeto ou a conclusão correta dos passos de uma tarefa
(memória procedural) (SQUIRE, 1987). Tem sido considerada que essa memória
procedural permanece relativamente preservada durante o curso da DA, mas há
controvérsias quanto a essa informação (SHRESTHA; KLANN, 2016). A
memória implícita é preservada sem interferência da memória explícita. No
88
início da doença os pacientes com DA são capazes de aprender tarefas sem
consciência simplesmente por exposição repetida, embora seus desempenhos não
atinjam níveis normais (MACHADO et al., 2009, SHRESTHA; KLANN, 2016).
Sobre a memória não-declarativa, Milner, Squire e Kandel (1998)
definiram-na como um aprendizado emocional. A memória relacionada ao
estímulo aversivo é um tipo de memória que envolve mecanismos de
condicionamento de medo. Nesse caso, um indivíduo é treinado a prever um
evento aversivo. A memória aversiva possui geralmente uma fase condicionada,
com um estímulo neutro ou contextual e uma fase não condicionada, com
estímulo aversivo, onde é gerada uma resposta de medo ou resposta
condicionada. O medo condicionado faz parte do condicionamento clássico,
conhecido como condicionamento Pavloviano (FRENDT; FANSELOW, 1999;
LEDOUX, 2000; MAREN, 2001).
No presente estudo os animais que receberam o peptídeo Aβ1-42 via i.c.v. no
hipocampo (grupo CN), tiveram um déficit cognitivo de 56% da memória
aversiva em relação aos animais normais, mensurado como latência de descida
da plataforma no teste da Esquiva Inibitória, que tem como estímulo aversivo o
choque nas patas ao descer da plataforma (IZQUIERDO, MEDINA, 1997).
Também foi verificado que os tratamentos com a tacrina e os dímeros da tacrina
reverteram esse efeito, sendo que o tratamento dos animais com dímero DT2 foi
o que apresentou melhor desempenho na tarefa da esquiva inibitoria, com
aumento de 53% na latência de descida da plataforma.
Há poucos estudos sobre o impacto dos receptores colinérgicos no
aprendizado não-declarativo em humanos, e no geral, os resultados sugerem que
os mecanismos colinérgicos, em especial os receptores muscarínicos, pouco
estão envolvidos nesse tipo de aprendizado (GRAEF et al., 2011). Há estudos
mostrando que o peptídeo Aβ1-42 causa prejuízo cognitivo avaliado no teste da
Esquiva Inibitória (SHEN et al., 2016), assim como há estudos mostrando o
efeito positivo de inibidores colinesterásicos no mesmo teste (JAFARI;
ZARRINDAST; DJAHANGUIRI, 2006). Porém, ainda não há a correlação dos
três fatores: indução de DA com Aβ1-42, tratamento com inibidores
colinesterásicos e avaliação de memória no teste da Esquiva Inibitória. Os
resultados do presente estudo demonstraram então que animais submetidos ao
modelo de Alzheimer com Aβ1-42 avaliados no teste da esquiva inibitória e
tratados com agentes conhecidamente anticolinesterásicos tiveram reversão dos
déficits cognitivos. Ainda não se pode sugerir o mecanismo pelo qual esses
compostos atuaram na memória aversiva dos animais, mas é provável que o
89
sistema colinérgico esteja envolvido, uma vez que todos os compostos avaliados
exibem atividade inibitória da AChE como demonstrado por Aquino e
colaboradores (2013).
Em roedores, testes de labirintos, como o LAM, são aplicados para
investigar a memória espacial de referência. Estes testes também são descritos
como meios experimentais para mensurar tanto a memória de trabalho, como a
memória de referência (declarativa) (BARNHART; YANG; LEIN, 2015).
A memória de trabalho é uma memória de curto prazo, que uma vez usada,
não é mais utilizada pelo SNC. Trata-se de uma memória “on line” sem traços
bioquímicos detectáveis (BHARADWAJ et al., 2015). Essa memória pode ser
distinguida da memória de referência (uma associação de longo prazo entre
estímulos ou um estímulo e uma resposta) pela sua transitoriedade. E, há
evidências que sugerem que as duas dependem de diferentes sistemas cerebrais.
