UNIVERSIDADE DA BEIRA INTERIOR

Ciências

Avaliação de alguns métodos de extração de

substâncias bioativas de microalgas

Cahilo Manuel Martins

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Química Medicinal

(2º ciclo de estudos)

Orientador: Prof. Doutor Rogério Manuel dos Santos Simões

Co-orientador: Prof. Doutor Jesus Miguel Lopez Rodilla

Covilhã, janeiro de 2019

ii

Agradecimentos

Em primeiro lugar agradeço a Deus por me amparar nos momentos difíceis e me dar forças

interior, para superar as dificuldades, mostradas ao longo do caminho nas horas incertas em

suprir todas a minhas necessidades;

Aos meu pais por tudo que têm feito por mim pela educação que me passaram. vós sois meus

heróis;

A minha querida esposa Ilda Catarina Segunda Martins, que é minha amiga e meu amor. Sem

seu apoio a caminhada até aqui seria mais dura e árdua. Obrigada por sempre estar ao meu

lado e me compreender quando nem eu mesmo fui capaz!

Ao professor Doutor Rogério Manuel dos Santos Simões, pela oportunidade de aprender com

ele, pela amizade, e troca constante de conhecimento e por ter acreditado no meu trabalho;

Aos queridos amigos, professores, sem esquecer da professora Cândida Tomás por ser um

exemplo de coração humilde, por sua amizade e que no momento difíceis esteve ao meu lado

a encorajar de que podia vencer;

Ao professor Paulo Almeida, ao professor Samuel Silvestre, a professora Isabel Gonçalves e

todos os professores do curso de Química medicinal de uma forma me ajudaram na construção

dos meus conhecimentos;

Aos colegas de laboratório que sempre estiveram ao meu lado para me ajudar em especial

João Parente e Henrique Guilherme.

Ao chefe Manuel Gouveia pelo incentivo nos meus estudos, como o Director da Universidade

José Eduardo dos Santos o DR: Victor Silva.

Aos meus irmãos e seus respetivos. Se me fosse dada a oportunidade de escolher minha

família, vocês seriam os escolhidos. Amo cada um de vocês com todo meu coração. Obrigada

pelo apoio e pelos ótimos momentos que passamos juntos

A todos que de uma forma ou de outra contribuíram para a minha formação pessoal e

profissional, a vocês meus queridos amigos que Deus os abençoe. Muito obrigado!

iii

Resumo As microalgas têm sido objecto de muitos estudos nos últimos anos tendo em vista a sua

aplicabilidade nas indústrias de alimentos e farmacêutica, nas áreas da biomedicina e

ambiental, bem como na produção de energia renovável. As aplicações ambientais das

microalgas incluem a bio-fixação de CO2, a remoção de matéria orgânica e metais tóxicos de

efluentes, a produção de biocombustíveis como biodiesel e bioetanol. De entre as microalgas

estudadas, a Chlorella tem apresentado grande potencial de utilização em todos esses

sectores, com destaque especial na área de saúde.

No presente trabalho realizou-se o crescimento da microalga Chlorella vulgaris, testaram-se

alguns métodos de extracção de lípidos e identificaram-se alguns desses compostos presentes

na biomassa algas, utilizando a técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de

massa.

Palavras-chave: microalgas; Chlorella vulgaris; lípidos; aplicações na saúde.

iv

Abstract

Microalgae have been the subject of many studies in recent years aiming to evaluate their

applicability in the food and pharmaceutical industries, in the areas of biomedicine and the

environment, and in the production of renewable energy, as well. Environmental applications

of microalgae include bio-fixing of CO2, removal of organic matter and toxic metals from

effluents, production of biofuels such as biodiesel and bioethanol. Among the microalgae

studied, Chlorella has presented great potential of use in all these sectors, with special

emphasis in the health area.

In the present work, the microalgae Chlorella vulgaris was grown, some lipid extraction

methods were tested and some of these compounds were identified in the algal biomass using

the gas chromatography coupled to mass spectrometry.

Key-words: microalgae; Chlorella vulgaris; lipids; applications in health.

v

Índice

INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

1.1 Benefícios dos compostos bioactivos, incluindo os ácidos gordos polinsaturados na saúde ...................................................................................................... 1

1.2 Microalgas .......................................................................................... 2

1.3 Substâncias bioactivas em microalgas. ...................................................... 4

1.3.1 Carotenoides. .................................................................................... 5

1.3.2 Ácidos gordos polinsaturados. .............................................................. 6

1.4 Métodos de lise celular e extração de compostos activos ............................... 7

Capítulo:2 ....................................................................................................... 9

2.1 Objectivo do trabalho ........................................................................... 9

Capítulo:3 ..................................................................................................... 10

3 Materiais e métodos .................................................................................. 10

3.1 Reagentes e solventes ......................................................................... 10

3.2 Microalgas ........................................................................................ 10

3.3 Métodos ........................................................................................... 11

3.3.1 Produção de biomassa alga ............................................................. 11

3.3.2 Produção de biomassa algas em reator cilíndrico de 1L ......................... 12

3.3.3 Produção de biomassa algas em reator cilíndrico de 5L ......................... 12

3.3.4 Produção de biomassa algas em reator de flat-plate descontínuo ............ 13

3.3.5 Manutenção e controlo do processo. ................................................ 13

3.4 Desintegração celular e extração de lípidos .............................................. 14

3.4.4 Identificação e quantificação de compostos ....................................... 18

4 Resultados e discussão .................................................................................. 21

4.1 Crescimento da biomassa ..................................................................... 21

4.1.1 Reactores com volumes diferentes e a mesma geometria ...................... 21

4.1.2 Reactores com geometrias diferentes ............................................... 22

4.2 Rotura da biomassa e Extração .............................................................. 23

4.2.1 Ensaios de rotura ......................................................................... 23

4.2.2 Identificação dos componentes dos extratos ....................................... 26

Capítulo 5 ..................................................................................................... 31

Conclusões e perspetivas futuras..................................................................... 31

Capítulo 6 ..................................................................................................... 32

Referência bibliografia.................................................................................. 32

Anexos ......................................................................................................... 37

Anexos de aspectos das estruturas dos lípidos .................................................... 37

vi

Lista de figuras

Figura 1.1 – Imagem de reactor fechado industrial;

Figura 1.2 - Estrutura das moléculas B-Carotenos e vitamina A;

Figura 1.3 - Estrutura de alguns ácidos gordos.

Figura 3.1 – Fermentadores diversos com culturas de microalgas;

Figura 3.2 – Fotobioreator cilíndrico de 1litro;

Figura 3.3 – Fotobioreator cilíndrico de 5 litros;

Figura 3.4 – Fotobioreator flat-plate;

Figura 3.5 – Reta de calibração da biomassa;

Figura 3.6 – Pré-tratamento da biomassa;

Figura 3.7 – Evaporador rotativo;

Figura 3.8 – Esquema do processo de extração;

Figura 3.9 – Balão de decantação ilustrando a separação de fases;

Figura 3.10 – Equipamento LC-MC/LC-GS;

Figura 3.11 – Absorvância versos concentração de ácido linoleico;

Figura 4.1- concentração de biomassa de algas produzidas ao longo do tempo na primeira

série de crescimento em reatores cilíndricos de 1l e 5l;

Figura 4.2- Ph do meio de cultura ao longo do tempo todas as manhãs antes de ajustar a ph

7,5 da primeira série de ensaios;

Figura 4.3 – Figura: 4.3- flat-plate série 1 e reator de 5l série 2;

Figura 4.4 – Massa de extrato obtida para diferentes condições de concentração celular;

Figura 4.5 – Visualização da migração de compostos numa proporção de 7/3 e lâmpada

ultravisível.

Figura 4.6 – Cromatografia (GC) do extracto de clorofórmio (esquerda) e metanol (direita) da

biomassa algas após a desconstrução celular com ácido sulfúrico.

Figura 4.7 - Espetro de massa do pico dos 23min:55 seg.

Figuras 4.8 - Estruturas destacadas de acordo com a nomenclatura acima mencionada.

vii

Listas de tabelas

Tabela 3.1 – Constante dieléctrica, índice de polaridade e massa volumétrica de diferentes

solventes usados na extração;

Tabela 3.2 - Solução stock de nutrientes;

Tabela 3.3 – Métodos de desintegração celular usada na fase preliminar do trabalho;

Tabela 3.4 – Composição temporal do eluente;

Tabela 4.1 - Métodos de desintegração celular usada na fase preliminar do trabalho;

Tabela 4.2 – Volume de solvente aplicado no processo de extração;

Tabela 4.3 – Volume de solvente efetivamente medidos após o processo de extração;

Tabela 4.4 – Aspetos qualitativos dos cromatogramas.

viii

Lista de acrónimos. Abreviaturas e símbolos

CO2 – Dióxido de carbono;

CHCl3 – clorofórmio ou triclorometano;

PUFAs – ácidos gordos polinsaturados;

DHA – ácido docoso-hexaenoico;

H2SO4 – ácido sulfúrico;

NaOH -Hidróxido de sódio;

pH – escala numérica adimensional utilizado para especificar acidez ou basicidade;

Pellet- resido da biomassa;

LC-MS – Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa;

GC-MS – Cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa;

% - percentagem;

MS - moagem do material seco;

HM 1min - homogeneizador mecânico 10000 rpm 1 min;

M+E - moagem → enzima;

P+E - pressão → enzima;

HM 24000 rpm - homogeneizador mecânico 24000 rpm, 1 min;

HA - hidrólise ácida;

P+U - pressão → ultrassons;

P branco - Pressão (68 atmosferas);

MC - moagem criogénica;

MC+U - moagem criogénico → ultrassons;

HM 5min - homogeneizador mecânico 10000 rpm 5 min;

µm - Micromentro;

kg - Quilogramas.

1

Capítulo 1

INTRODUÇÃO

1.1 Benefícios dos compostos bioactivos, incluindo os ácidos gordos

polinsaturados na saúde

As microalgas são micro-organismo reconhecidos como fonte natural de grande importância

de novos compostos funcionais, tais como as vitaminas, minerais e proteínas, bem como

carotenoides, lípidos e polissacáridos; podem ainda ser usadas diretamente como suplementos

alimentares para alimentos saudáveis. A Chlorella vulgaris são algas verdes unicelulares,

cultivadas principalmente em lagoas de água doce, onde se adaptam e desenvolvem com

facilidade. Estudos diversos mostraram que o consumo das algas do género Chlorella tem

vários benefícios para a saúde humana, nomeadamente efeitos anti-proliferativos sobre

células cancerosas, atividade anti-inflamatória e anti-oxidante (SALAS-CORONADO1 et al

2016, SAULI, E.& R. SARBATLY et al 21012, LIANG et al 2009). Por exemplo, os esteroides

extraídos do género Chlorella têm uma longa história e provaram ter efeitos importantes na

atividade antifúngica, nomeadamente o ergosterol e seus análogos. Assim, um método

eficiente para o isolamento e purificação de esteroides da Chlorella vulgaris em quantidades

razoáveis é de grande importância para novas investigações sobre os seus efeitos biológicos e

para o desenvolvimento de novos produtos para a área da saúde (JIANBING WU,2017). De

fato, as microalgas apesar de receberem uma especial atenção como uma fonte de lípidos

(transformável em biodiesel) também têm sido objeto de interesse por parte da indústria

farmacêutica, como fonte de esteroides, ácidos gordos polinsaturados, conhecidos por PUFA,

polissacáridos e carotenoides (MOTONOBU GOTO et 2015), entre outros (ARJUNA, et al 2016

TRARCILLA al.; 2016). As algas fazem parte de sistemas ecológicos complexos,

interdependentes e competitivos, tendo-se adaptado às mais diversas condições ambientais

através da biossíntese de metabolitos secundários, como estratégia de sobrevivência

(CARDOZO et al, 2007). Inúmeras atividades biológicas foram relatadas na literatura

incluindo atividades anti-oxidante, anti-inflamatória, imuno-modulatória, anti-virais e

antimicrobianas, entre outros, demonstrando o potencial destes organismos (SMIT et al,

2004).

