AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGÊNICA E …siaibib01.univali.br/pdf/Silvia Aparecida Ramos.pdf · modelos de dor aguda induzida pelo ácido acético (0,6%), hiperalgesia e edema

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGÊNICA E

ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS PIRAZOLÍNICOS

SILVIA APARECIDA RAMOS

Itajaí - 2012

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS

SILVIA APARECIDA RAMOS



Dissertação apresentada à Universidade

do Vale do Itajaí como parte dos

requisitos parcial, para a obtenção do

grau de Mestre em Ciências

Farmacêuticas.

Orientador: Prof. Dra. Márcia Maria de

Souza

Co-orientadora: Prof. Dra. Fátima de

Campos Buzzi

Itajaí, Fevereiro de 2012.

DEDICATÓRIA

Por tudo o que a vida tem nos proporcionado.

Momentos bons e ruíns.

Pela amizade, cumplicidade e paciência.

Pela nossa história.

Dedico este trabalho ao meu irmão

Mário Nicanor Ramos.

AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar agradeço a Deus, pela força e vontade de continuar nos

momentos difíceis.

Aos meus “nove” irmãos e toda a minha família que me suportaram, pois eles

passaram todo este tempo escutando eu falar de um único assunto “Mestrado”. E as

minhas sobrinhas maravilhosas Thiana e Jéssica, minha cunhada Tati, que me

ajudaram a fotografar os animais.

Aos meus colegas de trabalho da UNIVILLE, Dalva Tomaz, Profa Roseneide,

Profa Carmen, Profa Bianca, Profa Vivia, que sempre me apoiaram a ir em frente e

me apresentaram a docência.

Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, que

contribuíram infinitamente para o meu amadurecimento. Vocês participaram de uma

etapa muito importante da minha vida. Em especial, muito obrigado à Professora

Nara, que sempre me ajudou quando precisei.

Agradeço à Maria Angélica, pelo abraço aconchegante quando eu chegava,

pelas palavras de apoio sempre bem vindas. Maggie você fez falta!!!

As minhas amiguinhas, Lilian, Liliane, Claudia, Gislaine e Nicole, pelo

companheirismo, pela ajuda com os experimentos, vocês foram muito importantes.

Sem você Nicole, este trabalho não teria sido realizado, você sabe disso né amiga!

À professora e coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências

Farmacêuticas Tânia Mari Bellé Bresolin.

Aos meninos do biotério, que sempre me ajudaram com os animais.

Às minhas queridas Orientadoras pela confiança nas minhas idéias, pelo

respeito as minhas opiniões, pelo companheirismo e principalmente por confiar no

meu potencial. Professora Márcia e Fátima, eu admiro muito vocês!!! Obrigado por

tudo.

Agradeço a Lorena pelo desenvolvimento dos compostos e pela confiança na

utilização dos mesmos.

Pai e mãe, apesar de vocês não estarem mais entre nós, tenho certeza que

este seria um momento de muito orgulho. Tenho certeza que em todos os momentos

difíceis que eu passei durante este período, vocês estiveram ao meu lado. E tenho

certeza que de algum lugar vocês estão me aplaudindo. Obrigado, afinal de contas

sem o amor de vocês eu não teria nascido.

Aos meus queridíssimos, ratos e camundongos, sem eles este trabalho não

existiria. Não foi fácil sacrificar os ratos, depois de quase 30 dias de convivência.

E por fim, agradeço aqueles que me deram amor e foram verdadeiros...

EPÍGRAFEEPÍGRAFEEPÍGRAFEEPÍGRAFE

Minha lutaMinha lutaMinha lutaMinha luta

Lutar é viver sensações de chegadaLutar é viver sensações de chegadaLutar é viver sensações de chegadaLutar é viver sensações de chegada

É iniciar cada dia uma jornadaÉ iniciar cada dia uma jornadaÉ iniciar cada dia uma jornadaÉ iniciar cada dia uma jornada

É subir ao pódio dos É subir ao pódio dos É subir ao pódio dos É subir ao pódio dos recomeçosrecomeçosrecomeçosrecomeços

É silenciar os gritos e transpor defeitosÉ silenciar os gritos e transpor defeitosÉ silenciar os gritos e transpor defeitosÉ silenciar os gritos e transpor defeitos

É clarear o dia da vida que quer recomeçar É clarear o dia da vida que quer recomeçar É clarear o dia da vida que quer recomeçar É clarear o dia da vida que quer recomeçar

É brigar com o sono, odiar o travesseiroÉ brigar com o sono, odiar o travesseiroÉ brigar com o sono, odiar o travesseiroÉ brigar com o sono, odiar o travesseiro

Lutar é persistir no rumo escolhidoLutar é persistir no rumo escolhidoLutar é persistir no rumo escolhidoLutar é persistir no rumo escolhido

É brigar contra vÉ brigar contra vÉ brigar contra vÉ brigar contra vontades, vencendo as própriasontades, vencendo as própriasontades, vencendo as própriasontades, vencendo as próprias

Lutar é não levantar em vãoLutar é não levantar em vãoLutar é não levantar em vãoLutar é não levantar em vão

É encarar o leão nosso de cada dia É encarar o leão nosso de cada dia É encarar o leão nosso de cada dia É encarar o leão nosso de cada dia

É sobreviver de espaçosÉ sobreviver de espaçosÉ sobreviver de espaçosÉ sobreviver de espaços

É saber amanhecer a vida É saber amanhecer a vida É saber amanhecer a vida É saber amanhecer a vida

É dominar o sonho de ser vencedorÉ dominar o sonho de ser vencedorÉ dominar o sonho de ser vencedorÉ dominar o sonho de ser vencedor

Assim é ser, é assim que souAssim é ser, é assim que souAssim é ser, é assim que souAssim é ser, é assim que sou

Assim nasci assim é lutar.Assim nasci assim é lutar.Assim nasci assim é lutar.Assim nasci assim é lutar.

Por, Nico Ramos.Por, Nico Ramos.Por, Nico Ramos.Por, Nico Ramos.



Silvia Aparecida Ramos

Fevereiro /2012

Orientador: Profa. Dra. Márcia Maria de Souza.

Co-Orientadora: Profa. Dra. Fátima de Campos Buzzi.

Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.

Número de páginas: 147.

Os análogos pirazolínicos possuem importante participação no repertório de

fármacos utilizados para o tratamento de diversas patologias. Um fármaco muito

conhecido deste grupo é a Dipirona, porém, o seu uso tem sido questionado quanto

à possibilidade do mesmo em induzir distúrbios hematológicos, como a

agranulocitose. O presente estudo teve como objetivo fazer um screening de uma

série de compostos pirazolínicos substituídos segundo modelo de Topliss, em

modelos de dor aguda induzida pelo ácido acético (0,6%), hiperalgesia e edema de

pata induzidos pela ʎ-carragenina (Cg 300 µg/pata). O composto 3,5-bis(4-

clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) foi o que apresentou o melhor perfil

antinociceptivo e dessa forma foi avaliado quanto ao seu efeito antiedematogênico

induzido por substância P (SP, 30nmol/pata), histamina (HIS, 100 µg/pata),

bradicinina (BK, 3nmoL/pata) e prostaglandina E2 (PGE2, 3nmol/pata) no modelo do

edema de pata. O efeito antinociceptivo foi avaliado no modelo de hiperalgesia

induzida pela PGE2 (0,1nmol/pata), Lipopolissacarídeo (LPS 100 ng/pata), BK (500

ng/pata) e adjuvante completo de Freund (CFA 20 µg/pata). Além disso, o composto

foi avaliado no modelo de artrite induzida pelo CFA. Foram avaliados os possíveis

efeitos tóxicos do composto sobre as células sanguíneas da medula óssea e sangue

periférico, a função hepática e renal, temperatura retal e a atividade motora pelo

teste de campo aberto. Nos experimentos foram utilizados camundongos Swiss

machos ou fêmeas (20-35g) e ratos machos Wistar (250 - 380g), dependendo do

protocolo experimental adotado. Os animais foram divididos em grupos distintos

denominados controle negativo/veículo, controle positivo/fármaco referência e C61,

os quais receberam os tratamentos por via intraperitoneal (i.p.). O C61 foi capaz de

inibir de maneira significativa o edema de pata induzido pela HIS (30 ± 4% 0,3

mg/Kg), PGE2 (40 ± 4%, 3 mg/Kg), SP (28 ± 6%, 3 mg/Kg), BK (50 ± 2%, 1 mg/Kg),

além disso, o C61 também demonstrou expressiva redução da hiperalgesia

mecânica induzida pelo CFA (84 ± 6%, 3 mg/Kg), PGE2, (73 ± 10%, 3 mg/Kg), LPS

(58 ± 5%, 0,3 mg/Kg) e BK (64 ± 5%, 1 mg/Kg). No modelo de artrite induzido pelo

CFA os resultados demonstraram inibição siginificativa na hiperalgesia mecânica (52

± 8%, 0,3 mg/Kg) bem como no edema de pata (37 ± 4%, 1 mg/Kg). Além disso, o

tratamento crônico dos animais no modelo de artrite induzido pelo CFA, não

apresentou alterações significativas nos parâmetros hematológicos e bioquímicos. O

tratamento com o C61 também não interferiu na atividade motora e temperatura

corporal dos animais, nas condições experimentais avaliadas. Entretanto para

elucidar os possíveis mecanismos de ação do C61, bem como a sua segurança

terapêutica, outros experimentos devem ser realizados.

Palavras chave: Pirazolina, dor inflamatória, hiperalgesia.

EVALUATION OF THE ANTIEDEMATOGENIC AND

ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF PYRAZOLINE DERIVATIVES

Silvia Aparecida Ramos

February /2012

Supervisor: Prof. Dr. Márcia Maria de Souza.

Co-Supervisor: Prof. Dr. Fátima de Campos Buzzi.

Area of concentration: Natural products and Bioactive and Synthetic Substances.

Number of pages: 147.

Pyrazoline analogs have extensive involvement in the repertoire of drugs used to

treat various diseases. A well-known drug of this group is Dipyrone. However its use

has been questioned as to the possibility that it induces haematological disorders

such as agranulocytosis. This study screens a series of pyrazoline substitute

compounds according to the Topliss model, in models of acute pain induced by

acetic acid (0.6%), hyperalgesia and paw oedema induced by carrageenan-ʎ (Cg

300µg/paw). The compound 3,5-bis (4-chlorophenyl)-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-

pirazolin (C61) was the one that showed the best analgesic antinociceptive profile,

therefore it was evaluated for its antiedematogenic effect induced by substance P

(SP, 30nmol/paw), histamine (HIS, 100 mg/paw), bradykinin (bradykinin (BK,

3nmoL/paw), and prostaglandin E2 (PGE2, 3 nmoL/paw) in the model of paw edema.

The antinociceptive effect was evaluated in the model of hyperalgesia induced by

PGE2 (0.1 nmoL/paw), Lipopolysaccharide (LPS 100 ng/paw), BK (500 ng/paw), and

complete Freund´s adjuvant (CFA 20 µg/paw). Furthermore, the compound was

evaluated in the model of arthritis induced by CFA. The possible toxic effects of the

compound on blood cells from bone marrow and peripheral blood, the liver and

kidney function, rectal temperature and motor activity were evaluated by the open

field test. Male and female Swiss mice (20-35g) and male Wistar rats (250-380g)

were used, depending on the experimental protocol adopted. The animals were

divided into distinct groups named negative control/vehicle, positive control/reference

drug and C61, which received the treatments intraperitoneally (i.p.). C61 was capable

of significantly inhibiting the paw oedema induced by HIS (30 ± 4% 0,3 mg/Kg), PGE2

(40 ± 4%, 3 mg/Kg), SP (28 ± 6%, 3 mg/Kg), and BK (50 ± 2%, 1mg/Kg), also, C61

also showed a significant reduction in mechanical hyperalgesia induced by CFA (84 ±

6%, 3 mg/Kg), PGE2 (73 ± 10%, 3 mg/Kg), LPS (58 ± 5%, 0,3 mg/Kg) and BK (64 ±

5%, 1 mg/Kg). In the model of arthritis induced by CFA, the results demonstrated a

significant inhibition in mechanical hyperalgesia (52 ± 8%, 0.3 mg/Kg) and in the paw

oedema (37 ± 4%, 1 mg/Kg). In addition, chronic treatment of animals in the model of

arthritis induced by CFA showed no significant changes in the hematological and

biochemical parameters. Treatment with C61 also did not interfere in motor activity or

body temperature of the animals, under the experimental conditions evaluated.

However, to elucidate the possible mechanisms of action of C61, as well as it’s

therapeutic safety, further experimental models are necessary.

Keywords: Pyrazoline, inflammatory pain, hyperalgesia.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Uma visão esquemática dos principais circuitos da dor nociceptiva...........27

Figura 2. Diferentes nociceptores detectam diferentes tipos de dor..........................30

Figura 3. Dor Nociceptiva...........................................................................................33

Figura 4. Vias de sinalização e transmissão da dor inflamatória...............................34

Figura 5. Migração dos leucócitos..............................................................................40

Figura 6. Escada Analgésica......................................................................................47

Figura 7. Esquema geral da reação das 1,3,5-triaril-pirazolinas................................55

Figura 8. Procedimento de coleta da medula óssea dos ratos utilizados no modelo

de artrite induzida pelo CFA. Fonte: Ramos, 2011....................................................64

Figura 9. Efeito das 1,3,5-triaril-pirazolinas sobre a contorção abdominal induzida

pela administração i.p. de ácido acético 0,6% em camundongos..............................69

Figura 10. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre

o edema de pata induzido pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em

camundongos.............................................................................................................70

Figura 11. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina

(C60), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-

carragenina em camundongos...................................................................................71

Figura 12. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre

o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em

camundongos.............................................................................................................72

Figura 13. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina

(C62), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-


Figura 14. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-

pirazolina (C66), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de

ʎ-carragenina em camundongos................................................................................74

Figura 15. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre

a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em

camundongos.............................................................................................................75

Figura 16. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina

(C60), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em

camundongos.............................................................................................................76

Figura 17. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre

a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em

camundongos.............................................................................................................77

Figura 18. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina

(C62), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em

camundongos.............................................................................................................78

Figura 19. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-

pirazolina (C66), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-


Figura 20. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre

o edema de pata induzido pela administração i.pl. de BK em camundongos............81


o edema de pata induzido pela administração i.pl. de HIS em camundongos..........82


o edema de pata induzido pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos.......83


o edema de pata induzido pela administração i.pl. de SP em camundongos............84


a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de BK em camundongos................85


a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos............86


a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de LPS em camundongos...............87


a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de CFA em camundongos..............88


o desenvolvimento da artrite (severidade) após a administração i.pl. de CFA

(100µL/pata) em ratos................................................................................................89


o desenvolvimento da artrite após a administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em

ratos (Fotos) ..............................................................................................................90


o edema de pata induzido pela administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em

ratos............................................................................................................................91


a intensidade de hiperalgesia induzida pela administração i.pl de CFA (100 µL/pata)

em ratos, ipsilateral (A e B) e contralateral (C e D)...................................................92

Figura 32. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-

pirazolina (C61) sobre as células sanguíneas............................................................94

Figura 33. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-

pirazolina (C61) sobre o peso dos órgãos e peso corporal........................................96


a atividade motora em camundongos........................................................................97


a temperatura corporal em camundongos..................................................................98

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Previsão teórica da solubilidade e permeabilidade das 1,3,5-triaril-2-

pirazolinas segundo a “Regra dos 5” de Lipinsk........................................................56

Tabela 2. Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por

Topliss........................................................................................................................57

Tabela 3. Resultados das DI50 e % de inibição dos derivados pirazolínicos..............80

Tabela 4. Efeito das doses do C61 sobre a função renal e hepática.........................95

LISTA DE ABREVIATURAS

5-HT – Serotonina

AAS - Ácido acetil salicícilo

Aβ – A-Beta

ACE - Acetaminofeno

Aδ – A-delta

ALT - Alanina amino transferase

AMPc – Adenosina monofosfato cíclico

AINES - Anti-inflamatórios não esteroidais

ANOVA – Análise de variância

AR – Artrite Reumatóide

AST – Aspartato amino transferase

ATP – Adenosina tri-fosfato

AUC – Área sobre a curva

BK – Bradicinina

CFA – Adjuvant Completo de Freund

Cg – ʎ-carragenina

CGRP – Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina

COX – ciclooxigenase

Dex - Dexametasona

DI50 – Dose inibitória 50%

Dip – Dipirona

EPM – Erro padrão da média

ERK - quinases reguladas por sinal extracelular (ERK1, ERK2)

Fenil – Fenilbutazona

G-CSF - Fator estimulador de colônia de granulócitos

GLU - glutamato

GM-CSF – Fator estimulador de colônia de granulócitos macrófagos

HIS – Histamina

HGB – hemoglobia

HTO – hematócrito

IASP - Associação Internacional de Estudos da Dor

ICAM-1 – Molécula intercelular de adesão

IκB – Proteínas inibidoras do κB

IΚΚs – Proteínas quinases IκB

IL - Interleucina

IL-1β – Interleucina – 1beta

IL-1R – receptor de IL-1

IM – Inibição máxima

Ind – Indometacina

iNOS – Óxido nítrico sintase induzida

I.p. – intraperitoneal

IP3 – Fosfotidilinositol

I.pl. – intraplantar

JNK - quinase c-Jun N-terminal

LT - Leucotrienos

LPS – Lipopolissacarídeo

MAPK – Proteínas quinases ativadas por mitógeno

M-CSF - Fator estimulador de colônia de macrófagos

MMPs - Metaloproteinases

NF-κB – Fator nuclear κB

NGF – Fator de crescimento do Nervo

NMDA- N-metil-D-Aspartato

NMR – Núcleo magno da rafe

NO – Óxido nítrico

NOS – Óxido nítrico sintase

nNOS – Óxido nítrico sintase neuronal

NOR - Noradrenalina

OMS – Organização Mundial da Saúde

PAF - Fator de agregação plaquetária

PAG – Substância cinzenta periaquedutal

PGs – Prostaglandinas

PGE2 – Prostaglandina E2

PM – peso molecular

PLT – plaquetas

PKA - Proteína quinase A

PKC – Proteína quinase C

RVM - medula rostroventromedial

s.c. - subcutânea

SI – Sistema Imune

SNC – Sistema Nervoso Central

SNP – Sistema Nervoso Periférico

SNS – Sistema Nervoso Simpático

SP – Substância P

TCAs – Antidepressivos tricíclicos

TTXr – Resistente à Tetrodotoxina

TTXs – Sensível à Tetrodotoxina

TLRs – Receptores do tipo Toll

TNF-α – Fator de necrose tumoral-α

TGF-beta1 – Fator transformador de crescimento Beta-1

VCAM1 – Moléculas de adesão celular vascular 1

v.o. – via oral

VHF – filamento de Von Frey

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 20

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23

2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 23

2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 23

3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 25

3.1 Dor: Características e processamento. ................................................. 25

3.2 Tipos de dor ............................................................................................. 32

3.3 Dor Inflamatória ....................................................................................... 34

3.4 Resposta Imune ....................................................................................... 37

3.5 Artrite Reumatóide .................................................................................. 41

3.5 Como proporcionar o alívio da dor e inflamação ................................. 44

3.6 Heterociclos: pirazol, pirazolinas e pirazolonas .................................. 50

4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 55

4.1 Obtenção das substâncias avaliadas .................................................... 55

4.1.1 Síntese dos derivados 1,3,5-triaril-pirazolínicos ......................................... 55

4.2 Métodos teóricos para avaliação da estrutura-atividade .................... 56

4.2.1 Regra dos cinco de Lipinski. ......................................................................... 56

4.2.2. Método de Topliss ......................................................................................... 57

4.3 Animais ..................................................................................................... 58

4.4 Reagentes ................................................................................................. 58

4.5 Ensaios Farmacológicos ........................................................................ 59

4.5.1 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor aguda. ............. 59

4.5.2 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor persistente. ..... 59

4.5.3 Análise da Propriedade Antiedematogênica ................................................ 60

4.5.4 Modelo de artrite induzida pelo CFA ............................................................ 61

4.5.6 Investigação de possíveis efeitos adversos e/ou colaterais ...................... 65

4.6 Análise Estatística ................................................................................... 66

5 RESULTADOS ....................................................................................................... 68

5.1 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a nocicepção induzida pelo

ácido acético 0,6% em camundongos ......................................................... 68

5.2 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre o edema de pata induzido

pela ʎ-carragenina em camundongos ......................................................... 70

5.3 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a hiperalgesia mecânica

induzida pela ʎ-carragenina em camundongos ......................................... 75

5.4 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61),

sobre o edema de pata induzido por diferentes agentes flogísticos em

camundongos ................................................................................................ 81

5.5 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61),

sobre a hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes

flogísticos em camundongos ....................................................................... 84

5.6 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61)

sobre o edema e hiperalgesia mecânica no modelo de artrite induzida

pelo Adjuvante Completo de Freund (CFA) ................................................ 88


sobre as células sanguíneas no tratamento crônico de artrite induzida

pelo Adjuvant Completo de Freund (CFA) .................................................. 93


sobre a função hepática, renal, peso corpóreo e peso de órgão após

tratamento crônico no modelo de artrite induzida pelo Adjuvant

Completo de Freund (CFA) ........................................................................... 95


sobre a deambulação em camundongos normais. .................................... 97


sobre a temperatura corporal em camundongos normais. ....................... 98

6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 99

7 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 117

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 118

20

1 INTRODUÇÃO

Mesmo sendo um processo fisiológico de alerta para o indivíduo, a dor e a

inflamação ainda constitui, em muitos aspectos, o flagelo da humanidade (PORTH,

2004). Os processos inflamatório e doloroso ocorrem em resposta à lesão celular e

caracterizam-se por um fenômeno complexo, dinâmico e multimediado, os quais

podem ser desencadeados por vários tipos de agentes químicos, físicos ou

biológicos (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998a).

De acordo com Celsus (30 a.c – 36 d.c), médico da antiguidade, a dor é um

dos sinais cardinais da inflamação, e por si só, também compreende um mecanismo

fisiológico designado a proteger o indivíduo (SCOTT et al., 2004; ZAMPONI et al.,

2009). Ao experimentar a sensação dolorosa, o indivíduo é alertado para uma lesão

real ou iminente, e a partir de então, aciona respostas adequadas de proteção

(JULIUS; BASBAUM, 2001). Para tal situação, o Sistema Nervoso Central (SNC) é

especializado em detectar e reagir ao estímulo externo. Cada espécie, de acordo

com sua evolução, tornou-se capaz de identificar e diferenciar um estímulo agressivo

de um estímulo inócuo (KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006).

No entanto, nem sempre, a dor reflete um estado de defesa. Numerosas

condições fisiopatológicas, como diabetes, infecções virais, lesões no nervo, uso de

algumas classes medicamentosas e a inflamação propriamente dita, podem

provocar dor persistente e crônica. Este tipo de dor parece não servir a um propósito

de alerta e muitas vezes, é refratária aos tratamentos convencionais (PORRECA;

OSSIPOV; GEBHART, 2002; ZAMPONI et al., 2009).

A dor é, sem dúvida, o principal sintoma que motiva os pacientes a

procurarem atendimento médico. Alguns exemplos comuns da procura clínica

incluem: dor nas costas, dor lombar, cefaleia, processo doloroso secundário a

trauma agudo. No caso de pacientes com artrite reumatoide (AR), os mesmos

queixam-se mais da dor do que da própria perda da função. Tanto a dor aguda

quanto a crônica constitui um problema de saúde pública de alta prevalência na

sociedade, o que gera altos custos, diretos e indiretos, pois, acarretam em perda

substancial da produtividade (LEVINE; TAIWO, 1990; PAYNE, 1997; GUILLOT et al.,

2011).

21

O desenvolvimento de áreas da ciência como biologia molecular, genética,

imuno-histoquímica, histologia e neuroimagem, contribuíram muito nos últimos anos,

na descoberta de mecanismos moleculares envolvidos na neurobiologia da dor.

Consequentemente, esta evolução tem favorecido a Indústria Farmacêutica no

desenvolvimento de analgésicos mais modernos (BROOKS; TRACEY, 2005).

Esse grande avanço na farmacologia do processo doloroso reflete os

recentes conhecimentos e identificação de importantes alvos envolvidos na

transmissão nociceptiva, bem como na plasticidade neuronal. Dentre eles,

encontram-se os receptores, canais iônicos, neuromoduladores, fatores de

transcrição, que atuam em nociceptores periféricos, medula espinhal, tálamo e

córtex cerebral, onde a sensação é percebida (CARVALHO; LEMONICA, 1998b;

STUCKY; GOLD; ZHANG, 2001; WOOLF; MAX, 2001; BROOKS; TRACEY, 2005).

