Bi or Eat Ores

5/14/2018 Bi or Eat Ores - slidepdf.com

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Principais etapas de um processo biotecnológico

Matéria-prima

(adequadibilidade aoprocesso,abundância

e custo)

Esterilização

Rastreio e seleçãode microrganismoscom a atividadedesejada

Processos demelhoramentodas estirpes

Biorreator

Controle do processo

Separação e purificaçãodo produto

Conservação daestirpe

industrial

PRODUTO FINALupstream

downstream



Seleção de microrganismos para uso Industrial

- Procura de microrganismos adequados para um processo particular(Isolamento e identificação de microrganismos com a atividade desejada)

- a partir do meio Ambiente (solo, água, etc.)

Eventual melhoramento de estirpes interessantes: Engenharia Genética;

Mutagénese - seleção de mutantes espontâneos ou induzidos)

- Maximizar o rendimento do processo

- Produtos com características melhoradas

- Produtos novos

Estirpes adequadas são conservadas (e, eventualmente, patenteadas)

- em coleções de culturas nacionais e internacionais (ex. American TypeCulture Collection – ATCC, INCQS - FIOCRUZ

- Transferência periódica

- Congelamento (-70ºC)- Ultra-congelamento (-196ºC, N2 liquido)

- Liofilização

técnicas deconservação



Várias metodologias permitem a manutenção de culturas viáveis, nãocontaminadas e inalteradas nas suas propriedades durante períodos de tempo

mais ou menos longos:

Manutenção de microrganismos viáveis no Laboratório e em Coleções de Culturas

•Transferência ou sub-cultura periódica em rampas ou placas de Petri contendo meiosólido (viabilidade: semanas)

* Congelamento (viabilidade:anos)- em Freezer - 20°C- em Nitrogênio líquido (-196ºC)

- em Ultrafreezers (- 70ºC)

• Liofilização: desidratação das células por sublimaçãode água congelada, sob vácuo. (viabilidade: anos; décadas)



Biorreator: equipamento central do processo fermentativo onde ocorrem as

reações de transformação dos substratos nos produtos de interesse atravésda ação de microrganismos. Também chamados de fermentadores.

O processo fermentativo se divide em três etapas básicas:

- Upstream: preparo de meio e material, esterilização.

- Fermentação: transformação substrato em produto

- Downstream: separação de células, isolamento, purificação e concentraçãodo produto

Os biorreatores podem variar em forma e tamanho dependendo daaplicação:

- frascos agitados (erlenmeyers ): 100-1000 mL

- fermentadores de bancada : 1 L – 30 L

- fermentadores piloto: 100 – 1000 L

- fermentadores industriais : 1000 – 1.000.000 L

Também podem ser bandejas , garrafas (fermentação sólida), colunas(imobilização células ou enzimas).



Produção industrial de células de levedura(Saccharomyces cerevisiae ) – estágios na produção e produtos finais



Exigências básicas de um biorreator :

condições adequadas de mistura (uniformidade na distribuição nutrientes,

aeração e baixo cizalhamento)

condições adequadas de pH e temperatura

design adequado para permitir facilidade de operações (compatibilidade com

operações de upstream e downstream)

Fatores fisico-químicos que devem ser considerados em uma fermentação industrial

1.- Oxigênio

2. Temperatura3.- pH



Oxigênio: é um dos substratos gasosos mais importantes para o metabolismo

microbiano. Não é um gás muito solúvel em água, sendo que uma solução saturada

contém aprox. 9 mg/L e devido aos ingredientes do meio de cultivo a saturação é

ainda menor. Portanto é necessário injetar ar no meio de cultura durante o processo

fermentativo.

Agitação e mistura: uma fermentação microbiana pode ser considerada umsistema de três fases.

1. fase líquida: contém sais, substratos e metabólitos dissolvidos. Podetambém possuir substrato imiscível em água.

2.- fase sólida: consiste nas células, substratos ou produtos insolúveis.

3.- fase gasosa: oxigênio, CO2 .

Outros fatores importantes



Uma agitação adequada é essencial em uma fermentação pois proporciona osseguintes efeitos nas três fases:

1.- Dispersão do ar no meio de cultivo

2.- Homogeneizacão, para igualar a temperatura, pH, e concentração de nutrientes.

