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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ESTRUTURAL DA
MEMBRANA PLASMÁTICA E DO ACROSSOMO DO
ESPERMATOZÓIDE CRIOPRESERVADO DE TOUROS
Isabel Ribeiro Orro
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL – BRASIL
MAIO DE 2007
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ESTRUTURAL DA
MEMBRANA PLASMÁTICA E DO ACROSSOMO DO
ESPERMATOZÓIDE CRIOPRESERVADO DE TOUROS
Isabel Ribeiro Orro
Orientadora: Prof. Dra. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul, como requisito à obtenção do
título de Mestre em Ciência Animal. Área de
concentração: Produção Animal.
CAMPO GRANDE
MATO GROSSO DO SUL – BRASIL
MAIO DE 2007
ISABEL RIBEIRO ORRO
“Ava l iação da in tegr idade es t ru tu ra l da membrana p lasmá t i ca e do acrossomo do Espe rmatozó ide c r iop reservado de touros ”
“ structural integrity assessment of plasma membrane and acrosome of cryopreserved bull sperm".
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul, como parte dos requisitos do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal
para obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Produção Animal
APROVADO: 29/05/2007
_________________________________________ Dra. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari Orientadora
______________________________ __________________________
Dra. Eliane Vianna da Costa e Silva Dra. Margot Alves Nunes Dode
“Tudo vale a pena
se a alma não é pequena”
Fernando Pessoa
Ao meus pais, marido, irmãos e sobrinhos...
dedico.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. Carmem Estefânia Serra Neto Zúccari pela oportunidade para que eu
pudesse realizar meu trabalho de mestrado.
À Profa. Dra. Eliane Vianna da Costa e Silva por toda a orientação recebida durante a
realização da análise estatística.
Ao Dr. Urbano Gomes Pinto de Abreu, pela análise estatística e por esclarecer inúmeras
questões referente aos resultados.
Ao CNPq pelo financiamento do projeto.
À acadêmica de mestrado Thaíse Silva Passos, pelo companheirismo e agradável
convívio.
Às acadêmicas de iniciação científica Paula Rosa Carrijo e Patrícia Arakaki Leite pela
agradável convivência durante a etapa laboratorial do trabalho.
Aos meus pais que compreenderam a ausência do convívio familiar e do trabalho.
Ao meu marido que forneceu o apoio suficiente.
A todos que de uma forma ou de outra contribuíram para esta dissertação.
SUMÁRIO
“Página”
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 10
2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................................... 11
2.1 Capacitação Espermática.............................................................................................. 11
2.2 Reação do Acrossomo................................................................................................... 12
2.3 Exames de Rotina Utilizados na Avaliação do Sêmen................................................. 12
2.3.1 Motilidade............................................................................................................ 12
2.3.2 Morfologia espermática....................................................................................... 14
2.4 Avaliação da Integridade Estrutural do Espermatozóide.............................................. 15
2.4.1 Integridade da membrana plasmática.................................................................. 15
2.4.1.1 Diacetato de 6-carboxifluoresceína e iodeto de propídio.......................... 15
2.4.1.2 Eosina – nigrosina..................................................................................... 17
2.4.2 Integridade do acrossomo.................................................................................... 17
2.4.2.1 Aglutinina de Arachis hipogaea conjugada ao isotiocianato de
fluoresceína e iodeto de propídio.............................................................. 17
2.4.2.2 Trypan blue – Giemsa............................................................................... 19
REFERÊNCIAS..................................................................................................................... 22
AVALIAÇÃO DA INTEGRIDADE ESTRUTURAL DA MEMBRANA PLASMÁTICA
E DO ACROSSOMO DO ESPERMATOZÓIDE CRIOPRESERVADO DE TOUROS...... 30
Resumo................................................................................................................................. 30
Abstract................................................................................................................................ 31
Introdução............................................................................................................................ 32
Materiais e Métodos............................................................................................................. 33
Resultados............................................................................................................................ 37
Discussão............................................................................................................................. 40
Conclusões........................................................................................................................... 43
Referências........................................................................................................................... 43
7
ABREVIATURAS
CAP capacitação espermática
CFDA diacetato de 6-carboxifluoresceína
CTC clortetraciclina
DEF ma defeitos maiores
DEF me defeitos menores
DEF TOT defeitos totais
DMSO dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
EN eosina nigrosina
FDA diacetato de fluoresceína
FITC isotiocianato de fluoresceína
FITC-PNA aglutinina de Arachis hypogea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína
IA inseminação artificial
MAE membrana acrossomal externa
MP membrana plasmática
PI iodeto de propídio
PNA aglutinina de amendoim (Arachis hypogaea)
RA reação do acrossomo
RAF reação do acrossomo falsa
RAV reação do acrossomo verdadeira
TALP meio de Tyrode
TB trypan blue
TBG trypan blue e Giemsa
TNR taxa de não retorno ao cio
ZP zona pelúcida
8
Avaliação da Integridade Estrutural da Membrana Plasmática e do Acrossomo do
Espermatozóide Criopreservado de Touros
Resumo
A criopreservação causa danos irreversíveis nas membranas espermáticas como a ruptura
das plasmática e acrossomal. A integridade da membrana plasmática tem sido estudada usando
diferentes técnicas incluindo as sondas fluorescentes diacetato de 6-carboxifluoresceína associada
ao iodeto de propídio (CFDA/PI) e eosina-nigrosina (EN); e a integridade do acrossomo
incluindo a lecitina Arachis hypogaea conjugada a sonda fluorescente isotiocianato de
fluoresceína associada ao PI (FITC-PNA/PI) e o corante trypan-blue/Giemsa (TBG). O objetivo
deste estudo foi a utilização desses testes para avaliar a integridade da membrana plasmática e do
acrossomo e verificar se os resultados desses testes têm correlação com a fertilidade in vivo.
Inseminações foram realizadas em 2036 matrizes Nelore em duas propriedades e quatro estações
de monta. Amostras de sêmen pós descongelação de 22 touros Nelore foram avaliadas quanto a
motilidade, concentração, morfologia e os testes para avaliar a integridade da membrana
plasmática e do acrossomo. Foi realizada análise dos componentes principais e os resultados
laboratoriais foram avaliados por correlação de Pearson (SAS Institute, Cary, USA, 1995).
Correlação positiva foi encontrada entre concentração (r=0,98; p<0,0001), integridade de
membrana com FDA (r=0,92; p<0,0001) e EN (r=0,70; p=0,0002) e do acrossomo com FITC-
PNA (r=0,92; p<0,0001) e TBG (r=0,90; p<0,0001) com fertilidade in vivo. Os testes CFDA/PI,
EN, FITC-PNA/PI e TBG juntos responderam por 78% da variação na taxa de prenhez. Portanto,
a integridade da membrana plasmática e do acrossomo podem ser consideradas importantes
variáveis para a função espermática e esses testes podem ser usados para avaliar a qualidade de
uma amostra de sêmen destinado a IA.
Palavras-chave: Sêmen congelado de touro, avaliação do sêmen, integridade da membrana
plasmática, integridade do acrossomo, fertilidade.
9
Structural Integrity Assessment of Plasma Membrane and Acrosome of Cryopreserved
Bull Sperm
Abstract
Cryopreservation imposes irreversible damage to sperm membranes such as disruption of
plasma and acrosome membranes. Plasma membrane integrity has been widely studied using
different techniques, including fluorescent probes as 6-carboxifluorescein diacetate and
propidium iodide (CFDA/PI) and eosin nigrosin (EN); and the acrosome integrity by Arachis
hypogaea lectin conjugated with a fluorescent probe, fluorescein isothiocyanate and PI (FITC-
PNA/PI) and trypan-blue/Giemsa (TBG). The aim of this study was to combine these tests to
evaluate membrane and acrosome integrity and determine if the results of these assays were
associated with in vivo fertility. Insemination was performed in 2036 Nelore bovine female in
two properties at four breeding season. Semen samples pos thawing of 22 Nelore bulls was
assessed to motility, concentration, morphology and to membrane and acrosome integrity.
