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isico-quimica Do Oleo de Peixce
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE TECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA
E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
DO ÓLEO DE PEIXE
KASSANDRA DE LOURDES GADELHA
VELOSO ARAÚJO
JOÃO PESSOA – PB
2007
KASSANDRA DE LOURDES GADELHA
VELOSO ARAÚJO
AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
DO ÓLEO DE PEIXE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal da Paraíba para obtenção de título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Área de pesquisa química e bioquímica de alimentos.
Orientador:
Prof. Dr. Antônio Gouveia de Souza
JOÃO PESSOA – PB
2007
A663a Araújo, Kassandra de Lourdes Gadelha Veloso. Avaliação físico-química do óleo de peixe. / Kassandra de Lourdes
Gadelha Veloso Araújo. – João Pessoa, 2007. 79 p. Orientador: Antonio Gouveia de Souza. Dissertação (mestrado) - UFPB/CT
1.Óleos comestíveis – origem animal. 2. Óleo de peixe – avaliação oxidativa. 3. Óleo de peixe – análise térmica.
UFPB/BC. CDU: 664.324.3(043)
AVALIAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA
DO ÓLEO DE PEIXE
KASSANDRA DE LOURDES GADELHA VELOSO ARAÚJO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal da Paraíba para obtenção de título de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos. Área de pesquisa química e bioquímica de alimentos.
Aprovada em Setembro de 2007.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________ Prof. Dr. Antônio Gouveia de Souza/UFPB
Orientador
__________________________________________ Profa. Dra. Marta Maria da Conceição/UFCG
Membro externo
________________________________________________ Profa. Dra. Marta Célia Dantas Silva/UFCG/CNPq/FAPESQ
Membro externo
DEDICATÓRIA
A meus avôs Maria de Lourdes (in memorian) e Manoel Dionízio (in memorian)
exemplos de vida, e responsáveis pela minha formação.
A Verônica, minha mãe, amiga, confidente, por está sempre ao meu lado me apoiando.
A meu pai João Crisóstomo, pelo incentivo à educação.
Aos meus irmãos Júnior e Tatiana, amores da minha vida.
Ao meu esposo, João Romero, pelo companheirismo.
A Deus, responsável pelas minhas vitórias.
AGRADECIMENTOS
A Deus e Nossa Senhora da Penha, por me concederem mais esta vitória e me guiarem
sempre.
A minha mãe, pela confiança, carinho e amor incondicional.
A todos os meus familiares pelo apoio, amor, incentivo e crença.
Aos meus amigos que torceram sempre por mim.
Ao Professor Dr. Antônio Gouveia de Souza, meu orientador, por quem tenho uma grande
admiração.
A Professora Dra. Marta Maria da Conceição, pela colaboração imprescindível, pela presteza
e vontade de ajudar.
A Professora Dra. Marta Célia Dantas Silva, pelo auxílio valioso, atenção e principalmente
amizade.
Aos funcionários do LACOM, Lúcia, Rogério e Adriana, pela disponibilidade sempre.
A todos os Professores do LACOM, Iêda, Tatiana, Sávio, Soledade e Fabíola.
Aos amigos que fazem a família LACOM, principalmente a Raul, Roberlúcia, Manoel,
Anderson, Vasconcelos, Geuza, Gabriel, Lúcia, Sara, Lécia, pela companhia, amizade, ajuda,
conhecimento.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, ao coordenador,
Prof. José Marcelino Cavalheiro e ao Secretário Humberto Bandeira, pelo apoio recebido.
Aos Professores do Programa de Pós-Graduação, pelos ensinamentos.
A todos os colegas do Mestrado, principalmente a Jailane pelo apoio, amizade, presença.
À CAPES, pela bolsa concedida.
RESUMO
ARAÚJO, K. L. G. V. Avaliação Físico-química de Óleo de Peixe. João Pessoa, 2007. 79f. Dissertação (Mestrado em Ciências e Tecnologia de Alimentos), Universidade Federal da Paraíba. Pesquisas têm sido intensificadas enfocando a análise da composição nutricional de produtos marinhos, pois são ricos em ácidos graxos polinsaturados n-3 benéficos à saúde humana. No Brasil, apesar do vasto litoral, a produção de óleo de peixe, geralmente destina-se a alimentação animal, a fabricação de tintas e vernizes ou sua utilização como lubrificante e impermeabilizante. Desse modo, não existe controle de qualidade eficaz na produção do óleo de peixe nacional o que leva a uma matéria prima de qualidade reduzida. Diante deste contexto, este trabalho visou avaliar a qualidade do óleo de peixe nacional através das análises físico-químicas convencionais e instrumentais como também, a avaliação da estabilidade térmica e do processo oxidativo utilizando técnicas térmicas tais como: Termogravimetria (TG) e Calorimetria Exploratória Diferencial Pressurizada (PDSC). Os resultados obtidos mostraram que as características físico-químicas do óleo de peixe bruto evidenciam uma matéria-prima de baixa qualidade. O processo de refino do óleo foi eficaz na redução dos ácidos graxos livres, porém ineficiente na redução de peróxidos. As técnicas analíticas, espectroscópicas e térmicas evidenciaram que os óleos de peixe sob estresse térmico deterioram rapidamente. O acompanhamento do efeito térmico por UV-vis mostrou ser um recurso eficaz, pois indica a formação de dienos e trienos conjugados, que são produtos de oxidação e podem ser monitorados. A curva PDSC do óleo de peixe refinado apresentou um Tempo de indução oxidativo (OIT) de 36,42 minutos. As técnicas termoanalíticas e a espectroscopia UV-vis são ferramentas imprescindíveis no controle de qualidade de óleos, sendo rápidas, sensíveis e precisas. Palavras-chave: óleo de peixe, avaliação oxidativa, análise térmica, espectroscopia UV-Vis.
ABSTRACT
ARAÚJO, K. L. G. V. Physical-chemical Evaluation of Fish Oil -. João Pessoa, 2007. 79f. Dissertation (Master’s Degree in Food Science and Technology), Federal University of Paraíba. Researches have been intensified focusing in the analysis of the nutritional composition of sea products, as they are rich in polyunsaturated n-3 fatty acids which are good for the human health. In Brazil, despite of the vast seashore, the production of fish oil is normally aimed to animal feeding, the fabrication of paints and varnishes, or its usage as lubricants and impermeable substances. This way, there is no control of the effective quality in the production of national fish oil which leads to a raw material of low quality. Facing this context, this study evaluated the quality of national fish oil through conventional and instrumental physical-chemical analysis, as well as the evaluation of the thermal stability of the oxidative process, using thermal techniques, such as: Termogravimetry (TG) and Pressurized Differential Exploratory Calorimetry (PDSC). The obtained results showed that the physical-chemical characteristics of crude fish oil attested a raw material of low quality. The process of refinement of the oil was effective in the reduction of free fatty acids, however inefficient in the reduction of peroxides. The analytical, spectroscopical and thermal techniques attested that the fish oil under thermal stress deteriorated fast. The attendance of the thermal effect by UV-Vis demonstrated to be a good recourse, because it indicates the formation of conjugated dienes and trienes, which are oxidation products and can be monitored. The PDSC curve of refined fish oil presented an Oxidative Induction Time (OIT) of 36.42 minutes. The thermal-analytical techniques and the UV-Vis spectroscopy are essential tools in the control of the quality of oils, being fast, sensitive and precise. Keywords: fish oil, oxidative evaluation, thermal analysis, UV-Vis spectroscopy.
LISTA DE QUADROS
Quadro 3.1 – Fontes alimentares de ácidos graxos essenciais.................................................19
Quadro 3.2 – Composição de ômega-3 em animais marinhos................................................23
Quadro 3.3 – Compostos da oxidação lipídica e suas respectivas faixas de absorção no
espectro do ultravioleta.............................................................................................................32
Quadro 3.4 – Classificação das Técnicas Termoanalíticas......................................................34
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.1 – Processos metabólicos dos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6...........................21
Figura 3.2 – Síntese de eicosanóides pelo ácido araquidônico e pelo ácido eicosapentaenóico.
...................................................................................................................................................25
Figura 3.3 – Esquema geral da autoxidação de ácidos graxos poliinsaturados.......................27
Figura 4.1 – Diagrama de Blocos do procedimento experimental para a clarificação do óleo
bruto de pescado........................................................................................................................40
Figura 4.2 – Mufla com sistema de programação....................................................................42
Figura 4.3 – Viscosímetro Brookfield, modelo LV-DVII.......................................................46
Figura 4.4 – Espectrofotômetro UV/Vis Shimadzu 2550........................................................46
Figura 4.5 – Analisador Térmico TA INSTRUMENTS SDT 2960........................................47
Figura 4.6 – Calorímetro TA INSTRUMENTS MDSC 2920.................................................48
Figura 4.7 – Cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massa modelo QP 2010...
...................................................................................................................................................49
Figura 5.1 –Ácidos graxos livres do óleo de peixe bruto e refinado.......................................51
Figura 5.2 – Índice de iodo do óleo de peixe bruto e refinado................................................52
Figura 5.3 – Índice de peróxido do óleo de peixe bruto e refinado.........................................53
Figura 5.4 – Índice de anisidina do óleo de peixe bruto e refinado.........................................53
Figura 5.5 –Valor totox do óleo de peixe bruto e refinado......................................................54
Figura 5.6 –Viscosidade do óleo de peixe bruto e refinado.....................................................54
Figura 5.7 – Espectros de absorção no UV/Vis do óleo de peixe bruto e refinado.................56
Figura 5.8 – Curva TG do óleo de peixe refinado em várias razões de aquecimento, em
atmosfera de ar sintético...........................................................................................................58
Figura 5.9 – Curva TG do óleo de peixe refinado em várias razões de aquecimento, em
atmosfera de nitrogênio...........................................................................................................59
Figura 5.10 – Curva TG do óleo de peixe refinado em atmosfera ar sintético e nitrogênio...60
Figura 5.11 – Curva PDSC dinâmica do óleo de peixe neutralizado durante armazenamento
prolongado...............................................................................................................................62
Figura 5.12 – Curva PDSC isotérmica do óleo de peixe neutralizado durante armazenamento
prolongado...............................................................................................................................63
Figura 5.13 - Ácido graxos livres de óleos submetidos à degradação térmica.......................64
Figura 5.14 – índice de iodo de óleos submetidos à degradação térmica................................65
Figura 5.15 – índice de peróxido de óleos submetidos à degradação térmica.........................65
Figura 5.16 – índice de anisidina de óleos submetidos à degradação térmica........................66
Figura 5.17 –viscosidade de óleos submetidos à degradação térmica.....................................66
Figura 5.18 - Espectros de absorção no UV/Vis dos óleos de peixe bruto e degradados........67
LISTA DE TABELAS
Tabela 5.1 – Análises físico-químicas do óleo de peixe bruto e refinado................................55
Tabela 5.2 – Principais ácidos graxos presentes no óleo de peixe bruto e refinado................58
Tabela 5.3 – Dados termogravimétricos das amostras de óleo de peixe refinado em atmosfera
oxidante (ar sintético) e inerte (nitrogênio)...............................................................................61
Tabela 5.4 – Análise físico-química dos óleos de peixe refinado e degradado termicamente.....
...................................................................................................................................................67
Tabela 5.5 – Principais ácidos graxos presentes no óleo de peixe bruto e refinado................69
LISTA DE ABREVIATURAS
TG – termogravimetria
PDSC – Calorimetria Exploratória Diferencial Pressurizada
CG – Cromatografia
MS – espectrometria de massas
Uv-vis – Ultravioleta-visível
FAO – Food and Agricultures Organization
AOCS - American Oil Chemists Society
EPA – Eicosapentaenóico
DHA – Docosapentaenóico
n-3 – ômega-3
w-3 – ômega -3
n-6 – ômega-6
w-6 – ômega -6
n-9 – ômega-9
w-9 – ômega -9
PG – Prostaglandina
LT – Leucotrienos
TX – Tromboxanos
VLDL – Lipoproteína de Muita Baixa Densidade
HDL – Lipoproteína de Alta Densidade
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................................15
2 OBJETIVOS.........................................................................................................................17
2.1 OBJETIVO GERAL...........................................................................................................17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..............................................................................................17
3 REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................................18
3.1 ÓLEOS EGORDURAS......................................................................................................18
3.2 ÓLEO DE PEIXE...............................................................................................................22
3.3 OXIDAÇÃO DE ÓLEOS...................................................................................................26
3.4 MÉTODOS DE ANÁLISE.................................................................................................29
3.4.1 Índice de iodo..................................................................................................................29
3.4.2 Ácidos graxos livres.......................................................................................................30
3.4.3 Índice de peróxido..........................................................................................................31
3.4.4 Índice de anisidina.........................................................................................................31
3.4.5 Espectroscopia de varredura na faixa do espectro Uv-visível...................................32
3.5 ANÁLISE TÉRMICA........................................................................................................33
3.5.1 Termogravimetria.............................................................................................................35
3.5.2 Termogravimetria Derivada.............................................................................................37
3.5.3 Análise Térmica Diferencial............................................................................................37
3.5.4 Calorimetria exploratória Diferencial..............................................................................38
4 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................40
4.1 ÓLEO DE PEIXE...............................................................................................................40
4.2 REFINO DO ÓLEO DE PEIXE.........................................................................................40
4.2.1 Degomagem.....................................................................................................................41
4.2.2 Neutralização..................................................................................................................41
4.2.3 Lavagem..........................................................................................................................41
4.2.4 Secagem...........................................................................................................................41
4.2.5 Branqueamento..............................................................................................................41
4.2.6 Filtração..........................................................................................................................41
4.3 TRATAMENTO ÁCIDO DA ARGILA NATURAL........................................................42
4.4 DEGRADAÇÃO DO ÓLEO DE PEIXE............................................................................42
4.5 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS.......................................................................................43
4.5.1 Determinação do índice de iodo....................................................................................43
4.5.2 Determinação de ácidos graxos livres..........................................................................43
4.5.3 Determinação de índice de peróxido............................................................................44
4.5.4 Determinação do índice de anisidina............................................................................45
4.5.5 Determinação do Valor Totox.......................................................................................45
4.5.6 Determinação da viscosidade........................................................................................46
4.6 ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA NO ULTRAVIOLETA.........................................46
4.7 ANÁLISES TÉRMICAS....................................................................................................47
4.7.1 Termogravimetria (TG) ...............................................................................................47
4.7.2Calorimetria Exploratória Diferencial Pressurizada(PDSC).....................................47
4.8 CROMATOGRAFIA GASOSA........................................................................................48
4.8.1 Preparação dos ésteres metílicos..................................................................................48
4.8.2 Identificação e quantificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos......................49
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................51
5.1 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DO ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDO A PROCESSO
DE REFINO..............................................................................................................................51
5.2 ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ELETRÔNICA (UV/VIS) D O
ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDO A PROCESSODE REFINO...............................................55
5.3 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DO ÓLEO DE PEIXE BRUTO E REFINADO.........56
5.4 ESTUDO TÉRMICO..........................................................................................................58
5.4.1 Dependência do perfil termogravimétrico em função das razões de aquecimento..58
5.4.2 Dependência do perfil termogravimétrico em função das atmosferas......................59
5.4.3 Calorimetria exploratória diferencial pressurizada(PDSC)..................................... 62
5.5 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DO ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDO A PROCESSO
DE DEGRADAÇÃO TÉRMICA.............................................................................................64
5.6 ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ELETRÔNICA (UV/VIS) DO
ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDO A PROCESSO DEDEGRADAÇÃO TÉRMICA...............67
5. 7 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DO ÓLEO DE PEIXE DEGRADADO.....................68
6 CONCLUSÕES....................................................................................................................70
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS.................................................................71
REFERÊNCIAS......................................................................................................................72
ANEXOS..................................................................................................................................81
15
1 INTRODUÇÃO
Nos últimos anos pesquisas têm sido realizadas e intensificadas com o objetivo de
fornecer subsídios para uma análise da qualidade dos alimentos. As mesmas são direcionadas
aos estudos sobre os efeitos da temperatura de processamento a que estes alimentos são
submetidos e as análises do teor de substâncias que os compõem (JESUS, 2001; GARCIA,
2004).