3.- Suspensão dos microorganismos e dos nutrientes sólidos.

4.- Dispersão de líquidos imiscíveis

Pode-se então pensar que quanto maior a agitação, melhor será o

crescimento. Entretanto, a agitacão excessiva pode romper as células e

aumentar a temperatura o que ocasiona uma redução na viabilidade

celular. Deve-se buscar o equilíbrio entre a necessidade de mistura do

meio evitando-se o dano celular.



Principais Tipos de Biorreatores

convencionais (tanque agitado/aerado)

não-convencionais (sem agitação mecânica)

reatores enzimas/células imobilizadas

Reatores tipo tanque agitado:

Possuem agitação mecânica (impellers) que auxiliam a mistura e distribuição

de nutrientes, calor, O2.A agitação mecânica favorece a homogeneização, suspensão de sólidos,dispersão gás-líquido, aeração e a transferência de calor e massa.



Convencionais

Reator tipo tanque agitado



Agitadores ou impellers: geralmente são colocados em volta de um eixo central

rotatório e distribuídos ao centro e fundo do tanque. O tipo, tamanho e número de

agitadores bem como a localização influenciam diretamente na mistura e

transferência de massa no reator. A velocidade de rotação (rpm) dos agitadores

é definida pelo usuário.

Disco

Turbina

Hélice

Principais tipos de agitadores:



Aeração: o ar é injetado na parte inferior geralmente através de difusores

para controlar o tamanho das bolhas e passa por filtros absolutos para

evitar contaminação. A vazão do ar também é definida pelo usuário (vvm).

O controle de temperatura é feito através de camisa com circulação de água

ligado a um termostato. Os controles de pH, oxigênio dissolvido e espuma

são realizados por sensores específicos. Existem entradas na parte superior

para adição de ácido/base, antiespumante e para entrada de meio e retirada

de amostras.

A esterilização do reator pode ser feita in situ no caso de fermentadoresindustriais ou pode ser levado ao autoclave no caso de fermentadores debancada.

Além do controle de agitação, aeração, pH, temperatura também é

importante considerar a geometria do tanque (relação H/D) que é

importante para a transferência e homogeneização eficiente e o volume

de meio presente. O tanques geralmente são confeccionados em aço

inox ou vidro, materiais que facilitam a limpeza e desinfecção.



Reatores não-convencionais

Principais vantagens uso tanque agitado:

- boa homogeneização

- fácil operação

- baixo custo de manutenção

Principais desvantagens uso tanque agitado:

- baixa produtividade volumétrica

- cizalhamento (atrito) pode prejudicar alguns tipos de células

Biorreatores de bolha (bubble driven reactors): o ar é injetado e disperso sem

agitação mecânica e as bolhas são responsáveis pela agitação e aeração do

sistema. Destacam-se dois tipos principais:

- Reator de Coluna de bolhas

- Reator Airlift



Tubo difusor



Reator de coluna de bolhas é geralmente utilizado para culturas sensíveisao cizalhamento (atrito) tais como fungos e células vegetais.

O reator tipo airlift é semelhante ao de coluna de bolhas porém dispõe de

um tubo difusor.

O tubo difusor: - aumenta transferência de O2 e calor

- uniformiza as forças de cizalhamento- diminui coalescência das bolhas



Redução coalescência devido

circulação induzida pelo tubodifusor.

Maior número bolhas pequenas aumentam superfície troca O2 este é o

principal motivo pelo qual os fermentadores airlift possuem maior

eficiência na transferência de massa e calor e maior produtividade do

que os tanque agitados.

Como exemplo de aplicação

industrial de biorreatores airlift :

produção de antibióticos



Desvantagens airlift em relação tanque agitado:

- maior consumo de energia- maior nível de espuma

- não é compatível com alguns tipos de células (animais)

Reatores para células/ enzimas imobilizadas

As células ou enzimas são imobilizadas em partículas sólidas inertes (vidro,

plástico, fibra vidro, argilas porosas, madeira) ou partículas de gel.