A memória de referência é uma memória que é tipicamente adquirida com treinos
repetidos, e pode persistir por dias a meses. A memória de trabalho pode ser
definida como um tipo de memória de curto prazo por estímulos ou localização
espacial (DUDCHENKO, 2004). No caso do LAM, modelo espacial de memória
utilizado no presente estudo, a memória espacial está relacionada à memória de
referência. A metodologia que se utilizou nesse estudo há repetições diárias
(treinos), neste caso, a memória de referência é que está sendo trabalhada. É uma
característica padrão do LAM fazer o Probe trial em que a plataforma é
removida. Se o animal aprendeu a localização da plataforma, deve mostrar uma
preferência para o quadrante em que a plataforma foi localizada e, até mesmo
para o local onde a plataforma estava dentro do quadrante alvo. Se o Probe trial
é feito pouco depois do último teste de plataforma, surge a questão de saber se o
desempenho do animal reflete memória de referência ou uma mistura de
referência e memória de trabalho, porque o animal poderia estar usando seu
recall de curto prazo do último treinamento. No presente estudo, o Probe trial
foi aplicado 24h depois do último teste com a plataforma, avaliando então, a
memória de referência.
Há pelo menos dois tipos distintos de orientação para navegação. A
distinção é feita entre orientação alocêntrica e egocêntrica. A alocêntrica refere-
se à navegação espacial, é caracterizada pela habilidade de navegar utilizando
pistas distais – ou seja, pistas localizadas fora e de uma certa distância do
indivíduo. Já a egocêntrica é caracterizada pela habilidade de navegar usando
pistas internas (ex: movimentos límbicos, como movimentos e direção)
(VORHEES; WILLIAMS, 2014). As principais regiões cruciais para a
90
orientação alocêntrica são mediadas pelo hipocampo e córtex entorrinal. O
hipocampo tem sido identificado como estrutura chave para formação de mapas
cognitivos (O’KEEFE; NADAL, 1978). A mesma estrutura que dá informação
espacial em roedores está envolvida na memória semântica e episódica em
humanos. A memória semântica, que é sobre fatos e lugares, é tida por ser uma
extensão do sistema que processa a localização espacial em roedores, que é
testada como memória e aprendizado alocêntrico (BUZSAKI; MOSER, 2013), é
o caso do modelo que se utilizou nesse estudo, onde os animais tinham pistas
distais, treinados para achar a plataforma com orientação alocêntrica. Ao longo
dos dias de treinamento todos os grupos, além do CN, diminuíram o tempo de
latência para achar a plataforma, como pode ser visualizado através dos
resultados apresentados na Tabela 3. O resultado obtido com o grupo CN indica
que o peptídeo Aβ1-42 causou prejuízo na memória espacial nos camundongos, e,
os tratamentos com a tacrina e os dímeros da tacrina conseguiram reverter o
declínio cognitivos dos animais. A partir do terceiro dia de treinamento é que
visualizamos a diferença entre os grupos. No terceiro dia o DT4 apresenta melhor
performance em relação aos outros dímeros, resultado que se mantem no
resultado do Probe trial, em que o DT4 teve melhor resultado dentre os dímeros.
No quarto dia de treinamento, o DT1 comporta-se melhor apesar do quinto dia
ele ter sido o pior entre os grupos tratados. Esse resultado não descarta sua
eficiência quando analisado no Probe trial, onde ainda foi significativamente
melhor que o grupo CN. No quinto e, último dia de treino, o DT3 apresentou
melhor tempo de latência de escape que os outros grupos, não sendo melhor
apenas que o grupo tacrina. Seu desempenho melhorou em 37% em relação ao
dia anterior, porém no Probe trial, foi o composto que teve pior performance,
apesar de ter sido significativamente melhor que o grupo CN. A diferença de
resultado entre os dímeros é pouca, pois os mesmos conseguiram aprender a
localização da plataforma de forma eficiente, o que gera um resultado promissor
quanto ao tipo de memória conservada.
O primeiro parâmetro analisado no LAM é a latência de escape, que é o
tempo que o animal leva para achar a plataforma. No entanto, esse parâmetro
pode ser confundido com a velocidade de natação, o que não é necessariamente
um fator de cognição, já a distância nadada entre o ponto de origem e a
plataforma é um parâmetro mais próximo relacionado ao aprendizado espacial
(SINGH; KAUR; SANDHIR, 2015). Como neste estudo os animais eram da
mesma espécie e da mesma idade, a velocidade de natação de cada um dos
indivíduos foi observada como sendo uma quantidade constante e a distância
91
percorrida foi proporcional ao tempo tomado, como é evidente a partir da latência
de escape e da distância percorrida (Figura 23). Nesse estudo, não houve
diferença estatística entre os grupos em relação à velocidade média nadada e a
distância total percorrida durante o Probe trial, um importante parâmetro para
descartar dúvidas quanto a possível interferência causada pela alteração motora
observada no teste do Campo Aberto.