Considerando as opções de tratamento farmacológico para as desordens

inflamatórias e dolorosas, ainda são descritos muitos efeitos adversos, colaterais ou

não, que inviabilizam o tratamento, principalmente quando este é prolongado. Há

então, a necessidade de constante manejo no tratamento das enfermidades de

cunho doloroso, pois, muitas vezes, ocorre falta de adesão à terapêutica, em função

de tais efeitos (PIETROVSKI et al.,2008). Diante destes fatos, continua sendo

constante e necessária a investigação e busca de novos fármacos, ou então,

modificações estruturais em moléculas clássicas, que melhorem a sua relação

estrutura - atividade, diminuindo os efeitos adversos e aumentando os seus efeitos

farmacológicos desejados (ZHANG et al., 2009a).

Vários trabalhos na literatura descrevem os efeitos farmacológicos de

compostos heterociclos, em especial os que possuem um núcleo pirazol. Uma

revisão feita por Rahman e Siddqui (2010), relata diversos estudos decorrentes da

síntese e avaliação da atividade farmacológica de derivados pirazolínicos. Algumas

das propriedades demonstradas nos estudos foram: efeito antiepilético (SINGH et

al., 1974; KUCUKGUZEL et al., 2000), antidepressivo (PRASAD et al., 2005), anti-

inflamatório (BARSOUM; GIRGIS, 2008), antimicrobiano (OZDEMIR et al., 2007),

antitumoral (MANNA et al., 2005), antiamoébica (BUDAKOTI; ABID; AZAM, 2007),

antinociceptiva (GODOY et al., 2004), inseticida (SILVER; SODERLUND, 2005),

hipotensiva (TURAN-ZITOUNI et al., 2000), antioxidante (BABU et al., 2008), entre

outros.

22

Nesse aspecto, considerando que os núcleos pirazolínicos constituem um

importante grupo de moléculas com efeitos terapêuticos, e visando a necessidade

da busca de novas moléculas como candidatos a fármacos para a terapêutica da dor

e inflamação, o presente trabalho aborda a relação estrutura atividade de derivados

pirazolínicos, avaliando sua ação antiedematogênia e antinociceptiva, e também a

influência destas moléculas sobre alguns parâmetros que apontam toxicidade.

23

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

�Estudar a atividade antiedematogênica e antihiperalgésica dos derivados

pirazolínicos, em modelos experimentais de inflamação e dor, bem como, avaliar

possíveis efeitos adversos.

2.2 Objetivos Específicos

� Analisar o efeito antiedematogênico e antinociceptivo de derivados pirazolínicos

através dos modelos de nocicepção induzida pelo ácido acético, edema de pata e

hiperalgesia mecânica induzidos pela ʎ-carragenina, em camundongos e escolher o

composto mais ativo para estudos posteriores de dor e inflamação;

�Avaliar o efeito antiedematogênico do composto, escolhido no modelo de edema

de pata induzido por BK, HIS, PGE2 e SP, em camundongos;

�Avaliar o efeito anti-hiperalgésico, do composto, por meio do modelo de

hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes flogísticos (BK, PGE2, LPS e

CFA) em camundongos;

�Avaliar a atividade antidematogênica e anti-hiperalgésica do composto no modelo

de artrite induzida pelo CFA em ratos;

�Avaliar macroscopicamente os efeitos do composto sobre o índice de severidade

de instalação de artrite induzida pelo CFA em ratos;

�Investigar o efeito da administração crônica do composto sobre as células da

medula óssea e sangue periférico nos animais submetidos ao modelo de artrite

induzido pelo CFA;

�Investigar o efeito da administração crônica do composto, sobre a função renal e

hepática nos animais submetidos ao modelo de artrite induzido pelo CFA;

�Investigar o efeito do composto sobre o peso corporal e de alguns órgãos, além da

temperatura corporal, verificando a existência de um possível efeito tóxico nos

animais submetidos ao modelo de artrite induzido pelo CFA;

�Verificar se o composto em estudo possui efeito sobre a atividade locomotora dos

animais por meio do modelo de campo aberto, em camundongos;

24

�Comparar os efeitos obtidos do composto mais ativo com fármacos utilizados no

tratamento clínico da dor e inflamação;

25

3 REVISÃO DA LITERATURA

3.1 Dor: Características e processamento.

A capacidade de detectar estímulos nocivos é essencial para a sobrevivência

e bem estar do indivíduo e encontra-se presente na maioria das espécies,

assumindo um alto grau evolutivo na espécie humana. Entretanto, algumas pessoas

sofrem de anomalias genéticas e/ou congênitas que as impede de executar este

simples reflexo de sobrevivência, ou seja, se tornam incapazes de detectar os

estímulos dolorosos (COX et al., 2006).

Os pacientes portadores dessas deficiências congênitas, não desenvolvem a

resposta fisiológica protetora induzida pelo processo doloroso. Obviamente este tipo

de situação pode levar a lesões extensas de uma determinada área, que, em muitos

casos pode causar mutilação ou ainda ser fatal. Diante desse fato, pode-se aferir

então, que a capacidade de detectar um estímulo nocivo desencadeado pela dor é

essencial para a sobrevivência do indivíduo (WOOLF; COSTIGAN, 1999; BASBAUM

et al., 2009).

A sensação “dolorosa” se refere a um conjunto de fatores que envolvem a

percepção do processo nociceptivo associada ao componente afetivo (DAMME et

al., 2010). Desta maneira, a Associação Internacional de Estudos da Dor (IASP)

definui a dor como: “Uma sensação ou experiência emocional desagradável,

associada com dano tecidual real ou potencial, ou descrita nos termos de tal lesão”

(LOSER; MELZACK, 1999; WILHELM et al., 2009). Esta definição é baseada no

conceito de dor como uma percepção e não somente como uma modalidade

puramente sensorial, e leva em conta o fato para que a dor seja conscientemente

experimentada, é necessário o processamento cognitivo (MORIARTY; McGUIRE;

FINN, 2011).

Nocicepção, no entanto, é o processo pelo qual estímulos nocivos são

detectados por uma subpopulação de fibras nervosas periféricas especializadas,

denominadas de nociceptores (BASBAUM et al., 2009). Não se deve confundir os

termos “Nocicepção” e “Dor”, pois, uma pode ocorrer sem a outra. Por exemplo,

após uma anestesia local do nervo mandibular para procedimentos odontológicos,

há nocicepção periférica sem haver a dor, enquanto em um paciente com dor

26

talâmica há dor sem nocicepção periférica. Logo, a nocicepção é uma sensação,

como o tato, a audição, a visão, enquanto a dor é a percepção desta sensação

(LOESER; TREEDE, 2008).

Há mais de um século, o fisiologista britânico Charles Scott Sherrington

(1906), propôs o conceito-chave de nocicepção. Sherrington descreveu a existência

de terminações nervosas livres na pele, responsáveis pela resposta nociceptiva

reflexa. Além disso, apontou como nociceptor, o neurônio sensorial primário, que é

ativado por estímulos capazes de desenvolver lesões (WOOLF; MA, 2007;

OMOIGUI, 2007).

De acordo com esta descrição, os nociceptores têm características

particulares, como limites e sensibilidade que os distinguem de outras fibras

sensoriais (JULIUS; BASBAUM, 2001). Os nociceptores são excitados somente

quando um estímulo intenso alcança o seu limiar, sugerindo que os mesmos

possuem propriedades biofísicas e moleculares capazes de detectar e responder

seletivamente a danos potenciais (BASBAUM et al., 2009).

A ativação dos nociceptores pode ter origem em estímulos de natureza

química, mecânica ou térmica, e a percepção de como será este estímulo (se

doloroso ou não) não é propriedade absoluta do mesmo. Ou seja, alguns dos

estímulos citados podem parecer mais agressivos do que realmente são, da mesma

maneira um estímulo totalmente inócuo, como um simples sopro, pode ser percebido

como potencialmente doloroso, a estes fenômenos denomina-se hiperalgesia e

alodinia, respectivamente (LARSSON, 2009).

Hiperalgesia é um termo psicofísico, que atualmente é proposto para designar

todas as condições de sensibilidade dolorosa aumentada. Dessa forma, a definição

de hiperalgesia está em paralelo com aquela do termo fisiológico “sensibilização”. A

hiperalgesia, geralmente ocorre em processos inflamatórios agudos ou crônicos

passando a ser um dos sintomas em processos dolorosos como a dor neuropática

(IRWIN, 2011).

Após a lesão cutânea, a hiperalgesia pode ser dividida em dois fenômenos: a

hiperalgesia primária, que ocorre no local da lesão e é caracterizada em resposta a

estímulos mecânicos e calor, e hiperalgesia secundária, que ocorre distante do local

da lesão, e é caracterizada por estímulos mecânicos. Um exemplo que se

assemelha a este tipo de hiperalgesia é a dor neuropática e a dor referida (TREEDE

et al., 1992).

27

A sensibilização dos nociceptores é o denominador comum de todos os tipos

de dor inflamatória (CUNHA et al., 1999). A hiperalgesia inflamatória é a

consequência da sensibilização dos neurônios aferentes primários, em particular as

fibras C polimodais de alto limiar. As mudanças em ambos os sítios, tecido inflamado

e sistema nervoso, são resultantes da diminuição do limiar nociceptivo, induzido por

mediadores inflamatórios, os quais possuem a capacidade de sensibilizar

diretamente o neurônio nociceptivo periférico (WOOLF et al., 1997; CUNHA et al.,

2008; PARANOS et al., 2011).

Quando os nociceptores são ativados por algum tipo específico de estímulo,

esta sensação é transmitida por vias aferentes até o gânglio da raiz dorsal (Figura 1)

(RITTNER; BRACK; STEIN, 2008). Esses neurônios então fazem sinapses com os

neurônios de segunda ordem na superfície do corno dorsal da medula espinhal.

Neste processo o corno dorsal age como filtro de informações dos sinais periféricos

antes de enviá-los a sítios supraespinhais, como o tálamo, córtex somatosensorial,

córtex insular e córtex cingular, onde as informações transmitidas serão processadas

no contexto nociceptivo (SCHMIDTKO; TEGEDER; GEISSLINGER, 2009).

Figura 1. Uma visão esquemática dos principais circuitos da dor nociceptiva. A ativação da terminação nervosa periférica por um estímulo nocivo leva à geração de potenciais de ação que são conduzidos até o corno dorsal da medula espinhal. A neurotransmissão no corno dorsal transmite o sinal a neurônios do SNC, que enviam o sinal ao cérebro. Esse circuito está sujeito a modulação pelo controle descendente (Esquema adaptado de KUNER, 2010).

28

A transmissão da dor ocorre através de uma série de eventos finamente

regulados por neurônios, interneurônios, mediadores químicos, mecanismos

periféricos e centrais que modulam o processo nociceptivo de maneira complexa, e

ainda não estão totalmente esclarecidos (SCHMIDTKO; TEGEDER; GEISSLINGER,

2009).

O processo nociceptivo envolve, de maneira resumida, o estímulo inicial

gerando ativação dos nociceptores, a transmissão, a modulação e percepção do

estímulo (SERPELL; MAKIN; HARVEY, 1998; WU; ZHUO, 2009). Desta forma pode-

se visualizar a medula espinhal como uma espécie de interlocutor ou uma estação

intermediária entre o estímulo agressor e o cérebro, formada por uma complexa

estrutura com grande variedade de células nervosas, neuropeptídeos e

neurotransmissores (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998b).

Os neurônios que tem suas projeções no interior das lâminas I e V são as

principais saídas do corno dorsal da medula em direção ao cérebro, com a origem

de múltiplas vias ascendentes incluindo o trato espinotalâmico e o trato

espinoreticulotalâmico, que levam a mensagem dolorosa para o tálamo e para o

cérebro respectivamente (BASBAUM et al., 2009).

Os corpos celulares dos nociceptores que inervam o tronco, membros e

vísceras, estão localizados no gânglio da raíz dorsal, e os que inervam a face e

crânio localizam-se no gânglio do nervo trigêmio (BASBAUM et al., 2009). Os corpos

celulares dos neurônios que dão origem as fibras sensoriais de maior diâmetro são

chamadas de fibras A Beta (Aβ). Estas fibras são mielinizadas e de condução

rápida, onde a presença ou não da bainha de mielina interfere na condutibilidade da

fibra em questão e consequentemente na velocidade da transmissão do estímulo

doloroso (MILLAN, 1999). A maioria destas fibras Aβ, mas nem todas, detectam

estímulos inócuos aplicados na pele, músculos e articulações, e, portanto não

contribuem para o processo doloroso. (JULIUS; BASBAUM, 2001).

Uma teoria de grande importância na compreensão da transdução e

transmissão do estímulo nociceptivo é a teoria das comportas, “Controle de Portão

para a Dor” proposta por Melzack e Wall em 1965. Foi proposto que alguns

neurônios teriam a capacidade de suprimir a transmissão do sinal doloroso no corno

dorsal da medula, fechando assim uma espécie de portão hipotético, e inibindo a

passagem do impulso doloroso (MELZACK; WALL, 1965).

29

Os neurônios responsáveis pelo mecanismo de “fechar o portão” incluem as

fibras nervosas ascendentes de maior calibre (fibras Aβ), estimuladas por estímulos

cutâneos táteis indolores, e o sistema descendente inibitório da dor, constituído por

fibras originárias de neurônios da substância cinzenta periaquedutal (PAG) do

mesencéfalo e do núcleo magno da rafe (NMR) (MELZACK; WALL, 1965; MELZAK,

1999). Essas fibras estimulam as células da lâmina II do corno dorsal da medula

(substância gelatinosa), que consistem, principalmente, de interneurônios inibitórios

curtos, que se projetam para as lâminas I e V, regulando a transmissão da via

nociceptiva. Essa teoria explica que nem toda dor está associada a um estímulo

lesivo e que estímulos nocivos podem não causar dor (MELZACK; WALL, 1965;

LOSER; TREEDE, 2008).

Os aferentes nociceptivos primários incluem outros dois tipos de fibras, que

são as mais importantes (Figura 2): as fibras C e A-delta (Aδ). Como descrito

anteriormente, os corpos celulares destas fibras também estão localizados no

gânglio da raíz dorsal, e seus axônios podem ser mielinizados, de diâmetros finos,

ou não mielinizados (DRAY, 1995).

As fibras Aδ possuem diâmetro pequeno, são mielinizadas, e conduzem o

estímulo doloroso de maneira rápida. O tipo de dor conduzido por esta fibra é

característico da dor aguda, bem localizada. As fibras Aδ podem ser ativadas por

estímulos mecânicos, térmicos e às vezes químicos, por isso são chamadas de

polimodais. Este conjunto de fibras pode ser dividido em duas classes, tipo I que

responde a ambos os estímulos mecânicos e químicos e com alto limiar para

estímulos térmicos (>50°C), e o tipo II apresentando limiares para estímulo quente

menor (43°C), porém, um limiar mecânico muito alto. Essas fibras apresentam

terminações em todo o corno dorsal, mas terminam predominantemente na lâmina I

e mais profundamente na lâmina V (RICE; JUSTINS, 1999).

As fibras C nociceptivas são fibras não-mielinizadas, de diâmetro pequeno, e

de condução lenta. Neste caso, o tipo de dor conduzido é vaga e em queimação.

Podem apresentar-se como fibras C peptidérgicas, expressando neuropeptídeos

como a SP e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), e fibras C não-

peptidérgicas. Essas fibras também são chamadas de polimodais por responderem a

diversos tipos de estímulos, além dos dolorosos. Sua distribuição no corno dorsal da

medula espinhal contempla principalmente as lâminas I e II (CARVALHO;

LEMÔNICA, 1998b; LARSSON, 2009).

30

Figura 2. Diferentes nociceptores detectam diferentes tipos de dor. A. Nervos periféricos incluem fibras mielinizadas aferentes de pequeno diâmetro (Aδ) e de médio a grande diâmetro (Aα,β), bem como de pequeno diâmetro das fibras amielínicas aferentes (C). B. O fato de que velocidade de condução está diretamente relacionada ao diâmetro da fibra é destaque na gravação de um potencial de ação de um nervo periférico. A maioria dos nociceptores são fibras Aδ ou C, e suas velocidades de condução são diferentes (12 a 30 m/s e de 0,5 a 2,0 m/s, respectivamente), de acordo com a primeira (rápida) e segunda (lento) resposta de processo doloroso à lesão (Adaptado de BASBAUM; JULIUS, 2001).

Apesar da maioria dos nociceptores serem polimodais, a estimulação química

parece ser a mais comum e diversificada na geração de sinais em todos os tipos de

fibras. Alguns tipos de nociceptores denominados “silenciosos” (que pertencem ao

grande grupo das fibras C polimodais) têm sido identificados na pele e órgãos, e são

responsivos somente quando são sensibilizados por tecidos lesados, ou seja, são

irresponsivos mesmo com estímulo intenso, sem produção de lesão. Os

nociceptores silenciosos representam uma gama ampla das fibras aferentes

sensitivas, os quais contribuem para o fenômeno de sensibilização periférica (DRAY,

1995; JULIUS; BASBAUM, 2001).

Um dos mecanismos centrais de grande importância na fisiopatologia da dor é

o da transmissão facilitada no corno dorsal da medula espinhal e,

consequentemente, para as vias nociceptivas mais altas (CARVALHO; LEMÔNICA,

31

1998b). As lesões que se iniciam no sistema nervoso periférico (SNP) modificam a

anatomia e a fisiologia do SNC com hiperatividade celular, como um estímulo

inflamatório que provoca sensibilização periférica das fibras C nociceptivas. No

entanto, quando o estímulo torna-se repetitivo e prolongado, pode ocorrer um

fenômeno conhecido como Wind up, que é o resultado do somatório de potenciais

de ação pós-sinápticos lentos após estimulação aferente de baixa frequência (<5Hz)

repetida e por tempo prolongado, ocorre então aumento da condutividade de cálcio e

da resposta à dor (KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006).

Este estímulo intermitente provoca a liberação de SP e glutamato (GLU). O

glutamato atua sobre os seus receptores do tipo N-metil-D-Aspartato (NMDA) na

medula espinhal, tornando o neurônio da medula espinhal ainda mais responsivo

aos estímulos. Ocorre então consequente elevação na frequência de descargas

espontâneas destes neurônios e exagerada resposta aos estímulos

somatosensoriais, resultando na sensibilização central. A ativação de receptores

NMDA aumenta a resposta celular aos estímulos dolorosos e diminui a sensibilidade

neuronal a agonistas de receptores opioides (DICKENSON; SULLIVAN, 1987;

BENNETT, 2000).

Após a lesão no nervo, ocorrem alterações drásticas no sistema

somatosensorial, amplificando a experiência dolorosa e aumentando a sensibilidade

dos nociceptores aos estímulos periféricos. Logo, os estímulos que até então eram

inócuos ou de baixa intensidade, passam a ser dolorosos (FERRARI; BOGEN;

LEVINE, 2010). Quando os nociceptores são ativados por algum tipo de estímulo,

ocorre a ativação de vários canais iônicos. Neste caso os canais de sódio voltagem-

dependente e os canais de potássio, são fundamentais para a geração de potencial

de ação, os quais transmitem a informação dolorosa da periferia para o corno dorsal

da medula espinhal (BASBAUM, 2009).

Os canais de sódio voltagem-dependente são o principal tipo de canais

iônicos envolvidos na gênese da excitabilidade neuronal no SNC e SNP, e podem

ser classificados em dois grandes grupos: os sensíveis à tetrodotoxina (TTXs), que

estão presentes nas fibras Aδ, em todo sistema nervoso e no gânglio da raiz dorsal;

e os resistentes à tetrodotoxina (TTXr), que são encontrados especialmente nas

fibras C do gânglio da raiz dorsal. Os distúrbios que implicam em aumento da

hiperexcitabilidade ou aumento da sensibilidade à estimulação neuronal incluem a

dor (LAI et al., 2002; KRAFTE; BANNON, 2007).

32

As vias descendentes da dor se originam no tronco cerebral e outras

estruturas como hipotálamo, córtex, tálamo, NMR, PAG e estruturas adjacentes da

medula rostroventromedial (RVM), que exercem importante papel na integração e

modulação dos mensageiros nociceptivos no corno dorsal da medula espinhal

(OSSIPOV; DUSSOR; PORRECA, 2010). Os mecanismos descendentes modulam a

resposta nociceptiva por exercer suas ações em nociceptores presentes nas vias

aferentes primárias, bem como em neurônios intrínsecos do corno dorsal,

interneurônios excitatórios e inibitórios e neurônios de projeção (PORRECA;

OSSIPOV; GEBHART, 2002).

3.2 Tipos de dor

Existem várias maneiras de classificar a dor. Alguns dos critérios para a

classificação da dor podem ser de acordo com a duração, topografia, intensidade,

dentre outros. De acordo com os critérios temporais ela pode ser transitória, aguda

ou crônica (BRENNAN; CARR; COUSINS, 2007). Do ponto de vista fisiológico a dor

pode ser classificada como nociceptiva, inflamatória ou neuropática (SALTER,

2005).

Como dito anteriormente, a dor é uma experiência sensorial multidimensional,

intrinsicamente desagradável e se associa ao fato de ferir. Pode variar de

intensidade (leve, moderada ou grave), qualidade (aguda, afiada, ardor, maçante),

duração (transitória, intermitente ou persistente), localização (superficial, profunda,

localizada ou difusa), todas estas características são vinculadas a experiência

sensorial (WOOLF, 2004).

Outra forma de descrever os tipos de dor é essencialmente por duas grandes

categorias: adaptativa e mal-adaptativa. A dor adaptativa contribui para a

sobrevivência, protegendo os organismos de lesões ou promovendo a cura quando

a lesão ocorreu. A mal-adaptativa, ao contrário, é uma expressão do funcionamento

patológico do sistema nervoso, é a dor como doença (WOOLF, 2010).

No que se refere à dor aguda, caracteriza-se por ser de curta duração (alguns

segundos até poucos dias), sendo muitas vezes, decorrente de uma lesão tecidual,

com subsequente ativação de nociceptores, desaparecendo com a resolução do

processo que a originou (LOESER; MELZACK, 1999; MONTECUCCO; CAVAGNA;

CAPORALI, 2009).

33

A dor nociceptiva compreende a dor aguda, em outras palavras, é sistema

fisiológico de alerta rápido, com função protetora. Este sistema defensivo é essencial

para detectar e minimizar o contato com o estímulo nocivo. Essa é a dor que um

indivíduo sente ao tocar a ponta de uma agulha, o fogo ou o gelo, bater com um

martelo, ou queimar com um agente caústico (Figura 3) (WOOLF, 2004). A dor

nociceptiva detecta o agente específico (físico, químico ou térmico), que

possivelmente daria origem a uma lesão tecidual, por este motivo ela é chamada de

dor nociceptiva, e sem dúvidas é vital (WOOLF, 2010).

Mesmo a dor nociceptiva desempenhando o seu papel de alerta, a lesão

tecidual pode ocorrer, por exemplo, através de um trauma, cirurgia ou doença

inflamatória. Essas situações podem estimular mudanças na resposta nociceptiva,

visando promover a cura do tecido lesado. Neste momento a dor inflamatória se faz

presente (LOESER; TREEDE, 2008).

Figura 3. Dor nociceptiva. Estímulos nocivos são traduzidos em atividade elétrica nos terminais periféricos de nociceptores por fibras amielínicas C e de fibras Aδ pouco mielinizadas por receptores específicos ou canais iônicos sensíveis ao calor, e ao frio (Adaptado de SCHOLZ; WOOLF, 2002).

34

3.3 Dor Inflamatória

Assim como a dor, a inflamação é uma resposta natural, que faz parte dos

mecanismos de defesa do ser humano. Na medida adequada é fisiológica e

essencial para a proteção contra agentes nocivos (LAUPATTARAKASEM et al.,

2003). É caracterizada pelos sinais cardinais da inflamação (calor, rubor, inchaço e

dor), primeiramente descritos por Celsus (30 a.c – 36 d.c) e aperfeiçoado por

Virchow, que descreveu a perda da função da área lesada, que sinalizam o início do

processo inflamatório (SCOTT et al., 2004).

Após a lesão tecidual por ação mecânica, infecção, isquemia, crescimento

tumoral ou processos autoimunes, múltiplos mediadores químicos são liberados no

local, além disso, ocorre o recrutamento de células inflamatórias. O resultado da

liberação dos mediadores forma a conhecida “sopa inflamatória”, rica em citocinas,

fatores de crescimento, cininas, purinas, aminas, prostanoides e íons incluindo

prótons (Figura 4) (SCHOLZ; WOOLF, 2002).

Figura 4. Vias de sinalização e transmissão da dor inflamatória. Os tecidos danificados, as células inflamatórias ou tumores liberam mediadores químicos criando uma “sopa inflamatória” que ativa ou modifica a propriedade de resposta do estímulo dos nociceptores aferentes. Estes, por sua vez, estabelecem mudanças na capacidade de resposta dos neurônios do SNC (Adaptado de SCHOLZ; WOOLF, 2002).

35

Alguns mediadores agem sensibilizando o sistema nervoso somatosensorial,

e assim, são capazes de facilitar a ativação das vias nociceptivas até a cura ou

recuperação tecidual (SCHOLZ; WOOLF, 2002). Estes mediadores também são

chamados de mediadores hiperalgésicos intermediários, entre eles destacam-se as

citocinas/quimiocinas, de origem celular, a BK, as proteínas do sistema

complemento C3a e C5a, liberados logo após o reconhecimento do processo

inflamatório (FERREIRA et al., 2009).