Estes reatores podem ser de dois tipos:

- leito fixo ou empacotado

- leito fluidizado



Biorreatores de leito fixo: as células ou enzimas são imobilizadas em grandes

partículas sólidas ou gelatinosas formando “pacotes”. O meio é adicionado ou

bombeado através da coluna preenchida com partículas onde estão aderidas ou

aprisionadas as células que vão converter o substrato em produto.

No caso de suportes sólidos: células são aderidas na superfície

No caso de partículas de gel: células aprisionadas na rede de polímero. A matrizde gel possui melhor retenção e maior área efetiva superficial para imobilização.



Aplicações do leito fixo ou empacotado:

- tratamento de resíduos (suportes sólidos- filtros biológicos)

- produção de enzimas (suportes gelatinosos)

- biotransformação de esteróides

- produção tradicional de vinagre:

gerador de Frings utiliza tanque

preenchido com lascas de madeira

cobertas com bactérias acéticas

(Acetobacter ) capazes de transformar

etanol (vinho) em ácido acético

(vinagre). O vinho é gotejado na parte

superior do tanque lentamente e quandopassa pela madeira é oxidado

recuperando-se na parte inferior o

vinagre



Biorreatores de leito fluidizado: as células são imobilizadas em pequenas

partículas que ficam em suspensão e se movem com o líquido. Podem ser

definidos como grandes tubos ocos onde partículas contendo células ou

enzimas imobilizadas ficam em suspensão.

As partículas são de material leve e a turbulência do ar e entrada de meio

promovem o movimento das mesmas.

Vantagens do leito fixo = (células imobilizadas)

- fácil recuperação do produto

- utilização células que não estão crescendo (população constante)

Desvantagens: - deficiência na transferência de O2 e nutrientes,

- entupimento e alterações de fluxo (caminhos preferenciais)

- homogeneização prejudicada

-com tempo perda (lavagem) de células aderidas ou aprisionadas



Pequenas partículas: grandesuperfície de contato permitindo alta

transferência de nutrientes e O2.

Nestes reatores é possível obter altaconcentração de biomassa e aomesmo tempo alta taxa de

transferência.

Vantagens:

- alta taxa de transferência e homogeneização

- baixo atrito

- fácil recuperação do produto (não precisa separar as células)

- não há problemas de entupimento como leito fixo

- boa produtividade volumétrica (maior que leito fixo e tanques agitados)



Fermentação em estado sólido ou fermentação semi-sólida: cultivo de

microrganismos em suportes sólidos sob baixo teor de umidade.

Os suportes podem ser resíduos agrícolas (palha, fibra os cascas de arroz,

trigo, milho, mandioca) alimentos (grãos e farinhas) ou ainda suportes inertes

(argilas). A fermentação ocorre em níveis de umidade semelhantes aos

encontrados no ambiente natural dos microrganismos.

- Muito utilizado para processos que envolvem microrganismos filamentosos:

como a produção de enzimas por fungos filamentosos

O microrganismo é inoculado sobre o suporte e o substrato (meio de cultura)

é adicionado sob condições controladas. Em geral quando se utilizam

resíduos agrícolas ou de alimentos estes suportes são utilizados como fonte

de carbono e energia, sendo apenas necessário o controle da umidade e da

temperatura.O processo pode ocorrer em frascos, colunas, tanques, bandejas

ou em tambores rotatórios que facilitam a mistura do suporte com o meio.



Colunas

Bandejas



Tambor rotatório

Reator adaptadocom misturadorpara FES

Tanques com agitadores ourotatórios auxiliam a

homogeneização durante afermentação



Vantagens da FS em relação a fermentação submersa:

- menor custo de capital e operacional

- menor risco de contaminação (baixa umidade)

- maior facilidade de remoção do produto final

- utilização de fontes de carbono não convencionais insolúveis

- ausência de atrito

- permite o desenvolvimento de estruturas diferenciadas importante para a

formação de alguns produtos (fungos)

Desvantagens:

- dificuldade controle de parâmetros físicos durante o cultivo (criação degradientes)

- natureza heterogênea do meio devido a dificuldades na homogeneização



Modos de operação dos biorreatores

Os biorreatores podem ser operados por 3 tipos de processos:

- batelada (batch)

- batelada alimentada (fed-batch)

- contínuo

Batelada: o reator é carregado com meio de cultura, inoculado com o

microrganismo, e o processo segue até o esgotamento de nutrientes e/ou

acúmulo do produto de interesse.

