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BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO PARA BIORREMEDIAÇÃO NA INTERFACE SOLO-PLANTA- MICRORGANISMOS João Victor Rego Ferreira Rio de Janeiro 2012

BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS … victor rego.pdf · Bibliografia: f. 24-31. ... Thiago Bretz Carvalho Dr. em Biotecnologia Vegetal _____ Ronaldo Figueiró Portella

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BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE

MICRORGANISMOS COM POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO

PARA BIORREMEDIAÇÃO NA INTERFACE SOLO-PLANTA-

MICRORGANISMOS

João Victor Rego Ferreira

Rio de Janeiro

2012

JOÃO VICTOR REGO FERREIRA

Aluno do Curso de Tecnologia em Biotecnologia

Matrícula 0913800325

BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE

MICRORGANISMOS COM POTENCIAL

BIOTECNOLÓGICO PARA BIORREMEDIAÇÃO NA

INTERFACE SOLO-PLANTA-MICRORGANISMOS

Trabalho de Conclusão de Curso, TCC, apresentado ao curso de Graduação em Tecnologia em Biotecnologia da UEZO como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Tecnólogo em Biotecnologia, sob a orientação da Prof.a Ida Carolina Neves Direito.

Rio de Janeiro

Julho de 2012

F383 Ferreira, João Victor Rego. Bioprospecção e identificação de micro rganismos

com potencial biotecnológico para biorremediação na interface solo-planta-microrganismos / João Victor Rego Ferreira.

31 f.; 30 cm.

Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação Tecnologia em Biotecnologia ) — Fundação Centro Universitário Estadual da Zona Oeste, Rio de Janeir o, 2012. Bibliografia: f. 24-31.

1. ácido2,4-diclorofenoxiacético. 2.Biodegradação . 3. Bioprospecção. 4. hortaliças I. Título.

CDD 620.112

ii

BIOPROSPECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE

MICRORGANISMOS COM POTENCIAL

BIOTECNOLÓGICO PARA BIORREMEDIAÇÃO NA

INTERFACE SOLO-PLANTA-MICRORGANISMOS

Elaborado por João Victor Rego Ferreira

Aluno do curso de Tecnologia em Biotecnologia da UEZO

Este trabalho de Graduação foi analisado e aprovado com

Grau: 10 (dez)

Rio de Janeiro, de 09 de Julho 2012

_________________________________________________ Thiago Bretz Carvalho

Dr. em Biotecnologia Vegetal

_________________________________________________ Ronaldo Figueiró Portella Pereira

Dr. em Ecologia

_________________________________________________ Ida Carolina Neves Direito

Dr.a em Biotecnologia Vegetal

iii

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora, professora Ida Carolina Neves Direito e meu co-orientador

Andrew Macrae pelo apoio, paciência e exemplo.

Aos técnicos do laboratório LTBM, Rafael Gomes, Adriano Pereira, Verônica

Torres e Francisco Júnior. Ao técnico José Olavo do laboratório de Biotecnologia

Sustentável e Bioinformática Microbiana da UFRJ.

Aos companheiros de laboratório Juliana Succar, Andressa Sbano, Barbara Peckle,

Angel Gomes, Kayo Bianco, Aline Lorete, Pedro Rodrigues, Juliana Chal, Ezaine

Torquato, Amanda Monteiro e Adriana Sacramento.

Aos meus amigos da UEZO, em especial Lígia Ferreira, Marcos Felipe e Yuri

Faria.

A UEZO pelo apoio financeiro e pela experiência e conhecimento adquirido.

A minha namorada Andressa Sbano que esteve ao meu lado nos momentos mais

difíceis e melhores na UEZO. Dando-me todo o apoio e tranquilidade durante a escrita

deste trabalho.

Aos professores João Bosco de Salles, Maria Cristina de Assis e Jessica Manya por

deixarem utilizar os seus laboratórios.

A toda minha família, em especial minha mãe Ilma Rego, minha irmã Luana

Rodrigues, meu pai Ilson Ferreira, minha avó Hilda Rodrigues e meu avô João Severino do

Rego.

Aos meus amigos, em especial Alleson Costa, Luan Pereira, Marcello dos Anjos e

Yuri Lima por me apoiarem nos estudos e entender os dias que fiquei ausente estudando.

A Deus por ter me dado a oportunidade de estudar nesta faculdade e conseguir

todas as glórias em minha vida!!!

iv

RESUMO Ao longo dos anos, o aumento da agricultura em área cultivada e produtividade foi baseada no uso de pesticidas, fertilizantes químicos e outras substâncias sintéticas. Os pesticidas são utilizados para controlar pragas, doenças e ervas daninhas em culturas para garantir a produtividade e qualidade do produto. Devido à toxicidade e persistência dos pesticidas, existe uma meta mundial para desenvolver meios mais eficientes de remover os resíduos destes presentes no meio ambiente. Uma forma de degradação dos pesticidas no meio ambiente é a biodegradação. Um modo para localizar e descobrir o potencial de microorganismos que degradam pesticidas é a bioprospecção. A bioprospecção representa uma estratégia importante para a obtenção de microrganismos para a biorremediação de áreas contaminadas. Neste estudo, foi utilizado o herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) como um modelo para a bioprospecção de microrganismos capazes de degradar este pesticida. O objetivo deste estudo foi a bioprospecção de bactérias degradadoras do herbicida 2,4-D em solo aderido a hortaliças comercializadas no Rio de Janeiro - RJ. Amostras de solo utilizadas foram coletadas a partir de solo aderido à mandioca, alface, couve e chicória. A biopprospecção foi realizada utilizando meio MEMB. 247 isolados foram obtidos. Os resultados corroboram com os resultados de estudos preliminares que mostraram que bactérias com esta capacidade estão presentes em locais sem histórico de aplicação de pesticidas.

Palavras-Chave: ácido 2,4-diclorofenoxiacético, biodegradação, hortaliças.

v

ABSTRACT Over the years, agriculture increase in crop area and productivity was based in the pesticides, chemical fertilizers and other synthetic substances applied. Pesticides are used to control pests, diseases and weeds in crops to ensure productivity and product quality. Due to the toxicity and persistence of pesticides, there is a world goal to develop efficient ways of removing their waste from the environment. One way of degradation of pesticides in the environment is the biodegradation. One manner to locate and discover the potential of pesticide degrading microorganisms is the bioprospection. The bioprospection represents an important strategy in order to obtain microrganisms for the bioremediation of contaminated areas. In this study, was used herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) as a model for bioprospection of microorganisms capable of degrading this pesticide. The aim of this study was the bioprospection of degrading bacteria for 2,4-D herbicide in soil adhering to vegetables sold in Rio de Janeiro - RJ. Soil samples used were colected from soil adhered to cassava, lettuce, kale and chicory. The biopprospection was performed employing MEMB medium. 247 isolates were obtained. Our results corroborate with the results of preliminary experiments that showed that pesticide degrading bacteria are present in places without historical of pesticides application. Keywords: acid 2,4-dichlorophenoxyacetic, biodegradation, vegetables.

vi

SUMÁRIO

RESUMO ............................................................................................................................. iv ABSTRACT .......................................................................................................................... v

LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................... vii LISTA DE TABELA .......................................................................................................... vii LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................................ viii 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1

1.1. CONSUMO DE HORTALIÇAS ............................................................................ 2

1.1.1 IMPORTÂNCIA DAS HORTALIÇAS NA SAÚDE ................................... 2 1.1.2. IMPORTÂNCIA FINANCEIRA DAS HORTALIÇAS NO BRASIL ......... 4

1.2. IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NA SAÚDE PÚBLICA .......................... 5 1.3. IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NO MEIO AMBIENTE ......................... 7 1.4. HERBICIDA ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO (2,4-D) ....................... 8

1.4.1 HISTÓRICO DO USO DO HERBICIDA 2,4-D ................................................. 8

1.4.2. CARACTERÍSTICAS DO HERBICIDA 2,4-D ................................................. 9

1.5. BIODEGRADAÇÃO DE PESTICIDAS .............................................................. 10

1.5.1. MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PESTICIDAS ................. 11 1.6. BIOPROSPECÇÃO .............................................................................................. 12 1.7. BIORREMEDIAÇÃO DE PESTICIDAS ............................................................ 12

1.8. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 13 1.9. OBJETIVOS ......................................................................................................... 13

1.9.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................... 13

1.9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 13

2. METODOLOGIA ........................................................................................................... 15 2.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBICIDA 2,4-D 15

2.2. COLORAÇÃO DE GRAM ...................................................................................... 16 2.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNICA FONTE DE CARBONO ..................................................................................................................... 17

3. RESULTADOS ............................................................................................................... 18 3.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBICIDA 2,4-D 18

3.2. COLORAÇÃO DE GRAM ...................................................................................... 19 3.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNICA FONTE DE CARBONO ..................................................................................................................... 20

4. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 21 5. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 23 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 24 ANEXO I ............................................................................................................................. 31

Meios de cultura .............................................................................................................. 31

vii

LISTA DE FIGURAS Figura 1.1. Distribuição percentual dos ingredientes ...................................................... 8 ativos de pesticidas, por classes de uso - Brasil – 2005 (IBGE, 2010).

