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FLÁVIO FERRAZ DE CAMPOS JÚNIOR
AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE IN VITRODA LIGA NÍQUEL-BERÍLIO ÀS CÉLULAS
BACTERIANAS E À LINHAGEM CELULARNCTC CLONE 929.
Tese de doutorado apresentada ao Programade Pós–Graduação InterunidadesBioengenharia - Escola de Engenharia de SãoCarlos / Faculdade de Medicina de RibeirãoPreto / Instituto de Química de São Carlos daUniversidade de São Paulo como parte dosrequisitos para a obtenção do título de doutorem Ciências.
Área de Concentração: Bioengenharia
Orientadora: Profª. Drª. Elisabeth Loshchagin Pizzolitto
VERSÃO CORRIGIDA
São Carlos,2015
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO,POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINSDE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Campos Júnior, Flávio Ferraz de C198a Avaliação da citotoxicidade in vitro da liga
níquel-berílio às celulas bacterianas e à linhagemcelular NCTC Clone 929 / Flávio Ferraz de CamposJúnior; orientadora Elisabeth Loshchagin Pizzolitto.São Carlos, 2015.
Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia e Área de Concentração emBioengenharia -- Escola de Engenharia de São Carlos;Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto; Instituto deQuímica de São Carlos, da Universidade de São Paulo,2015.
1. níquel. 2. berílio. 3. resistência bacteriana. 4. ligas metálicas. 5. citotoxicidade. I. Título.
DEDICATÓRIA
A minha esposa, companheira e conselheira, Rafaela Messias. O meu muito
obrigado pelos momentos de incentivo e compreensão da minha ausência. Obrigado
por ser essa pessoa tão maravilhosa e obrigado por me dar tranquilidade para
concluir mais uma etapa da minha vida, mais esta realização pessoal e profissional.
A minha princesa, Laura, por existir, por me dar tanta alegria e por me ensinar a
verdadeira razão de viver.
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Flávio e Lourdes, que me apoiaram, me incentivaram e me
deram suporte para terminar meu doutoramento. Agradeço por me ensinarem a crer
nos meus sonhos. A minha irmã, Karen, por todo carinho, apoio, compreensão
prestado durante estes 4 anos de doutoramento.
Aos meus sogros, Sr. Messias e Dona Lourdes, que também me deram
tranquilidade para realizar este processo de doutoramento, por confiarem no meu
trabalho e me incentivarem a concluir mais esta etapa. Os considero também meus
pais. Ao meu cunhado, Guilherme, agradeço pela amizade e pelas conversas.
Ao meu grande amigo e companheiro de trabalho, de pesquisa e viagens,
Cássio Antonio Lanfredi dos Santos. O meu muito obrigado por todos os seus
conselhos microbiológicos. Conte sempre comigo.
As funcionárias do setor de Microbiologia Clínica do CRD/NAC.
Ao engenheiro, professor Dr. João Manuel Domingos de Almeida Rollo, pela
grande ideia de testar a liga níquel-berílio, pelos conselhos fornecidos, pela
informação compartilhada e pelo sua grande dedicação à pesquisa. Obrigado por
crer no meu potencial.
Ao grande amigo, Paulo José Martins Bispo, que me auxiliou e cedeu as
cepas ATTCs utilizadas na realização de toda parte prática do projeto e pelas
considerações feitas na língua inglesa.
Ao professor e amigo, Adilson César de Abreu Bernardi, por todos os
ensinamentos passados sobre microbiologia, e também, por ter acreditado em meu
potencial.
Aos meus grandes amigos, Marcelo Cremonez, Jader Moreno, Juliano
Chaker, Fernanda Sanchez, Paulo Barreto Júnior e Carlos Mellaci Jr., Normandis
Cardoso Filho, Raquel Camargo, Willys Tristão, Diego R. Rodrigues e Jhonatan
Perin pelo incentivo, confiança e carinho depositados a mim.
A Deus por me abençoar e iluminar minha vida. Aos meus mentores,
agradeço imensamente pelos conselhos e pelas palavras de amor que me
direcionaram nos momentos difíceis dessa caminhada.
Obrigado a todos que acreditaram em meu sonho.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
A professora Doutora Elisabeth Loshchagin Pizzolitto por todo apoio, incentivo,
determinação, ensinamentos, paciência, calma e carinho para comigo. Obrigado por
ter acreditado e lutado comigo durante esses anos. Lembrarei da senhora com muito
carinho, respeito e admiração durante toda minha vida. Uma excelente profissional,
excelente pesquisadora e um excelente ser humano. Obrigado por tudo.
Que o amor à pesquisa, à microbiologia, aos biofilmes e aos docência NUNCA
acabem!
EPÍGRAFE
Penso noventa e nove vezes e nada descubro.
Deixo de pensar, mergulho em profundo silêncio e
eis que a verdade se revela.
Albert Einstein
RESUMO
CAMPOS JÚNIOR, F. F. AVALIAÇÃO DA CITOTOXICIDADE IN VITRO DA LIGANÍQUEL-BERÍLIO ÀS CÉLULAS BACTERIANAS E À LINHAGEM CELULAR NCTCCLONE 929. 2015. 114f. Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação Interunidadesem Bioengenharia – EESC / FMRP / IQSC, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2015.
A contaminação de equipamentos e materiais hospitalares por microrganismospotencialmente infecciosos e altamente resistentes aos antibióticos incitam grupos depesquisa e industrias ao redor do mundo a produzir novos materiais, e que estespossuam propriedades capazes de inibir ou eliminar (quase que completamente) apermanência desses patógenos sobre sua superfície. O objetivo deste trabalho foi avaliara citotoxicidade da liga níquel-berílio quando em contato com as cepas bacterianas deStaphylococcus aureus (ATCC 25932), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228),Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Klebsiella pneumoniae (amostra clínica) eEscherichia coli (ATCC 11775), após diferentes períodos de incubação, e em contato coma linhagem celular NCTC Clone 929, célula de tecido conectivo de camundongo. Pararealização destes ensaios, foram confeccionados corpos de prova da liga níquel-berílio,com aproximadamente 10,0 mm e diâmetro e 3,0 mm de espessura. Para metodologia decitotoxicidade as células bacterianas preparou-se um inóculo bacteriano de 109 UnidadesFormadoras de Colônia por mililitro. Para cada bactéria, um inóculo bacteriano foipreparado e deste, 40 µl foram aplicados em um swab estéril e espalhado no corpo deprova, onde foram introduzidos em placas de Petri, deixados a temperatura 20ºC, pordiferentes períodos de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72 horas). Este teste foirealizado em triplicata. Após cada período de tempo, os corpos de prova erampressionados contra o meio de cultura Agar Mueller-Hinton, em dez diferentes pontos daplaca. O método de difusão em Agar foi utilizado para verificar a citotoxicidade da liganíquel-berílio à linhagem celular NCTC clone 929. Os resultados obtidos demonstram umamaior resistência a liga níquel-berílio das bactérias gram-positivas (S. aureus e S.epidermidis) quando comparadas com as gram-negativas (P. aeruginosa, K. pneumoniaee E. coli). Destas últimas citadas, a E. coli foi a única que sobreviveu até a sexta hora deexposição, quando em contato de uma hora com o corpo de prova. Todavia, os S. aureuse S. epidermidis foram capazes de resistir até a décima segunda hora em contato com aliga níquel-berílio. Contudo, a partir deste período de incubação, nem mesmo osestafilococos toleraram a presença desses íons. Quando analisados os resultados decitotoxicidade, a liga não apresentou qualquer efeito citotóxico as células NCTC clone929, sendo classificadas como índice de zona (IZ) zero. Os dados obtidos demonstramque a liga possui propriedades antibacteriana contra as células bacterianas testadas eque não possui nenhum efeito tóxico à linhagem celular NCTC clone 929. Além disso, aliga NiBe mostrou-se mais citotóxica contra as bactérias gram-negativas.
Palavras-chave: níquel; berílio; resistência bacteriana; ligas metálicas; citotoxicidade;células NCTC 929.
ABSTRACT
CAMPOS JÚNIOR, F. F. EVALUATION OF IN VITRO CYTOTOXICITY OF NICKEL-BERYLLIUM ALLOY THE BACTERIAL CELLS AND CELL LINE NCTC CLONE 929.2015. 114f. Tese (Doutorado). Programa de Pós-Graduação Interunidades emBioengenharia – EESC / FMRP / IQSC, Universidade de São Paulo, São Carlos, 2015.
The contamination of equipment and hospital supplies for potentially infectiousmicroorganisms and highly resistant to antibiotics encourage research groups andindustries around the world to produce new materials, and they have properties able toinhibit or eliminate (almost completely) to stay these pathogens on its surface. Theobjective of this study was to evaluate the cytotoxicity of nickel-beryllium alloy when incontact with the bacterial strains of Staphylococcus aureus (ATCC 25932),Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853),Klebsiella pneumoniae (clinical sample) and Escherichia coli (ATCC 11775), after differentperiods of incubation, and in contact with the cell line NCTC Clone 929, connective tissueof mouse cell. For these assays were prepared coupons of nickel-beryllium alloy, withapproximately 10.0 mm and diameter and 3.0 mm thick. For cytotoxicity methodologybacterial cells prepared in a bacterial inoculum of 109 Colony-Forming Units per milliliter.For each bacterium, a bacterial inoculum was prepared and this, 40 μl were applied in asterile swab and spread in the coupons, which were introduced in Petri dishes left at 20°Ctemperature, for different exposure times (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 and 72 hours). This testwas performed in triplicate. After each time period, the samples were pressed against theculture medium Mueller-Hinton Agar at ten different points of the plate. The agar diffusionmethod was used to assess the cytotoxicity of nickel-beryllium alloy to clone cell lineNCTC 929. The results show a greater resistance to nickel-beryllium alloy of gram-positivebacteria (S. aureus and S. epidermidis) compared to gram-negative (Pseudomonasaeruginosa, K. pneumoniae and E. coli). Of the latter mentioned, E. coli was the only onethat survived until the sixth hour of exposure when contact an hour with the alloy. However,S. aureus and S. epidermidis were able to hold out until the twelfth time in contact withnickel-beryllium alloy. However, from this incubation period, even staphylococci toleratedthe presence of these ions. When analyzed the results of cytotoxicity, the alloy showed nocytotoxic effect the NCTC clone 929 cells, are classified as zone index (IZ) zero. The dataobtained show that the alloy possesses antibacterial properties against the tested bacterialcells and has no toxic effect on the cell line NCTC clone 929. Furthermore, NiBe alloy wasmore cytotoxic against gram-negative bacteria.
Keyword: nickel, beryllium, bacterial resistance; alloys; cytotoxicity; NCTC 929 cells.
LISTA DE ABREVIAÇÕES, SIGLAS, ELEMENTOS QUÍMICOS E UNIDADES DE
MEDIDA
a.C – antes de Cristo
Al – Alumínio.
ATCC – American Type Culture Collection
ATSDR – Agência de Substância Tóxicas e Registro de Doenças (Agency for Toxic
Substances and Disease Registry).
ATV – Associação de Tripsina 0,20% e Versene 0,02%.
Be – Berílio.
BeO – Óxido de berílio.
BGN – Bacilo gram-negativo.
C – Carbono.
CDC – Centros de Controle e Prevenção de Doenças (Centers for Disease Control and
Prevention).
cm2 – Centímetro quadrado.
Co – Cobalto.
Cr – Cromo.
Cu – Cobre.
EPA – Agência de Proteção Ambiental (Environmental Protection Agency).
FDA – Administração de Drogras e Alimentos (Food and Drug Administration).
Fe – Ferro.
g – Grama.
IARC – Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (International Agency For
Research On Cancer).
ICA – Associação Internacional do Cobre.
IRAS – Infecção Relacionada à Assistência à Saúde.
ISO – Organização Internacional de Padronização (International Organization for
Standardization).
IZ – Índice de zona.
LEMC – Laboratório Especializado em Microbiologia Clínica.
ml – mililitros.
mM – Milimolar.
MME – Meio Mínimo de Eagle.
MRSA – Staphylococcus aureus resistente a meticilina.
NAC – Núcleo de Atendimento à Comunidade.
NCC - Núcleo de Cultura Celulares.
NCTC clone 929 - Cultura de células de tecido conjuntivo de camundongo.
Ni – Níquel.
nm – Nanômetro.
ºC – graus Célsius (unidade de medida de temperatura).
OMS – Organização Mundial de Saúde.
Pb – Chumbo.
PBP – Proteína ligantes/ligadora de penicilina.
pH – Potencial Hidrogeniônico.
ppb – Partes por bilhão.
PPR – Penicilina-Penicilinase Resistente.
RODAC – Contagem e Detecção de Organismos Replicados.
SFB – Soro Fetal Bovino.
Si – Silício.
SIDA – Síndrome da Imunodeficiência Adquirida.
Sn – Estanho.
TSB – Caldo de Soja Tríptica.
UFC – Unidades formadoras de Colônia.
USGS – Pesquisa Geológica dos Estados Unidos.
USP – Farmacopeia dos Estados Unidos (United States Pharmacopeia).
UTI – Unidade de Terapia Intensiva.
VRE - Enterococcus resistente a vancomicina.
Zn – Zinco.
µl – Microlitro.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Reserva e produção mundial do níquel. 19
Tabela 2 Reserva e produção mundial do berílio. 26
Tabela 3 Porcentagem dos isolados bacterianos encontrados napesquisa de CHIKERE et al., 2008.
40
Tabela 4 Patógenos, nichos ecológicos e significância clínica(ZIMRING et al., 2013).
42
Tabela 5 Persistência das bactérias clinicamente relevante emsuperfícies secas inanimadas (KRAMER; SCHWEBKE;KAMPF, 2006).
47
Tabela 6 Composição química da liga níquel-berílio testada nopresente estudo.
57
Tabela 7 Descreve e classifica o IZ (USP 23, 1995; USP 24, 1999;USP 25, 2002):
63
Tabela 8 Representação qualitativa do potencial de toxicidade da ligade níquel-berílio as cepas bacterianas testadas de acordocom os períodos de exposição.
64
Tabela 9 Média e desvio padrão da representação quantitativa deUFC de Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli,S. aureus e S. epidermidis sobreviventes ao contato com asuperfície de níquel-berílio, após os períodos de incubação
65
Tabela 10 Índice de zona (IZ) obtido da cultura celular NCTC 929 apóscontato de 24 horas com a liga de níquel-berílio.
72
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Rotas de transmissão de patógenos hospitalares. (MRSA –Staphylococcus aureus resistentes à meticilina; VRE –Enterococos resistentes à vancomicina; BGN – bacilosgram-negativos)
45
Figura 2 Demonstração dos corpos de prova da liga níquel-berílio. 55
Figura 3 Momento da aplicação do swab contendo 109 UFC sobre asuperfície do corpo de prova da liga de NiBe.
59
Figura 4 Corpos de prova da liga NiBe em contato com as cepastestadas, a temperatura ambiente.
60
Figura 5 Após cada período de exposição a temperatura ambiente,retirava-se os corpos de prova da placa de Petri e aplicava-se o mesmo sobre a superfícies do Agar Mueller-Hinton, medez locais diferentes.
61
Figura 6 Unidades Formadoras de Colônia sobreviventes após cadaperíodo de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72h) daPseudomonas aeruginosa com a liga NiBe.
66
Figura 7 Unidades Formadoras de Colônia sobreviventes após cadaperíodo de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72h) daKlebsiella pneumoniae com a liga NiBe.
67
Figura 8 Unidades Formadoras de Colônia sobreviventes após cadaperíodo de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72h) daEscherichia coli com a liga NiBe.
68
Figura 9 Unidades Formadoras de Colônia sobreviventes após cadaperíodo de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72h) doStaphylococcus epidermidis com a liga NiBe.
69
Figura 10 Unidades Formadoras de Colônia sobreviventes após cadaperíodo de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72h) doStaphylococcus aureus com a liga NiBe.
70
Figura 11 Representação gráfica da média e desvio padrão das UFCssobreviventes de Pseudomonas aeruginosa, K.pneumoniae, E. coli, S. aureus e S. epidermidis, após cadaperíodo de exposição a liga NiBe.