O sistema é fechado, ou seja não ocorre adição de nutrientes (apenas ar,

ácido e base) durante o cultivo. A composição do meio muda constantementedevido ao metabolismo celular e tem-se uma curva de crescimento típica

com sua 4 fases principais.

O volume de meio do reator permanece constante.



Vantagens do processo de batelada:

- fácil operação e controle

- menor risco de contaminação

- construção e instrumentação simples e barata

- processo adequado para curtos períodos de tempo

- versatilidade de usos

Desvantagens:

- esgotamento do meio de cultivo e acúmulo de compostos tóxicos ou degradação

do produto

- menor produtividade volumétrica

- preparo do reator entre uma batelada e outra reduz tempo útil e aumenta custos



Batelada alimentada: inicialmente funciona como um sistema de batelada mas

ocorre adição de meio a medida que a fermentação progride. A alimentação de

meio ou substrato pode ocorrer continuamente (1 etapa) ou em pulsos (váriasetapas). O volume do reator é variável. Muito utilizado para produção de

metabólitos secundários (antibióticos).

Vantagens:

- controle de oferta de substratos as células: permite

alta concentração de substratos indutores; impede

efeito de repressão catabólica (presença de alta

concentração de substrato inibe a síntese de compostos

de interesse - ocorre muito com enzimas e antibióticos);

mantém baixa concentração de substratos inibitórios p/

formação de produto (ácido cítrico)

- permite obtenção alta concentração celular

Desvantagens:

- maior risco de contaminação

- maior necessidade de controle do processo (adição nutrientes)



Contínuo: o meio é adicionado de forma contínua e os produtos da fermentação

também são continuamente removidos. Sistema aberto. Volume é mantido fixo ou

constante. O objetivo da cultura contínua é controlar o crescimento celular em um

nível de produtividade ótima.

Nos sistemas contínuos atinge-se um estado de

equilíbrio onde a concentração de células e

nutrientes é mantida constante, e o produto é

produzido continuamente.

As células e nutrientes que se perdem na saída domeio são equilibradas pelas novas células que

formadas quando substrato é adicionado.

Fatores importantes no sistema contínuo:

- taxa diluição (D) ou fluxo

- concentração de substrato limitante

Agitação do sistema é fundamental para rápida distribuição dos nutrientes



O volume do fermentador é mantido constante utilizando-se uma taxa de fluxo

que gera a produtividade desejada e o equilíbrio do sistema.

Biorreator contínuo no qual o crescimento celular é controlado pela taxa de

alimentação (fluxo) do substrato é chamado de Quimiostato.



Vantagens sistema contínuo:

- maior produtividade volumétrica

- controle da velocidade de crescimento e manutenção da atividademetabólica celular por longos períodos de tempo

- menor perda tempo útil pois fermentação é longa

Desvantagens:

- maior risco de contaminação (tempo muito longo e sistema aberto)

- nem sempre é possível produzir compostos não relacionados ao crescimento

em culturas contínuas

- dificuldade de utilização de substratos complexos de composição variável

- surgimento de mutantes ou variantes genéticas menos produtivas

- dificuldade de utilização de organismos filamentosos (dificil homogeneizaçãopelo padrão crescimento e viscosidade do meio).

Sistemas contínuos não são muito usados industrialmente, mas são úteis emestudos de bancada para desenvolvimento de processos.



Biorreatores contínuos são muito utilizados no tratamento de resíduos

Não há preocupação com contaminação

Sistema de batelada é inviável para tratar toneladas de resíduo



Referencia : A. B. Neto; D. B. Hirata; L. C. M. Cassiano Filho; C. Bellão; A. C. Badino Júnior;C. O. Hokka. A study on clavulanic acid production by Streptomyces clavuligerus in batch, fed-batch and continuous processes. Braz. J. Chem. Eng. 22 (4):557-563, 2005.

Todos os três modos de operação podem ser adaptados aos diferentes tipos

de reatores (tanque agitados, não convencionais e cel. imobilizadas)

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