Figura 1.2. Estrutura química do 2,4-D (Ellis et al., .................................................. 10

2006).

Figura 2.1. Metodologia para isolamento de bactérias .................................................. 15 degradadoras do 2,4-D (modificado de Direito, 2009).

Figura 3.1. Fotos das placas após 15 dias de incubação .................................................19 Em meio MEMB.

LISTA DE TABELA

Tabela 1.1. Aquisição domiciliar de hortaliças e distribuição por ................................ 4 região geográfica, 2002-2003 (IBGE, 2012).

Tabela 1.2. Comercialização de pesticidas (em toneladas) para ................................ 5 as principais hortaliças entre os anos de 2004 a 2008 no Brasil (Almeida et al., 2009).

Tabela 1.3. Uso de equipamentos de proteção individual por ................................... 6 trabalhadores que são expostos aos pesticidas (Faria et al., 2004). Tabela 3.1. A tabela apresentada UFC.mL-1 em 24 e 48 horas ................................... 18 em função dos tipos de amostras. Tabela 3.2. A tabela apresenta a quantidade de isolados obtidos .....................................19 pela bioprospecção. Tabela 3.3. Classificação dos isolados oriundos dos solos aderidos...................................20 a cultura de chicória em gram positivos ou em gram negativos.

viii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

% Porcentagem

°C Grau Celsius

µL Microlitro

2,4,5-T Ácido triclorofenoxiacético

2,4-D Ácido 2,4 Diclorofenoxiacetico

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

DNA Ácido desoxirribonucleico

EPA Environmental Protection Agency

EPI Equipamento de Proteção Individual

g Gramas

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

LB Meio de cultura Luria Broth

MEMB Meio de cultura diferencial descrito por CHONG (2005)

mL Mililitro

pH Potencial Hidrogeniônico

pka Constante de acidez

rpm Rotações por minuto

UEZO Centro Universitário Estadual da Zona Oeste

UFC Unidade formadora de colônia

USEPA Agência de Proteção Ambiental Americana

1

1. INTRODUÇÃO

Ao longo dos anos, a agricultura mundial cresceu em área cultivada e produtividade

acompanhada pelo uso intenso de pesticidas, adubos químicos e outras substâncias

sintéticas (Armas e Monteiro, 2005). O benefício mais comum associado à utilização

dessas substâncias químicas seria o aumento na produtividade da lavoura, ou seja, uma

maior produção agrícola obtida para uma determinada área plantada (Veiga, 2007). O

aumento na produtividade seria capaz de reduzir a demanda por recursos naturais (terra e

água) e por alguns recursos tecnológicos (mecanização) para a produção de uma mesma

quantidade de produtos agrícolas a ser ofertada (Veiga, 2007).

Utilizam-se pesticidas para controle de pragas, doenças e plantas daninhas em

plantações para assegurar a produtividade e a qualidade dos produtos (Vieira e Prado,

1998). As pragas causam vários danos mecânicos nas plantas, o que além de prejudicar a

produção vegetal, favorece o surgimento de doenças, principalmente fúngicas (Ghini e

Bettiol, 2000). As doenças infectam os vegetais causando doenças vasculares, foliculares,

seca das ramas, podridão das raízes, nematóides e morte prematura (Junqueira et al., 2000).

As plantas daninhas têm efeitos negativos na produção, uma vez que competem com a

cultura por espaço, água, luz e, principalmente, nutrientes; além de serem muitas vezes

hospedeiras de pragas e doenças (Vieira e Prado, 1998).

Dependendo da sua atuação, os pesticidas se apresentam em diversas classes como

herbicidas, acaricidas, fungicidas, larvicidas, algicidas e inseticidas (Coutinho et al., 2005).

Os herbicidas constituem uma importante classe de pesticidas usados no controle de

plantas daninhas (Amarante Júnior, 2002). A aplicação dos herbicidas tem aumentado nos

países desenvolvidos durante as últimas décadas (Guedes, 2010). Dentre os países

consumidores de pesticida, o Brasil foi o oitavo maior consumidor mundial destes em 2006

(Galli, 2006; apud Rodrigues e Andrietta, 2010). No mercado mundial dos pesticidas, os

herbicidas merecem destaque por representarem 47% do total comercializado, sendo

seguidos pelos inseticidas que representam 25% do mercado mundial de pesticidas

(Guedes, 2010).

O uso indiscriminado de pesticidas e sem conhecimento dos efeitos secundários

destes pelos agricultores acarretou danos ao meio ambiente e, logo, a qualidade de vida do

homem ficou comprometida (Vieira e Prado, 1998). Sem as devidas precauções e cuidados

em relação a manipulação, produção, estocagem e destino final dos pesticidas, não só o

2

meio ambiente corre risco, mas também a saúde das pessoas que de alguma forma entram

em contato com tais produtos (Dams, 2006). A utilização destes agentes químicos gerou a

contaminação de grãos, frutas, legumes, hortaliças e verduras, trazendo inúmeros

malefícios ao meio ambiente, produtores rurais e aos consumidores (Ciscato, 2011).

Embora a aplicação de pesticidas em monocultivos realizados em grande escala seja uma

prática difícil de ser abolida em função da dificuldade de práticas rápidas e eficientes de

controle de pragas, doenças e plantas daninhas, existe uma busca por tecnologias

alternativas que gerem menor impacto ao meio ambiente. Segundo Rodrigues e Andrietta

(2010), também há uma preocupação geral em desenvolver formas eficientes de remoção

de resíduos de pesticidas do meio ambiente.

Uma dificuldade para o desenvolvimento de uma forma eficiente de remoção de

resíduos de pesticidas do meio ambiente é o fato de que a persistência do pesticida no solo

dependente das características do solo, especialmente do tipo de argila, e dos fatores

climáticos tais como radiação, temperatura, umidade e oxigenação (Burns, 1975; apud

Direito, 2009). É a associação destes fatores, juntamente com as características da

molécula, que determinam o tempo de vida dos pesticidas no ambiente (Regitano e

Bonfleur, 2011).

A biorremediação vem se destacando por ser uma tecnologia que emprega

microrganismos para a remoção de poluentes no meio ambiente (Brito, 2010). Para

podermos fazer uso desta tecnologia, é preciso um estudo para o isolamento e a

identificação de microrganismos capazes de degradarem o poluente desejado, ou seja, a

bioprospecção (Santos, 2011). Neste trabalho, realizamos a bioprospecção de bactérias

degradadoras do herbicida ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) em amostras de solos

aderidos a hortaliças. Para melhor compreensão da justificativa da realização deste estudo

apresentamos maiores informações nos tópicos que se seguem.

1.1. CONSUMO DE HORTALIÇAS

1.1.1 IMPORTÂNCIA DAS HORTALIÇAS NA SAÚDE

Inúmeros estudos realizados nas últimas décadas têm demonstrado o importante

papel da alimentação causando ou prevenindo doenças (Figueiredo, 2008). A população

3

brasileira tem, ultimamente, mudado seus hábitos alimentares para pior (Monteiro et al.,

2000). O consumo de doces, refrigerantes e massas tem aumentado bastante, enquanto o

consumo de arroz, feijão, frutas e verduras vêm diminuindo muito (Monteiro et al., 2000).