Outro objetivo do presente estudo foi avaliar o envolvimento do estresse
oxidativo cerebral dos camundongos com DA induzida por Aβ1-42, e o possível
efeito dos dímeros da tacrina nesse sistema.
Como mencionado anteriormente o peptídeo Aβ1-42 induz estresse oxidativo
em níveis intracelulares pela interação com a bicamada lipídica que libera
radicais livres, causando uma perda da homeostase cerebral (SÖLLVANDER et
al., 2016). Como a indução do peptídeo foi realizada no hipocampo, decidiu-se
realizar as análises bioquímicas em diferentes estruturas cerebrais: córtex e
hipocampo. Nas análises realizadas no presente estudo, o efeito dos tratamentos
não alterou os níveis bioquímicos estudados no córtex. Entretanto avaliando o
hipocampo, os animais com DA induzida apresentaram um resultado diferente
dos animais normais (Naive).
A GSH é o maior antioxidante endógeno que tem função fundamental na
desintoxicação das EROs e na regulação do estado redox intracelular. Vários
estudos in vivo e in vitro evidenciaram o papel do GSH contra uma variedade de
formas de estresse oxidativo. Abramov, Canevari e Duchen (2003) demostraram
a neurotoxicidade do Aβ1-42 em neurônios e astrócitos, que pode ser devido a
depleção de GSH, o que reforça a hipótese de que a patologia da DA está
associada com os desníveis de GSH, e que a presença dessa enzima é
neuroprotetora e diminui a oxidação causada pelo peptídeo (MARK et al., 1997).
Foi o que se evidenciou nos experimentos deste estudo os quais determinaram os
níveis de GSH no cérebro dos camundongos. No córtex cerebral não houve
nenhuma alteração entre os grupos, resultado também encontrado em outro
estudo que utilizou o modelo do Aβ1-42 (MAO et al., 2015). Já no hipocampo, os
animais do grupo CN e tacrina, apresentaram níveis de GSH significativamente
menores que os animais normais. Enquanto o tratamento com os dímeros da
tacrina reverteram esse efeito de maneira significativa. Comparando os dímeros
entre si, o mais eficiente foi o DT4 (com melhora de 33%), seguido de DT3 e
DT2 que foram igualmente eficazes (29%), e por último o DT1, com apenas 19%
de diferença. Hu e colaboradores (2012), também demonstraram diminuição do
GSH no hipocampo de animais que receberam Aβ1-42. Porém, não há na literatura
92
estudos com dímeros da tacrina sobre o sistema oxidativo in vivo. O que
evidenciamos é que de fato a tacrina não tem efeito sobre o sistema antioxidante
da glutationa, porém, os dímeros tiveram capacidade de aumentar as defesas do
sistema contra a oxidação causada pelo Aβ1-42. Em relação aos compostos,
observamos que quanto maior a rigidez da molécula (DT1 < DT2 < DT3 < DT4),
maior é a sua capacidade de aumentar os níveis de GSH. Porém, o mecanismo
pelo qual isso ocorre ainda é obscuro.
Outra enzima antioxidante importante que catalisa a conversão de radicais
superóxidos em peróxido de hidrogênio é a SOD. Há fortes evidências
estabelecendo a relação entre SOD e DA. A contribuição da enzima na patologia
é bastante controversa. Alguns estudos reportam que a SOD está reduzida no
córtex, hipocampo e cerebelo em pacientes com DA (RICHARDSON, 1993),
outros demonstram que há elevação da atividade da enzima (MARKLUND et
al., 1985). E ainda, outras pesquisas sugerem que não há mudanças nos níveis da
SOD em cérebros com DA (GSELL et al., 1995). Estudos mais recentes sugerem
que a enzima esteja com sua atividade diminuída na presença de marcadores da
DA (HU et al., 2012; MAO et al., 2015). Porém, o que encontramos no presente
estudo, é que não houve alterações na atividade da SOD na região cortical dos
animais. No entanto, no hipocampo ocorreu uma elevação na atividade da enzima
nos grupos CN, tacrina e DT1 de 28, 28,9 e 27%, respectivamente. Em relação a
atividade da SOD dos animais normais (Naive) indicando que o modelo utilizado
neste trabalho (Aβ1-42) gera mais ânion superóxido, fazendo com que a enzima
SOD esteja mais ativa nessa região, sendo que nem a tacrina e nem o dímero
DT1 conseguiram reverter esse efeito. Os grupos tratados com dímeros DT2,
DT3 e DT4 apresentaram uma diminuição da atividade da SOD em 30,4; 33,1 e
33,7% comparando com o grupo tacrina, mostrando que esses compostos atuam
como possíveis neuroprotetores.
