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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE AVALIAÇÃO “IN VITRO” DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES SOLUÇÕES A BASE DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO Eduardo José Guerra Seabra Natal\RN 2008

AVALIAÇÃO “IN VITRO” DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE ... · presentes na boca são as principais causadoras de duas das patologias mais comuns; cárie dentária e doença periodontal

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO “IN VITRO” DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES SOLUÇÕES A BASE DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO

Eduardo José Guerra Seabra

Natal\RN 2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

AVALIAÇÃO “IN VITRO” DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE DIFERENTES SOLUÇÕES A BASE DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO

Eduardo José Guerra Seabra

NATAL 2008

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Seabra, Eduardo José Guerra. Avaliação “in vitro” da atividade antimicrobiana de diferentes soluções a base de hidróxido de cálcio. Eduardo José Guerra Seabra – Natal, RN, 2008.

....41 p Orientador: Antonio de Lisboa Lopes Costa. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de

Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde - UFRN. 1. Hidróxido de cálcio – Tese. 2. HCT20 – Tese. 3. Controle químico do

biofilme dental – Tese. 4. Clorexidina – Tese. 5. Odontologia – Tese. 6. Periodontia. – Tese. I. Costa, Antonio Lisboa Lopes da. II. Título.

RN/UF/BSO Black D 64

Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte UFRN/Biblioteca Setorial de Odontologia

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DEDICATÓRIA

“ A morte de um professor equivale ao incêndio de uma biblioteca. Ele

não só se vai, mas leva consigo acúmulo de conhecimentos capazes de

iluminar gerações de estudantes e profissionais.”

Dizer africano.

O professor, e grande cientista, Sérgio Valmor Barbosa pode até ter

levado algumas chaves importantes para os caminhos da ciência. Mas,

certamente, deixou àqueles que souberam apreciá-lo e observá-lo princípios,

curiosidades e inquietudes. Valores estes primordiais à docência, bem como a

alma de cientista essencial a um bom pesquisador.

Que os princípios deixados por este grande homem perpetuem através

de seus orientados e seguidores . Como eu, que tive a honra de ser orientado

por ele no mestrado e grande parte do doutoramento.

Este trabalho, pela sua própria essência, não existiria se não fosse a

mente brilhante de Sérgio Valmor Barbosa.

Fazendo alusão aos escritos sagrados, Matuzalém foi um homem que

viveu por 900 anos mais ou menos. Qual o seu legado? Deixou filhos e filhas.

Já Moisés não viveu mais que 50 anos. Mas certamente a Bíblia seria diferente

não fosse sua existência e sua obra. O professor Sérgio Valmor trilhou seu

caminho estando sempre mais para Moisés que para Matuzalém.

Enfim, qualquer atitude diferente de dedicar 100% da realização desta

etapa da minha vida profissional a Sérgio Valmor faria com que eu me sentisse

desprestigiando sua importância não só para a minha formação, mas também a

relevância que ele para a ciência da Odontologia, com toda a sua obra real e

palpável.

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AGRADECIMENTOS

Esta é a parte mais difícil do trabalho, pois a responsabilidade de não

cometer nenhuma injustiça é enorme. E isso faz com que a gente fique por

vários minutos simplesmente olhando para a tela do computador, na vil

esperança que ela “nos tire deste perrengue.”

Todas as pessoas que são ou que foram importantes para a minha vida,

seja a profissional ou a pessoal sintam-se sincera e humildemente abraçadas e

reverenciadas por mim.

A minha família merece sempre um carinho e atenção especiais de

agradecimentos. Meus pais: Eduardo e Zélia; esposa: Isabela; filhos: Gabriel e

Maria Eduarda.

Deus os abençoe e nos ajude a construir nossos caminhos. Amém.

Agradecimentos especiais aos professores Kênio Costa Lima pela

construção e execução de grande parte deste projeto.

Ao professor Antonio de Lisboa Lopes Costa, pelo desprendimento e

presteza mostrados ao assumir a continuidade deste trabalho, mesmo com

todos os seus afazeres, o meu agradecimento só é menor que minha

reverência.

Quero agradecer também a todas as pessoas importantes na minha vida

profissional, onde para não citar todos e certamente esquecer alguém,

represento-os com muita propriedade na pessoa da professora Auxiliadora

Nesi, que sempre foi tão amiga e me acolheu tão bem, como lhe é peculiar, na

carreira docente.

Finalmente, agradeço à UFRN, por ter me dado oportunidade de trilhar

toda a espinha dorsal do caminho acadêmico nas suas dependências

estruturais e cerebrais (professores): graduação, mestrado e doutorado.

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Fase 1 - medição dos halos de inibição de crescimento bacteriano

por solução teste. Medição e média em milímetros.-------------------------------p.19

Tabela 2- Fase 1 – desempenho das soluções em valores de halos de inibição

mínimos, máximos e mediana.---------------------------------------------------------p.20

Tabela 3- Fase 2 – número de unidades formadoras de colônias (UFC’s) em

log de 10 para S. sanguis.----------------------------------------------------------------p.21

Tabela 4- Fase 2 – número de unidades formadoras de colônias (UFC’s) em

log de 10 para S. mutans.----------------------------------------------------------------p.21

Tabela 5- Fase 2 – número de unidades formadoras de colônias (UFC’s) em

log de 10 para S. sobrinus.-------------------------------------------------------------p.22

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RESUMO

Na busca pela ciência odontológica de se chegar ao composto que

possa ser considerado o agente ideal para o controle químico do biofilme

dental foi idealizado este estudo. Avaliou-se a capacidade antimicrobiana “in

vitro” de diferentes soluções a base de hidróxido de cálcio e tergentol partindo

em princípio do HCT 20, solução irrigadora dos canais radiculares composta

por 80% da solução saturada de hidróxido de cálcio (água de cal) e 20% do

detergente tergentol buscando verificar sua possível indicação como solução

para bochechos, visando prevenção ou combate a doenças como cárie

dentária e doença periodontal. No laboratório de microbiologia do

Departamento de Odontologia da UFRN, foram realizados testes em discos de

antibiograma para os microrganismos: Streptococcus mutans, Streptococcus

sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei. Bem como em bactérias

formadoras de biofilme para os mesmos, à exceção do L. casei. Estipulou-se

diferentes concentrações de tergentol para a água de cal, além do tergentol em

água destilada, usou-se digluconato de clorexidina a 0,12% como controle

positivo e água destilada como controle negativo. Os resultados mostraram

desempenho inferior das soluções a base de Ca(OH)2 em relação à clorexidina

frente a estes microrganismos e à metodologia empregada, direcionando pois,

para a não indicação do uso do HCT 20 como colutório bucal.

PALAVRAS-CHAVE

Hidróxido de cálcio; HCT 20; Controle químico do biofilme dental; Odontologia

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SUMÁRIO

Dedicatória..................................................................................................... iv

Lista de tabelas.............................................................................................. vi

Resumo......................................................................................................... vii

1- INTRODUÇÃO........................................................................................... 01

2- REVISÃO DA LITERATURA...................................................................... 04

3- METODOLOGIA........................................................................................ 10

4- RESULTADOS.......................................................................................... 16

5- DISCUSSÃO.............................................................................................. 21

6- CONCLUSÕES......................................................................................... 36

7- REFERÊNCIAS.......................................................................................... 37

8- ABSTRACT................................................................................................ 41

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1- INTRODUÇÃO

A cavidade oral é naturalmente sítio para vários tipos microbianos, que,

quando organizados e estruturados compõem a flora oral. As bactérias

presentes na boca são as principais causadoras de duas das patologias mais

comuns; cárie dentária e doença periodontal. Pode-se afirmar seguramente

que o controle da placa bacteriana ou biofilme dental tem importância ímpar na

prevenção, cura e controle destas doenças. Tal controle pode ser realizado

mecanicamente ou por intermédio de substâncias químicas.