Por esta razão, Monteiro et al. (2000) colocam que a qualidade da alimentação do

brasileiro está se tornando inadequada.

Nas últimas décadas, condições favoráveis à ocorrência de deficiências nutricionais

têm sido gradativamente substituídas por epidemia de obesidade e doenças crônicas

relacionadas ao consumo excessivo e desequilibrado de alimentos (Valla, 2000). Segundo

Claro et al. (2007), o padrão dietético associado à obesidade e a outras doenças crônicas é

caracterizado essencialmente pelo consumo insuficiente de frutas, legumes, verduras e pelo

consumo excessivo de alimentos de alta densidade energética e ricos em gorduras,

açúcares e sal.

O consumo insuficiente de hortaliças e frutas é um fator de risco relacionado à

causa de doenças crônicas não transmissíveis para a população (Melo, 2009). Esses

alimentos são importantes para uma dieta saudável, pois são fontes de micronutrientes,

fibras e de outros componentes com propriedades funcionais (Jaime et al., 2007). As frutas

e hortaliças têm baixa densidade energética, o que favorece a manutenção saudável do peso

corporal (Melo, 2009). Segundo Ornellas (2001) é de grande importância a inclusão de

hortaliças variadas na dieta por causa do seu efeito alcalinizante sistêmico, além de

favorecerem o preenchimento das quotas vitamínicas, minerais e aumentarem o resíduo

alimentar no trato digestivo. Comer uma variedade de hortaliças garante, seguramente,

uma adequada ingestão da maior parte dos micronutrientes, fibras e uma gama de fatores

nutricionalmente essenciais (Gomes, 2007). Além disso, o aumento do consumo de

hortaliças pode ajudar a substituir alimentos que possuem altas concentrações de gorduras

saturadas e sal (Gomes, 2007). As hortaliças, além de fornecerem componentes

importantes para desempenharem funções básicas do organismo como, por exemplo, ácido

ascórbico, betacaroteno e ácido fólico, são fontes de compostos bioativos diretamente

associados à prevenção de doenças (Faller e Fialho, 2009).

4

1.1.2. IMPORTÂNCIA FINANCEIRA DAS HORTALIÇAS NO BRASIL

A globalização da economia tem causado alterações em todos os elos da cadeia

produtiva brasileira de hortaliças (Melo e Vilela, 2007). Entre 1990 e 2006 no Brasil, a

área de produção de hortaliças cresceu 5%, enquanto a produção cresceu 63% em função

do aumento da produtividade de 54% (Melo e Vilela, 2007). Em 2003, o consumo de

hortaliças nas regiões Sudeste e Sul, em média, foi aproximadamente 60% superior à

média das regiões Norte, Nordeste e Centro-oeste (Tabela 1.1) (Melo e Vilela, 2007). Em

2005, a produção total de hortaliças foi de 17.385,9 mil toneladas, ocupando uma área

cultivada de 785,2 mil hectares (Melo e Vilela, 2007). O valor total da produção de 2005

foi estimado em R$ 11.482,42 milhões (IBGE, 2005).

Tabela 1.1. Aquisição domiciliar de hortaliças e distribuição por região geográfica, 2002-2003 (IBGE, 2012).

A produção de hortaliças é apresentada em grupos sendo o primeiro composto por

raízes, bulbos e tubérculos que correspondem a 40% da produção, o segundo composto por

“hortaliças frutos” (legumes) que correspondem a 37% da produção, o terceiro composto

por hortaliças folhosas que compreendem a 16% da produção, o quarto composto por

melancia, melão e morango que correspondem a 7,5% da produção, e o quinto composto

por outras hortaliças e condimentares que correspondem a 6,2% da produção (IBGE,

2005). Muito desta produção foi assegurada pelo uso de pesticidas no controle de pragas,

doenças e plantas daninhas (Tabela 1.2). O consumo de pesticida no grupo das hortaliças

aumentou em 8% entre os anos de 2004 a 2008 (Tabela 1.2).

5

Tabela 1.2. Comercialização de pesticidas (em toneladas) para as principais hortaliças entre os anos de 2004 a 2008 no Brasil (Almeida et al., 2009).

Ano 2004 2005 2006 2007 2008 Total de pesticidas

aplicados (t) 463.604 485.969 480.120 599.834 673.892

Hortaliças Alho 123 169 113 144 148

Batata Inglesa 8.259 8.146 8.436 8.151 8.414 Cebola 611 655 632 586 755

Horticultura 4.318 4.399 632 7.031 4.455 Melão 264 332 298 264 296

Tomate Rasteiro (indústria) 1.385 1.657 1.589 1.805 1.720 Tomate Envarado (mesa) 3.800 4.146 3.158 3.322 4.519

Total 18.760 19.504 17.813 21.303 20.307

Se a ingestão de hortaliças é um habito saudável e recomendado, com o emprego de

pesticidas os cuidados devem ser redobrados a estes alimentos comumente ingeridos crus.

Ao mesmo tempo, o uso de pesticidas nos desperta o interesse em verificar a presença de

organismos capazes de degradarem estes pesticidas aderidos ao solo destas hortaliças.

Neste trabalho, utilizamos amostras de solo aderidos as hortaliças chicória, alface lisa,

alface crespa, couve e aipim, comercializados regularmente no Rio de Janeiro, com a

finalidade de encontrar microrganismos degradadores de pesticida.

1.2. IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NA SAÚDE PÚBLICA

A exposição ocupacional aos pesticidas tem um forte impacto na saúde pública

(Dams, 2006). Keifer e Mahurin (1997) observaram que as consequências neurotóxicas de

uma exposição aguda de alto nível estão associadas a uma série de sintomas e defeitos na

conduta neurológica e anormalidades na função nervosa. Os sintomas neurológicos menos

severos incluem dor de cabeça, tontura, náusea, vômito e excessivo suor (Dams, 2006). Já

os mais perigosos são o desenvolvimento de fraqueza muscular e bronquiespasmos,

podendo progredir para convulsões e coma (Dams, 2006). Entre algumas das

manifestações de intoxicação por pesticidas observadas em trabalhadores rurais estão a

diminuição das defesas imunológicas, anemia, impotência sexual masculina, cefaléia,

insônia, alterações da pressão arterial, alterações do humor e distúrbios do comportamento,

como surtos psicóticos (Lundberg et al., 1997).

6

A carência na assistência técnica ao homem do campo, a dificuldade do

cumprimento das leis e os próprios trabalhadores que se opõem ou não têm conhecimento

quanto ao uso dos equipamentos de segurança pessoal (Equipamento de Proteção

Individual – EPI) agravam a situação de contaminação tanto humana como ambiental

(Oliveira et al., 2000). A tabela 1.3 mostra o uso de equipamentos de proteção individual

por trabalhadores que são expostos aos pesticidas nas atividades agrícolas (Faria et al.,

2004). Segundo Faria et al. (2004), mais de 35,0% dos trabalhadores admitiram nunca usar

luvas, máscaras ou roupas de proteção. O uso de EPI foi mais frequente nos homens e nas

pessoas com escolaridade média de 5 a 8 anos, enquanto as mulheres e o grupo sem

escolaridade era o que menos usava estes equipamentos (Faria et al., 2004). O acesso a

orientações técnicas para práticas agrícolas mostrou-se relacionado a maior uso de EPI

específico para proteção química (Faria et al., 2004). Os trabalhadores rurais que usavam

mais EPI trabalhavam nos estabelecimentos com maior renda bruta de produção, maior

nível de mecanização e tinham jornada de trabalho agrícola mais extensa (Faria et al.,

2004).

Tabela 1.3. Uso de equipamentos de proteção individual por trabalhadores que são expostos aos pesticidas (Faria et al., 2004).

