UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE

PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA

COORDENAO DE PESQUISA

Programa Institucional de Bolsas de Iniciao Cientfica PIBIC

Avaliao da atividade repelente de produtos naturais para mosquitos (Diptera: Culicidae)

rea de Concentrao: Sade Pblica

Bolsista: Tllio Dias da Silva Maia

Orientadora: Roseli La Corte dos Santos

DMO/CCBS

Relatrio Semestral

Perodo

2011/2012

Este projeto desenvolvido com bolsa de iniciao cientfica

PIBIC/COPES

Resumo

Os mosquitos apresentam importncia peculiar para a sade pblica, seja pelo incmodo causado pela sua picada, seja pela sua capacidade de transmitir patgenos. Com o intuito de reduzir o contato entre seres humanos e mosquitos, foram desenvolvidos os repelentes, que podem ser sintticos ou derivados de produtos naturais. O seguinte trabalho se prope a analisar o efeito de repelncia de leos essenciais derivados de plantas para mosquitos da espcie Aedes aegypti, com metodologia baseada na sugerida pela Organizao Mundial de Sade sendo descrito um experimento piloto com produto a base de DEET a 12,5%. Este trabalho no apresenta dados conclusivos.

Palavras chaves: Mosquitos, leos essenciais, produtos naturais, repelentes.

Sumrio 1- Introduo.................................................................................................................. 03 2- Objetivo...................................................................................................................... 06 3- Materiais e Mtodos.................................................................................................. 06

3.1- Material............................................................................................................... 06 3.1.1- Mosquitos......................................................................................................... 06 3.1.2- leos essenciais................................................................................................ 06 3.2- Mtodos............................................................................................................... 06 3.3- Consideraes ticas.......................................................................................... 08

4- Resultados parciais e discusso................................................................................ 09 5- Referncias Bibliogrficas........................................................................................ 11 6- Anexo 1....................................................................................................................... 13

1- Introduo

Os mosquitos apresentam, h muito, importncia peculiar para a sade pblica e para

a parasitologia, uma vez que so hematfagos e considerados insetos vetores. O hbito de

sugar o sangue geralmente praticado pelas fmeas as quais, ao faz-lo, injetam saliva na

pele do hospedeiro. A saliva desses animais contm protenas que podem causar a algumas

pessoas reaes alrgicas como: pruridos, endemas e eritemas (RUTLEDGE & DAY, 2002).

Alm da sensao de desconforto decorrente da picada do mosquito, h o risco de

transmisso de patgenos como dengue, febre amarela e encefalites (viroses), malria

(protozoose) e elefantase (helmintose) (NEVES, 2005).

O desconforto causado pela picada desses insetos, bem como o avano das

informaes com relao aos patgenos por eles transmitidos, fez com que a sociedade se

atentasse para o uso de produtos com efeito repelente, tanto como uma maneira de aliviar os

efeitos desagradveis das picadas, quanto como medidas profilticas. Repelentes so

substncias que, quando aplicadas sobre a pele, roupas e superfcies, desencorajam a

aproximao de insetos (RIBAS & CAREO, 2010). Embora cada ser humano apresente

maneiras peculiares de atrair esses animais (LOGAN et. al., 2010), h um mecanismo geral

de atuao dos repelentes sobre a pele: formando uma camada de vapor com odor repulsivo

(STEFANI et al., 2008) e inibindo a liberao de odor do cido ltico (presente na

transpirao e nos corpos de seres endotrmicos, como os seres humanos), que uma

substncia atrativa para fmeas de mosquitos, sobretudo do gnero Aedes (PETERSON &

COATS, 2001). Repelentes podem ser originados de produtos sintticos ou extrados de

recursos naturais.

Os produtos sintetizados so compostos basicamente pela substncia N,N-dietil-

metatoluamida, tambm conhecida como DEET, que foi descoberta e passou a ser

comercializada nos Estados Unidos a partir da dcada de 1950 (PETERSON & COATS,

2001). Com eficcia historicamente conhecida, o DEET, segundo STEFANI et al. (2008) o

repelente mais eficaz atualmente disponvel, sendo usado em mais de 80 bilhes de

aplicaes. Outro produto sinttico bastante utilizado, principalmente em crianas, o

IR3535 (etil-butil-acetilaminopropionato), que um biopesticida com estrutura qumica

similar ao aminocido alanina e o nico indicado para crianas menores de dois anos de idade

(STEFANI et al., 2008).