No que se refere às cininas, estes peptídeos vasoativos são gerados no

plasma e tecidos periféricos a partir dos cininogênios de alto peso molecular por

ação das enzimas kalicreínas, possuem diversas ações fisiológicas, dentre as quais,

aumento da permeabilidade vascular, promoção da dilatação venular, indução de

dor e hiperalgesia e controle da pressão sanguínea (CAMPOS; SOUZA; CALIXTO,

1998; MAURER et al., 2011).

O efeito das cininas está relacionado com a atuação em receptores B1 e B2,

sendo que os receptores B2 são constitutivamente expressos em muitos tipos

celulares, amplamente distribuídos no SNC e SNP. Os receptores B1 não são

normalmente expressos em tecidos íntegros, sua expressão é estimulada após lesão

tecidual, ou tecido inflamado, decorrente da ação de certos agentes como

endotoxinas bacterianas ou CFA (DRAY, 1995; CAMPOS; SOUZA; CALIXTO, 1998).

Ao agir sobre os receptores B2, a BK causa excitação e sensibilização dos

nociceptores causando dor e hiperalgesia. Assim, estes efeitos diretos levam a

produção de outros mediadores inflamatórios, como as PGs, leucotrienos (LT), HIS,

óxido nítrico (NO), fator de agregação plaquetária (PAF), e citocinas como o fator de

necrose tumoral-α (TNF-α), que agem não somente nos terminais aferentes

primários, mas também estão envolvidos na geração e manutenção da inflamação

(BURGESS et al., 2000).

Os receptores B1 e B2 são receptores acoplados a proteína G, desta maneira,

podem atuar através da estimulação da hidrólise do fosfotidilinositol (IP3) com

conseqüente aumento da concentração intracelular de cálcio, ou ainda ativar a

fosfolipase C (PKC) gerando os metabólitos derivados da via do ácido araquidônico

(McEACHERN et al., 1991; DRAY, 1995; CAMPOS; SOUZA; CALIXTO, 1998).

Quando há o aumento citosólico de cálcio na célula endotelial, promovido pela

ativação de receptores B2 por seus ligantes BK ou kalidina, ocorre ativação da óxido

nítrico sintase (NOS) e conseqüentemente a formação de NO a partir da arginina. O

36

NO se difunde do endotélio para o músculo liso e ativa guanilato ciclase, levando o

aumento de monofosfato de guanosina cíclica (GMPc), um segundo mensageiro que

promove o relaxamento da musculatura lisa (REGOLI et al., 1996; JU et al., 1998).

Outros mediadores inflamatórios ativam diretamente os nociceptores,

evocando a dor, e são chamados também de mediadores hiperalgésicos finais. Eles

atuam diretamente na membrana dos neurônios periféricos nociceptivos e induzem

mecanismos responsáveis pela sua sensibilização. Entre os mais importantes estão

os eicosanoides (PGs e prostaciclinas), as aminas simpáticas, LT, PAF, HIS e a

serotonina (5-HT) (SHOLZ; WOOLF, 2002; FERREIRA et al., 2009).

No que diz respeito à HIS, esta uma amina biogênica é amplamente estudada

por desempenhar diversos papéis na imunomodulação, alergia, inflamação,

hematopoiese, proliferação celular e na dor. Além de promover contração do

músculo liso e secreção do ácido gástrico, aumento da permeabilidade vascular e

tem papel neurotransmissor. Os efeitos da HIS são mediados por sua ligação aos

subtipos de receptores designados HR1, HR2, HR3 e HR4, sendo todos estes

receptores acoplados a proteína G (MAHDY; WEBSTER, 2011).

Uma vez liberadas no espaço intercelular as PGs se ligam aos seus

receptores específicos na membrana plasmática. Cada receptor é designado pela

letra P, precedido pela inicial da série da PG, por exemplo, o receptor da PGE2 é o

EP, o receptor da PGI é IP, e assim sucessivamente. Todos os receptores das PGs

são acoplados a proteína G, e os mecanismos intracelulares que medeiam a

ativação destes receptores, envolve modificações intracelulares de cálcio, adenosina

monofosfato cíclico (AMPc) e fosfotidilinositol (IP3) (VANEGAS; SCHAIBLE, 2001).

Quatro são os receptores ativados pela PGE2, EP1, EP2, EP3 e EP4 e tem um papel

importante no aumento da permeabilidade vascular e na geração da febre, além de

modular a hiperalgesia (CUNHA; TEIXEIRA; FERREIRA, 1999; REINOLD et al.,

2005; KASSUYA et al., 2007).

Recentemente foi demonstrado que a PGE2 promove aumento as expressão

da IL-6, via receptor EP4 na gênese da dor neuropatica (St-JACQUES; MA 2011).

Desta forma, a PGE2 é um contribuinte muito importante para a sensibilidade á dor

durante a inflamação. Sua produção requer a atividade de pelo menos uma das

duas isoformas de ciclooxigenase (COX), a COX-1 e COX-2, a qual é mais

expressiva e relevante para a inflamação. Os anti-inflamatórios não esteroidais

(AINES) clássicos bloqueiam em grau semelhante ambas as isoformas, enquanto

37

que os AINES seletivos como os Coxibes bloqueiam especificamente a COX-2. Em

virtude disso, os AINES tradicionais causam efeitos colaterais em virtude da não

seletividade enquanto que os seletivos não o fazem. Entretanto, o uso de inibidores

seletivos da COX-2 está associado com o risco aumentado de eventos

cardiovasculares (CHAPLAN et al, 2010).

A SP é um neuropeptídeo da família das taquicininas, que se estocado e

liberado nos terminais nervosos autonômicos promove vasodilatação e

extravasamento vascular (MAPP; KIDD, 1994; BIRKLEIN; SCHMELZ, 2008). A SP

está intimamente relacionada com a inflamação neurogênica (BLACK, 2002;

BIRKLEIN; SCHMELZ, 2008).

Essa taquicinina é amplamente distribuída no SNC e SNP. No SNP é

localizada nas fibras C amielínicas, também chamadas de fibras C peptidérgicas,

que quando estimuladas transmitem a informação nociceptiva (MAPP; KIDD, 1994).

Assim como na dor, a SP também desempenha um papel eferente, onde o nervo

sensorial ativado causa transmissão antidrômica (reversa) dos impulsos nervosos

(além da transmissão ortodrômica para a medula espinhal) nos ramos da mesma

fibra C. A estimulação antidrômica do nervo periférico sensorial causa as respostas

típicas da inflamação aguda (GARRETT et al., 1992).

3.4 Resposta Imune

Em relação à resposta imune inata, que consiste na primeira linha de defesa

contra patógenos invasores, é uma importante via de reconhecimento de produtos

bacterianos (FURZE; RANKIN, 2008). A resposta inflamatória desencadeada, em

parte, via sistema imune inato se dá pela ativação de receptores do tipo Toll (TLRs)

que são expressos em monócitos, macrófagos, mastócitos, neutrófilos, células

dendríticas e queratinócitos (REN; DUBNER, 2010; GUILLOT et al., 2011).

Os receptores TLRs, são glicoproteínas de membrana integral tipo I,

responsáveis por fazer a comunicação entre os aspectos externo e interno da célula.

Dois membros dessa família, os receptores TLR-2 e TRL-4, foram identificados

como o receptor envolvido na sinalização do LPS via ativação do fator nuclear-κB

(NF-κB) (MOORE, 2001; CARRENHO, 2009). Este efeito pode também ser mediado

pelo aumento de interleucina-1β (IL-1β) através da sinalização dos TLR-2 e TLR-4,

bem como aumento de TNF-α através dos TLR2 (DREXLER; FOXWELL, 2009).

38

O LPS é um componente importante da membrana externa de bactérias Gram

negativas e um dos iniciadores microbianos mais potentes da inflamação. Os

mecanismos moleculares de ativação de macrófagos pelo LPS envolvem diversas

quinases como a proteína quinase C (PKC), proteína quinase A (PKA) e três classes

de proteínas quinase ativadas por mitógeno (MAPK): quinases reguladas por sinal

extracelular (ERK1, ERK2), quinase c-Jun N-terminal (JNK) e P38 MAPK. Além das

quinases, a ativação dos receptores TLR4, pelo LPS promove a ativação do NKKB o

qual por sua vez promove a ativação da transcrição de genes para diversos

mediadores da resposta imunológica (NICOTRA et al., 2011).

O LPS induz a produção de citocinas pró-inflamatorias como o TNF-α, IL-1β,

IL-6, IL-8,e também IL-12 por mastócitos e macrófagos. Também é relatado que os

macrófagos secretam, em resposta ao LPS, uma grande variedade de outros

mediadores da resposta inflamatória, incluindo PAF, PGs, enzimas e radicais livres

como o NO (FERREIRA; LORENZETTI; POOLE, 1993; CUNHA et al., 1992; CUNHA

et al.,2000).

A ativação dos receptores TLRs pela via proteína MyD88-dependente, gera

uma cascata de transdução de sinal por ativação do NF-κB (REN; DUBNER, 2010).

O NF-κB é um fator de transcrição que desempenha um papel importante na

regulação das respostas imunes inatas e adaptativas associado a funções efetoras,

por regular a expressão genética de muitos mediadores celulares. Nas células em

repouso, o NF-κB reside no citoplasma em uma forma fisicamente inativa, associado

com proteínas inibidoras conhecidas como proteínas inibidoras do kB (IkB)

(BÁRTHOLO; BÁRTHOLO, 2009).

Quando um ligante específico ativa o receptor de NF-κB (Ex: LPS, TNF-α, IL-

1β), é desencadeado uma série de eventos que resulta no recrutamento e ativação

de proteínas quinases IκB (IKKs) que fosforilam IκB. A degradação da IκB promove a

translocação do NF-κB para o núcleo da célula e conseguinte promoção de genes e

controle de transcrição, que desencadeia a síntese de citocinas inflamatórias

(CAAMAÑO; HUNTER, 2002; HANADA; YOSHIMURA, 2002).

Em função do aumento da permeabilidade vascular, frente à resposta

inflamatória, ocorre o extravasamento do líquido intersticial (edema), rico em água e

proteínas de fase aguda. O aumento da permeabilidade vascular também favorece o

infiltrado de células fagocíticas, como os neutrófilos (fase aguda) e monócitos (fase

39

crônica). A infiltração destas células nos tecidos é característica histológica

patognomônica de inflamação (SCHOTTENFELD; BEEBE-DIMMER, 2006).

Os neutrófilos são células do tipo polimorfonucleares, que constituem a maior

porção dos leucócitos circulantes do sangue periférico e medula óssea. A sua

produção na medula óssea é regulada pela expressão de fator estimulador de

colônia de granulócitos (G-CSF) (FURZE; RANKIN, 2008). No que diz respeito à

resposta imune, estas células desempenham papel crucial na limitação e expansão

da disseminação bacteriana. Quando há um estímulo inflamatório ou resposta

infecciosa, estas células são rapidamente mobilizadas dos seus sítios de reserva,

para o sítio da lesão (DA SILVA; HASHIMOTO, 2003; FURZE; RANKIN, 2008).

A homeostasia de produção destas células é mantida por um delicado

equilíbrio entre a granulopoiese (pool das stem cell, pool mitótico e pós mitótico) na

medula óssea, a porção no sangue periférico (pool circulante e marginação

intravascular) e a demanda tecidual (SUMMERS et al., 2010). Para atingir o tecido

alvo (ou possível foco infeccioso), o neutrófilo realiza um processo chamado

transmigração (FURZE; RANKIN, 2008).

A adesão dos neutrófilos circulantes ao endotélio microvascular é o passo

inicial na diapedese, ou seja, ocorre a migração das células através dos vasos

sanguíneos e vão se acumular no local da lesão (TONNESEN, 1989). Fatores

quimiotáticos como peptídeos (N-formilmetionil-leucil-fenilalanina, C5a) e

mediadores lipídicos (LTB4 e PAF) atuam sobre receptores específicos na

membrana do neutrófilo, favorecendo uma firme adesão do neutrófilo a célula

endotelial. Assim é desencadeada uma série de eventos que vão favorecer

rolamento, adesão e diapedese celular, com posterior infiltração tecidual (Figura 5)

(TONNESEN, 1989; DA SILVA; HASHIMOTO, 2003).

Os sinusoides da medula óssea e o endotélio expressam moléculas de

adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e moléculas intercelular de adesão (ICAM-1), P-

selectina, E-selectinas (FURZE, RANKIN, 2008). As L-selectinas são expressas na

maioria dos leucócitos, enquanto que as E- selectinas e P-selectinas são expressas

em células endoteliais inflamadas. A P-selectina também é expressa por plaquetas

ativadas (LEY et al., 2007).

A expressão de L-selectina nos neutrófilos desencadeia o movimento de

rolamento ao longo do capilar, antes da sua transmigração através do endotélio

vascular (LEY et al., 2007). Os neutrófilos, monócitos e linfócitos podem se aderir à

40

parede dos vasos, migrar e se acumular no local da lesão. Desta maneira, estas

células contribuem para a sensibilização nociceptiva periférica, através da liberação

de fatores solúveis que vão interagir diretamente com os nociceptores (REN;

DUBNER, 2010).

Figura 5: Migração dos leucócitos. Os três passos são mostrados em negrito: rolamento, que é mediado pelas selectinas, ativação, que é mediado pelas quimiocinas, e a captura/parada que é mediada pelas integrinas. Moléculas chave envolvida em cada etapa são mostradas nas caixas: ESAM, seletivas moléculas de adesão das células endoteliais. ICAM1, molécula de adesão intercelular 1. JAM, molécula de adesão juncional. LFA1, antígeno associado a função linfoide 1 (também conhecido como αLβ2-integrina). MAC1, antígeno de macrófago 1. MADCAM1, mucosa vascular adressina molécula de adesão celular 1. PSGL1, P-selectina glicoproteína ligante 1. PECAM1, molécula de adesão de plaquetas/endotélio-célula 1. PI3K, fosfatidilinositol-3-quinase. VCAM1, molécula de adesão células vascular 1. VLA4, antígeno muito tardio 4 (também conhecido como α4β1-integrina).

A resolução do processo inflamatório é resultante da produção de citocinas

anti-inflamatórias por células do SI, que ajudam a controlar e resolucionar tal

resposta. As citocinas anti-inflamatórias naturais são o antagonista do receptor de IL-

1 (IL-1R), IL-10, IL-4, IL-13 e o fator tranformador de crescimento – beta1 (TGF-

beta1). Tem sido demonstrado que as citocinas IL-4 e IL-10 limitam a hiperalgesia

inflamatória, por inibição da produção de citocinas hiperalgésicas e PGs (CUNHA et

al., 1999).

Uma vez terminada a infecção ou inflamação, se instala a cura e a área uma

vez lesionada, deverá voltar a sua existência normal. Uma das vias finais da

resposta inflamatória se dá pelo fenômeno de apoptose (OMOIGUI, 2007). Diante do

41

conhecimento dos mecanismos expostos, muitos pesquisadores se esforçam para

encontrar novas opções terapêuticas, principalmente no que diz respeito à dor

inflamatória crônica (BECK et al., 2009).

3.5 Artrite Reumatóide

A artrite reumatóide é uma doença autoimune que envolve um influxo

descontrolado de células inflamatórias nas articulações, levando à lesão progressiva,

caracterizada por dor crônica e inflamação (ALZABIN; WILLIAMS, 2011). A dor

desencadeada durante a artrite afeta milhões de pessoas anualmente, em torno de

1% da população mundial, e os pacientes acometidos pela doença, freqüentemente

desenvolvem incapacidade motora e angústia psicológica, frente à qualidade de vida

prejudicada. Entretanto, os mecanismos relacionados com a dor articular não estão

totalmente elucidados (UEMATSU et al., 2011).

Sabe-se que durante o processo inflamatório na AR, ocorre uma complexa

interação entre mediadores químicos, células do SI e nervos presentes nas

articulações que são sensibilizados por estímulos mecânicos (MAPP; KIDD, 1994;

FOX et al., 2010). Além disso, o processo inflamatório na artrite gera mudanças

importantes na plasticidade periférica e no SNC, os quais reduzem o limiar da dor,

dando origem a alodínia e a hiperalgesia (WOOLF; COSTIGAN, 1999; RITTNER;

BRACK; STEIN, 2008; WALDBURGER; FIRESTEIN, 2010). Durante o processo,

uma maneira pela qual a dor articular é gerada é através da estimulação de

nociceptores silenciosos. Em condições fisiológicas normais estes nociceptores

estão quiescentes nas articulações, no entanto, após uma lesão tecidual ou

processo inflamatório pode ocorrer a ativação destas células (Mc DOUGALL, 2006).

Nas décadas de 50 e 60 Carl Pearson, divulgou vários trabalhos descrevendo

a metodologia de artrite induzida por CFA. A administração intraplantar de CFA em

ratos causa poliartrite migratória, e esta reação se assemelhava muito com a AR

humana. Ainda de acordo com Pearson, a reação inflamatória que ocorre não é

infecciosa, mas sim uma reposta imuno-mediada contra algum constituinte da

bactéria injetada (bacilo da tuberculose) (PEARSON, 1956; PEARSON; WAKSMAN;

SHARP, 1961). Em 1985 Van Eden et al., descreveram que a artrite induzida por

CFA ocorreria através de resposta auto-imune mediada por células, uma espécie de

42

mimetismo estrutural entre a micobactéria e proteoglianos (componente normal) da

cartilagem do animal.

Desde então a artrite induzida por CFA tem sido comumente utilizada como

modelo experimental em estudos in vivo em animais. Como já reportado, este

modelo desenvolve muitas características comuns a artrite que ocorre em seres

humanos, caracterizado por severo e persistente processo inflamatório e

comprometimento da cartilagem e estrutura óssea com o passar do tempo

(NEWBOLD, 1963). A semelhança comum da patologia induzida experimentalmente

com a artrite reumatóide em humanos faz com que este modelo seja utilizado para a

pesquisa de novos medicamentos para o tratamento desses processos crônicos,

envolvendo dor e inflamação persistente (PAN et al., 2009).

Dentre os mediadores inflamatórios envolvidos na rede de eventos

moleculares e celulares, envolvidos na patogênese da AR, o TNF-α tem papel de

destaque (TAYLOR; FELDMANN, 2009). O TNF-α é reconhecido por mediar uma

variedade de funções efetoras relevantes na patogênese da AR, incluindo a ativação

de células endoteliais, indução da produção de citocinas inflamatórias como a IL- 1,

IL-6, IL-8, facilitação dos processos de quimiotaxia de células inflamatórias, ativação

de enzimas matriz metaloproteinases (MMPs), inibição da síntese de proteoglicanos

na cartilagem, regulação da expressão da RANKL e fator estimulador de colônias de

macrófagos (M-CSF), bem como aumento da produção de PGE2, entre outras

funções (BRENNAN; MCINNES, 2008).

As citocinas são naturalmente produzidas no organismo, desde que foi

identificado o TNF-α tem sido exaustivamente estudado por pesquisadores do

mundo todo. Possui papel central na imunidade e inflamação, interferindo em um

amplo espectro de respostas celulares (SUH et al., 2006; PARK; KIM, 2007). Os

efeitos periféricos do TNF-α na sensibilização dos nociceptores (sensibilização

periférica) têm sido documentados. A injeção de TNF-α pela via intra.plantar (i.pl.),

intradérmica, intramuscular, endoneural, provoca hiperalgesia térmica, e alodínia

mecânica, sendo utilizado então como modelo de febre e alodinia (ZHANG et al.,

2011).

O TNF-α é uma citocina de 17KDa que é produzida por diversos tipos de

células, como neutrófilos, linfócitos ativados, macrófagos, células do revestimento

sinovial, células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, queratinócitos

(CARSWELL et al, 1975; ZHANG et al., 1995; WOOLF et al., 1997; KARMAKAR;

43

KAY; GRAVALLESE, 2010). O TNF-α, exerce seus efeitos através da interação com

dois receptores denominados TNFR1 (p-55R) e TNFR2 (p-75R), os quais são

claramente dependentes da ativação de fatores de transcrição e a síntese de novas

proteínas envolvidas na resposta inflamatória (ROCHA et al., 2006; LEUNG;

CAHILL, 2010).

Tendo em vista a grande variedade de mediadores inflamatórios que atuam

nas terminações nervosas sensoriais, existem múltiplas oportunidades para produzir

alterações locais na sensibilidade terminal e, portanto hiperalgesia. Podemos citar

degranulação de mastócitos, ativação de cininogênios, interação simpática pós-

ganglionar, fatores de crescimento dentre outros (WOOLF et al., 2007).

Apesar do mais óbvio sítio de inflamação na AR ser a sinóvia, citocinas como

TNF-α, IL-6 são liberadas de maneira sistêmica na circulação, possuindo múltiplos

efeitos em órgãos distantes (KU et al., 2009), e tem sido descritos como a chave no

desenvolvimento de artropatias inflamatórias (FONSECA et al., 2009).

A indução da artrite por CFA pode acarretar em monoartrite ou poliartrite. A

poliartrite é desenvolvida quando o adjuvante é administrado na superfície

intraplantar, subcutânea, intradérmica, na base da cauda (LABRECQUE; BUREAU;

REINBERG, 1995; RAMPRASATH; SHANTHI; SACHDANANDAM, 2005; SUH et al.,

2006; NEUGEBAUER et al., 2007). A monoartrite, no entanto, é desenvolvida

quando o adjuvante é administrado de forma intra-articular (normalmente na junção

tibiotarsal ou tibiofemoral) (VON BANCHER et al., 2000; BILEVICIUTE-LJUNGAR;

SAXNE; SPETEA, 2006; NEUGEBAUER et al., 2007). Ambas as situações,

monoartrite ou poliartrite induzidas pelo CFA desencadeiam resposta contralateral.

A artrite contralateral, ou a resposta característica da artrite que são a dor e a

inflamação, pode ser vizualizada tanto na artrite reumatóide em humanos, quanto na

artrite induzida por adjuvantes como o CFA em ratos. Em geral mudanças bilaterais

no sistema nervoso após uma patologia unilateral, como a lesão do nervo e

inflamação, não são incomuns, apesar dessas mudanças nem sempre serem

observadas (VON BANCHER et al., 2000).

Tal resposta contralateral exige a administração de concentrações ideais do

agente indutor, para que o estímulo inflamatório seja de grande magnitude. A

precisão topográfica da resposta contralateral fortemente implica em um mecanismo

neurogênico ao invés de um efeito sistêmico. Se a resposta ipsilateral é de origem

inflamatória, a resposta contralateral também será, caso for de origem neurogênica,

44

idem. A resposta contralateral é apenas uma sombra da resposta original tanto

temporalmente quanto em magnitude, conhecida como imagem ou espelho

(SHENKER et al., 2003).

O processo de ativação do nociceptor na articulação acarreta na transmissão

para a medula espinhal, onde os neurônios simpáticos pré-ganglionares na medula

espinhal serão seletivamente ativados. Estes neurônios se projetam através da

medula espinhal para os seus homólogos contralateral, estimulando a liberação de

neuropeptídeos, como a SP, a partir de neurônios sensoriais aferentes, que em

conjunto com a inervação simpática produzem a inflamação no lado oposto. A

transecção no nervo a partir de qualquer membro impede a manifestação de

inflamação e hiperalgesia no membro contralateral. Este processo indica que ambos

sistema nervoso simpático (SNS) e fibras C estão envolvidos neste processo

(LEVINE et al.,1985; BLACK, 2002).

3.5 Como proporcionar o alívio da dor e inflamação

O controle farmacológico da dor e inflamação é baseado principalmente em

duas estratégias. A primeira envolve o uso de fármacos que possam inibir a

sensibilização do nociceptor, impedindo a formação dos primeiros mediadores

envolvidos no processo e, portanto, inibir o desenvolvimento da hiperalgesia. Este é

o principal mecanismo de ação de fármacos como a aspirina, que inibem a COX,

prevenindo a sensibilização dos nociceptores pelas PGs (CURY et al., 2011).

A segunda estratégia envolve o uso de fármacos que agem diretamente no

bloqueio da transmissão da informação nociceptiva, ou deprimindo os centros

cerebrais decodificadores do processo doloroso resultando em analgesia. Este

mecanismo é exercido por fármacos como a morfina, anestésicos locais e gerais,

dipirona, e também por alguns anti-inflamatórios (via ativação de NO-GMPc) (CURI

et al., 2011).

Os recursos terapêuticos atuais costumam ser eficientes no que diz respeito

ao tratamento da dor aguda, pois, é capaz de minimizar o sofrimento do paciente.

Quando a dor aguda se mantém ativa, detecta-se a não efetividade dos

medicamentos e, neste momento, deve-se suspeitar de uma terapia mal

administrada, tendo como consequência o tratamento inadequado e a dor pode se

tornar crônica e persistente (MOORE, 2009).