PRINCOMP procedure was made and the laboratorial results was correlated by Pearson (SAS
Institute, Cary, USA, 1995). Positive correlation was observed between membrane FDA (r=0,92;
p<0,0001) and EN (r=0,70; p=0,0002) and acrosome integrity with FITC-PNA/PI (r=0,92;
p<0,0001) and TBG (r=0,90; p<0,0001) and in vivo fertility. The tests CFDA/PI, EN, FITC-
PNA/PI and TBG together account for 78% of variation in fertilization rates. Therefore
membrane and acrosome integrity can be considered important variables for normal sperm
function and these tests can be used to assess the quality of a semen sample used for AI.
Keywords: Frozen-thawed bovine spermatozoa, semen assay, membrane integrity, acrosome
integrity, fertility.
10
1. INTRODUÇÃO
A inseminação artificial (IA) é uma biotécnica de primeira geração com significativa
contribuição para o melhoramento genético dos rebanhos, além de ser de fácil acesso e domínio
técnico (ASBIA, 2006). Apesar desta técnica estar sendo utilizada desde a década de 40, uma
avaliação mais precisa da fertilidade do sêmen bovino criopreservado é de extrema importância.
A maior desvantagem do processo de criopreservação é ser prejudicial ao espermatozóide.
O processo de criopreservação resulta em diminuição da fertilidade quando comparado a
do sêmen a fresco e causa um decréscimo de aproximadamente 50% da viabilidade espermática
(THOMAS et al., 1998; WATSON, 2000). Este prejuízo surge da combinação de dois aspectos,
morte celular e danos na capacidade funcional dos espermatozóides sobreviventes (CORMIER
et al., 1997; DEN DAAS et al., 1998; PETRUNKINA et al., 2005; WATSON, 2000). Embora o
espermatozóide possua poucas organelas, é uma célula complexa (GRAHAM, 2001; GILLAN
et al., 2005) com vários compartimentos celulares, diferentes composições de membrana e
estruturas subcelulares, que devem estar íntegros para que ocorra a fecundação (GRAHAM,
2001). Ocorrem mudanças morfológicas na organização, fluidez, permeabilidade, composição
lipídica (THOMAS et al., 1998) e até ruptura das membranas espermáticas (HOLT, 2000).
Do ponto de vista biológico apenas espermatozóides viáveis e contendo informações
genéticas intactas são potencialmente fertéis (JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002). Desta
forma, alguns processos fisiológicos são necessários e requerem múltiplos atributos celulares
(GRAHAM, 2001) como a capacitação espermática (CAP) e a reação do acrossomo (RA). Uma
vez capacitado, o espermatozóide exibe elevada taxa metabólica, mudanças no potencial de
membrana, aumento da sua permeabilidade e assim, condições para sofrer a RA
(YANAGIMACHI, 1994). Apenas espermatozóides capacitados e com o acrossomo íntegro são
capazes de se ligar a zona pelúcida (ZP), sofrer a RA e fertilizar o ovócito. Portanto, a
viabilidade espermática é crítica para ocorrência da RA e penetração do espermatozóide através
da ZP (KITIYANANT et al., 2002).
A avaliação tradicional da qualidade do ejaculado por centrais de coleta e processamento
de sêmen tem se baseado na análise da motilidade, morfologia e concentração, aspectos que têm
11
uma capacidade limitada no que se refere a estimativa do potencial fertilizante de um ejaculado
(ASBIA, 2006; GILLAN et al., 2005). O processo de fecundação envolve eventos bioquímicos e
moleculares complexos que não são analisados na avaliação de rotina.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a integridade estrutural da membrana
plasmática e do acrossomo do sêmen criopreservado de touros e verificar a correlação entre
estas técnicas e destas com a fertilidade in vivo.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Capacitação Espermática
A capacitação espermática é um evento fisiológico altamente complexo que envolve uma
série de modificações bioquímicas que ocorem no trato genital da fêmea, conferindo ao
espermatozóide a capacidade de penetrar o ovócito (FELIX, 2005; BREITBART et al., 2005).
Em bovinos, nos quais os espermatozóides são depositados na vagina durante o coito, a
CAP pode ter início durante a passagem do espermatozóide pelo muco cervical. Embora alguns
espermatozóides estejam num estágio avançado de CAP, após a passagem pelo muco, não se
sabe se são capazes de ingressar no oviduto para participar da fecundação (YANAGIMACHI,
1994). Já, no istmo, uma molécula ligante de carboidrato, presente na superfície do
espermatozóide, se une a uma porção oligossacarídica do epitélio e proteínas secretadas pelo
epitélio preservam a viabilidade, suprimem a motilidade hiperativada dos espermatozóides e
retardam a RA (BOQUEST et al., 1999), para aguardarem o momento da ovulação e
fecundação.
12
2.2 Reação do Acrossomo
O acrosssomo é uma vesícula especializada que recobre a porção anterior da cabeça do
espermatozóide, composta pelas membranas acrossomal externa e interna, dividindo-se nos
segmentos apical e equatorial. Enquanto o segmento apical contém enzimas hidrolíticas, o
segmento equatorial não possui enzimas. A reação do acrossomo, uma forma modificada de
exocitose, altera o espermatozóide tanto estrutural quanto funcionalmente (YANAGIMACHI,
1994). A RA envolve a fusão entre as membranas plasmática (MP) e acrossomal externa
(MAE), seguida da liberação do conteúdo do acrossomo, um processo que permite o
espermatozóide a penetrar o ovócito e fertilizá-lo. Apenas espermatozóides capacitados podem
sofrer a RA ao se ligarem a ZP (PEREIRA et al., 2000; BREITBART et al., 2005).
A avaliação do status acrossomal classifica os espermatozóides em: a) vivo – aquele
viável e com acrossomo intacto; b) morto – lesado, mas com acrossomo intacto; c) reação do
acrossomo verdadeira (RAV) – onde o espermatozóide apresenta-se vivo e o acrossomo ausente
e; d) reação do acrossomo falsa (RAF) – lesado/morto e com o acrossomo ausente. Em qualquer
amostra de sêmen a percentagem de espermatozóides vivos e com acrossomo intacto diminui ao
longo do tempo, consequentemente a percentagem de mortos e sem o acrossomo aumenta. Isto
sugere que subpopulações de espermatozóides estão sofrendo um ciclo contínuo de CAP, RAV e
morte celular (DIDION et al., 1989).
2.3 Exames de Rotina Utilizados na Avaliação do Sêmen
2.3.1 Motilidade
A avaliação subjetiva da motilidade espermática pós-descongelação é o parâmetro mais
usado para estimar a qualidade do sêmen destinado a IA. Embora seja um bom indicador da
viabilidade espermática e de relevância para a fecundação, não é um bom indicador de
fertilidade (AMANN, 1989; WHITFIELD; PARKINSON, 1995; RODRIGUEZ-MARTINEZ,
13
2000; GRAHAM, 2001; JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002; JANUSKAUSKAS et al.,
1999).
Com a criopreservação a eficiência do transporte espermático pode ser reduzida
severamente (HOLT, 2000), pois enquanto uma percentagem da população exibe motilidade
progressiva satisfatória, outra mostra algum grau de prejuízo que parece ter uma contribuição
importante para o menor potencial fertilizante dos gametas quando introduzidos no trato
reprodutivo da fêmea, após a IA. O transporte para o local de fecundação requer um mínimo de
capacidade de deslocamento (WATSON, 2000).
A presença de motilidade progressiva e um acrossomo intacto são dois dos maiores
responsáveis pelo sucesso da IA (HOLT, 2000; BRITO et al., 2003; GILLAN et al., 2005). Mas,
de acordo com Amann (1989), uma queda da fertilidade tem ocorrido mesmo quando o sêmen
pós-descongelação contém um percentual adequado de espermatozóides com motilidade
progressiva.
Um estudo de Blottner et al. (1990) mostrou correlação positiva entre motilidade e
fertilidade, tanto pela taxa de não retorno ao cio (TNR; r = 0,61; p < 0,05), como pelos
resultados da fecundação in vitro (r = 0,62; p < 0,05). Da mesma forma, Januskauskas et al.
(2000) e Corrêa et al. (1997) obtiveram correlação significativa entre motilidade e TNR (TNR-
56 dias, r = 0,53, p < 0,05; e TNR-60-90 dias, r = 0,53, p < 0,01; respectivamente) em sêmen
congelado de touro. Também Den Daas (1997) obteve correlação significativa entre motilidade
e TNR-56 dias (r = 0,52; p < 0,05). Em relação a fertilidade in vitro, de acordo com a taxa de
clivagem, Brito et al. (2003) observaram que a motilidade é um bom parâmetro, explicando 18%
de sua variação. Porém, Phillips et al. (2004) avaliando sêmen criopreservado de touros não
observaram correlação significativa da motilidade tanto com TNR, quanto com a taxa de
concepção.