O HCT 20 (80% de água de cal + 20% de tergentol) é uma solução

irrigadora dos canais radiculares desenvolvida por Barbosa em 1984.Tal

substância vem sendo usada desde então, com bastante sucesso clínico na

desinfecção dos canais radiculares por ser dotada de boas propriedades

antimicrobianas, de biocompatibilidade e de tensão superficial atestadas 1, 2, 3.

Trata-se de uma solução composta na proporção de 0,2g de hidróxido

de cálcio P.A. (pró-análise), 80 ml de água destilada e 20 ml de detergente

Tergentol (lauril-dietileno-glicol-éter-sulfato de sódio) a 0,125%. Sua concepção

teve o intuito de ser uma efetiva solução irrigadora dos canais radiculares,

sendo usada desde então com larga margem de sucesso clínico neste sentido.

Ensaios clínicos foram realizado com o HCT 20 introduzindo o seu uso

sob a forma de bochechos 29, 30, 31. Comparativos clínicos entre o HCT 20 e a

clorexidina em pacientes com gengivite e periodontite no qual foram obtidos

com as duas drogas índices de redução de placa bacteriana estatisticamente

similares.

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A capacidade antimicrobiana do HCT 20 deve-se ao Hidróxido de cálcio,

uma substância que tem poder bactericida como atestam alguns trabalhos 1, 2, 3,

12, 29, 30, 31. A ação do tergentol nesta solução tem vital importância para o seu

desempenho. O detergente atua como tensoativo aumentando a capacidade de

difusão da solução no interior da massa microbiana organizada incrementando,

assim, sua ação anti-séptica.

A presente pesquisa visou: estudar diferentes concentrações de HCT

como antimicrobianos; confirmar o potencial antimicrobiano desta solução

(HCT 20); avaliar o potencial de uso do HCT 20 como solução para bochechos.

Para tanto, desenvolveu-se um estudo comparativo entre HCT 20 com sabor e

sem sabor e a clorexidina “in vitro”.

Partiu-se então do princípio básico de que nem sempre, com o

tratamento convencional e boa orientação sobre higiene bucal, os Cirurgiões-

Dentistas conseguem devolver e/ou manter as condições de saúde ao

paciente. Nestas situações (entre outras), está indicado o controle químico da

placa.

Como não está disponível no mercado aquilo que se poderia chamar de

agente químico ideal, ou seja, uma substância que possua excelente

capacidade bactericida com especificidade para microrganismos patogênicos,

ao mesmo tempo em que não exerça qualquer efeito danoso sobre os tecidos

moles e/ou duros da cavidade bucal (propriedade denominada toxicidade

seletiva), justifica-se a continuidade dos estudos sobre o controle químico do

biofilme dental.

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Pesquisar a ação antimicrobiana do HCT 20 e outras concentrações de

soluções a base de hidróxido de cálcio e tergentol frente a bactérias

colonizadoras iniciais da cavidade bucal e cariogênicas em testes

microbiológicos diferentes visando contribuir para o estudo dos agentes

químicos para controle do biofilme dental vem a ser, basicamente, o que este

trabalho se propõe.

Para propiciar ratificação dos testes com as soluções em análise, optou-

se pelo uso, com a mesma metodologia, do digluconato de clorexidina a 0,12%

como controle positivo por ser esta solução bastante utilizada em Odontologia

com eficácia microbiológica e clínica comprovada, e da água destilada como

controle negativo.

Finalmente, por meio da comparação entre os resultados, torna-se

possível uma avaliação fidedigna sobre o potencial do HCT 20 como agente

anti-placa, bem como o do seu uso em solução para bochechos e o objetivo

deste trabalho é avaliar através de testes microbiológicos “in vitro” o potencial

do HCT 20 como uma substância capaz de ser utilizada como colutório bucal

na forma de solução para bochechos.

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2- REVISÃO DA LITERATURA

É sabido que as patologias mais prevalentes na cavidade oral em

humanos são: cárie e doença periodontal. Tais condições são provocadas por

desequilíbrio no biofilme dental associado a diversos outros fatores. Logo, é de

extrema importância a manutenção da microflora contida na cavidade bucal em

níveis compatíveis com a saúde 30, 31. O ambiente exerce ação direta sobre o

comportamento da microbiota residente no biofilme dental. Qualquer alteração,

que pode ser proveniente de fatores como dieta cariogênica, queda na

higienização ou até mesmo o uso de agentes químicos antimicrobianos pode

resultar em alterações clínicas nos tecidos do hospedeiro 25.

Ao longo dos anos tem havido constante preocupação de pesquisadores

no tocante às drogas usadas para o controle químico da placa bacteriana e,

com isso, existe grande diversidade de estudos a esse respeito. Principalmente

em se tratando da eficácia como antimicrobianos e a toxicidade das soluções

30.

Várias substâncias têm sido desenvolvidas e\ou aplicadas para este fim.

No entanto, o digluconato de clorexidina é o composto químico que mais se

destaca para o controle do biofilme dental 6, 9, 10, 11, 24. Desde que foi sintetizada

em laboratório por Davies em 1954, a clorexidina tem sido bastante estudada

10. Suas formas mais frequentemente encontradas são gluconato e digluconato.

Relatos 10, 26 afirmam que o digluconato é mais indicado, pois tem maior

solubilidade em água e, em pH fisiológico, dissocia-se liberando o componente

catiônico.

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A clorexidina é um agente catiônico, uma biguanidina que tem ação

sobre bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras. É estável, e

apresenta como característica principal a substantividade, ou seja, tempo de

permanência ativa na cavidade bucal de aproximadamente 12 horas 26.

A clorexidina tem afinidade pela célula bacteriana provavelmente devido

à interação entre sua molécula carregada positivamente e a parede celular

carregada negativamente (principalmente pelos grupos fosfato). Esta interação

aumenta a permeabilidade da parede celular e permite que o agente

antimicrobiano penetre no citoplasma e provoque a morte do microrganismo 10.

Este mesmo trabalho conclui que: entre as substâncias químicas

existentes, a clorexidina é a que melhor inibe o desenvolvimento da placa

subgengival sendo, portanto, a droga mais efetiva no controle químico da placa

bacteriana.

A clorexidina parece ser o mais efetivo agente para redução de placa

bacteriana e gengivite podendo conseguir redução de até 60% nos índices de

placa bacteriana 27.

A ação da clorexidina é descrita como atuando na formação da película

adquirida, alterando a adsorção bacteriana às superfícies e sobre

microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos aumentando a

permeabilidade da membrana e conseqüente rompimento celular ou

coagulação e precipitação de seus constituintes citoplasmáticos levando à

diminuição significativa na placa bacteriana 26.

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A clorexidina, por possuir eficácia comprovada tem sido grandemente

estudada nos últimos anos, constitui-se no padrão-ouro, quando se deseja

fazer comparações com outros compostos anti-sépticos 6, 9, 10, 11, 17, 25, 26, 27.