Os estudos enfocando a análise do teor das substâncias que compõem os alimentos
têm se estendido aos recursos pesqueiros, pois, os peixes são uma fonte rica em ácidos graxos
polinsaturados ômega-3 e estes ácidos fornecem benefícios para a saúde humana além da
nutrição básica (YAMADA et al, 2000).
Segundo dados preliminares da Organização das Nações Unidas para Agricultura e
Alimentação (FAO, 2004), a captura pesqueira mundial para o ano de 2002 foi de 133,0
milhões de toneladas, das quais 93,2 milhões de toneladas eram de origem marinha. Os
mercados de peixe frescos, congelados, enlatados e secos foram os principais destinos dos
pescados produzidos, utilizando aproximadamente 76% da produção mundial. Os 24%
restantes seguiram para o preparo de farinha e óleos de pescados, sendo que 60% da produção
mundial de óleo, aproximadamente 1,2 milhões de toneladas, foi destinada à aqüicultura, e o
restante ao consumo humano, este último sendo destacado como um mercado em expansão
(OLIVEIRA, 2002).
No Brasil, o óleo de peixe produzido, normalmente é empregado para consumo animal
e destinado para a fabricação de tintas e vernizes ou usado como lubrificante e
impermeabilizante (BRASIL, 1985), não existindo dados seguros sobre a sua produção total.
E apesar da nossa potencialidade pesqueira, os suplementos alimentares à base de óleo de
peixe contendo ômega-3 são importados e apenas encapsulados em nosso país. Esta situação
poderia ser redirecionada a partir da utilização de óleos provenientes do pescado brasileiro,
principalmente se obtido do resíduo industrial. Esta situação exibe, ainda, a escassez de
tecnologia apropriada para a fabricação de óleos de pescados refinados.
Na alimentação Humana, diversos autores afirmam que além do conhecido emprego
do óleo de pescados em margarinas, atualmente os ácidos graxos polinsaturados da família
ômega-3 são incorporados a outros produtos alimentícios, como leite, ovos, pães e
suplementos alimentares (BADOLATO et al, 1991; BIMBO, 1987; CHAPMAN e
REGENSTEIN, 1997).
16
Existem dois ácidos essenciais na nutrição humana: o ácido alfa-linolênico 18:3n-3
que forma parte das famílias dos ácidos graxos ômega-3 e o ácido linoléico 18n-6 que forma
parte das famílias dos ácidos graxos ômega-6. Eles não podem ser sintetizados pelo
organismo humano, sendo necessário serem introduzidos na dieta.
Apesar dos seus efeitos benéficos, os ácidos graxos insaturados de cadeia longa são
conhecidos por serem instáveis a processos autooxidativos e oxidativos (BORQUEZ et al,
1997), os quais podem afetar o seu sabor, cor, textura e valor nutricional (SIRIWARDHANA
et al, 2004).
Entre os principais catalisadores do processo de oxidação em óleos e gorduras,
destaca-se a temperatura que estes óleos e gorduras são submetidos durante os seus
processamentos e estocagem.
Neste sentido, diversos métodos analíticos foram desenvolvidos para avaliar a
qualidade dos óleos e gorduras. Por exemplo, a determinação dos índices de iodo, peróxido e
ácidos graxos livres são técnicas volumétricas clássicas, constituindo processos laboriosos
que demandam tempo e que estão sujeitos a dificuldades na visualização do ponto final da
titulação. Mais recentemente, são as técnicas instrumentais de análises como a análise
térmica, a espectroscopia de ultravioleta, visível e infravermelho; a espectrometria de massa e
ressonância magnética nuclear (RMN), que vêem sendo inseridas no processo de
determinação de oxidação de óleos, apresentando muitas vantagens sobre as técnicas
analíticas, apesar do custo dos equipamentos.
Diante do exposto, este trabalho tem como objetivo principal realizar a avaliação
físico-química do óleo de peixe bruto produzido no Brasil, utilizando métodos físico-
químicos, espectroscópico, cromatográfico e análise térmica, através das técnicas de
termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória diferencial prssurizada (PDSC); avaliando
a importâncias dos métodos instrumentais de análise; bem como, estudar o processo de refino
e estresse oxidativo do óleo submetido a elevadas temperaturas.
17
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Realizar a avaliação físico-química do óleo de peixe, utilizando métodos físico-
químicos, espectroscópico, cromatográfico e a análise térmica através das técnicas térmicas
termogravimetria (TG) e calorimetria exploratória diferencial (PDSC).
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Realizar processo de refino do óleo bruto, através das etapas de degomagem,
neutralização e clarificação;
• Determinar parâmetros físico-químicos, tais como: índices de iodo, ácidos
graxos livres, índice de peróxido, índice de anisidina e viscosidade do óleo de peixe após
refino e degradação térmica;
• Analizar através da técnica de espectroscopia UV/Vis os processos de oxidação
do óleo de peixe após refino e sob degradação;
• Estudar o perfil da decomposição térmica e oxidativa do óleo de peixe refinado
através das técnicas térmicas (TG e PDSC);
• Determinar a composição dos ácidos graxos dos óleos de peixe bruto, refinado
e degradado através da cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas.
18
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 ÓLEOS E GORDURAS
Os óleos e gorduras são substâncias insolúveis em água (hidrofóbicas), de origem
animal ou vegetal; formados predominantemente de misturas de triglicerídeos, isto é, ésteres
do triálcool glicerol (propano-1,2,3-triol) e três resíduos de ácidos graxos que podem ser
idênticos ou não (MORETTO & FETT, 1998; COULTATE, 2004). Os óleos diferem das
gorduras por apresentarem-se líquidos a temperatura de 25 °C, enquanto as gorduras
apresentam-se na forma sólida ou pastosa a esta mesma temperatura (BRASIL, 2005). Esta
diferença deve-se, exclusivamente, à natureza do ácido ou ácidos graxos aos quais o glicerol
está esterificado (BOBBIO & BOBBIO, 1992).
Além dos glicerídeos (mono, di e triglicerídeos), os óleos e gorduras apresentam como
componentes substâncias que são denominadas não-glicerídeos e que perfazem certa de 5%
em óleos brutos e 2% em óleos refinados. Entre os grupos destas substâncias têm-se os
fosfatídeos, esteróis, ceras, hidrocarbonetos insolúveis, clorofila, vitaminas lipossolúveis,
lactonas e metilcetonas (FARIA et al, 2002).
Os ácidos graxos são os principais componentes dos óleos e gorduras, podendo está na
forma livre ou fazendo parte das moléculas dos glicerídeos e de certos não-glicerídeos e
chegam a apresentar até 96% do peso total destas moléculas; contribuindo de forma
significativa nas suas propriedades mais características (MORETTO & FETT, 1998).
Constituem-se de cadeias retas de hidrocarbonetos, terminadas em um grupo carboxila numa
ponta, e em um grupo metila na outra e diferem-se pelo número de átomos de carbono, bem
como pela colocação e a natureza de suas ligações químicas.
A extensão da cadeia dos ácidos graxos pode variar de 4 a 30 átomos de carbono. O
termo cadeia curta refere-se aos ácidos graxos com 6 carbonos ou menos, como por exemplo
o ácido butírico encontrado na manteiga. Ácidos graxos de cadeia média contêm entre 8 e 12
átomos de carbono, e usualmente são encontrados em gorduras sintéticas. Ácidos graxos de
cadeia longa contêm até 27 átomos de carbono (MAHAN,1994).
Quando saturados, os ácidos graxos apresentam apenas ligações simples entre
carbonos e possuem pouca reatividade química. Já os ácidos graxos insaturados, contêm uma
ligação (monoinsaturados) ou mais ligações duplas (polinsaturados) no seu esqueleto
carbônico e possuem maior reatividade. Torna-se importante salientar, ainda, que o estado de
19
saturação ou insaturação constitui uma importante característica química, assim como
nutricional, face ao papel exercido por certos ácidos graxos nos processos metabólicos e
imunitários (FRANCO, 1999).
A classe de ácidos graxos ômega-3 (w-3 ou n-3), ômega-6 (w-6 ou n-6) e ômega-9
(w-9 ou n-9) consistem de ácidos graxos insaturados contendo de 18 a 22 carbonos e sua
designação ômega tem relação com a posição da primeira dupla ligação, contando a partir do
grupo metílico final da molécula de ácido graxo. Os ácidos graxos n-3 apresentam a primeira
dupla ligação entre o terceiro e o quarto átomo de carbono, enquanto os ácidos graxos n-6 têm
a primeira dupla ligação entre o sexto e o sétimo átomo de carbono e os ácidos graxos n-9
apresentam a primeira dupla ligação entre o nono e décimo átomo de carbono (BELDA &
POURCHET-CAMPOS, 1991). Os principais ácidos graxos n-3 são o ácido linolênico 18:3, o
ácido eicosapentaenóico (EPA) 20:5 e o ácido docosahexaenóico (DHA) 22:6, enquanto os
principais n-6 são o ácido linoléico 18:2 e o ácido araquidônico 20:4, na classe n-9 têm-se o
ácido oléico 18:1 como principal componente (SUÁREZ-MAHECHA et al.,2002).
Existem dois ácidos essenciais na nutrição humana: o ácido alfa-linolênico 18:3n-3
que forma parte das famílias dos ácidos graxos ômega-3 e o ácido linoléico 18n-6 que forma
parte das famílias dos ácidos graxos ômega-6. Eles não podem ser sintetizados pelo
organismo humano, sendo necessário serem introduzidos na dieta. No Quadro 3.1 estão
destacadas fontes alimentícias dos ácidos graxos essenciais (SIRIWARDHANA et al., 2004).
Quadro 3.1 – Fontes alimentares de ácidos graxos essenciais
Fontes Alimentares de ácidos Graxos Essenciais
Ácidos graxos ômega-6 Ácidos graxos ômega-3 Linoléico Gama-linolênico Alfa-linolênico Eicosapentaenóico
Docosahexaenóico
Óleo de algodão Óleo de groselha Óleo de soja • Sardinha Óleo de Amendoim Vegetais Óleo de noz • Salmão Óleo de uva Legumes Linhaça • Atum Óleo de girassol Vegetais • Cavala Legumes Peixes brancos Fonte: Sydney-Smith (2005).
20
Os efeitos benéficos dos ácidos graxos polinsaturados, na saúde humana podem ser
obtidos através de uma alimentação equilibrada, que proporcione uma relação adequada de
ácidos graxos polinsaturados n-6 e n-3. Segundo a FAO (1994) e o Institute of Medicine
(2002) a relação entre n-3 e n-6 de 5:1 a 10:1 é considerada satisfatória.
Segundo uma pesquisa realizada pela FAO realizado no ano 1994 estima-se que as
dietas de certas comunidades ocidentais incluíam proporções médias de n-6 e n -3, em torno
de 20:1 a 25:1, bastante diferentes do consumo de nossos antepassados e das recomendações
atuais. Frente a isso, em vista da evolução industrial, a emergência por alimentos processados
e a hidrogenação dos óleos vegetais reduziram ainda mais a concentração de ácidos n-3.
Os ácidos graxos polinsaturados essenciais desempenham um importante papel no
organismo humano, participam do metabolismo e transporte de gorduras, da manutenção da
função e integridade das membranas celulares, modulação dos receptores de hormônios e
função imune, além de serem precursores dos eicosanóides (prostaglandinas, tromboxanos e
leucotrienos), um grupo de componentes semelhantes ao hormônio, que participam da
regulação da pressão sanguínea, freqüência cardíaca, dilatação vascular, coagulação
sanguínea, lipólise, respostas imunológicas e sistema nervoso central (MAHAN, 1994;
FRANCO, 1999).
Os ácidos linoléico e alfa-linolênico sofrem processos de dessaturação e alongamento
para formar os demais ácidos graxos das famílias n-6 e n-3. São metabolizados pelos mesmos
sistemas de enzimas, estando sujeitos à inibição do competidor. Os sistemas enzimáticos têm
preferência pelos ácidos graxos n-3 e não existe nenhuma interconversão entre eles.
As séries de ácidos graxos essenciais n-6 e n-3 competem entre si pela mesma enzima
para dessaturação a delta-6-dessaturase, assim como, seus principais derivados os ácidos
araquidônico e eicosapentaenóico (EPA) também apresentam concorrência por um único sítio
para dessaturação, realizada pela enzima delta-5-dessaturase. Ambas as enzimas são chaves
metabólicas clássicas e comuns para as duas vias metabólicas e apresentam maior afinidade
pelos substratos mais altamente insaturados. Logo, devido essa natureza competitiva, cada
ácido graxo pode interferir no metabolismo do outro, apresentando implicações nutricionais
(WAITZBERG & BORGES, 2002).
O ácido linoléico (28:2 n-6) forma o gama-linolênico (18:3 n-6) que é convertido em
ácido araquidônico (20:4 n-6). Em outra via o ácido alfa-linolênico (18:3 n-3) é convertido, de
forma lenta em ácido eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA), como mostrado
na Figura 3.1.
21
Figura 3.1 – Processos metabólicos dos ácidos graxos ômega-3 e ômega-6 (Fonte: Carvalho et al, 2003).
α-Linolênico (18:3n-3)
ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-3
Estaridônico (18:4n-3)
Docosatetraenóico (20:4n-3)
Eicosapentaenoico (20:5n-3)
Docosapentaenoico (22:5n-3)
Docosahexaenóico (22:6n-3)
ÁCIDOS GRAXOS ÔMEGA-6
Ácido Linoléico (18:2n-6)
γ-Linolênico (18:3n-6)
Araquidônico (20:4n-6)
∆ 6-dessaturase
Alongase
Dihomo-γ-linolênico (18:3n-6)
∆ 5-dessaturase
Adrênico (22:4n-6)
Alongase
Docosapentaenoico (22:5n-6)
∆ 4-dessaturase
22
3.2 ÓLEO DE PEIXE
Segundo dados preliminares da Organização das Nações Unidas para Agricultura e
Alimentação (FAO, 2004), a captura pesqueira mundial para o ano de 2002 foi de 133,0
milhões de toneladas, das quais 93,2 milhões de toneladas eram de origem marinha. Os
mercados de peixe frescos, congelados, enlatados e secos foram os principais destinos dos
pescados produzidos, utilizando aproximadamente 76% da produção mundial. Os 24%
restantes seguiram para o preparo de farinha e óleos de pescados, sendo que 60% da produção
mundial de óleo, aproximadamente 1,2 milhões de toneladas, foi destinadas à aqüicultura, e o
restante ao consumo humano, este último sendo destacado como um mercado em expansão
(OLIVEIRA, 2002). No Brasil, o óleo de peixe produzido, normalmente é empregado para
consumo animal e destinado para a fabricação de tintas e vernizes ou usado como lubrificante
e impermeabilizante (BRASIL, 1985). Entretanto, não existem dados seguros sobre a
produção total de óleo de pescados no Brasil.