Apesar do dímero DT1 ter apresentado níveis de GSH significativamente
maiores que o grupo CN, foi o grupo com menor aumento, o que corrobora com
o resultado encontrado na SOD, onde esse grupo permaneceu com a atividade
enzimática elevada tanto quanto o CN e a tacrina. Os dados se complementam
pelo fato de quanto maior a atividade da SOD, maior a produção de H2O2, e
assim, maior consumo de GSH no sistema da glutationa, apresentando níveis
baixos nas análises realizadas.
Continuando com a avaliação do sistema oxidante determinou-se, o nível
da mieloperoxidase (MPO). A MPO é associada à eventos inflamatórios, quando
liberada pelos neutrófilos migratórios. No cérebro humano, a MPO está presente
93
na micróglia, o macrófago residente do cérebro (JOLIVALT et al., 1996).
Atualmente, a MPO está relacionada a doenças neurodegenerativas nas quais
estão associados na patogênese dos mesmos processos inflamatórios, estresse
oxidativo e apoptose (RAY; KATYAL, 2016). Além disso, dados demonstram
que há co-localização da MPO com placas β-amiloides ao redor de neurônios
granulares e piramidais do hipocampo em cérebro de pacientes com DA,
indicando sua eventual contribuição para a patologia da doença (GREEN et al.,
2004). Os resultados desse estudo demonstraram que os níveis de MPO
encontraram-se aumentados no hipocampo dos camundongos dos grupos CN
(25,6%) e tacrina (21,2%) em relação aos animais normais, o que indica que a
tacrina não age na redução da neuroinflamação desencadeada pelo MPO.
Enquanto os tratamentos com os dímeros da tacrina (DT1, DT2, DT3 e DT4)
apresentaram uma redução nos níveis da enzima de 25,7; 31,1; 33,7 e 26,8%,
respectivamente. Nesse caso, o DT3 foi o que apresentou maior diferença nos
níveis de MPO em relação a tacrina, seguido do DT2, DT4 e DT1. Não há
correlação estrutural das moléculas com a atividade enzimática, sendo que todas
foram efetivas em diminuir os níveis de MPO. Podemos sugerir que os dímeros
da tacrina em estudo são eficientes em diminuir os níveis de neuroinflamação
desencadeado pela micróglia na presença de Aβ1-42.
A lipoperoxidação inicia-se pela captação de radicais livres. A oxigenação
da bicamada lipídica inicia uma reação em cadeia autoperpetuante, conduzindo
à amplificação do evento oxidativo inicial. E na DA a lipoperoxidação está
evidente em todas as fases da doença (BRADLEY-WHITMAN; LOVELL,
2015). O que observamos em nossos experimentos é que o grupo de animais CN
que recebeu peptídeo Aβ1-42 apresentaram aumento de hidroperóxidos lipídicos,
corroborando com os achados de Aguirre-Rueda e colaboradores (2015) que
demonstraram que o peptídeo Aβ1-42 diminui a viabilidade celular, aumenta a
peroxidação lipídica e a apoptose de neurônios. Nossos resultados também
apresentaram aumento dos níveis de LOOH nos grupos tacrina, DT1, DT2 e
DT3. Porém, o dímero DT4 mostrou níveis de hidroperóxidos lipídicos cerca de
70% mais baixo que a tacrina, esse resultado pode ser decorrente do
envolvimento do dímero com os astrócitos, já que os autores anteriormente
citados indicaram que os astrócitos protegem os neurônios provavelmente por
um aumento na biogênese mitocondrial, obtendo melhor proteção contra o
estresse oxidativo e talvez produzindo controle do processo inflamatório
(AGUIRRE-RUEDA et al., 2015). Os dímeros DT2 e DT3 atuaram
positivamente no sistema oxidativo provavelmente por outros mecanismos que
94
não o dos astrócitos, possivelmente pela atuação direta na enzima superóxido
dismutase.