As microalgas têm um potencial biotecnológico excepcional, uma vez que produzem

substâncias naturais e biomateriais que podem encontrar aplicações industrial diversificadas,

além de constituírem alternativas às fontes não renováveis. No entanto, existem ainda alguns

constrangimentos à sua exploração industrial. Por exemplo, a viabilidade económica da

produção de biodiesel a partir dos lípidos das algas ainda não está assegurada, principalmente

devido aos altos custos de colheita e secagem de biomassa. A viabilidade melhora quando se

2

considera a exploração das microalgas nas suas diferentes vertentes; i.e. energética,

ambiental e de produtos de elevado valor em produção em grande escala (ACKMAN, R. G.

WCOT, 1987 e RAFAEL SILVA MENEZES et al, 2013)

Algumas vantagens das microalgas são as seguintes: apresentam um ciclo de vida curto e altas

taxas de crescimento; permitem condições de cultivo diversificadas, além da possibilidade de

colheita durante todo o ano; não há necessidade de agroquímicos; exigem uma área

significativamente reduzida para o cultivo e, consequentemente, usam um volume reduzido

de água potável; podem ser cultivadas em terras não agrícolas, causando um impacto menor,

se não inexistente, no fornecimento global de alimentos. Ao contrário de outros tipos de

matérias-primas, que são produzidas em grandes extensões de terras agrícolas, as microalgas

não competem com a produção de tais produtos para a alimentação humana.

A produção de lípidos por via das microalgas é uma alternativa cujo interesse tem crescido

consideravelmente (ARJUNA et al,2014). Entre os lípidos, têm particular interesse os ácidos

gordos do tipo ómega-3, sendo a sua produção a partir de microalgas utilizando substratos

sustentáveis e condições de cultura que optimizem o rendimento em ácidos gordos

polinsaturados um grande desafio (JANG et al, 2005).

No entanto o principal desafio na produção dos ácidos gordos polinsaturados é a seleção de

estirpes que produzam grande quantidade de biomassa e apresentem alto rendimento de

ácidos gordos com elevado teor em ómega-3 (LI et al,2008 & *, CARL et al.;2009). Um dos

caminhos que tem vindo a ser explorado é a modificação do metabolismo das microalgas

favorecendo a produção de ω-3 PUFA.

1.2 Microalgas

As algas são organismos muito diversos, predominantemente autotróficos, presentes no

ambiente aquático e nos mais diversos ambientes onde há humidade, sendo o termo

completamente desprovido de valor taxonómico, visto que designa organismos muitos

distintos entre si quanto à sua origem, composição química e morfologia. As algas pertencem

a diversas divisões e classes baseadas em muitos casos na coloração dos indivíduos (VAN DEN

HOECK et al, 1995). A sua coloração variada é proporcionada pela presença de pigmentos.

Estes organismos podem ser unicelulares ou multicelular (KWIETNIEWSKA et al.;2012); são

seres com a capacidade de realizar a fotossíntese, porém não possuem folhas, raízes e nem

tecidos vasculares (VAN DE HOECK et al,1995). As microalgas são predominantemente

aquáticas e geralmente microscópicas unicelulares, podendo formar colónias e apresentar

pouca ou nenhuma diferenciação celular.

As algas aquáticas, tais como a Chlorella vulgaris, exercem um papel ecológico importante,

semelhante ao das plantas no que diz respeito ao habitat terrestre, pois são os produtores

primários no ambiente (RAVE NET et al.;2007).

As microalgas são micro-organismos com clorofila e outros pigmentos fotossintéticos capazes

de realizar a fotossíntese e libertar oxigénio. São capazes de captar CO2 e utilizar a luz como

3

fonte de energia para produzir biomassa e oxigênio, tendo assim um impacto significativo no

balanço global de oxigénio e CO2. As algas, bem como as microalgas, desempenham um papel

central no ciclo do carbono e são responsáveis pela libertação de 50% do oxigénio atmosférico

e pela fixação de carbono.

Para além de preferencialmente autotróficas, apresentam metabolismo heterotrófico e

amiotrófico, possibilitando-lhes tirar proveito de diferentes fontes de energia e carbono para

o crescimento (CRISAL ZUNIGA, 2016). Existem mais de cem mil espécies diferente de micro-

organismo pertencente a família das algas. As algas são facilmente cultivadas e podem ser

manipuladas para produzirem grandes quantidade, sem que haja distúrbio em habitats

naturais ou fonte de alimentos.

A microalga verde Chlorella vulgaris tem sido amplamente reconhecida como um candidato

promissor para a produção de biocombustíveis devido à sua capacidade de armazenar alto

teor de lipídios e à sua versatilidade metabólica natural. Sob condições óptimas, podem ser

cultivadas gerando grande quantidades de biomassa.

As algas são importantes fontes de compostos essenciais para a nutrição humana. Em muitos

países, a indústria alimentar consome uma grande quantidade de algas bastantes conhecidas,

entre elas a Chlorella vulgaris, por fornecerem grande quantidade de fibras, minerais

vitaminas, proteínas e anti-oxidante; nos últimos tempos, observa-se um esforço no

desenvolvimento do cultivo em larga escala em detrimento da exploração indiscriminada dos

bancos naturais. Os compostos mais explorados são os ácidos gordos e esteróis, carotenoides,

lípidos, micospirinas tipo aminoácido (CARDOZO et at, 2007).

Os primeiros interessados em verificar a atividade anti-oxidante de algas foram os japoneses,

com objectivos de obter novos aditivos antioxidantes para alimentos, em substituição dos

antioxidantes sintéticas. Mesmo com o desenvolvimento dos processos sintéticos para a

obtenção de novas moléculas a partir do final do XIX, os produtos naturais sempre exerceram

um papel importante na pesquisa de novos compostos farmacêuticos ativos. Este facto deve-

se à grande complexidade estrutural de alguns de seus princípios ativos. Atualmente, uma

grande percentagem dos fármacos clinicamente viáveis e comercialmente disponíveis com

atividades anti-tumoral e anti-inflamatório ou anti-infeciosa, por exemplo, tem origem em

produtos naturais (Shu,1998).

A microalga unicelular Chlorella vulgaris, da família Chlorophyta, serve há muito tempo como

organismo modelo. As estirpes apresentam flexibilidade metabólica substancial em resposta a

perturbações ambientais; além disso, são capazes de usar nutrientes (ou seja, carbono

orgânico e minerais) diretamente das águas residuais para o crescimento, tornando-se

fábricas celulares atraentes para processos de produção biosustentáveis (CRISAL ZUNIGA,

2016).

À escala industrial, uma boa parte das microalgas são produzidas em lagoas artificiais abertas

(tipo “race way”)) operados continuamente, de modo que o CO2 e os nutrientes são

constantemente adicionados, enquanto as microalgas são recolhidas na extremidade oposta

4

para manter o sistema em estado estacionário. Nestes casos, recomendam-se lagoas com um

volume máximo de 30 m3 para o melhor desempenho.

O cultivo de microalgas em lagoas do tipo “race way” requer pouco investimento para

construção e manutenção, enquanto os tanques podem ser ampliados facilmente. No entanto,

as condições reinantes nestas lagoas são difíceis de controlar, têm baixa eficiência de

produção e são susceptíveis à contaminação. Esse sistema requer grandes áreas de cultura,

mistura eficiente e sofrem a falta de CO2 suficiente e luz limitada nas camadas inferiores. Os

sistemas abertos são usados comercialmente para produzir algumas estirpes de microalgas

com condições de crescimento muito específicas; por exemplo, Chlorella sp., Spirinula sp., e

Dunaliella salina Dunal (SALAS-CORONADO et al, 2016). Porém, existem explorações

industriais em fotobioreator fechado como está ilustrado na imagem abaixo.

Figura:1.1 Imagem de reator fechado industrial.

1.3 Substâncias bioactivas em microalgas.

O interesse inicial pelo estudo de substâncias com atividade antioxidante (AAO) em algas

surgiu no Japão, na busca de novos aditivos para alimentos, em substituição dos antioxidantes

sintéticos utilizados, como o hidroxianisol butilado e o hidroxitolueno butilado, os quais

mostravam efeitos carcinogénicos, alterações enzimáticas e lipídicas em animais. O facto de

as algas secas poderem ser armazenadas por um longo período de tempo, sem o perigo da

deterioração oxidativa, apesar de apresentarem mais de 30% do total dos seus ácidos gordo na

forma de cadeias polinsaturadas (principalmente as algas chlorella vulgaris), despertou o

interesse dos pesquisadores em relação aos produtos antioxidantes presente nessas algas.

Para avaliarem o potencial das substâncias antioxidantes presentes nas microalgas usaram o

teste da estabilidade do éster metílico do óleo de algas e constataram que 60% das frações

solúveis em clorofórmio (CHCl3) dos extratos das algas testadas foram capazes de estender o

período de indução da reação do substrato éster (tempo necessário para atingir um ponto

5

crítico de oxidação). As algas Chlorella vulgaris, em geral, apresentaram maior atividade

antioxidante. Por outro lado, a biossíntese de ácidos gordos polinsaturados, como o ácido

linoleico desempenha um papel essencial na resposta de plantas e outros organismos ao

abaixamento da temperatura. A introdução de uma ou mais ligações duplas cis nas cadeias de

hidrocarbonetos de ácidos gordos confere propriedades de fluidização às biomembranas. Um

grande volume de trabalho suporta o papel das desnaturases de ácidos gordos como parte de

um sistema de controlo em feedback em que a fluidez da membrana é mantida perto de um

certo nível, apesar das mudanças na temperatura ambiente. Esta homeoviscosidade parece

ser importante nos organismos fotossintéticos para uma ótima função do cloroplasto a baixas

temperaturas.

1.3.1 Carotenoides.

Carotenoides são substâncias químicas do tipo pigmento que encontramos em abundância na

natureza, desde as bactérias, algas e fungos, até às plantas e animais. São os carotenoides

que na natureza conferem os tons de amarelo ao vermelho. Plantas, algas, fungos e bactérias

conseguem sintetizá-los, já os animais não, devendo adquiri-los através da dieta. Os

carotenoides são caracterizados por serem lipossolúveis e por terem grupos oxidáveis.

A sua estrutura química pertence à classe dos tetraterpenoides, tendo a propriedade de

absorver luz visível em diferentes comprimentos de ondas. Na natureza encontramos mais de

900 tipos de carotenoides, estando os comprimentos de onda onde absorvem radiação

associados ao alongamento de cadeia, isomerização, migração de duplas ligações,

hidrogenação, desidrogenação, ciclização, entre outros. Podem ser divididos em duas classes:

carotenos e xantofilas. A figura seguinte ilustra a estrutura do β-caroteno e da vitamina A,

derivada do β-caroteno.

Molécula de β-caroteno.

Molécula de vitamina A.

Figura: 1.2 – Estrutura das moléculas de β-caroteno e vitamina A.

6

Os carotenoides que apresentam apenas carbono e hidrogênio na molécula são chamados de

carotenos, e são sintetizados a partir de derivados do isopreno (cinco carbonos),

apresentando um número variável de ligações duplas conjugadas. É o composto que confere o

tom amarelo-alaranjado à cenoura. Já as xantofilas, para além de carbono e hidrogênio,

contêm grupos com oxigênio, hidroxilo, cetonas, etc. São elas que conferem a coloração que

vai do amarelo ao marrom-avermelhado. Exemplo: luteína, mixol e zeaxantina.