71
SUMÁRIO
1– INTRODUÇÃO............................................................................................. 14
2 - REVISÃO DA LITERATURA....................................................................... 16
2.1 – Os metais e as ligas metálicas – Um breve histórico............................... 16
2.2 – O níquel e suas funções........................................................................... 18
2.3 – Níquel e sua citotoxicidade....................................................................... 22
2.4 –O berílio e suas funções........................................................................... 25
2.5 – Berílio e sua citotoxicidade....................................................................... 27
2.6 – Infecção Hospitalar: uma preocupação mundial...................................... 30
2.7 – Os principais patógenos no ambiente hospitalar 33
2.8 – A busca de novos materiais para reduzir a contaminação das
superfícies e as infecções hospitalares............................................................. 40
3. OBJETIVO..................................................................................................... 54
3.1 – Objetivo Geral........................................................................................... 54
3.1.1 – Objetivos específicos............................................................................. 54
4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 55
4.1 – Material..................................................................................................... 55
4.1.1 – Corpos-de-prova da liga níquel-berílio.................................................. 55
4.1.2 – Microrganismos..................................................................................... 55
4.1.3 – Linhagem celular.................................................................................... 56
4.1.4 – Meios de Cultura.................................................................................... 56
4.1.4.1. –- Ágar Mueller-Hinton…………........................................................... 56
4.1.4.2 – Agar de Soja Tríptica……................................................................... 56
4.1.4.3 – Caldo de Soja Tríptica........................................................................ 57
5 – MÉTODOS.................................................................................................. 57
5.1 – Confecção dos corpos-de-prova da liga níquel-berílio............................. 57
5.2 – Preparo do inóculo bacteriano.................................................................. 58
5.3 – Ensaio de sobrevivência microbiana sobre superfície metálica
seca................................................................................................................... 58
5.4 – Cultura Celular.......................................................................................... 61
5.4.1 – Método de difusão em Agar................................................................... 62
5.5 – Análise Estatística..................................................................................... 63
6 – RESULTADOS............................................................................................. 64
6.1 – Sobrevivência bacteriana sobre superfície da liga níquel-
berílio................................................................................................................. 64
6.1.1 - Análise qualitativa da capacidade citotóxica da liga níquel-berílio em
relação à sobrevivência bacteriana................................................................... 64
6.1.2 - Quantificação de Unidades Formados de Colônia (UFC) de
Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli, S. aureus e S.
epidermidis sobreviventes a liga níquel-berílio, após os períodos de
exposição........................................................................................................... 64
6.1.2 - Quantificação de Unidades Formados de Colônia de Pseudomonas
aeruginosa resistentes a liga níquel-berílio, após os períodos de
exposição........................................................................................................... 64
6.1.3 – Imagens das UFCs recuperadas de Pseudomonas aeruginosa, K.
pneumoniae, E. coli, S. aureus e S. epidermidis, após seus respectivos
períodos de exposição a liga NiBe.................................................................... 65
6.1.3.1 – Pseudomonas aeruginosa.................................................................. 66
6.1.3.2 – Klebsiella pneumoniae........................................................................ 67
6.1.3.2 – Escherichia coli................................................................................... 68
6.1.3.3 – Staphylococcus epidermidis............................................................... 69
6.1.3.4 – Staphylococcus aureus....................................................................... 70
6.1.4 – Representação gráfica das UFCs sobreviventes após cada período
de exposição a liga NiBe................................................................................... 71
6.2 – Determinação da citotoxicidade da liga níquel-berílio através do teste
realizado com a linhagem celular NCTC 929.................................................... 71
7 – DISCUSSÃO............................................................................................... 73
8 - CONCLUSÃO.............................................................................................. 82
REFERÊNCIAS................................................................................................ 83
ANEXOS
ANEXO A – INFORMAÇÕES SOBRE A AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE. 113
ANEXO B – LAUDO DO TEXTE DE CITOTOXICIDADE DA LIGA NiBe 114
14
1 – INTRODUÇÃO
A busca incessante por melhorias dos materiais que são utilizados no
revestimento dos equipamentos nos estabelecimentos da área da saúde, bem como
das industrias alimentícias, propulsiona empresas e grupos de pesquisas a
desenvolverem novas estratégias para minimizar possíveis formas de contaminação
e transmissão de microrganismos patogênicos nestes locais (AFESSA et al., 2010).
A contaminação microbiana nos alimentos e nos equipamentos deste ramo
industrial são considerados problemas de saúde pública, uma vez que com a vida
moderna, o ser humano sente maior necessidade de se alimentar fora de casa. A
manipulação imprópria e a contaminação cruzada durante o processo industrial, ou a
manipulação inadequada do consumidor, pode contribuir para disseminar perigosos
microrganismos (FAÚNDEZ et al., 2004). O Centro de Controle e Prevenção de
Doenças (CDC) e a Administração de Drogas e Alimentos (FDA) dos Estados
Unidos, estima que mais de 30 milhões de pessoas adoecem por ano devido a
infecções causadas por contaminação de alimentos (durante o processo industrial
ou durante o manuseio), e aproximadamente 9000 morrem (BUTZBY; ROBERTS,
1996; MAED et al., 1999). No Reino Unido, estima-se que 1 a cada 10 pacientes que
entram no hospital para fazer um procedimento médico adquire infecção hospitalar,
e estas infecções custaram cerca de 1 bilhão de libras por ano a mais para os
hospitais Os principais patógenos envolvidos nestas infecções são os
Staphylococcus sp., Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Klebsiella sp.
(BREATHNACH, 2005). Nos Estados Unidos da América, estima-se que ocorrem
mais de 1,7 milhões de infecções hospitalares por ano, na qual esta resulta em
aproximadamente 99.000 mortes/ano (KLEVENS et al., 2007).
Weber et al. (2010) relatam que uma variedade de fatores podem facilitar
bactérias patogênicas serem transmitidas em um ambiente hospitalar, são eles: i) a
capacidade destes microrganismos em sobreviver sobre superfícies por longos
períodos de tempo; ii) a habilidade de permanecerem virulentos mesmo após
contaminaram o ambiente; iii) frequente contaminação do ambiente hospitalar; iv)
capacidade de colonizar pacientes; v) habilidade de transitar pelas mãos dos
profissionais da saúde; vi) habilidade de serem transmitidos via contaminação das
15
mãos dos profissionais da saúde, e; vii) uma pequena dose inoculada em um
paciente suscetível é capaz de levá-lo a morte (elevado potencial de virulência).
Com isso, muitos centros de pesquisa investiram no tratamento dessas
superfícies com substância biocidas. A primeira superfície que sofreu tratamento e
apresentou boas características antimicrobianas foram os plásticos. Logo, deram
início a produção de telefones recobertos com esse material, assentos de banheiros,
brinquedos e entre outros materiais (AIREY; VERRAN, 2007).
As contaminações bacterianas são tão preocupantes na saúde pública, que
em qualquer tipo de material, inicialmente deve ser testado sua ação sobre as
bactérias, somente depois de comprovado sua eficácia, que este deve passar por
experimentos com fungos, algas e vírus. Este material pode apresentar excelentes
propriedades antimicrobianas, mas se for tóxico à célula humana, o mesmo não
poderá ser implantado para o contato com o homem (no caso de industrias,
hospitais e etc).
Mediante a essa premissa, diversos pesquisadores ao redor do mundo
iniciaram testes com vários tipos de materiais metálicos a fim de encontrar àquele
que possua melhor atividade antimicrobiana, inibindo assim, a capacidade destes
microrganismos de se multiplicar e de sobreviver sobre essas superfícies. Somente
em 2008, 275 ligas de cobre foram protocoladas e aprovas pela Agência de
Proteção Ambiental (EPA, em inglês) como material contendo propriedades
antibacterianas. Após isso, a Associação Internacional do Cobre (ICA, em inglês)
deu início a implantação destas superfícies em ambientes hospitalares. O cobre é o
elemento químico mais testado no momento quanto as suas propriedades
antimicrobianas, contudo, pouco se sabe sobre seus mecanismos de ação no
contato direto com os microrganismos. Outro fator negativo sobre esse íon são os
relatos encontrados na literatura científica de isolados de microrganismos
(principalmente bactérias) portadores de plasmídeos (material genético circular,
presente no citoplasma e constituinte não obrigatório) que codificam genes de
resistência ao cobre, surgindo assim a necessidade de encontrar outros materiais
(formados por compostos diferentes) com ação antimicrobiana.
16
2 – REVISÃO DA LITERATURA
2.1 - Os metais e as ligas metálicas – Um breve histórico
Diferentes materiais têm acompanhado a humanidade desde seus primórdios,
e estes tendo sido usados para produzir uma grande variedade de objetivos, entre
estes exemplos estão ferramentas, utensílio, armas, objetos decorativos, etc. Sua
utilização em determinadas épocas foi tão importante que períodos antigos foram
denominados a partir do material neles predominantemente utilizados. A substituição
de um material por outro trazia sempre novas aplicações e a transição entre os
diferentes períodos era progressiva, tendo ocorrido em épocas diferentes em cada
região do mundo. Os metais, inicialmente usados em seu estado nativo e, mais
tardiamente, extraídos de minérios, apresentavam inúmeras vantagens em relação à
pedra: eles podiam ser vazados na forma final, deformados e endurecidos por
trabalho a frio ou amolecidos por aquecimento (HUMMEL, 1998.).
A palavra metal, deriva de métallon (que significa mina, em grego) e assume,
nos dias de hoje, vários significados conforme o contexto em que é utilizada. No
âmbito da Química, a palavra ferro, por exemplo, pode referir-se ao material sólido
com esse nome utilizado em múltiplas aplicações – pontes e linhas férreas,
máquinas agrícolas, instrumentos industriais, mobiliários, utensílios domésticos, etc.
– ou aos íons ferro, que por exemplo, intervêm na constituição da hemoglobina, ou
fazem parte da ferrugem (GIL et al., 2005).
No continente europeu a utilização de ligas metálicas remonta ao terceiro
milênio antes de Cristo, quando o homem calcolítico descobriu, por experiência ou
coincidência, que a combinação de certos elementos metálicos – formando ligas –
melhorava as propriedades do material, ampliando consideravelmente as
possibilidades de aplicação do mesmo. Enfim, o avanço tecnológico responsável
pela elaboração da ampla gama de ligas metálicas atuais teve sua origem há pelo
menos quase cinco mil anos, quando a maior parte dos efeitos produzidos pela
introdução de elementos de liga – aumento da resistência, diminuição do ponto de
fusão, endurecimento por trabalho a frio, amolecimento por aquecimento, reatividade
química diferencia – já era conhecida, como o atestam objetos encontrados (SMITH,
1981).
17
Os metais são geralmente empregados na forma de ligas, ou seja,
substâncias que consistem em misturas íntimas de dois ou mais elementos
químicos, dos quais pelo menos um é metal, e possuindo propriedade metálica
(CHIAVERINI, 1986).
As ligas constituem, pois, uma combinação de duas ou mais variedades de
átomos, resultando numa substância que apresenta alterações às vezes muito
profundas, tanto nas propriedades físicas como químicas, em relação aos elementos
correspondentes (CHIAVERINI, 1986).
O número de possíveis combinações de apenas dois elementos, dos quais
um deve ser sempre metal, é muito grande. Por outro lado, para cada composição
específica de uma liga, procura-se determinar as modificações estruturais que
podem ocorrer às diversas temperaturas, a partir da sua temperatura de fusão
(CHIAVERINI, 1986).
As ligas são verdadeiras soluções sólidas, obtidas a partir da mistura dos
componentes fundidos, seguida de resfriamento. Com efeito, é fácil imaginar a
substituição de alguns cernes na estrutura do metal principal, normalmente um metal
de transição, por átomos de outros elementos, mantendo-se, na essência, o “mar”
de elétrons (CHIAVERINI, 1986).
As alterações estruturais ocasionadas pela formação de ligas conduzem a
importantes modificações das propriedades originais do material, que encontram
uma gama variada de aplicações e vantagens. Desde o processo de elaboração a
introdução de elementos de liga traz vantagens econômicas importantes, pois em
geral o metal nobre é parcialmente substituído por outro de menor valor, fato que
reduz o custo energético, diminuí o ponto de fusão do material e a formação de
poros. Talvez uma das principais razões para o desenvolvimento de tão grande
diversidade de ligas metálicas tenha sido a busca de propriedades mecânicas
especiais (CHIAVERINI, 1986).
A busca de materiais mais resistentes à corrosão também contribuiu para o
desenvolvimento de tipos especiais de liga, como os aços inoxidáveis. Neste caso,
elementos formadores de filmes passivos – níquel e cromo – são adicionados a um
material com boas características mecânicas e custo relativamente baixo, como é o
caso dos aços ao carbono (CHIAVERINI, 1986).
18
2.2 - O Níquel e suas utilizações
O nome níquel (Ni) é um metal duro e prateado, deriva de “kupfernickel”,
referência dada a nicolita pelos mineradores alemães, quando a identificaram no
século XVII. Antes da era cristã, o metal já era utilizado. Moedas japonesas de 800
anos a.C. e gregas de 300 anos a.C. continham níquel. Acredita-se que seja uma
liga natural com o cobre. Nos anos 300 ou 400 a.C. fabricavam-se armas que
possuíam ferro meteorítico, com conteúdo de níquel variando de 5 a 15% (SILVA,
2001). O níquel foi descoberto em 1751 por Axel Frederich Cronstedt. Em 1804,
Richter descreveu as propriedades desse metal (ALI et al., 1987; RANA, 2006). Este
metal teve pouca importância real na economia industrial até 1820, quando Michael
Faraday, com a colaboração de seu associado Stodard, foram bem sucedidos
fazendo uma liga sintética de ferro-níquel, sendo o início da liga níquel-aço que tem
uma grande contribuição para o desenvolvimento industrial do mundo (SILVA, 2001).
O níquel é um metal duro e ferromagnético, com densidade de 8,9 g/cm3 (ALI et al.,
1987; WHO, 2005). É um elemento de transição e pertence ao grupo 10 da tabela
periódica. Ocorre naturalmente em cinco formas isotópicas: 58 (67,8%), 60 (26,2%),
61 (1,2%), 62 (3,7%) e 64 (1,2%) (WHO, 2005). O níquel forma uma grande
quantidade de compostos e complexos, nos quais apresenta os estados de oxidação
-1, 0, +1, +2, +3, +4. Embora possa existir em vários estados de oxidação, o mais
importante sob condições ambientais é aquele que apresenta o estado de valência 2
(HABER et al., 2000).
A procura global por níquel tem sido aumentada ao longo do tempo,
principalmente devido a intensa produção de aço inoxidável. Níquel é usado em
cerca de 250.000 aplicações industriais nas formas de carbonato de níquel, níquel
carbonil, cloreto de níquel, nitrato de níquel, óxido de níquel, sulfato de níquel e
sulfeto de níquel. Algumas aplicações incluem o uso em processamento de ferro,
niquelagem, baterias de níquel-cádmio, certas soldagens e máquinas copiadoras. O
ferro-níquel é utilizado em equipamentos elétricos, o cobre-níquel é utilizado como
um anticorrosivo para navios e equipamentos marítimos, enquanto que o titanato de
níquel é usado como pigmento de tintas (PASCALICCHIO, 2002)
O níquel é o 24º elemento mais abundante da crosta terrestre,
compreendendo cerca de 3% da composição da terra. É o quinto elemento mais
19
abundante em peso depois do ferro, oxigênio, magnésio e silício (CEMPEL; NIKEL,
2006). Ele é encontrando principalmente combinado com oxigênio, enxofre e com
vários minerais que ocorrem naturalmente na crosta terrestre (ATSDR, 2005; DAS et
al., 2008).
As reservas mundiais de níquel apresentaram um crescimento de 3,5% em
relação a 2009. A China foi o país que mais contribuiu neste aumento, com uma
expansão de 172,7% de suas reservas de níquel em relação ao ano de 2009,
seguido pelo Brasil com 34,73%. Dessa forma, classificou o país na 2ª posição no
ranking mundial. A produção mundial cresceu 20,0%, a Rússia apresentou a maior
participação na produção total (16,6%), seguida da Indonésia (14,6%), Filipinas
(9,8%) e Canadá (9,7%) (DMPM, 2011).
Discriminação Reservas (103t) Produção (103t)
Países 2010 2008 2009 2010 %
Brasil 7.532.310 67.116 41.059 108.983 6,8
Rússia 6.000.000 277.000 262.000 265.000 16,6
indonésia 3.900.000 193.000 203.000 232.000 14,6
Filipinas 1.100.000 83.900 137.000 156.000 9,8
Canadá 3.800.000 260.000 137.000 155.000 9,7
Austrália 24.000.000 200.000 165.000 139.000 8,7
Nova Caledônia 7.100.000 103.000 92.000 138.000 8,7
China 3.000.000 68.400 79.000 77.000 4,8
Cuba 5.500.000 67.000 67.000 74.000 4,6
Colômbia 1.600.000 76.400 72.000 70.200 4,4
África do Sul 3.700.000 31.700 34.600 41.800 2,6
Botswana 490.000 38.000 28.600 32.400 2,0
Venezuela 490.000 13.000 13.200 14.300 0,9
Madagascar 1.300.000 - - 7.500 0,5
República
Dominicana
960.000 31.300 - 3.100 0,2
Outros países 4.500.000 46.000 51.700 77.800 4,9
Total 74.972.310 1.555.816 1.384.659 1.592.083 100Legenda: t = toneladas.
Tabela 1 – Reserva e produção mundial do níquel (fonte: DIPLAM / DNPM e USGS:
Mineral Commodty Summaries – 2011).
20
O níquel é um elemento pertencente a família do ferro (ferro, cobalto e
níquel), com número atômico é 28, e seu peso atômico é 58,71. Devido às suas
propriedades física e química, o níquel metálico e seus compostos são amplamente
utilizados na indústria (ALBRACHT, et al., 1984).
Os compostos de níquel são importantes na indústria moderna e são usados
como galvanoplastia, eletroformados, pela produção de baterias de níquel-cádmio e
de equipamentos eletrônicos. As ligas de níquel, como aço inoxidável, são usadas
na produção de ferramentas, maquinários, armamentos e outras aplicações. Eles
também são usados na produção de moedas, joias e próteses médicas. As fontes de
contaminação ambiental por níquel incluem a produção e o processamento do níquel
e de seus produtos, a reciclagem de produtos contendo níquel e o desperdício
durante o seu descarte. Os compostos de níquel são encontrados também no solo e
estão presentes na forma insolúvel e solúvel (GARRETT, 2000).
O níquel também está presente na atmosfera, mas as espécies de níquel
encontradas dependem da fonte de contaminação. Das fontes antopogênicas, o
níquel é emitido como óxidos, sulfetos, silicatos, compostos solúveis, e em menor
extensão, como níquel metálico. A queima de combustíveis fósseis produzem a
maior contribuição de compostos de níquel no ar ambiente (MERIAN, 1984). Embora
a concentração atmosférica de níquel nas áreas industrializadas tem sido estimada
em uma variação de 120 -170 ng/m3, e 6 -17 ng/m3 nas áreas suburbanas
(NORSETH; PISCATOR, 1979).