O HCT 20, solução composta na proporção de 80 ml de água de cal

para 20 ml de detergente tergentol lauril-dietileno-glicol-éter-sulfato de sódio a

0,125% tem sido usada com bastante sucesso como solução irrigadora em

Endodontia por ser dotada de boas propriedades antimicrobianas, de pH e de

tensão superficial 1, 2, 3, 29, 30, 31, 39.

A capacidade antimicrobiana do HCT 20 deve-se ao Hidróxido de cálcio,

que é uma substância que tem poder bactericida confirmado por vários estudos

12, 13, 19, 23, 32, 34 e pode ser explicado resumidamente em seu pH, em torno de 12

a 13 (o pH do HCT 20 é 10,8), ser considerado incompatível com germes

patógenos orais; e também na penetração de íons cálcio no interior da célula

bacteriana inviabilizando seu metabolismo e provocando, por conseguinte a

morte celular. A ação do tergentol nesta solução tem vital importância para o

seu bom desempenho antimicrobiano. É que um detergente, quando

adicionado a qualquer solução provoca diminuição da sua tensão superficial 16,

o que acarreta em maior capacidade de difusão desta no interior da massa

microbiana organizada com conseqüente maior velocidade no desenvolvimento

de sua ação antisséptica.

O HCT 20 mostrou-se eficaz em estudos “in vitro” para microrganismos

como a Cândida albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e

Bacillus subtillis 15. Mas estes organismos não são considerados importantes

no início da cárie e a doença periodontal.

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Em 2003 14, uma extensa revista da literatura sobre hidróxido de cálcio

reportou vários aspectos sobre este composto desde que este teve seu uso

para tratamento da polpa dental por Herman em 1920 em virtude da detecção

de sua capacidade de estimular a mineralização associada a um poder

antimicrobiano, o que conferia ao Ca(OH)2 uma possibilidade de vir a ter

sucesso como medicação endodôntica.

A frente benéfica de ação do hidróxido de cálcio de interesse para este

estudo é sua capacidade antimicrobiana. Afirma-se que o pH influi na atividade

enzimática de bactérias anaeróbias. Acredita-se que a hidroxila dissociada do

Ca(OH)2 desenvolve ação na membrana plasmática bacteriana devido a

enzimas localizadas na mesma. A membrana responde por funções essenciais

do metabolismo bacteriano, tais como: divisão e crescimento celular, estágio

final da formação da parede celular e transporte de íons. O pH da membrana

plasmática é alterado pela alta concentração de íons hidroxila do hidróxido de

cálcio que promove a desnaturação de proteínas da membrana. O alto pH do

Ca(OH)2 altera a parede celular e membrana plasmática bacteriana

prejudicando componentes orgânicos e transporte de nutrientes. Com

propriedades importantes como a permeabilidade seletiva alteradas, a bactéria

não tem condições de sobreviver 1, 2, 3, 12, 13, 14, 16, 18, 19, 20, 23, 29, 30, 31, 32, 35, 39.

Considerando que a liberação de íons hidroxila pelo hidróxido de cálcio é

essencial ao processo antimicrobiano, é importante que se use veículos que

favoreçam a rápida dissociação iônica, e ainda mantenham o pH alto do

Ca(OH)2 durante o período de atividade 11, 12, 13.

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Um trabalho clássico de 1927 já afirmava que o efeito de um germicida

sobre uma célula bacteriana é dependente da razão de difusão do mesmo

através da membrana celular. Se a tensão superficial de uma solução é

diminuída pela adição de um tensoativo, ainda que este redutor de tensão não

seja dotado de qualquer ação anti-séptica, vai fazer com que um número muito

maior de moléculas do germicida se difunda na célula num mesmo intervalo de

tempo. Ou seja, a diluição de um germicida que era totalmente ineficaz em

cinco minutos, pode fazê-lo tornar-se completamente eficiente em apenas dois

minutos, meramente pela adição do redutor de tensão superficial 16.

Um bom método para se conseguir abaixamento na tensão superficial

em líquidos (como a solução saturada de hidróxido de cálcio-água de cal), é a

adição de detergente à sua composição 14, 16, 19. Estes trabalhos conceituam

detergentes como sendo substâncias que diminuem a tensão superficial dos

líquidos, aumentando o poder de penetração.

Tensão superficial é conceituada como a força existente entre

superfícies moleculares que propicia que uma porção de líquido se espraie ou

se concentre quando aplicada em uma superfície. Este fenômeno depende do

valor de forças coesivas (forças de atração que resultam de forças que

moléculas de um líquido exercem entre elas) e forças adesivas (forças que

moléculas de uma superfície exercem quando em contato com um líquido) 1, 2, 3,

14, 16, 19.

A adição do detergente tergentol à solução de hidróxido de cálcio na

proporção de 20% (HCT 20) leva à diminuição no tempo que esta solução

necessita para desencadear sua ação antimicrobiana 1. E que isto deveria

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ocorrer por algum mecanismo que envolva o potencial de superfície e a

constituição da membrana da célula bacteriana 1, 2, 3. Afirma também que ao se

adicionar um agente tensoativo na solução saturada de hidróxido de cálcio

pode-se aumentar a sua ação anti-séptica e de limpeza.

Mediu-se a tensão superficial do hidróxido de cálcio associado a

diferentes substâncias, entre as quais o digluconato de clorexidina e o

detergente sulfato éter lauril sódio 3%. E foi justamente a associação com o

detergente aniônico que resultou na mais baixa tensão superficial 12.

Um estudo microbiológico “in vitro” envolvendo a solução aquosa de

hidróxido de cálcio a 2% avaliou positivamente sua potencial capacidade

antimicrobiana frente a 30 microrganismos diferentes (Gram-positivos e Gram-

negativos) 20.

Avaliou-se o HCT 20 como agente anti-placa 29 usando estudantes de

Odontologia e pacientes. Nesse estudo, comparou-se o HCT 20 com o

digluconato de clorexidina a 0,2% como redutores do índice de placa

bacteriana de Löe e Silness, e obtiveram melhores resultados com o HCT 20.

Em avaliação comparativa em indivíduos portadores de gengivite e

periodontite crônicas 30, a capacidade de redução do índice de Löe e Silness de

placa bacteriana com digluconato de clorexidina a 0,12% ou HCT 20 e

encontrou como resultado a equivalência estatística entre os níveis de redução

do índice de placa entre as duas soluções.

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3- METODOLOGIA

A atividade experimental desta pesquisa desencadeou-se no laboratório

de microbiologia do Departamento de Odontologia da UFRN.

3.1- Determinação da Concentração Inibitória Mínima Tergentol/ água de

cal .

A etapa primeira deste trabalho teve como objetivo fundamental

determinar a concentração inibitória mínima para a associação hidróxido de

cálcio + tergentol. Este estudo realizou-se da seguinte maneira: confeccionou-

se em farmácia de manipulação amostras com concentrações diferentes de

tergentol na solução saturada de hidróxido de cálcio (água de cal) onde se

chamou estas soluções teste de HCT 5, HCT 10, HCT 20, HCT 30 e HCT 40,

digluconato de clorexidina a 0,12%, Tergentol e água destilada.