Alguns estudos apontam para uma possvel toxicidade desses repelentes sintticos.

Em relao ao DEET, a toxicidade se manifesta quando h o uso do produto em altas

concentraes e por repetidas vezes (RIBAS & CAREO, 2010). Dentre as consequncias da

toxicidade, esto: dermatites, reaes alrgicas, sinais de toxicidade neurolgica ou

cardiovascular como ataxia, encefalopatia, hipotenso e bradicardia (MIOT et al. 2004). Essa

toxicidade uma preocupao no uso de repelente tanto por crianas quanto por gestantes.

Nesses casos, as indicaes so controversas, sendo consenso na literatura a no utilizao do

DEET em crianas menores de dois anos de idade (STEFANI et al., 2008).

Na inteno de buscar novas alternativas de produtos, a cincia tem se voltado para a

pesquisa sobre os produtos naturais, sobretudo os que so derivados de vegetais. A maioria

das plantas possui compostos os quais so usados na preveno ao ataque de fitfagos (Maia

& Moore, 2011). Apesar de as funes primrias de tais compostos serem a defesa contra os

insetos mencionados, muitos so tambm efetivos na preveno picada de mosquitos e

outros dpteros (Pichersky & Gershenzon, 2002). Estudos etnobotnicos mostram que em

algumas comunidades, o uso de repelentes extrados de vegetais que reduzem o contato entre

os vetores e os seres humanos tem sido uma prtica comum (WAKA et al. 2004; KWEKA et

al. 2008a), sobretudo em comunidades rurais tropicais, onde esses produtos so, muitas vezes,

o nico meio de proteo contra a picada dos mosquitos (MOORE et. al., 2006). A

descoberta desses compostos com propriedades repelentes despertou o interesse da

comunidade cientfica devido ao seu baixo custo e toxicidade (MIOT et al., 2004). H vrios

modos de utilizao dos repelentes originados de produtos naturais, como velas e incensos

(PETERSON & COATS, 2001), sendo mais comum o uso dos princpios ativos desses

produtos sob a forma de leos. Esses leos, chamados de leos essenciais, tm importncia

no s na sade pblica, mas tambm na agricultura, uma vez que muitos so utilizados para

o controle natural de pragas agrcolas.

A utilizao de plantas como repelentes de insetos uma prtica bastante antiga,

sendo registrado na literatura greco-romana o uso de losna (Artemisia absinthium L.)

(Compositae) como repelente de mosquitos e pulgas por personalidades como Caio Plnio, o

velho (23-79 a.D.) e o mdico Dioscorides (c. 50- 70 a.D.) (BUENO & ANDRADE, 2009).

Embora ainda existam poucos estudos a respeito, vegetais como a citronela

(Cymbopogon nardus) e a andiroba (Carapa guianesis) devido a seu efeito repelente para

mosquitos em seres humanos tm gerado vrios produtos com eficincia inferior ou

inicialmente at similar ao DEET ou ao IR3535 (MIOT et al., 2004; ANDRADE, 2005;

2008), e permitido patentes registradas na Frana, Japo, Unio Europia e Estados Unidos

(BUENO & ANDRADE, 2009).

Outras espcies como o eucalipto-limo (Eucaliptus citriodora) e o alecrim-de-cheiro

(Rosmarinus officinalis L.) (BUENO & ANDRADE, 2010); espcies de Verbenacea (AMER

& MEHLHORN 2006; GILLIJ et al. 2008); Lippia citriodora (GILLIJ et al., 2008); L.

junelliana e L. integrifolia (GLEISER et al., 2011) demonstraram efeitos repelentes sobre

espcies de culicdeos.