Devido a abundancia do níquel na crosta terrestre, estima-se que seja difícil
encontrar uma dieta alimentar que não contenha o elemento níquel presente
(FOSTER; HUTT, 1960; BENNETT, 1984; NIELSON, 1991; SUNDERMAN;
OSKARSSON, 1991). Muitos autores tem estimado que o consumo de níquel
ingeridos diariamente através das dietas (FOSTER; HUTT, 1960; ANKE et al. 1995;
BARCELOUX, 1999). Sabe-se que o níquel é essencial para produção de diversas
enzimas e cofatores nos organismos superiores. Todos estes fatores tem contribuído
para concluir se o níquel é ou não essencial aos seres humanos. Apesar dessa
incerteza, no início de 1920 foi sugerido que o níquel pode ter funções fisiológicas
nos organismos superiores, e essa observações se deu através de resultados
obtidos através de experimentos animais com dietas deficientes de níquel. Foi
21
constato um aumento importante nos resultados de mortalidade perinatal, bem
como, decréscimo nos índices de desenvolvimento (NIELSON et al., 1975;
SCHNEGG; KIRCHGESSNER, 1975; KIRCHGESSNER et al., 1982). Outro estudo
mostrou que a deficiente de níquel resultou em anemia, como consequência da
diminuição da hemoglobina e dos valores de hematócrito (NIELSON et al., 1984;
LEACH et al., 1985; SPEARS et al., 1986). Após essas pesquisas, surgiram outras
que mostraram que a deficiência de níquel reduz a atividade de muitas enzimas
envolvidas no metabolismo de carboidratos e dos aminoácidos (NIELSEN, 1991;
STANGL, 1996).
Enzimas dependentes de níquel também são conhecidas no mundo
bacteriano (ANKEL-FUCHS; THAUER, 1988;STANGL, 1996; HAUSINGER, 1997;
RAGSDALE, 1998; MARONEY, 1999;). Acreditava-se que somete sete enzimas
eram dependentes, incluindo hidrogenase, CO-dehidrogenase, metilcoenzima M-
redutase, Ni-superóxido dismutase, glicoxilase I e a cis-trans isomerase. Watt e
Ludden (1999) estudaram as bactérias com enzimas dependentes de níquel, o
biometabolismo no níquel, sistemas de transporte e proteínas ligantes de níquel.
Algumas enzimas bacterianas dependentes de níquel também estão sendo
estudadas por suas relações às doenças humanas.
O níquel é comumente encontrado na água como poluente de resíduos
industriais. Este metal é tipicamente encontrado no estado de Ni(0) ou Ni(II) devido a
estabilidade dessas espécies na água (NIEMINEN et al., 2007).
Até a década de 60, o níquel era conhecido somente pelos seus efeitos
tóxicos. Foi então que em 1965, Barth e Ordal, durante seus estudos com bactérias,
notaram que esse íon era um nutriente essencial para muitos microrganismos,
responsável por muitas reações metabólicos (BARTHA; ORDAL, 1965).
O níquel é utilizado por uma variedade de bactérias para funções de
sobrevivência. Até hoje, o níquel foi identificado como elemento essencial para nove
enzimas microbianas (MARONEY, 1999; MULROONEY; HAUSINGER, 2003).
Embora as bactérias necessitem do níquel para realizar diversos processos
enzimáticos, a alta concentração de íons níquel torna-se tóxico para esses
microrganismos. Como resultado, as bactérias tiveram que se adaptar a presença
desse íon em altas concentrações e desenvolveram mecanismos sofisticados para
22
regular os níveis intracelulares de níquel (MULROONEY; HAUSINGER, 2003;
EITINGER; MANDRAND-BERTHOLET, 2000).
O níquel é um dos metais com mais propriedades antimicrobianas, quando
em altas concentrações. Seu íon pode penetrar na célula microbiana e matá-la
principalmente pela inativação de suas enzimas (CHOHAN, 2000). Muitos
pesquisadores mostraram diferentes complexos de níquel manifestando ação
antimicrobiana (RAO; REDDY, 1990; THIRUMALAIKUMAR et al., 1999; CHOHAN et
al., 2002; SINGH et al., 2003; PATEL et al., 2004). Nos últimos anos, diversas
pesquisa estão sendo desenvolvidas para uma melhor compreensão para a ação
antimicrobiana íons metálicos, sua toxicidade e sua termoestabilidade tem sido
estabelecida nesses últimos anos (KAMALAKANNAN; VENKAPPAYYA, 2002).
Tem sido provado cientificamente a atividade antimicrobiana de alguns
compostos de níquel (NAIK et al., 2002; SHIVANKAR; TAKKAR, 2003). Blasco et al.,
(1996) estabeleceram um complexo de níquel que comprovou in vitro sua atividade
inibitória contra importantes patógenos como a Escherichia coli e o Staphylococcus
aureus.
2.3 - Níquel e sua citotoxicidade
Devido as suas propriedades físicas e químicas, o níquel metálico e seus
componentes são amplamente usados na indústria moderna. O elevado consumo de
produtos contendo níquel, inevitavelmente, levou a poluição ambiental por níquel e
por seus produtos em todos os estágios de produção, reciclagem e descarte (IARC,
1990).
A citotoxicidade do níquel nos humanos recebeu intensa atenção devido as
ligações entre o níquel e o câncer (DENKHAUS; SALNIKOW, 2002; KAZPRZAK,
SUNDERMAN; SALNIKOW, 2003; SALNIKOW, 2007; DAS; DAS; DHUNDASI,
2008). Este metal não é prejudicial apenas ao homem, sabe-se que ele causa danos
a diversos microrganismos (DENKHAUS; SALNIKOW, 2002; KASPRZAK et al.,
2003; DAS et al., 2008; YUSUF et al., 2011) e há relatos de sua citotoxicidade
também é relatada nas plantas (YUSUF et al., 2011).
A exposição humana ao níquel ocorre primariamente via inalação e ingestão
deste elemento. Concentração significantes de níquel, em diferentes formas, podem
23
ser depositadas no corpo humana através da exposição ocupacional e da dieta de
uma vida toda. Uma vez que o níquel não tem sido reconhecido como um elemento
essencial para os seres, não é claro o modo com que os compostos de níquel são
metabolizados. Sabe-se, todavia, que a exposição aos compostos de níquel podem
ter efeitos adversos na saúde humana. Alergia ao níquel na forma de contato com a
pele é a mais comum e bem conhecida reação. Embora o acúmulo do níquel no
corpo humano através da exposição crônica pode levar a uma fibrose pulmonar,
doenças cardiovasculares e renais, e a maior preocupação relatada é a atividade
carcinogênica do níquel. Estudos epidemiológicos tem claramente envolvido os
compostos de níquel como bases carcinogênicas em uma maior incidência dos
pulmões e câncer nasal com trabalhadores de refinarias e mineradores. Em vários
modelos animais, os compostos de níquel induzem tumores próximo ao sítio que foi
administrado. Além disso, os compostos de níquel insolúveis como o subsulfeto de
níquel são excelentes indutores a alterações celulares em roedores e em humanos.
Baseadas nestas observações a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer
(IARC) avaliou a carcinogenicidade do níquel em 1990 (IARC, 1990)
A intoxicação por níquel nos microrganismos acreditava-se ser um problema
limitado as células expostas a poluição industrial ou da ocorrência natural de solos
contaminados com níquel (BABICH; STOTZKY, 1983). Essa teoria foi anulada,
contudo, quando um sistema de defesa do níquel foi caracterizado em uma
Escherichia coli (RODRIGUE et al., 2005). Após esse estudo, diversos genes de
defesa ao níquel foram detectados nas bactérias (RODRIGUE et al., 2005). Estas
descobertas sugerem que o excesso do níquel é uma preocupação fisiológica dos
microrganismos. Por exemplo, as bactérias comensais no intestino humano são
expostas a 150-900µg de níquel por dia, como constituinte da dieta (BARCELOUX,
1999).
O níquel pode ser útil e essencial para as bactérias, entretanto, ele também
pode apresentar toxicidade e ser letal (MACOMBER; HAUSINGER, 2011). Sempre
que esses microrganismos entram em contato com uma quantidade de níquel
superior a que eles necessitam, eles podem morrer ou desenvolver formas de se
proteger dessa sobrecarga de níquel (HAUSINGER, 1987).
24
Alguns microrganismos possuem enzimas e proteínas capazes de que
coordenam a absorção ou a expulsão (efluxo) de metais pesados, como no caso o
níquel. Dessa forma, mantém-se a homeostase do níquel. Além dessas alternativas,
os microrganismos contém um sistema de proteínas (proteínas metalo-regulatórias
de níquel) responsáveis pela percepção e resposta ao níquel (KALUARACHCHI et
al., 2010).
No ambiente, os microrganismos estão sujeitos a diversas alterações, dentre
elas, as mudanças nas concentrações de metais. Para agravar ainda mais este
problema, muitos microrganismos possuem tendências de concentrar/absorver
metais (OUTTEN; O’HALLORAN, 2001; FINNEY; O’HALLORAN, 2003). Por estas
razões os microrganismos tem desenvolvido formas para se proteger da alta
concentração de metais. Uma resposta microbiana comum a elevada concentração
de metais tóxicos é a síntese de um sistema específico de efluxo, assim reduzindo a
concentração internado destas espécies de metais (NIES, 2003). As bombas de
efluxo são as melhores características dos organismos que exibem elevada
resistência aos metais, tipicamente isolados em solos ricos em níquel, poluídos ou
que apresentam uma quantidade natural deste metal.
Bactérias que possuem esses genes contém proteínas na membrana externa
que expulsa substâncias em excesso ou tóxicas ao meio. Estas proteínas são
conhecidas por bombear metais para fora da membrana externa, e portanto, não são
encontradas em microrganismos ausentes desta membrana (HANEY et al., 2005). A
proteína codificada, conhecida como nreB, é conhecida como responsável por
bombear o níquel para fora do citoplasma bacteriano (GRASS et al, 2001). A
expressão da nreB na E. coli aumenta a resistência intracelular ao níquel. Já foram
encontradas proteínas homólogas a nreB em outras bactérias (NIES, 2003; PARK et
al., 2004).
A bomba de efluxo RcnA foi identificada pela primeira vez na E. coli e mostrou
ser responsável pelo bombeamento de níquel e cobalto para fora do citoplasma
(RODRIGUES et al., 2005).
Embora o efluxo de níquel seja amplamente usada pelas células para se
protegerem contra elevadas concentração deste metal, vários outros mecanismos
são utilizados por outros microrganismos. A E. coli exibe uma resposta quimiostática
25
a concentração de níquel no meio, com o níquel agindo como um repelente
quimostático (TSO; ADLER, 1974; BORROK ET AL., 2005; ENGLERT et al., 2010).
A Pseudomonas putida acumula níquel em seu periplasma, possivelmente em um
complexo proteico, como um mecanismo de resistência a este metal (TRIPATHI;
SRIVASTAVA, 2006). Em contraste, a cepa Pseudomonas aeruginosa acumula o
níquel intracelularmente (SAR; KAZY; SINGH, 2001). Formas de defesa ao níquel
são sistemas comumente encontrado em diversos microrganismos. Este sistema
sugere que o excesso de níquel é uma preocupação para a homeostase fisiológica
desses microrganismos (MACOMBER; HAUSINGER, 2011).
2.4 - O Berílio e suas funções
Berílio, assim denominado por ter sido obtido a partir de um mineral
conhecido como berilo. O berílio foi descoberto por Vauquelin em 1798, ao analisar
amostras de dois minerais, berilo e esmeralda. Ao novo elemento encontrado,
Vauquelin deu o nome de glucínio, uma vez que seus sais conhecidos na época
tinham um sabor mais doce. Mais tarde, tomou-se berílio como o nome aceito. O
abade Haüy chamara a atenção para o fato de o berilo e a esmeralda serem muito
semelhantes quanto à estrutura cristalina, dureza e densidade e que portanto era
provável que fossem idênticos quimicamente. Vauquelin demonstrou que de fato os
dois minerais eram idênticos. Hoje, sabe-se que tanto o berilo como a esmeralda
são silicatos duplos de berílio e alumínio, Be3Al2(SiO3)6, a diferença básica entre o
berilo e a esmeralda é que esta contém cerca de 2% de Cr, conferindo-lhe uma cor
verde (DIAS, 1973; PEIXOTO, 1996).
Apesar do trabalho pioneiro de Vauquelin, o berílio só foi produzido 30 anos
mais tarde sobre a forma metálica, em 1828, por dois pesquisadores, Wöhler e
Bussy (DIAS, 1973; PEIXOTO, 1996).
Suas propriedades químicas demonstram um peso atômico de 9,012, uma
valência de 2, um número atômico de 4 e é um metal alcalino terroso. Na Terra
existe um único isótopo natural do Be, no entanto são conhecidos seis isótopos. A
proporção de berílio na crosta terrestre é de 2 g a cada 1 tonelada. Este elemento é
cerca de 3,5 vezes mais denso que o lítio, seu ponto de fusão é cerca de 1287,2ºC,
considerado um dos únicos metais leves com ponto de fusão significativamente alto.
26
O principal uso do berílio é na fabricação de ligas metálicas (cobre-berílio, bronze-
berílio, dentre outros (PEIXOTO, 1996).
O elemento berílio (Be) está presente em diversos minerais, porém, o berílo
(Be3Al2Si6O18) é comercialmente, o mais importante. As reservas oficiais desse
minério em nosso país são pouco representativas, com teores entre 10 a 12% de
BeO. Encontra-se em rochas pegmatíticas distribuídas, nos estados de Minas
Gerais, Bahia e Ceará (DNPM, 2011).
De acordo com o Serviço Geológico dos Estados Unidos - United Geological
Survey (USGS), estima-se que a reserva mundial de berílio de 2010 seja superior a
80.000 toneladas, encontradas, principalmente em depósitos pegmatíticos. Os
Estados Unidos, principais consumidores e fornecedores de concentrado e de
produtos manufaturados de berílio, são detentores de 65% da reserva mundial de
berílio. Destaque deve ser dado ao depósito não pegmatítico de Spor Mountain, no
Estado de Utah – EUA, onde as reservas medidas estão em torno de 16.000
toneladas de berílio contido, provenientes do minério bertrandita (Be4Si2O7) (DNPM,
2011).
As desejáveis propriedades físico-químicas de baixa densidade, resistência a
corrosão, elevado ponto de fusão, resistência a tensão, justifica o uso do berílio na
produção de uma ampla variação de produtos incluindo armas nucleares, próteses
dentais e etc. O hidróxido de berílio é usado na produção de óxidos de berílio, o
metal puro e as ligas de cobre. O óxido de berílio (BeO), ligas de cobre, alumínio,
níquel e o metal puro são usados em inúmeras aplicações incluindo cerâmicas, nas
indústrias produtoras de naves aeroespaciais, produtos eletrônicos, materiais
esportivos e aeronaves (GORDON, T; BOWSER, D, 2003).
Discriminação Reserva (tonelada) Produção (t)
Países 2010 2009 2010 (%)
Brasil 6.000 0 0 0
Estados Unidos 52.000 120 170 88,1
China sem registro 20 20 10,4
Moçambique sem registro. 2,0 2 1,0
Outros países 27.500 1 1 0,5
Total 85.500 142 193 100
Tabela 2 – Reserva e produção mundial do berílio (Fonte: DIPLAM / DNPM e USGS:
Mineral Commodty Summaries – 2011).
27
No grupo do mineral berílio, a variedade de berílio industrial apresenta grande
potencial de uso, por se constituir geralmente de rejeito da extração das gemas
(esmeralda, água marinha e outras), em diversas jazidas no Brasil. No ano de 2011,
o estado brasileiro que mais extraiu esse mineral foi Minas Gerais (DNPM, 2011).
2.5 - Berílio e sua citotoxicidade
O berílio (Be) é altamente tóxico, podendo ocorrer envenenamento agudo por
inspiração de seus sais, produz calafrios, febre, tosse dolorosa e acúmulo de
líquidos nos pulmões, podendo levar à morte. A inalação de compostos insolúveis
pode levar à beriliose, quando os pulmões são lesado (formação de granulomas).
Esta doença é também conhecido como granulomatose pulmonar crônica e seus
sintomas aparecem, em média, 15 anos após a exposição a certos compostos de
Be, como aqueles usados no revestimento interno de lâmpadas fluorescentes. A
toxicidade dos compostos de Be deve-se provavelmente a sua capacidade de
deslocar o Mg em enzimas que contém magnésio. Por essas razões, garimpeiros e
lapidadores de água-marinha, berilo e esmeralda devem tomar precauções
especiais (PEIXOTO, 1996).
A exposição humana ao berílio e a seus componentes tem sido associado
com a doença crônica do berílio (ou beriliose). Desde o início de 1960 ao meados de
1980, acreditou-se que esta doença quase eliminada através do local de trabalho
dos engenheiros e de suas práticas. Entretanto, o melhoramento da vigilância
médica, da tecnologia diagnóstica, e uma alteração no critério e diagnóstico da
beriliose, permitiram detectar a forma subclínica da doença de uma maneira mais
rápida e precisa, na qual anteriormente esse tipo de diagnóstico não era possível. O
melhoramento da técnica de identificação da beriliose mostrou que a doença era
muito mais incidente nos trabalhadores do que era esperado (DEUBNER et al,
2001).
A população em geral está exposta ao berílio através do ar, da água e da
alimentação. A estimativa total da exposição diária ao berílio através de diversas
fontes (incluindo ar, água e comida) pode variar de 0,5 a 20µg de Be por dia
(Agência de Substâncias Tóxicas e Registro de Doenças - Agency for Toxic
Substances and Disease Registry, 1997).
28
Não tem sido relatado casos de beriliose na população em geral como um
resultado da exposição natural provenientes de materiais contendo berílio
(DUEBNER et al., 2001).
