Bactérias, leveduras e algas: biofábricas de proteínas

Prof. Fabricio Rochedo Conceiçãofabricio.rochedo@ufpel.edu.br

27 de março de 2012

Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Biotecnologia Microbiana II

Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?

Estudos bioquímicos

Determinação da estrutura 3D

Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico...

Alternativa para as seguintes limitações:

Quantidade

Dificuldade de purificação a partir do tecido original

Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)

Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas

Processo completamente controlado

Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos

Mycoplasma hyopneumoniae

Pneumonia Micoplásmica Suína

Toxina botulínica

Clostridium botulinum C e D

Botulismo

Como prevenir?

Toxóide

Sistemas de expressão de proteínas heterólogas

***Algas, animais e plantas

2. Expression vectors

3. Hosts

Relação volume meio/capacidade do frasco

0,2 (20%)

Inóculo – 5 a 10%

Bactérias e leveduras

Microalgas

Produção industrial

Algumas empresas que comercializam insumos para a expressão de proteínas heterólogas

http://www.promega.com

http://www.neb.com

http://www.stratagene.com

http://www.invitrogen.com

Cultivo:- 28 a 37 C- Aerobiose- pH neutro- Fonte de C e N, microelementos (sais)

Escherichia coli Bacillus subtilis

BACTÉRIASBACTÉRIAS

APLICAÇÕES- Minimizar a proteólise- Maximizar a expressão- Minimizar “vazamento” de expressão (expressão de proteínas tóxicas)- Facilitar o folding- Solubilidade

Vantagens Desvantagens

Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais

Enorme variedade de vetores disponíveis

Atividade biológica pode diferir da proteína natural

Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas

Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção

Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão

Expressão heteróloga em E. coli

*** Alternativas

Vantagens Desvantagens

Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares

Codon usage adequado Plasmídeos instáveis

Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli

Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas

Alta produção de proteínas heterólogas

Expressão heteróloga em B. subtilis

*** Alternativas

LEVEDURASLEVEDURAS

Eucariotos unicelulares – “organelas”

Multiplicação rápida

Manipulação simplificada

Altas densidades celulares

Não Patogênicas (GRAS)

Fisiologia e genética bem conhecidas

Realizam modificações pós-traducionais

PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS

PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS

Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica

DESVANTAGENSDESVANTAGENS

Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose

Alteração da antigenicidade da proteína

Alteração da estrutura 3D

Produção de etanol – tóxico

Falha na secreção de proteínas

Alternativa: outras espécies de leveduras

Metilotrófica – metanol como fonte única de carbono

Glicosilação mais estável e semelhante a de mamíferos

Fermentação pobre – não produz etanol e atinge altas densidades

celulares

28 a 30 C, aerobiose, pH 5,0 - 6,0

Fonte de C (glicerol, metanol...)

Fonte de N (sulfato de amônio)

Desvantagens

Proteólise de proteínas secretadas

Poucos vetores disponíveis (Invitrogen)

Necessita o uso de fermentadores para atingir alta densidade

celular – no entanto não realiza fermentação. Precisa de

oxigênio!

METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL

Álcool Oxidase

Dois genes: AOX1 e AOX2

AOX1 é mais expresso e altamente induzido na presença de

metanol

Enzima tem baixa afinidade por metanol, formando

formaldeído. Compensa produzindo grande quantidade de AOX

(~30% do total de prot)

FENÓTIPOSFENÓTIPOS

Mut = Metanol Utilization

Mut+ - crescimento rápido em metanol

MutS – crescimento lento em metanol

CEPASCEPAS

CLONAGEM - INTEGRAÇÃOCLONAGEM - INTEGRAÇÃO

PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA

PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA

MICROALGAS

MICROALGAS

Eucariotos unicelulares que realizam fotossíntese

Elaboração de alimentos e obtenção de compostos naturais de valor agregado

“Best of both worlds”

Microrganismos: rápido crescimento e facilidade de cultivo

Plantas: capacidade de realizar modificações pós-transcripcionais/traducionais

Rápida produção e scale up

Meio de cultivo muito barato: sais, CO2 e luz solar

Não Patogênicas (GRAS)

Baixo custo de produção de algumas proteínas recombinantes

Chlamydomonas, Chlorella, Volvox, Haematococcus e Dunaliella

Baixa expressão de proteínas heterólogas

Chlamydomonas reinhardtii

Cultivo:

- No geral 18 a 22 C- Agitação- Luz natural ou fluorescente- pH 8,2 – 8,7- Microelementos (P, Zn, B...)- Salinidade 20 a 24 g.L-1