Apesar dos resultados promissores, h ainda a desvantagem no uso desses repelentes,

pois a maioria deles possui alta volatilidade, sendo ineficazes por longos perodos de tempo,

necessitando de frequentes reaplicaes (KWEKA et. al, 2008b; LOGAN et. al., 2010).

Uma vez que a maioria dos repelentes, tidos como uma alternativa eficaz para evitar o

contato com insetos vetores, sobretudo mosquitos, encontrados no mercado tm alto custo e

toxicidade, se comparados aos leos essenciais derivados de plantas com efeito repelente, o

presente estudo se faz necessrio no sentido de testar novas alternativas de produtos com o

mesmo efeito repelente, que possam ser utilizados diretamente ou que sejam promissores

para o desenvolvimento de novos produtos.

2- Objetivo

Avaliar a eficcia de produtos naturais na proteo contra a picada de mosquitos da

espcie Aedes aegypti.

3- Materiais e Mtodos

3.1- Material

3.1.1- Mosquitos

Estabelecimento das colnias

Os mosquitos utilizados nos experimentos so provenientes de colnia livre de

infeco, mantida no insetrio do Laboratrio de Parasitologia da Universidade Federal de

Sergipe. Est sendo utilizada a cepa Rockefeller (ROCKE), considerada padro de

suscetibilidade a inseticidas. Para o estabelecimento da colnia ROCKE, tm sido utilizados

ovos cedidos pelo Laboratrio de Fisiologia e Controle de Artrpodes Vetores (LAFICAVE)

do Rio de Janeiro, de linhagem criada por muitos anos no laboratrio. Em laboratrio, os

ovos so depositados em bandejas brancas de polietileno com dimenses de 35x20x6 cm

previamente limpas apenas com gua contendo 1L de gua desclorada. As larvas so criadas

nessas mesmas bandejas e a alimentao feita diariamente com rao triturada de gato

devidamente esterilizada. Ao atingir o estgio evolutivo de pupa, elas so transferidas para

gaiolas de alumnio cuja dimenso 30 cm x 30 cm x 30 cm, onde emergem os adultos. Os

mosquitos adultos recebem alimentao de gua aucarada, que fica disponvel nas gaiolas

at uma hora antes dos experimentos, quando a soluo retirada.

3.1.2- leos essenciais

Os leos essenciais so fornecidos pelo Departamento de Qumica, sendo produtos

que j esto em testes com relao a outros potenciais de uso (Costa et al., 2011).

3.2- Mtodos

Os experimentos sero realizados no Laboratrio de Parasitologia da UFS, utilizando

os parmetros contidos no guia para avaliar a eficcia de produtos repelentes sobre a pele

humana da Organizao Mundial de Sade, com algumas modificaes (WHO, 2009).

Cada experimento conta com seis voluntrios, sendo eles indivduos adultos, trs do

sexo masculino e trs do sexo feminino, com idade entre 18 e 30 anos, que no possuam

alergia a picadas de insetos ou repelentes. Os voluntrios no podero fazer uso de nenhum

produto de fragrncia, como perfumes, repelentes ou serem fumantes.

As mos e antebraos dos voluntrios so lavados com sabonete sem odor e, em

seguida, enxaguados. Aps esse procedimento, as mos e antebraos so tratados com

soluo de lcool a 70%, sendo, logo aps, secos com uma toalha e as mos protegidas por

luvas.

Os antebraos direito e esquerdo recebem tratamentos diferenciados, sendo o direito

controle e o esquerdo experimental. Apenas o antebrao esquerdo ser utilizado mais de uma

vez, utilizando vrias concentraes dos produtos analisados.

Durante o teste, so analisadas as atividades de sondagem e pouso dos mosquitos

sobre o antebrao tratado. Os insetos so criados em gaiolas contendo aproximadamente 100

fmeas no alimentadas, sendo ento realizadas observaes captando as quantidades de

pouso.