Poucas pesquisas estão focadas na exposição oral ao berílio, pois geralmente
presume-se ser pobremente absorvido e limitado na toxicidade através desta rota de
exposição (Agência de Substâncias Tóxicas e Registro de Doenças - Agency for
Toxic Substances and Disease Registry, 1997). A fração de uma dose ingerida que
torna-se absorvida na circulação sistêmica depende na forma química do berílio, do
tamanho da partícula e da dose exposta. A estrutura química interfere na
solubilidade do berílio. Exemplo os sais de berílio [BeF2, BeCl2, Be(NO3)2, BeSO4]
são solúveis, portanto, são adequados para absorção. Entretanto, a geração de sais
de berílio é primariamente restrita à extração de berílio do minério. Apenas poucas
quantidades de sais de berílio são comercializadas. Em contraste, as formas de
berílio mais comumente encontradas no comércio (exemplo do metal berílio, ligas de
cobre-berílio com menos de 2% de Be, e algumas cerâmicas de berílio) são
consideradas insolúveis e somente são capazes de sofrer uma dissolução limitada
no estômago, mas a maior parte passa pelo trato gastrintestinal sem ser absorvido
(REEVES, 1965). Com isso, tem sido geralmente assumido que a absorção oral do
berílio apresenta um risco insignificante ao homem (DUEBNER et al., 2001).
Em 1943, o Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos estabeleceu um
valor de absorção gastrintestinal pelo berílio de 0,006%. Pesquisas subsequentes
não confirmaram este valor, mas deram indícios que a absorção ao berílio no trato
gastrintestinal é baixa, provavelmente menos do que 1% (DUEBNER et al., 2001).
Após a exposição oral à compostos de berílio, a toxicidade sistêmica é
limitada. A mais compreensiva avaliação até hoje envolve a administração de sulfato
de berílio na dieta de ratos por dois anos (MORGAREIDGE et al., 1975). Neste
estudo, não houve efeitos observados no sistema cardiovascular, pulmões, trato
gastrintestinal, sangue, sistema musculoesquelético, fígado, pele, olhos, baço,
linfonodos, cérebro e sistema reprodutivo. Foi constatado um aumento no peso dos
rins, mas não foi observado dano morfológico ao órgão. Esforços por outros
pesquisadores revelaram a ausência da toxicidade sistêmica após a exposição ao
29
berílio (REEVES, 1965; SCHROEDER; MITCHENER, 1975; SCHROEDER;
MITCHENER, 1975).
Em sua avaliação da literatura publicada sobre a toxicidade da exposição oral
ao berílio, a Agência de Proteção Ambiental selecionou lesões no intestino delgado
como a extremidade mais sensível a toxicidade através da exposição oral (EPA,
2000). Esta toxicidade provavelmente reflete na ação corrosiva direta dos sais de
berílio nos tecidos intestinais após sua ingestão, e não foram relatados efeitos
subsequentes à absorção na corrente sanguínea (DUEBNER et al., 2001).
A absorção cutânea dos diversos metais é baixa. Em 1980, a Agência de
Proteção Ambiental dos Estados Unidos forneceu orientações onde relatavam que o
fator da absorção cutânea era de 0,01 µg para os componentes inorgânicos (EPA,
1998). Este fator de absorção é um valor de proteção e conservação à saúde, onde
é utilizado para todos os compostos inorgânicos, independente das suas
propriedades químicas. Especificamente ao berílio, a absorção através da pele
intacta é considerado ser insignificante (fator de absorção muito menor que 0,01 µg)
(Agencia de Substâncias Tóxicas e Registro de Doenças - Agency for Toxic
Substances and Disease Registry, 1997). A baixa absorção e solubilidade cutânea
pelos sais de berílio estão relacionadas primariamente a baixa solubilidade dos
níveis de pH fisiológico, e o berílio iônico reage com os constituintes epidérmicos
(FRIBERG et al., 1979).
Embora a absorção de berílio através do contato da pele íntegra seja
insignificante, o berílio em contato com uma pele não íntegra pode permitir o contato
com uma dose maior de berílio e este ser absorvido pelo corpo (IVANNIKOV et al.,
1982). Neste estudo, Ivannikov e colaboradores aplicaram BeCl2 diretamente na pele
de animais vivos que apresentavam três tipos de feridas: abrasivas (trauma
superficial), cortes (trauma de pele e superfície muscular) e penetrantes (trauma
muscular profundo). Nas três situações testadas, os pesquisadores encontraram
uma quantidade significante de berílio, onde a inoculação de berílio nos tecidos mais
profundos apresentaram uma elevada concentração sistêmica (IVANNIKOV et al.,
1982; EPSTEIN, 1991).
Um considerável número de estudos epidemiológicos tem examinado o
potencial do berílio em causar tumores no trato respiratório de trabalhadores
30
expostos ao berílio no transporte aéreo (WARD et al. 1992; GORDON, T.; BOWSER,
D, 2003). Até o presente momento, não há relatos na literatura científica sobre a
atividade do berílio aos microrganismos.
2.6 – Infecção Hospitalar: uma preocupação mundial
Infecções nosocomiais são aquelas adquiridas ou associadas com os
hospitais. Elas também são conhecidas como infecções adquiridas em hospitais ou
Infecção Relacionada à Assistência à Saúde (IRAS). A definição mais usual da
infecção nosocomial é aquela infecção que não estava presente ou incubada
quando o paciente foi admitido no hospital ou no estabelecimento de saúde. Em
caso de dúvida, usa-se um período de coorte (isolamento) de 48 horas após a
admissão. Os termos de infecções adquiridas em hospitais ou associadas aos
cuidados de saúde são frequentemente alterados, mas o termo “relacionados à
assistência à saúde” também apresenta um significado muito amplo, englobando
qualquer infecção adquirida e em qualquer ambiente (BREANTHNACH, 2013).
Apesar dos recentes avanços na ciência médica, as infecções nosocomiais
ainda causam doenças consideráveis e o aumento da taxa da mortalidade. Estima-
se que 5-10% dos pacientes nos hospitais britânicos e irlandeses apresentam uma
infecção nosocomial, sendo a prevalência mais elevada nas feridas cirúrgicas e nas
unidades de terapia intensiva, e a menor prevalência nas unidades médicas
(SMYTH et al., 2008).
Além do dano relevante conhecido que os cuidados médicos trazem aos
pacientes, a infecção nosocomial causa prejuízos financeiros para o hospital e para
a sociedade. Em um estudo realizado na década de 90, o custo no Reino Unido,
com o aumento da estadia e tratamento nos hospitais, foi estimado em 1 bilhão de
libras esterlinas/ano (PLOWMAN et al., 2002). Este valor não inclui custos com
processos judicial e indenizações, e nem inclui custos ao paciente, devido a sua
infecção (BREANTHNACH, 2013). Nos Estados Unidos, é estimado que ocorram 1,7
milhões de infecções hospitalares por ano, na qual resulta em aproximadamente de
99 mil mortes (KLEVENS et al., 2007).
Nos países em desenvolvimento, a incidência de infecções hospitalares
podem ser devastadores, resultando em um maior surtos de doenças nos hospitais e
31
em outras unidades de saúde. Isto pode ser atribuído a pobre/baixa infraestrutura, a
superlotação e a gestão inadequada destes estabelecimentos (CHIKERE; OMONI;
CHIKERE, 2008).
As infecções hospitalares são preocupações mundialmente importantes para
o desenvolvimento nacional. No norte da Europa as taxas de infecção hospitalar
atinge 1%, especialmente a Holanda, que introduziu medidas extremamente duras
contra o controle de infecção. Contudo, também há relatos de taxas de infecções
hospitalares acima de 40% em algumas partes da Ásia, América do Sul e a África
Subsaariana (KLENVENS et al., 2007; NNIS, 2004; CDC, 2003; EDWARDS et al.,
2007; CDC, 2005).
Cerca de 720.00 pessoas são infectadas em hospitais brasileiros por ano e,
destas, 20% (144.000) evoluem para o óbito. Essas infecções podem ser atribuídas
ao ambiente hospitalar e se manifestar durante a internação ou após a alta,
acometendo mais de 15% dos pacientes internados, fato agravado com a resistência
bacteriana (OLIVEIRA; BETTCHER, 2010; MARTINS et al., 2008; SOUZA et al.,
2009).
Entre as nações mais industrializadas e desenvolvidas, a Organização
Mundial da Saúde (OMS) encontrou uma taxa de 8,7% de pacientes com infecções
nosocomiais, na somatória de todos os hospitais. Estudos sobre a prevalência anual
das IRAS revelaram que entre 100 admissões de pacientes, a Grécia tinha 9,1% de
pacientes com IRAS, 7% na Espanha, a Noruega possui uma taxa de 5,1%,
enquanto que a Eslovênia registra uma tava de 4,6% de IRAS (KLEVENS et al.,
2007; KLAVS et al., 2003; DUNN; SEMMELWEIS, 2005). Em 2001, Machado et al.
(2001) relatam que cerca de 5% a 15% dos pacientes internados em hospitais
brasileiros contrariam IRAS. Em 2011, A OMS realizou pesquisa nos hospitais
brasileiros e relatou uma taxa de 14 a 19% de infecções hospitalares, sendo que em
algumas localidades menos desenvolvidas, esses índices possam chegar a 88,3%
de IRAS (OMS, 2011).
O custo de um paciente com infecção hospitalar pode ser três vezes maior do
que o de um paciente sem infecção. Os índices de infecção permanecem elevados
no Brasil, a maior incidência ocorre em hospitais de ensino ou universitários em
comparação a outros hospitais, devido à variedade de doenças, à realização de
32
procedimentos de alta complexidade, aos longos períodos de internação e ao
contato de pacientes com diversos profissionais da saúde, incluindo estudantes.
Ressalta-se, ainda, a insuficiente habilidade técnica de estudantes em realizar
procedimentos invasivos (MENEZES et al., 2007; MOURA et al., 2007).
Os pacientes internados em instituições de saúde estão expostos à variedade
de microrganismos patogênicos, principalmente em Unidades de Terapia Intensiva
(UTI), cujo o risco de infecções é elevado, favorecendo o surgimento de IRAS,
apresentando risco médio de 5 a 10 vezes maior do que outros setores hospitalares,
que atingem cerca de 10 a 30% dos pacientes internados, contribuindo com taxa de
mortalidade que varia de 10 a 80%, de acordo com o perfil do paciente internado
(LIMA; ANDRADE; HASS, 2007; PAULA, 2008).
O próprio ambiente hospitalar é um reservatório em potencial de agentes
infecciosos, uma vez que abriga pacientes com diversos microrganismos
patogênicos, bem como indivíduos imunocomprometidos ou susceptíveis
(RHOMBERG et al., 2006; ZHANEL et al., 2008).
Para a contaminação ambiental desempenhar um papel importante na
aquisição de um patógeno nosocomial, o microrganismo deve demonstrar certas
características microbiológicas, exemplos: a) o patógeno deve ser capaz de
sobreviver por um prolongado período de tempo em superfícies ambientais; b)
habilidade de permanecer virulento após exposição ambiental; c) contaminação
frequente do ambiente hospitalar; d) habilidade de colonizar pacientes; e) habilidade
de colonizar transitoriamente as mãos dos trabalhadores da saúde; f) ser
transmitidos através das mãos contaminadas dos trabalhadores da saúde; g)
pequena dose infectante; h) apresentar relativa resistência aos desinfetantes usados
na higienização das superfícies inanimadas (WEBER et al., 2010).
Os patógenos nosocomiais que causam infecções podem ser transmitidos de
fontes endógenas ou exógenas. As fontes endógenas são aqueles microrganismos
provenientes da própria microbiota normal dos pacientes, enquanto que as
exógenas são microrganismos presentes no próprio ambiente hospitalar. Um
paciente pode se contaminar com sua própria microbiota durante o pós-cirúrgico, no
qual na maioria dos casos o médico administra drogas que suprimem o sistema
imunológico do paciente, permitindo assim a multiplicação do microrganismos e o
33
acesso ao mesmo a regiões mais internas do corpo humano (PELCZAR et al.,
1993). Superfícies animadas e inanimadas são fontes exógenas de infecção,
incluindo a equipe médica, outros pacientes, visitantes, comida/alimentos, água,
fômites, cateteres urinários, dispositivos intravenosos, equipamento respiratório e
próteses (PRESCOTT et al., 2005).
Os fatores de risco que fazem com que pacientes se tornem susceptíveis a
estas infecção incluem: infecções concomitantes, dispositivos protéticos, cirurgias,
agentes imunossupressores, administração de antibióticos de amplo espectro, e o
surgimento de patógenos multirresistentes aos antibióticos (PELCZAR et al., 1993;
COURVALAINE; WEBER, 2005). Outros fatores de risco incluem a idade do
paciente, o tempo de internação, doenças crônicas como diabetes mellitus, tumores
e a superlotação nos hospitais (PRESCOTT et al., 2005).
2.7 – Os principais patógenos no ambiente hospitalar
As infecções nosocomiais e a distribuição dos patógenos variam de acordo
com o cenário clínico, as características do paciente (diagnóstico primário,
multiplicas morbidades, realizado procedimento) e o cenário do cuidado com a
saúde (se possui terapia intensiva, unidade para queimados, e quais são os
cuidados destes estabelecimentos) e também por coorte (neonatal e adulta)
(ROBIN; McFEE, 2009).
A principal fonte de patógenos nosocomiais acredita-se ser de
microrganismos da própria microbiota do paciente, mas estima-se que de 20 a 40%
das infecções nosocomiais atribuem-se as infecções cruzadas, sendo que as mãos
dos profissionais da saúde são as principais vias de transmissão (WEINSTEIN,
1991). A contaminação das mãos dos profissionais da saúde podem resultar ou na
contaminação direta ou indireta de pacientes, ou de superfícies inanimadas do
hospital. A alternativa menos comum de se transmitir um patógeno é quando um
paciente pode se tornar colonizado com um patógeno hospitalar através do contato
direto com uma superfície ambiental contaminada (KRAMER; SCHWEBKE; KAMPF,
2006).
As bactérias que comumente causam infecções nosocomiais são os
Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, Acinetobacter spp.,
34
Staphylococcus coagulase-negativa, enterococos, Pseudomonas aeruginosa,
membros da família Enterobacteriaceae, como a Escherichia coli, Proteus mirabilis,
Salmonella spp., Serratia marcescens e Klebsiella pneumoniae (ESPOSITO;
LEONE, 2007; ZHANEL et al., 2008).
Dentre os cocos gram-negativos, os S. aureus são microrganismos
comumente encontrados na pele e na cavidade nasal da população (SANTOS, 2007;
MOURA et al., 2010). Essa colonização determina o estado de portador ou portador
assintomático, uma vez que a presença da bactéria no organismo do hospedeiro não
ocasiona lesões aparentes (CAVALCANTI et al., 2006). Mesmo sendo considerado
parte da microbiota normal do ser humano, em algumas condições o S. aureus pode
tornar-se patogênico e causar uma ampla variedade de infecções sendo o
responsável por diversas infecções nosocomiais e comunitárias. Tais episódios são
desencadeados pela ruptura da barreira cutânea ou queda da imunidade (GELATTI
et al., 2009). A relação entre colonização e infecção ainda não é compreendida em
sua totalidade, mas sabe-se que está associada a fatores intrínsecos do hospedeiro
e também à cepa de S. aureus que o mesmo está carreando (GORWITZ, 2008).
As infecções causadas por essa bactéria frequentemente acometem a pele, e
tecido subcutâneo, sendo muito comum sua associação com dispositivos e
aparelhos implantados, especialmente em pacientes cujo sistema imunológico
encontra-se debilitado, bem como em crianças e idosos. (CAVALCANTI et al., 2006).
Algumas dessas infecções têm caráter agudo e podem gerar focos metastáticos,
disseminando para outros tecidos. Há ainda o risco de infecções “mais graves”,
como: septicemia, pneumonia, osteomielite, endocardite, miocardite, pericardite,
meningite, abscessos musculares e cerebrais (GELATTI et al., 2009).
Cerca de um terço da população possui essa bactéria como parte da
microbiota transitória da pele (RAZERA et al., 2009) constituindo uma importante
fonte de infecção para o próprio indivíduo ou para outras pessoas (CAVALCANTI et
al., 2006). Estima-se que cerca de 11% a 43% dos pacientes colonizados adquirem
infecção (GELATTI et al., 2009). Já a transmissão de pessoa para pessoa pode
ocorrer por contato direto, sendo muito comum no ambiente hospitalar, onde os
trabalhadores da área da saúde podem contaminar suas mãos ao prestar
assistência a pacientes portadores persistentes ou manusear objetos colonizados e
35
subsequentemente transmitir o microrganismo para outros pacientes (CAVALCANTI
et al., 2006).
O Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é a principal causa
de infecções nosocomiais na América Latina, e sua prevalência em infecções
adquiridas na comunidade não para de crescer (RODRIGUEZ-NORIEGA; SEAS,
2010). Estima-se que, já na década de 90, 2,9% dos S. aureus isolados eram
resistentes à meticilina. Em 2000, a prevalência era de 19% e, três anos depois, em
2003 já era de 62,4% (RAZERA et al., 2009). Deve-se ressaltar também que as
infecções causadas por MRSA apresentam elevado índice de letalidade, muito
superior ao que ocorre em infecções estafilocócicas causadas por cepas não
resistentes (KLEVENS et al., 2007).
O aumento nas taxas da incidência e a recém-observada mudança no padrão
epidemiológico das cepas de MRSA, ao lado da dificuldade do tratamento das
infecções causadas por essa bactéria têm colocado a mesma em posição de
destaque dentre os microrganismos de importância médica e têm também feito dela
um verdadeiro desafio à saúde pública (MORAN et al., 2005; PRESCOTT et al.,
2005; MCCRAIG et al., 2006; SCHEIDER-LINDER et al., 2007; SALES; SILVA,
2012).
O S. epidermidis é a espécie mais frequentemente isolada de epitélio
humano, e colonizadores predominantemente das axilas, cabeça e narinas (OTTO,
2009). Como parte da microbiota do epitélio humano, o S. epidermidis
frequentemente tem uma relação benigna com o hospedeiro. Além disso, alguns
estudos propõem que este microrganismo apresenta função probiótica, prevenindo
assim colonizações de outros patógenos, tais como o S. aureus (LINA et al., 2003).
