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Biofísica Molecular Métodos Experimentais em Biofísica Molecular

- Espectrometria de Massas

Prof. Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

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Dr.

Wal

ter F

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Aze

vedo

Jr.

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Biofísica molecular

Química

Física

Biofísica e sua Relação com Outras Disciplinas

Biologia molecular

Bioquímica estrutural

Bioquímica metabólica Biologia celular

Biologia tecidual

Morfofisiologia animal

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O método científico é um conjunto de procedimentos que possibilita a análise de fenômenos naturais com um olhar crítico e sistemático. O método científico visa ex t ra i r mode los de observações e x p e r i m e n t a i s q u e p e r m i t a m o entend imento dos fenômenos da natureza. Podemos estabelecer que o método científico envolve a observação de fenômenos, levantamento de hipóteses sobre o fenômeno, experimentação para verificar a validade ou não das hipóteses levantadas e uma conclusão que valida ou não as hipóteses. Resumindo, o método científico é um guia para descobertas científicas, é a luz que nos separa da superstição.

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Método Científico

Rocha lunar coletada durante a missão da Apollo 15 em exposição no Science Museum London UK. A peça mostrada na foto foi cortada da rocha “Great Scott”, coletada pelo astronauta David Scott em Agosto de 1971, após a alunissagem da nave Apollo 15. A rocha lunar tem massa de 83 g e é mantida numa câmara de nitrogênio para não entrar em contato com a atmosfera terrestre. Um total de 400 kg de rochas foram trazidas da Lua. Uma análise comparativa das rochas lunares indicou semelhanças com as rochas terrestres, o que levou à hipótese da Lua ter se formado a partir de pedaços da Terra, que foram levados ao espaço após a colisão com um planetoide. Essa análise é um exemplo da aplicação do método científico. Foto de Linus Santana Azevedo, 3 de fevereiro de 2013. Informações adicionais em: <h t t p : / / w w w. s c i e n c e m u s e u m . o r g . u k / o b j e c t s / l o a n s /moonrock.aspx > . Acesso em: 3 de novembro de 2017.

O fluxograma ao lado ilustra os principais passos para a aplicação do método científico. Ao identificarmos o problema, escolhemos qual parte da natureza estamos interessados em estudar. Uma vez definido o problema, coletamos dados sobre o problema. A coleta de dados significa observar e realizar medições focadas no problema em estudo, ou usar dados previamente coletados na literatura científica sobre o problema a ser estudado. A natureza das medidas depende do sistema sendo estudado. Tais medidas formam os dados, que serão submetidos à análise estatística que auxiliarão na elaboração da(s) hipótese(s) e posterior teste(s) desta(s). A elaboração da(s) hipótese(s) é uma tentativa de explicar de forma racional a parte da natureza (problema) que estamos estudando.

4

Identificação de um problema

Coleta de dados

Elaboração de hipótese(s)

Teste de hipótese(s)

(experimento)

Novos dados

confirmam as

hipótese(s)?

Não Sim

Método Científico

Nada garante que nossa(s) hipótese(s) está(ão) certas. Temos que testá-la(s), elaborando um novo experimento que, por sua vez, irá gerar novos dados. A caixa de decisão, representada pelo losango ao lado, indica que testamos se os novos dados estão em concordância com a(s) hipótese(s). Caso estejam, temos um experimento em concordância com a(s) hipótese(s) e podemos elaborar um novo experimento para testar a(s) hipótese(s). Depois que um número estatisticamente relevante de experimentos for realizado, p r e f e r e n c i a l m e n t e p o r d i v e r s o s labora tó r ios independentes , a (s ) hipótese(s) pode(m) receber o status de uma teoria. Caso os novos dados refutem a(s) hipótese(s) levantada(s), temos a necessidade de nova(s) hipótese(s), que geram novos experimentos, o ciclo se repete.

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Novos dados

confirmam as

hipótese(s)?