O experimento se d da seguinte maneira: 1 mL do lcool utilizado para diluir os

produtos com potencial de repelncia aplicado uniformemente, usando uma pipeta, em

aproximadamente 250 cm da pele do antebrao entre o pulso e o cotovelo. O brao , ento,

inserido na gaiola e depois realizada a contagem dos nmeros de mosquitos que pousam

nele. O voluntrio deixa o brao na gaiola por 30 segundos, evitando moviment-lo durante

esse tempo. Para que o teste tenha validade, necessrio que o nmero de pousos ou

sondagens seja maior ou igual a 10 no perodo de 30 segundos. Em seguida, o mesmo brao

tratado com o produto diludo em lcool, deixando-o secar e ento o procedimento de colocar

o brao na gaiola por 30 segundos repetido. No recomendvel que haja um tempo longo

entre uma sesso e outra. A cada sesso, aumenta-se a concentrao de repelente, devendo

haver cinco sesses alm da sesso controle. No antebrao esquerdo, o teste baseia-se em

dosagens sucessivas e com concentraes cada vez maiores, sendo realizadas cinco

aplicaes sucessivas. Os mesmos mosquitos so utilizados para cada voluntrio durante o

experimento.

Aps o fim da etapa com o brao esquerdo, o brao direito tratado com lcool a 70%

e o processo de inserir na gaiola contendo os mosquitos pelo perodo de 30 segundos

repetido. Caso o nmero de pousos ou sondagens seja inferior a 10, o resultado do teste deve

ser descartado.

A Tabela 1 abaixo resume os procedimentos adotados.

Tabela 1. Sequncia de eventos em uma sesso de avaliao de produto com potencial de repelncia para mosquitos (Diptera: Culicidae).

Sequncia de aplicao Concentrao da soluo de repelente para ser aplicada em 1mL (mg/mL)

Quantidade acumulada de repelente (mg/250 cm )

Controle do brao esquerdo Pr-tratada com lcool apenas

-

Brao esquerdo dose 1 1 1 Brao esquerdo dose 2 1 2 Brao esquerdo dose 3 2 4 Brao esquerdo dose 4 4 8 Brao esquerdo dose 5 8 16 Controle do brao direito Pr-tratada com lcool

apenas -

Fonte: Guidelines for Efficacy Testing of mosquito repellents for human skin. WHO, 2009.

No caso de muitas sondagens ou pousos, o teste pode ser realizado em trs sries de cinco segundos e o resultado multiplicado por dois, estimando, dessa forma, o nmero de mosquitos que pousariam durante os 30 segundos.

Para expressar a proteo apresentada para cada produto avaliado (p), considera-se a proporo mdia do nmero de pousos sobre o brao tratado (T) em relao proporo mdia do nmero de pousos no brao controle (C) do mesmo indivduo:

3.3- Consideraes ticas

Os voluntrios deste projeto tm sido selecionados entre docentes, funcionrios e alunos da UFS, sem relao de hierarquia com a pesquisadora responsvel, o que exclui todos os estagirios, alunos de mestrado e funcionrios do Laboratrio de Parasitologia. Os participantes so questionados sobre doenas febris recentes, histrico de alergia a picadas de insetos e medicamentos. So alertados sobre o desconforto relacionado picada dos insetos e o prurido subseqente e assinam o termo de consentimento livre e esclarecido (Anexo 1). Aps o experimento, os voluntrios que desejam, recebem loo ps-picada para alvio das reaes que possam manifestar. O projeto foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa envolvendo seres humanos do Hospital Universitrio, protocolo CEP 319/2011 e N CAAE 0280.0.107.000-11.

5- Resultados parciais e Discusso

A primeira etapa do projeto foi destinada ao levantamento bibliogrfico e estudo da metodologia a ser empregada. Inicialmente foi realizado experimento piloto para padronizao tcnica. O experimento foi realizado no insetrio do Laboratrio de Parasitologia da Universidade Federal de Sergipe. Foi voluntrio um indivduo do sexo masculino que no utilizava nenhum produto de fragrncia ou nicotina. Aps a higienizao das mos e antebraos, foi realizado o experimento.

Por se tratar de um procedimento piloto, houve diferenas na metodologia a ser utilizada. Utilizou-se uma quantidade menor de mosquitos (aproximadamente 30 fmeas de Aedes aegypti) que a prevista pela metodologia (100), sendo consideradas as propores, ao invs de nmeros absolutos, para a anlise dos dados. O produto com potencial repelente utilizado foi um comercial composto de DEET a 12,5%, para evitar o desperdcio de leo essencial.