Os carotenoides são a segunda classe de pigmentos mais importante no processo de

fotossíntese, a seguir à clorofila. São os responsáveis pela coloração da laranja, do maracujá,

da abóbora, do tomate, por exemplo. E ainda estão presentes na coloração de alguns animais,

como caranguejos, camarão, flamingos e guarás que o adquirem através da alimentação. Na

fotossíntese absorvem luz e protegem a clorofila contra a oxidação por excesso de luz.

As funções dos carotenoides no organismo humano não estão completamente determinadas,

mas sabemos que desempenham um papel importantíssimo. Estudos recentes têm mostrado a

importância dessas substâncias como antioxidantes, na prevenção de doenças mediadas por

radicais livres, contra o cancro e ainda podem atuar como reguladores do sistema

imunológico.

1.3.2 Ácidos gordos polinsaturados.

Os ácidos gordos polinsaturados conhecidos com PUFAs desempenham uma função

fundamental no que toca ao metabolismo celular, bem como ao transporte de eletrões

(Karina. HM et al, 2007). Os ácidos gordos fazem parte da dieta humana, apresentando

efeitos terapêuticos positivos, para além de desempenharem um papel fundamental na

indústria de alimentos. Os ácidos gordos extraídos das microalgas podem ser utilizados como

alimentos, fármacos ou transformados em biocombustível. A figura 1.2 ilustra a estrutura de

alguns ácidos gordos.

Ácido Palmítico

Ácido Linoleico

7

Ácido Oleico

Ácido Palmitoleico

Figura: 1.3– Estrutura de alguns ácidos gordos.

Os suplementos derivados de algas com ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa (LC) do

tipo omega-3 (n-3) (LCn-3PUFA) podem aumentar significativamente o nível desses ácidos em

produtos de origem animal. A deposição de LCn-3PUFA, especificamente o ácido

eicosapentaenóico (EPA, 20: 5n-3) e o ácido docosa-hexaenóico (DHA, 22: 6n-3), em músculo

e leite aumentou quando as ovelhas foram alimentadas com algas marinhas (BOHUSTSKYI,

BAUWER et al, 2016). Por outro lado, há indicações de que a nutrição com materiais com

elevados teores de ómega-3 PUFA entre a concepção e o desmame pode alterar o

metabolismo da gordura e a acumulação de LCn-3PUFA no novo ser vivo. Um efeito deste tipo

foi observado em cordeiros quando a progenitora foi alimentada com algas. Isso levanta a

questão de saber se a expressão génica foi alterada pela interação nutricional, mas os

resultados até à data são inconclusivos (KUMORE, BHAVANATH et al, 2013).

1.4 Métodos de lise celular e extração de compostos activos

Uma das funções da parede celular é proteger as células contra danos físicos, mecânicos ou

químicos; a parede celular típica aparece nas espécies eucariotas, sendo uma estrutura rígida

que envolve o protoplasto (KWIETNIEWSKA et al.; 2012; SALAM VELASQUEZ-ORTA; HARVEY et

al, 2016). Devido à espessura e composição química e estrutural da parede celular, bem como

às suas funções metabólicas, as microalgas retêm os lipídios no seu interior. Assim, é

necessário usar métodos para a sua libertação e extração. Para a realização da rotura celular

existem diversos métodos: mecânicos, físicos, químicos e enzimáticos. Para além da

tradicional prensa mecânica (“French cell press”), existem os ultrassonificadores e

homogeneizadores de vários tipos, ciclos de congelamento/descongelamento, produtos

químicos, bem como enzimas específicas (ROCHA FD et al 2014). Para além da lise celular, é

naturalmente necessário proceder ao processo de extração do/s componente/s desejados,

podendo usar-se os solventes convencionais ou, mais recentemente, fluidos em estado

supercrítico, nomeadamente o CO2, eventualmente com outro co-solvente (ROCHA FD et al

2014). A extração do/s componente/s desejados com solvente/s é o método mais comum

8

devido às suas vantagens económicas e técnicas; a escolha do/s solvente/s obedece a

critérios de solubilidade e seletividade face ao/s produto/s a extrair, no presente trabalho os

lípidos.

As pesquisas na extração de lipídios de biomassa com solvente incluem o uso de diferentes

solventes e métodos melhorados aplicados a diferentes estirpes de microalgas, analisando-se

os rendimentos lipídicos face às condições de extração aplicadas.

De entre os processos testados, têm-se os solventes orgânicos e os líquidos iónicos,

precedidos por tratamento diversos. Os métodos de extração de lipídios baseados em

solventes orgânicos são em geral considerados de baixo custo, exigem investimentos de

capital modestos e são fáceis de ampliar (GEIGER et al, 2016). Os diferentes processos se

extração existentes visam romper a parede celular, para a posterior extração propriamente

dita dos lípidos. Embora a combinação de solventes polares e não-polares, como metanol

e clorofórmio são recomendados para uma maior eficiência de extração de lipídios da

biomassa de algas, deve notar-se que tais misturas (especialmente clorofórmio / metanol)

geralmente extraem lipídios polares (presumivelmente de membranas) e lipídios neutros (a

partir de gotículas lipídicas, altamente desejáveis para matéria-prima para a produção de

fármacos) (ZHANG et al,2011)

Assim, o sistema de solvente deve ser selecionado e otimizado tendo em consideração os

processos subsequentes e o fim a que se destina o produto. (KUMARI, MANTRI et al 2013)

evidenciaram o efeito significativo da hidrólise da parede celular pelo H2SO4, mesmo na

ausência de qualquer solvente polar, como o metanol. Também deve ser enfatizado que

este processo de ácido sulfúrico pode ser aplicado diretamente na biomassa molhada, embora

os materiais de construção devam ser os adequados. A extração lipídica com fluidos em

estado supercrítico requer equipamento dispendioso. Num ensaio típico com hexano, foram

adicionados 5 g de algas no reservatório seguido de introdução de 100 ml de hexano. O

sistema foi purgado para remover o ar e evitar o risco de explosão. A mistura foi aquecida até

à temperatura desejada de 235 °C. A pressão de vapor é de aproximadamente 34 bar a esta

temperatura (NGUYEN, et al, 2016).

9

Capítulo 2

2.1 Objectivo do trabalho

O objectivo central deste trabalho é avaliar o desempenho da extração precedida/conjugada

por vários processos de desintegração celular, nomeadamente tratamento ácido,

homogeneizador mecânico e alta pressão, com vista a obter os lípidos das microalgas. Para

além da quantificação global dos diferentes extratos, fez-se a identificação de extratos mais

significativos.

2.2 Organização do documento

O documento tem um capítulo introdutório onde se apresenta uma breve revisão das matérias

objecto do trabalho experimental; no capítulo 3 apresentam-se as metodologias

experimentais seguidas; no capítulo 4 apresentam-se os resultados e faz-se a sua exploração e

no capítulo 5 apresentam-se as conclusões.

10

Capítulo3

3 Materiais e métodos

3.1 Reagentes e solventes

Foi utilizada água destilada, produzida por um sistema RIOsTM 3 (milipore, Estados Unidos). O

CO2 foi fornecido engarrafado pela empresa Praxair (Porto, Portugal). O metanol e a acetona

foram fornecidas pela LabChem (Zelienople, Pensilvânia, E.U.A). O n-hexano foi fornecido

pela empresa Scharlau (Barcelona, Espanha). O clorofórmio foi fornecido pela empresa

Pronalab (Lisboa, Portugal).

Tabela 3.1 – Constante dieléctrica, índice de polaridade e massa volúmica de diferentes

solventes usados na extração.

3.2 Microalgas

Para o presente trabalho foi utilizada a microalga Chlorella vulgaris, que foi adquirida à

empresa Aqualgae S.A. (Viana do Castelo, Portugal). Esta microalga foi mantida em stock e

produzida para o isolamento dos lípidos. O meio utilizado para o crescimento das microalgas

foi o meio GoldMedium Fresh-Water Species (GM-FWS), preparado a partir dos nutrientes

fornecidos pela empresa Aqualgae (Viana do Castelo, Portugal).

Tabela 3.2 Soluções stock de nutrientes.

NUTRIENTE CONCENTRAÇÃO (mg/l) SOLUÇÃO

N NA FORMA DE NaNO3 7000 1

P NA FORMA DE KH2PO4 2046 1

Mg NA FORMA DE MgSO4.7H2O 1480 2

CaCl2 1360 3

OLIGÓMEROS E VITAMINAS 1450 4

SOLVENTES CONSTANTE

DIELÉTRICA

ÍNDICE DE

POLARIDADE

MASSA VOLÚMICA

(kg/l)

CLOROFÓRMIO 4.18 4.1 1,489

HEXANO 1.88 0,1 O,660

ÉTER DE PETRÓLEO 2.1 0,1 0,71

ACETATO DE ETILO 6.02 4.4 0,897

METANOL 33 5.1 0,792

ÁGUA 78.5 0.79 0,998

11

3.3 Métodos

3.3.1 Produção de biomassa alga

As microalgas foram cultivadas em reatores de 1L, de 5L e de 6L numa estante de cultura de

microalgas fornecida pela empresa Aqualgae (Viana do Castelo, Portugal). A estante está

apetrechada com um compressor de ar, marca Hailea (Guangdong, China), modelo v-60, para

abastecimento de ar e com um sistema para controlo dos ciclos de luz e escuro e controlo dos

caudais de dióxido de carbono. A estante é constituída por seis (6) lâmpadas fluorescentes de

40 W, podendo ainda ser adicionada uma placa do modelo PL-600*600-CW de 40W da Lowcled

(Shenzhen, China). O pH inicial das culturas foi da ordem dos 6,5—7,5, sendo mantido abaixo

do pH 7,5 recorrendo a soluções H2SO4 1M e NaOH 2M. A figura 3.1 representa uma imagem da

montagem experimental.

Figura: 3.1– Fermentadores diversos com as culturas de microalgas

A produção da biomassa foi realizada em diferentes tipos de fotobiorreatores com o objectivo

de apreciar o efeito da geometria do reator sobre o crescimento. Para este efeito não podem

faltar nutrientes, incluindo o CO2, que foi adicionado em pulsos de 6 segundos cada 120

segundos, durante o ciclo diurno. O ar é abastecido por um compressor, sendo inserido nos

reatores através de dispersores, após filtragem em filtros de nylon de porosidade 0,45 µm; o

caudal de ar proporciona também a agitação necessária a cultura. A luminosidade foi

assegurada através de lâmpadas fluorescentes de 40W, colocadas numa das laterais da

estante, fornecendo cada uma 1600 lúmen, o que corresponde a 16985 lux (tendo em conta os

0.0942 m2 de área exterior); tendo em conta o factor de conversão de 0.013 obtido na

literatura (SYLVANIA et al.; 2017), teremos uma intensidade da ordem dos 220 μmol

fotões/(m2.s) O pH foi conservado a 7.5 com recurso a H2SO4 0.5M.

12

3.3.2 Produção de biomassa algas em reator cilíndrico de 1L

Trata-se de frascos cilíndricos de 1l com injeção de ar. A geometria do vaso proporciona uma

área/volume de 452 cm2/L. Considerando que só havia luz de um lado, a área efetiva é de

226 cm2/L. O Caudal de ar foi de cerca de 0.5 L ar/ (L meio.min), neste caso sem adição

suplementar de dióxido e carbono.