Garner et al. (1986) relataram correlação positiva (r = 0,55; p < 0,05) entre motilidade
progressiva e viabilidade espermática analisada pela associação de diacetato de 6-
carboxifluoresceína e iodeto de propídio (CFDA/PI). Já, Thomas et al. (1998), avaliando a
integridade de membrana com SYBR-14/PI, encontraram r = 0,98 (p < 0,05) com a motilidade.
Com o uso da clortetraciclina (CTC) para avaliar a ocorrência de capacitação espermática,
14
Januskauskas et al. (1999) relataram que o percentual de células não capacitadas teve correlação
com a motilidade subjetiva (r = 0,41; p < 0,001) e computadorizada (r = 0,51; p < 0,001).
Em estudo realizado por Garner et al. (1997) foi observado alta correlação entre função
mitocondrial avaliada pelo iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro-1,1’,3,3’-tetraetilbenzimidazolil-
carbocianina (JC-1), rhodamina 123 (R123) e Mito Tracker Green FM (MITO) com viabilidade
avaliada com SYBR-14/PI (r = 0,99; r = 0,98; e r = 0,97; p < 0,01; respectivamente) além de
alta correlação entre si. Ainda, viabilidade teve alta correlação com motilidade (r = 0,97; p <
0,01).
De acordo com estudo retrospectivo de Graham (2001), as correlações entre fertilidade a
campo e apenas um atributo do sêmen congelado de touros variam consideravelmente entre
estudos, sendo com a motilidade espermática de 0,15 a 0,84; para morfologia, de 0,06 a 0,86 e;
entre fertilidade e integridade da membrana plasmática de 0,33 a 0,66.
2.3.2 Morfologia espermática
A morfologia espermática é um dos parâmetros rotineiros utilizados para a avaliação da
qualidade do sêmen de touros e permite eliminar aqueles com baixo potencial fertilizante,
priorizando a entrada de bons reprodutores em programas de teste de progênie e preservação do
sêmen (AMANN, 1981; JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002).
As causas de defeitos espermáticos podem ser ambientais, genéticas ou a combinação de
ambas (CHENOWETH, 2005).
Corrêa et al. (1997), avaliando sêmen criopreservado de touros, observaram correlação
significativa entre morfologia normal e TNR-60-90 dias (r = 0,59 p < 0,01). Além disso, Phillips
et al. (2004) avaliando motilidade, concentração, morfologia e viabilidade espermática
observaram que morfologia foi o parâmetro individual mais consistente para estimar a
capacidade fertilizante de uma amostra de sêmen bovino pós-descongelação, medida pela TNR
(r2 = 70; p < 0,001). E, ainda, Brito et al. (2003) observaram que a morfologia é um bom
indicador da fertilidade in vitro, explicando 16% da variação da taxa de clivagem.
15
De acordo com Tartaglione e Ritta (2004) a integridade da membrana plasmática
(eosina) e do acrossomo (trypan blue/giemsa-TBG) são melhores para estimar a fertilidade in
vitro que a avaliação da morfologia e motilidade espermáticas e, de acordo com o relato de
Rodriguez-Martinez (2000), morfologia e motilidade têm demonstrado diferentes associações
com fertilidade.
2.4 Avaliação da Integridade Estrutural do Espermatozóide
2.4.1 Integridade da membrana plasmática
A integridade da membrana plasmática reflete a viabilidade espermática sendo o
principal local onde ocorrem lesões durante a criopreservação do sêmen (JANUSKUSKAS;
ZILINSKAS, 2002). Porém, a teca perinuclear (MARTINEZ et al., 2006), região pós
acrossomal, anulus (ANZAR et al., 1997) e outros elementos do citoesqueleto (WATSON,
2000) também podem ser lesados e, assim, contribuírem para a redução da viabilidade do sêmen
criopreservado, sugerindo que a diminuição da viabilidade pode ser atribuída não apenas à lesão
primária da membrana plasmática (HOLT, 2000).
2.4.1.1 Diacetato de 6-carboxifluoresceína e iodeto de propídio
Vários eventos relacionados a fecundação como a CAP, RA e fusão com o ovócito,
requerem uma membrana plasmática e acrossomo intactos (TARTAGLIONE; RITTA, 2004;
BRITO et al., 2003) já que, uma vez lesado o espermatozóide não é capaz de regenerar a
membrana plasmática comprometida (NUR et al., 2005). Assim, a avaliação de sua viabilidade
pode ser útil para predizer a capacidade fertilizante do espermatozóide.
O desenvolvimento de técnicas de coloração usando fluorocromos tem fornecido novas
ferramentas para avaliar o sêmen pós-descongelação. Isolados ou em combinação podem ser
usados para determinar a integridade das membranas e podem ser visualizados simultânea ou
separadamente, usando diferentes filtros (RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2000;
JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002; GILLAN et al., 2005).
16
Os estudos iniciais para a avaliação da membrana plasmática dos espermatozóides de
touros com CFDA/PI foram realizados em citômetro de fluxo (GARNER et al., 1986). Só em
1990, Harrison e Vickers acrescentaram o uso de baixas concentrações de formaldeído,
permitindo assim, a avaliação em microscopia de epifluorescência, aumentando a aplicabilidade
da técnica.
A combinação do diacetato de 6-carboxifluoresceína (CFDA) com iodeto de propídeo
(PI) permite determinar a viabilidade dos espermatozóides devido às suas características
moleculares. A membrana plasmática intacta é permeável ao CFDA e esterases intra-celulares o
convertem em composto fluorescente, a fluoresceína. Esta é incapaz de atravessar a membrana
intacta, sendo retida no citoplasma (GILLAN et al., 2005; HOLT; NORTH, 1994), corando em
verde. Corantes para ácido nucléico como o PI, identificam espermatozóides mortos corando seu
núcleo em vermelho, pois a membrana plasmática intacta impede sua entrada na célula
(GARNER et al., 1986).
Assim, quando o CFDA é usado com o PI, três populações de células podem ser
identificadas, como descrito por Harrison e Vickers (1990): vivas, se coram em verde; mortas,
em vermelho e uma terceira população se cora com ambos – acrossomo em verde e núcleo em
vermelho – e são considerados semi-lesados.
Pintado et al. (2000) observaram que o PI é um bom indicador de células lesadas,
apresentando correlação positiva tanto com Hoechst 33258 (r = 0,80; p < 0,01) quanto com
eosina/nigrosina/giemsa (r = 0,69; p < 0,01).
Garner et al. (1986) usando a associação CFDA/PI, observaram que, embora não
significativa (p = 0,06), houve correlação negativa (r = −0,57) entre o aumento de células
lesadas e decréscimo de espermatozóides íntegros com a fertilidade (TNR-90 dias). Já, Brito et
al. (2003) não obtiveram correlação entre a taxa de clivagem e integridade de membrana
plasmática. Da mesma forma, Phillips et al. (2004) avaliando integridade de membrana (SYBR-
14/PI) do sêmen congelado de touro, não observaram correlação significativa com TNR, nem
com a taxa de concepção.
17
2.4.1.2 Eosina – nigrosina
O corante supravital eosina é indicador da integridade da membrana plasmática, corando
apenas espermatozóides mortos, ou seja, com a membrana plasmática lesada, e é comumente
associado a nigrosina, que é responsável pelo contraste do fundo da lâmina (BARTH; OKO,
1989). Essa coloração foi descrita pela primeira vez em 1951 por Swanson e Bearden, e desde
então vem sendo amplamente usada.
A habilidade da eosina/nigrosina (EN) de diferenciar células mortas foi confirmada por
Pintado et al. (2000) que, avaliando sêmen de touro pós-descongelação, observaram alta
correlação entre EN e iodeto de propídeo (PI) (r = 0,83; p = 0,0009).
Brito et al. (2003), avaliando sêmen criopreservado de touro, observaram que as
proporções de espermatozóides com membrana plasmática íntegra identificados pela dupla
coloração EN ou Trypan blue (TB) foi maior (p <0,0001) que aquelas detectadas pelas sondas
fluorescentes CFDA/PI ou SYBR/PI. Apesar da correlação entre a coloração EN com CFDA/PI
(r = 0,92; p < 0,01), SYBR/PI (r = 0,58; p < 0,01) e TB (r = 0,93; p < 0,01), nenhum desses
testes apresentaram correlação significativa com a taxa de clivagem.