Embora a tacrina tenha efeitos terapêuticos positivos, é reportado aumento
nos níveis das transaminases em cerca de 30% dos pacientes (WATKINS et al.,
1994). A tacrina induz hepatotoxicidade pela via do citocromo P450 em
microssomas hepáticos humanos e também é associada a disfunção mitocondrial
(SPALDIN et al., 1994), além de induzir aumento de EROs e diminuição de GSH
(OSSENI et al., 1999, EZOULIN et al., 2006). Mas o mecanismo exato para que
isso ocorra, ainda não foi elucidado (PARK et al., 2015). Devido a esse fato, foi
objetivo deste estudo avaliar se os dímeros da tacrina também apresentariam tais
efeitos. A primeira análise realizada foi determinar os níveis das transaminases,
marcadores de lesão hepática no soro dos animais. No presente estudo, a
administração da tacrina, DT1 e DT3 por 15 dias em camundongos, aumentaram
significativamente os níveis séricos da enzima AST em 28,6; 25,9 e 22,2%,
respectivamente, comparando com os animais normais, sem alteração da ALT,
que está presente em grande quantidade no citoplasma de hepatócitos e é
considerado um excelente marcador de dano hepático. A AST é uma enzima
ligada a mitocôndrias e é encontrada em vários tecidos, especialmente no fígado
e no músculo estriado. Além disso, a atividade da AST no soro encontra-se
elevada na presença de necrose no músculo esquelético ou necrose hepática
(CAROBENE et al., 2013). Park e colaboradores (2015) encontraram alterações
tanto em AST quando em ALT em ratos tratados com tacrina na dose de 30
mg/kg, via oral 24h antes das análises. Li e colaboradores (2014) também
encontraram alterações tanto em AST quanto em ALT em camundongos tratados
8h antes com tacrina 30 mg/kg. Apesar de não encontrarmos alterações
significativas nos níveis de ALT, e o parâmetro AST não ser específico para o
fígado, a histologia do fígado mostra alterações importantes que comprovam a
lesão hepática.
É amplamente reportado na literatura que a tacrina em tratamento agudo
induz danos histológicos no fígado, como aumento de regiões degeneradas,
infiltração de células inflamatórias e necrose dos hepatócitos (CHEN et al., 2015;
LI et al., 2014; PARK et al., 2015). No presente estudo foi observado que o
tratamento de 15 dias com a tacrina na dose de 50 µmol/kg via oral, apresentou
danos hepáticos significativos, juntamente com a alteração da AST. Os grupos
tratados com os dímeros DT1 e DT3 também apresentaram lesões histológicas
pronunciadas, porém os dímeros DT2 e DT4 parecem apresentar menos lesões
95
que a tacrina, da mesma forma que esses dímeros não apresentaram alterações
significativas nos níveis das transaminases.
Por fim, para concluir o objetivo de investigar a possível lesão hepática
causada pelos dímeros da tacrina, foi avaliado a citotoxicidade em células de
hepatoma humano. A linhagem celular HepG2 tem sido muito utilizada por
estudos de antimutagenicidade e citotoxicidade. Esta linhagem celular mantém
muitas das funções especializadas normalmente perdidas pelas culturas de
hepatócitos primários, tais como a secreção das principais proteínas plasmáticas,
além de expressar uma grande quantidade de enzimas de Fase I, como o
citocromo P450 (CYP) e de Fase II (MERSCH-SUNDERMANN et al., 2004).
Para determinar a viabilidade celular da linhagem HepG2 frente ao
tratamento com os dímeros da tacrina, foi aplicado o ensaio citotóxico do MTT,
que é um ensaio colorimétrico muito utilizado para triagens iniciais de moléculas
bioativas, pois permite quantificação fácil e rápida de resposta celular. O sal de
tetrazólio MTT (corante amarelo) é metabolizado pela mitocôndria de células
viáveis formando cristais de formazan azuis insolúveis (BAHADAR et al.,
2016).