Entretanto, as infecções por o S. epidermidis e os mecanismos pelo qual o S.
epidermidis promove doenças tem se tornado amplamente estudado. Entre os
estafilococos coagulase-negativa, o S. epidermidis causa o maior número das
infecções (CARMODY; OTTO, 2004). Este microrganismo representa o mais
frequente agente causador de infecções de dispositivos médicos implantáveis, tais
como cateter venoso central ou periférico (ROGERS; FEY; RUPP, 2009), infecção de
sítio cirúrgico, artroplastias, válvulas cardíacas, dentre outras. Ao menos, 22% das
infecções na corrente sanguínea, aonde o paciente possui um biomaterial ou sofreu
36
uma cirurgia, o S. epidermidis é o responsável por tal enfermidade (O'GRAY et al.,
2002; CDC, 2004; ROGERS; FEY; RUPP, 2009).
A Klebsiella pneumoniae, também conhecida como bacilo de Friedländer, é
um bacilo gram-negativo, membro da família Enterobacteriaceae, encontrado em
locais como água, solo, plantas e esgoto. Sua colonização em seres humanos
provavelmente ocorre por contato com diversas fontes ambientais e pode ser
encontrada colonizando a orofaringe e no trato gastrintestinal de pessoas sadias, já
no organismo de pessoas imunocomprometidas esta bactéria encontra um ambiente
propício para o seu crescimento, levando aos quadros de infecção. Dentre as
espécias de Klebsiella conhecidas, além da K. pneumoniae, pode-se citar as
seguintes: K. oxytoca, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis, K. ornithinolytica, K.
planticola, K. terrigena. São anaeróbios facultativos ou aeróbios, fermentam um
grande número de carboidratos, possuem estrutura antigênica complexa e produzem
uma variedade de toxinas e de outros fatores de virulência (FARMER; KELLY, 1991;
PODSCHUM; ULLMANN, 1998; DESIMONI et al., 2004; MARTINEZ et al., 2004).
Algumas doenças, como cirrose, desordens do trato biliar, diabetes mellitus e o
alcoolismo, podem prejudicar as defesas do organismos e aumentar o risco de
infecções pela K. pneumoniae (TSAI et al., 2010)
A Escherichia coli, inicialmente chamada de “Bacterium coli commune”, foi
isolada pela primeira vez nas fezes de uma criança em 1885, pelo cientista Theodor
Escherich. Ela é uma bactéria gram-negativa, anaeróbia facultativa pertencente à
família Enterobacteriaceae (KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004). A grande maioria
dessas amostras é pertencente à microbiota intestinal, tanto de seres humanos
quanto de animais de sangue quente. No entanto, aproximadamente, 10% são
patogênicas, podendo causar infecções intestinais e infecções extraintestinais,
exemplo infecções nosocomiais, septicemia, infecções do trato urinário, dentre
outras (JOHNSON; RUSSO, 2005; KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004).
A Pseudomonas aeruginosa é um patógeno nosocomial frequente que é o
grande responsável por infecções em pacientes com fibrose cística, bronquiectasia,
neutropenia, Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA), e/ou queimados, e
pacientes com doenças metabólicas, hematológicas ou malignas (OBRITSCH et al.,
2004; YETKIN et al., 2006; LIPSKY et al., 2010; LEWIS et al., 2012; COETZEE;
37
RODE; HKAHN, 2013). Esta bactéria é predominantemente responsável por
pneumonias associadas à ventilação mecânica, infecção do sítio cirúrgico, infecção
do trato urinário e sepse em pacientes da unidade de terapia intensiva. A maioria
destas cepas são comumente resistentes a muitos antibióticos incluindo imipenem e
meropenem, com isso, são geralmente patógenos problemáticos na terapia. (NDIP
et al., 2005; LU et al., 2014). A P. aeruginosa é geralmente adquirida do ambiente,
raramente ocorre disseminação de pessoa a pessoa (ANTHONY et al., 2002). A
contaminação de equipamentos de cuidados respiratório, irrigação de soluções,
cateteres, infusões, cosméticos, soluções antissépticas, soluções desinfetantes, e
até mesmo no sabonete tem sido relatados como veículos de transmissão (PIER;
RAMPHAL, 2005; BERROUANE et al., 2000; DOUBIS et al., 2001).
Cepas patogênicas de E. coli podem causar diferentes formas de infecções
gastrintestinais. A P. aeruginosa é um comum patógeno hospitalar em infecções
como pneumonia, do trato urinário, infecções do sítio cirúrgico e infecções em
queimados. O S. aureus é comumente associado com infecções de pele e de
tecidos moles, infecções cirúrgicas, infecções do trato respiratório baixo e infecções
em neonatos (MCCRAING et al., 2006; PILOUT et al., 2005; PILOUT et al., 2007).
BARROS et al. (2012) realizaram um estudo para identificar a prevalência dos
principais microrganismos patogênicos em uma Unidade de Terapia Intensiva de um
hospital de Fortaleza (CE), Brasil. Seus resultados expressam que a P. aeruginosa
foi o principal patógeno isolado, logo em seguida o S. aureus, Acinetobacter sp.,
Enterobacter sp., E. coli e Klebsiella pneumoniae. Estes microrganismos
supracitados foram responsáveis por infecções graves, tais como: infecção
respiratório, sepse, infecção de sítio cirúrgico e infecção do trato urinário.
Praticamente qualquer patógeno encontrado no ambiente hospitalar pode ser
causador de uma infecção nosocomial. Entretanto, os mais frequentes causadores
destas enfermidades têm como alvo àqueles pacientes com o sistema imunológico
comprometido, ou com fatores de risco, bem como exposição aos antibióticos,
queimaduras, cirurgias ou traumas (SANDS; VINEYARD PLATT, 1996; MANIAN;
MEYER, 1997; ZEREY et al., 2007; ARONSON; SANDERS; MORAN, 2006; CDC,
2004).
38
Sem dúvidas, se tivéssemos que listar os principais patógenos hospitalares
mencionaríamos o Staphylococcus aureus, especialmente os resistentes a meticilina
(HEALTH STATISTICS, 2007; GRIFFIN, 2007). A proporção de S. aureus isolados
entre pacientes de unidades de terapia intensivas são que a resistência à meticilina,
oxacilina ou nafcilina é de aproximadamente 60% (ROBIN; McFEE, 2009).
O Staphylococcus aureus é um importante agente etiológico associado às
infecções adquiridas, tanto na comunidade quanto em hospitais, e que se tornou
um paradigma das infecções bacterianas. É considerado um dos principais
patógenos humanos, destacando-se por sua elevada frequência e patogenicidade
que o capacita a produzir doenças, tanto em indivíduos imunocomprometidos
quanto em hígidos e por sua fácil disseminação intra-hospitalar associada à
resistência aos antimicrobianos. (TOKARS et al., 2004; AMERICAN HOSPITAL
ASSOCIATION, 2004). A característica mais extraordinária do S. aureus é a sua
elevada capacidade de adquirir resistência aos antibióticos. Nenhuma outra
espécie bacteriana, com semelhante nível de virulência para o organismo humano,
apresenta tamanho grau de flexibilidade para suportar e sobreviver à terapia
antimicrobiana AMERICAN HOSPITAL ASSOCIATION, 2004; BURKE, 2004). Cerca
de 70% dos isolados de S. aureus de infecções hospitalares, nos principais hospitais
brasileiros, são resistentes à meticilina (CATÃO; FREITAS; SILVA; FEITOSA et.,
2013).
O mecanismo de resistência dos MRSA está relacionado à alteração de
proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) codificada pelo gene mecA. A presença da
PBP2a faz com que a meticilina e os compostos penicilina-penicilinase resistentes
(PPR) tenham baixa afinidade pelo local de ligação na bactéria, a parede celular e,
consequentemente, deixem de ser efetivos. O grupo PPR é composto pelas drogas:
oxacilina; meticilina; nafcilina; cloxacilina; e dicloxacilina (GOTIJO FILHO, 2006).
No Brasil, vários estudos tem demonstrado prevalência de infecções
hospitalares por S. aureus variando entre 17% a 26%, e aproximadamente 70% a
100% são causadas por amostras multirresistentes (OLIVEIRA; MARUYAMA, 2008;
MINISTÉRIO DA SAÚDE; 1998). De modo que, diante da disseminação de bactérias
multirresistentes, é necessária a adoção de programas de vigilância que envolvem,
entre outras medidas, a avaliação do perfil de sensibilidade dos isolados
39
empregando-se metodologias apropriadas e recomendadas por órgãos de referência
(MARQUES et al., 2008; MINISTÉRIO DA SAÚDE; 1998).
A Klebsiella pneumoniae tem demonstrado um aumento de 50% na taxa de
resistência das cefalosporinas de terceira geração. Outro patógeno bastante isolado
em infecções hospitalares é a Pseudomonas aeruginosa, ainda mais pela grande
quantidade de antibióticos intrinsecamente resistentes desta espécie (ROBIN;
McFEE, 2009).
A maioria das infecções hospitalares estão associadas com infecções do trato
urinário, do sítio cirúrgico, pneumonia, sepses e outras, incluindo infecções
gastrintestinais (KLENVENS et al., 2007). Cateteres uretrais são dispositivos que
apresentam um risco bem conhecido. Infecções no cirúrgico contabilizam mais de
240.000 relatos na “Vigilância Nacional de Infecções Nosocomiais”, de 1992 a 2004,
nos Estados Unidos da América. Existe também uma variação sazonal associados a
esses patógenos hospitalares (ROBIN; McFEE, 2009).
Embora os microrganismos causadores de muitas infecções nosocomiais
frequentemente são da microbiota normal do próprio corpo dos pacientes, o contato
com o ambiente hospitalar, onde os patógenos podem sobreviver em superfícies ou
instrumentos oferece um significante risco ao homem. O paciente interage com a
equipe médica, com os auxiliares e com os instrumentais médicos. Como os
pacientes se locomovem muito dentro do hospital e os períodos de internação são
cada vez mais curtos, muitos pacientes recebem alta (dispensa médica para retorna
a sua residência) enquanto estão assintomáticos, antes da infecção se tornar
aparente. Um grande desafio do controle da infecção encontra-se no fato de que
muitas infecções nosocomiais em pacientes hospitalizados originalmente surgem no
setor ambulatorial e só torna-se aparente (sintomática) após a alta do paciente
(ROBIN; McFEE, 2009).
Chikere et al. (2008) realizaram um estudo a fim de isolar e identificar os
principais patógenos da enfermaria de um hospital da Nigéria. De acordo com seus
resultados, foram isolados 39,2% de S. epidermidis, 28,5% de S. aureus, 8,9% de
Streptococcus sp., 7,1% de E. coli, 5,3% de K. pneumoniae, 3,5% de Proteus sp. e
3,5% de Enterobacter aerogenes. Sendo que o setor da enfermaria que apresentou
40
maior concentração de microrganismos foi a ortopedia. Abaixo, encontra-se uma
tabela sobre a distribuição dos isolados, por setor de enfermaria.
Bactéria isolada Ortopedia Pediatria Cirurgia Clínica
S. epidermidis 40,9% 22,7% 18,2% 18,2%
S. aureus 37,5% 37,5% 16,3% 18,7%
Streptococcus sp. - 20% 60% 20%
E. coli 50% 25% 25% -
K. pneumoniae 66,7% - - 33,3%
Proteus sp. 50% - 50% -
Enterobacter aerogenes - 100% - -
Bacillus cereus 100% - - -
Tabela 3 - Porcentagem dos isolados bacterianos encontrados na pesquisa de
CHIKERE et al., 2008.
As infecções do trato urinário representam a principal causa de infecção
nosocomial em nações industrializadas, enquanto que em países em
desenvolvimento os procedimentos invasivos são a principal causa (CHRISTENSON
et al., 2006; WENZEL, 2007; ROSENTHAL et al., 2009). As intervenções cirúrgicas
são uma das maiores fontes de infecções nosocomiais, com uma taxa de 1,2% a
23,6%, sendo que os principais patógenos causadores destas enfermidades nos
países em desenvolvimento são os S. aureus (20%), E. coli (18%) e outras
enterobactérias (LANCET, 2009; ALLEGRANZI et al., 2011; MAWALLA et al., 2011).
2.8 - A busca de novos materiais para reduzir a contaminação de superfícies e
as infecções hospitalares
A contaminação de equipamentos hospitalares, médicos e suprimentos de
água e alimentos com patógenos hospitalares é causa bem conhecida de fontes de
infecção nos estabelecimentos da saúde (VILLEGAS; HARTSTEIN, 2003; DANCER,
2009). Amplas orientações sobre prevenção e controle da contaminação são
disponibilizadas pelos fabricantes, especialistas, e departamentos de saúde, e há
41
frequentemente exigências legais com regulamentações de saúde e segurança. Em
contraste, o grau para qual a atual contaminação de superfícies do meio contribuem
para o desenvolvimento das infecções associadas a serviços de saúde não é clara,
e suas abordagens para o controle é incerta (OTTER et al., 2011).
A Tabela 4 abaixo, fornece uma visão global dos microrganismos mais
comumente discutidos na literatura, concentrando-se na estratégia de intervenção
por todo o ambiente hospitalar.
42
Tabela 4 - Patógenos, nichos ecológicos e significância clínica (ZIMRING et al., 2013).
PATÓGENOS NICHO
ECOLÓGICO NOS
HOSPITAIS
SOBREVIVÊNCIA
EM SUPERFÍCIES
INANIMADAS
PRINCIPAL MODO
DE TRANSMISSÃO
PAPEL DAS
SUPERFÍCIES
INANIMADAS
COMO FONTE DE
TRANSMISSÃO
EVIDENCIAS DE
QUE A
TRANSMISSÃO
PODE SER
ATENUADAS
ATRAVÉS DAS
SUPERFÍCIES
INANIMADAS
SURTOS
ASSOCIADOS
COM AS
SUPERFÍCIES
INANIMADAS
SIGNIFICÂNCIAS
CLÍNICAS DO
PATÓGENO NOS
HOSPITAIS
Staphylococcus
aureus, incluindo a
cepa resistente à
meticilina (MRSA)
Superfícies da pele
humana e mucosas;
Superfícies
inanimadas
De dias a meses Contato Modesta Algumas evidências
apresentam redução
com o melhoramento
da limpeza
Transmissão com
equipamentos
médicos reutilizáveis
Principal patógeno
associado aos
cuidados médicos;
causa de moderadas
a graves infecções,
incluindo as infecções
de sítio cirúrgico e
associados a
cateteres.
Enterococcus spp.,
incluindo as cepas
resistes a
vancomicina (VRE)
Cólon humano;
Superfícies
inanimadas
De dias a meses Contato Moderado Algumas evidências
apresentam redução
com o melhoramento
da limpeza
Transmissão com
equipamentos
médicos reutilizáveis
Pode causar uma
variedade de
infecções associadas
aos cuidados
médicos,
particularmente em
pacientes imuno-
comprometidos
Continuação da Tabela 4 - Patógenos, nichos ecológicos e significância clínica (ZIMRING et al., 2013).
43
Pseudomonas
aeruginosa
Água; cólon
humano
De dias a meses Contato Documentado em
surtos; papel
desconhecido no
cenário endêmico
Sim, em surtos. Torneiras e pias. Principal patógeno
associado a
infecções
relacionadas a
cuidados médicos;
frequentemente
associada com
pneumonia
associada a
ventilação mecânica
Mycobacterium
tuberculosis
Trabalhadores da
saúde; pacientes
com a doença ativa
Dias a meses Ar Relevante Sim, pode ser
reduzido com a
ventilação de
pressão negativa e
irradiação de luz
ultravioleta
Transmissão de
pacientes fonte em
hospitais sem
adequado controle
ambiental
Doenças
pulmonares e
extrapulmonares.
Acinetobacter sp. Água; superfícies;
pode colonizar a
pele e mucosas
humanas
De dias a meses Contato Documentado em
surtos; papel
endêmico
desconhecido
Sim, em surtos. Cortina; toalhas;
pias; torneiras e
sistema de
ventilação
Patógeno
principalmente
relacionado a
doenças
respiratórias;
pacientes com
ventilação
mecânica.
Continuação da Tabela 4 - Patógenos, nichos ecológicos e significância clínica (ZIMRING et al., 2013).
44
Os pacientes internados disseminam patógenos no meio, mas existe um
debate sobre a importância da contaminação da superfície resultando em um
possível fonte de transmissão. Desde 1950, o modelo dos hospitais e as práticas
higiênicas tem sido amplamente direcionada para o controle de patógenos
nosocomiais através do ar, das mãos, equipamentos e das superfícies (WILLIAMS et
al., 1966). Entretanto, nos anos 70 e no início dos anos 80 muitos estudos sugeriram
que o ambiente hospitalar tinha uma contribuição insignificante para a transmissão
de patógenos (WEBER et al., 1976; MAKI et al., 1982). Culturas rotineiras de
vigilância do ambiente hospitalar foram injustificáveis, e a importância das culturas
realizadas no hospital durante surtos infecciosos eram questionadas.
Consequentemente, após essas informações, as culturas de vigilância
reduziram em 3/4 nos hospitais dos Estados Unidos. De fato, naquela época o
Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) orientou os hospitais a
realizarem o processo de busca ativa no ambiente hospitalar somente durante o
surto infeccioso (SEHULSTER; CHINN, 2003). O CDC fez uma reavaliação sobre
essa informação e sobre o papel desempenhado por superfícies contaminadas na
transmissão de patógenos nosocomiais (DANCER, 2009; WEBER et al., 2010).
A transferência do patógeno de um paciente infectado ocorre frequentemente
através das mãos dos trabalhadores da saúde, mas objetivos contaminados,
superfícies e o ar podem ser diretamente ou indiretamente envolvidos na trajetória
da transmissão. Um exemplo encontra-se na Figura 1, onde é representado as
possíveis rotas de contaminação dos principais patógenos hospitalares (OTTER et
al., 2011).
45
Figura 1 – Rotas de transmissão de patógenos hospitalares. (MRSA –
Staphylococcus aureus resistentes à meticilina; VRE – Enterococos
resistentes à vancomicina; BGN – bacilos gram-negativos) (OTTER
et al., 2011).