Identificação de um problema

Coleta de dados

Elaboração de hipótese(s)

Teste de hipótese(s)

(experimento)

Não Sim

Método Científico

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Método Científico (Exemplo da Estrutura do DNA)

Nosso problema está focado na forma que o DNA armazena a informação genética (identificação de um problema). Antes da resolução da estrutura do DNA, sabia-se que este armazenava a informação genét ica (Exper imento de Avery-MacLeod-McCarty)(Avery, MacLeod, McCarty,1944) e era constituído de 4 nucleotídeos (coleta de dados). Referência: Avery, Oswald T.; Colin M. MacLeod, Maclyn McCarty (1944-02-01). "Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types: Induction of Transformation by a Desoxyribonucleic A c i d F r a c t i o n I s o l a t e d f r o m Pneumococcus Type III". Journal of Experimental Medicine 79 (2): 137-158.

Representação artística da estrutura do DNA. Science Museum, London, UK. Foto de Linus Santana Azevedo, 3 de fevereiro de 2013.

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Em seguida temos a elaboração da hipótese. A hipótese levantada por James Watson e Francis Crick é que a estrutura do DNA apresenta uma hélice dupla. Sabia-se que o padrão de difração de raios X de uma estrutura helicoidal produziria um padrão com formato de “X” (Cochran, Crick and Vand, 1952). Assim, temos uma forma de confirmar se o DNA é helicoidal ou não. O passo seguinte é o teste da hipótese, no caso os experimentos que envolvem a cristalização do DNA e a posterior coleta de dados de difração de raios X (figura mostrada ao lado). A cristalização e coleta de dados de difração de raios X foram realizadas por Rosalind Franklin.

Diagrama esquemático para a produção do padrão de difração de raios X do DNA. O padrão foi obtido originalmente por Rosalyn Franklin, e usado por James Watson e Francis Crick para elucidarem a estrutura 3D do DNA, contudo, ao publicarem o artigo relatando a estrutura do DNA, o nome da Rosalyn Franklin foi omitido. S i te Science Photo L ib rary . D isponíve l em: <http://www.sciencephoto.com/media/210096/view >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.


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A partir da cristalização e, posterior coleta do padrão de difração de raios X do DNA, Watson e Crick propuseram a estrutura em hélice dupla para DNA, mostrada no modelo de metal em exposição do Science Museum, London UK. A estrutura de DNA foi descrita num artigo de duas páginas, publicado na revista Nature em Abril de 1953. O padrão em X da difração de raios X deu suporte experimental para a hipótese (teste da hipótese). Referências: Cochran W, Crick FHC and Vand V. (1952) "The Structure of Synthetic Polypeptides. I. The Transform of Atoms on a Helix", Acta Cryst., 5, 581-586. Watson JD, Crick FH. Molecular structure of nucle ic ac ids; a st ructure for deoxyribose nucleic acid. Nature. 1953;171(4356):737-8.

Modelo em metal da estrutura do DNA. A estrutura do DNA foi modelada a partir das informações contidas no padrão de difração de raios X de cristais de DNA. Science Museum, London, UK. Foto de Linus Santana Azevedo, 3 de fevereiro de 2013.


Uma grande parte de cientistas da área de inteligência artificial, acredita que vivemos um momento especial da história do desenvolvimento científico. Devido à importância deste momento, destaco nos meus modestos cursos alguns aspectos relevantes do processo da singularidade tecnológica. Uma das características desta última é o aumento expressivo da expectativa de vida. Se compararmos a expectativa de vida hoje, com a de um brasileiro do início do século XX, vemos q u e m a i s q u e d o b r a m o s n o s s a expectativa. No gráfico ao lado, vemos que a expectativa de vida do brasileiro em 1910 era de 34 anos, e hoje está acima de 70 anos. O aumento deve-se a d i v e r s o s f a t o r e s , t a i s c o m o o desenvolvimento no saneamento básico e as conquistas científicas da medicina moderna.