Os números para o HCT: 5, 10, 20, 30 e 40 representam a proporção de

tergentol na solução de água de cal, onde se procurou determinar que diluição

da solução a base de Ca(OH)2 em tergentol ( lauril-dietileno-éter-sulfato de

sódio a 0,125%) propiciaria melhor ação antimicrobiana (concentração inibitória

mínima). Sendo que, para se descartar a ação do tergentol, optou-se pelo uso

de uma solução-teste com este detergente. A todas as soluções foi

acrescentado o flavorizante Aniz.

Destes frascos, foram removidos os rótulos de identificação e trocados

por uma numeração pré-definida por sorteio de 1 a 9 com o objetivo de quem

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estiver manuseando as soluções não saber com que solução se estaria

trabalhando (estudo tipo cego).

A aleatorização para esta primeira etapa resultou na seguinte ordem:

- Solução 1: HCT 20 + flavorizante Aniz;

- Solução 2: HCT 10 + flavorizante Aniz;

- Solução 3: HCT 40 + flavorizante Aniz;

- Solução 4: HCT 20 convencional ( sem flavorizante );

- Solução 5: Água destilada + flavorizante Aniz;

- Solução 6: HCT 5 + flavorizante Aniz;

- Solução 7: Tergentol + flavorizante Aniz;

- Solução 8: Digluconato de clorexidina a 0,12% + flavorizante Aniz;

- HCT 30 + flavorizante Aniz.

A primeira etapa deste estudo se constituiu na verificação da atividade

antimicrobiana através do teste de difusão em ágar.

Foram ativadas 04 cepas bacterianas de estoque: Streptococcus

mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei.

A ativação bacteriana realizou-se em meio de cultura “Brain Heart Infusion”

(BHI-ágar)-(Difco-Detroit-Michigan) com as referidas bactérias incubadas em

caldo a 37oC por 48 horas em condições de anaerobiose.

As cepas foram semeadas em placas de Petri com auxílio de “Swabs”

estéreis por esgotamento. Em seguida, discos de antibiograma estéreis, cada

um com 6 milímetros de diâmetro foram embebidos com as soluções teste e

dispostos de um modo eqüidistante nas placas com o meio de cultura para

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PLACA DE PETRI COM O MEIO DE CULTURA

DISCO DE ANTIBIOGRAMA + SOLUÇÃO TESTE

posterior verificação dos halos de inibição promovidos por cada solução teste

em milímetros. Foi necessário 0,25 ml de solução para saturar cada disco.

Após este processo, é preciso que se promova condições de

anaerobiose para o crescimento bacteriano em toda a placa semeada. A

anaerobiose foi conseguida através de jarras de Gaspak a 37oC por 48 horas

para posterior mensuração dos halos de inibição. Objetivando a redução da

variabilidade e obtenção de resultados precisos, o experimento foi feito em

triplicata para cada microrganismo e solução, exceto o L. casei, que foi

realizado em duplicata. O valor dos diâmetros dos halos de inibição foi dado

pela média aritmética tirada a partir da soma dos maiores diâmetros de cada

halo obtido nas três repetições.

O desenho esquemático a seguir ilustra a conformação desta etapa do

experimento.

3,2- Verificação da atividade antimicrobiana em microrganismos

formadores de biofilme.

A segunda fase do trabalho, também “in vitro”, ocorreu da seguinte

maneira: as mesmas soluções teste da etapa anterior foram confeccionadas e

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13

novamente distribuídas aleatoriamente e numeradas de 1 a 9. O meio de

cultura foi o mesmo da etapa anterior e as cepas bacterianas, exceto o L. casei

por não ser um microrganismo formador de biofilme, foram também as

mesmas. O que diferiu foi o fato das bactérias terem sido usadas para testar a

ação do HCT 20 em biofilme bacteriano. Estes biofilmes foram produzidos de

acordo com o modelo proposto por Thrower e Pinney & Wilson, onde os

biofilmes são produzidos em membranas de filtro de nitrato de celulose de 13

milímetros de diâmetro com 0,22 micrômetros de diâmetro do poro (Milipore

Corp., New York- NY). Cada membrana foi colocada em placas de Petri com

meios de cultura com as cepas de estoque para crescimento bacteriano.

Esta fase do experimento também se desencadeou em triplicata para

cada microrganismo e para cada solução-teste.

A aleatorização das soluções para esta fase da pesquisa foi a seguinte:

- Solução 1: Clorexidina + flavorizante Aniz;

- Solução 2: Tergantol + flavorizante Aniz;

- Solução 3: HCT 5 + flavorizante Aniz;

- Solução 4: Água destilada + flavorizante Aniz;

- Solução 5: HCT 10 + flavorizante Aniz;

- Solução 6: HCT 20 sem flavorizante;

- Solução 7: HCT 20 + flavorizante Aniz;

- Solução 8: HCT 30 + flavorizante Aniz;

- Solução 9: HCT 40 + flavorizante Aniz.

Após 48 horas, cada biofilme (3 membranas) foi transferido da cultura

para um recipiente contendo 10 ml de cada solução testada. Os biofilmes

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14

permaneceram em contato com estas soluções por 1 minuto, simulando assim

a duração de um bochecho com antisséptico.

Após a permanência do biofilme em contato com a solução pelo tempo

determinado (1 minuto), cada um foi então, transferido para um recipiente

contendo 10 ml de água deionizada estéril e homogeneizado em vibrador

“vortex” por 1 minuto para ressuspender os microrganismos. Então, transferiu-

se 1 ml desta suspensão resultante para 9 ml de solução salina redutora estéril,

quando foi diluída. O número de microrganismos foi determinado em placas de

Petri com meio de cultura ( ágar BHI + 5% de sangue desfibrinado de carneiro,

incubadas em anaerobiose por 48 horas a 37 graus Celcius).

Foi contado o número de microrganismos para verificar se foram

perdidas células dos biofilmes controle.

Ao final deste processo, foi determinada a média do número de unidades

formadoras de colônias (UFC) de todos os biofilmes submetidos a cada produto

e suas diluições.

3.3- Análise Estatística

Os testes estatísticos utilizados neste experimento foram o teste de

Kruskal-Wallis para a primeira etapa e o pós-teste de comparação múltipla de

Dunn.

Os dados obtidos foram enfim, analisados estatisticamente para a

tabulação dos resultados com suas respectivas médias, valores de p e desvios-

padrões.

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15

Para a etapa dos discos de antibiograma, os valores importantes a

serem levantados eram a média aritmética dos halos de inibição em milímetros,

bem como a mediana, o valor mínimo e máximo destes halos e o valor de p

dado pelo teste de Kruskal-Wallis deveria ser menor que 0,05.

Na etapa dos testes em microrganismos formadores de biofilme, o

número de unidades formadoras de colônias para os diferentes tratamentos

nos vários tempos, para serem apresentados, foi transformado em logaritmo de

base 10, para reduzir a variabilidade dos dados microbianos. Levou-se em

consideração também os valores mínimo, máximo e a mediana do número de

Unidades Formadoras de Colônias obtidos com cada solução.

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16

4- RESULTADOS

Na fase de estudos realizados com discos de antibiograma em placas de

Petri, a medição dos halos de inibição provocados pelas soluções testadas

obteve os valores expressos na tabela 1. Ela representa as três medições em

milímetros dos halos de inibição de crescimento microbiano provocados por

cada solução teste, seguidos da média aritmética destas medidas. A tabela 1

da fase 1 deste experimento se apresenta na página a seguir.