Entrevistados Equipamento de Proteção Individual (EPI)

Características Total Luvas (%) Máscaras (%)

Roupas de proteção (%)

Sexo Masculino Feminino

706 399

62,8 45,2

60,0 37,2

67,8 55,6

Idade em anos 15-19 20-29 30-39 40-49 50-59 60 ou mais

88 179 284 256 182 116

63,2 56,8 61,3 56,2 53,3 45,2

46,0 54,0 62,8 49,8 41,7 47,0

66,7 63,1 70,6 61,4 52,2 66,1

Aplica agrotóxico Não Até 2 dias por mês 3 ou mais dias por mês

449 518 493

33,5 53,1 66,7

22,3 49,8 63,7

34,7 63,6 70,6

Onde trabalha com agrotóxico Uma propriedade Mais de uma propriedade

1.141

81

54,7 65,4

50,2 63,0

62,0 63,0

Escolaridade em anos Sem escolaridade 1-4 5-8 Mais de 8

46 465 503 91

32,6 55,5 60,8 52,2

32,6 52,4 54,9 42,2

56,5 60,7 67,7 58,9

Orientação técnica Não Até 1 vez por ano Mais de 1 vez por ano

297 205 586

32,0 58,5 68,4

26,3 56,6 63,3

46,8 66,8 70,8

7

Além da contaminação ocupacional de produtores agrícolas, é possível que os

alimentos comercializados nas cidades apresentem resíduos de pesticidas (Dams, 2006).

Estudos têm demonstrado a presença de resíduos de vários produtos como inseticidas

organoclorados e fungicidas organofosforados em sucos de fruta e vinhos (Tadeo et al.,

2004). A contaminação dos alimentos pode vir de uma aplicação direta em uma das fases

da produção, do transporte ou do armazenamento, devido a uma possível manipulação

errada dos trabalhadores, ao uso excessivo dos pesticidas (Tadeo et al., 2004) ou da

comercialização de produtos sem respeitar o período de carência da aplicação de

pesticidas. Desta maneira, tanto produtores quanto consumidores podem se contaminar

diretamente pelo contato com pesticidas. Também a ingestão pelo ser humano de animais

contaminados através da biomagnificação (acúmulo do pesticida ao longo da cadeia

alimentícia) ou o contato com o meio ambiente contaminado podem gerar intoxicações. Os

riscos do uso de pesticidas não se limitam ao homem do campo ou ao consumidor, pois os

resíduos das aplicações atingem os mananciais e o solo (Dams, 2006).

1.3. IMPACTO DO USO DE PESTICIDAS NO MEIO AMBIENTE

Ao utilizar produtos sintéticos, como os pesticidas, o homem tem contaminado o

ecossistema em decorrência da fácil dispersão desses produtos e de sua longa permanência

no meio ambiente (Moreira, 2004). Outra forma que pode ocasionar o aumento da área de

contaminação por pesticida no ambiente é através da contaminação indireta, que pode

ocorrer em decorrência de fortes chuvas e erosão nos solos tratados que desencadeiam a

movimentação dos pesticidas para outras áreas que não as de sua aplicação (Yang et al.,

2006). Os pesticidas podem ser volatilizados e dispersos pelo vento ou lixiviados, sendo

assim transportados através da atmosfera e do solo (Gonzalez et al., 2005).

Os pesticidas no meio ambiente também podem ser degradados. Uma das formas de

conseguir degradar o pesticida no meio ambiente é transformando-o (Damin, 2005). A

transformação de pesticida pode ser abiótica ou biótica (Bollag e Liu, 1990). A

transformação abiótica ocorre quando o pesticida é transformado pela ação de

componentes físicos ou químicos do ambiente (Damin, 2005). A elevação do pH do solo,

por exemplo, pode contribuir com a hidroxilação destas moléculas, sendo este um dos

principais processos envolvidos na degradação de pesticidas devido ao aumento de sua

8

polaridade (Bollag e Liu, 1990). Já a transformação biótica ou biodegradação ocorre pela

ação do metabolismo de microrganismos (Damin, 2005) (Veja item 1.5. Biodegradação de

pesticidas).

1.4. HERBICIDA ÁCIDO 2,4-DICLOROFENOXIACÉTICO (2,4-D)

Dentre os inúmeros herbicidas existentes, o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

é o segundo herbicida mais utilizado no Brasil, ficando atrás apenas do glifosato (IBGE,

2010) (Figura 1.1). Ele é o ingrediente ativo de várias formulações de herbicidas que têm

sido amplamente aplicados para controlar plantas daninhas eudicotiledôneas em culturas

de milho, trigo, aveia, cevada e cana de açúcar (Guedes, 2010). O 2,4-D também é

empregado para controlar plantas daninhas em acostamentos de estradas e sob linhas de

transmissão elétrica (Vieira e Prado, 1998). Por ser uma auxina sintética, o 2,4-D é

utilizado em laboratórios para indução de calos e age como regulador de crescimento em

cultura de tecidos, tendo um efeito de supressão da morfogênese (Guerra e Nodari, 2006).

Figura 1.1. Distribuição percentual dos ingredientes ativos de pesticidas por classes de uso - Brasil – 2005 (IBGE, 2010). 1.4.1 HISTÓRICO DO USO DO HERBICIDA 2,4-D

A utilização do 2,4-D em larga escala não é recente. Este composto foi

desenvolvido durante a Segunda Guerra Mundial (1939-1945) por uma equipe britânica

com o objetivo de aumentar a produção agrícola durante a guerra (Federation of American

9

Scientists, 2006). O composto também foi posteriormente utilizado na Guerra do Vietnã

(1954-1975), juntamente com o herbicida 2,4,5-T (ácido triclorofenoxiacético), para a

produção do agente laranja (Frumkin, 2003). Este composto foi utilizado como desfolhante

das florestas Vietnamitas na operação conhecida como “Ranch Hand” (1962-1971), onde

cerca de 68.000 m3 de 2,4-D foram aplicados por aviões e helicópteros americanos nas

áreas rurais (Federation of American Scientists, 2006). Segundo a Environmental

Protection Agency (EPA), os efeitos na saúde dos soldados americanos que participaram

da Guerra do Vietnã, incluindo alguns tipos de carcinoma, são resultado do contato direto

com o 2,4-D (Federation of American Scientists, 2006). Em 1946, quando foi

comercialmente lançado, o 2,4-D tornou-se o primeiro herbicida seletivo bem sucedido,

permitindo o controle de plantas daninhas em plantações como milho, trigo, arroz e cevada

(Guedes, 2010). Logo foi transformando-se rapidamente no herbicida mais extensamente

usado em todo o mundo (Amarante Júnior, 2002).

1.4.2. CARACTERÍSTICAS DO HERBICIDA 2,4-D

O 2,4-D é um herbicida seletivo, sistêmico e pós-emergente (Amarante Júnior,

2002). Uma vez absorvido pela planta, acumula-se nas raízes e age promovendo o

crescimento desordenado das células e, consequentemente, impedindo o transporte de água

e nutrientes através da planta (Amarante Júnior, 2002). O 2,4-D é classificado pela

Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), pela Organização Mundial de Saúde

(World Health Organization - WHO) e pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados

Unidos (United States -Environmental Protection Agency/ US-EPA) como um herbicida

hormonal de toxicidade II (Amarante Júnior et al., 2003), por ser um agente carcinogênico

que afeta o coração, o fígado e o sistema nervoso central levando a convulsões (Silva e

Stets, 2006). Devido a estas características e por ser usado como fonte de carbono e

energia por bactérias presentes no solo, o herbicida 2,4-D é amplamente estudado e usado

como modelo para a compreensão dos mecanismos de degradação de compostos

cloroaromáticos (Bradley et al., 1996).

O 2,4-D tem a fórmula molecular C8H6Cl2O3 (Massa Molar = 221,0g.mol-1)

(Amarante Júnior, 2002) (Figura 1.2). Em condições ambientais, o 2,4-D apresenta-se

como sólidos cristalinos (Amarante Júnior, 2002). Este herbicida é um ácido orgânico com

10

pKa 2,6 e pouca solubilidade em água (Silva e Stets, 2006). Já na sua forma comercial

pode ser encontrado na forma de sais, amina e éster (Amarante Júnior et al., 2003). Nestas

condições, o 2,4-D é solúvel em água e pode ser facilmente pulverizado nas plantações.