Já, Tartaglione e Ritta (2004) associando EN com o teste hiposmótico, para avaliar
sêmen criopreservado de touros, observaram correlação com a fertilidade in vitro (r = 0,62; p <
0,05), mas quando analisados separadamente, os testes não foram bons estimadores da
fertilidade.
2.4.2 Integridade do acrossomo
2.4.2.1 Aglutinina de Arachis hipogaea conjugada ao isotiocianato de
fluoresceína e iodeto de propídio
O teste ideal para determinar a percentagem de espermatozóides que sofreram RA deve
ser preciso, rápido, não deve comprometer a função espermática e ser capaz de distinguir a RAV
da RAF (CROSS; MEIZEL, 1989).
As lecitinas são aglutininas que conjugadas com isotiocianato de fluoresceína (FITC),
uma sonda fluorescente, são utilizadas para a verificação do status acrossomal (SUZUKI et al.,
18
2003). As lecitinas têm afinidade específica por determinadas moléculas sacarídicas
(carboidratos) da matriz acrossomal ou da membrana acrossomal externa (MAE) (FLESCH et
al., 1998; CHAN et al., 2002; MAGARGEE et al., 1988; SIRIVAIDYAPONG et al., 2000) e
requerem permeabilidade celular (CROSS; MEIZEL, 1989). Uma das lecitinas mais usadas é a
Arachis hypogaea - aglutinina do amendoim (PNA), que se liga à membrana acrossomal externa
(CHAN et al., 2002; KITIYANANT et al., 2002).
Assim, a aglutinina de Arachis hipogaea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína
(FITC-PNA) tem sido usada para determinar a ocorrência da RA em várias espécies como em
humano (CROSS; MEIZEL, 1989), ovino (MAGARGEE et al., 1988), suíno (FAZELI et al.,
1997), cão (SIRIVAIDYAPONG et al., 2000) e equino (CHENG et al., 1996).
O FITC-PNA foi usado pela primeira vez para verificar o status acrossomal em
espermatozóide bovino por CROSS e WATSON (1994). Mas, só recentemente foi associado ao
PI, distinguindo assim, vivos e mortos, RAV e RAF (NAGY et al., 2003).
Uma MP intacta e funcional se torna impermeável ao FITC-PNA e nenhum sinal de
fluorescência é observado. Quando o espermatozóide sofre RA, ocorrem pontos de fusão entre a
MP e MAE, resultando na formação de poros, que dão acesso às membranas acrossomais e seu
conteúdo e o acrossomo apresenta-se corado em verde – RA verdadeira. Quando ocorre a fusão
completa entre a MP e MAE, isto resulta na completa perda da capa acrossomal e o
espermatozóide apresenta fluorescência apenas no segmento equatorial ou simplesmente não
exibe fluorescência (CROSS; MEIZEL, 1989; KITIYANANT et al., 2002; HOLLINSHEAD et
al., 2004; CHENG et al., 1996). Dependendo da MAE restante, o FITC-PNA cora com várias
intensidades de fluorescência e contraste e não gera dúvidas na leitura como as demais
colorações (FAZELI et al., 1997; CROSS; MEIZEL, 1989).
O FITC-PNA vem sendo comumente usado em combinação com o PI, que identifica em
vermelho células mortas. Espermatozóides com PI e PNA positivo – morto com acrossomo
reagido, sofreram RA falsa, pois podem ter perdido seu acrossomo com a morte celular
(KITIYANANT et al., 2002; FAZELI et al., 1997). Esta técnica necessita de alternância entre
microscopia de epifluorescência e campo claro já que o espermatozóide vivo não se cora nem
com o FITC-PNA nem com o PI.
19
As membranas acrossomais são especialmente propensas a danos causados pela
criopreservação (RISOPATRÓN et al., 1996), assim, o status acrossomal de uma população
espermática é de especial interesse porque o número de espermatozóides que apresentam RA,
quando induzida com cálcio ionóforo A23187, tem correlação positiva com a fertilidade (TNR-
90 dias) do sêmen criopreservado de touro (r = 0,86; p < 0,001) de acordo com estudo realizado
por Whitfield e Parkinson (1995). Porém, Assumpção et al. (2002), avaliando RA induzida com
heparina e cálcio ionóforo A23187, não observaram correlação com fertilidade in vivo.
Kitiyanant et al. (2002) usando FITC-PNA e ethidium homodimer-1 (EthD-1) para
avaliar RA induzida com heparina e cálcio ionóforo em sêmen criopreservado de búfalo,
obtiveram 78% de espermatozóides vivos com acrossomo intacto e 9% de RAV e usando FITC-
PNA/TBG obtiveram 80% de vivos e 10% de RAV tanto pela heparina quanto pelo cálcio
ionóforo. Além disso, alta correlação foi observada entre as duas técnicas de coloração (r >
0,90), reforçando a capacidade do FITC-PNA de avaliar a RA.
Já, Prathalingam et al. (2006) avaliando a integridade do acrossomo com FITC-PNA/PI
encontraram 1,16 ± 0,9% de RAV em sêmen de touro pós descongelação.
2.4.2.2 Trypan blue/Giemsa
A primeira descrição do uso do trypan blue/Giemsa (TBG) para determinar
simultaneamente viabilidade espermática e status acrossomal foi feita por Didion et al. (1989).
Desde então tem sido usada por ser uma técnica acessível, simples, eficiente, de baixo custo
(KITIYANANT et al., 2002) e pode ser empregada para estimar o potencial fertilizante de
amostras de sêmen bovino destinadas a fecundação in vitro ou IA (TARTAGLIONE; RITTA,
2004).
O TB é um corante vital que detecta espermatozóides mortos, com membrana lesada,
corando-os em azul, enquanto espermatozóides intactos (vivos) não se coram (SUTTIYOTIN;
THWAITES, 1994; TALBOT; CHACON, 1981). Já, o Giemsa indica ausência ou presença do
acrossomo, corando em roxo ou rosa escuro o acrossomo intacto (TARTAGLIONE; RITTA,
2004; WAY et al., 1995). Essa coloração é útil para estudar a ocorrência da RA (SUTTIYOTIN;
THWAITES, 1991), pois permite a diferenciação de espermatozóides que sofreram RAV
20
daqueles que sofreram RAF e tem sido usada em várias espécies como bovino, suíno, ovino e
equino (DIDION et al., 1989).
Quando o sêmen é corado com TBG, quatro categorias são consideradas: a) vivo com
acrossomo intacto; b) morto com acrossomo intacto; c) vivo sem acrossomo (RAV) e d) morto
sem acrossomo (RAF). Os acrossomos de espermatozóides mortos são corados mais
intensamente que os acrossomos de vivos, e a região sem acrossomo de espermatozóides mortos
também é mais escura que a mesma área nos vivos (DIDION et al., 1989).
A percentagem de espermatozóides corados com TB aumenta com o aumento da
concentração do corante, aumento da temperatura de incubação de 30◦ a 40◦ C – sendo ótima
entre 37◦ a 40◦C – e tempo de exposição ao corante – que deve ser o mínimo de tempo possível
– até 15 minutos. A exposição ao corante por mais de 60 minutos resultou no aumento de células
coradas em 6,1% (p < 0,01). Entre 1 a 15 minutos não houve diferença significativa, mas o
número de espermatozóides corados com TB foi maior aos 30 minutos que com 1 minuto
(55,7% e 50,5%, respectivamente; p < 0,05) (SUTTIYOTIN; THWAITES, 1991). Porém Talbot
e Chacon (1981) avaliando sêmen humano a fresco, observaram que a incubação deve ser no
mínimo de 15 minutos antes da lavagem e fixação. O procedimento ideal deve ser rápido,
preciso e sem efeitos tóxicos.
Suttiyotin e Thwaites (1991), avaliando sêmen fresco de ovino, observaram correlação
significativa entre a percentagem conhecida de espermatozóides mortos e células coradas com
TB (r = 0,95; p < 0,05). Já, Didion et al. (1989) observaram que a motilidade é semelhante à
percentagem de espermatozóides vivos, não corados com TB e a associação do Giemsa com TB
não modificou sua habilidade de diferenciar vivos e mortos e o TBG foi idêntico ao contraste de
interferência diferencial na avaliação da ocorrência da RA, confirmando a validade da técnica.