Os óleos de pescados são constituídos dos mesmos componentes dos outros óleos e
gorduras, sendo, portanto, formados predominantemente de ésteres de ácidos graxos e
glicerol. Diferem-se por apresentarem a seguinte composição geral: (a) seus óleos contêm
aproximadamente 25% de ácidos graxos saturados, e 75% de ácidos graxos altamente
insaturados, (b) os ácidos graxos insaturados dos óleos de peixe variam substancialmente em
comprimento e a maioria destes contêm 16, 18, 20 e 22 carbonos em suas moléculas, (c) a
composição de seu material insaponificável varia consideravelmente, (d) óleos de fígado de
peixes contêm alto percentual de colesterol, enquanto que os óleos do corpo de peixes um
baixo teor de colesterol, (e) em geral, as estruturas dos glicerídeos dos óleos de peixe são
muito mais complexas do que as gorduras de animais terrestres e óleos vegetais (BRONDY,
1965).
O alto teor dos ácidos graxos polinsaturados eicosapentaenóico (EPA) e
docosahexaenóico (DHA) presentes no óleo de pescados conferem a esses óleos uma notável
importância, já que são um dos únicos alimentos que aparecem como fontes expressivas
destes ácidos graxos (Quadro 3.2). Esses ácidos graxos são reconhecidos por desempenharem
um papel essencial na saúde e nutrição humana (CHANTACHUM, 2000) e têm sido referidos
pelos seus efeitos benéficos à saúde humana (BORQUEZ, 1997).
23
Quadro 3.2 – Composição de ômega-3 em animais marinhos.
Alimento % de ômega-3 em animais marinhos
Cavala 1.8 - 5.1 Arenque 1.2 - 3.1 Salmão 1.0 - 3.1 Atum 1.0 - 1.4 Truta 0.5 - 1.6 Camarão 0.5 -1.6 Lagosta 0.2- 0.5 Bacalhau 0.3 - 0.4 Linguado 0.2 - 0.3
Fonte: Cukier & Waitzberg (1996).
A composição dos ácidos graxos nos pescados deve-se à sua alimentação
fitoplanctônica e zooplanctônica que concentra ácidos graxos de cadeia longa altamente
insaturados (BELDA e POURCHET-CAMPOS, 1991). Segundo Pitcher e Hart (1982), a
alimentação pelágica proporciona dietas ricas em óleos e ceras, as quais são metabolizadas
para glicerol e ácidos poliinsaturados através da dessaturação e alongamento das cadeias
carbônicas.
A presença de ácidos graxos polinsaturados em peixes possui como principais funções
biológicas, a manutenção do mosaico fluído das membranas, bem como a reserva de energia e
a regulação da densidade, através do acúmulo em depósitos de gordura, preferencialmente na
forma de triglicerídeos (LEHNINGER et al, 2000).
Em humanos, o ácido alfa-linolênico que pode ser derivado de algumas fontes
vegetais, pode ser convertido a eicosapentaenóico (EPA) e docosahexaenóico (DHA), porém
esta conversão caracteriza-se por ser limitada e lenta (GERSTER, 1998), tendo uma eficiência
em torno de 10 a 15% em adultos jovens (EMKER, 1994).
No Brasil, a oferta no comércio de suplementos alimentares a base de óleo de peixe,
contendo os ácidos eicosapentaenóico (EPA) e docosapentaenóico (DHA) encapsulados, vem
crescendo ultimamente, bem como as solicitações de análises ao Instituto Adolfo Lutz para
fins de registros de novas marcas desses produtos no Ministério da Saúde. De acordo com o
declarado pelos interessados, os óleos, geralmente de sardinha, são importados da Inglaterra e
submetidos ao encapsulamento no Brasil. A fórmula convencional garante que os produtos
contêm 180 mg de EPA e 120 mg de DHA por grama. Em alguns casos, há adição de
vitamina E ou tocoferol como antioxidantes (BADOLATO et al, 1991).
24
Diversos autores afirmam que além do conhecido emprego do óleo de pescados em
margarinas, atualmente os ácidos graxos polinsaturados da classe n-3 são incorporados a
outros produtos alimentícios com leite, ovos e suplementos alimentares (BIMBO, 1987;
BADOLATO et al, 1991; CHAPMAN & REGENSTEIN, 1997).
Na Europa é prática comum a formulação de pães e margarinas com óleo de peixe. A
produção de ovos com teores elevados de DHA é possível, alimentando-se as galinhas com
rações enriquecidas com este ácido, geralmente através da adição de microalgas. A
incorporação de ácidos graxos n-3, especialmente a pães, tem sido indicada como um
procedimento ideal, pois o dióxido de carbono gerado durante o assar age como antioxidante,
prevenindo a oxidação dos ácidos graxos n-3, enquanto os pães estão sob altas temperaturas
(MENEGALDO, 1999).
Os primeiros relatos sobre o metabolismo dos ácidos graxos n-3 surgiram na década
de 70, a partir de estudos na doença coronariana (DYERBERG et al, 1978). Esquimós da
Groenlândia, apesar do alto consumo de dietas ricas em gorduras com elevados teores de
colesterol e baixa ingestão de carboidratos, apresentaram baixos níveis de colesterol total,
triglicérides, lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL) e níveis maiores de lipoproteína
de alta densidade (HDL), relacionados a menores índices de doenças cardiovasculares
(BEILIN, 1993). Nos Esquimós a doença cardiovascular manifesta baixo índice de
mortalidade (10,3%) em relação à população norte-americana (50%) (BANG et al, 1976). Os
esquimós também têm baixa incidência de asma, psoríase, doenças auto-imunes e diabetes
mellitus e maior incidência de doenças hemorrágicas e epilepsia (HEINE, 1993).
Em estudos sobre a fisiologia dos ácidos graxos n-3 encontram-se alterações na função
plaquetária e síntese de eicosananóides, que motivam as pesquisas em uma miríade de
condições e doenças (CUKIER e WAITZBERG, 1996).
Ácidos graxos n-3 competem com o ácido araquidônico como substrato para síntese de
prostaglandinas e leucotrienos. Com a maior disponibilidade de n-3 a síntese de
prostaglandina (PG) e tromboxanes (TX) da série 2 e leucotrienos (LT) da série 4 diminuem,
sendo substituída pela síntese de prostaglandinas e leucotrienos da série 3 e 5,
respectivamente. As PG, TX e LT das séries 3 e 5 são mediadores inflamatórios menos
potente, podendo modular a resposta inflamatória exacerbada (Figura 3.2) (CUKIER &
WAITZBERG, 1996).
O consumo exclusivo e constante de gorduras vegetais contendo grandes quantidades
de n-6 pode resultar em produção excessiva de eicosanóides e peróxidos da série
Leucotrienos4, PGI2 e TXA2. Em um organismo sadio, quantidades extremamente baixas de
25
eicosanóides são produzidas, enquanto que em tecidos alterados e em condições patológicas,
como: inflamações, artrites, hemorragias, lesões vasculares e oncogêneses, grandes
quantidades são sintetizadas. Estes fenômenos têm relação com as prostaglandinas,
leucotrienos, tromboxanos e radicais livres dos peróxidos. É necessário também destacar
como são importantes os efeitos antagonistas do tromboxano e a prostaciclina. O tromboxano
favorece a agregação das plaquetas, enquanto que a prostaciclina inibe a agregação das
plaquetas e dispersa os agregados já formados. O aparecimento de escleroses, por exemplo,
está relacionado a um déficit de prostaciclina (HEARN et al., 1987; SIMOPOULOS, 1990;
SANDER, 2000).
Figura 3.2 – Síntese de eicosanóides pelo ácido araquidônico e pelo ácido eicosapentaenóico (Fonte: Ward, 1995).
ÁCIDO ARAQUIDÔNICO 20:4 ÔMEGA-6
ÁCIDO EICOSAPENTAENÓICO (EPA) 20:5 ÔMEGA-3
PGH3 PGH2
PGE3 PGE2
cicloxigenase
5-lipoxigenase
5-hidroxiperoxieicosatetraenóico 5-hidroxiperoxieicosapentaenóico
LTA 4 LTA 5
26
Os ácidos graxos polinsaturados contidos na dieta reduzem o nível de colesterol e de
lipoproteínas de baixa densidade no sangue, mas, ao mesmo tempo, a presença de grandes
quantidades de n-6 pode resultar em uma produção excessiva de eicosanóides e peróxidos
com maior capacidade para inibir a síntese de prostaciclina. Neste sentido, os ácidos graxos
EPA e DHA provenientes da carne de peixe incorporam-se facilmente aos fosfolipídios no
lugar do ácido araquidônico e entram para o ciclo produzindo eicosanóides ou docosanóides
apropriados, como Leucotrienos3, PGI3, TXA3. Os ácidos graxos n-3 são, portanto, pobres
geradores de peróxido quando comparados ao ácido araquidônico e constituem falsos
substratos para a cicloxigenase, conseguindo inibir a síntese posterior de eicosanóides não
apropriados. Assim como o EPA inibe a síntese de prostaciclina e tromboxano, o DHA inibe
preferencialmente a síntese de tromboxano. Isto significa que o DHA é um melhor fator
antitrombótico, além do tromboxano TXA3 gerado a partir do n-3, que é um fator favorecedor
da agregação plaquetária, muito mais débil que o tromboxano-TXA2, gerado a partir do ácido
araquidônico (LANDS, 1986).
Na comunidade científica encontra-se bem estabelecido que um aumento na ingestão
de ácidos graxos polinsaturados, principalmente ácido eicosapentaenóico (EPA), em uma
dieta, reduz o risco de doenças cardíacas (ARCHER et al, 1998; KROMAN & GREN, 1980;
NESTEL, 2000; SCHACKY, 2000). Além disso, estudos realizados por Simopoulos (1991),
Siguel (1996) e Weaver & Holob (1998), comprovaram que o consumo de ácidos graxos
polinsaturados reduz fatores bioquímicos associados a artrite, psoríase e câncer, atuam
diretamente no processo de crescimento e desenvolvimento humano e possuem ações
antitrombóticas e antiflamatórias exercidas através do metabolismo dos eicosanóides
(MARTINHO & TAKAHASHI, 2001).O ácido docosahexaenóico (DHA) é considerado
fundamental na formação de tecidos nervosos e da visão. Seu requerimento associa-se
principalmente com as primeiras etapas do desenvolvimento, tanto intra como extra-uterino
(CRAWFORD et al, 1999).
3.3 OXIDAÇÃO DE ÓLEOS
A degradação de lipídios pode ser ocasionada por oxidação, hidrólise, polimerização,
pirólise e absorção de sabores e odores estranhos. Dentre estes fatores, a oxidação é a
principal causa da deterioração de vários produtos biologicamente importantes, alterando
diversas propriedades, como qualidade sensorial (sabor, aroma, textura e cor), valor
27
nutricional, funcionalidade e toxidez (ARAÚJO, 1999). Tais mudanças podem ter sua origem
durante a produção, processamento e armazenamento do óleo, afetando sua aceitação pelo
consumidor, com conseqüente prejuízo à sua saúde devido aos efeitos tóxicos causados pela
ingestão contínua e prolongada de produtos oxidados (BOBBIO & BOBBIO, 1992).
A estabilidade oxidativa depende do grau de insaturação dos ácidos graxos presentes,
daí óleos que contenham altas proporções de ácidos graxos polinsaturados apresentarem
problemas de conservação, como é o caso dos óleos de peixes.
Os óleos ricos em ácidos graxos polinsaturados têm facilidade de sofrer deterioração
oxidativa e formam facilmente sabores e odores desagradáveis. A oxidação é causada a partir
da reação do oxigênio atmosférico com os ácidos graxos insaturados dos óleos ou gorduras,
sendo acelerada pela presença de íons metálicos, luz, temperatura, radiação ionizante e outros
agentes oxidantes. A inibição da oxidação é de extrema importância no processamento de
óleos marinhos (SHAHIDI, 1998).
A oxidação dos óleos acontece através da reação em cadeia de radicais livres em três
etapas: iniciação, propagação e terminação. Sendo distinguíveis pelos produtos formados e
por suas características organolépticas. O radical livre (R••••) é uma espécie química que
apresenta um número ímpar de elétrons, sendo, portanto, altamente reativo e instável (Figura
3.3).
Figura 3.3 – Esquema geral da autoxidação de ácidos graxos poliinsaturados (Fonte: Melo e Guerra, 2002).
Na fase inicial ou de indução formam-se os radicais livres, não havendo alterações no
odor ou sabor do óleo. Ocorre um baixo consumo de oxigênio e baixa formação de peróxido.
A formação do radical livre (R••••) se dá pela supressão de um átomo de hidrogênio do carbono
α-metileno adjacente à dupla ligação alílico do ácido graxo insaturado. A formação dos
primeiros radicais livres pode ser explicada pela ação da luz sobre o grupo alílico, pela
Iniciação:
Propagação:
Terminação:
R1H →→→→ R1•••• + H••••
R1•••• + O2 →→→→ R1OO••••
R1OO•••• + R2H →→→→ R2•••• + R1OOH
R1•••• + R2
•••• →→→→ R1-R2 R2
•••• + R1OO •••• →→→→ R1OOR2 R1OO•••• + R2OO•••• →→→→ R1OOR2 + O2
28
presença de cátions de metais com Fe, Cu, Cr e pelo ataque do oxigênio singleto (1O2)
diretamente a dupla ligação (BOBBIO & BOBBIO, 2001; PACHECO, 2005).
Na fase de propagação já é possível detectar a presença de odor e sabor de ranço
característico, que tende a aumentar rapidamente. Há uma elevação no consumo de oxigênio e
na quantidade de peróxidos e de seus produtos de decomposição, esta fase é tida como a
principal etapa do processo oxidativo (OZAWA & GONÇALVES, 2006).
Após a formação suficiente de radicais livres, a reação em cadeia é propagada pela
remoção de átomos de hidrogênio localizados na posição α à dupla ligação e adição de
oxigênio tripleto (3O2) nestas posições, levando a formação do radical peroxil (ROO••••), e este
novamente remove o hidrogênio do carbono α-metileno do ácido graxo insaturado,
produzindo o hidroperóxido (ROOH) e radicais (R••••). Em seguida os novos radicais livres
formados reagem com o oxigênio e a seqüência de reações repete-se. A reação do oxigênio
com os radicais livres é extremamente rápida, portanto, a vida útil dos radicais livres é muito
pequena e difícil de ser detectada. Os hidroperóxidos formados são instáveis decompondo-se
em aldeídos, álcoois, ácidos responsáveis pelo odor característico dos produtos rançosos
(SHAHIDI, 1998; COULTATE, 2004).
A fase de terminação caracteriza-se pela presença de cheiros e sabores de ranço forte,
alterações de cor, viscosidade e da composição do lipídeo, além de baixo consumo de
oxigênio e baixa concentração de peróxido. A quantidade de compostos químicos altamente
reativos aumenta constantemente até que se inicia a interação entre as várias espécies de
radicais livres, formando produtos estáveis, que são espécies não radicais (RR, ROOR)
(MORETTO & FETT, 1998; BOBBIO & BOBBIO, 2001).
