Bacilos Gram Negativos

Fermentadores - Enterobactérias

Enterobactérias• As enterobactérias possuem características em comum

que definem a família Enterobacteriaceae: São bacilos Gram-negativos; Fermentam a glicose com ou sem produção de gás; São aeróbios e anaeróbios facultativos; A maioria reduz nitrato a nitrito; A maioria é oxidase negativa e catalase positiva; Podem ser móveis por flagelos peritríqueos ou imóveis; Crescem bem em meios comuns de cultura, como ágar

MacConkey.

Importância clínica• As enterobactérias são universalmente distribuídas no solo, plantas, na água e

no trato gastrointestinal de humanos e dos animais• As Enterobacteriaceae podem ser isoladas de vários sítios infecciosos e são

responsáveis por:- Abscessos; - Pneumonia; - Meningites; - Septicemias; - Infecções de feridas, trato urinário e trato gastrintestinal. • Alguns também são considerados enteropatógenos por causarem

preferencialmente infecções gastrintestinais, como a Salmonella typhi, outras Salmonellas, Shigella spp., Yersinia enterocolitica e vários sorotipos de Escherichia coli, embora possam também causar infecção em outros sítios.

Importância clínica• As principais enterobactérias isoladas, constituindo cerca de 99% dos isolamentos

de enterobactérias de importância clínica, são:• Escherichia coli; Klebsiella spp.; Enterobacter spp.; Proteus spp.; Providencia spp.;

Morganella spp.; Citrobacter spp.; Salmonella spp.; Shigella spp.; Serratia spp.

• As enterobactérias que atualmente predominam são:• Escherichia coli; • Klebsiella spp.; • Enterobacter spp.

• As isoladas com menor freqüência são:• Edwardsiella spp.; • Hafnia spp.; • Yersinia spp.

Isolamento• A amostra clínica deve ser enviada imediatamente ao laboratório

clínico após a coleta.• Em casos onde não é possível o envio ao laboratório em no máximo até

2 horas, manter a amostra refrigerada.• Amostras coletadas em swab podem ser colocadas em meio de

transporte tipo Cary-Blair e/ou meio de Amies.• Amostras de sangue devem ser imediatamente inoculadas em frascos

apropriados para hemocultura.• As enterobactérias crescem bem em meios comuns de cultura e meios

seletivos utilizados para o isolamento de bacilos Gram-negativos. • A maioria delas apresenta colônias maiores de 1 mm de diâmetro, após

incubação de 18 a 24 horas a 35±2ºC, com aspecto opaco, brilhante, transparente ou mucóide.

Identificação

• Baseia-se principalmente na presença ou não de diferentes enzimas codificadas pelo material genético dos cromossomos bacterianos.

• Estas enzimas participam do metabolismo bacteriano em diversas vias, que podem ser detectadas por meios especiais utilizados em técnicas de cultivo in vitro.

Identificação

• A caracterização definitiva dos membros das Enterobacteriaceae pode requerer uma bateria de provas bioquímicas.

• Primeiramnete confirmar se é enterobactéria:*Fermentação da glicose; *Citocromo oxidase negativa; *Redução de nitrato a nitrito.

Identificação• Os passos importantes a serem avaliados para a

identificação das enterobactérias são: Exame macroscópico e microscópico da cultura

• O exame macroscópico e microscópico da cultura constitui a primeira etapa da identificação das enterobactérias.

• O exame macroscópico da cultura permite uma análise do tamanho, aspecto morfológico e coloração da colônia em meios simples e seletivos.

• O exame microscópico se faz através da coloração de Gram

Identificação bioquímica• Após o exame macroscópico e a confirmação da pureza da cultura, uma colônia pode ser

identificada com a ajuda de meios presuntivos de identificação, tais como o meio de Triple Sugar Iron (TSI), EPM Mili e/ou Rugai modificado por Pessoa e Silva (Meio de IAL).

• No meio de IAL, nove reações bioquímicas são observadas em um único tubo:• Fermentação da glicose; • Produção de gás; • Fermentação da sacarose; • Desaminação do L-triptofano; • Produção de indol; • Produção de sulfeto de hidrogênio (H2S); • Hidrólise da uréia; • Descarboxilação da lisina (LDC); • Motilidade.

• O exame presuntivo acompanhado de provas complementares auxilia na confirmação de um gênero ou espécie.

• As provas complementares geralmente necessárias são a descarboxilação da ornitina (ODC), arginina de-hidrolase (ADH), utilização do citrato (Simmons), prova da DNase e prova de Voges Proskauer (reação de VP), e, quando necessário, a fermentação de alguns açúcares.

VP

• A reação de VP divide as enterobactérias em dois grandes grupos: espécies VP positivas e espécies VP negativas

• Em geral, entre os membros mais comuns da família, as espécies VP positivas pertencem aos gêneros Klebsiella, Enterobacter e Serratia.