Estima-se que 40-60% dos patógenos causadores de infecções relacionadas
à assistência à saúde em Unidades de Terapia Intensiva estejam relacionados a
própria microbiota do paciente; 20-40% infecção cruzada via mãos de profissionais
de/da saúde; 20-25% administração de antibióticos que resultam na alteração da
microbiota do paciente; 20% outras causadas (incluindo contaminação do ambiente
nosocomial) (WEBER; ANDERSON; RUTALA, 2013). Ao longo da última década, a
evidência científica substancial tem acumulado dados que a contaminação da
superfície ambiental (inanimada) das salas hospitalares desempenham um
importante papel na transmissão de vários patógenos-chave associados aos
cuidados da saúde, incluindo Clostridium difficile, Staphylococcus aureus resistente
à meticilina (MRSA), Enterococos resistentes à vancomicina (VRE), Acinetobacter
46
baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella sp. (VANDENBERGH et al., 1999;
BOYCE, 2007; WEBER et al., 2010; OTTER et al., 2011).
As evidências que sustentam o papel da contaminação das superfícies
ambientais na transmissão de patógenos-chave associados aos cuidados médicos
está resumido a seguir: I. A superfície ambiental nas salas de pacientes colonizados
ou infectados é frequentemente contaminado com o patógeno; II. O patógeno é
capaz de sobreviver na superfície das salas hospitalares e em equipamentos
médicos por um longo período de tempo; III. O contato com as superfícies das salas
hospitalares ou equipamento médico dos profissionais da saúde frequentemente
conduzem a contaminação das mãos e/ou das luvas; IV. A frequência na qual as
superfícies das salas hospitalares são contaminadas correlaciona-se com a
frequência das contaminação das mãos e/ou luvas dos profissionais da saúde; V. O
surto de cepas clones contaminando a superfícies das salas hospitalares de um
paciente colonizado ou infectado demonstra ser devido a transmissão pessoa a
pessoa ou compartilhamento de equipamentos médicos; VI. O paciente admitido em
uma sala previamente ocupada por um paciente colonizado ou infectado com um
patógeno (MRSA, VRE, C. difficile, Acinetobacter sp) tem uma maior probabilidade
de desenvolver colonização ou infecção com aquele patógeno; VII. O melhoramento
da limpeza no ambiente hospitalar conduz a uma diminuição da taxa de infecção
nosocomial; VIII. Melhoramento de desinfecção final (exemplo a vaporização por
peróxido de hidrogênio) conduz a uma diminuição na taxa de infecção em pacientes
subsequentemente admitidos a uma sala onde um ocupante (paciente) anterior
estava colonizado ou contaminado (WEBER et al., 2013).
Embora a transferência do patógeno, de um paciente colonizado ou infectado
a um paciente suscetível, pode ocorrer através da via de transmissão/disseminação
direta ou indireta, frequentemente ocorre via mãos dos profissionais da saúde,
superfícies ou equipamentos médicos contaminados (e menos comum, através da
água e ar). Estas vias de transmissão tem sido esquematizadas e estes modelos
fornece a base para desenvolver intervenções para interromper a transmissão
(RUTALA; WEBER, 2009; OTTER et al., 2011).
47
A proporção de superfícies hospitalares contaminadas com MRSA tem
variado de acordo com as publicações entre 1 a 27% das superfícies nos quartos
dos pacientes das enfermarias de hospitais, e poucos porcentos até a 64% nas
unidades de queimados (BOYCE, 2007). Um artigo de revisão reportou que de 7–
29% dos sítios ambientais de hospitais foram positivos nas áreas em que haviam
pacientes portadores do enterococos resistente à vancomicina (WEBER; RULATA,
2007).
A sobrevivência dos patógenos nosocomiais nas superfícies ambientais tem
sido revisada sistematicamente (HOTA, 2004; KRAMER; SCHWEBKE; KAMPG,
2006), como demonstrado na Tabela 5:
Tipo de bactéria Duração da persistência Referências
Acinetobacter sp. 3 dias a 5 meses JAWAD et al., 1996;
WENDT et al., 1997;
NEELY, 2000; WEBSTER
et al., 2000; MUSA et al.,
1990; GETCHELL-WHITE
et al., 1989.
Bordetella pertusis de 3 a 5 dias HAHN; ARVAND, 2001;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984.
Campylobacter jejuni Até 6 dias BOUCHER et al., 1998.
Clostridium difficile
(esporos)
5 meses KIM et al., 1981;
McFARLAND; STAMM,
1986.
Chlamydia pneumoniae;
Chlamydia trachomatis
Até 30 horas NOVAK et al., 1995;
FALSEY; WALSH, 1993.
Chlamydia psittaci Até 15 dias MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984.
Corynebacterium
diphtheriae
De 7 dias até 6 meses MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984; CROSBIE;
48
WRIGHT, 1941;
Corynebacterium
pseudotuberculosis
De 1 até 8 dias MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984; CROSBIE;
WRIGHT, 1941;
Escherichia coli 1,5 horas até 16 meses DICKGIESSER, 1978;
GUNDERMANN, 1972;
WILLIAMS et al.,
2005;,WILKS et al., 2005;
NEELY, 2000; SCOOT;
BLOOMFIELD, 1990;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984; MAULE,
2000; ABRISHAMI et al.,
1994; KAMPF et al., 1998.
Enterococcus sp.
(incluindo VRE e VSE)
De 5 dias até 4 meses NEELY; MALEY, 2000;
BALE et al., 1993; NEELY,
2000; NOSKIN et al., 1995;
WENDT et al.,, 1998.
Haemophilus influenzae Até 12 dias MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984.
Helicobacter pylori Até 99 minutos BOEHMIER et al., 1996.
Klebsiella spp. De 2 horas a 30 meses DICKGLESSER, 1978.
GUNDERMANN, 1972;
NEELY, 2000; SCOOT;
BLOOMFIELD, 1990;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984.
Listeria spp. De 1 dia a meses HELKE; WONG, 1994;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984; MIELKE;
HAHN, 2001.
49
Mycobacterium bovis Menos que 2 meses HIRAI, 1991;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984.
Mycobacterium
tuberculosis
1 dia a 4 meses SMITH, 1942;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984
Neisseria gonorrhoeae 1 a 3 dias ELMOS, 1977; PERES et
al., 1990;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984
Proteus vulgaris 1 a 2 dias MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984
Pseudomonas aeruginosa 6 horas a 16 meses DICKGLESSER, 1978;
GUNDERMANN, 1972;
NEELY, 2000; SCOOT;
BLOOMFIELD, 1990;
KAMPF et al, 1998;
GOULD, 1963; ,PANEGEA
et al., 2005.
Salmonella typhi 6 horas a 4 semanas MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984
Salmonella typhimurium 10 dias a 4,2 anos HELKE; WONG, 1994;
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984;
ROBERTSON, 1972.
Salmonella spp 1 dia SCOOT; BLOOMFIELD,
1990.
Serratia marcescens 3 dias a 2 meses DICKGLESSER, 1978 e
MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984
Shigella spp. 2 dias a 5 meses MISTSCHERLICH;
50
MARTH, 1984, NASS,
1977; ISLAM et al., 2001.
Staphylococcus aureus,
incluindo MRSA
7 dias a 7 meses NEELY; MALEY, 2000;
WAGENVOORT;
PENDERS, 1997;
GUNDERMANN, 1972;
SCOOT; BLOOMFIELD,
1990; KAMPF et al, 1998;
WAGENVOORT et al.,
200.
Streptococcus
pneumoniae
1 a 20 dias MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984
Streptococcus pyogenes 3 dias a 6 meses MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984
Vibrio cholerae 1 a 7 dias MISTSCHERLICH;
MARTH, 1984; BARUA,
1970.Tabela 5 - Persistência das bactérias clinicamente relevante em superfícies secas
inanimadas (KRAMER; SCHWEBKE; KAMPF, 2006).
Bactérias, esporos e vírus são disseminados de pacientes colonizados ou
infectados (e as vezes, pela própria equipe de saúde) no ambiente hospitalar. A
ampla variação relatada na frequência da contaminação ambiental pode ser
explicada por diversos fatores, incluindo a capacidade de se cultivar estes
microrganismos, metodologia de amostragem, a facilidade de contaminação (ou a
dificuldade de descontaminação) do ambiente hospitalar e se há um surto no
hospital no momento da busca ativa (OTTER et al., 2011).
Os pacientes são a primeira fonte de contaminação no ambiente hospitalar, e
as superfícies em volta destes pacientes são tocadas frequentemente pelos
profissionais da saúde e outros pacientes. Estas superfícies são conhecidas como
“superfícies altamente tocadas”, pois possuem uma maior frequência de
51
contaminação do que outros sitio (HAYDEN et al., 2008; HUSLAGE et al., 2010;
BOYCE et al., 1997; DUCKRO et al., 2005). Por exemplo, um estudo recente definiu
as superfícies altamente tocadas como os apoiadores da cama, superfície da cama,
cadeira de rodas dentre outros equipamentos que são comumente tocados por
diversas mãos (HUSLAGE et al., 2010). O desenvolvimento de uma compreensão
de quais sítios comumente são mais contaminados com patógenos pode conduzir a
prática de controle e de outras inovações (OTTER et al., 2011).
Áreas ao redor dos pacientes são frequentemente contaminadas com MRSA,
VRE e alguns bacilos gram-negativos (ex. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,
etc). Pacientes infectados disseminam mais patógenos do que aqueles que são
somente colonizados, e àqueles pacientes que estão com quadro de diarreia são
caracterizados com o que mais distribuem microrganismos no ambiente hospitalar
(BOYCE et al., 1994; BOYCE et al., 1997; BOYCE et al., 2007).
A contaminação de quartos de pacientes não colonizados ou infectados pelos
patógenos hospitalares tem sido relatada. Das amostras obtidas de sala de
pacientes não colonizados ou contaminados, 43% apresentavam presença de MRSA
na cama do paciente, 13% apresentaram VRE em todo o quarto. A contaminação
dos quartos de pacientes não infectados ou colonizados é mais comum do que se
imagina, além disso, favorece com que o microrganismo continue a ser disperso no
ambiente hospitalar (BOYCE et al., 1997; HARDY et al., 2006; DREES et al., 2008).
Em geral, pacientes colonizados ou infectados tem uma maior concentração de
microrganismos patogênicos, que podem contaminar as superfícies ao redor, do que
propriamente as superfícies sabidamente contaminadas (exemplo as superfícies
altamente tocadas) (BONTEN et al., 1996; FRENCH et al., 2004; DUCKRO et al.,
2005; SEXTON et al., 2006; BOYCE et al., 2007; ECKSTEIN et al., 2007; ROHR et
al., 2009). A concentração de VRE é aproximadamente 103 unidades formadoras de
colônia (UFC) em 50 cm2 na pele do paciente, enquanto que a concentração de VRE
e MRSA atingem 103 a 109 UFC/grama nas fezes (MAYER et al., 2003; BOYCE et
al., 2007; AL-NASSIR et al., 2008).
A presença de um patógeno na superfície não necessariamente representa
um risco de transmissão. Todavia, a dose infecciosas para a maioria dos patógenos
52
nosocomiais associadas a contaminações ambientais parece ser baixa. Por
exemplo, menos de 15 células de Staphylococcus aureus são suficientes para causa
uma infecção em uma lesão experimental (FOSTER; HUTT, 1960), menos de 1
UFC/cm2 de Clostridium difficile foi suficiente para causar doença em camundongos
(LAWLEY et al., 2010). Consideravelmente, apesar da baixa concentração de
contaminação nas superfícies, se compararmos com a pele de um paciente
contaminada por VRE e uma superfície contaminada pelo mesmo microrganismo,
ambas superfícies apresentam o mesmo risco de adquirir o VRE através do toque
das mãos ( DUCKRO et al., 2005; HAYDEN et al., 2008).
Kramer et al. (2006) investigaram a capacidade de sobrevivência dos
patógenos nosocomiais em diversas superfícies, e obtiveram como resultado que o
VRE, MRSA, espécies de Acinetobacter sp. e bacilos gram-negativos podem
sobreviver de 4-5 meses ou mais em superfícies secas.
Uma das alternativas de eliminação destes microrganismos é a limpeza e
desinfecção dessas superfícies. A limpeza é caracterizada como a remoção de
sujeiras (sujidades) e contaminantes de uma superfície, enquanto que a desinfecção
é a inativação dos patógenos (SEHULSTER; CHINN, 2003). Os microrganismos
variam nas suas resistências à desinfecção, com isso essas substâncias deve ser
escolhidos cuidadosamente para que haja completa eficácia (MCDONNELL;
RUSSELL, 1999). Além disso, o ambiente hospitalar é complexo e frequentemente
difícil à limpeza e o uso de agentes de limpeza que não são efetivos contra o
microrganismo alvo favorecem com que os patógenos sejam difundidos em outras
superfícies (MCDONNELL; RUSSELL, 1999; BARKER et al., 2004).
Além disso, diversos desinfetantes líquidos geram danos aos equipamentos,
especialmente os eletrônicos, e o materiais contendo cloro (ex. água sanitária) pode
corroer os metais. Os desinfetantes podem prejudicar potencialmente os usuários, e
a liberação (descarga) de resíduos biocidas e antibióticos no ambiente podem
favorecer a resistência de ambos. Por estas razões, alguns autores tem questionado
o uso rotineiro de desinfetante para descontaminação do ambiente hospitalar
(DETTENKOFER; BLOCK, 2005).
53
A limpeza e a desinfecção não são as melhores formas de erradicar
microrganismos de uma superfície. Exemplo disso, foram cultivados VRE de 71%
das superfícies desinfetadas após um surto pelo mesmo microrganismos
(ECKSTEIN et al., 2007). O MRSA foi cultivado em 66% das 124 superfícies limpas
com soluções desinfetantes. Já no caso dos vírus (WU et al., 2005) e da bactéria
Acinetobacter baumannii (CORBELLA et al., 1999), a desinfecção das superfícies se
mostrou efetiva.
Os profissionais da saúde tem frequente contato com as superfícies
ambientais das salas dos pacientes, fornecendo uma ampla oportunidade de
disseminar estes patógenos através das luvas e/ou mãos (HUSLAGE et at., 2010).
Consideravelmente, a contaminação das mãos com o MRSA tem sido demonstrada
ocorrer com igual frequência se os trabalhadores da saúde tem contato direto com o
paciente colonizado ou infectado ou através do simples toque da superfície
contaminada (STIEFEL et al., 2011).
O mais importante fator de risco pela contaminação das mãos e/ou luvas dos
profissionais da saúde com patógenos multirresistentes aos antimicrobianos tem
sido demonstrado através das culturas positivas do ambiente nosocomial e da
cultura das mãos desdes profissionais (MORGAN et al., 2012).
54
3 - OBJETIVOS
3.1 – OBJETIVO GERAL
O presente estudo teve como objetivo avaliar a citotoxicidade da liga Níquel-
Berílio quando em contato com diversas cepas bacterianas e com a linhagem celular
NCTC clone 929 (Cultura de Células do Tecido Conjuntivo de Camundongo).
3.1.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar qualitativamente a citotoxicidade da liga níquel-berílio, quando em
contato com cepas padrão de Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae e Pseudomonas aeruginosa, em
diferentes períodos de contato;
Quantificar as Unidades Formadoras de Colônia (UFC) das bactérias viáveis
após cada período de contato com a liga de níquel-berílio, para cada cepa
bacteriana;
Avaliar a citotoxicidade da liga de Níquel-Berílio em contato com a linhagem
celular NCTC Clone 929 (Célula de Tecido Conjuntivo de Camundongo);
55
4 – MATERIAL E MÉTODOS
4.1 – Materiais
4.1.1 – Corpos de prova da liga níquel-berílio.
Os corpos de prova de Ni-Be foram preparados por torneamento, a partir da
liga no estado bruto de fusão. Após a fusão, foram obtidos tarugos de uma polegada
de diâmetro e deles foram extraídos os corpos de prova. Estes apresentavam a
forma de discos com 10,0 mm de diâmetro e 3,0 mm de espessura, e foram
confeccionados no Laboratório de Transformação de Fase, do Professor Dr. João
Manuel Domingos de Almeida Rollo, na Universidade de São Paulo, campus São
Carlos.
Figura 2 – Demonstração dos corpos de prova da liga níquel-berílio.
4.1.2 – Microrganismos
Para realização deste experimento, foram utilizadas as seguintes cepas ATCC
(American Type Culture Collection):
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (1);
Staphylococcus aureus ATCC 25932 (1);
Pseudomonas aeruginosa - ATCC 27853 (1);
Klebsiella pneumoniae - cepa de campo(3).
Escherichia coli - ATCC 11775 (2).
56
(1) cepas ATCCs cedidas pelo Laboratório Especial de Microbiologia Clínica –
LEMC, da Faculdade Paulista de Medicina – UNIFESP, da cidade de São Paulo,
com autorização do Professor Dr. Antônio Carlos Campos Pignatari.
(2) Cepa ATCC cedida pela Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, do estado do
Rio de Janeiro.
(3) Cepa isolada e identificada no Laboratório de Microbiologia Clínica do
Laboratório de Análises Clínicas “Professor Antônio Longo”, do Centro de Referência
Diagnóstica, do Núcleo de Atendimento a Comunidade – NAC, da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP.
4.1.3 – Linhagem celular
Para realização deste experimento, foram utilizadas células provenientes da
linhagem NCTC clone 929, do Núcleo de Cultura Celulares do Instituto Adolfo Lutz.
4.1.4 - Meios de Cultura
Os meios de cultura utilizados para o cultivo bacteriano foram: caldo Mueller
Hinton (Mueller Hinton broth-MHb), ágar soja tríptica (Tryptic Soy Agar-TSA), caldo
soja tríptica (Tryptic Soy Broth-TSB). Todos foram preparados de acordo com as
instruções do fabricante.