A rancidez hidrolítica também é um fenômeno oxidativo importante que ocorre em
óleos e gorduras, é também conhecida como rancidez lipolítica ou lipólise. Esta resulta da
ação de determinadas enzimas, do uso de calor ou da ação de agentes químicos, como ácidos
e bases, sobre o enlace éster dos lipídios. Neste processo geralmente são liberados os ácidos
graxos saturados de baixo peso molecular, os quais têm volatilidade suficiente para serem
perceptíveis pelo seu cheiro, mesmo em pequenas quantidades quando livres (ARAÚJO,
1999).
A estabilidade oxidativa de um óleo ou gordura é definida como a resistência da
amostra à oxidação. Ela é expressa pelo período de indução – tempo entre o início da medição
e o momento em que ocorre um aumento brusco na formação de produtos da oxidação.
Existem vários métodos para determinar a resistência de um óleo/gordura à oxidação.
A determinação da estabilidade oxidativa de óleos e gorduras deve ser feita de acordo com a
29
metodologia Cd 12b-92, segundo oficialização da American Oil Chemists’ Society (AOCS,
1985). De acordo com esta metodologia, pode-se utilizar, na determinação da estabilidade
oxidativa de óleos/gorduras, os equipamentos Rancimat ou OSI (ANTONIASSI, 2001).
3.4 MÉTODOS DE ANÁLISE
Atualmente, os estudos da degradação oxidativa dos lipídeos em alimentos são de
grande interesse. Diversos métodos analíticos foram desenvolvidos para avaliar a qualidade
dos óleos e gorduras. Por exemplo, a determinação dos índices de iodo, peróxido e ácidos
graxos livres são técnicas volumétricas clássicas, constituindo-se processos laboriosos que
demandam tempo e estão sujeitos a dificuldades na visualização do ponto final da titulação.
Os métodos volumétricos foram os primeiros métodos a serem utilizados, no controle de
qualidade de óleos. Dentre estes métodos, a determinação dos ácidos graxos livres revela o
estado de conservação do óleo, assim como a decomposição dos triacilgliceróis que é
acelerada pelo aquecimento e luz.
Mais recentemente, são as técnicas instrumentais de análises como a análise térmica, a
espectroscopia de ultravioleta, visível e infravermelho; a espectrometria de massa e
ressonância magnética nuclear (RMN), que estão sendo utilizadas e estudadas para serem
inseridas no processo de determinação de deterioração em óleos. Estas técnicas apresentam
muitas vantagens sobre as técnicas analíticas, apesar do custo dos equipamentos (REDA,
2004).
3.4.1 Índice de iodo
O índice de iodo é a medida do grau de insaturação de um óleo, definido pela
quantidade de halogênio absorvido em 100 g de amostra. Está relacionado com a quantidade
de ligações duplas presentes na amostra e a redução observada neste índice se deve à quebra
de ligações duplas resultantes de reações de polimerização, ciclização e oxidação, o que
aumenta o grau de saturação da amostra, tornando-a por fim, imprópria para o consumo
humano. Sob determinadas condições, o iodo pode ser introduzido quantitativamente nas
ligações duplas dos ácidos graxos insaturados dos triacilgliceróis e proporciona uma medida
30
do grau de insaturação da amostra. Quanto maior for o índice, maior será a insaturação da
amostra. Mesmo este método tendo algumas desvantagens, deve ser considerado como um
método empírico cujo resultado final dá uma idéia aproximada da realidade. Ao se utilizar
iodo (halogênio) para reagir especificamente com as ligações duplas, esbarra-se em algumas
dificuldades: uma é que o iodo sempre vai sofrer alguma interferência da luz, reduzindo sua
participação na reação de halogenação. Outra é que a adição devido a ligações duplas
isoladas, ou conjugadas podem resultar em algumas ligações duplas intactas sem a adição do
iodo resultando em valores menores do que o normal (JOSEPH-NATHAN, 1982).
O método convencional usado para determinar o grau de insaturação de óleos e
gorduras é o índice de iodo. Moléculas contendo ligações duplas carbono-carbono
(insaturadas) reagem com iodo, de modo que, quanto maior o número de insaturações maior é
o índice de iodo e maior é a probabilidade da ocorrência de processos oxidativos na molécula
do ácido graxo insaturado devido aos hidrogênios alílicos (hidrogênios adjacentes ao carbono
da ligação dupla). A reação de adição do iodo às ligações duplas carbono-carbono é lenta (30-
60 minutos), devendo ser conduzida sem aquecimento e na ausência de luz, para prevenir ou
minimizar as reações indesejáveis de substituição alílica – que ocorrem na presença de luz e
aquecimento - e assim, elevam o consumo de iodo no processo, conduzindo a resultados
errôneos. O índice de iodo não é uma medida quantitativa, é um número empírico que é útil
na definição do grau de insaturação, porém sujeito a erros. Nos métodos de determinação do
índice de iodo a solução do iodo liberado pela adição de KI e amido, já titulada com solução
de tiossulfato de sódio, deixada em repouso, freqüentemente reverte a coloração anterior.
Estas dificuldades limitam a aplicação destas técnicas.(MORETO & FETT, 1998; REDA,
2004).
3.4.2 Ácidos graxos livres
A decomposição dos glicerídeos é acelerada por aquecimento e pela luz, e a rancidez é
quase sempre acompanhada pela formação de ácido graxo livre. Acidez alta indica a ação de
reações hidrolíticas e pode ser definida como a quantidade - em gramas - de ácido oléico livre
para cada 100 g de óleo analisado. Na realidade, a expressão do resultado indica uma idéia
geral de acidez e não uma determinação específica de ácido oléico. O que este método acusa é
a formação em andamento de grupos carboxila (–COOH). A decomposição dos glicerídeos é
31
acelerada por aquecimento e pela luz, e a rancidez é quase sempre acompanhada pela
formação de ácido graxo livre (MORETTO& FETT, 1998).
3.4.3 Índice de peróxido
A avaliação dos produtos primários de oxidação é geralmente efetuada pela
determinação do índice de iodo. Este representa a diferença entre a formação e a
decomposição de peróxidos, e exprime-se em milimoles de oxigênio ativo por kg de matéria
graxa. Segundo alguns autores o índice de peróxido pode ser determinado nos primeiros
estágios do processo oxidativo. A variação do nível de peróxido ao longo do tempo ocorre de
uma forma gaussiana, pelo que um nível baixo de peróxidos não constitui uma garantia de boa
estabilidade oxidativa, podendo, pelo contrário, ser sinônimo de alteração pronunciada
(SILVA et al, 1999).Pela adição de solução de iodeto de potássio saturada a amostra com
solvente os íons iodeto reagem com os peróxidos, produzindo I2. O excesso de I- não reage e
fica em solução. Ao adicionar o amido, como indicador, este em presença de I2 ficará azul. Ao
titular-se a solução com tiossulfato de sódio, este é oxidado a tetrationato de sódio e o iodo é
reduzido a I-, causando a perda da cor azulada. Assim, a quantidade de tiossulfato consumida
é proporcional à quantidade de peróxidos presentes na amostra (BACCAN et al., 1985).
Ao efetuar esta determinação deve-se ter em consideração que: o iodo liberado pode
fixar-se às duplas ligações dos ácidos graxos insaturados, dando um valor de índice de
peróxido por defeito; o oxigênio presente no meio pode levar à liberação de iodo e dar origem
a um valor errado de índice de peróxido por excesso, sendo, portanto, aconselhável efetuar o
desarejamento prévio do meio, bem como evitar a agitação no decurso da reação e a
determinação do ponto final da titulação é difícil quando o nível de peróxido é baixo (0,06 -
20,00), mesmo em presença de um indicador (amido) (BERSET, 1996).
3.4.4 Índice de anisidina
O índice de anisidina é uma medida da concentração de aldeídos α,β-saturados
presentes em óleos e gorduras. O método é aplicado a óleos e gorduras animais e vegetais
brutos ou refinados, como também a ácidos graxos. O índice de anisidina é definido como
100 vezes a absorbância medida a 350nm de uma solução de 1g de gordura em 100ml da
mistura de solventes e reagentes de anisidina (MORETO & FETT, 1998).
32
A p-anisidina, em meio acético forma um complexo de cor amarela com os aldeídos
que possuem duas duplas ligações conjugadas, em particular com o trans,trans-2-4-
decadienal resultante da degradação do ácido linoléico. Trata-se de um método normalizado
pela IUPAC, estabelecendo-se que, por via de regra, um bom óleo deve apresentar um índice
de anisidina inferior a 10 (SILVA, 1999).
3.4.5 Espectrofotometria de varredura na faixa do espectro Uv-visível
A oxidação de ácidos graxos Polinsaturados pode ser analisada pelo aumento da
absortividade na faixa do espectro ultravioleta. Durante a oxidação, lipídios contendo duplas
ligações apresentam uma alteração na posição devido à ressonância na cadeia, resultando em
isomerização e conjugação. A formação de dienos e trienos é proporcional ao ganho de
oxigênio e à formação de peróxidos durante os estágios iniciais de oxidação. Estes dienos e
trienos conjugados apresentam intensa absorção em 234 e 268 nm, respectivamente, conforme
Quadro 3.3.
Quadro 3.3 – Compostos da oxidação lipídica e suas respectivas faixas de absorção no espectro do ultravioleta Composto Pico de máxima absorção (nm) Monoeno 190 Dieno 220-230 Trieno 265-270 Tetraeno 310-320 Aldeído cetônico 265-280 Aldeído cetônico α,β etilênico 220-250 310-330 Cetona dietilênica conjugada 265-280 α-dicetona 280 α-cetoaldeído 282 Forma enólica de α-dicetona e α-cetoaldeído 270 β-dicetona 271 Ácido α-cetônico 210-230 Ácido dietilênico conjugado 260 Ácido trietilênico conjugado 315 Fonte: Rovellini et al (1997); Pacheco (2005).
Os dienos conjugados absorvem a 232 nm. Os produtos secundários da sua oxidação,
em particular as α-dicetonas apresentam máximo de absorção a 270 nm. Esta diferença é
33
particularmente interessante permitindo diferenciar estados de evolução oxidativa com base
na relação dienos/dicetonas: quanto maior o valor de absorbância a 232 nm mais elevado será
o conteúdo em peróxidos, correspondendo, portanto, ao início do processo de oxidação; pelo
contrário, quanto maior for o valor de absorbância a 272 nm, maior será o teor de produtos
secundários presentes (SILVA, 1999).
Segundo Nawar (1985), o grau de mudança na absorbância só tem boa correlação com
o grau de oxidação nos primeiros estágios. A determinação da absorbância na faixa do
ultravioleta em 232 nm têm algumas vantagens sobre o índice de peróxido por ser mais rápida
e mais simples e não depender de reação química ou desenvolvimento de cor (SHAHIDI,
1995).
3.5 ANÁLISE TÉRMICA
A Análise térmica é conceituada como um conjunto de técnicas que permitem
medir as mudanças de uma propriedade física ou química de uma substância ou material em
função da temperatura ou tempo, enquanto a substância é submetida a uma programação
controlada de temperatura (MACKENZIE,1974; IANASHIRO & GLIOLITO, 1980; MOTHÉ
& AZEVEDO, 2002 ).
A evolução extraordinária da instrumentação termoanalítica ocorreu a partir da década
de 50, provocada pelos progressos globais da ciência e tecnologia que permitiu o
aperfeiçoamento contínuo da instrumentação básica, e a redescoberta das potencialidades de
aplicação destes métodos nos mais variados setores científicos e tecnológicos
(WENDLANDT, 1964).
Nos últimos anos, o desenvolvimento dos métodos termoanalíticos ganhou grande
impulso, muito embora, os fundamentos teóricos necessários já se encontrassem solidamente
estabelecidos desde fins do século XIX. A instrumentação termoanalítica atingiu um
elevadíssimo grau de satisfação e popularizou-se em função de uma aplicação prática
constante (WENDLANDT, 1986).
Com a criação da Confederação Internacional de Análise Térmica e Calorimetria
(ICTAC) e, também, o desenvolvimento dos equipamentos comerciais, respaldaram a Análise
Térmica como um campo extremamente ativo, podendo ser aplicado em inúmeras direções
(CONCEIÇÃO, 2004; ALBUQUERQUE,2006).
34
Para que uma técnica térmica seja considerada termoanalítica é necessário que
satisfaça três critérios (WENDLANDT, 1986): uma propriedade física deve ser medida; a
medida deve ser expressa como uma função da temperatura; a medida deve ser feita sob um
programa de temperatura controlada.
A aplicabilidade da análise térmica ocorre em diversas áreas: alimentícia, catálise,
cerâmica, engenharia civil, farmacêutica, inorgânica, petroquímica, polímeros, vidros e
outras. Apresenta como vantagens o uso de pequenas quantidades de amostra para os ensaios,
variedade de resultados em um único gráfico e não requer preparo prévio da amostra para o
ensaio a ser realizado (MOTHÉ, 2002).
Quadro 3.3 – Classificação das Técnicas Termoanalíticas. Propriedade física Técnica(s) derivada(s) Abrev. Massa Termogravimetria TG Determinação isobárica de variação de massa Detecção de gás desprendido EGD Análise de gás desprendido EGD Análise térmica por emanação Análise por produção térmica de partículas Temperatura Determinação da curva de aquecimento Análise térmica diferencial DTA Entalpia Calorimetria exploratória diferencial DSC Dimensões Termodilatometria Características mecânicas Medição termomecânica Medição termomecânica dinâmica Características acústicas Termossonimetria Termoacustimetria Características ópticas Termoptometria Características elétricas Termoeletrometria Características magnéticas termomagnetometria Fonte: Ionashiro & Giolito, 1980.
A habilidade das técnicas de caracterizar os materiais é bastante aperfeiçoada quando
combinada com outra técnica analítica, principalmente para caracterização dos produtos
gasosos, sendo freqüentemente possível realizar medidas simultâneas de mais que uma
propriedade (BROWN, 1988).
Dentre os vários sistemas simultâneos existentes podemos citar: termogravimetria -
cromatografia gasosa (TG-CG); termogravimetria - espectrometria de massa (TG-MS) e
termogravimetria – cromatografia gasosa - espectrometria de massas (TG-CG-MS)
(DOLLIMORE et al., 1984; SZEKELY et al., 1992).
O sistema de análise avançada TG/CG/MS possui a capacidade de observar e
quantificar as mudanças que ocorrem na amostra de acordo com a variação de sua massa, que
35
está sujeita ao aquecimento a uma velocidade constante (TG) e a qualificação e quantificação
da variedade de gases liberados, que são continuamente medidos e analisados (CG/MS). O
sistema TG/CG/MS oferece um completo entendimento do estudo de mecanismo da
decomposição térmica, através da aquisição da curva TG e de dados moleculares.
As técnicas termoanalíticas mais usadas são TG e DTA, seguidas por DSC e TMA.
Algumas dessas técnicas serão apresentadas, a seguir com suas respectivas aplicações
[WENDLANDT,1986].