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Ano

Expectativa de vida do Brasileiro entre 1910 e 2009. Fonte dos dados: Informe da Previdência Social. Disponível em: < h t t p : / / w w w. p r e v i d e n c i a . g o v. b r / a r q u i v o s / o f f i c e /4_110525-171625-908.pdf >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

0

10

20

30

40

50

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80

1900 1920 1940 1960 1980 2000 2020

Singularidade Tecnológica

Exp

ecta

tiva

de v

ida

Dados para expectativa de vida, antes de 1910, indicam números ainda piores. Segundo algumas fontes, a expectativa de vida no Brasil em 1900 era inferior a 30 anos. Fonte: Laboratório de Demografia e Estudo Populacionais. Disponível em: < http://www.ufjf.br/ ladem/2012/02/28/aumento-da-longevidade-e-estancamento-da-esperanca-de-vida-artigo-de-jose-eustaquio-diniz-alves/ >. Acesso em: 3 de novembro de 2017. Um gráfico da evolução da expectativa de vida ano a ano (2000-2012), mostra aspectos curiosos do aumento. Vemos um avanço considerável entre 2002 e 2004. Este pulo na melhora da expectativa de vida, é, também, uma consequência direta de políticas públicas de redução da pobreza.

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Expectativa de vida do Brasileiro entre 2000 e 2012. Fonte dos dados: Index Mundi. Disponível em: < http://www.indexmundi.com/g/g.aspx?c=br&v=30&l=pt >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80

1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010 2012 2014

Exp

ecta

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ida

Ano


Olhando para o futuro, a expectativa de vida traz grandes promessas. Um geneticista da Cambridge University -Reino Unido, prevê que a primeira pessoa a viver mais de 1000 anos já está entre nós (Site da BBC. Disponível em: < http:/ /news.bbc.co.uk/2/hi/uk_news/4003063.stm >. Acesso em: 3 de novembro de 2017. Isto mesmo, mil anos! Não é erro de digitação. Eu sou cético com relação a esse número, mas acredito, baseado na aceleração do desenvolvimento científico, que ultrapassaremos o limite de 120 anos nas próximas décadas.

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Página de entrada do site da Strategies for Engineered Negligible Senescence (SENS) Foundation. Disponível em: < http://sens.org/>. Acesso em: 3 de novembro de 2017.


A evolução da ciência médica, nos deu nas últimas décadas desenvolvimentos como transplantes, vacinas, novos fármacos etc. Além disso, temos a expectativa da substituição de órgãos, como o rim crescido artificialmente mostrado ao lado (Song et al., 2013). Baseado neste cenário, podemos ser otimistas quanto à expectativa de vida do ser humano. Esperamos que, nas p r ó x i m a s d é c a d a s , t e r e m o s a possibilidade de substituição de nossos órgãos conforme envelhecemos. A substituição do rim por um crescido artificialmente tem uma perspectiva de ser possível numa década. Outros órgãos apresentam equivalente biomecânico, como o coração.

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Rim artificial testado em ratos. D i s p o n í v e l e m : < http://www.bbc.co.uk/news/science-environment-22149844>. Acesso em: 3 de novembro de 2017. Referência: Song JJ, Guyette JP, Gilpin SE, Gonzalez G, Vacanti JP, Ott HC. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nat Med. 2013 Apr 14. doi: 10.1038/nm.3154


Além do aumento expressivo do número de anos vividos, a humanidade usufruirá de facilidades tecnológicas, cada vez mais baratas. A evolução da medicina e da cibernética permitirá o desenvolvimento de um equivalente computacional ao cérebro humano. Como o desenvolvimento concomitante da neurociência, espera-se que tenhamos a capacidade tecnológica de transferirmos o conjunto de nossas sinapses para um cérebro eletrônico, ou seja, a substituição do cérebro humano, por um equivalente computacional. Nessa fase a humanidade atingirá virtualmente a imortalidade. A situação onde esta transição ocorrerá, é chamada de singularidade tecnológica.