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17

Tabela 1- Fase 1: valores dos halos de inibição das soluções frente aos microrganismos testados e média aritmética.

Solução S. mutans Média S. sanguis Média S. sobrinus Média L. casei Média 1

HCT 20 +

Aniz

0

0

0

0,0

12

9

12

11,0

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

2

HCT 10 +

Aniz

0

0

0

0,0

4

1

2

2,3

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

3

HCT 40 +

Aniz

0

0

0

0,0

12

12

15

13,0

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

4 HCT 20 0 0 0 0,0 9 8 10 9,0 0 0 0 0,0 0 0 0 0,0 5

Água Destil. + Aniz

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

6

HCT 5 +

Aniz

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

7

Tergentol +

Aniz

5

4

4

4,3

15

12

15

14,0

5

4

4

4,3

11

9

12

10,6

8

Clor. +

Aniz

14

11

11

12,0

17

13

18

16,0

10

10

14

11,3

16

14

15

15,0

9

HCT 30 +

Aniz

0

0

0

0,0

10

11

13

11,3

0

0

0

0,0

0

0

0

0,0

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde-UFRN. 2008

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18

A seguir, a tabela 2 da fase 1 mostra o desempenho das soluções em

valores de halos de inibição mínimos, máximos e mediana ( em milímetros).

Tabela 2- Fase 1: valores de halos de inibição mínimos, máximos e mediana (

em milímetros).

Solução Medições Mediana Valor mínimo de halo

inibitório

Valor máximo de halo

inibitório 1 HCT 20 + Aniz 12 0.000 0.000 12.000 2 HCT 10 + Aniz 12 0.000 0.000 4.000 3 HCT 40 + Aniz 12 0.000 0.000 15.000 4 Água destilada +

Aniz 12 0.000 0.000 0.000

5 HCT 5 + Aniz 12 0.000 0.000 0.000 6 Tergentol + Aniz 12 7.000 4.000 15.000 7 Clorexidina + Aniz 12 14.000 10.000 18.000 8 HCT 30 + Aniz 12 0.000 0.000 13.000 9 HCT 20 12 0.000 0.000 10.000 Fonte: Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde-UFRN. 2008

Para consubstanciar estes dados, aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis. O

valor de “p” obtido foi inferior a 0,0001 para todas as bactérias juntas, sendo

considerado então, extremamente significante.

No teste com o biofilme, aplicou-se o teste de Kruskal-Wallis o pós-teste

de Comparação Múltipla de Dunn. Os resultados são expostos nas tabelas a

seguir.

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19

Tabela 3- Fase 2

Para S sanguis: número de unidades formadoras de colônias (UFC) em

log de 10

Solução Teste de Dunn

Mediana Mínimo Máximo Valor de p

1 Clorexidina + Aniz

A 8.000 8.000 8.600

2 Tergentol + Aniz B 11.370 11.370 11.260 3 HCT 5 + Aniz A,B 9.960 9.460 10.060 4 Água destilada +

Aniz A,B 9.750 9.480 9.870

5 HCT 10 + Aniz A,B 10.900 10.850 10.910 6 HCT 20 A,B 11.060 10.850 11.220 7 HCT 20 + Aniz A,B 9.920 9.840 9.930 8 HCT 30 + Aniz A,B 10.220 10.170 10.220 9 HCT 40 + Aniz A,B 10.740 10.700 10.740

0,0016

Fonte: Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde- UFRN. 2008

Tabela 4- Fase 2

Para S mutans: número de unidades formadoras de colônias (UFC) em

log de 10.

Solução Teste de Dunn

Mediana Mínimo Máximo Valor de p

1 Clorexidina + Aniz A 0.000 0.000 0.000 2 Tergentol + Aniz B 11.160 11.020 11.130 3 HCT 5 + Aniz B 10.950 10.910 11.030 4 Água destilada +

Aniz A,B 9.170 9.110 9.250

5 HCT 10 + Aniz A,B 8.600 8.470 8.840 6 HCT 20 A,B 9.460 9.360 9.560 7 HCT 20 + Aniz A,B 10.190 10.140 10.300 8 HCT 30 + Aniz A,B 8.470 8.000 8.470 9 HCT 40 + Aniz A,B 8.470 8.300 8.770

0,0015

Fonte: Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde- UFRN. 2008

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Tabela 5- Fase 2

Para S. sobrinus: número de unidades formadoras de colônias (UFC) em

log de 10

Solução Teste de Dunn

Mediana Mínimo Máximo Valor de p

1 Clorexidina + Aniz A 9.250 9.170 9.300 2 Tergentol + Aniz A,B 9.200 6.610 9.200 3 HCT 5 + Aniz A,B 10.450 10.360 10.470 4 Água destilada +

Aniz A,B 10.350 10.190 10.410

5 HCT 10 + Aniz A,B 10.410 10.400 10.560 6 HCT 20 A,B 11.130 11.080 11.160 7 HCT 20 + Aniz B 11.350 11.190 11.440 8 HCT 30 + Aniz A,B 10.670 10.590 10.780 9 HCT 40 + Aniz A,B 10.480 10.400 10.480

0,0021

Fonte: Programa de pós-graduação em Ciências da Saúde- UFRN. 2008

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21

5- DISCUSSÃO

O que se observou na primeira análise deste experimento foi uma grande

discrepância positiva da ação antimicrobiana da clorexidina frente a todas as

concentrações de HCT. Também chamou atenção o desempenho do tergentol

isoladamente ter sido melhor que o do HCT 20 principalmente. Isso porque o

HCT 20 é a solução que realmente estava sendo testada neste experimento em

virtude de ser um composto químico que já possui vida clínica em Endodontia e

alguns trabalhos apontarem boa capacidade antimicrobiana 1, 2, 3, 6, 10, 23, 24, 25.

No tocante à efetividade da clorexidina, os resultados da primeira fase

deste trabalho (discos de antibiograma) são plenamente condizentes com o que

a literatura mostra de maneira bastante vasta sobre esta droga 5, 7, 8, 9, 14, 20, 29, 30.

Isto corrobora para que se ateste veracidade a esta metodologia. A clorexidina

foi utilizada nesta pesquisa justamente por se tratar de um composto

amplamente estudado e aprovado em testes “in vitro” e “in vivo”, sendo a mesma

até considerada como padrão-ouro para testes comparativos quando se deseja

testar novas e\ou outras soluções 9.

Em relação à fase 2 desta pesquisa (mais especificamente à tabela 4),

qualquer teste que se promova usando Streptococcus mutans já remete a uma

maior atenção devido ao seu poder acidogênico considerável, característica esta

que, somada a outras, confere à esta bactéria grande importância na

etiopatogenia da cárie dental.

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22

O teste mostrou extrema eficácia da clorexidina frente a este

microrganismo, enquanto que as demais soluções apresentaram desempenho

estatisticamente semelhante, com ligeira vantagem para o HCT 30 e o HCT 40.

Para os testes realizados com o S. sobrinus, todas as soluções testadas

obtiveram desempenho estatístico bastante semelhante, com resultados

sutilmente melhores do tergentol frente aos outros compostos.

Para S. sanguis (tabela 3), pode-se observar que todas as

soluções obtiveram desempenho estatisticamente semelhante, sendo que o

digluconato de clorexidina a 0,12% apresentou constância entre as três

amostras com média ligeiramente menor de número de UFC’s em relação às

demais, porém sem significado estatístico.