As espécies dos gêneros Salmonella, Shigella, Proteus, Morganella, Citrobacter, Kluyvera, Providencia e a Escherichia coli apresentam reação de VP negativa.

Características para o diagnóstico presuntivo e triagem dos gêneros e espécies de enterobactérias mais comuns em material clínico.

• As cepas de E.coli apresentam distintos perfis em meio presuntivo de identificação. Isto se deve à grande variabilidade bioquímica que existe entre as cepas, especialmente em relação à produção de gás a partir da fermentação da glicose, fermentação da sacarose, LDC e motilidade.

• No entanto, fermentam a lactose e produzem indol, características que praticamente definem a espécie.

• Cepas de Salmonella produzem pouco gás a partir da fermentação da glicose, são em geral lactose negativas, sacarose negativas e possuem como uma das principais características a produção de H2S .

• As cepas com suspeita de Shigella apresentam um perfil bioquímico muito homogêneo e característico nos meios presuntivos de identificação:

• Raramente produzem gás; • São LDC negativas e imóveis.

• O gênero Citrobacter possui 11 espécies. Todas as espécies são LDC negativas, citrato positivas e a maioria fermenta a sacarose, a lactose e o glicerol, características que diferenciam as espécies de Citrobacter de Salmonella.As espécies de Citrobacter diferenciam-se entre si pela produção de H2S (6 das espécies são H2S positivas), produção de indol, ODC, utilização do malonato e a fermentação de vários açúcares.

• Cepas de Klebsiella possuem um metabolismo muito ativo.

• São VP positivas, fermentam a maioria dos carboidratos e colônias mucóides, lactose positiva, são extremamente comuns, são imóveis e a maioria das espécies é LDC positiva. A produção de urease é característica das espécies K. pneumoniae e K. oxytoca, as mais comuns em material clínico

• Enterobacter é um dos gêneros que possui o maior número de espécies.

• São VP positivas, a maioria das cepas de todas as espécies são móveis e extremamente variáveis bioquimicamente.

• As principais características diferenciais entre E. aerogenes, espécie LDC positiva, e K. pneumoniae são a motilidade e a produção de urease.

• LDC, ODC e ADH são excelentes testes para triagem inicial das espécies de Enterobacter.

• Outro gênero VP positivo, as culturas de Serratia em meio presuntivo de identificação são muito semelhantes as cepas de Salmonella sem H2S.

• A maioria é LDC positiva, lactose negativa e produz pouquíssimo gás a partir da fermentação da glicose.

• A DNase é um teste fundamental para a identificação de Serratia, e recomenda-se a utilização rotineiramente.

• As cepas de Serratia são DNase, lipase e gelatinase positivas. A ausência da fermentação da arabinose e melibiose distingue a S. marcescens, espécie mais comum, das outras espécies de Serratia

• Os gêneros Proteus, Morganella e Providencia caracterizam-se pela desaminação do triptofano. Diferente dos outros dois gêneros, o gênero Proteus invade a superfície de meios sólidos (swarming), é gelatinase e H2S positiva.

• A urease é positiva para os gêneros Proteus, Morganella e Providencia rettgeri. O Proteus mirabilis é indol e maltose negativo e ODC positivo, enquanto que o Proteus vulgaris é indol e maltose positivo e ODC negativo.

Kits de identificação

4 2 1 124 124 12LTD LAC H2S

CIT RAM

GLI GÁS ORN

IND LIS MOT

7 7 7 3

Resistência

• Os microbiologistas devem estar alerta à possibilidade do aparecimento de Enterobacteriaceae resistentes a múltiplos antibióticos.Os mecanismos de resistência bacterianos podem ser intrínsecos (já presentes em todas as amostras de determinada espécie) ou adquiridos (devido à presença de mutações, aquisição de plasmídeos etc).

Resistência

• Dentre os mecanismos de resistência adquiridos mais freqüentes entre as enterobactérias, destacam-se os associados à resistência aos β-lactâmicos, pela hiperexpressão de β-lactamases cromossômicas ou presença de β-lactamases de espectro ampliado (ESBL), às fluoroquinolonas, pelas mutações nos genes gyrA e parC, presença do gene qnr, e aos aminoglicosídeos, pela produção de enzimas que modificam estes agentes.