Figura 1.2. Estrutura química do 2,4-D (Ellis et al., 2006).

Por todas as razões antes apresentadas, o herbicida 2,4-D foi utilizado como

modelo neste trabalho para a bioprospecção de microrganismos biodegradadores de

pesticidas. O uso indiscriminado e pouco criterioso de pesticidas trouxe e continua

trazendo problemas muitos sérios para o ambiente e para a saúde humana (Silva e Stets,

2006). Portanto, o desenvolvimento de um processo de degradação eficiente para

pesticidas é extremamente relevante e necessário (Silva e Stets, 2006).

1.5. BIODEGRADAÇÃO DE PESTICIDAS

Biodegradação é a decomposição de uma determinada molécula em componentes

mais simples, realizada por organismos vivos como: bactérias, fungos, plantas, animais e

etc (Lima et al., 2001). A degradação microbiana é realizada por bactérias, fungos e outros

microrganismos que utilizam o pesticida como fonte de carbono (Cerniglia, 1984).

Devemos lembrar que a degradação microbiana não depende somente da presença dos

microrganismos com as enzimas degradadoras apropriadas, mas também de uma série de

condições ambientais (He e Tang, 2005). A degradação microbiana geralmente ocorre no

solo, sendo sensíveis as condições de umidade, temperatura, aeração, pH, densidade das

raízes, fertilização e quantidade de matéria orgânica que geralmente afetam o grau da

degradação em virtude da direta influência desses fatores sobre o crescimento dos

microrganismos e a atividade microbiana (Hinsinger et al., 2003).

11

Os microrganismos do solo têm uma função importante na atenuação dos efeitos

ambientais dos compostos orgânicos, uma vez que podem adaptar-se à presença desses

compostos potencialmente tóxicos e sobreviver por meio de sua degradação, ou seja,

utilizar essas moléculas como fonte de carbono e energia (Silva et al., 2002).

1.5.1. MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PESTICIDAS

Os microrganismos degradadores de pesticidas são encontrados no mundo

microbiano tendo muitos tipos fisiológicos: aeróbios, anaeróbios (fermentativos,

metanogênicos, redutores de enxofre), quimiolitotróficos e organismos fotossintéticos

(Fogel et al., 2001). Os resíduos de pesticidas podem ser mineralizados por um simples

microrganismo ou por conjuntos de microrganismos (Fogel et al., 2001). A biodegradação

de um complexo de moléculas normalmente envolve o efeito interativo das comunidades

mistas de microrganismos e conta com a versatilidade metabólica das bactérias e fungos

(Cavalcanti, 1997). Uma forma muito utilizada de localizar e descobrir o potencial desses

microrganismos degradadores de pesticidas é utilizando a bioprospecção (Wilson, 1997).

Foi empregando a bioprospecção que Direito (2009) identificou isolados

pertencentes aos gêneros Bacillus, Paenibacillus, Rhodococcus, Nocardia, Arthrobacter,

Brevibacterium, Streptomyces, Brachybacterium, Microbacterium, Ochrobactrum,

Brevundimonas, Pseudomonas, Achromobacter e Tetrathiobacter capazes de crescerem na

presença do herbicida 2,4-D como única fonte de carbono. A autora também pôde observar

que a distribuição destes microrganismos era independente do sistema de cultivo agrícola

ter tido ou não contado com o 2,4-D ou qualquer outro tipo de pesticida.

Existem vários estudos quanto à distribuição dos microrganismos nos mais

diferentes ambientes (Madigan et al., 2004). Quando se pensa em solo, especialmente em

sistemas agrícolas, a comparação é feita entre rizosfera (solo sob influência radicular) e

bulk (solo sem influência radicular) (Direito, 2005). A rizosfera apresenta maior

abundância das populações bacterianas nas proximidades das raízes do que a observada em

bulk (Smalla et al., 2001). Por outro lado, a diversidade filogenética diminui com a

proximidade das raízes (Marilley e Aragno, 1999).

A partir dos relatos dos estudos acima citados, escolhemos as amostras de chicória,

alface lisa, alface crespa, couve e aipim, devido sua proximidade ao solo e,

consequentemente, maior proximidade com as bactérias da rizosfera. Sendo assim,

12

consideramos que nosso objetivo de encontrar bactérias degradadoras do herbicida 2,4-D

poderia ser mais facilmente atingido.

1.6. BIOPROSPECÇÃO

A bioprospecção não é uma atividade nova na história humana (Trigueiro, 2009).

Desde seus primórdios, a humanidade experimenta os recursos biológicos disponíveis na

natureza e procura obter, a partir destes recursos, por exemplo, novos objetos e utensílios

para sua vida diária (Trigueiro, 2009). É o caso da utilização da pele dos animais para o

vestuário, do uso de ervas para o tratamento de doenças e das tinturas de determinadas

plantas para a pintura do corpo e para as artes (Trigueiro, 2009).

A bioprospecção pode ser definida como: “o método ou forma de localizar, avaliar

e explorar sistemática e legalmente a diversidade de vida existente em determinado local”

(Santos, 2011). Ela tem como principal finalidade a busca de recursos genéticos e

bioquímicos para fins comerciais (Santos, 2011). Podemos destacar como vantagens da

bioprospecção propiciar conhecimento da biodiversidade e seu potencial biotecnológico

(Wilson, 1997) e fornecer substâncias importantes ao homem, através das atividades

bioquímicas (Wilson, 1997). Assim, a bioprospecção de organismos selecionados

naturalmente representa uma estratégia importante, a fim de obter agentes para a

biorremediação de áreas contaminadas e por ser uma técnica de baixo custo (Martins,

2010).

1.7. BIORREMEDIAÇÃO DE PESTICIDAS

A partir dos microrganismos selecionados pela bioprospecção, podemos

biorremediar áreas contaminadas (Brito, 2010). A biorremediação é uma ferramenta

importante na biotecnologia, pois propicia um aumento na biodegradação já existente no

solo, provocando um aumento da atividade microbiana degradadora já existente (Brito,

2010). É considerado um método natural e relativamente simples, menos agressivo e mais

adequado para a manutenção do equilíbrio ecológico, além do baixo custo quando

comparados às alternativas físicas e físico-químicas (Brito, 2010).

Biorremediação é um processo biológico definido, segundo a Agência de Proteção

Ambiental Americana (USEPA, 1990), como o “processo de tratamento que utiliza

13

naturalmente microrganismos para degradar substâncias toxicamente perigosas

transformando-as em substâncias menos ou não tóxicas”. A biorremediação pode ser

realizada por métodos in situ, onde o tratamento do ambiente contaminado é feito no

próprio local, ou por métodos ex situ, onde consistem em escavar o solo contaminado ou

extrair a água subterrânea por bomba para então poder aplicar o tratamento em outro local

(Jacques, 2007). Neste trabalho, buscamos a biprospecção de bactérias degradadoras do

2,4-D para futura aplicação em biorremediação.

1.8. JUSTIFICATIVA

Para conter o avanço da contaminação do meio ambiente por pesticidas, uma

estratégia de bioprospecção de microrganismos degradadores de pesticidas usando como

modelo o herbicida 2,4-D foi traçada neste estudo. Visando conter esta contaminação,

escolhemos vegetais cultivados no Brasil para que os microrganismos neles presentes

possam ser, no futuro, utilizados em plantações para biorremediação de áreas

contaminadas pelo 2,4-D. Assim, estes microrganismos estariam adaptados ao clima e

outros fatores ambientais da região, minimizando a possibilidade de desequilíbrio

ecológico nas plantações onde esses microrganismos futuramente possam ser utilizados.

1.9. OBJETIVOS

1.9.1. OBJETIVO GERAL

O objetivo deste trabalho foi realizar a bioprospecção de bactérias degradadores do

herbicida 2,4-D em solos aderidos a hortaliças comercializadas no Rio de Janeiro - RJ.

1.9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Isolar bactérias capazes de crescerem na presença do herbicida 2,4-D em

amostras de solo aderidas a chicória, alface lisa, alface crespa, couve e

aipim usando meio diferencial.