3.5.1 Termogravimetria (TG)
É a técnica na qual se obtêm a variação (ganho ou perda) de massa em função do
tempo (com a temperatura constante), ou em função da temperatura. . Ela é basicamente
quantitativa de forma que a mudança na massa pode ser corretamente determinada. Porém, a
temperatura em que as mudanças de massa ocorrem, depende das características da amostra,
sendo, pois um parâmetro da avaliação qualitativa que pode ser correlacionado com outros
resultados se as mesmas condições de operação forem empregadas (SANTOS, 2001).
Segundo Machado et al (1999) os métodos termogravimétricos mais utilizados são:
a) Dinâmico→→→→ a perda de massa é registrada continuamente à medida que a
temperatura aumenta, constituindo a técnica mais utilizada.
b) Isotérmico→→→→ a variação de massa da amostra é registrada em função do tempo,
mantendo-se a temperatura constante. É um caso, usado geralmente, em trabalhos cinéticos.
c) Quase-isotérmico→→→→ a partir do momento que começa a perda de massa da amostra
(∆m ≠ 0), a temperatura é mantida constante até que a massa se estabilize novamente (∆m =
0). Neste momento recomeça o aquecimento e este procedimento pode ser repetido em cada
evento da decomposição.
A termogravimetria é essencialmente aplicável quando se deseja acompanhar
variações de massa envolvidas em um experimento e este tipo de medida é realizada
utilizando-se um equipamento denominado termobalança (DANTAS, 2006).
O porta-amostra deve ser escolhido de acordo com a amostra a ser analisada e com a
temperatura máxima de aquecimento aplicada a amostra. Os porta-amostras são geralmente
constituídos de alumínio (temperatura máxima de 600oC), alumina (temperatura máxima de
1200oC), platina, níquel, quartzo, tungstênio, grafite e cobre. A atmosfera que circunda a
36
amostra pode ser controlada, possibilitando trabalhar com atmosfera estática ou dinâmica à
pressão ambiente, sob pressão ou a vácuo. Os gases utilizados podem ser inertes (nitrogênio),
oxidantes (oxigênio) ou corrosivos (BRADLEY, et al., 1971; WENDLANT, 1972).
Nos estudos termogravimétricos, de acordo com Shugar (1990) as principais
aplicações são:
a) Decomposição e estabilidade térmica das substâncias orgânicas e inorgânicas e
dos mais variados materiais, tais como: minerais, carvão, madeira, petróleo, polímeros,
alimentos, fármacos e outros;
b) Corrosão de metais em atmosferas constituídas por diferentes gases e em faixas
muito amplas de temperatura;
c) Velocidade de destilação e evaporação de líquidos e de sublimação de sólidos;
d) Desidratação, higroscopicidade, absorção, adsorção, dessorção, determinação do
teor de umidade, fração volátil e teor de cinzas de vários materiais;
e) Cinética das reações, inclusive de reações no estado sólido e também descoberta
de novos compostos químicos;
f) Determinação da pureza e da estabilidade térmica de reagentes analíticos,
inclusive padrões primários e secundários;
g) Estudo sistemático das propriedades térmicas dos precipitados, de acordo com os
processos de precipitação utilizados;
h) Desenvolvimento de processos analíticos gravimétricos;
i) Curva de ignição dos meios de filtração e da conveniência de se secar ou calcinar
um precipitado;
j) Determinação de um único componente ou da composição de misturas com dois
ou três componentes;
k) Caracterização funcional de compostos orgânicos;
l) Definição da estequiometria;
m) Estabelecimento da composição e estabilidade térmica de compostos
intermediários;
n) Composição do resíduo e decomposição térmica em várias condições de
atmosfera e temperatura;
o) Sensibilidade do mecanismo e do registro.
37
3.5.2 Termogravimetria Derivada (DTG)
A Termogravimetria Derivada (DTG) é a derivada primeira da curva
termogravimétrica, ou seja, a derivada da variação de massa em relação ao tempo ou
temperatura. A curva DTG apresenta as informações de uma forma mais visualmente
acessível, mostrando com mais clareza os pontos inicial e final do processo, sendo a área
diretamente proporcional à variação de massa, levando à pronta determinação da temperatura
do pico e indicando as temperaturas inicial e final (FERNANDES, 1995; SILVA, 2005,
ALBUQUERQUE, 2006; DANTAS, 2006).
Podem-se citar como aplicações da curva DTG:
a) Separação de reações sobrepostas;
Onde é possível identificar as reações sobrepostas a partir da curva de DTG, através da
formação dos picos, uma vez que, cada pico formado corresponde a um fenômeno ocorrido.
b) Identificação de uma determinada substância;
Mantendo as mesmas condições de análise, com os picos registrados na curva de
DTG, é possível identificar a amostra, levando em consideração a atmosfera envolvida, fluxo
de gás, massa da amostra, composição do cadinho e a razão de aquecimento;
c) Variação da massa calculada, em reações sobrepostas;
d) Medida da altura do pico analisada quantitativamente;
e) Diferença entre os eventos térmicos comparados com a curva DTA.
3.5.3 Análise Térmica Diferencial (DTA)
É a técnica que fornece a diferença de temperatura de uma amostra (Ta) comparada a
de um material referência (Tr) termicamente inerte, quando a amostra é submetida ao
aquecimento ou ao resfriamento a uma razão de aquecimento constante. As variações de
temperatura da amostra (∆T = Ta – Tr) são causadas pelas transições entálpicas. Através desta
técnica, podem-se acompanhar os efeitos de calor associado com alterações físicas, ou
químicas da amostra, tais como transições de fase ou reações de desidratação, de dissociação,
de decomposição, etc. capazes de causar variações de calor exotérmicas ou endotérmicas. Em
geral, transições de fase, desidratações, reduções e certas reações de decomposição produzem
efeitos endotérmicos enquanto que cristalizações, oxidações, algumas reações de
decomposição, produzem efeitos exotérmicos (POPE et al., 1980);
38
Quando se aquece uma amostra, seu calor específico tende a variar, com a mudança de
estado físico ocorre uma alteração brusca, como também, processos do tipo fusão e
decomposição, nos quais há variações de entalpia, como por exemplo: calor latente de fusão,
calor de reação e outros. Caso uma reação endotérmica aconteça no interior da amostra, a
temperatura da amostra, comparada com a temperatura da referência, produz uma diferença
de temperatura e, por analogia, uma diferença oposta de temperaturas aparece como efeitos
exotérmicos (MOTHÉ e AZEVEDO, 2002).
Dessa forma, a técnica pode ser utilizada na identificação qualitativa e quantitativa de
compostos orgânicos e inorgânicos, metais, minerais, graxas, óleos, polímeros, madeiras e
outros. Essa técnica também pode ser utilizada na área farmacêutica para determinar a
estabilidade térmica, oxidação e transição vítrea dos fármacos, além da determinação da
pureza dos materiais biológicos. As técnicas DTA e a DSC estão sendo utilizadas na indústria,
especialmente na área de polímeros, metalurgia, geologia e cerâmicas, tendo como principal
objetivo à identificação de materiais e, também, a estabilidade térmica e oxidativa
(ALBUQUERQUE, 2006; DANTAS, 2006).
3.5.4 Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC)
Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) é uma técnica que mede as temperaturas
e o fluxo de calor associado com as transições dos materiais em função da temperatura e do
tempo. Essas medidas informam, qualitativamente e quantitativamente sobre mudanças físicas
e químicas que envolvem processos endotérmicos (absorção de calor), exotérmicos (liberação
de calor) ou mudanças na capacidade calorífica (SANTOS, 2001; MOTHÉ & AZEVEDO,
2002).
As mudanças de energia na amostra, em relação à referência, ocorrem devido à
transições endotérmicas ou exotérmicas como as causadas por mudança de fase, fusão,
inversão da estrutura cristalina, ebulição, sublimação e vaporização, ou reações tais como:
desidratação, dissociação, decomposição, gelatinização, oxidação, redução e outras reações
químicas. De maneira geral, transição de fase, desidratação, redução e algumas reações de
decomposição produzem efeitos endotérmicos, enquanto cristalização, oxidação e algumas
reações de decomposição produzem efeitos exotérmicos, isto é válido tanto para DSC quanto
para DTA.
A DSC apresenta as seguintes vantagens:
39
a) Tempo de análise rápido (geralmente, 30 minutos);
b) Preparação fácil da amostra;
c) Aplicabilidade em sólidos e líquidos;
d) Faixa de temperatura larga;
e) Medidas quantitativas.
Desvantagens e limitações da DSC:
a) Sensibilidade reduzida quando a linha base está em inclinação ou curvatura;
b) Para aumentar a sensibilidade é necessário elevar as razões de aquecimento, mas
com isso a resolução é reduzida;
c) Algumas transições observadas são complexas e apresentam dificuldades para
interpretação (por exemplo, temperatura de transição vítrea, fusão e cristalização).
Em óleos, a DSC é tipicamente usada para medir o OIT (Tempo indução oxidativa) ou
onset do material a uma temperatura específica em atmosfera oxidante. Sendo a onset
determinada como o período de tempo em que a taxa de oxidação acelera de zero para o
máximo. A onset é sinalizada, portanto, por um aumento abrupto na liberação de calor pela
amostra e é comumente usada por sua facilidade relativa de determinação, bem como pela
velocidade de análise (SHARMA & STIPANOVIC, 2003).
A PDSC (Calorimetria exploratória diferencial pressurizada) surgiu da evolução da
calorimetria exploratória diferencial utilizando-se uma célula de pressão acoplada ao
equipamento de análise. As altas pressões utilizadas pela PDSC inibem a taxa de volatilização
da amostra, elevando o seu ponto de ebulição, como também eleva a saturação da fase líquida
com o oxigênio, aumentando a interação do gás oxidante com a amostra; permitindo, assim, o
uso de baixas temperaturas de teste ou tempos de testes mais curtos às mesmas temperaturas.
Os resultados obtidos pela PDSC são mais precisos que os obtido por DSC. A tecnologia
desenvolveu uma técnica rápida, precisa e que utiliza uma pequena quantidade de amostra em
comparando-se às outras técnicas de análise de oxidação de óleos (SHARMA &
STIPANOVIC, 2003; HWANG et al, 2003; KODALI,2005; QIU et al, 2006).
40
4 MATERIAL E MÉTODOS
As análises experimentais do presente trabalho foram realizadas no Laboratório de
Combustíveis e Matérias (LACOM) localizado no Centro de Ciências Exatas e da Natureza da
Universidade Federal da Paraíba (UFPB).
4.1 ÓLEO DE PEIXE
Para realização dos experimentos, foi utilizado óleo bruto de pescados provenientes da
indústria Campestre S.A.. Este foi obtido através de prensagem a frio do corpo de peixes de
várias espécies provenientes da região Sul do Brasil e acondicionado em latas metálicas de 18
litros de capacidade.
4.2 REFINO DO ÓLEO DE PEIXE
O óleo bruto de pescados foi submetido a processo de refino, conforme o diagrama de
blocos da Figura 4.1, utilizando os métodos de degomagem, neutralização e branqueamento.
ÓLEO BRUTO
ÓLEO CLARIFICADO
Figura 4.1 – Diagrama de blocos do procedimento experimental para a clarificação do óleo bruto de pescado.
NEUTRALIZAÇÃO
DEGOMAGEM
LAVAGEM
SECAGEM
BRANQUEAMENTO
FILTRAÇÃO
41
4.2.1 Degomagem: a degomagem do óleo bruto foi realizada mediante a adição de 3,0% de
água ao óleo aquecido a 60 °C e agitação durante 30 min., seguindo metodologia proposta por
Moreto & Fett (1998). Após degomagem, a mistura foi resfriada e a fração oleosa foi separada
com auxílio de filtro centrífugo, com velocidade de 8000 rpm.
4.2.2 Neutralização: o óleo foi neutralizado seguindo a metodologia de Morais et al (2001)
com adição de 4,0% de excesso de solução de hidróxido de sódio (NaOH) 20%, sob
temperatura de 40 °C e agitação vigorosa por um tempo de 20 min. Após esse tempo, cessou-
se a agitação e elevou-se a temperatura até 8 0°C, a fim de facilitar a separação do óleo e da
borra. A mistura foi resfriada e separada através de filtro centrífugo a 8000 rpm.
4.2.3 Lavagem: o processo transcorreu através da adição de água ao óleo neutralizado, à
temperatura de 90-95 °C submetido à agitação e decantação em funil de vidro até supressão
do NaOH 20%, através da separação das fases aquosa, sólida (borra) e oleosa, utilizando a
fenolftaleína 1% como indicador.
4.2.4 Secagem: o óleo foi seco a temperatura de 60 °C, com pressão de vácuo por um tempo
de 20 minutos, sobagitação branda. Em seguida, o óleo foi resfriado.
4.2.5 Branqueamento: o processo de branqueamento ocorreu através da adição de
substâncias adsorventes (5% p/p de argila ativada e 10% p/p da mistura de argila ativada e
carvão ativo em relação à massa do óleo) ao óleo seco sob com agitação lenta à temperatura
de 70 °C por 20 minutos de retenção (MORAIS et al., 2001).
4.2.6 Filtração: Para a operação de filtração do óleo branqueado, foi realizada uma pré-capa
em filtro através de uma suspensão de terra diatomácea (celite). A retenção das substâncias
adsorventes foi obtida através de filtração a vácuo para maior rapidez no processo.
42
4.3 TRATAMENTO ÁCIDO DA ARGILA NATURAL
A capacidade adsortiva da argila natural foi aumentada através da ativação com ácido
sulfúrico. Preparou-se uma suspensão de 10% (p/v) de argila em solução de ácido sulfúrico 4
mol.L-1. A ativação foi realizada por agitação da suspensão a 90 °C por 210 min. Após a
ativação, o sólido foi lavado com água destilada e centrifugado até ficar livre de íons SO42- e
posto para secar a 60 °C por 24 horas.
4.4 DEGRADAÇÃO DO ÓLEO DE PEIXE
O óleo refinado de pescados foi submetido a um processo de degradação térmica
utilizando-se como parâmetros a temperatura inicial (190 °C) e final (360 °C) da primeira
etapa de perda de massa observado na curva termogravimétrica dinâmica em atmosfera de ar
sintético e razão de aquecimento de 10 °C.min-1. O processo de degradação foi realizado em
mufla (Figura 4.2) com programação de 10 °C.min-1, acoplado a um sistema de vazão de ar
sintético para simular as condições da termogravimetria. A degradação foi realizada em
cadinhos de porcelana com massa de óleo em torno de 20 g.
Figura 4.2 – Mufla com sistema de programação.
43
4.5 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
4.5.1 Determinação do índice de iodo
Foi aplicada a metodologia de Hübl de acordo com o descrito pelo Instituto Adolfo
Lutz (1985). Foram pesados 0,25 g das amostras e transferidas com auxílio de 10ml de
clorofórmio para um erlenmeyer de boca esmerilhada. Adicionou-se 20 mL de solução de
iodo (mistura de volumes iguais de solução alcoólica de iodo 5% e solução alcoólica de
cloreto mercúrico 6%) e deixou em repouso por 30 minutos ao abrigo da luz, agitando-se
ocasionalmente. Após este tempo foi adicionado 10mL de solução de iodeto de potássio 15%
e 100ml de água. Titulo-se o excesso de iodo com solução de tiossulfato de sódio 0,1 N,
usando o amido a 0,5% como indicador, até o desaparecimento da coloração azul. O teste em
branco ficou em repouso por 2 horas e seguiu a mesma metodologia das amostras.
