Avaliação Laboratorial da Hemostasia

Silmara Montalvão

Farmacêutica Bioquímica

Laboratório de Hemostasia - Hemocentro Unicamp

Sumário

• Integridade da amostra e variabilidade pré-analítica

• Principais exames na investigação laboratorial e sua interpretação:

- Limitações e considerações dos testes clássicos da avaliação laboratorial da hemostasia

• Laboratório de hemostasia x Hemofilia

Modelos para o entendimento da Hemostasia

Introdução

Cedido por De Paula, 2012

Integridade da amostra e variabilidade pré-analítica

Fontes de erros mais comuns:

1. Não utilizar citrato de sódio como anticoagulante

2. Tubos utilizado em sistema a vácuo incompletos

3. Inadequada homogeneização

4. Estocagem de sangue total em gelo ou ambiente refrigerado

Amostra ideal para teste de hemostasia

1. Coleta não traumática com mínimo tempo de torniquete

2. Tubos com correta proporção de anticoagulante ( > 90%)

3. Transporte em temperatura ambiente

4. Tempo máximo de uma hora entre coleta e processamento da amostra

Causas de rejeição de amostra

1. Amostra não coletada com citrato de sódio como anticoagulante

2. Amostras que contenham coágulo

3. Amostras que não apresentam a proporção de 9:1 (sangue/anticoagulante)

4. Amostras com hematócrito > 55%

5. Amostras hemolizadas

Steve K, Quality in laboratory Hemostasis 2009

Principais exames na investigação laboratorial e sua interpretação

Grupo I

• Avaliação do paciente com

história de sangramento

• Avaliação do paciente com

história de trombose

História Clínica

Grupo II

• Avaliação do paciente

assintomático pré

procedimentos (triagem)

• Avaliação do paciente

assintomático após alteração

dos exames de triagem

Modelo Clássico da Investigação Laboratorial

Hillarp, IHTC- Basic in vivo Coagulation

Modelo Clássico da Investigação Laboratorial

Hemostasia Primária

TS e PFA

Teste de função

plaquetária

Quantidade e função do

FVW

Hemostasia Secundária

Testes de triagem: TP,

TTPA, TT

Fatores da Coagulação

Fibinólise

Dímero D

Lise de euglobulina

Tromboelatometria

Testes de triagem

TP

TTPA

Hillarp, IHTC- Basic in vivo Coagulation

Testes de triagem

Cedido por De Paula, 2012

TTPa normal e TP prolongado

Repetir com mistura

50:50

Sem correção com mistura

Inibidor de FVII (raro)

Deficiência isolada de fator VII hereditária Deficiência de múltiplos fatores: hepatopatia, uso de Varfarina, deficiência de vitamina K (Fator VII tem a meia-vida mais curta)

Correção com mistura

Teste de triagem

TP normal e TTPa prolongado

Repetir com mistura

50:50

Sem correção do TTPa

Pesquisar inibidores: Inespecíficos (ac. Lúpico) Específicos (FVIII, FIX, FV)

Deficiência de fatores da via intrínseca FVIII, FIX, FXII, FXI, PK, HMWK Deficiência de fator de von Willebrand Pesquisa de inibidor especifico para FVIII

Correção do TTPa

Teste de triagem

Considerações: TTPA incubado a 37ºC/ 2h em pacientes com inibidor adquirido

KICHEN S, WFH 2010

Coagulopatia adquiridas

TP e TTPa normais Contagem de plaquetas normal Paciente com sangramento

Teste de triagem

Deficiência de F XIII Hiperfibrinólise Trombopatia

Ferramentas disponíveis para a investigação ?

Hemostasia Primária

TS e PFA

Teste de função

plaquetária

Quantidade e função do

FVW

Fibinólise

Dímero D

Lise de euglobulina

Tromboelatometria

Hemostasia Secundária

Testes de triagem: TP,

TTPA, TT

Fatores da Coagulação

Doença de von Willebrand

Procedimentos Laboratoriais para o diagnóstico da DvW

•Tempo de sangramento (TS) ou PFA-100 *Dade

•Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)

•Contagem de plaqueta

Testes de triagem

•Atividade de fator VIII (F VIII)

•Antígeno de fator de von Willebrand (FvW:Ag)

•Atividade de co-fator de Ristocetina (FvW: Rco)

•Capacidade de ligação do FvW ao colágeno (FvW:CB)

Testes confirmatórios

• Aglutinação plaquetária induzida pela ristocetina ( RIPA)

• Padrão Multimérico do FvW

•Capacidade de ligação ao FVIII (FvW: FVIIIB) Testes especiais

Avaliação dos distúrbios do FvW

Teste para avaliação da atividade de FVW X Variabilidade de técnicas atualmente disponíveis: Utilizar ou não a ristocetina?