14

• Identificar bactérias capazes de crescerem na presença do herbicida 2,4-D

como única fonte de carbono empregando meio mineral.

15

2. METODOLOGIA

2.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBIC IDA 2,4-D

Foram coletadas amostras de solo aderido ao aipim, chicória, alface lisa, alface

crespa e couve. Foi pesado 0,5 g do solo aderido a cada cultura e diluído a 10-1 em solução

salina. O material foi incubado a 150 rpm, por 50 minutos a 30°C. Foi preparada diluição

seriada em solução salina (NaCl 0,85%) de 10-2 a 10-7. De cada diluição de amostra foram

plaqueados 200 µL em cada placa de petri contendo meio diferencial MEMB (Chong,

2005) (Anexo I). O plaqueamento foi realizado a partir da diluição 10-2, em triplicata. Após

o plaqueamento as placas foram incubadas a 30°C (Figura 2.1). Foi realizada a

determinação de UFC.mL-1 (unidade formadora de colônia por mililitro) após 24 e 48h de

incubação das placas, os cálculos de UFC foram realizados em todas as placas que

apresentaram o número mínimo de 50 e máximo de 250 colônias. O isolamento foi

realizado através da seleção por visualização morfológica das colônias, sendo isoladas

colônias de todas as cores a exceção das azuis (colônias sem capacidade de degradação do

2,4-D pré-identificadas através do uso do meio diferencial) utilizando meio LB enriquecido

com 2,4-D a 500 mg.L-1. A técnica para obtenção de culturas puras foi a do esgotamento.

Figura 2.1. Metodologia para isolamento de bactérias degradadoras do 2,4-D (modificado de Direito, 2009).

16

Os isolados obtidos foram conservados em estoque com glicerol 30%. Para fazer o

estoque destas bactérias foi realizado o cultivo em meio LB líquido enriquecido com 2,4-D

a 30ºC. Após 48 horas de incubação, cada tubo de ensaio foi homogeneizado e, em

seguida, concentrado em microtubo de 2 mL por centrifugação a 10.000 rpm por 10

minutos. O sobrenadante foi descartado e a operação repetida. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado ressuspendido em 0,5 mL de meio LB líquido enriquecido com

2,4-D e 0,5 ml de glicerol 30%. Após este processo os isolados foram congelados.

Dentre os cinco lotes de amostras, foi selecionado o lote de isolados oriundos da

cultura da chicória para realização da coloração de gram e a verificação da capacidade de

crescimento dos isolados em meio mineral contendo 2,4-D como a única fonte de carbono.

2.2. COLORAÇÃO DE GRAM A primeira etapa da coloração de gram foi realizar a fixação dos isolados. A fixação

ocorreu da seguinte maneira: Uma quantidade mínima de amostra da colônia bacteriana de

uma placa de petri com meio MEMB foi coletada com o auxílio da alça de platina e

colocada sobre uma lâmina. Foi adicionado uma gota de água milli-Q estéril sobre o

material que, em seguida, foi espalhado sobre a lâmina. Em seguida, o material foi fixado

flambando a lâmina na chama da lamparina. A segunda etapa é cobrir a lâmina com a

solução de cristal violeta e deixar agir por 30 segundos a 1 minuto. Após este tempo o

excesso do corante é retirado deixando que o mesmo escorra da superfície da lâmina. Na

terceira etapa, ainda sem lavar a lâmina, cobre-se o material com solução de lugol e deixar

agir por 1 minuto. Em seguida, o excesso da solução é retirado deixando que o mesmo

escorra da superfície da lâmina. Na quarta etapa é realizada a lavagem da lâmina com a

solução de álcool-acetona até que não desprenda mais líquido na cor rósea, ou seja, até que

o descorante (álcool-cetona) se torne imediatamente incolor. Na quinta etapa a lâmina é

lavada com água corrente. Na sexta etapa a lâmina é coberta com fucsina, deixando agir

durante 30 segundos. Na sétima etapa o corante foi retirado sendo lavado com água

corrente. A observação da lâmina se deu em microscópio óptico.

17

2.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNICA FON TE DE CARBONO

Os isolados de chicória foram repicados para tubos de ensaio com meio de cultura

mineral usando o 2,4-D como a única fonte de carbono (FÜSCHSLIN et al., 2003) (Anexo

I). Todos os isolados foram empregados em triplicata. Eles foram encubados por 21 dias a

30ºC. Após este período foi realizada a leitura dos tubos, através da visualização a olho nu,

para verificar o crescimento dos isolados através da turbidez do meio de cultura em relação

ao meio sem inoculação.

18

3. RESULTADOS

3.1. ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS DEGRADADORAS DO HERBIC IDA 2,4-D

A contagem de UFC.mL-1 com 24 e 48 horas após a incubação forneceu um

parâmetro das condições do inóculo inicial usado na bioprospecção (Tabela 3.1).

Tabela 3.1. A tabela apresentada UFC.mL-1 em 24 e 48 horas em função dos tipos de amostras.

Amostras de solo UFC.mL -1

24h 48h

Aipim 1,03x107 3,05x107

Alface lisa 6,4X105 3,25X106

Alface crespa 5,0x105 6,5x105

Chicória 3,96x105 8,03x105

Couve 1,21x105 4,66x105

Os isolados ficaram encubados por 15 dias, depois disso foi feita a seleção das

colônias em função de características morfológicas e realizados repiques para manter as

culturas puras. O principal meio utilizado neste trabalho é o MEMB que é uma variação do

meio EMB empregado na microbiologia para identificação de bactérias fermentadoras de

lactose (Loos, 1975; Direito, 2009). No MEMB, as colônias de microrganismos

degradadores de 2,4-D possuem coloração avermelhada e as não degradadoras a coloração

azulada (Direito, 2009). Como relatado por Direito (2009), além das colônias de coloração

azulada e avermelha, houve o crescimento de colônias com coloração verde e amarela

(Figura 3.1). A visualização das colônias que degradam o 2,4-D pela alteração da cor da

colônia é induzida pela acidificação do meio (Chong, 2005; Direito, 2009). Como as

colônias verdes e amarelas não são nem avermelhadas (degradadoras do 2,4-D) nem

azuladas (não degradadoras do 2,4D), estas também foram selecionadas. O total de

isolados obtidos são apresentados na tabela 3.2.

19

Figura 3.1. Fotos das placas após 15 dias de incubação em meio MEMB. As setas identificam em: A, colônias com coloração roxa; B, colônias com coloração verde (seta verde) e amarela (seta amarela); C, colônias com coloração azul (seta azul) e vermelha (seta vermelha). Tabela 3.2. A tabela apresenta a quantidade de isolados obtidos pela bioprospecção.

Amostras de solo Quantidade de isolados

Aipim 62

Alface crespa 44

Couve 39

Chicória 45

Alface lisa 57

3.2. COLORAÇÃO DE GRAM

Foi observado que os isolados do lote oriundo do isolamento de bactérias isoladas

de solo aderido a cultura da chicória registrados sob os códigos CH1; CH7; CH10; CH11;

CH12; CH13; CH17; CH18; CH19; CH20; CH21; CH22; CH23; CH24; CH25; CH26;

CH27; CH29; CH32; CH33; CH34; CH38; CH40; CH42; CH44 e CH45 são gram

positivos (Tabela 3.3). Já os de códigos CH2; CH3; CH4; CH5; CH6; CH8; CH9; CH14;

CH15; CH16; CH28; CH30; CH31; CH35; CH36; CH37; CH39; CH41 e CH43 são gram

negativos (Tabela 3.3).

A B C

20

Tabela 3.3. Classificação dos isolados oriundos dos solos aderidos a cultura de chicória em gram positivos ou em gram negativos.