Cálculo:
Índice de Iodo = V x f x 1,27 P
Em que:
V = diferença entre os números de mL de solução de tiossulfato de sódio 0,1N gastos nas
titulações;
f = fator de correção da solução de tiossulfato de sódio 0,1 N;
P = peso da amostra em gramas;
1,27 = centiequivalente do iodo.
4.5.2 Determinação de ácidos graxos livres
Seguindo as normas da AOCS (American Oil Chemists’ Society) Cd 5-40 (1997) os
ácidos graxos livres foram determinados através da dissolução de amostras de 2 g do óleo de
peixe em 50 mL de álcool etílico a 95 %, previamente neutralizado com solução aquosa de
NaOH 0,1 N, utilizando 0,5 mL de solução etanólica de fenolftaleína a 1 % como indicador.
44
Em seguida, aqueceu-se a solução até ebulição e titulou-se com solução aquosa de NaOH 0,1
N, até coloração rósea persistente por 15 segundos.
Cálculo:
% de Ácidos graxos livres = Vx N x 28,2 P
Em que:
V = número de mL de solução de hidróxido de sódio a 0,1 N gasto na titulação;
N= normalidade real da solução de hidróxido de sódio;
P = número de gramas da amostra;
28,2 = deciequivalente-grama do ácido oléico.
4.5.3 Determinação de índice de peróxido
O índice de peróxido foi determinado segundo as normas da AOCS Cd 8-53. Foram
utilizados 5g de cada óleo dissolvidos em 30 mL da solução de ácido acético-clorofórmio (3:2
v/v), seguida da adição de 0,5 mL de solução saturada de iodeto de potássio A mistura foi
deixada em repouso por exatamente um minuto e a seguir, foram adicionados 30 mL de água
destilada e 0,5 mL de solução de amido 1%. O iodo liberado foi titulado com solução de
tiossulfato de sódio 0,1 N, até o desaparecimento da coloração azulada. Uma prova em branco
foi realizada nas mesmas condições descritas, sem a presença da amostra.
Cálculo:
Índice de Peróxido = (A-B) x N x 1000 P
Em que:
A = n º de mL de solução de tiossulfato de sódio gasto na titulação da amostra;
B = n º de mL de solução de tiossulfato de sódio gasto na titulação do branco;
N = normalidade real da solução de tiossulfato;
P = peso da amostra em gramas.
45
4.5.4 Determinação do índice de anisidina
O índice de anisidina foi determinado seguindo metodologia da AOCS Cd 18-90.
Pesou-se 0,5 g da amostra de óleo de peixe em um balão volumétrico de 25 mL, dissolveu-se
o óleo em hexano e completou-se o volume com o mesmo solvente. A amostra dissolvida foi
transferida para uma cubeta de 1 cm e sua absorbância foi medida a 350 nm, utilizando o
hexano puro com branco. Após leitura da absorbância da amostra, pipetou-se 5 mL da solução
de gordura em um tubo de ensaio e 5 ml de hexano em um segundo tubo de ensaio,
adicionou-se 1 mL do reagente de anisidina (solução 0,25% de p-anisidina em ácido acético
glacial) para cada tubo, tampou-se os dois tubos agitou-se e deixou no escuro por exatamente
10minutos, após esse tempo a absorbância da solução gordura-anisidina contra a solução
solvente anisidina foi medida a 350 nm utilizando-se uma cubeta de 1cm.
Cálculo:
Índice de Anisidina = 25(1,2As –Ab) P
Em que:
As = medida de absorbância da solução gordura-anisidina;
Ab = medida de absorbância da solução de gordura obtida;
P = peso da amostra em gramas.
4.5.5 Determinação do Valor Totox
O valor totox ou valor total da oxidação é dado pela correlação do índice de peróxido
com o índice de anisidina, de acordo com a equação:
Cálculo:
Valor Totox = 2(IP) + (IpA)
Em que:
IP = índice de peróxido;
IpA = índice de anisidina.
46
4.5.6 Determinação da viscosidade
As viscosidades das amostras foram determinadas em um equipamento Brookfield,
modelo LV-DVII (Figura 4.3), na temperatura de 25 °C, usando um adaptador para amostras
pequenas, acoplado a um controlador de temperatura. O splindle usado foi o número 31.
Figura 4.3 – Viscosímetro Brookfield, modelo LV-DVII.
4.6 ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA NO ULTRAVIOLETA
As amostras dos óleos de peixe foram diluídas utilizando-se um volume de 0,05 mL de
amostra em diclorometano em balão de 25 mL. O espectrofotômetro utilizado foi o UV/Vis
Shimadzu 2550 (Figura 4.4), com varredura de 200 a 400 nm.
Figura 4.4 – Espectrofotômetro UV/Vis Shimadzu 2550
47
4.7 ANÁLISE TÉRMICA
4.7.1 Termogravimetria (TG)
As curvas termogravimétricas do óleo clarificado de pescado foram obtidas em um
Analizador Térmico TA instruments SDT 2960 (Figura 4.5), em intervalo de temperatura de
25 a 700 °C com razões de aquecimento de 10, 15 e 20 °C.min-1 em atmosfera de ar sintético
e nitrogênio com vazão de 100 mL.min-1.
Figura 4.5 – Analisador Térmico TA INSTRUMENTS SDT 2960
4.7.2 Calorimetria Exploratória Diferencial Pressurizada (PDSC)
As curvas PDSC foram obtidas através de um Calorímetro Exploratório Diferencial
TA Instruments DSC 2920 (Figura 4.6) acoplado a uma Célula de Pressão, utilizando duas
condições de análise: Análise dinâmica (a fim de auxiliar na seleção da temperatura da
isoterma), e a análise isoterma (com a finalidade de determinar o tempo de indução à
oxidação – OIT).
As dinâmicas se processaram utilizando cadinho de alumina, sob atmosfera de ar
sintético e pressão de 500 psi com razão de aquecimento de 10 °C.min-1, no intervalo de
temperatura de 25 a 500 °C. E as isotermas foram realizadas nas mesmas condições de
48
atmosfera de oxigênio com fluxo de 100 mL.min-1 e pressão de 500 psi. Os valores do OIT
foram determinados pela diferença do tempo onset e do tempo inicial (tempo em que a
amostra atingir a temperatura de isoterma).
Figura 4.6 – Calorímetro TA INSTRUMENTS MDSC 2920
4.8 CROMATOGRAFIA GASOSA
4.8.1 Preparação dos ésteres metílicos
A obtenção dos ésteres metílicos dos óleos de peixe foi realizada de acordo com a
metodologia proposta por Hartman & Lago (1973). O método consiste em pesar 0,2 g da
amostra de óleo de peixe em um balão de boca esmerilhada de 250 mL, adicionar 3 mLs de
hidróxido de potássio (KOH) metanólico a 0,5 N (como agente hidrolizante). Aquecer até
ebulição e deixar em refluxo por 4 minutos. Posteriormente, adiciona-se 7mL de solução de
esterificação (solução de cloreto de amônia e ácido sulfúrico em metanol) mantendo a mistura
em refluxo por mais 4minutos. Em seguida, transfere-se para um funil de separação
adicionando-se 12,5 mL de éter etílico e 25 mL de água destilada, agitando-se lentamente
para separação das fases. A fração lipídica é purificada três vezes com 25 mL de água
49
destilada, decantando e descartando a fase aquosa. No final, a fase orgânica deverá ser filtrada
com sulfato de sódio anidro para reter o excesso de água.
4.8.2 Identificação e quantificação dos ésteres metílicos dos ácidos graxos
A identificação e quantificação dos ésteres metílicos foram realizadas por
cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massa modelo QP 2010 (Shimadzu),
equipado com coluna Durabond (30 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 0,20
µm de espessura de filme) e detector de massas com ionização por impacto de elétrons com
uma energia 70 eV (Figura 4.7).
Figura 4.7 – Cromatógrafo gasoso acoplado a um espectrômetro de massa modelo QP 2010
Foram injetados 1µL das amostras e a razão de divisão (split) foi de 1:50. A
temperatura da coluna foi de 170 °C por 16 minutos, sendo então elevada para 210 °C a uma
taxa de 2 °C.min-1 e mantida a esta temperatura por 5 min. A temperatura do injetor e do
detector foi 25 0°C. O tempo de corrida foi de 41 min. O hélio foi utilizado com gás de
arraste, com um fluxo de 41 cm.seg-1.
A caracterização dos ácidos graxos ocorreu por comparação do espectro de massas
com aquele obtido de padrões existentes na biblioteca do software instalado no CG-MS. Com
50
base nos valores da área total dos picos identificados, sendo estes correspondentes a 100%,
pôde-se quantificar a porcentagem de ácidos graxos em função da área relativa de cada pico.
51
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DO ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDO A PROCESSO
DE REFINO
O processo de refino químico ou alcalino do óleo de peixe bruto inclui a degomagem,
neutralização e clarificação do óleo. A degomagem visa a remoção, eliminação ou inativação
de fosfolipídeos e substâncias afins, além da eliminação de outras impurezas, como sabões e
íons metálicos. Na etapa de neutralização, os ácidos graxos livres são neutralizados por
solução aquosa de álcali em excesso, e eliminados com hidratação. O óleo a ser branqueado é
tratado com materiais adsorventes a fim de haver remoção de pigmentos, produtos de
oxidação, metais e outros. O óleo de peixe é bastante susceptível a oxidação e até mesmo no
processo de refino este pode vir a ser oxidado (MORAIS et al, 2001).
Nos resultados abaixo será mostradas as modificações físico-químicas ocorridas no
óleo de peixe após processo de refino.
A Figura 5.1 exibe a diferença nos valores dos ácidos graxos livres. Observa-se que,
após o refino o óleo reduziu significativamente seu índice de ácidos graxos livres, mostrando
a eficiência do processo de neutralização. Nota-se ainda que o óleo bruto apresentava um alto
percentual de ácido graxo livre, indicando já um processo de deterioração acentuado,
comprovando a baixa qualidade da matéria prima utilizada. Morais et al (2001), conseguiu
reduzir o índice de acidez do óleo de peixe de 5,20% para 0,04% utilizando esta mesma
metodologia. Segundo Rittner (1996), os óleos neutralizados devem apresentar teor máximo
de ácidos graxos livres de 0,1%.
1,29
0,070
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Áci
dos
Gra
xos
Livr
es (
%)
Óleo Bruto Óleo refinado
Amostras
Figura 5.1 –Ácidos graxos livres do óleo de peixe bruto e refinado
52
A Figura 5.2 demonstra que após o processo de refino do óleo de peixe o valor do
índice de iodo foi elevado. Os ácidos graxos livres foram removidos durante o processo de
refino, bem como outras impurezas presentes no óleo, concentrando assim o percentual de
ácidos graxos insaturados que fazem parte da composição do óleo. Os óleos de peixe bruto e
refinado apresentaram um índice de iodo menor do que o encontrado na literatura, Barlow &
Yong (1996) reportam valores de 155 mgI2/100g, sugerindo um número menor de ácidos
graxos polinsaturados na amostra devido provavelmente à reduzida qualidade do óleo.
119,23
139,79
105
110
115
120
125
130
135
140
Índi
ce d
e io
do
(mgI
2/10
0g)
Óleo Bruto Óleo refinado
Amostras
Figura 5.2 – Índice de iodo do óleo de peixe bruto e refinado
A Figura 5.3 reflete a redução no índice de peróxido no óleo de peixe. Nota-se um
elevado teor de peróxido no óleo bruto indicativo de seu elevado estado deteriorativo, o que
respalda a indicação do baixo valor qualitativo da matéria prima. Valores altos de índice de
peróxido sugerem que o óleo encontra-se na fase de propagação do processo oxidativo, tida
como principal etapa da oxidação. Apesar da redução deste índice, o óleo refinado ainda
apresenta-se com valor elevado em relação aos limites aceitáveis (10 meq/Kg). Morais et al
(2001) conseguiram, após refino, índice de peróxido de 2,5 meq/Kg em um óleo também
degradado, a utilização de vácuo durante estes processos pode ser o fator favorecedor.
53
53,28
35,38
0
10
20
30
40
50
60
Índi
ce d
e P
eróx
ido
meq
/Kg
Óleo Bruto Óleo refinado
Amostras
Figura 5.3 – Índice de peróxido do óleo de peixe bruto e refinado
O índice de anisidina é uma medida que reproduz os valores de compostos secundários
da oxidação. É possível observar um aumento nos valores do índice de anisidina após
processo de refino (Figura 5.4). Apesar da redução nos índices de peróxidos, a proporção de
compostos secundários foi elevada Nota-se que as temperaturas utilizadas durante as etapas
do processo de refino podem ter favorecido o andamento do processo oxidativo, já que este
foi conduzido em meio oxidante, sob atmosfera não controlada.
12,57
25,3
0
5
10
15
20
25
30
Índi
ce d
e A
nisi
dina
Óleo Bruto Óleo refinado
Amostras
Figura 5.4 – Índice de anisidina do óleo de peixe bruto e refinado
54
O Valor totox correlaciona o nível de peróxido, que representam o potencial de
degradação da qualidade organoléptica e os aldeídos, representativos do estado de
deterioração efetivo dos óleos (SILVA, 1999). Na Figura 5.5 está descrito o decréscimo do
valor totox no óleo após processo de refino. Apesar do acréscimo no índice de anisidina, o
processo de refino conseguiu reduzir o valor de oxidação do óleo a partir da remoção de uma
alíquota dos peróxidos.
119,11
96,07
0
20
40
60
80
100
120
Val
or d
e T
otox
Óleo Bruto Óleo refinado
Amostras
Figura 5.5 –Valor totox do óleo de peixe bruto e refinado
As viscosidades do óleo de peixe bruto e refinado (Figura 5.6) mantiveram-se quase
inalteradas, o processo de refino não interferiu significativamente nesta característica da
amostra.
57,64 57,19
5051525354555657585960
Vis
cosi
dade
mP
a.s
Óleo Bruto Óleo refinado
Amostras
Figura 5.6 –Viscosidade do óleo de peixe bruto e refinado
55
A Tabela 5.1 mostra as variações nos parâmetros físico-químicos do óleo de peixe
após processo de refino. O índice de ácidos graxos livres variou de 1,29 para 0,07 %. O índice
de iodo modificou de 119,23 para 139,79 mgI2/100 g. O índice de peróxido reduziu de 53,28
para 35,38 mEq/Kg, enquanto houve um aumento no índice de anisidina de 12,57 para 25,30.
O valor totox reduziu de 119,11 para 96,07. O valor da viscosidade manteve-se quase
constante, com uma redução de 57,64 para 57,19 cP.
As análises físico-químicas do óleo bruto demonstraram o alto teor de degradação do
óleo, evidenciando a qualidade inferior da matéria prima utilizada. Vários fatores podem
afetar a qualidade da matéria prima, desde a captura do pescado, passando pelo processo de
extração, transporte, acondicionamento do óleo.