Muitos trabalhos mostram alta correlação entre os resultados entre FVW:Ag por técnica de ELISA e Imunotubidimertria, bem como

alta concordância clínica.

KITCHEN. S, Quality in Laboratory Hemostasis and thrombosis, 2009.

Atividade

Proteína

F V W :A g

M é d ia /D P

U/d

L

E L IS A G r ifo ls IL

-5 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

p = 0 .9 5

Avaliação dos distúrbios do FvW

Montalvão SAL, Hemo 2012

Ferramentas disponíveis para a investigação ?

Hemostasia Primária

TS e PFA

Teste de função

plaquetária

Quantidade e função do

FVW

Fibinólise

Dímero D

Lise de euglobulina

Tromboelatometria

Hemostasia Secundária

Testes de triagem: TP,

TTPA, TT

Fatores da Coagulação

Avaliação dos distúrbios da fibrinólise

Há poucas evidências associado alterações da fibrinólise com quadros hemorrágicos ou trombóticos.

• CIVD grave • Coagulopatia pós-transplante hepático • leucemia promielocítica

D dímero

Tromboelastometria (tPA)

Teste de euglobulina

(baixa sensibilidade)

Avaliação Convencional x Global

Método tradicional da hemostasia compartimentaliza um processo que na prática ocorre simultaneamente, dependendo de plaquetas, endotélio, fatores da coagulação e até mesmo de outros elementos como hemácias e leucócitos Medem a Cinética da formação do coágulo e podem prover a exatidão do estado hemostático in vivo:

São mais efetivos para :

Avaliar a geração de trombina Capacidade hemostática individual Polimerização da fibrina em sangue total Estrutura e estabilidade do coágulo

MEERA CHITLUR, Thrombosis Research. 2012

Questões laboratoriais da Hemofilia

1. Diagnóstico

2. Quantificação de inibidor

3. Avaliação da Farmacocinética

3 questões laboratoriais que interferem no diagnóstico e tratamento das hemofilias

Favaloro Ej, Soltani S.McDonald J. Potencial Laboratory Misdiagnosis of Hemophilia and von Willebrand Disorder Owing to Cold Activation of Blood Samples for Testing. Am J Clin Pathol

2004; 122: 686-692.

Amostras para o teste de FVIII e FvW em tubo fechado

e conservado entre 18º e 24º devem ser centrifugados

e processados em 4 horas. Estocagem de 2º a 4º pode resultar em baixa atividade

de FVIII e FvW.

FVIII:C

1. Diagnóstico - Condição pré-analítica

1. Diagnóstico - Reagentes

1. Diagnóstico – Método

Montalvão SAL, Hemo 2011

1. Diagnóstico – Método

Montalvão SAL, Hemo 2011

• 1/3 pacientes com HA leve causado por mutação missense tem discrepância de resultados entre o ensaio cromogênico e o de coagulação de uma etapa • Normalmente a atividade do ensaio crormogênico é menor em relação ao de uma etapa •17 mutações até agora foram descritas com esta informação de discrepância • A discrepância pode ser parcialmente explicada pelo aumento da instabilidade da molécula que sofreu mutação • A diferença significativa entre os métodos é que o tempo de incubação necessário para o teste cromogênico é maior

1. Diagnóstico – Método

Bethesda Teste Padrão-Ouro: Bethesta Clássico (Kasper.C 1975) e Bethesda Modificado (Verbruggen 1995)-ISTH (2001)

Resultados do método Bethesda modificado apresenta menor CV% quando comparado ao Bethesda Clássico, sendo mais fidedignos em resultados de baixo título de inibidor ( 0 a 3 UB-mL)

2. Quantificação de inibidor

Montalvão SA, dado não publicado, 2013

2. Quantificação de inibidor A presença de FVIII na amostra do paciente viola o princípio do teste de Bethesda, onde a amostra do paciente e o controle devem ser equivalentes antes da incubação da amostra.