4.1.4.1. - Ágar Mueller-Hinton
Infusão de carne bovina.................................................................300,0 g
Peptona ácida..................................................................................17,5 g
Amido...............................................................................................1,5 g
Água destilada...........................................................................1000,0mL
Hidratar de acordo com as especificações do fabricante em água ultra pura,
esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 121°C e dispensar como desejar.
4.1.4.2 – Agar de Soja Tríptica - Tryptic Soy Agar (TSA)
Peptona de Caseína........................................................................15,0 g
Peptona de soja................................................................................5,0 g
57
Cloreto de sódio...............................................................................5,0 g
Ágar................................................................................................15,0 g
Àgua destilada...........................................................................1000,0mL
Hidratar de acordo com as especificações do fabricante em água ultra pura,
esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 121°C e dispensar como desejar.
4.1.4.3 – Caldo de Soja Tríptica - Tryptic Soy Broth (TSB)
Peptona de Caseína.........................................................................17,0 g
Peptona de soja.................................................................................3,0 g
Glicose..............................................................................................2,5 g
Cloreto de sódio................................................................................5,0 g
Fosfato de potássio...........................................................................2,5 g
Água destilada............................................................................1000,0mL
Hidratar de acordo com as especificações do fabricante em água ultra pura,
esterilizar em autoclave durante 15 minutos a 121°C e dispensar como desejar.
5 – MÉTODOS
5.1 – Confecção dos corpos de prova da liga níquel-berílio
A liga metálica de níquel-berílio utilizada como base para confecção dos
corpos de prova é procedente da empresa Brush Wellman Engineering Materials,
localizada no Estado de Ohio, Estados Unidos da América, sendo sua composição
descrita na Tabela 6 abaixo:
Tabela 6 – Composição química da liga níquel-berílio testada no presente estudo.
Componentes % em pesoNíquel 97,18Berílio 2,30
Carbono 0,48Cobalto 0,04
58
Também são componentes da liga níquel-berílio traços de carbono (C), cobre
(Cu), ferro (Fe), silício (Si), estanho (Sn), alumínio (Al), zinco (Zn), cromo (Cr) e
chumbo (Pb).
No total, duzentos e sessenta corpos de prova foram confeccionados,
esterilizados em autoclave e armazenados assepticamente até o momento do uso.
5.2 – Preparo do inoculo bacteriano
As cepas S. aureus, S. epidermidis, E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa
encontravam-se armazenadas em freezer à -21ºC com Tryptic Soy Broth (TSB)
suplementado de glicerol. Antes de realizar o procedimento de preparo do inóculo,
os tubos foram retirados do freezer e deixados descongelar a temperatura ambiente.
Após o descongelamento, as cepas foram semeadas, individualmente, em
ágar de Soja Tríptica e as placas foram incubadas em estufa bacteriológica 35±2ºC
por 24 horas, para reativar as células bacterianas. Com auxílio de agulha
bacteriológica, cerca de quatro unidades formadoras de colônia foram transferidas
para 5,0 ml de TSB.
O meio TSB contido em tubos foi homogeneizado em vortex por 15 segundos,
a seguir a turvação monitorada por espectrofotômetro com comprimento de onda de
625nm. O branco foi padronizado com o caldo TSB esterilizado e ausente de
bactéria.
Ao atingir a absorbância entre 0,08 - 0,12 nm (109 Unidades Formadoras de
Colônia/ml), a suspensão bacteriana encontrava-se adequada para ser utilizada nos
próximos testes.
5.3 – Ensaio de sobrevivência microbiana sobre superfície metálica seca
O presente experimento foi realizado de acordo com a padronização de
ESPIRITO SANTO et al. (2010).
Para determinação da sobrevivência de S. aureus, S. epidermidis, E. coli, K.
pneumoniae e P. aeruginosa sobre a superfície seca do corpos de prova de níquel-
berílio estéreis (em autoclave), foram realizados cultivos de 24 horas dos
microrganismos supracitados e padronizado, por espectrofotometria, a concentração
59
de 109 Unidades Formadoras de Colônia ml-1. Uma amostra de 40 µl foi aplicada em
um swab e espalhado sobre a superfície do corpos de prova, como demonstrado na
Figura 3. A concentração aplicada sobre a superfície do corpos de prova foi,
aproximadamente, de 2,83±0,17µl (7% do total do volume), contendo 1,4 x 109
células (4,3% do número inicial de células aplicadas no cotonete). Esta discrepância
ocorre provavelmente devido a ligação das células as fibras de algodão do cotonete.
Entretanto, o número de células aplicadas aos corpos de prova possuí alta
capacidade de replicação.
Figura 3 – Momento da aplicação do swab contendo 109 UFC sobre a superfície do
corpos de prova da liga de NiBe.
Para identificação da resistência bacteriana sobre a superfície metálica de
níquel-berílio, aproximadamente 109 Unidades Formadoras de Colônia foram
aplicadas, em cada corpos de prova. O experimento foi realizado em triplicata para
cada microrganismos. Todas as amostras foram completamente secas dentro de 5
segundos após o contato com a superfície. Para evitar contaminação do ambiente
laboratorial, os corpos de prova foram introduzidos em placas de Petri, à
60
temperatura de 23±2ºC, em diversos períodos de incubação (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24,
72 horas), como demonstrado na Figura 4.
Figura 4 – Após a inoculação das UFC, os corpos de prova eram colocados em
placas de Petri estéreis e deixados a temperatura ambiente por 1, 3, 6, 9, 12, 18, 24
e 72 horas.
Após cada período de incubação, os corpos de prova eram retirados das
placas de Petri e então carimbados diretamente, em dez locais diferentes, no meio
61
de cultura sólido (Agar Mueller-Hinton), como descrito nas Figuras 5, e as placas
eram incubadas em estufa bacteriológica por 24 e 48 horas de incubação, a 35±2ºC.
Após os períodos de incubação, a liga NiBe era classificada como antibacteriana se
10 ou menos UFCs se desenvolvesse, e com 11 ou mais UFC, sem propriedades
antibacterianas. A liga apresenta efeito antimicrobiano, caso após 24 e 48 horas de
incubação.
Figura 5 – Após cada período de exposição a temperatura ambiente, retirava-se os
corpos de prova da placa de Petri e aplicava-se o mesmo sobre a
superfícies do Agar Mueller-Hinton, em dez locais diferentes. Realizado
este procedimento, os meios de cultura eram incubados em estufa
bacteriológica, a 35±2ºC, por 24 e 48 horas.
5.4 – Cultura celular
O presente ensaio fora realizado pelo Núcleo de Cultura Celulares – NCC, do
Instituto Adolfo Lutz, da cidade de São Paulo – SP.
Para a realização do teste de citotoxicidade da liga NiBe, foi utilizada a
linhagem celular NCTC clone 929 (ATCC-CCL 1), células de tecido conjuntivo de
camundongos, do Seção de Culturas Celulares do Instituto Adolfo Lutz.
62
A linhagem celular NCTC clone 929 foi cultivada em meio mínimo de Eagle
(MME), suplementado com 0,1 mM de aminoácidos não essenciais, 1,0 mM de
piruvato de sódio e 10% de soro fetal bovino (SFB), sem antibiótico (MME com 10%
de SFB) (CRUZ, 2003).
A manutenção destas linhagens foi feita a 36ºC, em garrafas de 75cm2 ou 250
ml e repiques com intervalos médios de 72 horas. A dispersão da monocamada
celular foi efetuada utilizando uma associação de tripsina 0,20% e versene 0,02%
(ATV). Após a dispersão, as células foram novamente suspensas nos seus
respectivos meios de cultura e distribuídas em placas de Petri, que foram utilizadas
durante a realização dos ensaios de citotoxicidade (PAUL, 1975; FRESHNEY, 1987;
DOYLE, GRIFFITHS; NEWVELL, 1994).
5.4.1 Método de Difusão em Agar
As células foram semeadas em volumes de 5 mL em placas de Petri
(60x15 mm), na concentração de 3,0x105 céls/ml para as linhagens NCTC - clone
929. A incubação foi realizada por 48 horas a 37ºC em atmosfera úmida contendo
5% de CO2. Após este período, com a monocamada de células já formadas, o
meio de cultura foi desprezado e adicionado volume de 5ml de meio overlay, em
cada placa de Petri. Este meio é composto de partes iguais de MME duas
vezes concentrado e ágar (BBL-Becton Dickinson) a 1,8% contendo 0,01% de
vermelho neutro (Merck), como corante vital. No momento do uso o ágar foi
fundido e misturado com o MME, ambos à temperatura de 44 ± 1ºC. (GUESS et al.,
1965; USP 22, 1990; ISO, 1992).
Como controles positivos foram utilizados fragmentos de látex e como
controles negativos discos de papel de filtro, respeitando a dimensão de 0,5 cm de
diâmetro para ambos. As amostras foram avaliadas em triplicata.
Os corpos de prova da liga de Níquel-Berílio foram colocadas diretamente
sobre esse meio de cobertura e as placas incubadas por 24 horas, e este
procedimento foi realizado em quadruplicata.
As placas foram analisadas macroscópica e microscopicamente e a
citotoxicidade foi constatada pela presença de um halo claro sob ou ao redor da
63
amostra testada. A partir da medida da toxicidade, os índices de zona foram
graduados em:
Índices de Zona Descrição Classificação0 Nenhum zona sob ou ao redor da amostra Nenhuma1 Alguma alteração ou degeneração celular sob a amostra Fraca2 Zona limitada sob a amostra Leve3 Zona entre 0,5 – 1,0 cm ao redor da amostra Moderada4 Zona maior que 1,0 cm ao redor da amostra Severa
Tabela 7 – Descreve e classifica o teste de citotoxicidade da amostra NiBe.
O ensaio celular supracitado foi realizado em quadriplicata de quatro corpos
de prova distintos, em placas separadas, perfazendo um total de 16 (dezesseis)
testes para confirmar o potencial citotóxico da liga de níquel-berílio. Ensaio realizado
no laboratório do Núcleo de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz.
5.5 – Análise Estatística
Os dados foram expressos como média desvio padrão (sd). A análise
estatística foi realizada com o software QtiPlot (versão 0.9.8.9, LINUX).
64
6 – RESULTADOS
6.1 - Sobrevivência bacteriana sobre superfície da liga níquel-berílio.
6.1.1 - Análise qualitativa da capacidade citotóxica da liga níquel-berílio em
relação à sobrevivência bacteriana, após diferentes períodos de exposição.
Tabela 8 – Representação qualitativa do potencial de toxicidade da liga de níquel-
berílio as cepas bacterianas testadas de acordo com os períodos de exposição.
Microrganismostestados
Desenvolvimento bacteriano após o tempo de exposição a liga deNiBe.
1
hora
3
horas
6
horas
9
horas
12
horas
18
horas
24
horas
72
horas
P. aeruginosa
(ATCC 27853)
- - - - - - - -
K. pneumoniae
(cepa de campo)
- - - - - - - -
S. epidermidis
(ATCC 12228)
+ + + + + - - -
S. aureus
(ATCC 29213)
+ + + + - - - -
E. coli
(ATCC 11775)
+ + + - - - - -
Legenda: (+) crescimento bacteriano de ≥11 UFC; ( - ) Crescimento de bacteriano de ≤10 UFC.
6.1.2 - Quantificação de Unidades Formados de Colônia (UFC) de
Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli, S. aureus e S. epidermidis
sobreviventes a liga níquel-berílio, após os períodos de exposição.
A quantificação de UFCs sobreviventes, dos microrganismos testados, a liga
de níquel-berílio estão representadas na Tabela 9, abaixo:
65
Tabela 9 – Média e desvio padrão da representação quantitativa de UFC de
Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli, S. aureus e S. epidermidis
sobreviventes ao contato com a superfície de níquel-berílio, após os períodos de
exposição:
Microrganismostestados
Média das UFCs sobreviventes após o tempo de exposição a liga deNiBe, com desvio padrão.
1 h 3 h 6 h 9 h 12 h 18 h 24 h 72 h
P. aeruginosa(ATCC 27853)
6 0 0 0 0 0 0 0
K. pneumoniae(cepa de campo)
1 0 0 0 0 0 0 0
E. coli(ATCC 11775)
341±18
361±14
156±8 0 0 0 0 0
S. aureus (ATCC 29213)
550±56
287±3
246±70 17±2
0 0 0 0
S. epidermidis(ATCC 12228)
660±56
409±8 273±17
126±24
62±21 0 0 0
6.1.3 – Imagens das UFCs recuperadas de Pseudomonas aeruginosa, K.
pneumoniae, E. coli, S. aureus e S. epidermidis, após seus respectivos
períodos de exposição a liga NiBe.
66
6.1.3.1 – Pseudomonas aeruginosa.
Abaixo, estão representados nas figuras, as UFCs sobreviventes após cada
período de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72h) da P. aeruginosa com a liga NiBe.
1H 3H
6H 9H
12H 18H
24H 72H
67
6.1.3.2 – Klebsiella pneumoniae.
Abaixo, estão as figuras das UFCs sobreviventes após cada período de
exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72 horas) da K. pneumoniae com a liga NiBe.
1H 3H
6H 9H
12H 18H
24H 72H
68
6.1.3.2 – Escherichia coli.
Abaixo, estão representados nas figuras as UFCs sobreviventes após cada
período de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72 horas) da E. coli com a liga NiBe.
1H 3H
6H 9H
12H 18H
24H 72H
69
6.1.3.3 – Staphylococcus epidermidis.
Abaixo, estão representados nas figuras as UFCs sobreviventes após cada
período de exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72 horas) do S. epidermidis com a liga.
1H 3H
6H 9H
12H 18H
24H 72H
70
6.1.3.4 – Staphylococcus aureus.
Abaixo, estão representados as UFCs sobreviventes após cada período de
exposição (1, 3, 6, 9, 12, 18, 24 e 72 horas) da S. aureus com a liga NiBe.
1H 3H
6H 9H
12H 18H
24H 72H
71
6.1.4 – Representação gráfica das UFCs sobreviventes após cada período de
exposição a liga NiBe.
Figura 11 – Representação gráfica da média e desvio padrão das UFCs
sobreviventes de Pseudomonas aeruginosa, K. pneumoniae, E. coli, S. aureus e S.
epidermidis, após cada período de exposição a liga NiBe.
6.2 – Determinação da citotoxicidade da liga níquel-berílio através do teste
realizado com a linhagem celular NCTC 929.
De acordo com o teste de citotoxicidade realizado no Instituto Adolfo Lutz, a
Tabela 10 expressa a liga metálica de níquel-berílio quando em contato com as
células de conjuntiva de rato, pelo período de incubação de 24 horas.
72
Tabela 10 – Índice de zona (IZ) obtido da cultura celular NCTC 929 após contato de
24 horas com a liga de níquel-berílio.
Descrição da Amostra Testada Índice de zona obtido após a leitura dasplacas de culturas celulares
Liga de níquel-berílioNº1 Nº2 Nº3 Nº4IZ IZ IZ IZ0 0 0 0
Controle negativo (papel de filtro) 0 0 0 0Controle positivo (fragmentos de látex) 4 4 4 4
No ANEXO A, encontra-se o laudo emitido pelo Núcleo de Cultura Celular do
instituto Adolfo Lutz, contendo as informações supracitadas.
73
7 – DISCUSSÃO
Os microrganismos podem persistir nas superfícies por longos períodos de
tempo (dias a meses), dependendo das propriedades biológicas do organismos, da
presença de matéria orgânica ou da umidade da superfície, além das condições
ambientais e do tipo da superfície. Enquanto a contaminação das superfícies
ambientais persistirem, os microrganismos sobrevivem por variáveis períodos de
tempo (ZIMRING et al., 2013).
O níquel não é muito bem conhecido pela população e a sua principal
utilidade está na preparação de ligas. As ligas de níquel são conhecidos por sua
elevada resistência ao aquecimento e a corrosão. Estas propriedades fazem com
que o níquel seja amplamente utilizado na indústria, como processamento de
alimentos. As ligas de níquel também são comumente utilizadas como dispositivos
médicos (marca-passo, implantes ortopédicos, agulhas, instrumentos cirúrgicos e
etc). Um dos principais produtos da corrosão do aço inoxidável é o níquel, e a
bactéria pode entrar facilmente em contato com esse íon. As ligas de níquel são
requeridas para assegurar que o produto ou implante permaneça livre de
contaminações (HERTEL et al., 2005).
Tornou-se comum encontrar evidências na literatura científica que relatam
microrganismos capazes de tolerar a presença de componentes tóxicos. Nestes
casos, os principais relatos são referentes as cepas E. coli e P. aeruginosa, que são
muito bem estudadas no momento. A sobrevivência bacteriana quando em contato
com íons tóxicos é dependente dos mecanismos de resistência e tolerância. A
resistência de uma determinada bactéria a estes compostos tóxicos dependem de
cinco principais estratégias: i) bomba de efluxo; ii) sequestro do componente tóxico;
iii) redução da permeabilidade da membrana bacteriana; iv) alteração enzimática
para uma forma menos tóxica, e; v) redução da sensibilidade da célula alvo
(BRUINS et al., 2000). Estes mecanismos de resistência descritos acima permitem
ocorrer o crescimento bacteriano mesmo em altas concentrações de um antibiótico
ou de um metal. Em contraste com a resistência, algumas células são capazes de
sobreviver ao ataque dos metais tóxicos ou de antibióticos sem expressarem ou
74
usarem estes mecanismos de resistência citados. Contudo, essas células, são
mencionadas como células persistentes ou dormentes, e não possuem capacidade
de se dividir (LEWIS, 2007).