Estes dados poderiam conferir ao HCT 20, o “status” de agente

antimicrobiano em nível semelhante ao da clorexidina (para S. sanguis).

Baseando-se na literatura, de maneira geral, os achados deste

experimento se confrontam com as demais pesquisas sobre o HCT 20. Ao longo

deste capítulo será discorrido detalhadamente sobre esta pesquisa em relação à

literatura. Deixando-se bem claro que foram estudos com metodologias

diferentes 1, 2, 3, 8, 21, 30, 31, 39.

Em primeiro lugar faz-se necessário que se explane toda a idéia sobre o

desenvolvimento do HCT 20, bem como, a possibilidade de seu uso como

colutório bucal.

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23

O HCT 20 foi desenvolvido e descrito por BARBOSA, em 1984. Os

princípios que nortearam tal desenvolvimento serão colocados e discutidos a

seguir 1, 2, 3.

Partiu-se inicialmente de achados praticamente consensuais da literatura

ao longo da história que atestam duas grandes características do Hidróxido de

Cálcio em sua forma pró-análise (P.A.), que são a biocompatibilidade e a

capacidade antimicrobiana, além do pH 1, 2, 3, 11, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 23, 29, 30, 31, 32, 35.

Afirmação sobre a qual destacamos uma revisão sistemática sobre o uso do

hidróxido de cálcio em Odontologia 12. Mas sempre se relatou grande dificuldade

em se encontrar uma composição que pudesse servir como veículo para que o

Ca(OH)2 pudesse desenvolver este potencial antibiótico. A pasta de hidróxido de

cálcio e mesmo a água de cal não conseguiam permitir que ele se difundisse

pela massa microbiana e desencadeasse a ação desejada. Chegou-se à

conclusão que era preciso se adicionar à solução saturada de hidróxido de

cálcio (água de cal) algum composto químico que reduzisse sua tensão

superficial 1, 2, 3, 13, 16.

Sumarizando as colocações do parágrafo anterior, as pesquisas

apontavam para a necessidade de se chegar a algum composto que fizesse com

que o tempo necessário para que o hidróxido de cálcio desencadear o efeito

antimicrobiano de modo mais rápido e efetivo diminua. Tal afirmação

consubstanciava-se por conclusões de vários trabalhos 1, 2, 3, 13, 16, 20.

Em 1927 16 já se afirmava que a mera redução da tensão superficial de

um líquido anti-séptico aumentaria sua capacidade de difusão em um biofilme

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bacteriano incrementado e aumentando a velocidade com que este

desenvolvesse a ação anti-séptica.

Este princípio norteou a busca de um composto químico a ser adicionado

à solução saturada de hidróxido de cálcio com objetivo de incrementar sua ação

anti-séptica.

Resolveu-se através de análise química que o composto tenso-ativo a ser

usado para este fim seria o tergentol (detergente do grupo lauril), onde alguns

trabalhos atestaram posteriormente ser este o agente que propiciou menor valor

resultante de tensão superficial à água de cal 1, 13. Algumas pesquisas

concluíram 1, 2, 3 que a concentração ideal para esta solução seria de 80% de

água de cal e 20% de tergentol, composto que foi denominado neste estudo de

HCT 20. Logo, baseando-se no que a literatura afirmava 16, estava-se diante de

um composto de grande potencial antimicrobiano.

Os resultados da análise feita nos ensaios com placas de Petri e discos

de antibiograma neste experimento mostraram extrema superioridade na

capacidade antimicrobiana do digluconato de clorexidina a 0,12% sobre os

quatro tipos bacterianos testados, seja no colonizador inicial, que é o

Streptococcus sanguis, ou nas bactérias cariogênicas (Streptococcus mutans,

Streptococcus sobrinus e Lactobacillus casei). Apesar da metodologia e tipo de

análise diferirem do que a literatura traz sobre o HCT 20 1, 2, 3, 29, 30, 31, no

presente trabalho, a clorexidina se mostrou consideravelmente superior ao

referido composto, seja em sua apresentação convencional ou quando acrescido

do flavorizante Aniz.

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25

Esta diferença metodológica nos chamou atenção em relação aos alguns

trabalhos1, 2, 3, onde se encontrou bons resultados de ação antimicrobiana “in

vitro” frente a vários tipos de microrganismos, inclusive os testados neste

experimento. Desde então o HCT 20 vem sendo utilizado como solução

irrigadora dos canais radiculares com larga margem de sucesso clínico descrito

pela literatura 1, 2, 3, 8, 12, 13.

O presente trabalho só encontrou boa efetividade do HCT 20 frente ao

Streptococcus sanguis, não tendo obtido halo de inibição de crescimento

bacteriano algum para os demais tipos bacterianos testados.

Pensou-se na hipótese desta diferença na atividade anti-séptica ter

relação com algum tipo de reação negativa do hidróxido de cálcio do HCT 20 e

demais concentrações de tergentol nas soluções de HCT (água de cal +

tergentol) com o ágar presente no meio de cultura gelatinoso usado nesta etapa

do experimento. Hipótese esta que encontrava contraposição dentro mesmo

desta pesquisa, já que todas as concentrações de HCT (5, 10, 20, 30 e 40% de

tergentol) induziram formação de halos de inibição de crescimento bacteriano

contra o Streptococcus sanguis.

Tomando-se por base apenas esta metodologia de experimentação,

poder-se-ia raciocinar equivocadamente que o HCT 20 seria efetivo apenas

contra bactérias colonizadoras iniciais da cavidade bucal, sendo ineficaz contra

microrganismos cariogênicos. Os achados do presente trabalho, contra-

indicariam frente a esta metodologia, o uso desta solução como anti-séptico

bucal para bochechos. Pois não há sentido algum lançar mão de substância

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26

antibiótica, seja ela em qualquer nível de ação (local ou sistêmico) sabendo-se

que esta não irá agir sobre os microrganismos causadores da condição

patológica, bem como tendo conhecimento da existência de compostos mais

efetivos 9, 10, 21, 27, 36, 37. Confrontando com outros trabalhos sobre o HCT 20 1, 2, 3,

29, 30, 31, os resultados do presente estudo mostram uma diferença no caminho a

ser tomado quanto a esta indicação para a referida solução.

Poderia se pensar que, devido aos achados de grande desvantagem do

HCT 20 frente a clorexidina, não valeria a pena continuar desenvolvendo

estudos sobre o uso do HCT 20 como anti-séptico bucal.

Mas, é preciso que se venha a testar todas as possibilidades de estudo

para que se possa fazer qualquer tipo de afirmação com caráter científico. Além

disso, não se pode desconsiderar estudos realizados anteriormente a esta

pesquisa que atestam bom potencial do HCT 20 como solução para bochechos

29, 30, 31. Então, somando-se este raciocínio à possível reação do Ca(OH)2 com o

ágar, levou-se este estudo adiante e realizou-se a fase 2 do experimento

testando-se as mesmas soluções com as mesmas cepas bacterianas, só que

agora em biofilme, condição tal que simula com mais precisão um bochecho

com enxaguatório bucal, e também isenta as soluções teste do contato com o

ágar.