Beta-lactamases• A resistência a alguns antimicrobianos, especialmente β-

lactâmicos, é freqüentemente encontrada em enterobactérias de infecções em pacientes hospitalizados. Amostras clínicas de enterobactérias, especialmente K. pneumoniae e E. coli, podem produzir uma enzima mediada por plasmídeos denominada ESBL, a qual hidrolisa penicilinas, cefalosporinas e monobactans. A prevalência da produção desta enzima em enterobactérias varia de acordo com a espécie e a região geográfica estudada; entretanto, em determinados centros médicos brasileiros as taxas de ESBL em E. coli e K. pneumoniae coletadas de bacteremias de pacientes hospitalizados podem alcançar aproximadamente 7% e 50%, respectivamente

Beta-lactamases• As amostras bacterianas pertencentes aos gêneros

Citrobacter, Enterobacter, Serratia, Morganella e isolados de Proteus vulgaris são reconhecidamente produtores de β-lactamases AmpC. Estas enzimas são codificadas pelo gene AmpC, e sua produção pode ser induzida quando estes isolados clínicos são expostos a agentes β-lactâmicos. A hiperprodução desta enzima pode acarretar hidrólise de cefalosporinas, como ceftazidima e ceftriaxona, ocasionando falência terapêutica durante tratamento com estes agentes. As cefalosporinas de quarta geração e os carbapenens são mais estáveis à hidrólise pela AmpC.

Carbapenes• Isolados clínicos de enterobactérias resistentes à carbapenens já foram

identificados no Brasil. Os mecanismos de resistência associados a alguns destes fenótipos foram caracterizados por laboratórios de referência em microbiologia, incluindo:

• Enterobacter spp. resistentes a ertapenem: hiperprodução de AmpC e/ou produção de ESBLs; K. pneumoniae com susceptibilidade reduzida a imipenem e meropenem: produção de ESBLs associado a perda de proteína de membrana externa (porinas);

• K. pneumoniae com resistência a imipenem e meropenem: produção de enzimas que degradam os carbapenens (carbapenemases), denominadas KPC;

• K. pneumoniae com resistência a imipenem e meropenem: produção de enzimas que degradam os carbapenens, denominadas metalo-β-lactamases.

ESBL• Os testes fenotípicos para ESBL devem ser utilizados para: • Todos os isolados de K. oxytoca, K. pneumoniae e E. coli, independente do sítio de infecção; • Isolados de Proteus mirabilis provenientes de sítios estéreis de infecção, como sangue e líquor; • A partir da identificação destas espécies pelo laboratório de microbiologia, o perfil de sensibilidade (antibiograma) já contempla

automaticamente testes para a possível presença destas enzimas. Estes testes, realizados pelos laboratórios de rotina, dividem-se em duas fases: testes de triagem e testes confirmatórios para ESBL.

• O CLSI preconiza que o teste de triagem seja realizado pelos métodos de disco difusão (ágar Müeller-Hinton-MHA) ou microdiluição em caldo (Müeller-Hinton caldo cátion ajustado-CAMHB).

Teste de triagem para detecção de ESBL pelo método de disco difusão:

Suspeita-se de cepa produtora de ESBL, quando são encontradas zonas de diâmetro referentes a:• Para K. pneumoniae, K. oxytoca e E. coli:• Cefpodoxima ≤ 17 mm; • Ceftazidima ≤ 22 mm; • Aztreonam ≤ 27 mm; • Cefotaxima ≤ 27 mm; • Ceftriaxona ≤ 25 mm. • Para P. mirabilis:• Cefpodoxima ≤ 22 mm; • Ceftazidima ≤ 22 mm; • Cefotaxima ≤ 27 mm.

• Teste confirmatório para detecção de ESBL pelo método de disco difusão:

• Todas as cepas produtoras de ESBL, apresentam aumento na zona de diâmetro na presença do ácido clavulânico. Confirma-se como ESBL o microrganismo que apresentar um aumento ≥ 5 mm na zona de diâmetro para um dos dois agentes antimicrobianos testados em combinação com o ácido clavulânico versus a zona de diâmetro de quando testado sozinho.Exemplo: Ceftazidima com zona de diâmetro igual a 16 mm e ceftazidima/ácido clavulânico com zona de diâmetro igual a 21 mm. Resultado: ESBL positivo ou cefotaxima com zona de diâmetro igual a 20 mm e cefotaxima/ácido clavulânico com zona de diâmetro igual a 26 mm. Resultado: ESBL positivo.

Ácido Clavulânico• Preparar 1000 l de solução estoque (1 g/l) fresca ou

congelada a –70°C• Adicionar 10 l desta solução sobre os discos de CAZ e CTX uma

hora antes do teste• Comparar os resultados obtidos entre cefalosporinas sozinhas e

com adição de ácido clavulânico

Teste confirmatório recomendado pelo CLSITeste de adição de Ác. Clavulânico

Jarlier, 1988

Distância de 20 - 30

mm

CAZ

ATM

CRO/CTX

CPM

AMX/AC

Detecção de amostras produtoras de ESBLDisco-difusão dupla ou teste de aproximação