Figura: 3.2- Fotobiorreator cilíndrico de 1 L

3.3.3 Produção de biomassa algas em reator cilíndrico de 5L

Trata-se de reator cilíndrico de 4l de capacidade nominal, com 18cm de calibre e um volume

máximo de 5l, proporcionado uma área/volume de 222,8 cm2/L. Se o reator for aluminado

apenas de um dos lados, a área/volume passa para 111,4 cm2/L. A concentração inicial de

biomassa usada nos ensaios foi à volta de 0,2 g/l, dependendo do ensaio. O caudal de ar foi

cerca de 0,308 L ar/ (L meio.min), introduzido através de um dispersor cerâmico cilíndrico

com 10 cm de comprimento e 3 cm de diâmetro. O CO2 foi abastecido cada 10 minutos

durante 7 segundos com um caudal de 0.4L/min (0,28L/h). O fotobiorreator encontra-se na

figura 3.3.

Figura 3.3- Fotobiorreator cilíndrico de 5L

13

3.3.4 Produção de biomassa algas em reator de flat-plate descontínuo

O fotobiorreator “flat-plate” de 6 litros, com volume útil de 5 L, foi produzido por nós,

usando vidro e uma estrutura em acrílico. As dimensões internas são as seguintes: 28,6 cm de

comprimento, 50 cm de altura e 5,5 cm de espessura. Em síntese, trata-se de um vaso

paralelepipédico com 7,5 cm de espessura, proporcionando uma área/volume de 350 cm2/L.

O ar e o CO2 é alimentado ao fundo do fotobiorreator através de um dispersor modelo EW-

700025-28 da marca Cole-Parmer (Vernon Hills, Illinois, Estados Unidos); o caudal de ar

assegura também a mistura da biomassa. O ar foi fornecido au caudal de 0,308 L ar/ (L

meio.min); o CO2 foi de cerca de 0.4l/min durante 7 segundos a cada 10 minutos. A

concentração inicial da biomassa foi de 0,2 g/L sensivelmente. O fotobiorreator encontra-se

na figura 3.4

Figura: 3.4- Fotobiorreator “flat-plate”

3.3.5 Manutenção e controlo do processo.

De modo a monitorizar o crescimento da biomassa nos vários tipos de reatores foram usados

três procedimentos distintos. O primeiro procedimento assenta na leitura da densidade ótica

da suspensão, após a diluição apropriada, usando um espectrofotómetro modelo Helios

Omega (Thermo scientific, Inglaterra), medindo a absorvência no comprimento de onda de

685 nm. Esta leitura fez-se diariamente. O segundo procedimento para avaliação do

crescimento foi a contagem de número das microalgas por mililitro, usando a câmara de

Neubauer, após as diluições necessárias; as contagens, realizadas em microscópio ótico,

normalmente de 2 em 2 dias, foram convertidas nos valores reais empregando a fórmula

apropriada. O terceiro procedimento de avaliação do crescimento foi através da quantificação

da massa seca existente num determinado volume de suspensão. Normalmente, 100 ml de

suspensão são sujeitos à centrifugação, a 4500 rpm, numa centrífuga de marca Kn-70 da

14

Kubota (Osaka, Japão), durante 30 minutos; após descartar o sobrenadante e adicionar água

destilada ao “pellet”, repete-se o processo de centrifugação durante 15 minutos,

recuperando-se o “pellet” que vai ser seco em estufa a 100ºC até peso constante. Com base

na massa seca e no volume inicial, determina-se a concentração de biomassa no reator. A

temperatura, o pH, o oxigénio dissolvido e a condutividade foram monitorizadas em alguns

períodos através do sensor Aquaprobe AP2000 (Aquaread, Inglaterra).

A concentração da biomassa alga ao longo do tempo foi determinada por espectrofotometria,

usando uma correlação previamente estabelecida entre a absorvância da suspensão de

biomassa e o teor de biomassa determinado por pesagem após centrifugação. A figura

seguinte apresenta essa correlação.

Figura: 3.5- Reta de calibração entre absorvância e concentração de biomassa.

A equação seguinte permite estimar a concentração de biomassa alga, através da medição da

absorvância a 685 nm das suspensões convenientemente diluídas.

[𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎] = 0,0037 ∗ 𝐴𝐵𝑆 + 0,0131 𝑅2 = 0,9985

3.4 Desintegração celular e extração de lípidos

O procedimento selecionado visa a maximização da extração/recuperação de lípidos da

biomassa alga. No que respeita aos solventes de extração, seguiu-se no essencial o

procedimento de Bligh e Folch (EL-SHEEK, HMOUDA et al, 2016), tendo-se variado os pré-

tratamentos a que as amostras foram sujeitas. Pesou-se cerca de 2 g da biomassa húmida,

equivalentes a 200 mg de biomassa seca, à qual se acrescentou 20 ml de água destilada.

Nesta fase as amostram foram submetidas a diferentes pré-tratamentos. Numa primeira fase

testaram-se vários métodos, conforme descrito na tabela 3.3. Com base nos resultados

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0 50 100 150 200 250

Ab

sorv

anci

a

Biomassa mg/l

15

obtidos nesta fase preliminar selecionaram-se os seguintes métodos (figura 3.6): (i) hidrólise

ácida (pH ajustado a 2, com ácido sulfúrico 2M; temperatura 120ºC, durante 1 hora); (ii)

homogeneizador mecânico (10 000 rpm, 1 minuto); (iii) homogeneizador mecânico (24 000

rpm, 5 minutos); (iv) alta pressão (68 atmosferas).

Tabela 3.3. Métodos de desintegração celular usados na fase preliminar do trabalho.

Método legenda

MS moagem (Hz, 5 min, esferas de 8 mm) do material seco

HM 1min homogeneizador mecânico 10000 rpm 1 min

M+E moagem → enzima

P+E pressão → enzima

HM 24000

Rpm homogeneizador mecânico 24000rpm

HA hidrólise ácida

P+U pressão → ultrassons

P branco Pressão (68 atm)

MC moagem criogénica

MC+U moagem criogénico → ultrassons

HM 5min homogeneizador mecânico 10000 rpm 5 min

HA2 hidrólise ácida

Figura: 3.6- Pré-tratamentos da biomassa.

Após o pré-tratamento, seguiu-se o processo de extração propriamente dito, que consistiu no

seguinte: à amostra de 20 ml de suspensão pré-traçada, adicionou-se 40 ml de mistura de

clorofórmio e metanol (20 ml de cada) que se levou ao sistema de agitação/vibração

16

(agitação mecânica com esferas de vidro ( 20 esferas de diâmetro 2 mm, escala de vibração 4

(VibroMatic-384)) durante 1 hora; deixou-se sedimentar a amostra durante três horas e

recolheu-se a fase inferior, que conterá essencialmente clorofórmio (muito mais denso que a

água e o metanol). A biomassa ficou a maiores partes das vezes no clorofórmio (mas nalguns

casos ficou na fase aquosa metabólica). Retirou-se a fase que não continha a biomassa

(usualmente a fase metabólica/água). À fase contendo a biomassa, adiciona-se de novo 40 ml

de mistura clorofórmio e metanol (20 ml de cada); segue-se a agitação (1h) e decantação

(3h). Recolhe-se a fase sem biomassa (fase metanólica/água), que se junta à recolhida na

fase anterior, e repete-se o procedimento uma terceira vez. A figura 3.8 ilustra o processo de

decantação. No final tem-se a fase do clorofórmio (que teria um volume de 60 ml se as

separações fossem completas) e uma fase metanol/água que teria um total de 80 ml (60 de

metanol e 20 de água). De facto, não é assim, porque o metanol é parcialmente solúvel no

clorofórmio. Posteriormente, a fase do clorofórmio foi sujeita a uma extração com n-hexano

(3 x 20 ml). Verificando-se resíduos de biomassa em suspensão em alguns extratos, estes

foram submetidos a filtração/centrifugação para remoção dessa biomassa. Em resumo,

resultaram-se 3 extratos: n-hexano, clorofórmio e metanol (com alguma água), conforme se

ilustra na figura 3.9. Os extratos secos foram obtidos após evaporação em sistema de vácuo

(figura 3.7). Posteriormente, os extratos foram colocados na estufa a 70ºC durante a noite,

com vista a remover algum solvente residual.

Figura: 3.7- Evaporador rotativo.

17

Figura: 3.8- Esquema do processo de extração.

Os lípidos têm três características muito importantes: contêm extensas regiões formadas

quase exclusivamente por hidrogênio e carbono com ligações C-C ou C-H não-polares. São

insolúveis em água, mas são solúveis em solventes orgânicos, como éter, clorofórmio e

benzeno. Os ácidos gordos, que são a unidade fundamental dos lípidos, são moléculas

formadas por uma longa cadeia de hidrocarbonetos de tipo linear e com um número par de

átomos de carbono.

Figura: 3.9 – Balão de decantação, ilustrando a separação de fases (Fonte autoria própria)

18

3.4.4 Identificação e quantificação de compostos

Com vista a identificar e quantificar os compostos dos extratos, utilizaram-se várias técnicas

analíticas, nomeadamente, cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa (LC-

MS), cromatografia gasosa (GC-MS) e RMN.

A cromatografia líquida conectada a um sistema de espectrometria de massa (LC-MS) é da

marca Thermo Fischer Scientific (Waltham, Massachusetts, EUA). O sistema é constituído por

quatro componentes: uma bomba Acella 600, um autosampler Acella, um detetor PDA Acella

e um espectrofotómetro de massa LCQ Fleet (Figura 3.10).

A coluna usada para a separação foi do tipo C18, da marca Thermo Fischer Scientific

(Waltham, Massachusetts, EUA), modelo HyperSil Gold com tamanho de partícula 5 μm e

dimensões 150 mm x 4,6 mm. As amostras foram diluídas em metanol 1:10 e filtradas com

recurso a filtro de 0,25 µm de nylon antes de se proceder à análise em LC-MS.

A cromatografia foi realizada em modo de gradiente, fazendo variar no tempo a composição

do eluente.

Figura: 3.10 - Equipamento LC-MS/LC-GS

A cromatografia foi realizada em modo de gradiente, fazendo variar no tempo a composição

do eluente (Ver tabela 3.4). A fase móvel foi composta pelos seguintes solventes: A contendo

0.5M de acetato de amónio em metanol e água nas proporções 85:15 v/v, o solvente B

contendo acetonitrilo e água nas proporções 90:10 v/v e solvente C contendo acetato de

amónio. O fluxo foi de 300 µl/min.

19

Tabela 3.4 Composição temporal do eluente

TEMPO (MINUTOS) A% B% C%

0 30 60 0

5 50 0 0

25 90 0 40

70 50 0 0

80 30 0 0

90 30 0 0

100 50 0 50

105 30 60 70

110 30 60 70

Os comprimentos de onda selecionados para a análise foram os seguintes; 400 nm para o

lípidos e 555 nm para a clorofila A. Com o objectivo de quantificar alguns lípidos, construiu-se

uma reta de calibração usando o ácido linoleico como padrão (Figura 3.11).

Figura: 3.11 – Absorvância vs concentração de ácido linoleico.

No que respeita à cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC-MS), para

conferir volatilidade aos compostos, estes foram sujeitos a reação de esterificação. Para a

análise dos ácidos gordos, uma alíquota do extrato de lipídios, contendo aproximadamente

0,1 g de lipídios, foi seca em rota-evaporador e saponificada. Os ácidos gordos foram

metilados pelo método de METCALFE, SCHMITZ usando o diazometano como agente

esterificante. A reação ficou toda a noite à temperatura ambiente; passado este tempo,

verificasse a finalização da reação por adição de uma nova quantidade de solução de

diazometano. A cromatografia gasosa, para análise de ácidos gordos, foi realizada em

(Lípido) mg/l

20

cromatógrafo VARIAN, modelo 3300, equipado com: detector por ionização em chama; injetor

split, razão de 100:1; coluna capilar de sílica fundida, 30 m de comprimento x 0,30 mm de

diâmetro interno e contendo 0,25 µm de polietileno glicol (DB-WAX da J & W Scientific,

Califórnia, USA); e integrador processador INTRALAB 4290. As condições cromatográficas

foram: temperatura da coluna, 150°C por 11 min, programada a 210°C numa razão de

3°C/min; gás de arraste, hidrogénio ao caudal de 1,26 ml/min com velocidade linear de 39,4

cm/s; gás "make-up", nitrogénio a 30 ml/min; temperatura do injetor; 250°C; e temperatura

do detector, 280°C. A identificação dos ácidos gordos foi realizada pelo uso em conjunto dos

seguintes parâmetros: comparação do tempo de retenção corrigido de ésteres metílicos dos

ácidos gordos das amostras e padrões; co-comatrografia de padrões e amostras; e

comprimento equivalente da cadeia.