Visão artística da modelagem matemática do cérebro. D i s p o n í v e l e m : <http://www.kurzweilai.net/mind-uploading-featured-in-academic-journal-for-first-time>. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

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O gráfico ao lado ilustra a lei de Moore, que estabelece que aproximadamente entre 18 e 24 meses o número de transistores por chip dobra. Essa lei foi proposta por Gordon Moore cofundador da Intel. Ou seja, considerando-se os processadores hoje, esperamos que em aproximadamente entre 18 e 24 meses teremos disponíveis, pelo mesmo preço, c o m p u t a d o r e s c o m o d o b r o d a capacidade de processamento. Uma extrapolação da lei de Moore para 2030, ou um pouco depois, indica que teremos computadores com a complexidade do cérebro humano. D i s p o n í v e l e m : < http://www.kurzweilai.net/the-law-of-accelerating-returns >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Evolução do número de transistores por chip em função do ano. D i s p o n í v e l e m : http://library.thinkquest.org/4116/Science/moore%27s.htm. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

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A pesquisa em singularidade tecnológica é uma atividade multidisciplinar, cujo o foco é o entendimento dos sistemas b i o l ó g i c o s e c o m p u t a c i o n a i s , especificamente a interface do ser humano com máquinas. A partir desse conhecimento, teremos condições de prolongar nossa expectativa de vida, até termos condições tecnológicas de transferirmos nossa consciência para um sistema computacional, o que abre a possibilidade da imortalidade, bem como uma nova fase da evolução humana. Essa fase da evolução permitirá a integração das consciências computacionais, o que a b r e u m a m p l o e s p e c t r o d e possibilidades. Essas tecnologias ainda não existem, mas se consideramos a lei de Moore, vemos que o rápido desenvolvimento tecnológico nos levará até esse estágio.

Visão artística do cérebro digital. D i s p o n í v e l e m : < http:/ /www.kurzwei lai .net/cr i t ique-of-against-naive-uploadism#!prettyPhoto>. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

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Muitos autores destacam que, as p e s q u i s a s m a i s i m p o r t a n t e s e desafiadoras nos dias de hoje estão relacionadas com a singularidade tecnológica. A biofísica molecular pode contribuir nessa área em duas frentes de atuação. Uma frente para entendermos as bases moleculares do funcionamento do cérebro, que permitirá seu entendimento e então sua modelagem computacional. Noutra frente, ao vivermos mais (aumento da expectativa de vida), nos tornamos sujeitos a novas enfermidades, que podem ser combatidas com abordagens do desenho de fármacos baseado em computadores.

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Página de entrada do site Kurzweil Accelerating Intelligence. Disponível em:<http://www.kurzweilai.net/ >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.


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Ao atingirmos a singularidade tecnológica, abandonaremos as limitações biológicas do nosso ser e atingiremos um universo de novas possibilidades que essa fase nos trará.


Espectrometria de Massas (Fundamentos)

18

v

Se um objeto está movimentando-se numa dada trajetória, e submetemos esse objeto a uma força lateral (F), teremos uma mudança na sua trajetória. Consideremos o lançamento de uma bola de basquete, imagine que estamos com uma mangueira d’água, e direcionamos um jato d’água para a bola. Sua trajetória será alterada, devido à força transversal F exercida sobre a bola. Consideremos uma outra situação, uma bola de tênis, com a mesma velocidade (v) da bola de basquete. Se dirigirmos o mesmo jato d’água para a bola de tênis, teremos um desvio da t r a j e t ó r i a m a i o r a i n d a . E s t a m o s considerando que ambas as bolas estão com a mesma velocidade (v) e o jato d’água exerce a mesma força F.

F

R

O que podemos tirar qualitativamente desse experimento? O desvio da trajetória pode ser expresso pelo raio da curva (R) que a bola descreve ao ser submetida a uma força transversal (F). Assim, um desvio grande equivale a dizer que a bola descreve uma curva com raio menor. Olhando-se a física do sistema, temos uma bola submetida a uma aceleração centrípeta, que a coloca em uma trajetória circular, pelo menos enquanto submetida à força exercida pela água da mangueira.

4

v

F

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


A força é que leva à aceleração centrípeta, causando a trajetória circular de raio (R). A força centrípeta (F) é dada pela equação abaixo: onde R é o raio da circunferência, m a massa da bola e v a velocidade da bola. Isolando-se o raio da circunferência (R) da equação acima temos: A partir da equação do raio, vemos que para uma força e velocidade constantes, temos que o raio da circunferência (R) é proporcional à massa da bola (m).