45

A incidência da dor crônica é estimada em torno de 20-25% em todo o

mundo. Mais de um terço da população mundial sofre de dor persistente ou

recorrente. Poucos pacientes obtêm o alívio completo com os fármacos disponíveis

atualmente, e mais da metade tem tratamento inadequado (STUCKY; GOLD;

ZHANG, 2001; GOLD; GEBHART, 2010). O manejo da dor crônica, ao contrário da

dor aguda, é um problema de saúde pública (GUILLOT et al., 2011). A receita para

um tratamento bem sucedido, dos diversos tipos de dor, é conhecer os mecanismos

que geram a dor, e que a mantém (STUCKY; GOLD; ZHANG, 2001)

Os AINES são um grupo heterogêneo de moléculas com atividade analgésica,

antipirética e anti-inflamatória. Os AINES estão entre os agentes terapêuticos mais

utilizados mundialmente. Além da indicação para várias doenças inflamatórias, estes

fármacos também são aplicados no tratamento da artrite reumatoide (BADAWEY;

EL-ASHMAWEY, 1998; MANIVANNAN; CHATURVEDI, 2008).

O mecanismo de ação destes fármacos é determinado pela inibição não

seletiva da enzima COX (isoformas COX-1 e COX-2), consequentemente levando a

inibição da síntese de PGs. A etapa limitante para a síntese das PGs e tromboxanos

é a conversão do ácido araquidônico em prostaglandina H2, uma reação que é

catalisada pela COX (FERREIRA; MONCADA; VANE, 1973; MAZARIO; HERRERO,

1999).

As COXs são enzimas chave na síntese de prostaglandinas H2, que é

precursora da biossíntese de outras prostaglandinas, tromboxanos e prostaciclinas.

Existem duas principais isoformas da COX ligadas diretamente a processos

dolorosos e inflamatórios: COX-1 e COX-2. A COX-1 é constitutivamente expressa,

atuando em várias funções fisiológicas como: a proteção da mucosa gástrica,

agregação plaquetária e fluxo sanguíneo renal. A COX-2 por sua vez além de ser

constitutiva em alguns órgãos, por exemplo, nos rins, sua expressão e atividade

encontra-se aumentada em condições patológicas como inflamação, dor e

oncogênese, levando a se pensar que a enzima só apareça em tais processos

citados. Pelo fato da COX-2 participar em eventos patológicos, a identificação de

inibidores seletivos dessa enzima é essencial para a terapia de diversas doenças

(RATHISH et al., 2009).

Estudos recentes têm apontado o papel de uma terceira isoforma de COX, a

COX-3. Trata-se na realidade de uma variação da COX-1 que foi encontrada

principalmente em extratos de tecido encefálico de cães. Em humanos, a COX-3 foi

46

encontrada abundantemente em amostras de tecido encefálico e cardíaco.

Entretanto, seus efeitos biológicos e farmacológicos tem sido relacionados até o

momento com o controle da temperatura corporal, sendo a atividade desta enzima

fortemente inibida pelo acetaminofeno (RAINSFORD, 2009).

A PGE2, principal prostanoide formado nesta via, contribui tanto para a

sensibilização periférica de nociceptores quanto senbilização central. A

sensibilização periférica ocorre por meio da ativação de receptores acoplados a

proteína G aumentado os níveis de AMPc dentro dos nociceptores. Os produtos da

COX também estão presentes na medula espinhal onde parece interagir com os

terminais nociceptivos. Desta maneira é possível obter um efeito analgésico, tanto

em sítios centrais, quanto periféricos com o uso de inibidores da COX (JULIUS;

BASBAUM, 2001).

Apesar da sua ampla aplicabilidade clínica, tanto na dor aguda quanto na dor

crônica, o uso terapêutico dos AINES é acompanhado de vários efeitos indesejáveis.

Estes efeitos são relacionados ao uso prolongado do medicamento e colaterais ao

próprio mecanismo de ação, ou seja, a COX-1 é constitutiva e participa de eventos

homeostáticos em vários tecidos, enquanto que a COX-2 induzida, produz potentes

mediadores inflamatórios e nociceptivos responsáveis pela propagação da dor e da

inflamação (PIAZ et al., 2003).

Quando não há inibição enzimática seletiva da COX-2, ocorrem efeitos

colaterais significativos por inibição da COX-1, como: ulcerações gastrintestinais,

nefrotoxicidade e eventos hemorrágicos (BADAWEY; EL-ASHMAWEY, 1998).

Embora a inibição seletiva da COX-2 por alguns coxibes, também tenha apresentado

efeitos colaterias alarmantes, como complicações cardiovasculares (MUKHERJEE;

NISSEN; TOPOL, 2001; GROSSER; FRIES; FITZGERALD, 2006). Ainda assim, os

estudos para a identificação de um inibidor seletivo da COX-2, se fazem presentes

na literatura. HAYASHI et al., (2011), demonstraram obter um composto sintético

com potente atividade anti-inflamatória e antipirética, com ação inibitória seletiva da

COX-2 em modelos experimentais “in vivo”e “in vitro”.

Outra classe de medicamentos para o alívio da dor surgiu há muitos anos. O

ópio e os seus derivados, além de exercerem ponderável influência sobre o

comportamento dos seres humanos, têm sido empregados como sedativo e como

analgésico. A partir do século XIX, com o isolamento dos alcaloides do ópio e as

facilidades para o emprego dessas substâncias por via parenteral, houve aumento

47

do interesse pelo uso criterioso dos opioides na área médica e da análise das

consequências sociais de seu uso abusivo (DUARTE, 2005).

A morfina e os opioides endógenos são agonistas dos receptores µ-opioides

(STUCKY; GOLD; ZHANG, 2001). Estes receptores localizam-se perifericamente,

em sítios pré e pós-sinápticos, no corno dorsal da medula espinhal, tronco cerebral,

tálamo e córtex. Constituindo o sistema ascendente da transmissão da dor, bem

como estruturas que compõem o sistema inibitório descendente, que modula a dor

ao nível de medula espinhal (INTURRISI, 2002). Os opioides são fármacos utilizados

para o tratamento da dor que é refratária a outros analgésicos, em especial a dor

severa (Figura 6) (MOORE, 2009).

Figura 6. Escada analgésica. Escada da Dor da Organização Mundial da Saúde. Alívio da dor oncológica e cuidados paliativos. Genebra: OMS, 1996. (Adaptado de Manubay; Muchow; Sullivan , 2011).

48

O opioide mais comumente utilizado para tratar a dor comum é a codeína,

que é considerado um analgésico fraco. A codeína é eficaz contra a dor leve a

moderada e pode ser combinado com outros AINES (MOORE, 2009).

A eficácia analgésica dos opioides pode variar segundo a característica,

duração de intensidade do estímulo; dosagem e espécie. Os opioides bloqueiam a

transmissão periférica e central da via nociceptiva aferente e por isso, tornam-se

bastante eficientes no tratamento da dor inflamatória aguda. No entanto, eles não

são igualmente eficazes para todo tipo de dor como, por exemplo, a dor neuropática

que possui uma resposta pobre ou de curta duração aos opioides (KLAUMANN;

WOUK; SILLAS, 2008).

Assim como os opióides, os glicocorticóides têm grande aplicação

terapêutica. Porém, possuem potentes efeitos anti-inflamatórios e

imunossupressores, e são utilizados clinicamente para o tratamento de doenças

inflamatórias desde meados de 1900. Sua importância está ligada não só à melhora

da qualidade de vida, como também à sobrevida de pacientes com doenças

reumáticas. Muitos estudos demonstraram excelente resposta anti-inflamatória de

pacientes com AR após o uso de cortisona (XIE et al., 2006; ANTI; GIORGI;

CHAHADE, 2008).

Muitos mecanismos são propostos para ação anti-inflamatória e analgésica

dos glicocorticoides. Tais medicamentos interagem com receptores nucleares e a

princípio, a administração de um glicocorticoide promove a diminuição da expressão

do ácido araquidônico por diversos mecanismos, consequentemente seus

metabólitos (PGs, LT e tromboxanos). Ademais, induzem diminuição da expressão

do NF-κB e citocinas como TNF-α e IL-1β, em contrapartida estimula o aumento de

citocinas anti-inflamatórias como a IL-10 (RHEN; CIDLOWSKI, 2005; XIE et al.,

2006). Os efeitos terapêuticos destes fármacos são na maioria das vezes

acompanhados por efeitos adversos e/ou colaterais importantes e alguns

irreversíveis deixando a terapia com glicocorticoides como uma das últimas opções

de tratamento (XIE et al., 2006; ROMANHOLI; SALGADO, 2007).

Uma alternativa importante para auxiliar a terapia da dor são os adjuvantes,

que envolvem outras classes de medicamentos além dos analgésicos tradicionais,

entre eles estão os antidepressivos, anticonvulsivantes, canabinoides (WALKER;

STRANGMAN; HUANG, 2001), antagonistas de receptores NMDA (WIESENFELD-

HALLIN, 1998; BENNETT, 2000), anestésicos locais, entre outros.

49

Fármacos antidepressivos tricíclicos (TCAs) agem em muitos

neurotransmissores envolvidos na nocicepção. Eles bloqueiam a recaptação de 5-

HT e noradrenalina (NOR), além disso, bloqueiam a hiperalgesia mediada por

receptores tipo NMDA, e bloqueiam canais de sódio, isso justifica em parte, o fato da

propriedade analgésica independente da propriedade antidepressiva (MOULIN et al.,

2007).

Os TCAs são de grande valia para os casos de dor constante, com sensação

de queimadura ou parestesia, embora também tenham papel importante nas dores

neuropáticas. É indicado que seja utilizada a menor dose possível de um TCA, e que

esta dose obviamente seja eficaz, em pacientes com dor neuropática. Este cuidado

é importante em relação aos pacientes idosos, em função das interações

medicamentosas, principalmente outros medicamentos que atuam no SNC e em

paciente com risco de doença cardiovascular. Apesar da presença da depressão

não ser necessária para o efeito analgésico dos TCAs, ela possa ser útil em

pacientes que sofrem de crises depressivas, principalmente na vigência da dor, e

são inadequadamente tratados (DWORKIN et al., 2007; REISNER, 2011).

Outra classe importante que tem sido empregada no tratamento da dor

crônica são os anticonvulsivantes. Logo depois que eles revolucionaram o

tratamento da epilepsia, em 1960, os anticonvulsivantes foram incluídos no manejo

da dor crônica. A Gabapentina (Neurotin) merece destaque por ter melhor perfil de

segurança no uso e maior janela terapêutica. Além da Gabapentina também são

utilizados a Carbamazepina (Tegretol), Fenitoína (preferencialmente na neuralgia

trigeminal) (Hidantal) e Valproato (Depakene) (outras síndromes dolorosas)

(McQUAY et al., 1995; REISNER, 2011).

A gabapentina, e seu análogo Pregabalina, se ligam a canais de cálcio

dependentes de voltagem em neurônios pré-sinápticos no corno dorsal da medula

espinhal, resultando na diminuição da liberação de neurotransmissores excitatórios

como o GLU e SP (MOULIN et al., 2007). Consequentemente, a sua ação no alívio

da dor se dá pela supressão de circuitos hiperativos da medula e do córtex cerebral

e estabilização das descargas neuronais nas membranas das vias aferentes

primárias (LISBOA; TEIXEIRA; MARTINS; 2002).

A principal utilização dos anticonvulsivantes (em associação com

antidepressivos e analgésicos) é em casos de dor neuropática, como neuralgia do

50

trigêmeo, neuralgia pós-herpética e dor associada com compressão medular e

esclerose múltipla (McQUAY et al, 1995).

3.6 Heterociclos: pirazol, pirazolinas e pirazolonas

As Indústrias Farmacêutica e Agroquímica têm demonstrado interesse

consistente nos heterociclos pirazóis e seus análogos devido a sua variedade de

aplicações (MACHADO et al., 2009). Estes compostos heterociclos constituem um

grande grupo de moléculas com atividades farmacológicas diversificadas (MELO et

al., 2006).

Os heterociclos são compostos cíclicos que possuem um ou mais

heteroátomos na sua estrutura. Os heterociclos nitrogenados de cinco membros,

contendo um ou mais átomos de nitrogênio pertencem à classe de substâncias

denominada genericamente de azol sendo que o heterociclo nitrogenado mais

simples deles é o pirrol (1), seguido do pirazol (2), da pirazolina (3) e da pirazolona

(4) (PADMAVATHI et al., 2009).

O pirazol é um heterociclo com dois átomos de nitrogênio, três átomos de

carbono, e duas duplas ligações nas posições 2-3 e 4-5. Já o anel pirazolínico

possui apenas uma dupla ligação entre os carbonos 3-4, enquanto que a 5-

pirazolona além da uma dupla ligação entre os carbonos 3-4 possui uma carbonila

(C=O) na posição 5.

Outros azóis como o imidazol (5), 1,2,3-triazol (6), 1,2,4-triazol (7), tetrazol (8)

e pentazol (9) também apresentam relevantes atividades biológicas já referenciadas

na literatura, como atividade antimicrobiana e citotóxica (PADMAVATHI et al., 2009).

A substituição bioisostérica de um átomo de carbono por outros heteroátomos

constituem outros heterociclos relevantes. O heterociclo que possui a presença do

átomo de enxofre adicionalmente ao átomo de nitrogênio, denomina-se tiazol (10), e

no caso de um átomo de oxigênio adicionalmente ao átomo de nitrogênio,

denomina-se oxazol (11) (MELO et al., 2006).

Fatos importantes na história da medicina estão associados a fármacos

contendo núcleos heterociclos. A descoberta das pirazolonas foi registrada em de

1883, quando o químico alemão Ludwig Knorr, na tentativa de sintetizar derivados

quinolônicos acidentalmente sintetizou a antipirina, uma molécula com atividade

51

antipirética, analgésica e antirreumática (VOLZ; KELLNER, 1980; DE SOUZA et al.,

2001) e desde então, a utilização clínica destes compostos tem sido empregada.

2NH

1

3

5

4

5NH

1

4

N2

3

NH

NHNH

NHO

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

NH

N

NH

N

N

(7) (8) (9) (10) (11)

NH

N

NNH

N

N

N

NNH

N

N

N

N

S

N

O

A dipirona (12) também conhecida como metamizol, ou ácido 1-fenil-2,3-

dimetil-5-pirazolona-4-metilaminometanossulfônico, é um analgésico antipirético não

opioide, que pertence a classe dos AINES. Foram identificados pelo menos 4

metabólitos deste fármaco no plasma humano, após a administração oral em doses

variadas, 4-metilaminoantipirina (13), 4-aminoantipirina (14), 4-acetilaminoantipirina

(15) e 4-fomilaminoantipirina (16) (VOLZ; KELLNER, 1980). Além destes, vários

outros metabólitos já foram identificados (LEVY; ZYLBER-KATZ; ROSENKRANZ,

1995).

NN

OCH3

CH3 N

CH3 SO

O

O-Na

+

NN

OCH3

CH3 NH

CH3

NN

OCH3

CH3 NH2

NN

OCH3

CH3 NHO

CH3

NN

OCH3

CH3 NHO

H

(12) (13) (14)

(15) (16)

52

Seus derivados e/ou análogos são fármacos considerados veteranos na

prática médica, sendo amplamente utilizado com sucesso desde 1922, apesar de a

dipirona ter sido banida em alguns países pelo risco de causar agranulocitose

(LEVY, 2000). Por sua vez, a agranulocitose foi descrita por Schultz em 1922, como

uma doença misteriosa. Alguns anos depois, Madison e Squier (1934), descobriram

que o fenômeno que causava uma diminuição na linhagem granulocítica e por vezes

aplasia medular, era decorrente da hipersensibilidade ao fármaco aminopirina, outro

derivado pirazolônico identificado também como metabólito da dipirona (RUVIDIÉ,

1996).

Além da possibilidade da origem da agranulocitose ser imunomediada, tem

sido investigado um efeito direto da dipirona sobre o granulócito no sangue periférico

e sobre as unidades formadoras de colônia na medula óssea, porém, faltam dados

na literatura sobre a maneira como ocorre a interação do composto com estas

células. A redução maciça da contagem de granulócitos pode ser explicada pela

interação e interferência na diferenciação e maturação de células progenitoras ou

mesmo indução de apoptose nesta linhagem (SABAGGA et al.,1993; GARCIA-

MARTINEZ et al., 2003).

A possibilidade da dipirona induzir discrasias sanguíneas, em especial a

agranulocitose, é um problema que preocupa os médicos e a população, pelo fato

da dipirona ser um medicamento amplamente consumido em nosso país

(DANIELLE; LEAL, 2003). Efeitos adversos não colaterais como a agranulocitose,

aplasia de medula (hemotoxicidade), são comuns a certos fármacos utilizados na

terapêutica (TAKEDA et al., 2002; COLEMAN; KHALAF; NICHOLLS, 2003). Em se

tratando da dipirona, estes efeitos têm chamado a atenção de pesquisadores, para

síntese de novos análogos ou derivados pirazolônicos (MILANO et al., 2008). A

proibição do uso da dipirona tem se estendido a outros continentes além do

europeu. Recentemente, de acordo com o caderno farmacêutico da Organização

Mundial da Saúde (OMS) que relata restrições de uso e disponibilidade de

medicamentos atualizado em 2010, o metamizol foi banido das Filipinas pelo centro

de farmacovigilância. A Fenilbutazona (18), também é um derivado pirazolônico e

possui propriedades farmacológicas antipirética, antiinflamatória e analgésica (GIRI;

MUKHOPADHYAY, 1998)

O conhecimento profundo do mecanismo de ação dos AINES (exemplo de

representante da classe a Indometacina (17)), levou muitos estudiosos a

53

investigarem novas moléculas que fossem capazes de inibir seletivamente a enzima

responsável pelos efeitos na dor e na inflamação, ou seja, um inibidor seletivo de

COX-2. Então Penning et al. (1997), demonstraram em seu estudo a identificação do

1-(4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-H-pirazol-1-il] benzenosulfonamida,

denominado comercialmente como celecoxib (Celebra®) (19), que na época

apresentava-se em estudos de fase clínica III com indicações terapêuticas para a AR

e osteoartrite. Além deste outros inibidores de COX-2 foram descobertos como o

Rofecoxib (VIOXX®) (20), equipotente à Indometacina porém sem efeitos

gastrintestinais (PRASIT et al., 1999), o Valdecoxib (Bextra) (21) (TALLEY et al.,

2000), entre outros.

Mais tarde alguns inibidores seletivos da COX-2 como o Rofecoxib

apresentaram riscos cardiovasculares (MUKHERJEE; NISSEN; TOPOL, 2001),

sendo retirados do mercado (DAVIES; JAMALI, 2004).

NN

CH3

CH3

S OO

NH2

O

O

S

O

OCH3

NN

O

O

CH3

N CH3

OOHOCH3

O

Cl

(17) (18)

(19) (20)

O

N

S

O

OCH3

CH3

(21)

Na perspectiva de melhorar a relação estrutura atividade destes compostos, a

fim reduzir ao máximo os efeitos colaterais e adversos, inclusive sobre o órgão

hematopoiético, modificações estruturais e/ou a síntese de análogos pirazolônicos

54

têm sido amplamente estudadas, principalmente por seus efeitos antinociceptivos

(DE SOUZA et al., 2001; MILANO et al., 2008).

As pirazolinas constituem uma importante classe de compostos sintéticos que

tem sido destaque em muitos modelos farmacológicos, apresentando atividade

antimicrobiana (antifúngica e antibacteriana) (ABUNADA et al., 2009; DAWANE et

al., 2010), atividade antinociceptiva (TABARELLI et al., 2004; KAPLANCIKLI et al.,

2009), antitumoral (HAVRYLYUK et al., 2009), antiamoébica (BUDAKOTI et al.,

2008), antiulcerogênica e anti-inflamatória (SHOMAN et al., 2009). Seu amplo leque

de propriedades farmacológicas, sobretudo seu efeito antinociceptivo, impulsionou a

investigação farmacológica mais aprofundada de compostos inéditos desenvolvidos

na UNIVALI, resultando no presente trabalho.

55

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Obtenção das substâncias avaliadas

Os compostos utilizados neste estudo foram desenvolvidos e sintetizados no

laboratório de síntese orgânica da UNIVALI, por Lorena dos Santos.

4.1.1 Síntese dos derivados 1,3,5-triaril-pirazolínicos

Os derivados 1,3,5-triaril-pirazolínicos, foram sintetizados à partir de 5 mmol

das respectivas 4-cloro-1,3-difenil-2-propen-1-onas, contendo os substituintes de

Topliss (H, 4-CH3, 4-OCH3, 4-Cl e 3,4-Cl2) no anel A, previamente sintetizados a

partir das acetofenonas substituídas e do 4-clorobenzaldeído em meio básico

(NaOH) e etanol. Em seguida foi acrescentada a fenilhidrazina (6,5 mmol) e

carbonato de potássio (5 mmol), conforme descrito por Ghomi-Safael e

colaboradores (2006). A mistura foi submetida a refluxo com tempo reacional

variando de 30-180 minutos. O término da reação foi observado por cromatografia

em camada delgada. A reação foi vertida em água e gelo e o sólido formado foi

filtrado, lavado com água gelada e recristalizado em etanol.

Figura 7. Esquema geral da reação das 1,3,5-triaril-pirazolinas.

O

Cl

R

NHNH2

MeOH/ K2CO3

Cl

N N

R

R = H (58); 4-CH3 (60); 4-Cl (61); 4-OCH3 (62); 3,4-Cl2 (66)

56

4.2 Métodos teóricos para avaliação da estrutura-atividade

4.2.1 Regra dos cinco de Lipinski.

Modelos computacionais têm sido utilizados para estimar a solubilidade e

permeabilidade dos derivados sintetizados, baseando-se em parâmetros físico-

químicos propostos por Lipinski e colaboradores (2001). Esta regra prediz moléculas

com baixa absorção e permeabilidade, quando as mesmas apresentam mais de 5

doadores de ligação hidrogênio, acima de 10 aceptores de ligação hidrogênio, peso

molecular superior a 500 e valores de log P (ClogP) acima de 5 (ou MlogP > 4,15).

Os valores do peso molecular (PM), milog P, aceptores de ligação hidrogênio (N +

O), doadores de ligação hidrogênio (NH + OH), número de ligações rotáveis, área de

superfície polar e o número de violações foram obtidos a partir do programa “Free

molinspiration” disponibilizado on line, através do JME Editor, cortesia de Peter Ertl

da Novartis, disponível no site: http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties.

(SANTOS, 2008).

4.2.1.1 Previsão teórica da Regra dos 5 de Lipinski

Tabela 1. Previsão teórica da solubilidade e permeabilidade das 1,3,5-triaril-2-pirazolinas

segundo a “Regra dos 5” de Lipinsk.

N° n.atom logP PM n.

ONa

n.

OHNHb

n.lig.

rot.c

PSAd n.viol.e

58 24 5,937 332,83 2 0 3 15,602 1

60 25 6,386 346,86 2 0 3 15,602 1

61 25 6,615 367,28 2 0 3 15,602 1

62 26 5,994 362,86 3 0 4 24,836 1

66 26 7,221 401,72 2 0 3 15,602 1

* Método de predição do LogP desenvolvido por Molispiration (milogP 2.2 – Novembro 2005) a Somatório das ligações aceptores e hidrogênio (N e O) b Somatório das lgações doadores de hidrogeno (NH e OH) c Número de ligações rotáveis d Área de superfície polar e Número de violações

57

4.2.2. Método de Topliss

A síntese desta série de compostos foi direcionada pelos substituintes

indicados segundo a metodologia manual de Topliss, que preconiza a variação em

um dos anéis aromáticos pelos substituintes: H, 4-CH3, 4-OCH3, 4-Cl e 3,4-Cl2. Esta

série de cinco derivados compreende uma seleção inicial para o direcionamento de

novos análogos. A ordem de potência avaliada nos modelos biológicos é organizada

na Tabela 2, a fim de determinar qual o parâmetro responsável pela atividade em

estudo. Neste modelo são avaliados os parâmetros lipofílicos (π), eletrônicos (σ) e

estéricos (Es) e uma combinação estatística dos parâmetros π e σ (π – σ, π - 2 σ, π

- 3 σ, π + σ, etc). Após a avaliação deste método pode-se estabelecer os próximos

análogos em uma tabela subsequente (TOPLISS, 1972) (não demonstrada).

Tabela 2: Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por Topliss.

Substituintes Parâmetros físico-químicos de Topliss

π 2π– π 2 σσσσ π + σσσσ 2π - σσσσ π - σσσσ π - 2σσσσ π - 3σσσσ Es

3,4-Cl2 1 1-2 1 1 1 1-2 3-4 5 2-5

4-Cl 2 1-2 2 2 2-+3 3 3-4 3-4 2-5

4-CH3 3 3 4 3 2-3 1-2 1 1 2-5

4-OCH3 4-5 4-5 5 5 4 4 2 2 2-5

H 4-5 4-5 3 4 5 5 5 3-4 1

58

4.3 Animais

Foram utilizados camundongos Swiss Websters (20 a 35g) ambos os sexos, e

ratos Wistar machos (250 a 350g), aclimatizados a temperatura de 22 ± 2 °C com

ciclo claro/escuro de 12 horas, mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados

com água e ração ad libitum. Os animais permaneceram no ambiente do teste por

aproximadamente 30 minutos antes da realização dos experimentos para

adaptação.