Analisando-se agora os testes realizados com as bactérias formadoras de

biofilme, cruzando-se os resultados dos testes feitos com cada solução, a

clorexidina também apresentou os melhores resultados para os Streptococcus

mutans e Streptococcus sanguis, tendo havido resultados semelhantes ao

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Tergentol para Streptococcus sobrinus. Não se pode considerar como fator

causador de surpresa o fato da clorexidina apresentar performance satisfatória

ou melhor que outro anti-séptico bucal, pois a literatura a considera o padrão-

ouro para testes com soluções anti-sépticas para uso em bochechos 9, 10, 21, 27, 36,

37.

O HCT 20, assim como no teste com os discos de antibiograma,

apresentou os melhores resultados frente aos Streptococcus sanguis. Se

compararmos os HCT 20 puro e adicionado do flavorizante ao digluconato de

clorexidina a 0,12%, o pós-teste de Dunn revelou diferença estatisticamente

significante (p< 0,05) para suas ações contra o Streptococcus sobrinus. Mesmo

com a ação inibitória total do crescimento bacteriano que somente a clorexidina

desempenhou frente ao Streptococcus mutans. Faz-se importante relatar que a

literatura consubstancia os achados desta pesquisa 17, 34, 36, 37, 38, 39.

Os achados deste experimento pareciam direcionar que a capacidade

antimicrobiana das soluções de Ca(OH)2 + Tergentol (HCT) incrementava-se

conforme se aumentava a proporção de tergentol da composição. Mas a análise

estatística não confirmou tal relação.

Quanto à fase 2 deste modelo experimental, o que pode se afirmar é que

o digluconato de clorexidina é o anti-séptico mais efetivo contra bactérias

formadoras de biofilme. Este achado corrobora o que é relatado na literatura

sobre este composto 4, 5, 6, 7, 10, 11, 17, 24, 25, 26, 27, 36, 37, 38, 39.

Baseado neste trabalho atesta-se que o uso do HCT 20 como anti-séptico

bucal a princípio, não deve ser aconselhado. E como os achados obtidos nas

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28

fases 1 e 2 desta experiência mostraram resultados negativos para a solução

que era o objetivo central deste trabalho (HCT 20), tais dados inviabilizam sob o

ponto de vista ético, a continuidade e aprofundamento da pesquisa sobre o uso

potencial do HCT 20 como enxaguatório bucal. Tal etapa do processo científico

investigativo seria uma fase clínica experimental para dar resultados finais sobre

este assunto.

Esta experiência trata-se da fase “in vitro” do protocolo padrão da

American Dental Association para estudo sobre agentes antimicrobianos para

bochechos. Não vale a pena conduzir o estudo a etapas “in vivo”, tendo em vista

que o mesmo não atingiu dentro desta metodologia patamares satisfatórios em

suas fases iniciais.

Ainda que os resultados obtidos refiram-se eminentemente à metodologia

empregada para este experimento, faz-se oportuno que se discuta a partir de

agora sobre uma comparação crítica sobre os achados deste experimento em

relação ao que a literatura traz sobre as soluções abordadas neste estudo.

Em primeiro lugar o pensamento sobre a ação antimicrobiana do

hidróxido de cálcio nos remete a analisar toda uma literatura que, ao longo de

todos estes anos, atesta com clareza sobre o potencial do Ca(OH)2 como

bactericida 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 39.

Não se acredita que se tenha chegado por acaso a qualquer composto

químico, e o HCT 20 está entre eles. O que se tinha por base para a construção

desta solução? A resposta consiste em toda uma literatura pregressa com

afirmações positivas sobre o hidróxido de cálcio e que sua ação antimicrobiana

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não se dava da forma que se desejava porque não se havia chegado a uma

associação química que propiciasse ao Ca(OH)2 condições para que tal

desenvoltura se concretizasse 14, 16,17, 19, 25, 31.

O que se quer dizer com o desenvolvimento deste raciocínio é o seguinte:

de acordo com o que se tinha na literatura sobre hidróxido de cálcio, tergentol,

tensão superficial, biocompatibilidade e ação antimicrobiana, era de se esperar

que este experimento nos mostrasse como resultados finais um composto que

tivesse desempenho ao menos satisfatório, mesmo que com resultados aquém

do padrão-ouro da clorexidina.

Se o Ca(OH)2 tem ação bactericida descrita essencialmente como

desestabilizador de membrana e parede celular bacterianas; se a adição do

detergente tergentol confere redução de tensão superficial à solução de

hidróxido de cálcio; se esta redução da tensão superficial propicia melhor razão

de difusão da solução frente à massa microbiana gerando assim contato da

substância com maior número de bactérias 16; e principalmente, em havendo

estudos 1, 2, 3, 21, 28, 29, 30, 31, 39 e considerável vida clínica da solução HCT 20, não

era esperado um desempenho insatisfatório das soluções teste, principalmente

as composta de Ca(OH)2 com 20% de tergentol (HCT 20), ainda que esta

metodologia não desqualifique as demais.

Vale ressaltar que os fatores considerados no parágrafo anterior não são

frutos de discussão desenvolvidos nesta pesquisa. Mas sim, de relatos de vários

pesquisadores ao longo da história do uso do Ca(OH)2 na Odontologia.

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Tal raciocínio é consubstanciado por relatos de pesquisadores12, em

revisão sistemática da literatura sobre o hidróxido de cálcio onde os trabalhos

por eles pesquisados afirmam claramente sobre o potencial antimicrobiano do

hidróxido de cálcio ser bastante positivo.

Pontos importantes para uma reflexão crítica são: o que terá passado

desapercebido ao longo de todas estas metodologias em forma de análises

clínicas, microbiológicas e críticas? Por qual ou quais razões uma solução que

teria tudo, de acordo com as pesquisas ao longo da história, para vir a se

constituir em boa opção no estudo dos agentes para o controle químico do

biofilme dental não obteve resultados cientificamente esperados? Como

investigar que tipo ou tipos de variáveis estavam presentes em cada um dos

estudos?

Quanto às demais metodologias empregadas no estudo do HCT 20,

chama-se atenção em especial aos trabalhos de Barbosa 1, 2, 3, já que tratam-se

de uma pesquisa “in vitro” onde dentre os trabalhos com soluções de hidróxido

de cálcio, são os que mais se assemelham ao presente estudo. A conclusão

principal destes trabalhos foi que a solução saturada de Ca(OH)2 em 80%

adicionada de 20% de tergentol foi bactericida em 5 minutos para vários

microrganismos testados, inclusive os desta pesquisa.

Comparando estes resultados aos deste experimento, notamos que a

metodologia empregada em 1984 assemelha-se à fase 2 desta pesquisa, onde

não havia contato das soluções com meio de cultura gelatinoso. Mas a principal

diferença entre as duas metodologias foi o fato da primeira ter objetivo de

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desenvolver solução irrigadora dos canais radiculares e esta pesquisa, uma

solução para bochechos. Então, mesmo se tratando da mesma solução, o tempo

de contato solução/microrganismos ganha relevância importante. Pois 5 minutos

de contato e ação bactericida encontrada se constitui em ótimo resultado

quando pensamos em um tratamento de canal, seja em bio ou em necro-

pulpectomias. Já quando se pensa em bochecho com colutório, deve-se pensar

em torno de 1 minuto, pois este é o tempo médio de indicação das soluções

enxaguatórias existentes atualmente. Logo, o fator tempo de contato solução-

teste microrganismos provavelmente é o gerador de tal discrepância de

resultados 1, 2, 3, 29, 30, 31.