A técnica possui várias vantagens, pois os esfregaços são observados em microscópio de
campo claro, podem ser lidos em momento conveniente, podem ser fixados com rápida secagem
por secador e as lavagens não influenciam o status acrossomal (TBG). Uma desvantagem é que
não diferencia espermatozóide morto que perdeu o acrossomo após a morte celular (RAF) de
espermatozóide que sofreu a RAV e então morreu antes da fixação (DIDION et al., 1989).
Portanto, considerando que a fecundação é um processo multifatorial, a avaliação de
vários atributos permite melhor acurácia na estimação da capacidade fertilizante do
21
espermatozóide (AMANN; HAMMERSTEDT, 1993). Testes laboratoriais podem ter grande
utilidade na avaliação do sêmen antes da estação de monta e são necessários para que touros de
baixo potecial fertilizante não entrem em programas de IA. Desta forma, estudos têm sido
realizados com o objetivo de identificar qual teste ou associação de testes tem maior correlação
com a fertilidade in vivo.
22
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30
Avaliação da Integridade Estrutural da Membrana Plasmática e do Acrossomo do
Espermatozóide Criopreservado de Touros
Resumo
A criopreservação causa danos irreversíveis nas membranas espermáticas como a ruptura
das plasmática e acrossomal. A integridade da membrana plasmática tem sido estudada usando
diferentes técnicas incluindo as sondas fluorescentes diacetato de 6-carboxifluoresceína associada
ao iodeto de propídio (CFDA/PI) e eosina-nigrosina (EN); e a integridade do acrossomo
incluindo a lecitina Arachis hypogaea conjugada a sonda fluorescente isotiocianato de
fluoresceína associada ao PI (FITC-PNA/PI) e o corante trypan-blue/Giemsa (TBG). O objetivo
deste estudo foi a utilização desses testes para avaliar a integridade da membrana plasmática e do
acrossomo e verificar se os resultados desses testes têm correlação com a fertilidade in vivo.
Inseminações foram realizadas em 2036 matrizes Nelore em duas propriedades e quatro estações
de monta. Amostras de sêmen pós descongelação de 22 touros Nelore foram avaliadas quanto a
motilidade, concentração, morfologia e os testes para avaliar a integridade da membrana
plasmática e do acrossomo. Foi realizada análise dos componentes principais e os resultados
laboratoriais foram avaliados por correlação de Pearson (SAS Institute, Cary, USA, 1995).
Correlação positiva foi encontrada entre concentração (r=0,98; p<0,0001), integridade de
membrana com FDA (r=0,92; p<0,0001) e EN (r=0,70; p=0,0002) e do acrossomo com FITC-
PNA (r=0,92; p<0,0001) e TBG (r=0,90; p<0,0001) com fertilidade in vivo. Os testes CFDA/PI,
EN, FITC-PNA/PI e TBG juntos responderam por 78% da variação na taxa de prenhez. Portanto,
a integridade da membrana plasmática e do acrossomo podem ser consideradas importantes
variáveis para a função espermática e esses testes podem ser usados para avaliar a qualidade de
uma amostra de sêmen destinado a IA.
Palavras-chave: Sêmen congelado de touro, avaliação do sêmen, integridade da membrana
plasmática, integridade do acrossomo, fertilidade.
31
Structural Integrity Assessment of Plasma Membrane and Acrosome of Cryopreserved
Bull Sperm
Abstract
Cryopreservation imposes irreversible damage to sperm membranes such as disruption of
plasma and acrosome membranes. Plasma membrane integrity has been widely studied using
different techniques, including fluorescent probes as 6-carboxifluorescein diacetate and
propidium iodide (CFDA/PI) and eosin nigrosin (EN); and the acrosome integrity by Arachis
hypogaea lectin conjugated with a fluorescent probe, fluorescein isothiocyanate and PI (FITC-
PNA/PI) and trypan-blue/Giemsa (TBG). The aim of this study was to combine these tests to
evaluate membrane and acrosome integrity and determine if the results of these assays were
associated with in vivo fertility. Insemination was performed in 2036 Nelore bovine female in
two properties at four breeding season. Semen samples pos thawing of 22 Nelore bulls was
assessed to motility, concentration, morphology and to membrane and acrosome integrity.
PRINCOMP procedure was made and the laboratorial results was correlated by Pearson (SAS
Institute, Cary, USA, 1995). Positive correlation was observed between membrane FDA (r=0,92;
p<0,0001) and EN (r=0,70; p=0,0002) and acrosome integrity with FITC-PNA/PI (r=0,92;
p<0,0001) and TBG (r=0,90; p<0,0001) and in vivo fertility. The tests CFDA/PI, EN, FITC-
PNA/PI and TBG together account for 78% of variation in fertilization rates. Therefore
membrane and acrosome integrity can be considered important variables for normal sperm
function and these tests can be used to assess the quality of a semen sample used for AI.
Keywords: Frozen-thawed bovine spermatozoa, semen assay, membrane integrity, acrosome
integrity, fertility.
32
Introdução
A inseminação artificial (IA) tem fornecido uma significativa contribuição genética para
o melhoramento do rebanho bovino. Entretanto esse impacto não seria possível sem a
criopreservação do sêmen, porém os efeitos da criopreservação sobre o espermatozóide variam
desde a injúria letal (WATSON, 2000) àquelas que prejudicam a estrutura celular
(HAMMERSTEDT et al., 1990). Além disso, apenas metade dos espermatozóides sobrevive ao
processo de criopreservação (JANUSKAUSKAS; ZILINSKAS, 2002). Para que ocorra a
fertilização é necessário que haja uma percentagem de espermatozóides com total potencial,
sendo assim, um espermatozóide precisa expressar e suprimir adequadamente vários atributos
numa seqüência correta, com local e tempo adequados como a capacitação (CAP) e a reação do
acrossomo (RA) (AMANN; HAMMERSTEDT, 1993).
Exames laboratoriais comumente usados para avaliar a qualidade de uma amostra de
sêmen antes do seu uso na IA têm envolvido uma observação da percentagem de
espermatozóides móveis, morfologicamente normais e a concentração de uma dose de sêmen
(ASBIA, 2006; GILLAN et al., 2005), mas esses exames não são suficientes para estimar a
fertilidade de uma amostra (GILLAN et al., 2005).
Nesse contexto, a avaliação da integridade da membrana plasmática e do acrossomo é de
particular importância desde que uma membrana e acrossomo intactos são necessários para o
metabolismo, CAP, RA e, finalmente, fecundação (JEYENDRAN et al., 1984). A eosina
nigrosina (EN) que é um corante supravital e o diacetato de 6-carboxifluoresceína (CFDA), um
corante fluorescente comumente associado ao iodeto de propídio (PI) permitem avaliar a
integridade da membrana plasmática. O trypan blue associado ao Giemsa e a lecitina Arachis
hypogaea conjugada ao isotiocianato do fluoresceína (FITC-PNA) associada ao PI avaliam o
status acrossomal de uma população de espermatozóides. Muitos métodos estão sendo usados
para estimar o potencial fertilizante de uma amostra de sêmen e a correlação com a fertilidade in
vivo (RODRIGUEZ-MARTINEZ, 2006).
O objetivo do presente estudo foi a utilização de exames para avaliar a integridade da
membrana plasmática e a integridade do acrossomo e verificar a correlação entre as técnicas e
destas com a fertilidade in vivo.
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Materiais e Métodos
Animais e local
Os dados de campo foram obtidos junto a duas propriedades rurais, sendo a Fazenda 1
localizada a 22◦ 47’ 21,96” S e 54◦ 35’ 53,05” O, no município de Juti – MS e a Fazenda 2 a 19◦
55’ 30,62” S e 55◦ 40’ 20,89” O no município de Aquidauana – MS.