A aderência das bactérias as superfícies industriais e hospitalares podem
levar a uma infecção, ou contaminação, e/ou a destruição (perda de função) destes
materiais (GANESH; ANAND, 1998; MANGRAM et al., 1999; VIDELA, 2002). A
prevenção da aderência bacteriana as superfícies metálicas é o melhor método de
solucionar estes problemas. Pesquisas em materiais antimicrobianos resultou na
produção de diversos materiais como os plásticos antibacterianos (VAN HEERDEN
et al., 2009), cerâmicas antibacterianas (VITALE-BRAVARONE et al., 2008), roupas
antibacterianas (CHUN et al., 2009), e aços inoxidáveis contendo prata e cobre
(OKUBO et al., 1998; YOKOTA et al., 1998).
O uso destes materiais antibacterianos tornou-se significativo por exemplo
nas indústrias alimentícias (GANESH; ANAND, 1998), nos hospitais (MANGRAM et
al., 1999), e nos asilos. Nos hospitais, o uso dos materiais com ação antibacteriana
auxilia reduzir as infecções nosocomiais (SHIERHOLZ et al.,1998; MANGRAM et al.,
1999). Em muitas indústrias, o uso de materiais antibacteriano auxiliam prevenir a
deterioração do material pela bactéria, pois a mesma é reconhecida como a principal
causa de danos nestes materiais (YASUYUKI et al., 2010).
A composição química da bactéria demonstra a presença de macro e
micronutrientes. Os principais elementos presentes nas bactérias incluem carbono,
hidrogênio, oxigênio, fósforo e enxofre. Se excedidos, esses elementos que são
considerados essenciais a estes microrganismos, tornam-se tóxicos. O mesmo
ocorre com os metais prata, cobre e chumbo que são conhecidos como tóxicos
SHIERHOLZ et al.,1998). Todavia, existem algumas atividades do metabolismo
destes microrganismos que necessitam da presença de metais, como por exemplo,
a produção de uma substância extracelular polimérica pelas bactérias, envolvem o
processo de captação e acumulação intra e extracelular de metais pesados do meio
(GUTNICK; BACH, 2000; TIAN, 2008). Nies (1999) revisou a acumulação dos metais
nas bactérias, seus impactos e os mecanismos de resistência que esses
microrganismos possuem. Com isso, o pesquisador concluiu que a acumulação de
75
íons metais afetam os microrganismos de duas formas: direta e indireta. Os íons
metais dissolvidos afetam diretamente as bactérias através da incorporação deste
íons durante o processo de multiplicação, onde as proteínas que estão sendo
produzidas tornam-se não funcionais ou não conseguem realizar totalmente suas
funções (mau funcionamento). Por outro lado, a dissolução dos íons metais no meio,
resultado na formação de radicais livres no qual afetam diretamente a bactéria,
resultando na ruptura da parede celular, acometendo assim, na morte da mesma.
No presente estudo, ao analisar os resultados apresentados na Tabela 9,
observou-se uma maior resistência das bactérias, classificadas como gram-positivas
(S. aureus e S. epidermidis) a liga de níquel-berílio onde foram capazes de
sobreviver até 9 horas em contato com o material, quando comparadas as gram-
negativas (K. pneumoniae, E. coli e P. aeruginosa) que apresentaram resistência ao
metal somente até a primeira hora do teste (P. aeruginosa), enquanto que as demais
(K. pneumoniae e E. coli) não sobreviveram com uma hora de contato com a liga.
Com base na classificação de Gram destes microrganismos, nossos estudos não
corroboraram com os de YASUYUKI et al. (2010), onde utilizou-se bactérias gram-
positivas e gram-negativas para testar a tolerância (resistência) das bactérias frente
ao titânio, cobre, níquel, zinco, zircônio, molibdênio, estanho e chumbo, e concluíram
que é muito importante a utilização de cepas com espessuras diferentes de
peptídeoglicano, pois as bactérias apresentam diferentes níveis de tolerância aos
íons metal e estas diferenças podem ser atribuídas a este constituinte da parede
celular das bactérias. Todavia, no estudo supracitado, os autores informam que
mesmo conhecendo a maior vulnerabilidade apresentadas pelas bactérias gram-
negativas quando comparadas com as gram-positivas, não encontraram diferença
significante da resistência entre a cepa de E. coli e a de S. aureus aos metais
testados. Entretanto, YASUYUKI et al. (2010) concluíram que o níquel puro
apresenta excelente propriedade antibacteriana contra as E. coli, bem como, o S.
aureus, e que este metal pode ser considerado um bom candidato para ser
incorporado aos materiais antibacterianos. Contudo, os quando analisados os
resultados da presente pesquisa com os de ISOBE (2001), constatamos dados
concordantes no que se refere a maior resistência (tolerância) das cepas gram-
76
positivas quando comparadas as gram-negativas. O pesquisador acrescenta que as
bactérias gram-positivas possuem uma camada mais espessa de peptídeoglicano
(50-60µm) sobre a membrana, e esta camada é responsável por auxiliar a bactéria a
superar a tensão física superficial (ISOBE, 2001). Este camada da parede celular
bacteriana é também responsável por reduzir a penetração dos íons metais tóxicos.
Entretanto, as bactérias gram-negativas possuem uma camada fina de
peptídeoglicano sobre várias camadas da membrana celular. Estes microrganismos,
apresentam porinas na membrana externa da bactéria que age como canais para
substâncias de baixo peso molecular entrar no célula, exemplos os metais
(MADIGAN et al., 2009).
GOULD et al. (2009) relatam que infecções hospitalares por bactérias gram-
positivas e gram-negativas são os principais problemas no ambiente nosocomial. E
este fator é mais intensificado pelos microrganismos que apresentam elevado
potencial de desenvolver resistência aos antibióticos, como no caso, S. aureus, P.
aeruginosa, K. pneumoniae e E. coli (LEUTENBACH; POLK, 2007).
Em um ambiente hospitalar, os principais locais de contaminação de
microrganismos potencialmente infeccioso são superfícies inanimadas que podem
ser tocadas pelo homem, exemplo: maçanetas de portas, puxadores (de gavetas,
armários), torneiras, entre outros. Estes, deveriam ser compostos por materiais com
propriedades antimicrobianas a fim de evitar transmissões diretas ou indiretas. A
escolha do aço inoxidável para estes materiais resulta em sua durabilidade,
facilidade em limpeza, bem como a ausência de manchas que podem fazer com que
a superfície aparente não estar limpa. Entretanto, uma revisão literária recente
concluiu que importantes microrganismos, como gram-positivos (Staphylococcus
aureus resistente a meticilina - MRSA, e o Enterococcus vancomicina resistente -
VRE) e gram-negativos (Acinetobacter spp., E. coli e P. aeruginosa), tem sobrevivido
a superfície do aço inoxidável por logos períodos de tempo (KRAMER et al., 2006).
Essas superfícies, que não são capazes de eliminar os patógenos com o tempo,
podem atuar potencialmente como reservatórios para transferir estes
microrganismos aos funcionários da área da saúde, pacientes e membros de suas
família. Ultimamente, os trabalhadores da saúde lideram como agentes
77
responsáveis pela transmissão de microrganismos patogênicos aos pacientes (OIE
et al., 2002).
Há um crescimento evidente de que as fontes/superfícies ambientais de um
hospital ser como um importante meio de transmissão dos patógenos. Por exemplo,
estudos moleculares mostraram que os mesmos organismos que contaminavam o
ambiente podiam causar infecções hospitalares e eram encontrados em diversos
pacientes do mesmo hospital (ZIMRING et al., 2013).
Muitos estudos demonstraram que quando foram realizadas culturas dos
materiais metálicos provenientes de ambiente hospitalar, o aço inoxidável
demonstrou não ter efeito antimicrobiano sobre um período de seis horas
(FAÚNDEZ et al., 2004; NOYCE et al., 2006 (a); NOYCE et al., 2006 (b);
AIREY;VERRAN, 2007; MEHTAR et al., 2008; WEAVER et al., 2008). Todavia, se
compararmos esses dados com os obtidos neste estudo, observamos uma redução
da concentração dos microrganismos testados desde a primeira hora de incubação
(60 minutos). Com 9 horas de contato, constatamos a inibição total do crescimento
da E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae. Sendo que a P. aeruginosa apresentou
crescimento apenas na primeira hora, e mesmo assim, resultou em uma cultura de
apenas 9 UFC após 24 e 48 horas. Mediante ao protocolo padronizado por
ESPIRITO SANTO et al. (2010), um material metálico é considerado com ação
antimicrobiana quando o valor obtido de uma cultura de 48 horas é menor ou igual a
10 UFC, caracterizando assim, a liga de níquel-berílio com ação antibacteriana para
as três bactérias mencionadas anteriormente.
ESPIRITO SANTO et al. (2010) realizaram pesquisa para analisar a
resistência bacteriana ao cobre, uma vez que este íon (encontrado nas moedas)
entra facilmente em contato com as bactérias da microbiota da pele, e sabe-se que a
pele apresenta um ampla variedade de microrganismos. Dentre as 115 cepas
isoladas da superfície de moedas (contendo cobre e níquel), as que apresentaram
maior resistência foram Pseudomonas sp. (sua sobrevivência variou de 1 hora até
48 horas), S. epidermidis (que variou de 1 hora de sobrevivência até 24 horas), o
Staphylococcus warnerii (demonstrou capacidade de sobreviver a liga por 48 horas).
Os autores comentam que identificar e isolar microrganismos com certo potencial de
78
resistência (de 1 ou 2 dias) quando em contato com a liga de cobre-níquel é
considerado preocupante, uma vez que a utilização prolongada de materiais de
contato com atividade bacteriana não somente seleciona as cepas resistentes, mas
também favorece a coseleção de genes que codificam resistência a diversos
antibióticos. Os autores sugerem que deve-se incentivar mais pesquisas para
desenvolver novos materiais que possuam superfícies antibacterianas, assim,
aumentaria as opções de usos e poderia ocorrer uma diminuição da resistência
microbiana a alguns metais, uma vez que estes (níquel, cobre e aço inoxidável) são
amplamente utilizados.
A utilização incessante do cobre como material com ação antimicrobiana
resultou no surgimento de genes de resistências plasmidiais e cromossomais em
diversos tipos de bactérias. Encontra-se descrito o isolamento e identificação de
genes de resistência cromossomais (copA e copB) nos Enterococcus sp. (gram-
positivo), que determina respectivamente a absorção (na quantidade adequada) e o
efluxo (da quantidade excedida) do íon (ODERMATT et al., 1993). Todavia, outros
genes plasmidiais que codificam resistência ao cobre também foram descritos em
bactérias (gram-negativas), tais como a E. coli (genes pcoABCDE) e a
Pseudomonas sp. (genes copABCD, copR e copS) (BROWN et al., 1994; BROWN et
al., 1995; COOKSEY, 1993; COOKSEY, 1994). Por não haver relatos da utilização
da liga de níquel-berílio na literatura, acredita-se que não exista, até o presente
momento, relatos de resistência bacteriana (nem plasmidial e nem cromossomal) a
estes íons associados.
HARRINSON et al. (2004) executaram a análise da suscetibilidade das cepas
E. coli, P. aeruginosa (ATCC 27853) e do S. aureus (ATCC 29213) formadoras de
biofilme quando em contato com 17 diferentes compostos metálicos, após 24 horas
de incubação. De acordo com os resultados obtidos, a Pseudomonas aeruginosa
após formar biofilme, aumentou em 100 vezes a sua capacidade de resistência a 14
metais. De todas as bactérias testadas, tanto as células do biofilme, quanto as
células planctônicas, demonstraram alta toxicidade quando em contato com o níquel
(mesmo em baixas concentrações) presente no meio de cultura. ESPIRITO SANTO
et al. (2008), comentam que há um contraste de comportamento bacteriano quando
79
o teste é realizado com a intenção de analisar a toxicidade do metal em um ensaio
experimental de formação de biofilme, com um ensaio de toxicidade de superfície
seca (ou que rapidamente se seca). Os autores comentam que em uma superfície
de contato, a bactéria não possui tempo para captar a quantidade adequada de
nutrientes, se multiplicar e formar biofilme. Muito pelo contrário, ela passa por um
estresse nutricional e fisiológico, e as condições as condições de sobrevivência são
diferentes daquelas oferecidas em um sistema aquoso. Com isso, uma bactéria
pode apresentar resistência a um determinado metal, quando em meio líquido, e
outra tolerância em superfície seca. Os autores demonstram que uma cepa de E.
coli demonstrou-se ser suscetível a íons cobre dissolvidos em solução aquosa,
todavia, quando em contato com o corpo-de-prova de cobre (99% puro), a bactéria
demorou 24 horas para ser lisada.
MACOMBER e HAUSINGER (2011) relatam o efeito tóxico do níquel em
diversas células, e informam que basicamente o níquel pode agir em quatro
atividades metabólicas da bactéria: 1) o níquel substitui o metal essencial das
metaloproteínas bacterianas (muito estudado no caso das Pseudomonas sp. quando
em presença de íons metal); 2) o níquel se liga a enzimas que não toleram a
presença do íon metal (ocorre com grande frequência com a E. coli); 3) o níquel liga-
se a sítios externos de uma enzima e inibe sua função; 4) a presença do níquel leva
a célula (bacteriana ou de humanos) a um estresse oxidativo que afeta a síntese de
proteínas, DNA ou lipídeos. Este último fator está intimamente correlacionado a
citotoxicidade do níquel e sua contribuição a carcinogênese em humanos. Nossos
resultados são concordantes com as informações fornecidas pelos pesquisadores,
uma vez que observamos o efeito citotóxico nas células bacterianas, onde de acordo
com o tempo, reduziu-se a concentração (morte celular) das bactérias que estavam
em contato com o corpo-de-prova de níquel-berílio. Todavia, quando analisado o
teste de citotoxicidade da liga de níquel-berílio quando em contato direto com as
células NCTC clone 929 (células de tecido conjuntivo de camundongos), ficou
demonstrado que a liga estudada não apresenta qualquer efeito citotóxico do
material (índice de zona igual a zero em todos os dezesseis testes realizados). Não
há relatos na literatura científica sobre alguma análise da citotoxicidade da liga
80
níquel-berílio. A pouca informação que conhecemos é referente a citotoxicidade do
berílio (quando em elevadas concentrações) quando em contato prolongado com as
células humanas, podendo causar diversos tipos de câncer.
É importante relatar que independente do material (antibacteriano ou sem
nenhum eficácia contra esses e outros microrganismos) utilizado nos ambientes dos
estabelecimentos de saúde, algumas estratégias de prevenção não devem ser
descartadas, como a descontaminação destas superfícies e a permanente
higienização das mãos dos trabalhadores das saúde (TRIANDAFILLU et al., 2003).
Pacientes colonizados com bactérias multirresistentes apresentam 73% de
probabilidade de contaminar o ambiente do quarto em que se encontra, e 69% de
colonizar outros pacientes do mesmo hospital, através das mãos dos trabalhadores
da saúde (BOYCE et al., 1997).
Ao pesquisar bibliotecas online no mundo todo e periódicos científicos
disponíveis, foi possível encontrar somente duas referências de ligas de cobre que
utilizam os íons níquel e/ou berílio em sua composição. De acordo com um site de
patentes dos Estados Unidos da América, a liga patenteada C17510 (Beryllium
Copper) registrada na Agência de Proteção Ambiental (Environmental Protection
Agency – EPA) dos EUA, é composta por 98,7% de cobre, 0,4% de berílio e 1.8% de
níquel. A outra liga patenteada C17200 (Beryllium Copper) registrada também na
EPA dos EUA possui na sua composição, 98,1% de cobre e 1,90% de berílio. Ambas
são registradas como “materiais antimicrobiano”. Todavia, não há publicações destes
resultados em qualquer periódico científico. Com isso, impossibilita averiguar se a
ação antibacteriana desta liga ocorre devido a presença do íon berílio e/ou do cobre.
O que sabemos é que muitas empresas e pesquisas relatam a eficiência
antimicrobiana de, aproximadamente, 99,97% de superfícies de cobre (MICHELS et
al., 2008).
A procura incessante por novos materiais com atividade antimicrobiana
(contra vírus, fungos, bactérias e parasitas) e que reduza a quantidade de infecções
e colonizações de superfícies tem estimulado muitos grupos de pesquisa ao redor
de todo o mundo. Todavia, até o presente momento, ainda há uma limitação de
estudos de materiais (não implantáveis) com essa característica, descritos na
81
literatura científica. E ao realizar um levantamento bibliográfico detalhado sobre a
liga de níquel-berílio nos principais periódicos científicos, depara-se com a ausência
de referências para podermos utilizá-las como base. Novas estratégias, referências
e metodologias para avaliar a resistência dos microrganismos quando em contato
com os metais tóxicos devem ser realizadas, ainda mais quando se trata de ligas
não convencionais (como no caso da liga níquel-berílio), mas que apresentam
atividade antibacteriana e não citotóxica.
8 - CONCLUSÃO
A liga níquel-berílio demonstrou ter propriedades antibacterianas, uma vez que foi
capaz de inibir as bactérias gram-negativas (E. coli, K. pneumoniae e P. aeruginosa)
quanto as gram-positivas (S. aureus e S. epidermidis), em diversos períodos de
contato.
A liga níquel-berílio demonstrou maior eficácia contra as cepas E. coli, K.
pneumoniae e P. aeruginosa.
A cepa de Staphylococcus epidermidis foi a cepa que apresentou maior resistência à
liga, quando comparadas com as demais bactérias testadas.
A avaliação quantitativa das células viáveis após os oito períodos de contato com a
liga níquel-berílio demonstrou, de modo geral, que a partir de 18 horas a liga foi
capaz de eliminar as cinco bactérias avaliadas no presente ensaio.
Pela análise da citotoxicidade, através do método de difusão em Agar, comprovou-se
que a liga níquel-berílio testada não é capaz causar qualquer tipo de dano celular
quando em contato com a linhagem NCTC clone 929, sendo classificada como IZ
zero.
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ANEXO A – INFORMAÇÕES SOBRE A AVALIAÇÃO DE CITOTOXICIDADE.
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ANEXO B – LAUDO DO TEXTE DE CITOTOXICIDADE DA LIGA NiBe
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