O número de animais utilizados por tratamento durante os experimentos foi

entre 6-8 por grupo. Os diferentes grupos foram pré-tratados com os compostos em

estudo em diferentes doses 30 minutos antes do teste pela via i.p.

Comparativamente foi realizado um grupo controle negativo/veículo para cada

experimento, no qual os animais receberam apenas solução veículo nas mesmas

condições dos ensaios e um grupo controle positivo/fármaco referência. Após todos

os experimentos os animais foram eutanasiados em câmara de CO2.

Este estudo seguiu as recomendações do Guia de Uso e Cuidado com

Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH) dos EUA (NIH n° 85-23,

revisado em 1996). O Comitê de ética e pesquisa para uso de animais da UNIVALI

aprovou os procedimentos experimentais (parecer número 532/09).

4.4 Reagentes

Os reagentes utilizados nos experimentos foram: os compostos derivados

pirazolínicos (Laboratório de síntese – UNIVALI), solução salina (NaCl 0,9%) , ácido

acético, 0,6%, ʎ-carragenina, SP, PGE2, BK, CFA, LPS (Todos Sigma Aldrich

Chemical Company, St Louis, MO, E.U.A.) Indometacina (Indo), Dexametasona

(Dex), Dipirona (Dip), Fenilbutazona (Fenil), Tween 80, Kits comerciais Labtest® para

a dosagem de uréia, creatinina, e Kits comerciais Labtest® para a determinação das

enzimas aspartato amino transferase (AST) e alanina amino transferase (ALT).

59

4.5 Ensaios Farmacológicos

4.5.1 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor aguda.

4.5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%

Este modelo foi utilizado para verificação da atividade antinociceptiva dos

compostos em estudo. Após o tratamento com os compostos C58, C61, C62 e C66

pela via i.p. nas doses 0,3 1 3 e/ou 10 mg/kg, esperou-se 30 minutos (i.p.), e

procedeu-se a injeção do ácido acético 0,6% (10 mL/Kg). Além dos compostos em

estudo, foi utilizado um grupo controle negativo/veículo, e um grupo controle positivo

tratado com Indometacina (10 mg/kg). Os animais foram colocados individualmente

em funis de vidro, e o número de contorções abdominais foi quantificado

cumulativamente durante um período de 20 minutos (FERREIRA et.al., 2000).

4.5.2 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor persistente.

4.5.2.1 Hiperalgesia mecânica induzida pela ʎ-Carragenina

A indução da hiperalgesia inflamatória em camundongos foi realizada através

de injeção i.pl. de 50 µL de ʎ-carragenina (300 µg /sítio) na superfície plantar da pata

direita traseira. Esta dose é capaz de produzir edema, hiperalgesia e aumento

significativo do tamanho da pata injetada, porém os animais continuam

apresentando comportamento normal. Os animais foram pré-tratados com os

compostos C58, C60, C61, C62 e C66 pela via i.p. nas doses 0,3 1 e 3 mg/kg, 30

min antes da indução da hiperalgesia. Após os 30 minutos, os animais receberam

uma injeção i.pl. de ʎ-carragenina (300 µg/pata), e foram avaliados quanto a

hiperalgesia mecânica através do monofilamento de Von Frey 0,6g (VFH, Stoelting,

Chicago, USA), em diferentes tempos. Além dos derivados pirazolínicos, foi

realizado um grupo controle negativo tratado com o veículo utilizado para a diluição

dos compostos, e um grupo controle positivo tratado com Indometacina (10 mg/kg)

(DE CAMPOS et al., 1996; QUINTÃO et al., 2005), e dipirona 40 mg/kg.

60

4.5.2.2 Avaliação da hiperalgesia mecânica pelo monofilamento de Von frey

Para avaliar a hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes

flogísticos, os animais foram individualmente colocados em compartimentos de

acrílico transparente (9 X 7 X 11cm), localizados em uma plataforma de arame

elevada para permitir o acesso à superfície ventral das patas traseiras. Os animais

foram aclimatizados por pelo menos 30 minutos antes da avaliação comportamental.

A frequência de resposta de retirada da pata, foi obtida através de 10 aplicações

(com duração de 1 segundo cada) do VFH 0,6g. Os estímulos foram realizados na

superfície plantar da pata traseira direita. Todos os grupos em estudo foram

submetidos a avaliação prévia e novamente re-avaliados em diferentes tempos de

acordo com cada protocolo experimental específico para cada agente indutor de

hiperalgesia utilizado.

4.5.2.3 Hiperalgesia mecânica induzida por outros agentes flogísticos

Os animais foram previamente tratados pela via i.p. com o derivado

pirazolínico C61 nas doses 0,3 1 e 3 mg/kg, antes da indução da hiperalgesia. Após

30 minutos do tratamento, os animais receberam uma injeção i.pl. do agente

flogístico e os tempos de leitura foram: PGE2 (0,1 nmol/pata), 1, 2, 4 e 6 h,

(MANJAVACHI et al., 2010) LPS (100 ng/pata),0,5, 1, 2, 4, 6, 24 e 48 h

(SANTODOMINGO-GARZÓN et al., 2006), BK (100 ng/pata), 1, 3 e 6 h,

(HAYASHI et al., 2001) ou CFA (20µL/pata), 1, 3, 4, 6, 24 e 48 h, (MANJAVACHI et

al., 2010, QUINTÃO et al., 2005). Os aimais foram avaliados quanto a hiperalgesia

mecânica através do VFH 0,6g, conforme descrito anteriormente, em diferentes

tempos, de acordo com cada protocolo experimental.

4.5.3 Análise da Propriedade Antiedematogênica

4.5.3.1 Edema de pata induzido pela ʎ-Carragenina

A metodologia utilizada para a indução do edema de pata foi similar aquela

descrita por de Campos et al., (1996) com algumas adaptações. Para a realização

do experimento, os animais foram ligeiramente anestesiados com éter, antes da

61

injeção intraplantar de 50µL de solução salina contendo Cg (Cg, 300 µg/pata) na

pata direita e 50µL de solução salina (0,9%) na pata esquerda. Os diversos

derivados pirazolínicos C58, C60, C61, C62 e C66 foram administrados pela via i.p.

nas doses 0,3, 1 e 3 mg/kg, antes da indução do edema. A variação do volume da

pata foi expressa em µL, sendo que a diferença entre o volume da pata direita e

esquerda foi tomada como índice de edema. O edema de pata foi medido em

Pletismometro Ugo Basile®, nos intervalos de tempo de 0,5, 1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas

após a injeção i. pl. de Cg. Para controle positivo neste experimento foi utilizada

Indometacina 10 mg/Kg (ERDEMOGLU et al., 2009).

4.5.3.2 Edema de pata induzido por outros agentes flogísticos

Os animais foram previamente tratados pela via i.p. com o derivado pirazolínico

C61 nas doses 0,3, 1 e 3 mg/kg, antes da indução do edema. Os seguintes agentes

flogísticos foram realizados, e as medidas do edema foram: SP 30 nmol/pata), leitura

realizada em 30, 60, 90, 120, 150 e 180 min, HIS 100 µg/pata, leitura realizada em

15, 30, 45, 60 e 120 min, PGE2, 3 nmol/pata, leitura realizada em 15, 30, 60 e 120

min,e BK, 3 nmo/pata, leitura realizada em 10, 20, 30, 60 e 120 min (CORREA;

CALIXTO, 1993). A variação do volume da pata foi expressa em µL, sendo que a

diferença entre o volume da pata direita e esquerda foi tomada como índice de

edema. O edema de pata foi medido em Pletismometro Ugo Basile®, em diferentes

intervalos de tempo.

4.5.4 Modelo de artrite induzida pelo CFA

4.5.4.1 Indução da Artrite induzida por CFA

Para a indução de artrite foram utilizados ratos machos Wistar (300-350 g). Os

animais foram divididos em grupos e tratados com o derivado pirazolínico C61 nas

doses 0,03, 0,1, 0,3, e 1mg/Kg i.p., controle negativo/veículo utilizado para a diluição

dos compostos i.p., controle positivo/fármacos referência: Dex (0,5 mg/kg, s.c.), Fenil

(80 mg/Kg v.o.) (PEDERNERA et al., 2006), Dip (40 mg/kg, i.p.) e Indo (5 mg/Kg, i.p.)

(BABU; PANDIKUMAR; IGNACIMUTHU, 2009). Após 30 min dos tratamentos pela

via i.p., 1h v.o. e 4h s.c., os animais foram anestesiados com éter e receberam uma

62

injeção intraplantar única de 100 µL de CFA na pata direita. Os mesmos tratamentos

foram repetidos por 22 dias consecutivos, a partir do primeiro dia de indução da

artrite (NEWBOLD, 1963; NAIR; SINGH; GUPTA, 2011).

4.5.4.2 Indíce de severidade de desenvolvimento da Artrite induzida por CFA

Os animais foram avaliados macroscopicamente quanto a severidade de

desenvolvimento da artrite. A metodologia utilizada para obter a pontução foi a

mesma descrita por DONALDSON; McQUEEN; SECKL, 1995. Os índices para a

pontuação foram: Índice zero = pata normal. Índice 1 = Leve vermelhidão. Índice 2 =

Vermelhidão moderada e inchaço. Índice 3 = Inchaço grave e lesões visíveis sobre

as articulações. Baseado em outros autores foi avaliada a necessidade de

acrescentar mais um ponto no sistema de índices em função da gravidade de

instalação da artrite. Índice 4 = Inchaço grave, lesões e excesso de rigidez articular

(PAN et al., 2009) e deformidade do membro (andar arrastado) (LIU et al., 2008).

Os animais foram observados diariamente quanto a evolução da instalação do

processo inflamatório induzido pelo CFA, porém os índices foram quantificados nos

dias 3, 9, 15 e 21 após a injeção i.pl de CFA. Além disso, como medida clínica foi

incluído a determinação do peso corporal dos animais (PAN et al., 2009).

4.5.4.3 Avaliação do edema no modelo de Artrite induzido por CFA

Para a avaliação dos edemas decorrentes da indução de artrite pelo CFA, as

patas direita e esquerda dos animais foram medidas em Pletismometro Ugo Basile® a

cada 3 dias, após a indução, durante 21 dias (KIM et al., 2002; NAIR; SINGH;

GUPTA, 2011). A variação do volume da pata foi expressa em µL, sendo que a

diferença entre o volume da pata direita e esquerda foi utilizada como índice de

edema.

4.5.4.4 Avaliação da hiperalgesia mecânica pelo Von Frey eletrônico no modelo

de Artrite induzido por CFA

Para avaliar a nocicepção mecânica no modelo de artrite induzida pelo CFA, os

animais foram colocados individualmente em compartimentos de acrílico

63

transparentes (17 x 13 x 22 cm, para ratos), localizados em uma plataforma de

arame elevada para permitir o acesso à superfície ventral das patas traseiras. Os

animais foram aclimatados por pelo menos 1 hora antes dos testes

comportamentais, em temperatura controlada, para determinar o limiar mecânico

basal. Após determinar esse parâmetro, os animais foram tratados com derivado

pirazolínico C61 e controles (como especificado no item 4.5.3.1).

A hiperalgesia mecânica dos animais foi avaliada através de um anestesiômetro

eletrônico Von Frey eletrônico, Insight® (VHF), que consiste em um transdutor de

pressão conectado a um contador digital de força expressa em gramas (g). O

contato do transdutor de pressão à pata dos animais foi realizado por meio de uma

ponteira descartável de polipropileno com 0,5 mm de diâmetro adaptada ao

transdutor de pressão. Entre as malhas da rede de arame, foi exercida uma pressão

linear crescente no centro da planta da pata do rato até que o animal produzisse

uma resposta caracterizada como sacudida (“flinch”) da pata estimulada.

Os estímulos foram repetidos até o animal apresentasse três medidas similares

com uma clara resposta de “flinch”. A intensidade de hiperalgesia foi quantificada

como a variação na pressão obtida subtraindo-se a média de três valores expressos

em gramas (força) observada antes do procedimento experimental (limiar basal dos

animais) da média de três valores em gramas (força) após a administração do

agente flogístico em diferentes intervalos de tempo (de acordo com o protocolo

experimental dos diferentes agentes flogísticos) (CUNHA et al., 2004; VIVANCOS et

al., 2004; QUINTÃO et al., 2005)

4.5.5. Determinação dos possíveis efeitos tóxicos no modelo de Artrite

induzido por CFA

Com o objetivo de avaliar o efeito cumulativo das doses do composto em

estudo, foram avaliados os possíveis efeitos tóxicos sobre o sistema hematopoiético,

sobre a função renal e sobre a função hepática. Os resultados obtidos foram

comparados com os efeitos da Indometacina, Dexametasona, Dipirona,

Fenilbutazona.

No 22° dia de tratamento as patas dos animais foram fotografadas. Em seguida

os animais foram eutanasiados, para posterior coleta de sangue com anticoagulante

EDTA para as análises hematológicas, e soro para análises e bioquímicas. Em

64

seguida, foi realizada a extração do fêmur para a coleta das células da medula óssea,

e retirada dos órgãos: fígado e baço, servindo também como indicador de toxicidade.

O peso corporal foi determinado no início e no final do experimento (PEDERNERA et

al., 2006).

4.5.5.1 Avaliação do número de células do sangue periférico no modelo de

Artrite induzido por CFA

Para a avaliação de parâmetros hematológicos em sangue periférico após a

administração crônica do derivado pirazolônico C61 e controles, as amostras de

sangue foram coletas em tubos contendo anticogulante EDTA para a realização do

hemograma completo. O hemograma foi realizado em aparelho automatizado Micros

60 fornecendo parâmetros de eritrócitos (RBC x 106/µL), leucócitos (WBC x 103/µL),

hemoglobina (HGB g/dL), hematócrito (HTO %) e plaquetas (PLT x 103/µL).

(SAUZEM et al., 2009).

4.5.5.2 Avaliação do número total de células nucleadas da medula óssea no

modelo de Artrite induzido por CFA

Para a retirada das células da medula óssea, o fêmur de cada animal foi

extraído e cortado nas suas extremidade distais (epífises), e o seu canal interno foi

lavado com 3 mL de salina. Uma alíquota da suspenção celular obtida foi diluída em

salina e as suas células coradas com cristal violeta (0,5% em 30% de ácido acético)

para realizar a contagem das células na câmara de Neubauer com auxílio de

microscópio óptico comum em aumento de 400x (Figura 8).

Figura 8. Procedimento de coleta da medula óssea dos ratos utilizados no modelo de artrite induzida pelo CFA (Fonte: Fotografia por Silvia Aparecida Ramos).

65

4.5.5.3 Avaliação da função hepática

Para avaliar os possíveis efeitos tóxicos sobre a função hepática após a

administração crônica do derivado pirazolínico C61 e dos controles positivos, foi

realizada a determinação da atividade das enzimas ALT e AST, sendo indicativos de

lesão hepática. As amostras de sangue dos animais foram coletadas em tubo gel,

separador de células, para a dosagem da atividade das enzimas ALT e AST. Após

20 min do procedimento de coleta, as amostras foram centrifugadas e

acondicionadas em freezer -20°, para posterior análise. A determinação da atividade

das respectivas enzimas foi realizada seguindo o protocolo experimental descrito na

bula do kit, especificado pelo fabricante LABTEST®. A determinação

espectrofotométrica foi realizada em aparelho semi automatizado STARDUST.

4.5.5.5 Avaliação da função renal

Para avaliar os possíveis efeitos tóxicos sobre a função renal após a

administração crônica do derivado pirazolínico C61 e dos controles positivos, foram

avaliados os parâmetros uréia e creatinina. Amostras de sangue dos animais foram

coletadas em tubo gel separador de células para a dosagem da concentração de

uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL). Após aproximadamente 30 min do procedimento

de coleta, as amostras foram centrifugadas e acondicionadas em freezer -20°, para

posterior análise. A determinação da concentração dos analitos foi realizada

seguindo o protocolo experimental descrito na bula do kit, especificado pelo

fabricante LABTEST®. A determinação espectrofotométrica foi realizada em aparelho

semi automatizado STARDUST.

4.5.6 Investigação de possíveis efeitos adversos e/ou colaterais

4.5.6.1 Avaliação da atividade motora através do Modelo do Campo Aberto

(Open-Field) em camundongos

O modelo de campo aberto visa investigar a possível influência dos

compostos sobre o SNC do animal, especificamente efeitos depressores, ansiolíticos

ou ansiogênicos. Na prática experimental é utilizado para avaliar estimulantes ou

66

depressores do SNC (DE SOUZA et al., 2003). Para verificar a possibilidade do C61

ter ação sobre o sistema locomotor dos animais, realizou-se o teste do campo

aberto. O campo aberto consiste em um aparato de acrílico transparente, com 60 cm

de diâmetro e borda de 50 cm de altura, com a parte inferior dividida em 12

quadrantes de área igual. Os animais foram avaliados individualmente durante 6

minutos, sendo o número de cruzamentos realizados com as quatro patas entre as

divisões, o parâmetro de análise. Para a realização do experimento, os animais

foram inicialmente pré-tratados via i.p. nas mesmas doses utilizadas nos ensaios e

morfina (5 mg/kg ou 13,3 µmol/kg, s.c).

4.5.6.2 Medida da temperatura retal em camundongos

A redução da temperatura retal é um dos efeitos indesejáveis observados em

muitos fármacos que são utilizados para o tratamento de processos dolorosos

crônicos (ZIMMERMANN, 2001) com o objetivo de verificar se o C61 produzia tal

efeito os animais foram tratados via i.p. nas doses utilizadas nos demais modelos

experimentais e a temperatura retal foi medida 1 hora após o tratamento, utilizando

um termômetro digital (B & D – NJ, EUA). A sonda (2 mm de diâmetro) foi

mergulhada em vaselina antes da inserção. O termômetro foi mantido no reto do

animal até a obtenção de leitura (20 segundos).

4.6 Análise Estatística

Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média

(EPM, 95%), exceto os valores DI50 (doses da droga que produziram uma inibição da

resposta em 50% em relação ao grupo controle), que são apresentadas como a

média geométrica acompanhada de seus respectivos limites de confiança, em nível

de 95%. As porcentagens de inibição foram citadas como a média ± erro padrão da

média da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas (AUC) obtidas

para cada experimento individual em relação ao grupo controle correspondente. Em

alguns experimentos foram calculadas IM (porcentagem de inibição máxima do

efeito para a dose utilizada). A análise estatística dos dados foi realizada por meio

de análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, de

análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Dunett. Valores de p

67

menores que 0,05 (p<0,05) foram considerados como valores significantes. Todas

as análises citadas acima foram realizadas utilizando o programa Graphpad PRISM

5.0® ou Graphpad Instat®.

68

5 RESULTADOS

5.1 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a nocicepção induzida pelo ácido

acético 0,6% em camundongos

Neste modelo foi avaliado o efeito dos compostos C58, C61, C62 e C66,

sobre a nocicepção aguda induzida por ácido acético. Os resultados em conjunto,

apresentados na Figura 9, demonstram que a administração i.p. dos derivados

pirazolínicos em estudo, foi capaz de produzir efeito antinociceptivo significativo nas

diferentes doses utilizadas.

Pode-se observar que C58, nas doses de 0,3 a 10 mg/Kg, reduziu de maneira

significativa o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. A

porcentagem de inibição máxima (IM) para a dose de 10 mg/kg deste composto foi

de 69 ± 4%. A Indometacina utilizada como controle positivo, na mesma dose,

apresentou resposta similar, com porcentagem de inibição de 67 ± 2%.

A administração i.p. do C61 nos animais apresentou uma expressiva redução

da resposta nociceptiva induzida pelo ácido acético, de forma dose dependente.

Com IM calculadas de 32 ± 4%, 60 ± 3%, 72 ± 3% para as doses 0,3, 1 e 3 mg/Kg

respectivamente, e DI50 de 1,12 (0,93 – 1,34) mg/Kg. Vale ressaltar que o C61 na

dose de 3 mg/Kg produziu efeito antinociceptivo similar ao fármaco de referência

utilizado como controle positivo, Indometacina, que apresentou IM de 75 ± 2%.

O número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético também foi

significativamente reduzido pelo C62. Obteve-se valores de IM de 60± 2% e 63 ± 2%

nas doses de 3 e 10 mg/Kg, respectivamnete, e DI50 de 2,04 (1,22 – 3,38) mg/Kg. A

Indometacina apresentou IM de 70 ± 3% na dose de 10 mg/Kg, neste caso o

composto C62 não apesentou melhores resultados quando compara-se ao fármaco

de referência, a Indometacina.

Assim como os demais compostos analisados, o C66 mostrou-se efetivo ao

inibir as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, apresentando IM de 37

± 4% e 67 ± 4% nas doses de 3 e 10 mg/Kg. A DI50 calculada no experimento foi de

5,96 (5,57 – 6,49 mg/Kg). A dose de 10 mg/Kg do C66, apresentou porcentagem de

inibição próximo ao da Indometacina que foi de 71 ± 2%.

69

Figura 9. Efeito das 1,3,5-triaril-pirazolinas sobre a contorção abdominal induzida pela administração i.p. de ácido acético 0,6% em camundongos. (A) Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58). (B) Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61). (C) Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C62). (D) Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C66). Os animais receberam os tratamento nas diferentes doses (0,3 à 10 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg i.p.) ou veículo. O efeito antinociceptivo foi avaliado pelo número de contorções abdominais 20 minutos após a injeção de ácido acético 0,6%. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de uma via seguida pelo post hoc Dunnett.

Nú

mer

o d

e C

on

torç

ões

Ab

do

min

ais

C Ind 0,3 1 3 100

10

20

30

40

50

60

70

C58 (mg/Kg, i.p.)

****** ***

***

*

A

C Ind 0,3 1 30

10

20

30

40

50

60

70

80

C61 (mg/Kg, i.p.)

DI50 = 1,12 (0,93 - 1,34) mg/Kg

***

***

******

Nú

mer

o d

e C

on

torç

ões

Ab

do

min

ais

B

Nú

mer

o d

e C

on

torç

ões

Ab

do

min

ais

C Ind 1 3 100

10

20

30

40

50

60

70

C62 (mg/Kg, i.p.)

***

***

*** ***

DI50 = 2,04 (1,22 - 3,38 mg/Kg)

C

Nú

mer

o d

e C

on

torç

ões

Ab

do

min

ais

C Ind 0,3 1 3 100

10

20

30

40

50

60

70

C66 (mg/Kg, i.p.)

******

**

DI50 = 5,96 (5,57 - 6,49) mg/Kg

D

70

5.2 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre o edema de pata induzido pela ʎ-

carragenina em camundongos

Neste modelo foi avaliado o efeito dos compostos C58, C60, C61, C62 e C66,

sobre o edema de pata induzido pela ʎ-carragenina. Na Figura 10 (A e B), pode-se

observar que o pré-tratamento i.p. com ocomposto C58 reduziu significativamente o

edema de pata induzido pela ʎ-carragenina, destacando-se a dose de 3mg/Kg,

exibindo melhor efeito antiedematogênico na 1° e 2°h após a indução do edema,

com inibição de 30 ± 4%. As demais doses utilizadas foram praticamente

equipotentes. Entretanto, o efeito antiedematogênico foi inferior ao fármaco de

referência Indometacina (68 ± 6%), utilizado na dose de 10 mg/Kg (ZHANG et al.,

2009b).

Figura 10. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre o edema de pata induzido pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C58 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de ʎ-carragenina (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 4-6 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Carragenina (300µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C58 (0,3 mg/Kg, i.p.)C58 (1 mg/Kg, i.p.)C58 (3 mg/Kg, i.p)

******

****

*** *** *

0.5 1 2 4 6 24 48

***************

Tempo (horas)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

Cg Indo 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

700

C58 (mg/Kg, i.p.)

***

*******

AU

C

A B

71

A administração i.p. do composto C60, em todas as doses utilizadas, foi

capaz de inibir significativamente o edema de pata induzido por ʎ-carragenina,

conforme demonstram os resultados obtidos e expressos na Figura 11 (A e B). Os

efeitos foram observados desde o início da formação do edema, destacando as

doses de 1 e 3 mg/Kg, que apresentaram inibição de 45 ± 4% e 47 ± 3%,

respectivamente, tal efeito foi inferior ao observado com a Indometacina 10 mg/Kg

que apresentou inibição de 58 ± 2%.

Figura 11. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C60), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C60 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de ʎ-carragenina (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C60 (0,3 mg/Kg, i.p.)C60 (1 mg/Kg, i.p.)C60 (3 mg/Kg, i.p.)

*** *** *** *** *** ***** *** **

******* *** *** ***

******

*** *******

******0,5 1 2 4 6 24 48

Tempo (horas)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

Cg Indo 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

C60 (mg/Kg, i.p.)

***

***

*** ***AU

C

A B

72

O mesmo perfil farmacológico foi observado no pré-tratamento com o

composto C61, apresentando também uma atividade antiedematogênica

significativa, Figura 12 (A e B), evidenciada desde o início da formação do edema.