Foram submetidas a inseminação artificial 2.036 fêmeas da raça Nelore, pertencentes a
diferentes categorias reprodutivas sendo 1.374 vacas, 256 primíparas e 406 novilhas das quais
1.326 matrizes pertencentes a fazenda 1 e 710 a fazenda 2. Os dados compreenderam quatro
estações de monta: 2002/2003, 2003/2004, 2005/2005 e 2006/2006, com observações de cio no
início da manhã e final da tarde, e o diagnóstico de gestação por palpação retal foi realizado 90
dias após o término da estação de monta. Nas Fazendas 1 e 2, seis e dois inseminadores,
realizaram as inseminações artificiais com doses de 12 e 10 touros Nelore, respectivamente. A
taxa de gestação foi usada como índice para aferir a fertilidade dos touros a campo.
Avaliações das características físicas e morfológicas do sêmen
Motilidade
As doses utilizadas encontravam-se acondicionadas em palhetas de 0,5 ml e 0,25 ml,
estocadas em nitrogênio líquido e foram avaliadas no Laboratório de Biotecnologia da
Reprodução Animal-UFMS. Para a descongelação as palhetas foram imersas em banho-maria
(MD 100 – Fanem) a uma temperatura de 37◦C por 30 segundos. Avaliou-se a motilidade
espermática depositando uma gota de sêmen entre lâmina e lamínula, mantidas a 37ºC. A
avaliação subjetiva foi feita sob microscopia de campo claro (Axiolab, Zeiss, Alemanha), com
objetiva de 10 e 40X. O resultado foi expresso em percentagem conforme a estimativa da
proporção total de espermatozóides móveis.
Concentração
Procedia-se a diluição do sêmen em solução de formol-salina-tamponada na proporção de
1:20, a amostra era homogeneizada e depositada em Câmara de Neubauer, sendo realizada a
34
contagem do número de espermatozóides em microscopia de campo claro (Eclipse E200 –
Nikon), com objetiva de 40X e o resultado expresso em número de espermatozóides (x 106/mL).
Morfologia
As amostras de sêmen foram conservadas em solução de formol-salina-tamponada e
avaliadas 100 células em preparações úmidas, sob microscopia de contraste de fase (Eclipse E200
– Nikon), com aumento de 1000X. De acordo com a classificação da patologia proposta por
Blom (1977) citado por Barth e Oko (1989), os resultados foram expressos em percentagem de
defeitos maiores, menores e totais no laboratório de Reprodução Animal/FAMEZ.
Avaliação da integridade da membrana plasmática
Diacetato de 6-carboxifluoresceína/iodeto de propídio – CFDA/PI
A integridade da membrana plasmática foi avaliada empregando-se a técnica descrita por
Harrison e Vickers (1990), na qual dois fluorocromos são utilizados: CFDA e PI. A partir das
soluções estoque foi preparada uma solução de trabalho com 480 µl de citrato de sódio, 5 µl de
formalina, 5 µl de PI e 10 µl de CFDA (Sigma Aldrich do Brasil). As soluções de fluorocromos
eram mantidas ao abrigo da luz em tubos de ensaio envoltos por papel alumínio e congeladas a -
20◦C. As soluções de formaldeído 1:80 e citrato de sódio a 3% eram estocadas sob refrigeração a
5◦C.
Preparava-se a solução de trabalho no dia em que era utilizada e ao abrigo da luz. Todas
as soluções usadas no preparo da solução de trabalho encontravam-se à temperatura ambiente no
momento da realização do ensaio. O material a ser avaliado era acondicionado em tubos de
ensaio revestidos por papel alumínio, mantido a temperatura ambiente, na proporção de 40 µl da
solução de trabalho para 10 µl de sêmen.
A integridade da membrana plasmática foi avaliada em preparação úmida entre lâmina e
lamínula, sob microscopia de epifluorescência (Axioskop, Zeiss, Alemanha), filtro com
excitação de 492 nm e emissão de 517 nm, com objetiva de 40X, contadas 100 células,
classificadas quanto ao padrão de coloração em três categorias: íntegros – célula corada em
verde em toda sua extensão; lesados – o núcleo corado em vermelho e semi-lesados – núcleo
corado em vermelho e acrossomo em verde.
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Eosina/nigrosina – EN
A avaliação da integridade de membrana foi feita em esfregaço de sêmen corado pela
eosina/nigrosina (1:1), conforme proposto por Hancock e modificado por Barth e Oko (1989b). A
eosina penetra através da membrana plasmática lesada, corando as células mortas em rosa e a
nigrosina dando o contraste de fundo, permite detectar espermatozóides vivos não corados.
Foram contadas sob imersão ao microscópio ótico de campo claro (Zeiss), 200 células por
lâmina.
Avaliação da integridade do acrossomo
Arachis hypogaea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína/iodeto de propídio – FITC-
PNA/PI
A integridade do acrossomo foi avaliada empregando-se a técnica descrita por Nagy et
al. (2003) com a utilização do FITC-PNA e PI. Foi preparada uma solução de trabalho com 480
µl de citrato de sódio, 5 µl de formalina, 5 µl de PI (Sigma Aldrich do Brasil) e 10 µl de FITC-
PNA (Sigma Aldrich do Brasil). As soluções de fluorocromos eram mantidas ao abrigo da luz
em tubos de ensaio envoltos por papel alumínio e congeladas a -20◦C. As soluções de
formaldeído 1:80 e citrato de sódio a 3% eram estocadas sob refrigeração a 5◦C.
Preparava-se a solução de trabalho no dia em que era utilizada e ao abrigo da luz. Todas
as soluções usadas no preparo da solução de trabalho encontravam-se à temperatura ambiente no
momento da realização do ensaio. O material a ser avaliado era acondicionado em tubos de
ensaio revestidos por papel alumínio, mantido a temperatura ambiente, na proporção de 40 µl da
solução de trabalho para 10 µl de sêmen.
A integridade do acrossomo foi avaliada em uma preparação úmida entre lâmina e
lamínula e observada em microscopia de epifluorescência (Axioskop, Zeiss, Alemanha) em
filtro com excitação de 492 nm e emissão de 517 nm na objetiva de 40X, alternada com
microscopia de campo claro, contadas 100 células por lâmina, classificadas quanto ao padrão de
coloração em quatro categorias: vivos – não se coram – são visíveis na microscopia de campo
claro; mortos – a célula apresenta-se com o núcleo corado em vermelho pelo PI; reação do
acrossomo verdadeira (RAV) – o acrossomo apresenta-se corado em verde pelo FITC-PNA e
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reação do acrossomo falsa (RAF) – o núcleo corado em vermelho (PI) e o acrossomo em verde
(FITC-PNA).
Trypan blue/Giemsa – TBG
A integridade do acrossomo foi avaliada empregando-se a técnica descrita por Didion et
al. (1989). A solução corante de Giemsa era preparada em cubeta plástica com 27 ml de água
deionizada acrescida de 3 ml da solução estoque de Giemsa (Merck). Foram depositados 50 µl
de trypan blue 0,4% (Sigma Aldrich do Brasil) com 50 µl de sêmen em tubo cônico e, incubados
em banho-maria (MD 100 – Fanem) a 37◦C por 20 minutos. Após, foram adicionados 2 mL de
TALP-sp sem albumina (PARISH et al., 1985) e as amostras submetidas à centrifugação
(Excelsa Baby I – Fanem) por 10 minutos a 800G, por duas vezes. O pellet obtido foi
ressuspendido, o esfregaço confeccionado e a lâmina seca a temperatura ambiente. Após fixar
em metanol por 5 minutos, e estarem secas, as lâminas foram imersas em Giemsa overnight. Em
seguida, as lâminas foram lavadas com água deionizada, secas e avaliadas ao microscópio
(Zeiss) com objetiva de 100X. Os espermatozóides foram classificados como: vivos –
acrossomo corado em roxo pelo Giemsa e região pós acrossomal não corada; mortos – corados
em azul na região pós acrossomal pelo trypan blue e acrossomo roxo corado pelo Giemsa; RAV
– acrossomo e região pós acrossomal não coradas e; RAF – acrossomo não corado e região pós
acrossomal corada em azul pelo trypan blue.
Análise estatística
Utilizou-se o Teste do Qui-quadrado para verificar os efeitos de fazenda, inseminador,
estação de monta (EM), touro, central de processamento de sêmen (central) e categoria de vaca
(CAT), sobre a taxa de gestação (TG).
Considerando a fórmula de Yule para cálculo de número de classes (Sampaio, 1998), e
ponderando a viabilidade econômica de resultados de programas de inseminação artificial,
conforme a avaliação de Fonseca (1991), os touros foram agrupados em três classes de taxa de
gestação (clTG):
1) Classe 1: gestação menor que 59,4%;
37
2) Classe 2: gestação de 59,4% a menor que 67,2%;
Classe 3: gestação de 67,2% a 86,1%.