RmvF

2

=

FmvR

2

=

5

v

F

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


21

Olhando a equação do raio da trajetória, vemos que o termo entre parênteses é constante, o que varia é a massa da bola e, consequentemente, o raio da circunferência. A equação acima é uma forma de determinarmos a massa (m) de uma partícula a partir do raio (R) da circunferência descrita pela partícula quando submet ida a uma fo rça conhecida, como a exercida por um jato d’água.

v

F

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

FvmR2

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


22

Isolando-se a massa (m) da equação anterior temos: Resumindo, num experimento onde lançamos um partícula com velocidade (v) constante, sabemos a velocidade (v) e a força (F), podemos determinar a massa (m). Esse é o princípio para entendermos o funcionamento de espectrômetro de massas.

v

F

2vRFm =

v

F

Rbola de tênis

Rbola de basquete


23

v

F

R

B x

qvBEqF +=

Quando temos uma partícula com carga q, se deslocando com velocidade v em uma região, onde temos um campo elétrico E e um campo magnético B, essa partícula fica sujeita a uma força devido aos campos elétrico e magnético, essa força (F) é chamada força de Lorentz e tem a seguinte expressão: Estamos considerando que o campo magnético (B) é perpendicular à velocidade da partícula, como no desenho ao lado.

Campo magnético perpendicular ao plano do slide, x indica essa situação


Considerando-se somente o campo magnético B, a partícula será sujeita a uma força (F), dada pela seguinte equação: Essa força de aceleração centrípeta submete a partícula a uma aceleração radial (a), fazendo com que uma partícula de massa m e velocidade v descreva uma trajetória circular com raio R, essa força centrípeta tem a seguinte expressão: Igualando-se as duas equações acima, chegamos a seguinte expressão para a massa (m) de uma partícula, com raio da trajetória (R) num campo magnético constante (B):

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qvBF =

RmvF

2

=

vqBRmqvB

RmvF =⇒==

2


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Partícula com carga positiva deslocando-se num campo magnético constante gerado por um ímã. Figura disponível em: < http://www.school-for-champions.com/science/magnetism_lorentz.htm#.VFzoQpV0zIU > Acesso em: 3 de novembro de 2017.

B

F

v

Considerando que temos um campo magnético (B) constante entre os polos norte e sul de um ímã, temos uma força (F) atuando sobre uma partícula com carga positiva e velocidade v, como indicada na figura abaixo.


Muito bem, as observações anteriores servem de base para o entendimento de umas das técnicas mais usadas na análise de moléculas biológicas no século XXI, a espectrometria de massas. Essa técnica permite que as massas moleculares de a m o s t r a s d e p r o t e í n a s , peptídeos e outras moléculas biológicas sejam determinadas com precisão, a partir do desvio que apresentam ao deslocarem-se num campo magnét ico gerado por um eletromagneto. Ao lado temos o diagrama e s q u e m á t i c o d e u m espectrômetro de massas típico. D e s c r e v e r e m o s c a d a componente do equipamento nos próximos slides.

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Ionização Aceleração

eletromagneto

Para bomba de vácuo

Deflexão

Detecção

amostra vaporizada

amplificador

gravador de dados

Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.


A amostra (átomos ou moléculas) é vaporizada. Essa amostra vaporizada é injetada e submetida ao processo de ionização, que ocorre na câmara de ionização, mostrada abaixo. Nessa câmara temos um feixe de elétrons gerados a partir de um filamento de metal aquecido. Os elétrons são atraídos para uma placa metálica positiva, chamada armadilha de elétrons (electron trap). Ao passar pelo feixe de elétrons, a amostra vaporizada é ionizada, gerando íons positivos, ou seja, temos agora uma amostra formada em parte por partículas com carga +1. A grande maioria dos íons gerados tem carga +1, mas podemos ter íons com carga maior. Esses íons são forçados para direita pelo repelente de íons (ion repeller). A câmara de ionização é mantida num potencial elétrico de +10.000 Volts, que promove a ejeção de cargas positivas.