No incio, o voluntrio colocou o brao esquerdo no tratado dentro da gaiola, de maneira que a superfcie dorsal do antebrao se mantivesse encostada no fundo. Foi observada a atividade de pouso dos mosquitos sobre a superfcie exposta (ventral) desse antebrao (Figura 1). Aps 30 segundos de exposio, o voluntrio retirou o brao e foram aplicados os cinco tratamentos consecutivos, sendo realizadas as contagens. Aps os tratamentos do brao esquerdo, foi inserido o brao direito sem tratamento (controle).

Figura 1: Antebrao esquerdo tratado com face ventral exposta em gaiola com aproximadamente 30 fmeas de Aedes Aegypti.

Para maior segurana no resultado, duas pessoas devidamente instrudas observaram as atividades de pouso dos mosquitos sobre o antebrao tratado do voluntrio, sendo levado em conta o nmero maior. O resultado obtido est expresso abaixo na Tabela 2:

Tabela 2. Proteo apresentada por um produto repelente a base de DEET 12,5% para Aedes aegypti (Diptera: Culicidae), segundo quantidade aplicada.

Aplicao Quantidade aplicada de repelente

Quantidade acumulada de

repelente

Nmero de pousos Proteo (%)

Controle brao esquerdo

- - 12 -

Tratamento 1 1 mL 1 mL 4 66,67 Tratamento 2 1 mL 2 mL 0 100,00 Tratamento 3 2 mL 4 mL 0 100,00 Tratamento 4 4 mL 8 mL 0 100,00 Tratamento 5 8 mL 16 mL 1 91,67 Controle brao

direito - - 1 -

Observou-se que o nmero de pousos no brao direito foi inferior a 10% (quantidade mnima de pousos para validar o experimento), sendo assim, de acordo com a metodologia empregada, seria necessrio anular o experimento. Porm, deve-se ponderar que o produto utilizado no experimento possui eficcia j comprovada e supe-se que tenha influenciado no resultado do controle do brao direito, pois possui forte odor e, como previa o procedimento, foi utilizado repetidas vezes na mesma gaiola, inibindo, mesmo que no absolutamente, como visto no Tratamento 5, a ao dos mosquitos sobre a pele do voluntrio. Sendo assim, essa possibilidade ser considerada caso algum dos leos demonstre atividade repelente com proteo similar.

Durante o experimento, o voluntrio alegou no sentir dor, nem sequer picadas, embora tenha havido pousos. Sendo assim, foi avaliado que o tempo de 30 segundos, sugerido na metodologia, pertinente nesse tipo de teste. O forte odor emitido pelo produto sugere que, por medida de segurana, o experimento seja realizado em local em que o contato com outras gaiolas seja mnimo ou ausente, a fim de no alterar o comportamento dos mosquitos nelas contidos. Por ser difcil a visualizao dos mosquitos que pousam nas laterais dos antebraos, ser desenvolvida estratgia de proteo do antebrao, deixando exposta apenas a rea, de aproximadamente 250 cm, em que sero realizados os tratamentos.

A partir deste experimento, foi elaborado protocolo, o qual ser utilizado para os experimentos com os leos essenciais no prximo semestre.

4. Referncias Bibliogrficas

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World Health Organization: Guidelines for Efficacy Testing of mosquito repellents for human skin. WHO/HTM/NTD/WHOPES/2009.4.

Anexo 1

Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Nome da Pesquisa

Avaliao da atividade repelente de produtos naturais para mosquitos (Diptera: Culicidae)

Pesquisadores responsveis

Orientadora: Roseli La Corte dos Santos (79) 2105.6626 rlacorte@ufs.br

Graduando, bolsista PIBIC: Tllio Dias da Silva Maia (79)9972-9763

Instituio responsvel pela pesquisa

Universidade Federal de Sergipe (UFS) Departamento de Morfologia (DMO)

Informaes aos voluntrios

Voc est sendo convidado(a) para participar de uma etapa da pesquisa Avaliao da atividade repelente de produtos naturais para mosquitos (Diptera: Culicidae). Sua participao no obrigatria. A qualquer momento, voc pode desistir de participar e retirar o seu consentimento, sem que haja qualquer prejuzo em sua relao com os pesquisadores ou com a Universidade Federal de Sergipe.