Os lípidos recuperados e eventualmente outros compostos, após esterificação, foram

quantificados e analisados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-

MS), bem como cromatografia em camada fina.

21

Capítulo 4

Resultados e discussão

4.1 Crescimento da biomassa

Analisou-se o crescimento da biomassa alga em reatores da mesma geometria, mas diferentes

áreas específicas de iluminação, e reatores de geometrias diferentes e volumes da mesma

ordem de grandeza.

4.1.1 Reactores com volumes diferentes e a mesma geometria

O cultivo de microalgas apresenta algumas vantagens como sejam a facilidade de acesso aos

nutrientes necessários, a duplicação da biomassa em num curto período de tempo e a

possibilidade de manipular as condições de cultura, de modo a aumentar a produção de um

metabolito específico, como podem ser os ácidos gordos.

Diversos fatores podem influenciar a produção de lípidos e em particular de ácidos gordos

pelas microalgas, tais como a intensidade luminosa, a temperatura e os nutrientes. A

biomassa da microalga comparada com outras fontes de ácidos gordos apresenta como

vantagem a ausência de contaminação e certas microalgas possuem maior espectro de ácidos

gordos poli-insaturados (PUFA).

A figura seguinte (Figura 4.1) ilustra o crescimento de biomassa alga, medida através da

absorvância, para reactores com a mesma geometria cilíndrica, mas diferentes volumes o que

propicia diferentes áreas de captação de luz por unidade de volume.

Figura: 4.1 – Concentração de biomassa de algas produzida ao longo do tempo na 1ª série de

crescimento em reatores cilíndricos de 1 L e 5 L.

22

Pese embora alguma flutuação nos valores de densidade ótica medida (convertida em

concentração de biomassa através da equação na parte experimental deste trabalho),

verifica-se um crescimento linear da biomassa alga ao longo do tempo. Não ocorrendo

crescimento exponencial, tudo indica que haverá um factor limitante do crescimento que

poderá ser um nutriente ou a luz. Tendo em conta que N, P, Mg, Ca e micronutrientes e

vitaminas estão em razoável excesso, a limitação mais plausível será o carbono ou a luz.

Tendo em conta que estes ensaios foram feitos apenas com introdução de ar (i.e., sem

introdução de CO2 de garrafa), é muito provável que o nutriente limitante seja o carbono.

Entre os dois reatores (1L e 5 L), o de 5 L apresenta, em geral, menor produção devido à

menor intensidade luminosa que consegue captar (área por unidade de volume). Partindo de

uma concentração inicial inferior a 200 mg/L, obtiveram-se concentrações entre os 800 e

1000 mg/L, ao cabo de 25 dias, o que corresponde a crescimento médio de 24 mg/(L.dia) e 34

mg/(L.dia) respetivamente para o reator de 5 L e 1 L. Estes resultados evidenciam a

importância da radiação luminosa recebida por cada um dos reatores; com áreas específicas

de 111.4 cm2/L e 226 cm2/L, respectivamente.

Nestes ensaios foi-se monitorando diariamente o pH (que consta da figura 4.2) e ajustado

diariamente para pH 7.5. O aumento do pH de 7.5 (valor ajustado) para o valor medido no

dia seguinte (na figura 4.2) é um bom indicador do crescimento da biomassa alga.

Figura: 4.2– pH do meio de cultura medido ao longo do tempo, todas as manhãs, antes de ajuste a pH

7.5 (da primeira série de ensaios).

4.1.2 Reactores com geometrias diferentes

A figura 4.3 ilustra a evolução da concentração de biomassa ao longo do tempo em reatores

de geometrias completamente diferentes: cilíndrica e “flat-plate”, que proporcionam áreas

de iluminação por unidade de volume bastante diferentes (222 vs 350 cm2/L). Nesta série de

ensaios já se adicionou CO2 de garrafa.

7,5

8

8,5

9

9,5

2 3 5 6 7 8

pH

dias

4L vs Flat plate

4L

23

Figura: 4.3- flat-plate série 1 vs reator de 5l série 2

Observa-se um crescimento relativamente lento durante os primeiros 20 dias e depois um

crescimento exponencial; este seria o comportamento esperado para um sistema descontínuo,

mas a fase inicial de adaptação parece demasiado prolongada. Por outro lado, em coerência

com a área de iluminação proporcionada por cada um dos reatores, o reator “flat-plate”

apresentou maior crescimento.

4.2 Rotura da biomassa e Extração

Fizeram-se duas séries de ensaios. Uns preliminares, com um número alargado de

métodos de pré-tratamento, e uns pré-tratamentos mais reduzidos selecionados a

partir dos preliminares.

4.2.1 Ensaios de rotura

A tabela seguinte (Tabela 4.1) resume os resultados obtidos nos ensaios prévios de

desconstrução da biomassa alga, tendo em conta o extrato recuperado face à massa (base

o.d.) de biomassa alga usada no processo de extração. Os valores obtidos estão, em geral,

dentro do esperado.

0

5

10

15

20

25

30

35

0 20 40 60 80

abso

rvan

ica

dias

5L vs Flat plate1ªsérie 2ªsérieFlat plate VS 5L

24

Tabela 4.1 - Métodos de desintegração celular usados na fase preliminar do trabalho.

Método Legenda Recuperação, %

MS moagem do material seco 2

HM 1min homogeneizador mecânico 10000 rpm 1 min 4

M+E moagem → enzima 2

P+E pressão → enzima 5

HM 24000 rpm homogeneizador mecânico 24000 rpm, 1 min 6,5

H A hidrólise ácida 10

P+U pressão → ultrassons 5,5

P branco Pressão (68 atm) 8,5

MC moagem criogénica 3,5

MC+U moagem criogénico → ultrassons 3,5

HM 5min homogeneizador mecânico 10000 rpm 5 min 11,5

H A2 hidrólise ácida 11,5

Face aos resultados obtidos, verifica-se que a biomassa seca e submetida a moagem

apresenta enorme dificuldade em ser extraída; dentro das extrações realizadas com biomassa

húmida (tudo o resto), as extrações precedidas de hidrólise ácida, homogeneização mecânica

e pré-tratamento a alta pressão são as mais promissoras. Com base nestes resultados, os

estudos posteriores foram realizados com estes processos mais promissores.

As tabelas 4.2 e 4.3 registam os valores dos volumes de solventes usados e efetivamente

recuperados nos processos de extração. Relativamente aos volumes recuperados face aos

usados, verifica-se que existiram algumas perdas, que ficaram a dever-se à dificuldade do

processo de filtração usado para remover os resíduos de biomassa existente nos extratos. De

notar que a centrifugação nem sempre é adequada para remover os resíduos sólidos, já que

estes apresentam menor densidade do que o clorofórmio. Este assunto carece que reflexão

futura.

Por outro lado, verifica-se, de acordo com o expectável, que ocorre mistura de solvente; i.e.

uma parte do metanol é miscível com o clorofórmio e parte do n-hexano é miscível com o

clorofórmio.

25

Tabela 4.2 – Volumes de solventes aplicados no processo de extração.

volume teórico (ml)

total metanol + Água clorofórmio n-hexano

hidrolise acida 80 60 40 180

homogenizador 24000 rpm 80 60 40 180

homogenizador 10000 rpm 80 60 40 180

alta pressão 68 atm * 110 60 60 230

* : foi adicionado 20 ml extra de n-hexano; devido à diluição foi adicionado cerca de 30 ml de

água

Tabela 4.3 – Volumes de solventes efetivamente medidos após o processo de extração.

volume real obtido (ml)

total metanol + agua clorofórmio n-hexano

hidrolise acida 60 80 20 160

homogenizador 24000 rpm 40 82 30 152

homogenizador 10000 rpm 79 80 20 179

alta pressão 68 atm 90 130 10 230

A figura 4.4 mostra as massas de extrato recuperado para os diferentes processos de extração

e para os diferentes extratos (metanol/água; clorofórmio; n-hexano). Ao contrário do que

aconteceu nos ensaios preliminares, os valores recuperados nos 3 extratos não fazem sentido

já que se partiu de 200 mg de biomassa (base seca). Estes valores anormalmente elevados

podem ter ficado a dever-se a residuais de solventes e/ou eventualmente a erros de

pesagem. Apesar deste contratempo, avançou-se para a identificação dos compostos

existentes nos diferentes extratos.

Figura: 4.4- Massa de extrato obtida, para diferentes condições de desconstrução celular.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

10000 rpm 24000 rpm hidrolise acida alta pressao

pes

o (

gram

as)

cloroformio metanol + agua hexano

26

4.2.2 Identificação dos componentes dos extratos

Numa primeira fase, testou-se o potencial da cromatografia líquida (HPLC-MS) para tentar

identificar e quantificar alguns componentes dos extratos metalónicos, mas o processo foi mal

sucedido, devido à falta de sensibilidade do sistema de MS para identificar os compostos e à

indisponibilidade de padrões.

Note-se que os extratos de clorofórmio e hexano, de natureza hidrofóbica, estavam

destinados à derivatização e à análise por GC-MS. Na realidade também se fez a derivatização

dos extractos de metanol.

De acordo com o previsto, os vários extratos acima referidos foram esterificados com

diazometano e posteriormente analisados por cromatografia gasosa acoplada a

espectrometria de massa. Previamente, analisou-se o seu comportamento em cromatografia

em camada fina, conforme se ilustra na figura seguinte.

Figura: 4.5- Visualização da migração de compostos numa proporção de 7:3 lâmpada

ultravioleta do hidrolisado da biomassa.

A figura 4.5 mostra os cromatogramas obtidos para o extracto de clorofórmio e metanol para

o material resultante da hidrólise ácida da biomassa algas. Os resultados sugerem que as

proporções relativas dos diferentes compostos nos dois extractos são diferentes, mas uma

parte dos compostos parece ser comum. Ainda assim, uma análise adequada evidencia que há

compostos no extracto de metanol que não estão no extracto de clorofórmio; porém as suas

quantidades são baixas e não permitiram a sua identificação. A figura 4.6 ilustra o espetro de

massa do pico dos 23min:55 segundos do extracto de clorofórmio.

27

Figura 4.6- Cromatograma (GC) do extracto de clorofórmio (esquerda) e metanol (direita) da

biomassa algas após a desconstrução celular com ácido sulfúrico.

28

Figura 4.7 Espetro de massa do pico dos 23min:55 seg.

A tabela 4.4 resume alguns aspectos qualitativos dos cromatogramas. Confirma-se que muitos

compostos estão distribuídos pelos diferentes solventes, o que não seria à primeira vista de

esperar. Tal pode ocorrer pelo carácter anfipático (parte hidrofílica e parte hidrofóbica) das

moléculas originais na biomassa. Assim, do ponto de vista das extracções sucessivas que se

realizaram, no futuro deve eventualmente equacionar-se a possibilidade de hidrolisar a

ligação entre estas duas partes antes das etapas de extracção. Do ponto de vista prático, não

parece fazer sentido extracções sucessivas com diferentes solventes; a mistura de solventes

parece mais apropriada.