Foi utilizado o teste de Duncan para identificar se houve diferença significativa nas
avaliações da integridade da membrana plasmática pela técnica de CFDA/PI e EN e da
integridade do acrossomo pelo FITC-PNA e TBG.
Para análise da associação entre as variáveis laboratoriais e destas com a taxa de gestação
foram estimados os coeficientes de correlação de Pearson utilizando o CORR do SAS (1995).
Utilizou-se a técnica multivariada de componentes principais pelos procedimentos,
PRINCOMP e CLUSTER do Pacote Estatístico do SAS (1995).
Resultados
Pelo teste de qui-quadrado pode-se observar efeito de estação de monta (χ2 = 30,68; p <
0,0001), touro (χ2 = 77,61; p < 0,0001), central (χ2 = 37,18; p < 0,0001) e inseminador (χ2 =
40,34; p < 0,0001).
Classes foram estabelecidas de acordo com a taxa de gestação, formando as classes 1, 2 e
3, sendo as médias (± desvio padrão) das características físicas, morfológicas e da integridade da
membrana plasmática e acrossomal apresentadas nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1. Características físicas e morfológicas (média ± desvio padrão) do sêmen congelado de touros utilizados em programas de inseminação artificial de acordo com as classes de taxa de gestação. Classes de taxa de gestação Variáveis* 1 2 3 Total Touros (n) 5 6 11 22 TG (%) 47,5±3,1a 63,1±2,4 b 71,7±5,4 c 63,8±10,6 Motilidade (%) 62±8,4 a,b 55±5,5 b 63,6±6,7 a 60,9±7,5 Concentração (x106/dose) 54,3±31,5 a 21,5±12,4 b 24,5±5,9 b 30,4±20,4 DEF ma (%) 10,1±4,3 a 12,2±6,6 a 12±4,9 a 11,6±5,1 DEF me (%) 4,4±3,4 a 2,2±2 a 2,1±1,8 a 2,6±2,4 DEF TOT (%) 14,4±4,3 a 14,3±7,3 a 13,9±4,2 a 14,1±5 *letras diferentes na mesma linha indicam diferença significativa entre as médias pelo teste de Duncan. DEF ma – defeitos maiores; DEF me – defeitos menores; DEF TOT – defeitos totais; TG – taxa de gestação. Classes de taxa de gestação: 1 – 51,6 ≤ 59,4; 2 – 59,4 ≤ 67,2; 3 – 67,2 ≤ 86,1.
38
Tabela 2. Integridade da membrana plasmática e acrossomal (média ± desvio padrão) do sêmen congelado de touros utilizados em programas de inseminação artificial de acordo com as classes de taxa de gestação. Classes de taxa de gestação Variáveis* 1 2 3 Total Touros (n) 5 6 11 22 TG (%) 47,5±3,1a 63,1±2,4 b 71,7±5,4 c 63,8±10,6 CFDA-I (%) 42,6±10,5 a 34,3±10,9 a 46±16,5 a 42±14,3 EN-V (%) 61,3±7,3 a 63,4±10,8a 65,8±13,4 a 64,1±11,3 PNA-V (%) 42,6±17,9 a 33,8±9,1 a 45,5±11,8 a 41,6±13,1 TBG-V (%) 61,4±13,3 a 54,5±6,3 a 61,9±13,2 a 59,8±12,2 *letras diferentes na mesma linha indicam diferença significativa entre as médias pelo teste de Duncan. TG – taxa de gestação; CFDA-I – diacetato de 6-carboxifluoresceína, íntegro; EN-V – eosina/nigrosina, vivo; PNA-V – Arachis
hypogaea conjugada ao isotiocianato de fluoresceína, vivo. Classes de taxa de gestação: 1 – 51,6 ≤ 59,4; 2 – 59,4 ≤ 67,2; 3 – 67,2 ≤ 86,1. .
Foi observada diferença significativa entre as diferentes classes de taxa de gestação tanto
para motilidade, como para concentração (x106/dose). Porém, não houve diferança significativa
nas diferentes classes de taxa de gestação entre as características morfológicas e de integridade da
membrana plasmática e do acrossomo. O percentual médio de células com membrana plasmática
íntegra obtido pela técnica da fluorescência (CFDA-I) foi cerca de 65% daquele resultante da
avaliação pela eosina/nigrosina (EN-V). Da mesma forma, os dados referentes a média de
espermatozóides vivos com acrossomo presente na técnica do FITC-PNA (PNA-V), foi cerca de
69% daquele obtido pela coloração com o Trypan blue/Giemsa (TBG-V).
As correlações de Pearson entre as variáveis laboratoriais são apresentadas na Tabela 3.
Tabela 3. Correlações de Pearson entre categorias dos testes de integridade da membrana plasmática e do acrossomo. Variáveis* r** P
CFDA-I x EN-V 0,54 0,01 PNA-V x TBG-V 0,78 0,0001 EN-V x TBG-V 0,66 0,0009 CFDA-I x PNA-V 0,83 0,0001 *CFDA-I – diacetato de 6-carboxifluoresceína, íntegro; EN-V – eosina/nigrosina, vivo; PNA-V – Arachis hypogaea
conjugada ao isotiocianato de fluoresceína, vivo; TBG-V – Trypan blue/Giemsa, vivo. ** r = coeficiente de correlação de Pearson.
Os testes para avaliar a integridade da membrana plasmática CFDA-I x EN-V (r = 0,54;
p < 0,01) e integridade do acrossomo PNA-V x TBG-V (r = 0,78; p < 0,0001) no geral, tiveram
média e alta correlação entre si, respectivamente. Além disso, as técnicas de fluorescência
39
(CFDA-I x PNA-V r = 0,83; p < 0,0001) bem como as técnicas com corantes não fluorescentes
(EN-V x TBG-V r = 0,66; p < 0,0009) tiveram alta correlação.
Os testes foram separados em quatro modelos diferentes em relação a taxa de gestação,
onde todos os modelos eram compostos por motilidade, concentração, percentagem de normais
além de FDA-I e TBG-V - modelo 1; FDA-I e PNA-V - modelo 2; EN-V e TBG-V - modelo 3 e
EN-V e PNA-V - modelo 4.
As correlações de Pearson entre as variáveis laboratoriais e taxa de gestação por modelo
são apresentadas por modelos na Tabela 4.
Tabela 4. Correlações de Pearson entre os modelos por taxa de gestação. Modelo Variáveis* r** P
1 Motilidade 0,53 =0,01 Concentração 0,99 <0,0001 CFDA-I 0,95 <0,0001 TBG-V 0,88 <0,0001 2 Motilidade 0,52 =0,01 Concentração 0,98 <0,0001 CFDA-I 0,95 <0,0001 PNA-V 0,93 <0,0001 3 Motilidade 0,50 =0,01 Concentração 0,99 <0,0001 EN-V 0,87 <0,0001 TBG-V 0,92 <0,0001 4 Motilidade 0,51 =0,01 Concentração 0,99 <0,0001 EN-V 0,76 <0,0001 PNA-V 0,90 <0,0001 Geral Concentração 0,98 <0,0001 CFDA-I 0,92 <0,0001 PNA-V 0,92 <0,0001 TBG-V 0,90 <0,0001 EN-V 0,70 =0,0002 *CFDA-I – diacetato de 6-carboxifluoresceína, íntegro; EN-V – eosina/nigrosina, vivo; PNA-V – Arachis hypogaea
conjugada ao isotiocianato de fluoresceína, vivo; TBG-V – Trypan blue/Giemsa, vivo; TG – taxa de gestação. ** r = coeficiente de correlação de Pearson.
Os testes para avaliar a integridade da membrana plasmática - FDA e EN - tanto no
geral, quanto nos quatro modelos, obtiveram correlação significativa com a taxa de gestação. O
mesmo ocorreu com os testes para avaliar a integridade do acrossomo - PNA e TBG.
Os componentes principais selecionados foram os primeiros cuja soma dos autovalores
foi capaz de explicar um percentual mínimo de 78% da variação total da taxa de gestação no
40
modelo geral, 82% no modelo 1, 83% no modelo 2, 80% no modelo 3 e 77% no modelo 4 como
observado na Tabela 5.