Os resultados obtidos nesta pesquisa mostram com clareza: o simples

fato do digluconato de clorexidina a 0,12% ter galgado melhores patamares de

ação anti-séptica já propicia um direcionamento para que não se aprofunde

frente a esta metodologia, o estudo sobre o uso do HCT 20 como solução para

bochechos com a finalidade redutora do biofilme dental. Lembrando sempre que

existiria uma fase “in vivo” para aprofundar o conhecimento e se chegar a uma

conclusão definitiva sobre o uso potencial do HCT 20 como colutório bucal.

O HCT 20 vem tendo bastante sucesso clínico como solução irrigadora

dos canais radiculares desde 1984, e a literatura que atesta este fato ancora-se

em fatores como: biocompatibilidade, baixa tensão superficial e, é claro a

presença do Ca(OH)2 1, 2, 3, 8, 12, 13, 29, 30, 31, 39. A união destas três características

confrontadas com os achados ao longo da literatura direcionou a uma

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expectativa de bons resultados para esta solução como antisséptico bucal em

forma de solução para bochechos.

Vale lembrar que existe uma pesquisa que relata bom desempenho de

bochechos com HCT 20 como fator estimulante de salivação para pacientes

internados em hospital pós-irradiação ou quimioterapia 8, bem como há relato de

trabalho “in vitro” na área médica com resultados efetivos em biofilme para

Enterococcus faecallis quando se associa gel de eritromicina ao Ca(OH)2 P.A.5

.Existem também trabalhos relatando metodologias de adição de Hidróxido de

cálcio ao gel de gluconato de clorexidina com finalidade de medicação intra-

canal 4, 21, 39

Os nossos resultados mostram também os níveis de ação antimicrobiana

alcançados pelo HCT 20, em sua forma convencional ou adicionado do

flavorizante não foram condizentes com o que a literatura mostra e,

principalmente, não podem ser considerados padrões redutores de biofilme

dental que sejam adequados à sua indicação como colutório bucal. O HCT 20

mostrou-se eficaz em estudos “in vitro” para microrganismos como a Cândida

albicans, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus e Bacillus subtillis

15. Mas estes organismos não são considerados importantes no início da cárie e

a doença periodontal, que são as principais patologias bucais a nível de

prevalência em humanos, não sendo pois necessários em um estudo para

solução de bochechos.

Enfim, o planejamento inicial desta pesquisa contemplava um estudo

completo com cinco fases, sendo duas “in vitro” e as três seguintes “in vivo”.

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Objetivava-se desenvolver o protocolo completo da A.D.A. (American Dental

Association) para lançamento no mercado de uma solução para bochechos que

pudesse prestar um bom serviço de auxílio ao cirurgião-dentista no combate a

doenças como a cárie a doença periodontal. Pois estas duas se consistem nas

principais patologias que acometem a cavidade oral em humanos e têm como

agente etiológico principal microrganismos componentes do biofilme dental.

Mas, como os resultados obtidos nas duas primeiras fases (“in vitro”) não

obtiveram valores considerados satisfatórios, do ponto de vista ético, seria

contra-indicado continuar e avançar esta pesquisa para qualquer teste que

pudesse ser realizado em seres humanos. Consubstancia-se tal diretriz por

relatos de que cepas bacterianas de estoque são mais susceptíveis a agentes

químicos que bactérias colhidas de pacientes em pesquisas clínicas 36, 38.

Complementando o raciocínio, considera-se improvável em estudos como o que

se apresenta aqui, que uma solução apresente resultados negativos na fase “in

vitro” e positivos na fase seguinte “in vivo”.

Sendo assim, concluiu-se que este experimento, direcionando para que o

HCT 20 não possa ser utilizado pela Odontologia sob forma de solução para

bochechos. Isso em absoluto quer dizer que esta solução não deva ter

continuidade como solução irrigadora dos canais radiculares em Endodontia,

nem tão pouco, que não devam ser realizados mais estudos sobre suas

indicações como enxaguatório bucal. Trata-se apenas do direcionamento do

potencial clínico de um composto químico, o que tem efetividade como agente

de irrigação de canais radiculares não conseguiu desempenho satisfatório como

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colutório bucal frente à metodologia empregada por este experimento, mas um

fator não interfere no outro. Isso por que a atividade microbiana é uma

característica em comum que deve ter uma solução irrigadora e um anti-séptico

bucal. Mas existem várias outras que são diferentes nos dois tipos de soluções.

Comparando-se o presente estudo aos existentes na literatura 29, 30, 31,

que atestam efetivo potencial do uso do HCT 20 como solução para bochechos,

pode-se destacar a diferença básica que esta pesquisa abrange testes “in vitro”

com cepas bacterianas de estoque. Enquanto os referidos trabalhos, do ponto

de vista da pesquisa clínica, trataram-se de estudos piloto onde os achados

referiam-se a efetivas reduções percentuais no Índice de Placa Bacteriana de

Löe e Sillness, medição esta que consegue equilíbrio entre sensibilidade e

especificidade, tornando-se bom instrumento clínico de aferição do biofilme

dental. Hoje existem estudos positivos da clorexidina até mesmo com finalidades

endodônticas 21, 37, 39.

Como se tratavam de verificações eminentemente clínicas, estas

encontraram para o HCT 20, reduções percentuais do índice de placa bacteriana

estatisticamente semelhantes aos obtidos com o padrão-ouro (clorexidina),

diferentemente do presente estudo, onde as soluções de HCT se apresentaram

negativamente e a clorexidina manteve sua ação positiva condizente com a

literatura 6, 7, 9, 10, 11, 17, 24, 20, 25, 26, 27, 36, 38.

Pode-se direcionar tal diferença pensando-se da seguinte maneira: como

os estudos anteriores eram clínicos e obtiveram redução considerável do índice

de placa bacteriana com o HCT 20, isto pode significar que a ação do HCT 20

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pode ter sido mais pela desagregação das bactérias da massa microbiana que

por uma ação bactericida da solução em questão. Ação tal que é semelhante à

produzida pelo controle mecânico do biofilme dental, mas dentro de princípios de

uso para soluções químicas, não seria o mais indicado. Esta e outras são

questões para outras metodologias responderem.

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6- CONCLUSÕES

• As soluções a base de hidróxido de cálcio obtiveram níveis

antimicrobianos piores que o digluconato de clorexidina a 0,12%.

• Os resultados obtidos com o HCT 20 convencional e acrescido do

flavorizante não alcançaram níveis condizentes com um efetivo colutório

bucal frente à metodologia aplicada para este estudo.

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ABSTRACT

The science of Dentistry wishes obtains the ideal solution for the dental

plaque chemical control. This research evaluated antimicrobial action capacity in

calcium hydroxide and tergentol various solutions starting for the CHD 20, a root

canals irrigating solution with a reason of 80% calcium hydroxide saturated

solution and 20% tergentol detergent with the aim of evaluate this drug mouth

rinse indication with prevention or combat objective for dental caries and

periodontal diseases. Antibiogram disks and biofilm tests were accomplished for

the microorganisms: Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis,

Streptococcus sobrinus and Lactobacillus casei. Different reasons of detergent

for the calcium hydroxide saturated solution, tergentol and distillated water

solution, 0,12% clorhexydine digluconate solution was positive control and

distillated water was negative control. The results showed better performance of

clorhexydine in relation to calcium hydroxide directing to not accept this (CHD

20) as mouth rinse solution.

KEY WORDS

Calcium hydroxide; CHD 20; Dental plaque chemical control; Dentistry.