29

Tabela 4.4 – Aspetos qualitativos dos cromatogramas.

Observações sobre o GC-MS dos extratos

metanol (M) clorofórmio (C) n-hexano (H)

hidrolise acida (HA) vários picos significativos

vários picos significativos

sem picos significativos

homogenizador 24000 rpm (H)

picos semelhantes a outros

pouco material picos semelhantes a AP-

H

alta pressão 68 atm (AP)

picos semelhantes a AP-H

picos na gama 21-25 min

picos semelhantes ao HA-C

As análises realizadaa por GC-MS dos diferentes extratos permitiram identificar os ésteres

metílicos de ácidos carboxílicos presentes nos triacilglicerois presentes nos extratos. Temos a

destacar alguns compostos encontrados nos lípidos: 9-Oxodecanoato de metilo; nonanodioato

de dimetilo; 12-Metiltridecanoato de metilo; hexadecanoato de metilo; Ftalato de butilo e

isobutilo; heptadecanoato de metilo; octadecanoato de metilo; 14-metilhexadecanoato de

metilo. Estes ácidos apresentam cadeias saturadas e insaturadas de nove até dezoito átomos

de carbono. O ácido predominante nesta análise é o ácido hexadecanóico. Temos a destacar

as suas estruturas (figura 4.8) de acordo com a nomenclatura acima mencionada.

De realçar que não foi possível identificar ácidos gordos polinsaturados, o que pode ter ficado

a dever-se a várias razões: o seu baixo teor, face aos saturados; oxidação no processo de

extracção e análise; outros

(9-Oxodecanoato de metilo) (12-Metiltridecanoato de metilo)

(Nonanodioato de dimetilo) (Hexadecanoato de metilo)

30

(Ftalato de butilo ou de isobutilo) ( Heptadecanoato de metilo)

(Octadecanoato de metilo) (14-Metilhexadecanoato de metilo)

Figuras 4.8 estruturas destacadas de acordo com a nomenclatura acima mencionada.

As estruturas foram desenhadas no programa chemoffice 2015 por Cahilo Manuel Martins

31

Capítulo 5

Conclusões e perspetivas futuras

A biomassa algas tem potencial para que num futuro próximo possa constituir uma alternativa

para a obtenção de produtos de valor acrescentado para a incorporação em alimento,

fármacos, entre outros, e ao mesmo tempo mitigar as emissões de gases de efeito estufa, tais

como o CO2. No entanto, existem ainda variadíssimos trabalhos a ser realizados nas várias

áreas ligadas à produção e disrupção deste microrganismo até que a sua utilização plena à

escala industrial seja uma realidade.

Neste trabalho foi possível concluir através de dois ensaios efectuados no reator “flat-plate”

e no reator de cilíndrico de cinco litros (5l), que a produção de biomassa pode ser superior no

reator “flat-plate”, devido à sua maior área de captação de luz.

Relativamente à desintegração celular/extração, foi possível concluir que para a espécie

utilizada neste trabalho, a secagem da biomassa não compensa o gasto energético e de

recursos em relação à utilização de biomassa húmida aquando da sua desconstrução.

Os processos de desconstrução mais promissores foram a hidrólise ácida, o pré-tratamento a

alta pressão e a homogeneização mecânica (rotor/estator a elevada rotação).

Apesar da proporção relativa dos diferentes compostos variar com os solventes de extração

usados, n-hexano, clorofórmio e metanol, os solventes não evidenciaram seletividade para

compostos específicos, o que pode indicar que os compostos originais (não hidrolisados)

teriam partes hidrofílicas e partes hidrofóbicas.

A esmagadora maioria dos ácidos gordos identificados são de cadeia saturada, não tendo sido

possível identificar ácidos gordos insaturados, provavelmente devido à sua baixa concentração

nos extratos ou eventualmente à sua instabilidade nos processos de desconstrução e extração

usados.

Para trabalho futuro seria importante analisar as razões para a baixa seletividade dos

solventes e esclarecer a presença dos ácidos gordos insaturados, em termos de teor e em

termos de composição.

Com vista ao aumento da produtividade, seria necessário estudar o efeito da área interfacial

específica (m2/m3 de meio) para a transferência de massa através do aumento do caudal de

ar comprimido entregue às culturas através de uma placa porosa, reduzindo desta forma as

dimensões médias das bolhas e aumentando o carbono inorgânico inserido no meio.

32

Capítulo 6

Referência bibliografia

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37

Anexos

Anexos de aspectos das estruturas dos lípidos

Amostras e extrações da biomassa de Microalgas: RS – 1 (HA – hexano, peso 0,024 mg) Cromatograma:

Pico nº 1 987 TR (17.25) 36.24 17,57%, M ------- não tem sinais importantes RS – 2 (HA – clorofórmio, peso 0,176 mg). Cromatograma:

Pico nº 1 1121 TR (19:08) 19:2 tr,57%, M 328 mistura

28:07

rodilla021.SMS *

MaxE0 SumE1

RI 2211 67432

RI33

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

12:31

15:13

16:34

17:25

19:20

20:10

21:02

22:21

23:55

24:54

26:28

23:55

rodilla022.SMS *

MaxE1 SumE2

RI 16598 30513

RI33

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

25:35

28:38

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1121(19:08) 8 12% rodilla022.SMS *

100%

*10

82.9

110.9142.8

186.8

281.0

339.3 401.0 449.6 492.8

RI33

1000 1100 1200 1300 1400

rodilla022.SMS

38

Identificação:

Pico nº 2, 1193 TR (20:02) 20:2 tr,57%, M 200 9-oxodecanoato de metilo Identificação:

Pico nº 3, 1215 TR (20:19) 20:3 tr,57%, M 216 nonanodioato de dimetilo

55

83

111 143

187 207 281 307 Spectrum X 1121(19:08)

55

69

111 155 187

236 253 285S2 C48958 328

67

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

SISCOM [rodilla022.SMS] 1121(19:08) Libraries: V W V C Filter: 13 3 11 4

*1

81

95

150220

263294

S3 W145674 294

55

81

93

111

135163 251 S18 W191174 266

(CH2) 5

O

O

(CH2) 6

O

O

(CH2) 3 (CH2) 6

O

O

55

69

83

111

143

169 207 257 277Spectrum X 1193(20:02)

43

55 83

111

143

169200

S1 W23468 200

43

55 83

111

143

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

SISCOM [rodilla022.SMS] 1193(20:02) Libraries: V W V C Filter: 13 3 11 12

*1

169200

S2 C23468 200

55

74 87

129172

201S3 W147781 216

27

41

55 87

110

142

S4 W71647 142

(CH2)

5

O

O

O

(CH2)

5

O

O

O

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

1215(20:19) 8 11% rodilla022.SMS *

100%

*10

69.0

83.0

97.0 124.0

152.0

217.0

245.9280.9

354.5 401.1

RI33

1000 1100 1200 1300 1400

rodilla022.SMS

39

Identificação:

Pico nº 4, 1356 TR (22:06) 22:3 tr,57%, M 242 12-metiltridecanoato de metilo

Identificação:

Pico nº 5, 1443 TR (23:12) 23:3 tr,57%, M 250 NI

55

69

83

97111

124

152

185

217Spectrum X 1215(20:19)

15

29

43

55 74

97

111

124

152

185

216 S1 C75419 216

55

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

SISCOM [rodilla022.SMS] 1215(20:19) Libraries: V W V C Filter: 13 12 3

*1

15

29

43

74

97

111

124

152

185

216 S2 W75419 216

15 29

41

5574

97

111

124

152

171

185

218 S3 W27340 216

O

O

(CH2)

5

O

O

O

O

(CH2)

5

O

O

O

O

(CH2)

5

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1356(22:06) 5 11% rodilla022.SMS *

100%

*10

74.0

87.0

142.9

157.0 185.0

199.0

213.0

242.0

277.1355.0

414.8488.0

RI33

1000 1100 1200 1300 1400

rodilla022.SMS

55

74

143 199

242277 355 415 488

Spectrum X 1356(22:06)

41

74

143

199

242

S3 W33522 242

74

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

SISCOM [rodilla022.SMS] 1356(22:06) Libraries: V W V C Filter: 3 13 4

*1

143 199

256S4 W243443 256

41

74

143

199

242

S5 C33522 242

43

74

143199 242

S6 W237812 242

(CH2)

9

O

O

(CH2) 9

O

O

(CH2)

9

O

O

(CH 2)10

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

1443(23:12) 4 7% rodilla022.SMS *

100%

*10

81.0

95.0

109.0

123.0

136.9

178.9

193.0

207.0

250.1

281.0

342.2

429.1 474.9

RI33

1000 1100 1200 1300 1400

rodilla022.SMS

40

Identificação:

Pico nº 6, 1500 TR (23:55) 23:3 tr,57%, M 270 hexadecanoato de metilo

5895

165

207250 281 309 342

Spectrum X 1443(22:06)

55

105

131169

220281 320

S1 W112995 320

57

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

SISCOM [rodilla022.SMS] 1443(22:06) Libraries: V W V C Filter: 11 13 1 12

*1

75

121S2 W94490 212

55

105

131169

220281 320

S3 C112995 320

OO

O

O

Cl

Et

OBr

Et

OO

O

O

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280

1500(23:55) 182 11% rodilla022.SMS *

100%87.0

101.0129.0

143.0

157.0

185.0 199.1

213.1

227.1

241.2

269.9

RI33

1500 1600 1700

23:55

24:27

25:35

rodilla022.SMS

41

Identificação:

Pico nº 7, 1524 TR (24:13) 24:3 tr,57%, M 278 ftalato de butilo e isobutilo

55

87

143

171 185

227

270

Spectrum X 1500(23:12)

4355

87

143

171 185

227

27082% I1 3.1 C76802 270

43

87

143

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

SISCOM [rodilla022.SMS] 1500(23:12) Libraries: V W V C Filter: 3 4

*1

55

171 185

227

27082% I2 3.2 W76802 270

1429

4355

74

87

143

171 185 227270 79% I3 3.3 C52511 354

43

55

74

87

143

171 185 227 27077% I4 3.4 W158170 270

(CH2)

12

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH 2)4

O

O

(CH 2)6

O

O

(CH2)

12

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

1524(24:13) 24 44% rodilla022.SMS *

100%

*10

76.0 104.0

148.9

176.9

207.0

222.8

281.0354.9 415.2

RI33

1500 1600 1700

23:55

24:27

25:35

rodilla022.SMS

42

Identificação:

Pico nº 8, 1543 TR (24:27) 24:3 tr,57%, M 284 heptadecanoato de metilo

50 65 76 93 104 121

149

177 207 223Spectrum X 1524(4:58)

4156 76 93 104 121

149

205 22390% I1 1.1 C77042 282

149

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220

SISCOM [rodilla022.SMS] 1524(4:58) Libraries: V W V C Filter: 9 6 10 11 13

*1

41

57 76 93 104 121 167 192 205 22390% I2 1.2 C49949 334

29 41 57 76 93 104 121

149

167 205 22388% I3 1.3 W40613 278

29 41 57 76 93 104 121

149

167 205 22388% I4 1.4 C40613 278

O

OO

O

OO

O

O

O

O (CH 2)5

O

O

O

O

O

O

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

1543(24:27) 15 9% rodilla022.SMS *

100%

*10

87.0

101.0

129.0

143.0

157.0

199.1

213.2

241.2

284.1325.0 387.1

415.1

RI33

1500 1600 1700

23:55

24:27

25:35

rodilla022.SMS

43

Identificação:

Pico nº 9, 1632 TR (25:35) 25:3 tr,57%, M 298 octadecanoato de metilo Identificação:

5587

143

199

241

284

Spectrum X 1543(4:58)