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Espectrometria de Massas (Ionização)

Diagrama esquemático da câmara de ionização de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Repelente de íons

Amostra vaporizada

Armadilha de elétrons

Elétrons

Íons positivos

Filamento de metal aquecido

O feixe com as partículas da amostra sai da câmara de ionização e atravessa três fendas, como indicado na figura abaixo. As fendas aceleradoras de feixes são chamadas de lentes eletrostáticas, pois realizam o “foco” do feixe de íon. Essas fendas têm como função gerar um feixe de partículas estreito e permitir a aceleração das partículas carregadas da amostra vaporizada. As fendas apresentam potencial elétrico decrescente, da esquerda para direita, sendo que a fenda final apresenta um potencial elétrico de 0 volts. Tal arranjo de fendas possibilita a aceleração do feixe de partículas carregadas.

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Espectrometria de Massas (Aceleração)

Diagrama esquemático das fendas aceleradoras de feixe de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Placa intermediária

Placa final a 0 Volts

Feixe de íons

Câmara de ionização a + 10.000 Volts

Ao chegar ao eletromagneto, o feixe é submetido a uma deflexão que é inversamente proporcional à massa da partícula, ou seja, partículas mais leves sofrem maiores desvios. Outra parâmetro que afeta o desvio é a carga, íons mais positivos são mais defletidos, assim se tivermos, para uma mesma massa, um íon com carga +2, esse sofrerá um desvio maior que uma partícula com mesma massa mas carga +1. Como o desvio do feixe de partículas depende da massa e da carga, é padrão combinarmos essas informações na razão m/z (massa/carga). Por exemplo, se um íon tem uma massa atômica de 12 e uma carga de +1, sua razão m/z é 12. Veja que o “z” é minúsculo, não confundir com “Z” maiúsculo, usado para representar o número atômico.

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Espectrometria de Massas (Deflexão)

Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Eletromagneto

Feixe de íons misturados

Feixe de íons C

Feixe de íons B Feixe de íons A

No diagrama esquemático abaixo temos a indicação de três feixes de íons. Se considerarmos que todos os feixes são de partículas com carga +1, temos que o feixe A tem as partículas mais leves, seguido do feixe B, sendo o mais massivo o feixe C.

30 Diagrama esquemático do eletromagneto de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Eletromagneto

Feixe de íons misturados

Feixe de íons C

Feixe de íons B Feixe de íons A

Espectrometria de Massas (Deflexão)

No diagrama visto no slide anterior, temos que só o feixe B chega ao detector de íons, os outros feixes colidem com as paredes do espectrômetro de massas e são removidos pela bomba de vácuo. Um íon do feixe B, ao chegar no detector de íons, colide com a placa metálica do detector, essa placa está ligada a um fio. Ao colidir com a placa, o íon captura um elétron da placa, tornando-se neutro (carga elétrica zero). A captura do elétron do metal deixa uma lacuna de elétron na placa metálica, que é preenchida por um elétron do fio ligado à placa metálica. Essa corrente é detectada e amplificada. Quanto mais íons colidirem com a placa metálica do detector de íons, mais elétrons serão capturados e maior será a corrente gerada. Assim, a corrente gerada é proporcional ao número de íons que atinge o detector.

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Espectrometria de Massas (Detecção)

Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Feixe de íons B

Caixa de metal

Para o amplificador

Íon positivo

elétrons

Os íons do feixe A podem ser detectados diminuindo-se a intensidade do campo magnético. Já os íons do feixe C, necessitam um aumento na intensidade do campo magnético, para que possam atingir o detector de íons.

32 Diagrama esquemático do detector de íons de um espectrômetro de massas. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Feixe de íons B

Caixa de metal

Para o amplificador

Íon positivo

elétrons


A análise realizada pelo espectrômetro de massas gera um espectro de massas, que é mostrado num gráfico onde temos no eixo vertical a abundância relativa do íon e no eixo x a razão m/z. A abundância relativa é diretamente proporcional à intensidade corrente medida, assim o que temos também é uma representação da intensidade relativa das correntes medidas. Esse gráfico é chamado de espectro de massas da amostra. No caso abaixo temos uma amostra do elemento químico molibdênio. Pelo espectro vemos que o isótopo mais abundante do molibdênio é o de razão m/z igual a 98.