Tabela 5.1 – Análises físico-químicas do óleo de peixe bruto e refinado Análises físico-químicas Óleo de peixe bruto Óleo de peixe refinado
% Ácidos Graxos Livres (%AGL) 1,29 ± 0,12 0,07 ± 0,01 Índice de Iodo (II) 119,23 ± 0,10 139,79 ± 0,17 Índice de Peróxido (IP) 53,28 ± 0,12 35,38 ± 0,16 Índice de Anisidina (IpA) 12,57 ± 0,30 25,3 ± 0,00 Valor Totox (VT) 119,11 ± 0,23 96,07 ± 0,32 Viscosidade (V) 57,64 ± 0,09 57,19 ± 0,15 *Médias seguidas de desvio padrão (n=3).
5.2 ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ELETRÔNICA (UV/VIS) DO
ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDO A PROCESSO DE REFINO
Os valores de absortividade do espectro UV-Visível espelham o estado oxidativo do
óleo, visto identificarem o acúmulo de compostos primários e secundários resultantes da
oxidação.
Na Figura 5.7 estão inseridos os perfis de absorção no UV-Visível do óleo bruto e
refinado de pescados. Nota-se redução da absorbância no comprimento de onda 230 nm que
se refere aos dienos conjugados, corroborando com os valores obtidos de índice de peróxido
confirmando a observação feita por Shahide (1995), que existe uma correlação direta entre os
valores de índice de peróxido e de absortividade na faixa do ultravioleta a 232 nm no início do
processo oxidativo.
56
150 200 250 300 350 400 450 500
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Abs
orbâ
ncia
(u.
a)
Comprimento de onda (nm)
óleo bruto óleo refinado
Figura 5.7 - Espectros de absorção no UV/Vis do óleo de peixe bruto e refinado.
A absortividade a 270 nm reflete a formação de trienos conjugados e de compostos
secundários durante a oxidação do óleo, que é proporcional a absorção de oxigênio pelo óleo
(ROVELLINE et al, 1997). Na curva, pode-se observar que há um aumento na absorbância a
272 nm e em torno de 320 nm, que são atribuídos à formação de trienos e tetraenos, bem
como a formação de aldeídos, cetonas e ácidos; produtos secundários da oxidação, estando de
acordo com o acréscimo observado no índice de anisidina e corroborando com o analisado
anteriormente; que diz que a não supressão da atmosfera oxidante, e a escolha das
temperaturas utilizadas no processo, subsidiam o aumento na formação de compostos
secundários da oxidação, demonstrando assim a susceptibilidade à degradação dos ácidos
graxos de cadeia longa presentes no óleo. Os espectros de absorção no UV-Visível
reproduzem de maneira satisfatória os resultados obtidos nas análises fisico-químicas.
5.3 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DA DO ÓLEO DE PEIXE BRUTO E REFINADO Diversos são os fatores que influenciam a composição corporal de peixes, entre eles o
tipo de alimentação, maturação, idade, sexo, localização geográfica do habitat e estação do
ano, o que provoca uma grande variedade entre espécies e intraespecificamente
(BADOLATO et al, 1994).
57
Além destes, quando se considera processamento de alimentos de origem marinha
deve-se incluir, ainda, todas as etapas pelas quais passam os pescados até a chegada ao
consumidor ou, quando o foco são os subprodutos , até o final da linha de produção. O
método de pesca, o período entre captura e despesca, a duração e o tipo de armazenamento
nas embarcações de pesca e nas indústrias, além do processamento recebido (SILVA et al,
1993).
Na Tabela 5.2, retirada do cromatograma do óleo de peixe bruto e refinado (ANEXO
I) estão descritos os resultados dos percentuais de ácidos graxos presentes nestes óleos. O
percentual de ácidos graxos saturados compreende 23,29% no óleo bruto e 19,15% no óleo
neutralizado; os ácidos monoinsaturados 32,63 e 30,96% no óleo bruto e refinado
respectivamente; os ácidos polinsaturados correspondem a um percentual de 44,08 e 49,89%.
Entre os ácidos graxo saturados o ácido palmítico é o principal componente perfazendo um
percentual de 16,44 e 13,43% no óleo bruto e refinado, o ácido oléico é o principal
componente monoinsaturado com 32,63 e 30,96% no óleo bruto e refinado e o ácido linoléico
o principal representante da família dos ácidos polinsaturados com um total de 44,08 e
49,89% no óleo bruto e refinado.
Observa-se uma redução no percentual na maioria dos ácidos graxos obtidos, o ácido
linoléico é o único que apresenta seus valores aumentados. No processo de refino, os ácidos
graxos livres hidrolizados oriundos principalmente dos ácidos de menor peso molecular, neste
caso o palmítico; e os peróxidos formados principalmente dos ácidos altamente insaturados
são reduzidos, concentrando, assim, os valores do ácido linoléico.
Os ácidos graxos considerados característicos dos óleos de peixe de origem marinha,
encontram-se em percentuais inferiores ao observado por outros autores como Shimada et al
(1997) que obtiveram valores de 6,5% de eicosapentaenóico e 22.9% de docosahexaenóico, e
por Moura et al (2006) que obtiveram 14,80 e 1,92% valores esses bem superiores aos obtidos
neste trabalho que foram de 0,5 e 1,46% respectivamente no óleo bruto e refinado.
As características apresentadas pela tabela indicam ou um estado oxidativo acentuado
da matéria prima com implicação na redução dos ácidos graxos polinsaturados que são
susceptíveis a este ataque, ou o óleo de peixe ser obtido a partir de peixes de água doces, que
apresentam como característica a presença de ácido linoléico em abundância como nos óleos
vegetais.
58
Tabela 5.2 – Principais ácidos graxos presentes no óleo de peixe bruto e refinado.
Ácidos Graxos Óleo bruto Óleo neutralizado
Palmítico 16:0 16,44% 13,43% esteárico 18:0 5,42% 4,65% araquídico 20:0 0,51% 0,40% behenico 22:0 0,66% 0,50% lignocérico 24:0 0,26% 0,17% Total de saturados 23,29% 19,15% Palmitoleico 16:1n-7 0,89% 0,57% Oléico 18;1n-9 30,92% 29,93% docosenóico 22:1 n-9 0,32% 0,16% eicosenoico 20:1 n-9 0,50% 0,30% Total de monoinsaturados 32,63% 30,96% Linoléico 18:2n-6 41,14% 47,91% alfa-linolênico 18:3 n-3 0,98% 0,73% eicosapentaenoico 20:5 n-3 0,50% 0,29% docosahexaenoico 22:6 n-3 1,46% 0,96% Total de polinsaturados 44,08% 49,89%
5.4 ESTUDO TÉRMICO
5.4.1 Dependência do perfil termogravimétrico em função das razões de aquecimento
As amostras do óleo de peixe refinado foram avaliadas em várias razões de aquecimento
(10, 15 e 20 oC/min.) em atmosfera de ar e nitrogênio, para visualizar a influência da razão de
aquecimento no perfil termogravimétrico das mesmas, conforme Figura 5.8 e 5.9.
100 200 300 400 500 600 700
0
20
40
60
80
100
Per
da d
e M
assa
(%
)
Tem peratura (ºC )
10 ºC.m in -1
15 ºC.m in -1
20 ºC.m in -1
(a)
Figura 5.8 – Curvas TG do óleo de peixe refinado em diferentes razões de aquecimento, em atmosfera de ar sintético.
59
100 200 300 400 500 600 700
0
20
40
60
80
100
Per
da d
e M
assa
(%
)
Temperatura (ºC)
10 ºC.min -1
15 ºC.min -1
20 ºC.min -1
(b)
Figura 5.9 – Curvas TG do óleo de peixe refinado em diferentes razões de aquecimento, em atmosfera de nitrogênio.
Nas Figuras 5.8 e 5.9 verifica-se que com o aumento da razão de aquecimento, tanto em
atmosfera de ar como de nitrogênio, o perfil das curvas termogravimétricas foram deslocados
para maiores temperaturas..
As curvas termogravimétricas medem a perda de massa em função da temperatura e
também do tempo de exposição da amostra a este gradiente de temperatura. Portanto não
podemos avaliar a dependência do perfil termogravimétrico levando em consideração apenas
as temperaturas as quais as amostras foram submetidas, o binômio tempo x temperatura
influencia conjuntamente na oxidação térmica da amostra, quanto maior a razão de
aquecimento menor será o tempo de exposição da amostra as temperaturas escolhidas, o que
acarreta numa distribuição de calor menos uniforme, reduzindo o início da degradação
térmica e deslocando, assim, o perfil das curvas para maiores temperaturas. Deste modo a
razão de aquecimento que melhor reproduz os resultados nas duas atmosferas é a de 10 º
C.min-1.
5.4.2 Dependência do perfil termogravimétrico em função das atmosferas
A Figura 5.10 mostra a dependência do perfil termogravimétrico do óleo de peixe
refinado em função da atmosfera. As amostras foram aquecidas na razão de 10 ºC.min-1,
variando a atmosfera: ar sintético e nitrogênio.
60
Figura 5.10 – Curvas TG/DTG do óleo de peixe refinado em atmosfera ar sintético (A) e nitrogênio (B).
De acordo com as curvas TG/DTG do óleo de peixe refinado (Figura 5.10 e Tabela 5.3)
pode-se observar que na atmosfera oxidante (ar) o perfil termogravimétrico apresentou quatro
etapas de decomposição, sendo a primeira etapa de decomposição em 187,98 °C com perda de
massa de 27,93%, a segunda com Temperatura onset 355,74 °C com uma perda de massa de
53,30%, a terceira temperatura de decomposição em 442,2 °C com perda de massa de 12,43%
e a última etapa com Temperatura onset de 476,70 °C e perda de massa de 6,345%, que
podem ser atribuídas à volatilização e/ou decomposição dos triacilglicerídeos. Na atmosfera
inerte (nitrogênio) apenas uma etapa foi observada, com temperatura de decomposição em
222,42 °C com aproximadamente 100% de perda de massa. Pelo comportamento observado
nas curvas TG, provavelmente em atmosfera oxidante o processo de decomposição ocorre por
combustão e em atmosfera inerte por pirólise. Observou-se ainda que o perfil
termogravimétrico do óleo de peixe refinado em atmosfera oxidante apresentou temperatura
inicial de decomposição menor (187,98 °C) do que em atmosfera inerte (222,42 °C),
sugerindo favorecimento do processo de decomposição.
(A) (B)
100 200 300 400 500 600 700
0
20
40
60
80
100
TG
Temperatura (ºC)
Per
da d
e M
assa
(%
)
Ar Sintético
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
DTG
Deriv. M
assa (%/°C
)100 200 300 400 500 600 700
0
20
40
60
80
100
TG
Temperatura (°C)
Per
da d
e M
assa
(%
)
Nitrogênio
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
DTG
Deriv. M
assa (%/°C
)
61
Tabela 5.3 – Dados termogravimétricos das amostras de óleo de peixe refinado em atmosfera oxidante (ar sintético) e inerte (nitrogênio)
Amostra Etapa TINICIAL (oC) TFINAL (oC) ∆ massa (%)
Óleo de peixe refinado
(atmosfera ar)
1 2 3 4
187,98 355,74 442,27 476,70
355,74 442,27 476,70 561,46
27,93 53,30 12,43 6,34
Óleo de peixe
refinado (atmosfera de N2)
1
222,42
483,76
100,00
Quando os óleos e gorduras são aquecidos a altas temperaturas, o processo de
oxidação é acelerado, ocorrendo reações de oxipolimerização e decomposição termo-
oxidativa (KOVALSKI, 1990). Segundo Hellin & Pilar Rueda (1984), as modificações e
alterações de óleos ocorridas em temperaturas que variam entre 200 e 300 °C na ausência de
oxigênio são características da oxidação por polimerização térmica, já na presença de
oxigênio a altas temperaturas ocorre o processo de oxidação térmica ou oxipolimerização.
A temperatura inicial de decomposição do óleo de canola é 211,21 °C
(ALBUQUERQUE, 2006), no óleo de milho encontra-se uma temperatura onset de 224,67 °C
(DANTAS, 2006), o sebo bovino apresenta uma temperatura inicial de decomposição térmica
em 199,46 °C (MOURA, 2007). O óleo de peixe apresenta a menor temperatura de
decomposição térmica, devido a sua composição rica em ácidos graxos polinsaturados de
cadeia longa.
Alguns autores sugerem que a perda inicial de massa nas decomposições térmicas seja
atribuída aos ácidos graxos insaturados e as decomposições seguintes aos ácidos graxos
saturados e posterior carbonização do material. No entanto, o comportamento dos ácidos
graxos à temperatura elevada é muito variado levando em consideração não apenas as
insaturações mais também o tamanho da molécula e suas interações. Sathivel et al (2003),
analizou as curvas termogravimétricas de ácidos graxos puros em temperatura inerte e
observou que a 200 °C os ácidos graxos que tiveram maior perda de massa foram o mirístico
(14:0) e o palmitoléico (16:1), o ácido docasapentaenóico (22:6) apresentou menor perda de
massa, o ácido oléico (18:1) mesmo a temperatura de 250 °C apresentava uma pequena perda
de massa em relação aos outros ácidos graxos; à temperaturas acima de 400 °C todos os
ácidos já haviam sido degradados. É importante salientar que em atmosfera inerte os ácidos
62
graxos se comportam de maneira diferente à atmosfera oxidante, sendo preciso análises das
temperaturas de decomposição dos ácidos graxos puros em atmosfera de ar para entender a
ordem de decomposição dos mesmos.
5.4.3 Calorimetria exploratória diferencial pressurizada (PDSC)
A curva PDSC dinâmica, mostrada na Figura 5.11, foi realizada para a visualização da
melhor temperatura a ser utilizada no ensaio isotérmico.
0 100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
PD
SC
(W
/g)
Temperatura (ºC)
Figura 5.11 – Curva PDSC dinâmica do óleo de peixe refinado durante armazenamento prolongado.
A curva calorimétrica exploratória diferencial pressurizada (PDSC) realizada em
isoterma foi obtida visando-se verificar o comportamento oxidativo do óleo de peixe
neutralizando. O tempo de indução oxidativa (OIT) foi determinado a uma temperatura de
isoterma de 100 °C em atmosfera de oxigênio conforme Figura 5.12.
63
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
2
4
6
8
Flu
x de
Cal
or (
W/g
)
Temperatura (ºC)
OIT = 36,42 min
Figura 5.12 – Curva PDSC do óleo de peixe refinado durante armazenamento prolongado.
O óleo de peixe refinado apresentou um tempo de indução oxidativa de 36,42 min à
temperatura de 100 °C. Ainda são escassos os estudos do tempo de indução oxidativa
utilizando o PDSC, principalmente de óleos de origem animal. É de absoluta importância o
conhecimento do OIT para que se possam predizer as melhores condições de tempo e
temperatura a serem utilizados no processamento do óleo.
Atualmente os métodos mais utilizados para medir a estabilidade oxidativa de óleos
são o método do oxigênio ativo (AOM) e o método do Rancimat. No AOM, a amostra é
aquecida a 100 °C, e a oxidação é medida através da análise do índice de peróxido em
intervalos regulares até que seja alcançado um índice de peróxido de 100 mEq/Kg. Para
amostras que formam peróxidos instáveis, índice de peróxidos iguais a 100mEQ/Kg nunca
podem ser alcançados, e tais medidas não tem nenhum significado. O método Rancimat a
temperatura de 100 °C correlaciona-se bem com a estabilidade do óleo medida por
desenvolvimento de peróxido a 20 °C. Outro método oficial para medir o período de indução
oxidativa é o OSI (índice de estabilidade de óleo). Valores de OSI geralmente correspondem
bem com valores de AOM se o índice de peróxido for 200mEQ/Kg ou maior. Porém estas
técnicas prolongam o tempo de experimento, e são associadas com erros se houverem
pequenas mudanças dentro da taxa de fluxo de ar oxidante, além da inabilidade para mostrar
pequenas mudanças na matriz do óleo.