29

43

74

87

143

185241

284

S7 W77096 284

74

87

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

SISCOM [rodilla022.SMS] 1543(4:58) Libraries: V W V C Filter: 3 13 4

*1

29

43

143

185241

284

S8 C77096 284

1843 57

74

87

143

185241

284

S9 W77106 284

55

74

87

152 194 236285 S1 C48964 328

(CH 2)11

O

O

(CH 2)11

O

O

(CH 2)13

O

O

O

O(CH

2)

11

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

1632(25:35) 8 8% rodilla022.SMS *

100%

*10

74.0

101.0

143.0

157.0185.1

199.1

213.1 241.2

255.2

269.2

298.0327.0

354.9

429.0475.2

RI33

1500 1600 1700

23:55

24:27

25:35

rodilla022.SMS

44

Pico nº 10, 1874 TR (28:38) 28:3 tr,57%, M 390

55

87

143

199 255

298

327 355 Spectrum X 1632(24:55)

55

87

143

199255

298

S1 C133225 298

57

74

298

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

SISCOM [rodilla022.SMS] 1632(24:55) Libraries: V W V C Filter: 3 4 13

*1

143

199 255

S6 W44201 298

57

74

143

199 255

298

S8 C44201 298

18

43

74

143

199255

298

S10 C77380 298

(CH 2)14

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH2)

13

O

O

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280

1874(28:38) 142 35% rodilla022.SMS *

100%

*1071.1

104.0121.1

149.1

166.9

193.0

207.0

250.4

278.8

RI33

1700 1750 1800 1850 1900 1950

28:38

rodilla022.SMS

45

Identificação:

RS – 3 (HA – metanol, peso 0,229 mg). Cromatograma:

Pico nº 1 1503 TR (23:57) 23:2 tr,57%, M 280 hexadecanoato de metilo

57 71

104 121

149

167

207 250 279Spectrum X 1874(26:57)

43

57

71

83 113

132

149

167

279

81% I2 1.1 W78728 390

149

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

SISCOM [rodilla022.SMS] 1874(26:57) Libraries: V W V C Filter: 9 13 1

*1

43

57

71

83 113

132

167

279

81% I3 1.2 C78728 390

43

57

71

83113

132

149

167

197 231 261

279

79% I6 3.0 C133784 390

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

28:02

rodilla023.SMS *

MaxE0 SumE1

RI 2004 76562

RI33

600 800 1000 1200 1400 1600 1800

11:37 12:45

15:1517:28

19:23

22:24

23:56

24:54

46

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1503(23:57) 1 8% rodilla023.SMS *

100%

*10

73.9

87.0

143.0

171.0

207.0

227.1

281.0

340.9

359.1 399.2 489.2

RI33

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

19:2320:40

21:43

22:24

23:14

23:57

24:54

26:28

27:38

rodilla023.SMS

47

Identificação:

Pico nº 2 1579 TR (24:54) 24:2 tr,57%, M 280 NI

74

143171

207

281

342 401 489Spectrum X 1503(22:32)

43

87

143

185

227

270

S2 W237815 270

74

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

SISCOM [rodilla023.SMS] 1503(22:32) Libraries: V W V C Filter: 3 13 4 11

*1

18

43143

199255

298

S4 C77380 298

43

87

143

171 227 270

S10 C76800 270

43

87

143

171227

270S11 C76802 270

(CH2)

12

O

O

(CH2)

13

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH2)

12

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

1579(24:54) 1 9% rodilla023.SMS *

100%

*10

73.0

117.0

147.0

207.0

281.0

313.2

328.1

354.9

430.1 475.2

RI33

1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

19:2320:40

21:43

22:24

23:14

23:57

24:54

26:28

27:38

rodilla023.SMS

48

Identificação:

RS – 4 (AP – Hexano, peso 0,013 mg). Cromatograma:

55

73117

207

281

313

355Spectrum X 1579(24:54)

57

73

116147

188229 264

306

378

S1 W56504 393

73

50 100 150 200 250 300 350 400

SISCOM [rodilla023.SMS] 1579(24:54) Libraries: V W V C Filter: 5 3 11 13 7

*1

57

116147

188229 264

306

378

S2 C56504 393

55

75

117 201 317

S4 W232540 332

55

73

117204

229 345

S5 W232542 360

N

N N N

TM S

TM S

N

O

TM S

N

N N N

TM S

TM S

N

O

TM S

TM S

O

O

(CH 2)5

O

O

TM S

23:56

rodilla024.SMS *

MaxE0 SumE2

RI 12004 14220

RI33

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

15:15 17:27 22:24

25:35

28:46

31:37

49

Pico nº 1 1501 TR (23:56) 23:2 tr,57%, M 270 hexadecanoato de metilo

Identificação:

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1501(23:56) 14 12% rodilla024.SMS *

100%

*10

74.0

143.0

171.0 199.0

227.1

241.1269.9

341.1 417.3 487.6

RI33

1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100

23:56

24:28

24:55 25:35

27:5430:41

31:37

rodilla024.SMS

55

87

143

171 199227

270

Spectrum X 1501(21:27)

4355

87

143

171 185

227

27082% I1 3.1 C76802 270

43

87

143

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

SISCOM [rodilla024.SMS] 1501(21:27) Libraries: V W V C Filter: 3 4

*1

55

171 185

227

27082% I2 3.2 W76802 270

4355

87

143

171 185227 270

75% I4 1.1 W76800 270

4355

87

143

171 185227 270

75% I5 1.2 C76800 270

(CH2)

12

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH 2)12

O

O

50

Pico nº 2 1544 TR (24:28) 24:2 tr,57%, M 284 14-metilhexadecanoato de metilo

Identificação:

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1544(24:28) 1 7% rodilla024.SMS *

100%

*10

74.0

128.9

142.9

185.0

227.0

241.1

284.1

313.3

355.0

385.3

414.7

476.3

RI33

1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100

23:56

24:28

24:55 25:35

27:5430:41

31:37

rodilla024.SMS

87

143

185

241

284

313 355 385 415 476Spectrum X 1544(4:59)

43

74

143

185241

284

S3 W77096 284

74

50 100 150 200 250 300 350 400 450

SISCOM [rodilla024.SMS] 1544(4:59) Libraries: V W V C Filter: 3 13 4 11

*1

43

143

185241

284

S4 C77096 284

43

74

143

199227 255 297 339 395

438

S13 C59974 438

18

74

143

199 241 283339

382

S1 C78616 382

(CH 2)11

O

O

(CH 2)11

O

O

(CH2)

24

O

O

(CH2)

20

O

O

51

Pico nº 3 1579 TR (24:55) 24:2 tr,57%, M 396 NI

Identificação:

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1579(24:55) 1 10% rodilla024.SMS *

100%

*10

74.9

96.8

117.0

171.0

207.0

281.0

313.2

355.0

396.2 429.1

489.1

RI33

1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100

23:56

24:28

24:55 25:35

27:5430:41

31:37

rodilla024.SMS

75

97

117

171

207

281

313

355 396 429 489Spectrum X 1579(24:28)

43

73

117

201 269

313

S1 C133468 328

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

SISCOM [rodilla024.SMS] 1579(24:28) Libraries: V W V C Filter: 5 3 11 13 7 9

*1

75

129

215

257 287

331

S2 C78157 346

73

117204

229 345

S7 W232542 360

(CH 2)12

O

O

TM S

TM S

O

O

(CH2) 6

O

O

TM S

52

RS – 5 (AP – Clorofórmio, peso 0,000 ? mg). Cromatograma:

Pico nº 1 1501 TR (23:56) 23:2 tr,57%, M 270 hexadecanoato de metilo

28:57

29:42

30:25

rodilla025.SMS *

MaxE0 SumE1

RI 2673 92257

RI33

1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

21:43

22:23

23:35

23:56

24:54

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

1501(23:56) 1 9% rodilla025.SMS *

100%

*10

74.0

86.9

129.0

142.9

227.1

270.1

294.8

327.8

356.0

415.0

RI33

1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

21:43

22:23

23:35

23:56

24:54

28:57

29:42

30:25

rodilla025.SMS

53

Identificação:

RS – 6 (AP – Metanol, peso 0,251 mg). Cromatograma:

55

74

143227

270

328 356 415Spectrum X 1501(22:23)

55

74

143185 227 270

S3 W157413 270

43

74

50 100 150 200 250 300 350 400

SISCOM [rodilla025.SMS] 1501(22:23) Libraries: V W V C Filter: 3 4 13 11

*1

143

239270

S5 C76803 270

4374

143

185 229 297 353 396S6 C78788 396

18

55

74

143

199 241 283339

382

S9 C78616 382

(CH2)

12

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH2)

21

O

O

(CH2)

20

O

O

23:56

28:43

29:39

30:59

rodilla026.SMS *

MaxE0 SumE2

RI 3259 12893

RI33

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

11:33

12:45

15:14

16:31

17:27

19:23

21:04 22:32

54

Pico nº 1 1501 TR (23:56) 23:2 tr,57%, M 270 hexadecanoato de metilo

Identificação:

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420

1501(23:56) 3 10% rodilla026.SMS *

100%

*10

74.0

87.0

100.8128.9

143.0

157.0

171.0199.0

227.0

241.0

270.0

283.0

341.0415.0

RI33

1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000

21:20

22:32

23:19

23:56

24:28

26:10

28:04

28:43

29:39

30:38

rodilla026.SMS

55

74

143

171 199

227

270

341 415 Spectrum X 1501(23:50)

43

87

143

171

227

270

S6 C76802 270

87

50 100 150 200 250 300 350 400

SISCOM [rodilla026.SMS] 1501(23:50) Libraries: V W V C Filter: 3 4 13

*1

43

143

171

227

270

S7 W76802 270

55

74

143

199227

270

S8 C39210 270

(CH2)

12

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH 2)10

O

O

55

RS – 7 (24000 – Hexano, peso 0,232 mg). Cromatograma:

Pico nº 1 1499 TR (23:56) 23:2 tr,57%, M 270 hexadecanoato de metilo

23:56

rodilla027.SMS *

MaxE0 SumE1

RI 3956 70556

RI33

600 800 1000 1200 1400 1600

12:30

14:27

15:14

17:27

18:20

19:22

21:26

22:24

24:55

25:27

27:05

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

1499(23:56) 4 11% rodilla027.SMS *

100%

*10

74.0

87.0

100.8 128.9

142.9

157.0

171.0199.0

213.0

227.1

241.1270.0

283.1

355.2

370.4416.9

RI33

1200 1300 1400 1500 1600

19:54 20:41

21:0421:43

22:24

23:23

23:56

24:2824:55

25:27

26:27

rodilla027.SMS

56

Identificação:

Pico nº 2 1541 TR (24:28) 24:2 tr,57%, M 282 NI

55

74

143

171 199 227

270

355Spectrum X 1499(22:32)

43

87

143

185

227

270

S1 W237815 270

43

87

143

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

SISCOM [rodilla027.SMS] 1499(22:32) Libraries: V W V C Filter: 3 4 13

*1

171227

270S2 W76802 270

43

87

143

171227

270S3 C76802 270

43

87

143

171 227 270

S6 W76800 270

(CH2)

12

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH 2)12

O

O

57

Identificação:

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1541(24:28) 0 5% rodilla027.SMS *

100%

*10

74.0

86.9

143.0

185.0

207.0

224.7

241.2281.0

355.1

415.7

429.0

494.9

RI33

1200 1300 1400 1500 1600

19:54 20:41

21:0421:43

22:24

23:23

23:56

24:2824:55

25:27

26:27

rodilla027.SMS

55 74

143

207

241 281

355

429 495Spectrum X 1541(23:56)