Os percentuais de inibição obtidos foram muito similares ao composto descrito

anteriormente (C60), sendo que a dose de 1 mg/Kg apresentou um percentual de

inibição de 43 ± 2% e a dose de 3 mg/Kg de 48 ± 2%. Ambas as doses

apresentaram-se menos efetivas que a Indometacina 53 ± 4%.

Figura 12. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de ʎ-carragenina (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1 mg/kg, i.p.)C61 (3 mg/Kg, i.p.)

*** *********

*** *****

*** *** ***

****

********* ***

*** ******

*

0.5 1 2 4 6 24 48

******

******

***

***

Tempo (horas)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

Cg Indo 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

C61 (mg/Kg, i.p.)

***

****** ***

AU

C

A B

73

Na Figura 13 (A e B), é possível observar que o pré-tratamento dos animais

com o composto C62 foi capaz de reduzir significativamente o edema induzido pela

ʎ-carragenina, apenas na dose de 1 mg/Kg, as demais doses não produziram efeito

antiedematogênico significativo. Tal efeito passou a ser observado a partir da 4a h,

após a indução do edema e persistiu até a 24h, sendo que a IM para a dose de 1

mg/Kg foi de 22 ± 6%.

Figura 13. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C62), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C62 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de ʎ-carragenina (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C62 (0,3 mg/Kg, i.p)C62 (1 mg/Kg, i.p.)C62 (3 mg/Kg, i.p.)

** ** ******

****

**

**

**

0.5 1 2 4 6 24 48Tempo (horas)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

Cg Indo 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

C62 (mg/Kg, i.p.)

***

**

AU

C

A B

74

A última molécula testada neste modelo foi a pirazolina C66. Decorridos 30

minutos após a indução do edema, pode-se observar grande semelhança no perfil

de atividade quando comparado com o composto C62. O composto C66 apresentou

melhor atividade antiedematogênica na dose de 1mg/Kg com uma IM de 29 ± 7%,

Figura 14 (A e B). Este efeito pode ser observado desde a 1ª até a 4ª h, após a

indução do edema.

Figura 14. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C66), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C66 (nas doses de 0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de Cg (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva, seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C66 (0,3 mg/Kg, i.p.)C66 (1 mg/Kg, i.p.)C66 (3 mg/Kg, i.p.)

*** ****** *** ***

***

* ** **

*

0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 24 48Tempo (horas)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

Cg Indo 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

700

C66 (mg/Kg i.p.)

***

**

AU

C

A B

75

5.3 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a hiperalgesia mecânica induzida

pela ʎ-carragenina em camundongos

Na figura 15 (A e B) são demonstradosos resultados obtidos após a

administração i.p. do composto C58, no modelo de hiperalgesia mecânica induzida

pela ʎ-carragenina. Pode-se observar que o C58 não foi capaz de inibir de maneira

significativa a hiperalgesia mecânica nos animais, quando comparado com o grupo

controle negativo. Pode-se observar inibição significativa apenas no controle positivo

utilizado, Indometacina, com inibição de 86 ± 8%. O gráfico B (Figura15), apresenta

a AUC com porcentagens de inibição de 15 ± 6% e 15 ± 8% nas doses de 0,3 e 1

mg/Kg, respectivamente.

Figura 15. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento do C58 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎ-carragenina (300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)C58 (0,3 mg/Kg i.p.)C58 (1 mg/Kg i.p.)C58 (3 mg/Kg i.p.)A

*** ********* ***

**

****** ** *****

1 3 4 6B 24 48Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

Basal Cg Ind Dip 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

C58 (mg/Kg, i.p.)

***

B

***AU

C

76

Na Figura 16 (A e B) é possível observar que o tratamento i.p com o

composto C60 nas doses 0,3, 1 e 3 mg/Kg foi capaz de inibir significativamente a

sensibilidade mecânica induzida pela ʎ-carragenina, de forma dose-dependente.

Vale ressaltar que as doses de 1 e 3 mg/Kg foram mais efetivas a partir da terceira

até a sexta hora de avaliação. As IMs obtidas foram de 49 ± 6% para a dose de 1

mg/Kg e 64 ± 5% para a dose de 3 mg/Kg, e DI50 calculada de 2,52 (2,35 - 2,70)

mg/Kg. A dose de 3 mg/Kg do C60 apresentou IM ligeiramente maior, em relação ao

controle positivo dipirona 40 mg/kg, o qual foi obtida IM 62 ± 5%. No entanto,

compararmos o efeito inibitório desta dose do composto C60 com o outro controle

positivo utilizado, a Indometacina na dose de 10 mg/Kg apresentou IM de 72 ± 9%,

maior do que o C60.

Figura 16. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C60), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos.Os animais receberam o pré-tratamento do C60 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎ-carragenina(300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)

Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)C60 (0,3 mg/Kg, i.p.)C60 (1 mg/Kg, i.p.)C60 (3 mg/Kg, i.p.)A

*** ***********

****** ***

******

*** *********

*

1 3 4 6B 24 48

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


100

200

300

400

500

C60 (mg/kg, i.p.)

*

***

B

******

***

AU

C

77

Os resultados apresentados na Figura 17 (A e B), demonstram que o

tratamento pela via i.p. com o composto C61, inibiu significativamente a hiperalgesia

mecânica induzida pela ʎ-carragenina. Observa-se que o efeito do tratamento com o

composto nas doses de 1 e 3 mg/Kg perdurou das 3 até 48h. As IMs calculadas para

estas doses foram respectivamente, de 67 ± 6% e 71 ± 10%. Pode-se observar que

os resultados obtidos para este composto foram similares aos obtidos com os

controles positivos Indometacina 76 ± 7% e Dipirona 64 ± 5%.

Figura 17. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento do C61 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎ-carragenina (300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

20

40

60

80

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg)

Dipirona (40 mg/Kg)

C61 (0,3 mg/Kg i.p.)C61 (1 mg/Kg i.p.)C61 (3 mg/Kg i.p.)A

******

******

*******

****** *

**

*

******

******* ***

******

***

**1 3 4 6B 24 48

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e R

esp

ost

a (%

)


100

200

300

400

500

C61 (mg/kg, i.p.)

***

B

*** *** ***

AU

C

78

Em relação ao composto C62, obteve-se uma melhor resposta

antihiperalgésia na dose intermediária de 1 mg/Kg com IM de 47 ± 11%, já a dose de

3 mg/Kg apresentou IM de 35 ± 12% (Figura 18 A e B). Neste experimento os

controles positivos utilizados demonstraram IM 81 ± 5% Indometacina e 64 ± 6%

Dipirona.

Figura 18. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C62), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento do C62 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎ-carragenina (300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

O último composto testado neste modelo foi o C66, os resultados

apresentados na Figura 19 (A e B), demonstram uma discreta atividade anti-

hiperalgésica, porém significativa na dose de 0,3 mg/Kg com uma IM de 24 ± 2%.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)

Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)C62 (0,3 mg/Kg, i.p.)C62 (1 mg/Kg, i.p.)C62 (3 mg/Kg, i.p.)A

* *****

****** * ***

******

** *** ****

1 3 4 6B 24 48

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


100

200

300

400

500

C62 (mg/kg, i.p.)

***

***

*

B

***

AU

C

79

Figura 19. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C66), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento do C66 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎ-carragenina (300 µg/pata. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

De forma geral, embora todos os compostos analisados tenham apresentado

atividade antiedematogênica significativa, nenhum deles foi tão efetivo quanto a

indometacina utilizada nos experimentos como controle positivo. Os compostos C60

e C61 tiveram IMs equiparáveis a Indometacina na dose de 3 mg/Kg, porem não

superior.

Ao avaliar os resultados obtidos nos modelos de nocicepção induzida pelo

ácido acético e hiperalgesia induzida pela ʎ-carragenina, pode-se observar que as

pirazolinas C60 e C61, destacaram-se nestes modelos, demonstrando maiores

atividades antinociceptivas e antihiperalgésicas.

A Tabela 3 fornece um panorama geral dos resultados obtidos nestes testes

preliminares. A partir de então, optou-se dar continuidade aos ensaios

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Carragenina (300 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)C66 (0,3 mg/Kg, i.p.)C66 (1 mg/Kg, i.p.)C66 (3 mg/Kg, i.p.)A

*** *********

*** *****

******

*** ***

1 3 4 6B 24 48

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)


100

200

300

400

500

C66 (mg/kg, i.p.)

*

***

B

*

AU

C

80

farmacológicos apenas com o composto C61, uma pirazolina que apresentou

maiores percentuais de inibição no modelo de dor induzida pelo ácido acético e no

modelo de hiperalgesia mecânica induzida pela ʎ-carragenina. Os resultados obtidos

no modelo de edema de pata induzido pela ʎ-carragenina não evidenciou uma

melhor molécula ou o grupo substituinte de melhor ação.

Tabela 3: Resultados das DI50 e % de inibição dos derivados pirazolínicos.

Pirazolinas Ácido Acético DI50 DI50

% de inibição

3 (mg/Kg) 10 (mg/Kg) mg/Kg µmol

C58 (H) 58 ± 2% 70 ± 5% - -

C60 (4-CH3) 58 ± 2%* 96 ± 2%* 2,57 (2,10 – 3,15) 7,40 (6,04 – 9,09)

C61 (4-Cl) 72 ± 3% 92 ± 2%* 1,12 (0,93 – 1,34) 3,05 (2,53 – 3,65)

C62 (4-OCH3) 61 ± 2% 63 ± 2% 2,04 (1,22 – 3,38) 5,62 (3,36 – 9,31)

C66 (3,4-Cl2) 37 ± 4% 67 ± 4% 5,96 (5,57 – 6,49) 14,84 (13,86–16,15)

Pirazolinas Hiperalgesia (Cg) DI50 DI50

% de inibição

1mg/Kg 3mg/Kg mg/Kg µmol

C58 (H) 16 ± 8% 5 ± 3% - -

C60 (4-CH3) 49 ± 6% 64 ± 5% 2,52 (2,35 - 2,70) 7,27 (6,77 – 7,78)

C61 (4-Cl) 67 ± 6% 71 ± 10% - -

C62 (4-OCH3) 47 ± 11% 35 ± 12% - -

C66 (3,4-Cl2) 12 ± 6% 24 ± 2% - -

Pirazolinas Edema de Pata (Cg) DI50 DI50

% de inibição

1mg/Kg 3mg/Kg mg/Kg µmol

C58 (H) 22 ± 4% 30 ± 4% - -

C60 (4-CH3) 45 ± 4% 47 ± 3% - -

C61 (4-Cl) 43 ± 2% 48 ± 2% - -

C62 (4-OCH3) 23 ± 6% 13 ± 3% - -

C66 (3,4-Cl2) 29 ± 7% 6 ± 3% - -

*Valores obtidos a partir de estudos preliminares, DOS SANTOS, 2008.

81

5.4 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre

o edema de pata induzido por diferentes agentes flogísticos em camundongos

Diante da melhor atividade do C61 nos modelos utilizados nos ensaios

preliminares, foi dado continuidade a uma investigação farmacológica mais

específica utilizando outros agentes indutores de processos inflamatórios e/ou

doloroso, com a finalidade de direcionar um possível mecanismo de ação desta

molécula. A princípio o agente flogístico utilizado para investigar um possível

mecanismo de ação do C61, foi a BK. A Figura 20 (A e B) apresenta os resultados

obtidos com o pré-tratamento com C61 após a indução do edema de pata induzida

pela BK, onde foi possível observar que todas as doses avaliadas mostraram

significativo efeito antiedematogênico, porém de maneira não dose-dependente.

Neste experimento ficou evidenciada a maior atividade do composto na dose de 1

mg/kg, que apresentou IM de 50 ± 2%, mais efetiva que o fármaco referência,

Indometacina, que apresentou IM de 46 ± 4%.

Figura 20. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o edema de pata induzido pela administração i.pl. de BK em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento com C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de BK (3 nmol/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

B K (3 nmol/pata)Indometacina (10 mg/K g, i.p .)C 61 (0,3 mg/K g, i.p .)C 61 (1 mg/K g, i.p .)C 61 (3 mg/K g, i.p .)

10 30 60 12020

***

****

Tempo (minutos)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

C Ind 0,3 1 30

10

20

30

40

50

60

*****

C 61 (mg/K g, i.p.)

B radicinina (3 nmol/pata)

***

**

AU

C

A B

82

Os resultados obtidos no modelo de edema de pata induzido pela HIS são

demonstrados na figura 21 (A e B). Pode-se observar que o composto C61 provocou

uma redução significativa (P< 0,01) do edema induzido pela HIS, no entanto, a

menor dose 0,3 mg/Kg, foi a que apresentou melhor percentual de inibição 30 ± 4%,

com melhor atividade nos tempos de 45 e 60 minutos após a indução do edema.

Este resultado pode ser comparado com a Indometacina, que apresentou inibição de

31 ± 4%.

Figura 21. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o edema de pata induzido pela administração i.pl. de HIS em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de histamina (HIS – 100 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P < 0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

O pré-tratamento sistêmico via i.p. com o C61, foi capaz de reduzir de

maneira significativa e dose dependente a formação do edema induzido pela PGE2,

observado na figura 22 (A e B). Com inibições calculadas de 27 ± 2%, 35 ± 4%, 40 ±

4% para as respectivas doses, 0,3, 1 e 3 mg/Kg. A atividade da pirazolina ocorreu

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Histamina (100 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1 mg/kg, i.p.)C61 (3 mg/Kg, i.p.)

***

***

*

*

***

***

**

*

*****

******

*

15 30 45 60 120

Tempo (minutos)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

C Ind 0,3 1 30

100

200

300

400

C61 (mg/Kg)

*** *****

Histamina (100 µµµµg/pata)

***

AU

C

A B

83

desde o início da avaliação da formação do edema, extendendo-se até os 60

minutos após indução. Nenhuma das doses testadas, apresentou inibição maior do

que a da Indometacina que foi de 53,3 ± 2%.

Figura 22. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o edema de pata induzido pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de PGE2 (3 nmol/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

Conforme demonstrado na Figura 23 (A e B), o efeito antiedematogênico do

C61, é observado logo após a injeção i.pl. da SP. Neste caso, observou-se maior

inibição com a maior dose utilizada, 3 mg/Kg, nos tempos de leitura de 30 e de 90

minutos após a injeção i.pl. de SP, com IM de 28 ± 6%. A inibição calculada para o

controle positivo utilizado, Indometacina foi de 45 ± 5%.

0

10

20

30

40

50

60

70

******

******

**

***

***

***

**

**

A

15 30 60 120

PGE2 (100 ng/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1 mg/kg, i.p.)C61 (3 mg/Kg, i.p.)

Tempo (Minutos)

∆∆ ∆∆ V

olu

me

de p

ata

( µµ µµL

)

PGE2 Ind 0,3 1 30

50

100

150

C61 (mg/Kg)

PGE2 (3 nmol/pata)

***

*** *** ***

B

AU

C

84

Figura 23. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o edema de pata induzido pela administração i.pl. de SP em camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de SP (30 nmol/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

5.5 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre

a hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes flogísticos em

camundongos

A fim de avaliar um possível mecanismo de ação do C61 frente a sua

atividade anti-hiperalgésica, outros agentes flogísticos foram utilizados. A avaliação

da resposta anti-hiperalgésica induzida pela injeção i.pl. de BK também foi avaliada

após o pré-tratamento via i.p. com o C61. Foi observado que apenas as doses de 1

e 3 mg/Kg, apresentaram inibições significativas da freqüência de resposta induzida

pela BK, ilustrado na Figura 24 (A e B). As IM para este modelo foram de 64 ± 5% e

61 ± 4%, respectivamente.

0

20

40

60

***

**

****

*

*

A

30 60 90 120 150 180

Substância P (30 nmol/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1 mg/kg, i.p.)C61 (3 mg/Kg, i.p.)

Tempo (minutos)

∆∆ ∆∆ V

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

SP Ind 0,3 1 30

50

100

150

200

C61 (mg/Kg)

Substancia P (30 nmol/pata)

**** **

B

AU

C

85

Figura 24. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de BK em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de BK (500 ng/pata) na pata direita. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

Os resultados da hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 podem ser

visualizados na Figura 25 (A e B). Pode-se observar que o C61 foi capaz de reduzir

de forma acentuada a sensibilidade mecânica nas doses de 1 e 3 mg/Kg,com

inibições calculadas de 61 ± 11% e de 73 ± 9%, respectivamente. O efeito anti-

hiperalgésico do composto pode ser observado até a 4h, após a indução do edema

pela injeção i.pl. de PGE2. O controle positivo utilizado neste experimento foi a

morfina, que apresentou inibição de 94 ± 5%.

0 1 3 60

20

40

60

80

*

****** ********

Bradicinina (500 ng/pata)C61 (0,3 m/Kg, i.p.)C61 (1 m/Kg, i.p.)C61 (3 m/Kg, i.p.)A

Horas

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

S 0,3 1 30

100

200

300

400

****

C61 (mg/Kg, i.p.)

IDose 3 mg/kg = 61 ±±±± 4 %

IDose 1 mg/kg = 64 ±±±± 5 %

IDose 0,3 mg/kg = 20 ±±±± 8 %

B

AU

C

86

Figura 25. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Morfina (5 mg/Kg, s.c.), ou veículo. Após 30 minutos os animais receberam injeção i.pl. de PGE2 (100 ng/pata) na pata direita. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, *p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

A Figura 26 (A e B), apresenta os efeitos do pré-tratamento sistêmico dos animais

com o C61, sobre a hiperalgesia mecânica induzida pelo LPS. Também foi possível

observar nesse experimento a capacidade do composto em reduzir a sensibilidade

mecânica induzida pela administração i.pl. de LPS, tendo como IM 58 ± 5%, 36 ±

10% e 40 ± 9% para as doses de 0,3, 1 e 3 mg/Kg, respectivamente.Vale ressaltar

neste experimento, que a menor dose utilizada 0,3 mg/Kg, demonstrou efetividade

maior quando comparada com a Indometacina, na dose de 10 mg/Kg, que

apresentou inibição de 54 ± 4%.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

PGE2 (100 ng/pata)Morfina (5 mg/kg, s.c.)

C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1 mg/Kg i.p.)C61 (3 mg/Kg i.p.)

****** ******* ** ***** *** ***

A

B 1 2 4 6

Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e R

esp

ost

a (%

)

Basal PGE2 Morf 0,3 1 30

100

200

300

400

C61 (mg/kg, i.p.)

***

B

*****

AU

C

87

Figura 26. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de LPS em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata) na pata direita. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva, seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

A Figura 27 (A e B) apresenta o efeito do composto C61 frente à hiperalgesia

mecânica induzida pela administração i.pl. de CFA. Como se pode observar, houve

uma redução expressiva da sensibilidade mecânica nas doses de 0,3 e 3 mg/Kg,

com uma IM de 67 ± 10% e 84 ± 6%, respectivamente. Ambas as doses mostraram

ser efetivas desde o início do experimento, perdurando o efeito até as 48h após a

indução da hiperalgesia. Além disso, pode-se também observar que o efeito do

controle positivo Indometacina, fármaco de referência, foi menor do que a dose de 3

mg/Kg do referido composto.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

LPS (100 ng/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1 mg/Kg i.p.)C61 (3 mg/Kg i.p.)A

***

***

**

****

*** *****

**

0.5 1 2 4 6 24 48Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

Basal LPS Ind 0,3 1 30

100

200

300

400

500

C61 (mg/kg, i.p.)

***

B

****

***

AU

C

88

Figura 27. Efeita do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de CFA em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de CFA (20 µg/pata) na pata direita. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A) e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva, seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

5.6 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre

o edema e hiperalgesia mecânica no modelo de artrite induzida pelo Adjuvante

Completo de Freund (CFA)

A figura 28 (A e B) demonstra o efeito do C61 sobre a severidade de

instalação e desenvolvimento da artrite, nos animais que tiveram a pata direita

injetada com CFA. Pode-se observar que o C61 foi capaz de reduzir

significativamente as características do processo inflamatório induzidas pelo CFA.

Como o índice de severidade de artrite é uma medida subjetiva, o desenvolvimento

do edema também foi avaliado em pletismômetro para comparar ação entre os

grupos, pois fornece uma medição física e objetiva na medida de inflamação (PAN et

al.,2009).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CFA (20 µµµµg/pata)Indometacina (10 mg/Kg)

C61 (0,3 mg/Kg i.p.)

C61 (1 mg/kg, i.p.)C61 (3 mg/Kg, i.p.)A

*** ******

***

****

*********

*

**

*

***

**********

***

***

******

**

1 3 4 6B 24 48Tempo (h)

Fre

qü

ênci

a d

e re

spo

sta

(%)

Basal CFA Ind 0,3 1 30

100

200

300

400

500

600

C61 (mg/kg, i.p.)

***

B

*** ***AU

C

89

Figura 28. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o desenvolvimento da artrite (severidade) após a administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em ratos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,03 - 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.), Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.), Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.), e veículo. O índice de severidade foi determinado a cada três dias. Cada grupo representa a media de 4-6 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A) e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

Pode-se observar na Figura 29 as fotografias das patas dos animais

submetidos ao modelo de artrite induzida pelo CFA no 22° dia após a indução.

Houve aparentemente uma melhora dos animais que receberam os tratamentos com

o C61 em todas as doses utilizadas, bem como os fármacos utilizados como controle

positivo.

0

1

2

3

4

5

3 9 15 21Tempo ( dias após indução)

CFA (100 µµµµL/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)C61 (0,03 mg/Kg, i.p.)C61 (0,1 mg/Kg, i.p.)C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1,0 mg/Kg, i.p.)

Índ

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Sev

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de

Art

rite

CFA Ind Dip Dex Fen 0,03 0,1 0,3 10

20

40

60

80

C61 (mg/Kg, i.p.)

**************

***

******

AU

C

90

Figura 29. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o desenvolvimento da artrite após a administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em ratos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,03 - 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.), Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.), Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.) e veículo.

A variação do volume da pata no modelo de artrite induzida pelo CFA, foi

avaliada em pletismômetro. Pode-se observar que a atividade do C61 foi um pouco

inferior a alguns fármacos de referência utilizados (Figura 30). Mas, mesmo assim, o

composto promoveu uma diminuição significativa do edema induzido pelo CFA. As

porcentagens de inibição foram bem próximas entre as doses, destacando a dose

maior de 1mg/Kg, a qual promoveu o maior percentual de inibição com 37 ± 4%.

91

Figura 30. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o edema de pata induzido pela administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em ratos.Os animais receberam o tratamento de C61 (0,03 - 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), Dipirona (40mg/Kg, i.p.), Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.), Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.) e veículo. O efeito antiedematogênico foi avaliado a cada 3 dias em pletismometro. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A) e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

Na Figura 31 (A, B, C e D) pode-se observar o efeito farmacológico

decorrente da administração do composto C61, no modelo de artrite induzido pelo

CFA. Na Figura 31 (A e B) observa-se que houve com o tratamento, importante

redução da intensidade de hiperalgesia mecânica induzida pelo CFA, e a melhor

resposta frente ao processo doloroso artrítico foi obtida com a Fenilbutazona® (80

mg/Kg, v.o.) seguida da Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c). Quanto ao efeito do

composto C61, o mesmo apresentou uma resposta muito similar à Indometacina (10

mg/Kg, i.p.), ou seja, a dose de 0,1 mg/Kg apresentou um percentual de inibição de

46 ± 8% enquanto a Indometacina apresentou um percentual de 46 ± 7%. Ainda, é

importante destacar que o pré-tratamento na dose de 0,3 mg/Kg foi a que obteve o

maior percentual de inibição, com 52 ± 8% de redução da sensibilização mecânica

induzido pelo CFA.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 3 6 9 12 15 18 21

CFA (100 µµµµL/pata)Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)

Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)

C61 (0,03 mg/Kg, i.p.)C61 (0,1 mg/Kg, i.p.)C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)C61 (1,0 mg/Kg, i.p.)

Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)

Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)

A

Tempo (dias após indução)

∆∆ ∆∆ d

o v

olu

me

da

pat

a ( µµ µµ

L)

CFA Dex Fenil Ind Dip 0,03 0,1 0,3 10

5000

10000

15000

20000

25000

C61 (mg/Kg, i.p.)

***

***

***

***

***

*****

B

AU

C

92

Figura 31. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a intensidade de hiperalgesia induzida pela administração i.pl de CFA (100 µL/pata) em ratos, ipsilateral (A e B) e contralateral (C e D). Os animais receberam o tratamento de C61 (0,03 - 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.), Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.), Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.) e veículo. O efeito anti-hiperalgésico foi avaliado a cada 3 dias por Von Frey eletrônico. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A) e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

CFA (100 µµµµL/pata)Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)


1 3 6 9 12 15 18 21

Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)

A

Tempo (dias)

Inte

nsi

dad

e d

e h

iper

alge

sia

( ∆∆ ∆∆ d

a re

tira

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da

pat

a, g

)


500

1000

1500

******

*** *** ****

***

C61 (mg/Kg, i.p.)