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abundância relativa

Espectro de massas do molibdênio. Imagem disponível em: < http://www.chemguide.co.uk/analysis/masspec/howitworks.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.


Há diversos refinamentos da técnica de espectrometria de massas, especificamente com foco em cada uma das etapas do processo. Por exemplo, no método MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization), temos uma mistura da amostra a ser analisada com uma substância de baixa massa molecular, se comparada com uma proteína. Essa substância absorbe radiação ultravioleta, pois a maioria do espectrômetros de massa, que usam o método MALDI, apresenta um laser na faixa UV. A mistura amostra+substância é dissolvida em solvente orgânico e levada a uma câmara de vácuo, que leva à solidificação da mistura amostra+substância.

34

Espectrometria de Massas (MALDI)

Raio laser

Íon da amostra

Para o analisador de massa

Mistura amostra/matriz

Matriz ionizada

Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser analisada é misturada a uma substância que absorve radiação ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: < ht tp: / /www.magnet. fsu.edu/educat ion/ tutor ia ls/ tools/ionization_maldi.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

A remoção do ar na câmara de vácuo leva à evaporação do solvente orgânico e à cristalização da mistura amostra + substância, formando o que chamamos de matriz. Essa matriz é pulverizada a partir de um feixe de laser de alta intensidade, como ilustrado abaixo. A substância absorve UV ionizando-se e transferindo parte da energia absorvida para a proteína (amostra). A amostra é levada à ionização no processo. Todos os detalhes do processo de ionização da amostra não são totalmente entendidos, mas o resultado líquido é que a amostra é levada à ionização.

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Raio laser

Íon da amostra

Para o analisador de massa

Matriz ionizada

Mistura amostra/matriz

Método de ionização da amostra MALDI. A amostra a ser analisada é misturada a uma substância que absorve radiação ultravioleta, por exemplo a substância 2,5-dihidroxi ácido benzoico. Essa mistura é dissolvida em solvente orgânico, por exemplo acetonitrilia, e injetado numa câmara de vácuo para cristalizar, o que forma a matriz. Imagem disponível em: < ht tp: / /www.magnet. fsu.edu/educat ion/ tutor ia ls/ tools/ionization_maldi.html >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.


36 Diagrama da técnica MALDI. Figura modificada da original disponível em: http://mutage.oxfordjournals.org/content/15/5/415.full.pdf+html . Acesso em: 3 de novembro de 2017. Bakhtiar R., Tse FLS. Mutagenesis (2000) 15 (5): 415-430.

O diagrama abaixo ilustra os principais passos do método de MALDI aplicado na análise de um peptídeo (amostra). O peptídeo ionizado permite a análise da massa dos seus fragmentos.

Espectro de massas do peptídeo


Na análise dos espectros de m a s s a s d e p e p t í d e o s , terminamos com os valores das massas dos resíduos de aminoácidos, assim, para i d e n t i f i c a r s o b r e q u a l aminoácido o pico no espectro de massa se refere, temos que fazer uso de uma tabela de massas moleculares dos resíduos de aminoácidos, como a indicada ao lado. Lembrem-se que para o C-terminal, temos que somar o peso atômico do oxigênio e do hidrogênio.

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Espectrometria de Massas (Espectro de Massas)

Amino Acid Short Abbrev. Formula Mon. Mass§ (Da) Avg. Mass (Da)