75

129215

257

331

S1 C78157 346

73147

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

SISCOM [rodilla027.SMS] 1541(23:56) Libraries: V W V C Filter: 3 13 11 9 4 7

*1

247S3 W232535 262

18

73

147

217261

S22 W40170 276

45

73

147

218

291 S24 C50151 336

TM S

O

O

(CH2) 6

O

O

TM S

TM S

O

O

O

O

TM S

TM S

O

O O

O

TM S

O

O O

O

TM S TM S

TM S

58

RS – 8 (24000 – Clorofórmio, peso 0,061 mg). Cromatograma:

Não tem sinais RS – 9 (24000 – Metanol, peso 0,160 mg). Cromatograma:

Pico nº 1 1501 TR (23:56) 23:2 tr,57%, M 270 mistura

27:33

rodilla028.SMS *

MaxE0 SumE1

RI 1578 69756

RI33

600 800 1000 1200 1400 1600

11:22

12:31

15:13

16:41

17:26

19:22

21:04

22:24

23:56

24:56

23:56

28:40

29:57

rodilla029.SMS *

MaxE0 SumE2

RI 2393 11793

RI33

600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

11:48

14:1617:27

19:2321:04

22:24

23:12

59

Identificação:

RS – 10 (10000 – Hexano, peso 0,108 mg). Cromatograma:

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

1501(23:56) 1 8% rodilla029.SMS *

100%

*10

86.9

129.0

143.0

171.0

207.0

227.0

241.0

281.0

327.0

340.6

399.0

RI33

1200 1400 1600 1800

18:2119:23

20:3921:43

22:23

23:12

23:56

24:29

28:40

29:45

rodilla029.SMS

55 87

143

171227

281

341Spectrum X 1501(22:23)

18

55

74

143

199 241 283339

382

S1 C78616 382

43

87

143

50 100 150 200 250 300 350

SISCOM [rodilla029.SMS] 1501(22:23) Libraries: V W V C Filter: 3 13 4 11

*1

171 227 270

S2 W76800 270

55

87

143

199255

298

S5 C133225 298

43

87

143

199255 298

S16 W77393 298

(CH2)

20

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH 2)14

O

O

(CH 2)14

O

O

60

Pico nº 1 1502 TR (23:56) 23:2 tr,57%, M 280 mistura (hexadecanoato de metilo)

Identificação

RS – 11 (10000 – Clorofómio, peso 0,092 mg). Cromatograma:

rodilla030.SMS *

MaxE0 SumE1

RI 926 45465

RI33

800 1000 1200 1400 1600

14:19 15:14

17:27

19:23 20:41

21:05

22:24

23:23

23:56

24:29

24:54

26:23

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

1502(23:56) 1 6% rodilla030.SMS *

100% 73.9

142.9

207.0

227.1280.9

355.2450.9

499.3

RI33

800 1000 1200 1400 1600

14:19 15:1417:27

19:23 20:4121:05

22:24

23:23

23:56

24:29

26:23

rodilla030.SMS

87

143207

281

355381 451

499Spectrum X 1502(22:24)

74

143 199

256S1 W241194 256

87

143

298

50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

SISCOM [rodilla030.SMS] 1502(22:24) Libraries: W C Filter: 3 9 11 13 4 7

*1

199255

S10 C133225 29874

143 185 227 270S11 W157413 270

43

87

143

199255 298

S17 C77393 298

(CH2) 9

O

O

(CH 2)14

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH 2)14

O

O

61

Pico nº 1 1122 TR (19:10) 19:2 tr,57%, M 270 mistura

Identificação:

Pico nº 2 1213 TR (20:19) 20:2 tr,57%, M 216 nonanodioato de dimetilo

23:55

rodilla031.SMS *

MaxE0 SumE2

RI 85959 16950

RI33

1200 1400 1600 1800

24:2725:35

28:38

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

1122(19:10) 3 11% rodilla031.SMS *

100%

*10

82.8

111.0

128.8

142.8

155.0 207.0

219.0 267.1

277.1

341.1

RI33

1100 1200 1300 1400

19:10

20:05 20:53 21:2521:52

22:48

23:11

23:35

23:53

rodilla031.SMS

55

83

111 143

207 277 341 Spectrum X 1122(23:59)

55

111 155 187

236 285 S1 W48958 32855

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

SISCOM [rodilla031.SMS] 1122(23:59) Libraries: W C Filter: 13 3 11 9

*1

111 155 187

236 285 S2 C48958 32855

180 222264

296S3 C77341 296

55

180 222264

296S5 W77341 296

(CH2) 5

O

O

(CH2) 6

O

O

(CH2) 5

O

O

(CH2) 6

O

O

(CH 2)6 (CH 2)6

O

O

(CH 2)6 (CH 2)6

O

O

62

Identificação:

Pico nº 3 1353 TR (22:06) 22:2 tr,57%, M 242 12-metiltetradecanoato de metilo

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

1213(20:19) 1 6% rodilla031.SMS *

100%

*10

82.8

110.9

152.0

184.8

207.0

235.1

281.0

342.0

386.6

415.2

461.3

RI33

1100 1200 1300 1400

19:10

20:05 20:53 21:2521:52

22:48

23:11

23:35

23:53

rodilla031.SMS

5583

111

152

207

235281

342 387 415 461 Spectrum X 1213(20:19)

74

103

153185

S2 W167146 246

55111

152

50 100 150 200 250 300 350 400 450

SISCOM [rodilla031.SMS] 1213(20:19) Libraries: W C Filter: 13 11 3 12

*1

185

S1 W232951 216

15

55 111152

185

218 S3 W27340 216

15

74

111152

185

216 S4 C75419 216

O

O

(CH2)

5

O

O

O

O

(CH2)

5

O

O

O

O

(CH2)

5

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

1353(22:06) 2 9% rodilla031.SMS *

100%

*10

74.0

142.8

157.0185.0

199.0

242.0

281.0

341.0

401.1430.1 475.2

RI33

1100 1200 1300 1400

19:10

20:05 20:53 21:2521:52

22:48

23:11

23:35

23:53

rodilla031.SMS

63

Identificação:

Pico nº 4 1497 TR (23:55) 23:2 tr,57%, M 270 hexadecanoato de metilo

Identificação:

Pico nº 5 1540 TR (24:27) 24:2 tr,57%, M 284 heptadecanoato de metilo

55 87

143

199

242281 341 401 Spectrum X 1353(21:52)

57

74

143177

199

256S13 W243443 256

74

50 100 150 200 250 300 350 400

SISCOM [rodilla031.SMS] 1353(21:52) Libraries: W C Filter: 3 13 4 11

*1

43143

199 242

S14 W237812 242

41

74

143 199242

S19 W132581 242

57

74

143 199256

S20 W241194 256

(CH2) 9

O

O

(CH 2)10

O

O

(CH 2)10

O

O

(CH2) 9

O

O

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270

1497(23:55) 99 12% rodilla031.SMS *

100%87.0

101.0

115.0

129.0

143.0

157.0

171.0 185.0 199.0

213.1

227.1

241.2270.0

RI33

1500 1600 1700 1800 1900

23:55

24:2725:35

28:38

rodilla031.SMS

5587

101 129

143

171 199227

270

Spectrum X 1497(23:11)

4355

87

101129

143

171 185227

27079% I1 1.1 C76802 270

43

87

143

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

SISCOM [rodilla031.SMS] 1497(23:11) Libraries: W C Filter: 3 4

*1

55

101129 171 185

227

27079% I2 1.2 W76802 270

43 55

87

97 129

143

171 185 227 270

74% I3 1.3 C76800 270

74

87

129 143171 185 227 270

70% I8 3.1 W145553 270

(CH2)

12

O

O

(CH2)

12

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH2)

12

O

O

64

Identificação:

Pico nº 6 1629 TR (25:35) 25:2 tr,57%, M 298 octadecanoato de metilo

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

1540(24:27) 9 10% rodilla031.SMS *

100%

*10

74.0

87.0

101.0

129.0

143.0

171.0

185.0

241.1

283.9

327.2354.9 417.3 475.5

RI33

1500 1600 1700 1800 1900

23:55

24:2725:35

28:38

rodilla031.SMS

5574

143

185

241

284

Spectrum X 1540(4:59)

29

43

74

87

143185 241

284

S1 W77096 28474

87

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300

SISCOM [rodilla031.SMS] 1540(4:59) Libraries: W C Filter: 3 4 13

*1

1843 57 143

185 241284

S2 C77106 284

1843 57

74

87

143185 241

284

S3 W77106 284

29

43

74

87

143185 241

284

S4 C77096 284

(CH 2)11

O

O

(CH 2)13

O

O

(CH 2)13

O

O

(CH 2)11

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460

1629(25:35) 7 9% rodilla031.SMS *

100%

*10

74.0

87.0

101.0

143.0

157.0 185.0

199.0

213.0241.2

255.2

269.2

298.0354.9

381.6

428.9475.0

RI33

1500 1600 1700 1800 1900

23:55

24:2725:35

28:38

rodilla031.SMS

65

Identificação:

Pico nº 7 1871 TR (28:38) 28:2 tr,57%, M 298 ftalato de diisooctilo

Identificação:

RS – 12 (10000 – Metanol, peso 0,368 mg). Cromatograma:

5574

143

199255

298

355 381 429 Spectrum X 1629(24:27)

55

87

143

199255

298

S1 C133225 29874

298

50 100 150 200 250 300 350 400

SISCOM [rodilla031.SMS] 1629(24:27) Libraries: W C Filter: 3 4 13

*1

143

199 255S2 C44201 298

74

143199 255

298

S3 W44201 298

43

74

143

199255

298

S4 W237817 298

(CH 2)14

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH 2)14

O

O

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

1871(28:38) 28 29% rodilla031.SMS *

100%

*10

104.0

149.0

166.9 190.9

207.0

281.0

309.0

355.0

RI33

1500 1600 1700 1800 1900

23:55

24:2725:35

28:38

rodilla031.SMS

57104

149

207 281 309 355 Spectrum X 1871(25:35)

4357

113

149

71% I9 1.1 C78723 390

149

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

SISCOM [rodilla031.SMS] 1871(25:35) Libraries: W C Filter: 9 13 1

*1

4357

113 27971% I10 1.2 C78728 390

4357

113

149

72% I6 1.3 W78729 390

4155

83122

149

24976% I2 1.4 W77958 330

O

O (CH2)

4

O

O (CH2)

4

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

66

Pico nº 1 1500 TR (23:55) 23:2 tr,57%, M 270 hexadecanoato de metilo

Identificação:

Pico nº 2 1953 TR (29:38) 29:2 tr,57%, M 358 ver composto

29:38

rodilla032.SMS *

MaxE0 SumE2

RI 27628 16868

RI33

1400 1600 1800 2000

23:55

28:39

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480

1500(23:55) 9 12% rodilla032.SMS *

100%

*10

74.0

87.0

143.0

185.0

227.0

241.0

285.1355.2 428.0

488.9

RI33

1400 1600 1800 2000

23:55

28:39

29:38 rodilla032.SMS

55

74

143

171 185227

270

Spectrum X 1500(22:24)

4355

87

143

171 185227

27077% I2 3.1 W76802 270

43 55

87

143

20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

SISCOM [rodilla032.SMS] 1500(22:24) Libraries: W C Filter: 3 4 13

*1

171 185 227 270

69% I6 1.0 C76800 270

43 55

87

143

171 185 227 270

69% I7 1.1 W76800 270

30

4355

74

87

143171 185 227 270

68% I8 1.2 C76795 270

(CH2)

12

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH 2)12

O

O

(CH2)

11

O

O

67

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360

1953(29:38) 81 29% rodilla032.SMS *

100%

64.1

91.1

119.0

145.0 207.2

238.2

281.2 323.4

357.1

RI33

1400 1600 1800 2000

23:55

28:39

29:38 rodilla032.SMS