Isolados obtidos nas amostras de

solo aderidas a Chicória

Gram Positivo

Gram Negativo

Isolados obtidos nas amostras de solo aderidas a Chicória

Gram Positivo

Gram Negativo

Isolados obtidos nas amostras de

solo aderidas a Chicória

Gram Positivo

Gram Negativo

CH 1 * CH 16 * CH 31 *

CH 2 * CH 17 * CH 32 *

CH 3 * CH 18 * CH 33 *#

CH 4 * CH 19 *# CH 34 *

CH 5 * CH 20 * CH 35 *

CH 6 * CH 21 * CH 36 *

CH 7 * CH 22 * CH 37 *

CH 8 * CH 23 * CH 38 *#

CH 9 * CH 24 * CH 39 *

CH 10 *# CH 25 * CH 40 *

CH 11 *# CH 26 * CH 41 *

CH 12 * CH 27 *# CH 42 *#

CH 13 * CH 28 * CH 43 *

CH 14 * CH 29 * CH 44 *

CH 15 * CH 30 * CH 45 *#

*, sinaliza o grupo do isolado; #, indica os isolados que apresentaram esporos.

3.3. TESTE EM MEIO MINERAL CONTENDO 2,4-D COMO ÚNIC A FONTE DE CARBONO

Passados os 21 dias de incubação em meio mineral contendo 2,4-D como única

fonte de carbono dos isolados oriundos das amostras de solo aderidas a cultura da chicória,

foi observado o crescimento em 38 destes. Nos outros 7 isolados não houve crescimento.

Para verificar se as amostras realmente não conseguiam sobreviver nas condições

experimentais ou se por um acaso pudesse ter ocorrido falha humana (Por exemplo: a alça

de platina poderia estar muito quente e ter matado o inoculo, não ter esperado o tempo

necessário para a alça esfriar ou na hora de repicar ter pego uma quantidade pequena do

inóculo). Com isso o experimento foi repetido para os 7 isolados que não cresceram no

primeiro experimento. Passados 21 dias apenas o isolado CH39 não cresceu. Ao final do

experimento, 44 dos 45 isolados conseguiram se desenvolver em meio mínimo usando o

2,4-D como única fonte de carbono.

21

4. DISCUSSÃO

Segundo Direito (2009), da mesma forma que os pesticidas podem ser volatilizados

e dispersos pelo vento ou lixiviados, os microrganismos podem ser distribuídos a partir de

um local para quilômetros de distância. Sendo assim, seria possível o isolamento de

bactérias degradadoras do 2,4-D em amostras de solos aderidos a hortaliças

comercializadas no Rio de Janeiro, fosse pelo contato com o herbicida no processo

produtivo ou, posteriormente, pelo transporte da molécula ou dos microrganismos pelo

meio ambiente. Poderíamos ainda atribuir este isolamento a teoria de Singer et al. (2003),

de que similaridades estruturais existentes entre compostos aromáticos oriundos do

metabolismo secundário vegetal e alguns pesticidas podem deixar aptos microrganismos à

utilizar pesticidas como fonte de carbono. Nossos resultados sinalizam que um destes

eventos tornou possível a existência de bactérias capazes de utilizarem 2,4-D como única

fonte de carbono em amostras de solos aderidos às hortaliças utilizadas neste estudo e

comercializadas no Rio de Janeiro.

Os alimentos de origem vegetal são geralmente consumidos na sua forma crua e

têm sido cada vez mais incorporados na dieta humana (Almeida, 2006). Entretanto, a busca

por uma alimentação mais saudável vem aumentando o risco de transmissão de doenças

veiculadas por estes alimentos, em função das condições as quais o produto é exposto

durante o período de produção e distribuição (Madden, 1992). O perfil microbiológico em

alimentos vegetais depende de diversos fatores que vão desde as etapas de produção

primária até o seu preparo para o consumo final (Brackett, 1992). O solo parece ser o

responsável pela maioria das contaminações, seguido da utilização de água não tratada

para irrigação e condições impróprias de lavagem e estocagem (Odumeru et al., 1997).

Estas considerações poderiam explicar a presença das bactérias aderidas às hortaliças neste

estudo, bem como a existência de resíduos de pesticidas.

No Brasil, no Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos

(PARA), foram analisadas 4.345 amostras de hortaliças no período compreendido entre

junho de 2001 e dezembro de 2004 em redes de supermercados das cidades de Belém, Belo

Horizonte, Campo Grande, Curitiba, Florianópolis, Goiânia, Palmas, Porto Alegre, Recife,

Rio de Janeiro, Rio Branco, São Paulo e Vitória. Os resultados desta pesquisa mostraram

que 931 (28%) das amostras de hortaliças apresentaram resultados em desacordo com a

legislação vigente, sendo que, dentre estas, 776 (83%) apresentaram resíduos de uso de

22

pesticida não autorizado para a cultura e 17% com concentrações acima do LMR (Limite

Máximo de Resíduo em mg.kg-1) (Lemes, 2007; apud ANVISA, 2011).

Se por um lado a distribuição dos microrganismos no meio ambiente e a existência

de resíduos de pesticidas corroboram para obtermos sucesso em nosso estudo, por outro,

também a seleção das espécies de hortaliças nos auxiliou para que obtivéssemos os

isolados. Das espécies selecionadas, uma é tubérculo e as outras são hortaliças folhosas

produzidas sobre o solo, ou seja, suas folhas ficam em contato direto com a terra. Podemos

afirmar que houve o contato de nossas amostras com o solo, porque havia resíduos de solo

nas amostras adquiridas nos pontos comerciais. Diferentemente do que seria observado

quando empregadas outras técnicas de cultivo em que a cultura não entra em contato com o

solo integralmente ou parcialmente, como por exemplo, hidroponia e plasticultura,

respectivamente.

Mesmo o 2,4-D não sendo empregado na horticultura, isso não impede que

existam microrganismos capazes de utilizá-lo como fonte de carbono. Como observado por

Direito (2009) em seu estudo, isolados capazes de utilizar 2,4-D como única fonte de

carbono foram obtidos em amostras de solos sem histórico de uso de pesticidas,

demonstrando que a distribuição destes é independente da aplicação nas plantações.

O isolamento de 247 bactérias capazes de degradar o 2,4-D abre novas

possibilidades para o desenvolvimento de recursos a serem empregados na biorremediação

deste herbicida. Neste estudo, os isolados obtidos pela bioprospecção podem ser novas

espécies bacterianas com potencial biotecnológico para degradação de 2,4-D. Contudo,

estudos para caracterizar este potencial de degradação, caracterização de toxicidade ao

homem e a identificação taxonômica são necessários para viabilizarmos o emprego destes

em biorremediação. A biodegradação de 2,4-D é uma perspectiva biotecnológica que pode

trazer benefícios para o meio ambiente.

23

5. CONCLUSÕES A realização deste trabalho permitiu isolar bactérias capazes de crescerem na

presença do herbicida 2,4-D a partir de amostras de solo aderidas a chicória, alface lisa,

alface crespa, couve e aipim usando meio diferencial MEMB.

Permitiu também identificar culturas bacterianas capazes de crescerem na presença

do herbicida 2,4-D como única fonte de carbono empregando meio mineral, sendo assim

criada uma coleção de culturas de bactérias degradadoras do herbicida 2,4-D. Esta coleção

irá auxiliar os estudos de biodegradação por bactérias e permitir o uso destes em

biorremediação.

Para a continuidade deste trabalho, sugere-se um estudo a nível molecular dos

genes envolvidos no processo de degradação. Também devemos realizar a caracterização

do potencial de degradação dos isolados para posterior aplicação em processos de

biorremediação.

24

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALMEIDA, M. T. T. Avaliação microbiológica de alfaces (Lactuca sativa) em restaurantes self-service no Município de Limeira – SP. 2006. 91p. Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Ciências. Área de concentração: Ciência e Tecnologia de Alimentos. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Piracicaba, 2006. Orientador: Cláudio Rosa Gallo.

ALMEIDA, V. E. S.; CARNEIRO, F. F.; VILELA, N. J. Agrotóxicos em hortaliças: segurança alimentar, riscos socioambientais e políticas públicas para promoção da saúde. Actas em Saúde Coletiva, vol. 4, n. 4, p. 84-99. 2009.

AMARANTE JUNIOR, O. P. Revisão das propriedades, usos e legislação do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Cad. Pesq., São Luís, v. 13, n. 1, p. 60-70, jun. 2002.