3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII e FIX na prática

clínica

Parâmetros farmacocinéticos (PK) pode ser útil para:

(1) Profilaxia: calcular a dose mínima necessária para manter o pacientes > 1 UI/dL de fator

(2) Protocolo de ITI: critério de avaliação de sucesso

(1) Profilaxia: Dose mínima x Farmacocinética

Profilaxia: o aumento do nível mínimo de fator VIII e IX > 1 UI/dL, com o objetivo de transformar um paciente com hemofilia A ou B grave para moderado, melhorando a condição clínica do paciente

Dose escalonada x Uso de parâmetros farmacocinéticos:

Vantagens da utilização de PK Considera o padrão de sangramento individual do paciente, ou seja, o uso racional do concentrado de fator Com a dose ajustada corretamente o paciente apresenta menor risco de sangramento Desvantagens da utilização de PK Disponibilidade da apresentação dos frascos Quantidade de amostras requeridas (pediátricos)

3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII e FIX na prática

clínica

O sucesso da ITI é considerado levando-se em conta quatro parâmetros

• Título de inibidor negativo (< 0,6 UB/mL)

• Teste normal de recuperação in vivo (IVR) de FVIII:C (> 66%)

• Vida-média de FVIII normal (> 6 horas após 72h com ausência de fator exógeno)

• Ausência de resposta anamnésica em futura reexposição do fator

DI MICHELE et. al , Haemophilia2007

(2) Avaliação do sucesso de ITI: Farmacocinética

3. A importância da utilização da farmacocinética do FVIII na prática clínica

Amostras necessárias para avaliação da farmacocinética

Parâmetros da

farmacocinética

Método

convencional

ISTH (2001)

Método

utilizado no

Brasil

MS (2011)

Método em

avaliação

ISTH (2012)

Amostragem 8 6 5

Teste de

recuperação in

vivo

15 minutos 15 minutos 15 minutos

30 minutos 30 minutos 30 minutos

3 horas 1 hora 4 horas

Teste de vida -

média

6 horas 3 horas 24 horas

9 horas 6 horas 48 horas

24 horas 24 horas

28 horas

32 horas

Modelo convencional:

Cálculo do Teste de recuperação do FVIII in vivo

Cálculo da vida-média de Fator VIII (T1/2) Modelo convencional

Conclusão

A condição pré-analítica deve ser observada no momento da análise, pois 70% dos casos de erros no laboratório de hemostasia acontecem nesta etapa

Embora os principais testes que avaliam a hemostasia no modelo convencional esteja bem padronizados. Deve-se considerar as suas limitações para uma adequada interpretação dos resultados

A utilização dos parâmetros da farmacocinética do FVIII e FIX na pratica clinica são relevantes, sobreduto para o seguimento da profilaxia e na avaliação de sucesso do protocolo de ITI

Referências

1. FAVALORO, E.J. Diagnosis and classification of von Willebrand disease: a review of the differential utility of various functional von Willebrand factor assays. Blood Coagul. Fibrinolysis, London, v. 22, n. 7, p. 553-564, 2011 2. HAY, C. R. et al. The diagnosis and management of factor VIII and IX inhibitors: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization. Br. j. haematol., Oxford, v. 111, n. 1, p. 78-90, 2006 3. KITCHEN, S. ; MCCRAW, A.; ECHENAGUCIA, M. Diagnosis of hemophilia and other bleeding disorders: a laboratory manual. 2. ed. Montreal: WFH, 2010. 4. BRASIL. Ministerio da Saude. Manual de diagnóstico e tratamento da doença de von Willebrand. Brasilia, Ministerio da Saude, 2006. 5. BRASIL. Ministerio da Saude. Hemofilia congênita e inibidor, manual de diagnóstico e tratamento de eventos hemorrágicos. Brasilia: Ministerio da Saude, 2009 6. VERBRUGGEN, B. et al. The Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors: improved specificity and reliability. Thrombosis and haemostasis, Sttutgart, v. 73, n. 2, p. 247-251, 1995

Obrigada !