Tabela 5. Autovalores e percentuais de variância explicados pelos componentes principais (CP). Modelo Componente principal Auto valor % Variância acumlada Geral CP1 522,627020 41,30 CP2 468,793358 78,34 1 CP1 468,578762 48,49 CP2 326,007050 82,23 2 CP1 468,202676 47,30 CP2 360,716094 83,74 3 CP1 469,346885 52,80 CP2 249,241889 80,84 4 CP1 468,299850 51,32 CP2 242,547178 77,91 *CP1 – componente principal 1; CP2 – componente principal 2.
Os dois componentes principais consideraram significativa as categorias viáveis dos
testes CFDA/PI, EN, FITC-PNA/PI e TBG no modelo geral; CFDA/PI e TBG no modelo 1;
CFDA/PI e FITC-PNA/PI no modelo 2; EN e TBG no modelo 3 e EN e FITC-PNA/PI no
modelo 4.
Discussão
A fertilidade do touro é um fator importante, pois um único ejaculado pode ser usado para
inseminar inúmeras matrizes. Quando se avalia amostras de sêmen criopreservado o principal
objetivo é estimar a fertilidade antes do uso na inseminação artificial. No presente estudo foi
avaliada a relação entre diferentes parâmetros espermáticos e destes com a fertilidade in vivo. A
complexidade do processo de fecundação faz com que parâmetros individuais não sejam
suficientes para estimar a fertilidade de uma amostra de sêmen criopreservado. Por outro lado, a
combinação de vários parâmetros pode aumentar a estimação da fertilidade (ERICSSON et al.,
1993). A busca de novos métodos para estimar a fertilidade in vivo de um reprodutor vem sendo
estudada por vários autores, mas grande variação é encontrada entre os resultados.
41
Embora vários métodos possam ser usados para avaliar a qualidade de uma amostra de
sêmen, a avaliação subjetiva da motilidade é o procedimento mais rotineiramente utilizado
(CHRISTENSEN et al., 2005). Para que se obtenha uma taxa de prenhez satisfatória, a
motilidade espermática em sêmen criopreservado deve ser de no mínimo de 30% (CBRA, 1998).
No presente estudo a motilidade média (± desvio padrão) encontrada foi 60,9 ± 7,5%. Esse
resultado está de acordo com o descrito por vários autores (HALLAP et al., 2006;
JANUSKAUSKAS et al., 2003; 2001; 2000a; 2000b). Além disso, quando separado em modelos,
correlação positiva foi encontrada entre motilidade e fertilidade in vivo (r = 0,53; r = 0,52; r =
0,50; r = 0,51; p = 0,01 para ao modelos 1, 2, 3 e 4 respectivamente) assim como o observado por
Zhang et al. (1998), Amman e Hammerstedt (2002), Christensen et al.(2005), Gillan et al.(2007)
e Lindford et al. (1976).
Quanto a concentração (30,4 ± 20,4 x 106), esta está dentro do recomendado pelo CBRA
(1998), ou seja, acima de 6 x 106 de espermatozóides viáveis por dose e correlação positiva com
fertilidade in vivo foi encontrada tanto nos modelos como no geral (r = 0,53; p < 0,0001).
Além da motilidade e concentração, a morfologia é outra característica avaliada
rotineiramente. Ericsson et al. (1993), Tartaglione e Ritta (2004) e Hallap et al. (2006) também
obtiveram médias satisfatórias para morfologia (80 ± 10% de morfologicamente normais, 9,1 ±
1,7 e 2,8 ± 0,3 de defeitos totais, respectivamente) como observado neste estudo, onde os
percentuais de defeitos maiores (11,6 ± 5,1), menores (2,6 ± 2,4) e totais (14,1 ± 5), também
atendem ao estipulado pelo CBRA (1998) que é até 20% para defeitos maiores e até 30% para
defeitos totais em dose com 10 x 106 de espermatozóides com motilidade progressiva, porém não
foi observada correlação significativa com fertilidade in vivo.
Vários eventos, durante a fecundação, como a capacitação espermática, reação do
acrossomo e fusão com o ovócito, requerem uma membrana plasmática intacta
(TARTAGLIONE; RITTA, 2004). Além de ser importante para o metabolismo espermático, a
membrana plasmática tem a habilidade de permitir o transporte seletivo de moléculas, mas
quando lesada, é incapaz de regenerar-se (JEYENDRAN et al., 1984). Dessa forma, a avaliação
da integridade da membrana é de fundamental importância, sendo a coloração fluorescente
CFDA/PI (GARNER et al., 1986; GILLAN et al., 2005) e coloração pela eosina-nigrosina,
métodos amplamente utilizados. Neste estudo o percentual médio de espermatozóides íntegros
42
obtidos pela técnica de fluorescência foi 42 ± 14,3 e pela eosina-nigrosina 64,1 ± 11,3. De acordo
com Brito et al. (2003) é improvável que o peso molecular dos corantes (eosina Y = 647,89 Da;
PI = 668,39 Da) seja responsável pela diferença dos valores obtidos. Uma possível explicação
para essa diferença é o tempo de exposição ao corante (eosina-nigrosina = 30 segundos x
CFDA/PI = 10-30 minutos) e uma maior sensibilidade dos corantes fluorescentes (BRITO et al.,
2003; BORG et al., 1997). Além disso, pequenas lesões podem não ser detectadas pela eosina
devido a sua lenta passagem pela membrana plasmática. Assim, células lesadas podem ser
erroneamente classificadas como vivas (BORG et al., 1997). A correlação entre as técnicas foi
significativa (r = 0,54; p < 0,01), estando de acordo com o resultado (r = 0,92; p < 0,01)
encontrado por Brito et al. (2003). Os resultados também demonstraram correlação entre
integridade de membrana e fertilidade in vivo tanto nos modelos como no geral (r = 0,92; p <
0,0001 para CFDA/PI e r = 0,70; p < 0,0001 para EN). Porém, a relação entre fertilidade e
integridade de membrana nem sempre tem sido estatisticamente significativa como observado por
Januskauskas et al. (1999), Garcia-Macias et al. (2007) e Lindford et al. (1976).
Assim como a integridade de membrana, preservar a integridade do acrossomo em sêmen
criopreservado é de fundamental importância para a fecundação (HOLT, 2000). O acrossomo é
um lisossomo que, após a reação do acrossomo, libera seu conteúdo enzimático e então o
espermatozóide é capaz de fertilizar o ovócito. Portanto, grande ênfase vem sendo dada a
avaliação da integridade do acrossomo, como relatado em revisão recente de Gillan et al. (2007).
Neste experimento foram testadas sondas fluorescentes FITC-PNA/PI e o corante TBG. Os
valores médios obtidos para percentagem de células vivas com acrossomo intacto pela técnica
FITC-PNA/PI foi 41,6 ± 13,1. Este foi menor que o observado pelo trypan blue-Giemsa, de 59,8
± 12,2%. Segundo Cross e Meizel (1989) essa discrepância pode se dever ao fato dos corantes
fluorescentes serem mais sensíveis, produzirem maior intensidade e contraste e não gerarem
ambiguidade à interpretação como o trypan blue. Além disso, Talbot e Chacon (1981) e
Suttiyotin e Thwaites (1991) observaram que o trypan blue possui uma lenta passagem através da
membrana plasmática podendo superestimar a população de vivos como observado por Brito et
al. (2003). No presente estudo as técnicas tiveram alta correlação entre si (r = 0,78; p < 0,0001).
Correlação positiva também foi observada com a fertilidade in vivo tanto nos modelos como no
geral (r = 0,92; p < 0,0001 para FITC-PNA/PI e r = 0,90; p < 0,0001 para TBG).
43
Tanto os testes para a integridade da membrana plasmática quanto para integridade do
acrossomo apresentaram correlação com a fertilidade in vivo, ainda a análise de componentes
principais mostrou que juntos foram responsáveis por 78% da variação na taxa de gestação.
Conclusões
O presente estudo demonstrou correlação positiva entre as técnicas para avaliação da
integridade da membrana plasmática e integridade do acrossomo e individualmente correlação
positiva com a fertilidade in vivo. A análise de componetes principais demonstrou que estas
explicaram 78% da variação nas taxas de gestação. Assim, os testes podem ser incorporados à
avaliação de sêmen criopreservado de touros para estimar seu potencial fecundante.
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