O objetivo deste trabalho avaliar a eficcia dos produtos naturais na proteo contra a picada de mosquitos. Os leos essenciais a serem testados no possuem, comprovadamente, ao txica sobre a pele.

Sua participao nesta etapa da pesquisa consistir na aplicao de uma soluo de lcool a 70% em seu antebrao esquerdo. Esta rea tratada ser exposta dentro de uma gaiola de madeira contendo 100 fmeas sadias do mosquito Aedes aegypti. Aps o tratamento com lcool, o mesmo antebrao ser tratado com produtos com potencial de repelncia em cinco diferentes concentraes. A cada novo tratamento, ser repetido o processo de expor a rea tratada na gaiola. Aps essa etapa, o antebrao direito ser tratado com lcool 70% e realizado o mesmo procedimento ocorrido com o brao esquerdo. No total, sero sete sesses de exposio dos antebraos tratados, sendo o esquerdo exposto em seis sesses (um tratamento com lcool e cinco com as diferentes concentraes dos repelentes) e o direito em apenas um sesso (um tratamento com lcool 70%), contendo, cada uma, 30 segundos de durao. Os mosquitos sero provenientes de colnia mantida no insetrio do Laboratrio de Parasitologia. Os insetos utilizados so isentos de doena, no havendo nenhum risco de transmisso de patgenos. Os riscos antecipveis em decorrncia da participao na pesquisa restringem-se ao aparecimento de vermelhido no local da aplicao e eventuais reaes alrgicas devido sensibilidade ao leo ou picada. Neste caso, o voluntrio que apresentar reaes de sensibilidade ser afastado do ensaio. Devido irritao que ocorre aps a picada,

se assim o desejar, ser aplicada sobre a pele do voluntrio uma loo ps-picada, que ameniza o incmodo causado pelo prurido.

Para a participao nesta pesquisa os voluntrios devem apresentar idades entre 18 e 30 anos, no possuir alergia a picadas de insetos ou repelentes. No podero fazer uso de nenhum produto de fragrncia, como perfumes, repelentes ou serem fumantes.

A pesquisadora Roseli La Corte dos Santos ser responsvel por quaisquer despesas decorrentes de reaes ou danos aos voluntrios relacionados ao ensaio.

As informaes obtidas atravs desta pesquisa sero confidenciais e asseguramos o sigilo sobre sua participao.

Voc receber uma cpia deste termo onde constam os telefones dos pesquisadores, podendo tirar dvidas sobre o projeto e sua participao em qualquer momento.

Eu: ___________________________________________________________________ RG: ______________________, abaixo assinado, tendo recebido as informaes no verso e ciente dos meus direitos abaixo relacionados, concordo em participar como voluntrio da pesquisa citada.

1- A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento a qualquer dvida a cerca dos procedimentos, riscos, benefcios e outros, relacionado com a pesquisa e o tratamento a que serei submetido(a);

2- A liberdade de retirar o meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo;

3- A segurana de que no serei identificado(a) e de que ser mantido o carter confidencial da informao relacionada com a minha privacidade;

4- O compromisso de me proporcionar informao atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar a minha vontade de continuar participando;

5- A disponibilidade de tratamento mdico e a indenizao que legalmente tenho direito, por parte da Instituio, Sade em caso de danos que sejam comprovados como diretamente causados pela pesquisa;

6- Que se existirem gastos adicionais, estes sero absorvidos pelo oramento da pesquisa;

7- Que se ocorrerem reaes adversas na pele (como alergia, irritaes e outras), decorrentes da aplicao local das diferentes formulaes, ou pela picada dos mosquitos, os voluntrios sero afastados do ensaio.

Tenho cincia do exposto acima e desejo colaborar com a pesquisa.

So Cristovo,_____ de _______________ de __________.

__________________________________________

Assinatura do voluntrio