A tacrina por ser conhecidamente hepatotóxica, tem sido utilizada para
induzir citotoxicidade em células HepG2 como ferramenta de busca de novas
moléculas hepatoprotetora (LEE et al., 2012; PARK et al., 2015). De acordo com
Park e colaboradores (2015) a tacrina tem efeito tóxico a partir de 300 µM em
concentração celular de 5x104. Em nosso experimento, a tacrina apresentou uma
queda da viabilidade celular comparada com o grupo basal, porém, não foi
estatisticamente significativa pois a concentração celular era de 5x105. No
mesmo experimento avaliamos o efeito do tratamento das células com os dímeros
da tacrina na dose de 300 µM, onde não apresentaram efeito citotóxico.
Há a necessidade de maiores investigações para determinar se os dímeros
da tacrina estudados nesse trabalho são realmente hepatotóxicos como indicam
os resultados encontrados na alteração da AST e nas laminas histológica dos
fígados dos animais tratados.
96
97
7 CONCLUSÕES
Este trabalho demonstrou que o peptídeo Aβ1-42 é um modelo animal útil
para o estudo da Doença de Alzheimer. Alterações cognitivas e comportamentais
em três diferentes testes de memórias foram evidenciadas com o tratamento
proposto. Além do peptídeo Aβ1-42 ter causado estresse oxidativo na região
hipocampal do cérebro dos animais.
A tacrina confirmou seu efeito nootrópico na DA nos testes realizados neste
estudo, principalmente no teste LAM, onde foi o composto que apresentou
melhor resultado no último dia de treino e no Pobre trial. Ainda confirmou seu
efeito hepatotóxico pelo aumento da transaminase AST e danos histológicos, e
apresentou seu efeito colateral de alterações locomotoras no teste do campo
aberto.
O dímero DT1 é o composto com maior flexibilidade estrutural dentre os
dímeros estudados, porém foi o composto que apresentou resultados
comportamentais menos promissores, além de apresentar elevados níveis de AST
e lesões histológicas no fígado, e baixo efeito sobre o sistema antioxidante.
O dímero DT2 apresentou melhoras significativas nos testes
comportamentais e cognitivos, sendo o dímero que apresentou o melhor
resultado no teste de memória aversiva (EI). Também apresentou boa atividade
neuroprotetora em relação ao sistema antioxidante. Em relação ao efeito
hepático, o DT2 não apresentou alterações significativas nos níveis das
transaminases, porém, mostrou algumas lesões histológicas no fígado dos
animais.
O dímero DT3 foi o composto que apresentou melhor desempenho no teste
de reconhecimento de objetos e no último dia de treino no LAM, além de ter
apresentado boa atividade sobre o sistema antioxidante avaliado, assim como
também apresentou melhor efeito contra a atividade neuroinflamatória da MPO.
Porém, apresentou níveis significativamente elevados de AST, e alterações
histológicas no fígado, indicando aumento de glicogênio nos hepatócitos.
E o dímero DT4 foi um dos compostos que apresentou melhor performance
nos testes comportamentais de memória avaliados, assim como também
melhorou os níveis antioxidantes cerebrais e apresentou baixos níveis de
hidroperóxidos lipídicos. Não apresentou alterações das transaminases e foi o
composto que apresentou menor lesão histológica no fígado. Seus efeitos
nootrópico e neuroprotetor promissores pode ter sido influenciado pelo fato de
ser um composto estruturalmente mais rígido dentre os estudados, e conter
98
apenas um anel aromático no espaçador. Porém, o DT1 apresentou o mesmo
efeito colateral indesejado de alterações locomotoras da tacrina.
Em relação a citotoxicidade estudada em linhagem de hepatoma humano
(HepG2), nenhum dímero apresentou citotoxicidade, ao contrário da tacrina.
Novas investigações deveram ser realizadas para descartar o possível efeito
hepatotóxico apresentado pelos dímeros DT1 e DT3 nas alterações de AST e na
histologia do fígado.
Sendo assim, dentre os dímeros estudados nesse trabalho, o DT2 é o mais
promissor para dar continuidade nas investigações.
A realização deste trabalho confirma a atividade anticolinesterásica dos
compostos em estudo, com atividade in vivo, além de mostrar um efeito
promissor de neuroproteção. Estudos mais aprofundados são necessários para
elucidar o mecanismo de ação envolvido nessas respostas. Porém, esses
resultados abrem caminhos para dar continuidade no desenvolvimento de novos
híbridos da tacrina promissores para tratar a Doença de Alzheimer, sem que
apresentem efeitos hepáticos indesejáveis .
99
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ANEXO A – PARECER COMISSÃO DE ÉTICA NO USO
DE ANIMAIS – CEUA/UNIVALI