BA

UC

0

10

20

30

40

50

CFA (100 µµµµL/pata)Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)


1 3 6 9 12 15 18 21

Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)

C

Tempo (dias)

Inte

nsi

dad

e d

e hi

per

alge

sia

( ∆∆ ∆∆ d

a re

tira

da

da

pat

a, g

)


20

40

60

80

100

120

140

160

C61 (mg/Kg, i.p.)

D

AU

C

93


as células sanguíneas no tratamento crônico de artrite induzida pelo Adjuvant

Completo de Freund (CFA)

Pode-se observar através da Figura 32 (A, B, D e F) que o tratamento crônico

com o composto C61 no modelo de artrite induzido pelo CFA, de maneira geral, não

apresentou diferenças significativas nos parâmetros hematológicos avaliados,

quando foram comparados com o grupo de animais não induzidos e que receberam

somente salina (valor basal de referência).

Foi realizada a contagem global de leucócitos, eritrócitos, plaquetas, e

contagem global de células nucleadas da medula óssea, além da dosagem de

hemoglobina e hematócrito. O número de Leucócitos do sangue periférico

apresentou alterações significativas nos grupos CFA (8,66 ± 0,80), Ind (9,45 ± 0,45),

Dex (12,30 ± 1,20), Fen (9,40 ± 0,86), e também na dose de 1mg/Kg do C61 (8,04 ±

0,88).

De acordo com os dados obtidos, não há evidência de sinais de

hematotoxicidade do composto, frente aos parâmetros hematológicos avaliados ao

final de 22 dias de tratamento, nas diferentes doses.

94

Figura 32. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre as células sanguíneas. (A) Efeito dos compostos sobre os Leucócitos (B) Efeito dos compostos sobre os Eritrócitos, (C) Efeito dos compostos sobre a concentração de Hemoglobina, (D) Efeito dos compostos sobre o Hematócrito, (E) Efeito dos compostos sobre as Plaquetas, (F) Efeito dos compostos sobre a contagem de células nucleadas na Medula Óssea. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, *p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via para seguidos de post hoc Dunnet.

S CFA Ind Dip Dex Fenil 0,03 0,1 0,3 10.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

C61 (mg/Kg)

** **

***

***

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m³


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C61 (mg/Kg)

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m³


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12.5

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17.5

C61 (mg/Kg)

C*

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L)

S CFA Ind Dip Dex Fenil 0,03 0,1 0,3 10

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25

30

35

40

45

C61 (mg/Kg)

D

Hem

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crit

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%)

S CFA Ind Dip Dex Fenil 0,03 0,1 0,3 10

100

200

300

400

500

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700

800

900

C61 (mg/Kg)

E

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qu

etas

x 1

0³/m

m³

S CFA Ind Dip Fenil Dex 0,03 0,1 0,3 10

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500F*

C61 (mg/Kg)

M.O

. (C

élul

as x

10³

/mL)

95


a função hepática, renal, peso corpóreo e peso de órgão após tratamento

crônico no modelo de artrite induzida pelo Adjuvant Completo de Freund (CFA)

A Tabela 4 apresenta os efeitos do tratamento crônico do C61 via i.p. no

modelo de artrite induzido pelo CFA. Ao final de 22 dias de tratamento com o

composto, os marcadores de função renal, uréia e creatinina, de uma maneira geral

apresentaram-se sem alterações significativas. Em relação à função renal, somente

o grupo de animais que receberam o tratamento com Indometacina demonstrou um

aumento significativo da creatinina (0,88 ± 0,23). Os valores de uréia não

demonstraram alterações significativas quando foram comparados com o grupo

salina. Os resultados da avaliação da função hepática também estão apresentados

na Tabela 4. Observa-se também, que o tratamento do composto em estudo, não

alterou de maneira significativa a da atividade das enzimas AST e ALT, em todas as

doses utilizadas do C61.

Tabela 4: Efeito das doses do C61 sobre a função renal e hepática

Função Renal Função Hepática

Grupos (mg/Kg)

Uréia (mg/dL)

Creatinina (mg/dL)

AST (U/L)

ALT (U/L)

Controle Salina 43,3 ± 2,0 0,42 ± 0,02 83,0 ± 6,4 35,2 ± 5,3

CFA 51,9 ± 1,6 0,54 ± 0,06 113,7 ± 7,9 53,5 ± 3,7*

Ind (10 mg/Kg, i.p.) 45,9 ± 5,2 0,88 ± 0,23** 126,3 ± 12,1** 26,7 ± 5,1

Dip (40 m/Kg, i.p.) 45,0 ± 5,8 0,49 ± 0,13 107,6 ± 6,8 32,8 ± 2,6

Dex (0,5 mg/Kg, s.c.) 49,5 ± 3,3 0,41 ± 0,09 108,7 ± 16,3 44,0 ± 3,8

Fen (80 mg/Kg, v.o.) 52,9 ± 1,9 0,36 ± 0,05 98,5 ± 4,9 72,2 ± 5,1 ***

C61(0,03mg/Kg, i.p.) 52,1 ± 2,1 0,64 ± 0,04 69,3 ± 4,7 36,2 ± 1,4

C61 (0,1 mg/Kg, i.p.) 48,5 ± 1,9 0,42 ± 0,08 66,5 ± 4,7 49,4 ± 8,8

C61 (0,3 mg/Kg, i.p.) 46,1 ± 2,3 0,43 ± 0,04 62,2 ± 1,3 39,0 ± 3,3

C61 (1 mg/Kg, i.p.) 40,5 ± 1,4 0,53 ± 0,12 53,5 ± 1,6 40,5 ± 2,7

Os valores representam a média de ± erro padrão de 6-8 animais.

96

Outro parâmetro avaliado neste estudo como indicativo de sinais de possível

efeito tóxico, foi a variação do peso corpóreo no período de desenvolvimento da

artrite, bem como o peso do fígado e do baço. Na Figura 33 observa-se uma

redução significativa no peso corpóreo dos animais tratados com Dexametasona

P>0,001. Nos outros tratamentos não houve variação no peso corporal dos animais

no período experimental de 22 dias. Os animais tratados com Fenilbutazona, com as

doses de 0,1 e 1 mg/Kg do C61, apresentaram aumento de peso significativo, em

relação ao controle negativo que recebeu somente veículo para a diluição dos

compostos.

Em relação ao peso dos órgãos pode-se observar também na Figura 33, que

o grupo tratado com a Indometacina apresentou diferença estatística no peso do

baço (1,63 ± 0,29). E os animais que foram tratados com Dexametasona (11,1 ±

0,44) e a maior dose do C61 (11,4 ± 0,28), apresentaram diminuição significativa no

peso do fígado.

Figura 33. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o peso dos órgãos e peso corporal. (A) Peso do baço, (B) Peso do fígado, (C) Peso corporal (peso final – peso inicial). Cada grupo representa a media de 4-6 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, *p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via para seguidos de post hoc Dunnet.

CFA Ind Dip Dex Fen 0,03 0,1 0,3 10.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

***

C 61 (mg/K g, i.p.)

A

Baç

o -

Pes

o (

g)

CFA Ind Dip Dex Fen 0,03 0,1 0,3 10

5

10

15

20

*** **

C61 (mg/Kg, i.p.)

B

Fíg

ado

- P

eso

(g

)

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

CFA (100 µµµµ L/pata)Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)D ipirona (40 mg/Kg, i.p.)Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)Fenilbutaz ona (80 mg/K g, v.o .)C61 (0,03 mg/Kg, i.p.)C61 (0,1 mg/Kg, i.p .)C61 (0,3 mg/Kg, i.p .)C61 (1 mg/kg , i.p.)

***

* *

C

*

∆∆ ∆∆ d

o P

eso

Co

rpo

ral

(g)

97


a deambulação em camundongos normais.

Para avaliar a atividade motora dos animais após a administração i.p. do

composto C61, utilizou-se o teste de campo aberto. Pode-se observar que o pré-

tratamento com o C61, nas diferentes doses utilizadas, não alterou de maneira

significativa a movimentação, em relação ao grupo controle negativo, que foi tratado

com salina. (Figura 34).

Figura 34. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a atividade motora em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 (nas doses de 1 - 3 e 10 mg/Kg, i.p.), Morfina (5 mg/Kg, s.c.). O efeito motor o número de cruzamentos realizados pelo animal. Cada grupo representa a média de 6 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguidos de post hoc Dunnet.

C M 1 3 100

50

100

150

200

250

300

C61 (mg/Kg, i.p.)

**

Nú

mer

o d

e C

ruza

men

tos

98


a temperatura corporal em camundongos normais.

Para avaliar possíveis efeitos colaterais do composto, foi verificada a

temperatura corporal, após o tratamento i.p. com o C61, a temperatura retal dos

animais foi verificada. Pode-se observar na Figura 35, que o pré-tratamento i.p. dos

animais com o C61 nas diferentes doses utilizadas na pesquisa não provocou

variação significativa na temperatura corporal.

Figura 35. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a temperatura corporal em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 nas doses de (0,03 - 0,1 - 0,3 - 1 - 3 e 10 mg/kg i.p.). A temperatura retal foi verificada após 30 minutos da injeção i.p. dos compostos. Cada grupo representa a média de 6 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via, seguidos de post hoc Dunnet.

C0,

03 0,1

0,3 1 3 10

0

10

20

30

40

C61 (mg/Kg, i.p.)

Tem

per

atu

ra r

etal

(°° °°C

)

99

6 DISCUSSÃO

A modificação molecular, a partir de uma estrutura protótipo, é o método mais

promissor na introdução de novos fármacos na terapêutica (WERMUTH, 2003). Um

substituinte pode produzir modificações que atinja várias propriedades físico-

químicas da molécula, tais como hidrofobicidade, densidade eletrônica, conformação

estrutural e propriedades farmacocinéticas, entre outras, cuja análise poderá orientar

as sínteses seguintes (BARREIRO, 2007).

Em uma tese de doutorado, realizado por Santos (2008), foram sintetizados e

avaliados no modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%

uma série de 10 derivados pirazolínicos, os quais apresentaram relevante atividade

antinociceptiva na dose de 10 mg/kg. Das moléculas testadas apenas duas

apresentaram IM abaixo de 75% para a dose utilizada de 10mg/Kg, a melhor IM dos

compostos foi de 96,19 ± 1,5% da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-

1H-pirazolina, identificada como C60. Neste estudo apenas o composto mais ativo,

C60, foi avaliado em diferentes doses no modelo de contorção abdominal induzida

pelo ácido acético. Este composto chamou atenção devido a sua atividade biológica,

sendo cerca de 17 vezes mais ativo que o ácido acetilsalicílico (AAS) e o

acetaminofeno (ACE) e 22 vezes mais ativo que a Dipirona.

Outro ponto relevante desta série de compostos é sua estrutura pirazolínica,

uma vez que a Dipirona, fármaco do tipo AINE, aqui comparado, possui uma

estrutura pirazolônica e o Celecoxib fármaco seletivo para a COX-2 possui uma

estrutura pirazolínica. Desta forma, por similaridade, a estrutura dos compostos em

estudo, poderiam se acomodar de forma semelhante ao sítio receptor da COX, na

acomodação dos anéis aromáticos nos sítios lipofílicos. E, por possuir um anel a

mais na sua estrutura, em comparação ao Celecoxib, poderia promover uma

interação adicional contribuindo assim na sua atividade biológica (ABDEL-AZIZ;

ELTAHIR; ASIRI, 2011).

Estudos realizados em instituições de pesquisa e Indústrias Farmacêuticas,

nas últimas décadas, confirmam a grande importância da lipofilia e da determinação

do coeficiente de partição (log P), para o planejamento e a busca racional de

fármacos (LIPINSKI et al., 2004). Cabe ressaltar, que mesmo empregando-se os

métodos mais simples e clássicos da química medicinal na otimização de estratégias

100

de síntese, é possível contribuir no desenvolvimento dos estudos quantitativos da

relação estrutura-atividade (LUO et al., 2010).

No presente estudo, foi realizada previamente uma análise teórica proposta

por Lipinski et al., (2001), no intuito de determinar um perfil de absorção e

permeabilidade dos cinco derivados pirazolínicos. As propriedades físico – químicas

determinadas através da teoria de Lipinski (PM, milog P, aceptores de ligação

hidrogênio (N + O), doadores de ligação hidrogênio (NH + OH), número de ligações

rotáveis, área de superfície polar) são tipicamente usadas na construção de modelos

preditivos de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e também toxicidade

(ADMET), formando assim a base para o que tem sido chamado de desenvolvimento

baseado nas propriedades físico-químicas (EKINS; MESTRES; TESTA, 2007).

Segundo os resultados observados em nossos estudos, todos os derivados da

série violaram o parâmetro de log P adequado (log P < 5,0), fato que diminui a

probabilidade de absorção e permeabilidade deses derivados quando administrados

via oral (LIPINSKI et al., 2001). Para Lipinski até uma violação é permitida, e a

violação de um parâmetro não invalida o estudo destas moléculas, uma vez que este

método avalia a biodisponibilidade por via oral, considerando apenas um dos vários

meios pelos quais os fármacos podem se distribuir através de barreiras

membranosas, no caso aqui o transporte passivo (LIPINSKI et al., 2001).

A partir destes resultados e considerando a atividade farmacológica

observada para o composto C60, administrado por via intraperitoneal obtida nos

estudos prévios conduzidos por Santos (2008), todos os demais ensaios foram

direcionados inicialmente por esta via.

Para uma melhor avaliação deste composto, estudos adicionais foram

realizados juntamente com outros quatro análogos desta série (C58, C61, C62 e

C66), os quais foram escolhidos de forma racional segundo os substituintes

propostos no modelo manual de Topliss. A avaliação da relação estrutura-atividade,

utilizando o método de Topliss (1977), prediz que a atividade biológica é dependente

de alguns efeitos hidrofóbicos (π), eletrônicos (σ) ou estereos (Es) dos substituintes

aromáticos (BUZZI; CECHINEL FILHO; CORRÊA, 2010).

Estes compostos foram então avaliados inicialmente no modelo de contorções

abdominais induzidas pelo ácido acético e no modelo de hiperalgesia mecânica e

edema de pata induzidos pela ʎ-carragenina, a fim de selecionarmos a molécula

101

mais promissora e identificarmos, se algum destes parâmetros estaria relacionado

com a atividade antinociceptiva e antiedematogênica desta série de compostos.

No modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, a resposta

nociceptiva dos animais é caracterizada pela torção do tronco e extensão dos

membros posteriores (writhing), atribuídas à resposta reflexa, devido à irritação

peritoneal produzida pela injeção do agente irritante (COLLIER et al., 1968). Em

1964, Whittle descreveu a atuação indireta do ácido acético na liberação de

mediadores endógenos envolvidos na modulação da nocicepção, incluindo a BK, 5-

HT, HIS e as PGs.

De acordo com Ribeiro et al., (2000), a resposta nociceptiva neste modelo é

modulada a partir da liberação de citocinas como TNF-α, IL-1β e IL8 por macrófagos

e mastócitos residentes na cavidade abdominal, que em conjunto com outros

mediadores (como os acima indicados) induzem nocicepção característica (RIBEIRO

et al., 2000). Embora este seja considerado um modelo simples de nocicepção, e

pouco específico, a contorção abdominal induzida pelo ácido acético nos permite

avaliar a atividade antinociceptiva de várias moléculas do tipo AINEs, opioides e

outras substâncias de ação central (GALLANTINE; MEERT, 2004; MALEKI-DIZAJI;

FATHIAZAD; GARJANI, 2007). O tipo de dor avaliado através desse modelo é

inflamatória, decorrente de inflamação aguda, uma vez que o ácido acético provoca

indução da permeabilidade capilar e liberação do ácido araquidônico via biossíntese

de PGs (GULESHA et al., 2011).

Vários compostos, de origem natural ou sintética tem sido constantemente

avaliados através desse modelo. A atividade antinociceptiva da 1-

[(benzoxazol/benzimidazol-2-il)tioacetil] pirazolina (22) foi dessa forma testada por

Kaplancikli et al., (2009), o qual demonstrou atividade antinociceptiva importante.

NN

O

S

NH

XR3

R2

R1

R4

X= O, NH

R1=H, OCH3

R2=H, CH3

R3=H, CH3

R4=H, Cl(22)

102

Recentemente, Joshi et al., (2010), compararam a atividade antinociceptiva

de uma série de 3,2-(4,5-dihidro-5-(4-morfilinofenil)-1H-pirazol-3-il)fenol e N-

fenilpirazol-1-carbotioamida (23) com o Diclofenaco, por meio desse modelo. Os

autores demonstraram que a série de pirazolinas inéditas, apresentaram atividade

antinociceptiva equivalente ao fármaco referência testado. Além disso, foi

evidenciado melhor atividade nas estruturas que tiveram halogênios substituídos no

anel aromático. Joshi et al., (2010), associaram os efeitos das pirazolinas ao fato de

haver substituição por halogênios no anel aromático. Este dado corrobora com a

efetividade do C61 no modelo do ácido acético. O composto possui um átomo de Cl

substituinte no anel aromático com orientação para em relação ao anel pirazolínico.

N N

N O

SNH

OH

R1

R2

R3

(23)

Átomos de halogênio são capazes de produzir variados tipos de interações.

Diretamente eles podem estar implicados em interações hidrofóbicas ou polares e

indiretamente, eles são capazes de mudar a polaridade de determinados átomos ou

sistemas conjugados. A substituição por um átomo de cloro aumenta a atividade de

um derivado não substituído. Isso pode ser interpretado pela existência de um

espaço vazio correspondente ao volume de um átomo de cloro. Além disso, a

introdução do átomo de cloro pode aumentar a afinidade de ligação por estabelecer

interações adicionais de Van der Waals com uma proteína receptora. Outras razões

podem ser devido a alterações no volume total, na conformação ou nas

propriedades físico-químicas da molécula (SARAOGI, 2003).

Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o pré-tratamento

intraperitoneal dos animais com os compostos produziram redução significativa na

103

resposta álgica, sendo que a melhor atividade evidenciada foi a do composto C61

(4-Cl) (3,05 (2,53 - 3,65µmol)), seguido do C62 (4-OCH3) (5,62 (3,36 – 9,31µmol)) >

C60 (4-CH3) (7,40 (6,04 – 9,09µmol)) > C66 (3,4-Cl2) (14,84 (13,86 – 16,15µmol)),

no modelo do ácido acético. Como não foi possível determinar a DI50 para o C58, ele

não foi avaliado quanto a sua potência.

A ordem de potência encontrada demonstra que a atividade antinociceptiva

observada para esta série não é dependente dos efeitos hidrofóbicos (π), eletrônicos

(σ) ou estereos (Es) dos substituintes aromáticos. Apesar de não ter sido investigado

o possível mecanismo de ação destes compostos com relação à propriedade

antinociceptiva aguda, pode-se sugerir um possível efeito periférico, envolvendo a

supressão da liberação ou síntese de mediadores químicos como a BK, 5-HT, HIS e

as PGs (DERAEDT et al., 1980), evidenciado pelo modelo de contorção abdominal

induzida pelo ácido acético.

Dando continuidade a avaliação farmacológica dos compostos, foram

avaliados os efeitos, dos mesmos, sobre a resposta edematogênica e a hiperalgesia

mecânica induzida pela ʎ-carragenina. A ʎ-carragenina é um nome genérico dado a

uma família de polissacarídeos obtidos por extração de certas espécies de algas

vermelhas (Rhodophyta), sendo amplamente utilizada na indústria alimentícia,

cosmética e farmacêutica (CAMPO et al., 2009).

Em 1962, Winter, Risley e Nuss, introduziram o modelo de edema de pata

induzido pela injeção intraplantar de ʎ-carragenina em ratos, e desde então, tem

sido conveniente utilizar este modelo para investigar fármacos com possíveis efeitos

anti-inflamatórios. Em 1969, Vinegar, Schreiber e Hugo, descreveram a resposta

bifásica do processo inflamatório induzido pela ʎ-carragenina, sendo que a primeira

fase inicia imediatamente após a injeção do agente irritante, que leva a liberação de

BK, HIS e 5-HT, e se mantém até aproximadamente a 2,5h. Em seguida inicia-se a

segunda fase, caracterizada por elevada produção de PGs, espécies reativas de

oxigênio, e migração de células inflamatórias, além disso, ocorre a liberação

sequencial de uma cascata de citocinas (Di ROSA; WILLOUGHBY, 1971; CUNHA,

et al. , 2004).

A injeção i.pl. de ʎ-carragenina em roedores está associada à hiperalgesia

aguda, que é detectada como uma diminuição do limiar de retirada da pata em

resposta à um estímulo mecânico aplicado na pata inflamada. A resposta imune

ativada pela ʎ-carragenina envolve a ativação de macrófagos residentes, mastocitos

104

e células endoteliais, que resulta na liberação de citocinas pro-inflamatórias e

mediadores. A primeira citocina liberada no processo é o TNF-α, a qual desencadeia

a liberação de IL-6 e IL-1β, além da alta produção de PGs. Estes eventos levam a

sensibilização de neurônios sensoriais primários nociceptivos, frente a um estímulo

doloroso térmico ou mecânico (CHOU, 2003; CUNHA et al. , 2008).

É de extrema importância a participação do TNF-α na formação do edema,

bem como na resposta nociceptiva (alodínia mecânica) e migração de neutrófilos,

decorrentes da administração de ʎ-carragenina na pata de roedores. Logo, o modelo

de edema e hiperalgesia mecânica induzido pela ʎ-carragenina também podem ser

empregados para avaliar os efeitos do TNF-α “in vivo” e também possíveis inibidores

desta citocina e/ou vias relacionadas à ela (ROCHA et al., 2006).

A indução de inflamação aguda através da ʎ-carragenina mostra-se um

modelo pouco específico, por ser resultado de uma complexa diversidade de

mediadores. O tipo de edema formado reflete a ampla produção de PGs na

segunda fase, o que faz deste modelo uma ferramenta importante para avaliar a

atividade de anti-inflamatórios com mecanismo de ação “Aspirina-like”, ou seja,

relacionados à inibição da COX (VANE, 1996; KHODE et al., 2009).

Estudos realizados com uma série de 5-aril-3-(3-coumarinil)-1-fenil-2-

pirazolinas (24) demonstraram efeito antiedematogênico no modelo de edema de

pata induzido pela ʎ-carragenina e artrite induzida pelo CFA. Alguns dos compostos

testados na série apresentaram inibição similar ao fármaco de referência da classe

dos AINES, em ambos os modelos (KHODE et al., 2009). Outros estudos similares

demonstraram também a atividade anti-inflamatória de derivados pirazolínicos

comprovando o potencial farmacológico desses compostos em processos

inflamatórios (SHOMAN et al., 2009; RATHISH et al., 2009; JOSHI et al., 2010;

TABARELLI et al., 2004; SAUZEM et al., 2009; MARIAPPAN et al., 2011).

105

O

N N

R

O

R= 4-ClC6H4

2,4-(Cl)2-C6H3

3-OCH3C6H4

4-FC6H4

(24)

É reportado na literatura, que a diminuição do limiar de retirada da pata pelos

animais quando a hiperalgesia é induzida por ʎ-carragenina é caracterizada pela

liberação de diversos mediadores inflamatórios, dentre eles os metabólitos do ácido

araquidônico (PGE2), produtos originados a partir de mastócitos como a HIS, SP, BK

dentre outros (REICHILING; LEVINE, 2009). Cunha et al., (2005) ressaltam que a

hiperalgesia induzida pela carragenina em camundongos depende de duas citocinas

chaves, TNF-α e KC. Ambas atuam através da liberação de IL-1β e da produção de

prostanoides pela própria citocina IL-1β.

Nos resultados obtidos no presente estudo verificou-se que o tratamento

prévio dos animais com os compostos C61, C60 e C62, apresentaram uma maior

atividade antihiperalgésica quando comparado com o C58 e o C66. A resposta do

C61 se mostrou ainda mais proeminente e duradoura, porém de maneira não dose-

dependente, perdurando da terceira até 48h após a indução. Com base nesses

resultados, os compostos testados, em especial o C61, podem estar agindo nas

diferentes vias responsáveis pela sinalização da dor de origem inflamatória. Neste

caso, deve-se investigar a possível atuação dos compostos na liberação e/ou

atuação de citocinas, produção de prostanoides e sensibilização periférica de

neurônios sensoriais.

A ação ocorre principalmente na segunda fase da dor inflamatória induzida

pela ʎ-carragenina, onde há um predomínio da produção de PGs. Possivelmente

poderia estar ocorrendo inibição da atividade da COX, ou a liberação de citocinas,

que possam atuar como mediadores na inflamação e consequentemente sensibilizar

os nociceptores periféricos. Pode-se perceber também que estes compostos tiveram

perfil farmacológico similar aos fármacos de referência testados, a Indometacina e a

Dipirona e, parecem estar agindo da mesma forma que estes ao inibir a inflamação e

a dor.

106

Quanto ao efeito antiedematogênico dos compostos, o C60 e C61 também

apresentaram maior atividade farmacológica quando comparado aos demais

compostos. A atividade antiedematogênica foi observada, porém este efeito foi mais

discreto e de maneira não dependente da dose.