A estabilidade medida pelo PDSC requer uma quantidade menor de amostra além de
reduzir bastante o tempo de análise em relação aos métodos convencionais que podem levar
até dias para serem medida. É um método bastante reprodutível e versátil tornando-se uma
64
opção para a indústria de alimentos na caracterização oxidativa de óleos em tempos
relativamente curtos (KODALI, 2005).
5.5 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DO ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDOS A PROCESSO
DE DEGRADAÇÃO TÉRMICA
O percentual de ácidos graxos livres dos óleos refinado, degradados a 190 °C e
degradado a 360 °C são mostrados na Figura 5.13. É evidenciado um acréscimo progressivo
no índice de acidez à medida que o óleo aumenta a temperatura de degradação. Os ácidos
graxos livres são formados através do processo de rancidez hidrolítica, que é favorecida pelo
aumento da exposição à temperatura. Reda (2004) ratifica a mesma característica progressiva
nos valores de ácidos graxos livres com o aumento do tempo e da temperatura de exposição
ao óleo.
0,07
0,17
0,32
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Áci
dos
Gra
xos
Livr
es %
Refinado Degradado a190°C
Degradado a360°C
Amostras
Figura 5.13 - Ácido graxos livres de óleos submetidos à degradação térmica.
O índice de iodo apresenta relação decrescente nos seus valores em relação ao
aumento da temperatura de degradação como mostrado na Figura 5.12. À medida que os
peróxidos vão sendo transformadas em compostos secundários mais estáveis e estes unem–se
para formar polímeros, o número de ligações duplas de seu esqueleto carbônico vão sendo
reduzida. A rancidez hidrolítica também afeta o índice de iodo, uma vez que, a quebra dos
ésteres glicerídios acarreta em redução nos números de duplas ligações. Além disso, a
formação de dienos conjugados pode alterar as medidas do índice de iodo, já que eles tendem
a ligar-se apenas a uma das duplas conjugadas.
65
139,79
120,19
84,13
020406080
100120140
Índi
ce d
e Io
do
mgI
2/10
0g
Refinado Degradado a190°C
Degradado a360°C
Amostras
Figura 5.14 – índice de iodo de óleos submetidos à degradação térmica
Outro efeito importante observado nas análises físico-químicas foi a redução dos
teores de peróxidos. Podendo ser explicada pela natureza dos peróxidos formados, os quais
são muito instáveis, reativos e se degradam facilmente, formando produtos mais estáveis
como dímeros, trímeros e polímeros (Figura 5.15) característico da fase de terminação do
processo oxidativo.
35,38
9,85
3,9205
10152025303540
Índi
ce d
e P
eróx
ido
meq
/Kg
Refinado Degradado a190°C
Degradado a360°C
Amostras
Figura 5.15 – índice de peróxido de óleos submetidos à degradação térmica.
O índice de anisidina mede a quantidade de aldeídos, produtos secundários da
oxidação. A polimerização dos compostos secundários explica a redução no valor do índice
de anisidina a 190 °C. Havendo uma formação de novos compostos secundários oriundos da
degradação dos peróxidos neste mesmo momento, já que os compostos não seguem uma
66
cinética definida. O índice de anisidina (Figura 5.16) apresentou um comportamento
interessante, caracterizado por uma redução seguida de elevação nos seus teores.
25,3
17,8921,1
0
5
10
15
20
25
30
Índi
ce d
e A
nisi
dina
Refinado Degradado a190°C
Degradado a360°C
Amostras
Figura 5.16 – índice de anisidina de óleos submetidos à degradação térmica.
O aquecimento mais enérgico na segunda fase proporcionou as condições necessárias
para que os peróxidos formados sofressem polimerização com respectiva elevação na sua
viscosidade como mostrado na Figura 5.17.
57,19 57,97
75,75
01020304050607080
Vic
osid
ade
mP
a.s
Refinado Degradado a190°C
Degradado a360°C
Amostras
Figura 5.17 –Viscosidade de óleos submetidos à degradação térmica
Na Tabela 5.4 são expostos os valores das análises físico químicas dos óleos refinado,
degradado a 190 °C e degradado a 360 °C. Os valores de ácido graxos livres encontrados
foram respectivamente 0,07; 0,17 e 0,32% (no óleo refinado, degradado a 190 °C e a 360 °C).
O índice de iodo foi estimado em 139,79; 120,19 e 84,13 %. Os valores do índice de anisidina
e viscosidade determinados foram 25,30; 17,89 e 21,10 para a anisidina e 57,19; 57,97 e
75,75 Cp para a viscosidade seguindo a mesma ordem.
67
Tabela 5.4 – Análise físico-química dos óleos de peixe refinado e degradado termicamente.
*Médias seguidas de desvio padrão (n=3).
5.6 ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO ELETRÔNICA (UV/VIS) DO
ÓLEO DE PEIXE SUBMETIDO A PROCESSO DE DEGRADAÇÃO TÉRMICA
No espectro de absorção UV-Vis dos óleos degradados (Figura 5.18) é possível
observar o aumento na região de absorção referente aos dienos (232 nm) com a elevação da
temperatura. Observa-se máxima absorção em óleos degradados 360 °C. O óleo degradado a
190°C apresentou uma absorção igual ao do óleo refinado, reduzindo a absorção na região de
trienos e compostos secundários como ácidos, cetonas e aldeídos. Possivelmente, pelo inicio
do processo de polimerização enquanto outros peróxidos e dienos eram formados.
150 200 250 300 350 400 450 500
-0,20,00,20,40,6
0,81,01,2
1,41,61,82,02,22,4
2,62,83,03,2
Abs
orbâ
ncia
(ua
)
Comprimento de onda (nm)
óleo refinado óleo degradado 190ºC óleo degradado 360ºC
Figura 5.18 - Espectros de absorção no UV/Vis dos óleos de peixe refinado e degradado.
Análises físico-químicas
Óleo refinado
Óleo degradado 190 °C
Óleo degradado 360 °C
% Ácidos Graxos Livres (%AGL) 0,07 ± 0,01 0,17 ± 0,04 0,32 ±0,02 Índice de Iodo (II) 139,79 ± 0,17 120,19 ± 0,62 84,13 ± 0,61 Índice de Peróxido (IP) 35,38 ±0,16 9,85 ± 0,04 3,92 ± 0,01 Índice de Anisidina (IpA) 25,3 ± 0,00 17,89 ± 0,06 21,10 ± 0,00 Viscosidade (V) 57,19 ± 0,15 57,97 ± 0,16 75,75 ± 0,26
68
Todos os espectros mostram forte absorção em 230 nm, devido às ligações duplas
carbono-carbono presentes nos ácidos graxos insaturados e que contribuem para o alto grau de
insaturação dos óleos. Estas observações estão de acordo com relatos da literatura para
espectros de ultravioleta de compostos insaturados (OWEN et al., 2003).
Os espectros mostram um pronunciado efeito batocrômico inerente a progressiva
termo-oxidação dos óleos estudados, processo que leva a formação de peróxidos e de
isômeros trans conjugados, o que necessariamente aumenta a intensidade e posição da banda
de absorção para comprimentos de onda maiores (o efeito batocrômico). Estas observações
são compatíveis com as alterações estruturais que ocorrem nos ácidos graxos insaturados
livres ou esterificados em triacilgliceróis durante o processo termooxidativo, devido às
reações de isomerização, com a conseqüente formação de sistemas conjugados: reações de
epoxidação e peroxidação. Sendo possível monitorar a qualidade dos óleos por meio dos
espectros de UV-vis (REDA, 2004).
5.7 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DO ÓLEO DE PEIXE REFINADO E DEGRADADO
Na Tabela 5.5 e cromatograma (ANEXO 2) estão expostos os valores dos percentuais
do óleo de peixe refinado e após o processo de deterioração térmica. Observa-se
comportamentos diferentes em relação a redução dos ácidos graxos do óleo degradado a 190 e
a 360 °C. O óleo degradado a 190 °C obteve uma redução dos ácidos saturados de 19,15 para
18,38% e dos monoinsaturados de 30,96% para 30,73%. Com aumento nos índices de
polinsaturados atribuindo principalmente ao ácido linoléico. Quando o óleo é degradado até
360 °C há uma redução nos ácidos polinsaturados de 51,38 para 48,59% e aumento no teor de
monoinsaturados, principalmente o oléico que é mais estável. Observa-se ainda que a 360 °C
o ácido eicosapentaenóico foi totalmente degradado. De maneira geral, observa-se que não
houve diferenças significativas. A cinética de degradação dos ácidos graxos é muito
complexa, e necessita de estudo mais aprofundado.
69
Tabela 5.5 – Principais ácidos graxos presentes no óleo de peixe bruto e refinado
Ácidos Graxos Óleo neutralizado Óleo degradado
190 °C Óleo degradado
360 °C
Palmítico 16:0 13,43% 12,88% 13,42% esteárico 18:0 4,65% 4,59% 5,36% araquídico 20:0 0,40% 0,45% 0,42% behenico 22:0 0,50% 0,36% 0,51% lignocérico 24:0 0,17% 0,10% 0,13% Total de saturados 19,15% 18,38% 19,84% Palmitoleico 16:1n-7 0,57% 0,54% 0,51% Oléico 18;1n-9 29,93% 29,73% 30,59% docosenóico 22:1 n-9 0,16% 0,17% 0,19% eicosenoico 20:1 n-9 0,30% 0,29% 0,30% Total de monoinsaturados 30,96% 30,73% 31,59% Linoléico 18:2n-6 47,91% 48,95% 45,93% alfa-linolênico 18:3 n-3 0,73% 0,78% 0,90% eicosapentaenoico 20:5 n-3 0,29% 0,25% 0,00% docosahexaenoico 22:6 n-3 0,96% 0,91% 0,87% Total de polinsaturados 49,89% 51,38% 48,57%
70
6 CONCLUSÕES
O processo de Refino do óleo de peixe demonstrou-se eficaz na redução dos ácidos
graxos livres. Porém ineficiente para a redução de peróxidos a níveis aceitáveis. A elevação
do índice de anisidina evidencia a formação de produtos secundários durante o refino. O
controle da atmosfera e das temperaturas torna-se essenciais para a otimização do processo;
As avaliações físico-química e cromatográfica indicam o acentuado grau de
deterioração do óleo de peixe bruto, evidenciando uma matéria prima de reduzida qualidade;
O acompanhamento da absorbância no UV-Vis mostrou ser um recurso eficaz para a
avaliação do efeito térmico na estabilidade do óleo de peixe, uma vez que, deste modo a
formação de dienos e trienos conjugado, que são produtos da oxidação ocorrida, é
monitorada;
As curvas TG do óleo de peixe refinado permaneceram estáveis termicamente até
187,98 °C em atmosfera de ar e até 222,42 °C em atmosfera de nitrogênio, demonstrando a
eficiência do controle da temperatura sobre a degradação;
A curva PDSC mostrou que o tempo de indução oxidativa (OIT) do óleo de peixe
refinado a 100 °C e pressão de atmosfera de 500 psi foi de 36,42 minutos;
Óleos de peixe sob estresse térmico deterioram rapidamente conforme demonstraram
as técnicas analíticas, espectroscópica e termogravimétricas. O mecanismo oxidação do óleo
de peixe foi favorecido pelas condições de temperatura e pelo número de ligações duplas nos
ésteres de ácidos graxos. O processo foi responsável pelo surgimento de produtos oxidados
que aumentaram a absorvância do óleo;
Foi observado nos cromatogramas que não houve diferenças significativas na maioria
dos ácidos graxos detectados nos óleos bruto, refinado e degradado. No óleo refinado o ácido
linoléico eleva-se após neutralização e ácido eicosapentaenóico foi totalmente degradado a
360 °C.
71
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
• Otimizar o processo de refino do óleo de peixe;
• Verificar o processo do óleo de peixe utilizando a técnica simultânea TG_MS;
• Comparar a composição e degradação de óleo de peixe encapsulados com o
óleo comercial bruto.
• Utilização de antioxidantes naturais diversos no óleo de peixe.
72
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SIRIWARDHANA, N.; LEE, K.W.; KIM, S.H.; HA,J. H.; PARK,G. T.; JEON, Y. J. Lipid peroxidation inhibitory effects of Hizikia fusiformis methanolic extract on fish oil and linoleic acid. Food Science and Technology International,2004, v. 10, n. 2, p.65-72 SYDNEY-SMITH, MELVYN. The Clinical Application of Essential Fatty Acids in Treatment of Chronic Disease. A Nutrition Medicine seminar on clinical therapy. University of New England. Armidale. Austrália: 2005. Em http://www.nutrition-education.com/ SUÁREZ-MAHECHA, H., FRANCISCO, A., BEIRÃO, L. H., BLOCK, J. M., SACCOL, A.; PARDO-CARRASCO, S. Importância de ácidos graxos polinsaturados presentes em peixes de cultivo e de ambiente natural para a nutrição humana. Boletim do Instituto de Pesca, 2002, v.28, n.1, p. 1002-110. SZEKELY, G.; NEBULONI, M. & ZERILLI, L. F.; Thermochimica Acta, 1992, v.196, p.511 WAITTZBERG, D. L., BORGES, V. C. Nutrição Oral, Enteral e Parenteral na Prática Clínica.São Paulo, Atheneu, 2002. 3ed. WARD, O.P. Microbial production of long-chain PUFAs. Biotechnology Inform,1995, v. 6, n.6, p. 683-687 WEAVER, B.J.; HOLOB, B.J. Health effects and metabolism of dietary eicosapentaenoic acid. Progress in Food and Nutrion Science,1998, v.12, p. 111-150 WENDLANDT, W. Termal Methods of Analysis. John Wiley & Sons (1964) pp. 2-4. In: IONASHIRO, M. Análise térmica. Instituto de química de Araraquara – Departamento de química Analítica – UNESP. WENDLANDT, W. W.; Chimia, 26: 1, 1972. WENDLANDT, W. W.; Thermal Analysis, Third Edition, Jonh Wiley & Sons, New York, 1986. YAMADA ,T.; STRONG , J. P.; ISHII, T.; UENO, T.; KOYAMA, M.; WAGAYAMA, H.; SHIMIZU, A.; SAKAI, T.; MALCOM, G.T.; GUZMAN, M. A. Atherosclerosis and ω-3 fatty acids in the populations of a fishing village and a farming village in Japan. Atherosclerosis, 2000, vol.153, n.2, p.469-481
81
ANEXOS
82
ANEXO I
Cromatogramas dos óleos de peixe bruto e refinado
0 5 10 15 20 25 30 35 40 450,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Tempo de Retenção (min)
Refinado
0 5 10 15 20 25 30 35 40 450,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Inte
sida
de R
elat
iva
Bruto
83
ANEXO II
Cromatogramas dos óleos de peixe refinado e degradados
0 5 10 15 20 25 30 35 40 450,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Degradado 360 ºC
Tempo de Retenção (min)
Inte
nsid
ade
Rel
ativ
a
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Degradado 190 ºC
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Refinado