Alanine A Ala C3H5NO 71.03711 71.0788

Cysteine C Cys C3H5NOS 103.00919 103.1388

AsparLc acid D Asp C4H5NO3 115.02694 115.0886

Glutamic acid E Glu C5H7NO3 129.04259 129.1155

Phenylalanine F Phe C9H9NO 147.06841 147.1766

Glycine G Gly C2H3NO 57.02146 57.0519

HisLdine H His C6H7N3O 137.05891 137.1411

Isoleucine I Ile C6H11NO 113.08406 113.1594

Lysine K Lys C6H12N2O 128.09496 128.1741

Leucine L Leu C6H11NO 113.08406 113.1594

Methionine M Met C5H9NOS 131.04049 131.1986

Asparagine N Asn C4H6N2O2 114.04293 114.1039

Pyrrolysine O Pyl C12H21N3O3 255.15829 255.3172

Proline P Pro C5H7NO 97.05276 97.1167

Glutamine Q Gln C5H8N2O2 128.05858 128.1307

Arginine R Arg C6H12N4O 156.10111 156.1875

Serine S Ser C3H5NO2 87.03203 87.0782

Threonine T Thr C4H7NO2 101.04768 101.1051

Selenocysteine U Sec C3H5NOSe 150.95364 150.0388

Valine V Val C5H9NO 99.06841 99.1326

Tryptophan W Trp C11H10N2O 186.07931 186.2132

Tyrosine Y Tyr C9H9NO2 163.06333 163.1760 Fonte da tabela em: < http://en.wikipedia.org/wiki/Proteinogenic_amino_acid >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Maiores informações sobre a singularidade tecnológica podem ser encontradas nos artigos de Ray Kurzweil disponíveis on-line no site Kurzweil Accelerating Intelligence. ► Kurzweil responds: Don’t underestimate the Singularity. Disponível em: < http://www.kurzweilai.net/kurzweil-responds-dont-underestimate-the-singularity>. Acesso em: 3 de novembro de 2017. ► The new era of health and medicine as an information technology is broader t h a n i n d i v i d u a l g e n e s . D i s p o n í v e l e m : < http://www.kurzweilai.net/the-new-era-of-health-and-medicine >. Acesso em: 3 de novembro de 2017. ► How my predictions are faring — an update by Ray Kurzweil. Disponível em: < http://www.kurzweilai.net/how-my-predictions-are-faring-an-update-by-ray-kurzweil >. Acesso em: 3 de novembro de 2017. ► T h e L a w o f A c c e l e r a t i n g R e t u r n s . D i s p o n í v e l e m : < http://www.kurzweilai.net/the-law-of-accelerating-returns >. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

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O melhor material sobre a Singularidade Tecnológica, segundo minha modesta avaliação, é o livro do Ray Kurzweil. “The Singularity is Near”. O livro mostra de forma científica e criteriosa o crescimento rápido das revoluções científicas e tecnológicas, extrapolando a tendência de desenvolvimento para as próximas décadas, onde chegaremos ao ponto da Singularidade Tecnológica.

Disponível em: <http://www.amazon.com/gp/product/images/0143037889/ref=dp_otherviews_0?ie=UTF8&s=books&img=0>. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

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Livro Indicado

O site do Ray Kurzweil traz uma coleção de no t íc ias re lac ionadas com o desenvolvimento científico em áreas de interesse da Singularidade Tecnológica. Há destaque para pesquisas em Intel igência Art i f ic ial , Computação Quântica, Bioinformática, Biomecânica, desenvolvimento de novos fármacos, entre outros: http://www.kurzweilai.net/ Simplesmente fascinante!

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Página de entrada do site Kurzweil Accelerating Intelligence. Site Kurzweil Accelerating Intelligence. Disponível em: <http://www.kurzweilai.net/>. Acesso em: 3 de novembro de 2017.

Site Indicado

Para os interessados em ficção científica minha sugestão cinematográfica é o filme “Transcendence” que trata do assunto da singularidade tecnológica.

Cartaz do filme: Transcendence Disponível em: <http://www.imdb.com/media/rm2593966848/tt2209764?ref_=tt_ov_i>. Acesso em: 1 de mar. 2015.

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Material Adicional (Filme Indicado)

Dong H,, Marchetti-Deschmann M, Allmaier G. Characterization of on-target generated tryptic peptides from Giberella zeae conidia spore proteins by means of matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Mol and Cel Probes 2014, 28:91-8. Seidler J., Zinn N., Boehm M.E., Lehmann W.D. De novo sequencing of peptides by MS/MS. Proteomics 2010, 10:634-49. Steen H., Mann M. The ABC’s (and XYZ’s) of Peptide Sequencing. Nat Mol Cell Biol 2004, 5:699-711.

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Referências

Documents

Biofísica Molecular - azevedolab.net · O método científico é um conjunto de ... método científico envolve a observação ... o que levou à hipótese da Lua ter se formado