A partir de então, o delineamento experimental do estudo se voltou para o

aprofundamento dos efeitos farmacológicos do C61, em modelos experimentais de

dor e inflamação induzidos por outros agentes flogísticos, diferentes da ʎ-

carragenina. Além disso, por se tratar de uma estrutura derivada do núcleo pirazol e,

portanto, apresentar similaridade estrutural com a Dipirona, a qual é envolvida em

eventos de discrasias sanguíneas, foi avaliada nesse estudo os efeitos desta

pirazolina administrada cronicamente sobre parâmetros hematológicos e na função

renal e hepática.

No presente estudo, a injeção i.pl de BK promoveu aumento do edema e

hiperalgesia mecânica nos camundongos que foram submetidos à avaliação. O pré-

tratamento sistêmico dos animais com o C61 demonstrou diminuição significativa na

formação do edema bem como diminuição da resposta hiperalgésica. Desta forma, é

possível correlacionar a atividade farmacológica do C61 com o sistema das cininas.

O mecanismo exato pelo qual o composto exerce este efeito deverá ser

aprofundado, para determinar o tipo de interação existente, por exemplo, se o

composto desempenha uma função antagonista dos receptores B2, ou inibe a

subseqüente liberação da cascata de mediadores induzidos pela injeção i.pl de BK.

Foi demonstrado que o aumento da expressão dos receptores de cininas está

envolvido no desenvolvimento da fase inicial da inflamação e da dor inflamatória

após cirurgia (HAMZA et al., 2010).

Outro mediador utilizado para investigar o possível mecanismo de ação do

C61, foi a HIS. Considerando os eventos que ocorrem no processo inflamatório,

sabe-se que a HIS é um mediador liberado nos eventos iniciais de lesão tecidual

(O’MAHONY; AKDIS; AKDIS, 2011). Esta amina biogênica, liberada a partir dos

mastócitos sob condições inflamatórias, induz resposta anafilática, como

vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e contração do músculo liso

(HSIEH et al., 2010a). Além dos efeitos vasculares, a HIS também tem a capacidade

de excitar neurônios aferentes primários de pequeno diâmetro e evoca a liberação

de mediadores vasoativos nas terminações nervosas livres, como a SP, IL-1 e fator

107

de crescimento do nervo (NGF) (AMANN, 1995; DRAY, 1995; JUTEL; AKDIS;

AKDIS, 2009).

Assim como na inflamação a HIS também participa dos processos dolorosos.

Estudos demonstraram que o antagonismo seletivo de receptores H4, em modelos

experimentais in vivo, produziu resposta antinociceptiva significativa em modelos de

inflamação e dor neuropática (TILIGADA et al., 2009; HSIEH et al., 2010b; WALTER;

KOTTKE; STARK, 2011).

Interessantemente o extravasamento plasmático induzido pela HIS pode ser

atenuado em animais submetidos à desnervação pela capsaicina, neste caso, estes

animais têm suas fibras C aferentes destruídas, consequentemente são desprovidos

da liberação dos neuropeptídeos, normalmente liberados após a ação da HIS, como

a SP. Estes dados são importantes para predizer uma interação sinérgica entre os

terminais aferentes primários e a ação da HIS (JANCSÓ; JANCSO-GABOR;

SZOLCSANYI, 1987; SMITH et al., 2010), bem como para comprovar que a HIS

também é responsável pela liberação da SP. Os resultados deste estudo

demonstraram que o C61 foi capaz de diminuir o edema de pata induzido pela

injeção i.pl. de HIS, a partir dos 30 minutos da formação do edema, sendo provável

que o composto em estudo possa estar interagindo também com esta via.

Na sequencia do estudo os efeitos do C61 foram também avaliados frente ao

edema induzido por SP. A injeção intradérmica de SP na pata de roedores produz

vasodilatação com extravasamento plasmático e edema, através da liberação de

CGRP, 5-HT, bem como liberação de PGs e NO (ALVES et al., 1999; CASTARDO et

al., 2008). A SP também facilita o tráfego de células para o sítio da inflamação e

contribui para a formação do edema da pata injetada, pela interação especialmente

com os receptores NK1 (ALVES et al., 1999; BLACK, 2002).

No presente estudo, os resultados obtidos no modelo de edema de pata

induzido pela SP demonstraram que o composto C61, neste modelo também foi

eficaz em reduzir o edema induzido por esse mediador, porém os tratamentos não

foram tão eficaz em reduzir o edema quanto a Indometacina, utilizada como controle

positivo. Os dados nos permitem sugerir que o referido composto possa estar

inibindo a fase inicial da formação do edema, e inibindo a ação do neuropeptídeo e

reduzindo consequentemente o extravasamento vascular.

Como reportado anteriormente, as PGs são exemplos de mediadores que

participam do processo inflamatório e doloroso. Fazem parte da família dos

108

eicosanóides e são produzidas por quase todas as células do corpo. São

mediadores lipídicos que não são armazenados pelas células, mas sim, sintetizados

a partir do ácido araquidônico através da ação da COX. O prostanóide mais

abundante do corpo humano é a PGE2, e dependendo da situação específica,

exerce papel homeostático ou inflamatório e doloroso (PARK; PILLINGER;

ABRAMSON, 2006).

A hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 é normalmente mediada pela

ativação de AMPc, que ativa a proteína kinase A (PKA), segundo mensageiro da

cascata de sinalização em aferentes nociceptivos primários. Além disso, aumenta a

excitabilidade dos neurônios do DGR através do aumento da liberação de GLU

(KASSUYA et al., 2007; REICHLING;LEVINE, 2009)

No SNC a PGE2 atua em vários processos patológicos, envolvendo a geração

da febre, dor e comportamento. Parece atuar como chave na transmissão sináptica e

contribui para a lesão neuronal e neurodegeneração (O´BANION, 2010). Na

inflamação a COX-2 é induzida por mediadores inflamatórios como citocinas

pirogênicas, IL-1β, TNF-α, IL-6 e LPS (ARANOFF; NEILSON, 2001).

Os resultados do edema de pata e hiperalgesia mecânica induzidos pela

injeção i.pl de PGE2, demonstram que o C61 inibiu de maneira significativa e dose

dependente a formação do edema e a resposta hiperalgésica induzidos por esse

mediador, com resultado mais significativo no processo doloroso. Os resultados em

conjunto, nos permitem sugerir que o composto talvez tenha seu mecanismo de

ação envolvido com a inibição de alguns dos eventos mediados pela cascata da

PGE2, nos processos inflamatório e doloroso.

A fim de avaliar o suposto envolvimento de algumas citocinas na atividade do

C61 na hiperalgesia inflamatória, também foi avaliada a reposta farmacológica frente

a hiperalgesia e edema induzidos pela injeção i.pl. de LPS. Cunha et al., (2005)

ressaltam que a hiperalgesia mediada por LPS tem relação quase que direta com as

citocinas TNF-α e IL-1β. Entretanto, nesse modelo, parece que a hiperalgesia

mediada por citocinas é independente de prostanóides, sugerindo um efeito direto

da IL-1β, embora outros mediadores primários possam participar como, por

exemplo, as endotelinas e aminas simpáticas.

A administração i.pl. de LPS, induz uma reação inflamatória aguda com

aumento do volume da pata e hiperalgesia, semelhante a outros agentes como a ʎ-

carragenina (CUNHA et al., 2000). Ressalta-se ainda que a inflamação induzida pelo

109

LPS envolve aumento da expressão de NF-κB, o qual consequentemente aumenta a

liberação de mediadores inflamatórios, portanto o LPS é um indutor da expressão de

diversas citocinas (VAJJA et al., 2004).

Os lipopolisacarídeos bacterianos consistem tipicamente de um domínio

hidrofóbico conhecido como lipídeo A ou endotoxina, uma parte central (núcleo), e

um polissacarídeo distal (antígeno-O) (GALVANI; KREBS; VAZ, 1999). O

componente imunogênico do LPS, lipídeo A, é capaz de ativar a resposta

imunológica induzindo a ativação de diversos tipos celulares e a produção e

conseqüente liberação de citocinas pró-inflamatórias como relatado anteriormente

(GOLENBOCK et al., 1991).

No presente estudo, o fármaco padrão utilizado Indometacina, mostrou

inibição, frente a hiperalgesia mecânica induzida pelo LPS. Da mesma forma, C61

também foi eficaz em promover as inibições da freqüência de resposta, porém ao

compararmos as doses, o C61 foi em torno de 33 vezes mais efetivo que a

Indometacina.

Como reportado anteriormente, a injeção de LPS induz a modulação de uma

série de mediadores a começar pela, BK →TNF-α →IL-1β → IL-6 → COX → IL8 →

aminas simpáticas (WOOLF et al., 1997; CUNHA et al., 2005). Ao analisarmos estes

mediadores e a resposta obtida dos tratamentos dos animais, no presente estudo,

pode-se perceber a ação antihiperalgésica comum aos fármacos da classe dos

AINEs como é o caso da Indometacina, também evidenciou-se ação

antihiperalgésica do C61. Estes resultados suportam a hipótese de atuação do C61,

em algum dos eventos iniciados pelo LPS, durante a hiperalgesia e a inflamação.

A fim de estudar os efeitos do composto no processo doloroso e inflamatório

persistente, foi utilizado o CFA como agente indutor de sensibilização. Como

reportado por Woolf et al., (1997), embora o CFA produza uma resposta inflamatória

marcante dentro de poucas horas após sua injeção i.pl., é um agente utilizado para

avaliar a dor persistente, pois age tanto na sensibilização dos neurônios periféricos

(por possuir uma ação direta, sem a participação de prostanoides) quanto, através

da sensibilização central dos neurônios da medula espinhal. Essas alterações

centrais envolvem modificações teciduais dos neurônios da medula, especificamente

nas laminas superficiais (I e II), como também nas lâminas profundas (V e VI)

responsáveis pela recepção dos estímulos, levando a hiperexcitabilidade dos

neurônios nociceptivos do corno dorsal da medula, o que ocasiona resposta

110

hiperalgésica a estímulos mecânicos ou térmicos (FRASER et al., 2000; WILHELM

et al., 2009)

A injeção de CFA na pata de ratos aumenta os níveis de TNF-α, IL-1β e NGF

3h após a indução de inflamação periférica após a administração localizada. A

resposta das citocinas na inflamação é extremamente complexa, pois envolve

aumento da expressão de fatores pró e antiiflamatórios, que agem e interagem com

um amplo número de células produzindo muitas mudanças dependentes ou não de

fatores de transcrição (WOOLF et al., 2007).

Este modelo é amplamente utilizado em ensaios farmacológicos de dor e

inflamação, constituindo um modelo de grande similaridade com doenças crônicas

humanas tais como artrite reumatóide e as inflamações severas nas articulações

visto que, a injeção i.pl. de CFA produz hiperalgesia intensa e persistente em

roedores (WOOLF; COSTIGAN, 1999; ZHANG et al., 2009b).

Os estudos de Uematsu et al., (2011), demonstraram que a administração

intra-articular de antagonistas de receptores NK1, em modelo de monoartrite

induzida por CFA, foi capaz de reduzir a hiperalgesia mecânica induzida pelo

mesmo, reforçando a importante participação dos neuropeptídeos no

desenvolvimento da artrite.

Um estudo realizado por Mariappan et al., (2011), demonstrou o efeito

antiedematogênico de algumas pirazolinas em modelo de Artrite induzido pelo

CFA,4-[4-N dimetilamino benzilidino]-3-metil pirazolin-5(4H)-ona (25), 4-[2-

clorobenzilidino]-3-metilpirazolin-5(4H)-ona (26) e 4-[benzilidino]-3- metilpirazolin-

5(4H)-ona (27). As pirazolinas testadas demonstraram atividade antiedematogênica

promissora, e foram comparadas com a Aspirina. A pirazolina (26) apresentou

inibição similar ao fármaco referência.

N

NH O N

CH3

CH3

CH3

N

NH O

CH3

N

NH O

CH3

Cl(25) (26) (27)

111

Outro trabalho realizado por Sauzem et al. (2009), avaliou os efeitos dos

tratamentos agudo e crônico de derivados pirazolônicos, 5-trifluorometil-4,5-dihidro-

1H-pirazol (28), em artrite induzida por CFA em ratos. Neste estudo, a injeção i.pl de

CFA produziu edema e dor na pata ipsilateral, evidentes até o último dia de

avaliação experimetal (18 dias), caracterizando o desenvolvimento de um processo

inflamatório crônico. No entanto, os sinais inflamatórios ficaram restritos ao local da

injeção, sem propagarem-se para a pata contralateral. Neste mesmo estudo foi

utilizado a Dipirona como controle positivo, onde se observou resposta

antinociceptiva, porém não foi observado redução do volume da pata.

NN

ONH2

OH

F3C

R1R2

R1= -CH2CH3; R2= H

R1= H; R2= -CH3

(28)

Tatsuo et al., (1994), demonstraram que a dipirona induziu analgesia e

redução do volume da pata em ratos com artrite induzida por CFA de maneira dose

dependente, injetado na base da cauda e o edema foi avaliado 14 dias após a

injeção do CFA.

No modelo de poliartrite induzida pelo CFA, o C61 foi comparado com alguns

fármacos comerciais utilizados no tratamento da dor e da inflamação. A

Dexametasona, Fenilbutazona e Indometacina foram escolhidas como controle

positivo por serem utilizados em diversos processos inflamatórios e dolorosos,

inclusive os processos reumáticos, como os diferentes tipos de artrite. A Dipirona, no

entanto foi selecionada por ser uma pirazolona, ou seja, um fármaco amplamente

comercializado e estruturalmente similar ao C61 que é uma pirazolina.

No presente estudo, as respostas hiperalgésica e edematogênica foram

observadas desde os primeiros dias após a indução nos animais. Pode-se perceber

que o tratamento sistêmico com o C61, conseguiu inibir o desenvolvimento da

formação do edema. Em relação à hiperalgesia mecânica o tratamento com o C61

foi efetivo desde o início da experimentação e se manteve até o 21°dia. O C61

também demonstrou resposta antihiperalgésica superior a Indometacina e a

112

Dipirona. A resposta contralateral passou a ser discretamente observada a partir do

15° dia, porém de maneira não significativa, indicando possivelmente o início da

contribuição neurogênica que desencadeia o mecanismo de imagem (KELLY;

DUNHAM; DONALDSON, 2007), e/ou imunomodulação (TALWAR et al., 2011).

Como reportado anteriormente, existem divergências na literatura em relação

ao desenvolvimento das manifestações clínicas quando se utiliza injeção de CFA

que podem influenciar também nos resultados. Desta maneira algumas

considerações devem ser feitas, as quais são relacionadas ao método em si, tais

como: o local da injeção do adjuvante, o tipo de cepa de mycobacterium utilizada na

preparação do adjuvante, e a linhagem de ratos utilizada. Tais parâmetros interferem

diretamente na maneira pela qual a molécula testada vai demonstrar o seu efeito

(SAUZEM, 2008).

No presente trabalho o adjuvante utilizado foi o produzido com o

Mycobacterium tuberculosis e a linhagem de ratos foi a Wistar, e foi realizada injeção

i.pl do adjuvante, aparentemente nas mesmas condições experimentais utilizadas

por Sauzem et al., (2009). Entretanto, os resultados em relação ao aparecimento de

manifestações na pata contralateral e os resultados referentes aos efeitos da

Dipirona foram um pouco diferentes daqueles obtidos por Sauzem et al (2009).

Embora vários trabalhos na literatura reportam que, animais tratados com

CFA irão desenvolver um quadro artrítico (PEDERNERA et al., 2006; LEE et al.,

2009; VISWANATHA et al., 2011) e que, a mensuração da resposta

antiedematogenica e antihiperalgésica são suficientes para apontar um efeito “anti-

artrítico” de uma substância testada nesse modelo, concordamos com a ideia de que

outros ensaios devem ser realizados para uma verdadeira comprovação dessa

atividade, destacando-se dentre eles: histologia da cartilagem, dosagem de citocinas

como o TNF-α, IL-1β, IL-6, radiologia, mecanismos de osteoclastogênese e

osteoblastogênese (RANK, RANK-L, Osteoprotegerina) entre outros (SUH et al.,

2006; ZHANG et al., 2008; PAN et al., 2009; DONG et al., 2010; TALWAR et al.,

2011). Neste contexto, os resultados obtidos demonstraram atividade significativa,

sugerindo estudos mais específicos para que a atividade antiartrítica do composto

possa ser melhor comprovada e elucidada.

Como ressaltado anteriormente, compostos pirazolônicos e derivados destes,

apesar de potentes antiinflamatorios e/ou antipiréticos podem comprometer a função

hepática e de outros órgãos importantes na homeostasia do organismo. Desta

113

forma, procurou-se no presente estudo avaliar parâmetros funcionais de alguns

órgãos em animais com tratamento crônico do C61.

Uma maneira de avaliar alterações hepatobiliares é através da determinação

da atividade das enzimas hepáticas como a ALT e a AST. Essas são utilizadas para

detectar injúria tecidual em estudos toxicológicos (EVANS; WHITEHORN, 1995). Os

níveis séricos de ALT aumentam quando ocorrem mudanças na permeabilidade ou

lesão direta no tecido hepático. A AST possui uma isoenzima mitocondrial e não é

liberada tão rapidamente quanto a ALT, que é essencialmente citoplasmática. A

ALT, portanto, é um indicador mais sensível de hepatotoxicidade aguda em relação

a AST, pois essa também é encontrada em outros tecidos como o miocárdio, rins,

pulmões (BOONE et al., 2005).

Outro indicador importante de efeitos tóxicos dos medicamentos é avaliação

da função renal. A elevação dos níveis plasmáticos de uréia e creatinina fornecem

indícios de sobrecarga ou comprometimento renal, insuficiência renal aguda ou

ainda aumento do catabolismo protéico (ADEBAYO et al., 2003). No entanto, a

dosagem de creatinina sérica é um parâmetro mais sensível do que a uréia para

detectar nefropatias (ZHENGLE et al., 2012).

No presente estudo, o tratamento crônico com o C61 não causou lesão no

parênquima hepático, nas doses e tempo de administração utiizados neste estudo.

Este dado pode ser evidenciado ao analisarmos as enzimas hepáticas AST e ALT

que são marcadores de função hepática. O C61 não provocou alterações

significativas nos níveis destas enzimas, possivelmente o composto não toxicidade

para o parênquima hepático. Da mesma forma, a avaliação da função renal não

evidenciou sinais relevantes relacionados à nefrotoxicidade.

Clinicamente a agranulocitose se caracteriza pela vasta perda de granulócitos

do sangue periférico que se manifesta na clínica como ulcerações na garganta, no

trato gastrointestinal e outras mucosas, que se seguem por infecções graves

(GARCÍA-MARTINEZ et al., 2003). Essa condição tem sido relacionada ao uso

prolongado de alguns tipos de medicamentos, em especial a Dipirona, cuja

associação com a agranulocitose ainda é controversa (HAMERSCHLAK;

CAVALCANTI, 2005).

Até o momento na literatura, não foi encontrado referência da indução da

agranulocitose por pirazolinas. Entretanto, a proximidade química de pirazolinas e

pirazolonas é evidente. Então, procurou-se verificar se o tratamento crônico com

114

C61 pudesse causar nos animais agranulocitose. Os resultados mostraram que os

animais que foram submetidos ao modelo de artrite induzida pelo CFA e tratados

com o C61 em diferentes doses, não apresentaram sinais de toxicidade nos

leucócitos, série vermelha ou plaquetas, excluindo um efeito agranulocítico do

mesmo. Entretanto, no presente estudo, não foi detectado o efeito da Dipirona sobre

os parâmetros hematopoéticos, fato esse que pode estar relacionado ao tempo de

tratamento e linhagem dos animais utilizados (SHENTON; CHEN; UETRECHT,

2004). Lucchetti et al., (2010), reportam que os efeitos da dipirona em seres

humanos são tempo dependentes, não sendo encontrados dados consistentes com

relação a esse fato em experimentos com animais .

O peso de órgãos linfóides primários e secundários de animais pode estar

relacionado com a influência de fármacos com a resposta imune. Em particular, a

diminuição do baço e o aumento do timo estão relacionados a um efeito positivo

sobre o SI (THEISEN-POPP; MULLER-PSDDINGHAUS,1994). O timo e o baço são

afetados durante a condição de artrite, que pode ser resultado do processo de

fagocitose (RAMPRASATH; SHANTHI; SACHDANANDAM, 2005). O fato do

composto C61 não ter afetado o peso do baço no modelo de inflamação utilizado

pode indicar que ele não interfere diretamente com alguma resposta imune

específica. No caso do efeito encontrado para a Dexametasona, a redução do baço

pode ser atribuída a sua ação antiproliferativa (PEDERNERA et al., 2006).

O ganho de peso corporal é considerado como um índice de atividade

antiinflamatória e um positivo efeito imunológico em animais com artrite induzida por

CFA (PEDERNERA et al., 2006). No presente estudo, não foi evidenciado alteração

do peso dos animais com os tratamentos feitos com o composto e os controles

positivos, com exceção do grupo tratado com a Dexametasona. Nesse caso

específico, os animais em tratamento com Dexametasona desenvolveram severa

perda de peso, o que pode ser explicado novamente devido a sua propriedade

antiproliferativa e o efeito catabólico do fármaco em altas doses (SUH et al., 2006).

A medida da temperatura basal dos animais tem sido utilizada como indicador

de efeitos adversos no estudo de fármacos com propriedades analgésicas. Souza et

al., (2002), demonstraram o efeito hipotérmico das pirazolinas 3-metil- and 3-fenil-5-

hidroxi-5-triclorometil-4,5-dihidro-1H-pirazol-1-carboxiamidas (29), em camundongos

normais. Além disso, esses compostos também apresentaram atividade antipirética

induzida pelo LPS, com resposta com resposta foi similar a Dipirona. No presente

115

estudo não foram observadas variações na temperatura corpórea dos animais

tratados com o C61.

NN

ONH2

OH

Cl3C

R1

(29)

R1= -CH3

R1= -C6H5

Modelos farmacológicos como o Open Field e o Rota- rod têm grande

importância na avaliação da ação de compostos, uma vez que através deles é

possível verificar possíveis efeitos adversos dos mesmos, como uma atividade que

venha a causar efeitos inespecíficos no SNC e, que possam alterar a capacidade

locomotora dos animais e induzir a interpretações errôneas nos resultados obtidos

(MONTIGLIO et al., 2010). Esses modelos também são arrolados no screening de

fármacos com propriedades antiinflamatória e analgésica, uma vez que, dependendo

do modelo utilizado, a integridade motora do animal deve ser preservada. No

presente estudo, também não foi evidenciado alterações motoras nos animais com

tratamento do C61.

As terapias atuais utilizadas nos processos dolorosos e inflamatórios de

diversas etiologias são eficazes, porém acompanhadas de muitos efeitos adversos.

Portanto, constantemente se faz necessário descobrir novas opções para o manejo

clínico destes pacientes. Nesse contexto, há um grande interesse na área da

Indústria Farmacêutica no desenvolvimento de novos fármacos que apresentem

maior segurança no uso, maior eficácia terapêutica e menos efeitos adversos.

Tambem tem sido descrito na literatura vários estudos voltados para a descoberta de

novas moléculas de origem sintética, em especial os heterociclos, dentre eles os que

são derivados do pirazol (MILANO et al., 2008).

No presente estudo, o C61 se apresenta como uma molécula promissora na

terapêutica de processos dolorosos e inflamatórios agudos e crônicos cujo

mecanismo de ação parece ser mediado pela inibição da resposta inflamatória de

mediadores PGs, 5-HT, HIS, BK, dentre outros, os quais são oriundos de vias

metabólicas clássicas ou não. Além disso, o composto se mostrou desprovido de

116

efeitos adversos comuns a fármacos de classe similar utilizados ao tratamento da

dor e inflamação.

117

7 CONCLUSÃO

Diante dos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que todos os

derivados pirazolínicos estudados, apresentaram atividade farmacológica frente aos

modelos experimentais realizados no screening (atividade antinociceptiva,

antiedematogênica, anti-hiperalgésica) proposto.

O composto 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-dilorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina,

(C61) destacou-se por apresentar melhor atividade antinociceptiva e antiinflamatória

nos ensaios avaliados no screening. O que pode ser confirmado pelo seu

pronunciado efeito antinociceptivo no modelo de hiperalgesia mecânica, e atividade

antiedematogênica quando foi avaliado nos modelos de edema de pata, os quais

foram induzidos por diferentes agentes flogísticos.

Além disso, o C61 também se mostrou promissor no modelo de artrite

induzido pelo CFA, pois além de reduzir a hiperalgesia mecânica e o edema neste

modelo, o composto também não alterou de maneira significativa o resultado das

provas bioquímicas e hematológicas realizadas.

Os resultados em conjunto apontam o composto C61 como alvo promissor

para o tratamento de processos dolorosos e inflamatórios crônicos. Entretanto, para

confirmar tal hipótese uma avaliação farmacológica e também toxicológica mais

abrangente deverá ser realizada.

118

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