AMARANTE JUNIOR, O. P.; SANTOS, T. C. R.; NUNES, G. S. Breve revisão de métodos de determinação de resíduos do herbicida ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D). Departamento de Tecnologia Química, Universidade Federal do Maranhão. Quim. Nova, Vol. 26, No. 2, 223-229, 2003.

ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos – PARA. Relatório do PARA de 2001-2004. Disponível em <http://www.anvisa.gov.br/toxicologia/index.htm>. Acesso em 10 junho de 2011.

ARMAS, E. D.; MONTEIRO, R. T. R. Uso de agrotóxicos em cana-de-açúcar na bacia do rio corumbataí e o risco de poluição hídrica. Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo. Quim. Nova, Vol. 28, No. 6, 975-982, 2005.

BOLLAG, J. M.; LIU, S. Y. Biological transformation process of pesticides. Cheng. H.H. (Ed.). Pesticides in the soil environmente: processes, impacts and modeling. Solil Science Society of America, Vol. 2. p.169-210. dez. 1990.

BRACKETT, R. E. Shelf stability and safety of fresh produce as influenced by sanitation and desinfection. Journal of Food Protection, n.10, p.808-814, abr. 1992.

BRADLEY, S. N.; HAMMILL, T. B.; CRAWFORD, R. L. Biodegradation of agricultural chemicals. In: HURST, C. J.; KNUDSEN, G. R.; McINERNEY, M. J.; STETZENBACH, L. D.; WALTER, M. V. Manual of environmental microbiology. United States of America: ASM Press, 1996. Cap. 91. p. 815-821.

BRITO, G. C. B. A importância da bioprospecção de microrganismos em áreas contaminadas com produtos derivados do petróleo. Centro Universitário Una – UNA. Revista em Agronegócios e Meio Ambiente, v.3, n.3, p. 291-310, dez. 2010.

25

CAVALCANTI, A. P. B. Desenvolvimento sustentável e planejamento: bases teóricas e conceituais. Fortaleza: UFC – Imprensa Universitária, 1997.

CERNIGLIA, C. E. Microbial metabolismo of polycyclic aromatic hydrocarbons. Advances in Applied Microbiology, San Diego, v. 30, p. 31-71, 1984.

CISCATO, C. H. P. Pesquisa constata resíduos de herbicida em ovos. Faculdade de Medicina Veterrinária e Zootecnia (FMVZ), da Universidade de São Paulo. Revista Izunome, v. 43, p.35-37. Jul. 2011.

CHONG, N. M. Development of a tool for measuring the degradation capacity of microorganisms for a xenobiotic. Enzyme and Microbial Technology, v. 37, p. 467-471. Mai. 2005.

CLARO, R. M. et al. Renda, preço dos alimentos e participação de frutas e hortaliças na dieta. Revista de Saúde Pública. São Paulo, v.41, n.4, p.12-20. Ago. 2007.

COUTINHO, C. F. B.; TANIMOTO, S. T.; GALLI, A.; GARBELLINI, G. S.; TAKAYAMA, M.; AMARAL, R. B.; MAZO, L. H.; AVACA, L. A.; MACHADO, S. A. S. Pesticidas: Mecanismo de ação, degradação e toxidez. Revista de Ecotoxicologia e Meio Ambiente. Curitiba, v. 15, p. 65-72, dez. 2005.

DAMIN, V. Biodegradação, sorção e dessorção do herbicida 14C-Diuron em dois latossolos tratados com lodo de esgoto. 2005. 71p. Dissetação de mestrado em Agronomia, Área de concentração: Solos e Nutrição de Plantas. Universidade de São Paulo. Piracicaba, Estado de São Paulo , 2005. Orientador: Arquimedes Lavorenti.

DAMS, R. I. Pesticidas: Usos e perigos à saúde e ao meio ambiente. Revista Saúde e Ambiente / Health and Environment Journal. Universidade do Vale do Itajaí. Balneário Camboriú, SC. v. 7, n. 2. Dez. 2006.

DIREITO, I. C. N. Bioprospecção e interações de populações bacterianas degradadoras do herbicida 2,4-D em solos agrícolas. 2009. 190p. Tese de Doutorado (Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2009. Orientadores: Andrew Macrae e Leda Cristina Santana Mendonça Hagler.

DIREITO, I. C. N. Detecção de genes degradadores de compostos aromáticos em solos de rizosfera sob manejo convencional e orgânico. 2005. 90p. Dissertação de mestrado (Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal). Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2005. Orientadores: Andrew Macrae e Leda Cristina Santana Mendonça Hagler.

26

ELLIS, L. B. M.; ROE, D.; WACKETT, L. P. Biocatalysis/Biodegradation Database: The First Decade. Nucleic Acids Research, The University of Minnesota. v. 34, p. D17-D521. Jan. 2006. ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY – USEPA – U.S. Assessing UST corrective action technologies: early screenig of clean-up technologies for the saturated zone. [S. l.]: USEPA, 1990.

FALLER, A. L. K.; FIALHO E. Disponibilidade de polifenóis em frutas e hortaliças consumidas no Brasil. Departamento de Nutrição Básica e Experimental. Instituto de Nutrição Josué de Castro. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. Rev. Saúde Pública, vol.43. no.2 São Paulo Abr. 2009

FARIA, N. M. X.; FACCHINI, L. A.; FASSA, A. G.; TOMASI, E. Trabalho rural e intoxicações por agrotóxicos. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, vol.43 no.4. p. 1298-1308. Out. 2004

FEDERATION OF AMERICAN SCIENTISTS. National Programs Prior to and

During World War II . 2006. Disponível em:

<http://www.fas.org/bwc/papers/review/wwii.htm>. Acesso em: 15 mai. 2010.

FIGUEIREDO, I. C. R.; JAIME, P. C.; MONTEIRO, C. A. Fatores associados ao consumo de frutas, legumes e verdura em adultos da cidade de São Paulo. Revista de Saúde Pública, São Paulo, v.42, n.5, p.30-36, out.2008.

FOGEL, S.; LANIONE, R. L.; SEWAL, A. E. Enhanced biodegradation of methoxychlor in soil under sequential environmental conditions. Applied and Environmental Microbiology , Washington, v.44, p. 113-120, 2001.

FÜSCHSLIN, H. P.; RÜEGG, I.; VAN DER MEER, J. R.; EGLI, T. Effect of integration of a GFP reporter gene on fitness of Ralstonia eutropha during growth with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid. Environmental Microbiology , v. 5, p. 878-887, 2003.

GHINI R.; BETTIOL W. Proteção de Plantas na Africultura Sustentável. Cadernos de Ciência e Tecnologia. Brasília, 2000, v.17, p.61-70.

GOMES, F. S. Frutas, legumes e verduras: recomendações técnicas versus constructos sociais. Revista de Nutrição, Campinas, v.20, n.6, p.18-24, nov./dez. 2007.

GONZALEZ, M.; MIGLIORANZA, K. S. B.; MORENO, J. E. A.; MORENO, V. J. Evaluation of conventionally and organically produced vegetables for high lipophilic

27

organochlorine pesticide (OCP) residues. Food and Chemical Toxicology, v. 43, p. 261-269. Fev. 2005.

GUEDES, S. F. Estudo da biodegradação do ácido 2,4-diclorofenoxiacético, um herbicida selectivo amplamente utilizado na agricultura, por uma estirpe de penicillium. 210. 280p. Universidade Nova De Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Grupo de Disciplinas de Ecologia e Hidrosfera. Tese de mestrado, Monte da Caparica, 2010. Orientadora: Ana Lúcia Leitão.

GUERRA, M. P.; NODARI, R. O. Apostila de biotecnologia, 2006. Disponivel em: <http://www.lfdgv.ufsc.br/Apostila%20Biotecnologia.pdf>. Acesso em 10 de mar. 2012.

HE, Y.; XU, J.; TANG, C. W. Y. Facilitation of pentachlorophenol degradation in the rhizosphere of ryegrass (Loluim perenne L.). Soil Biol. Biochem, vol. 37. n 2. p. 017-.024. Jul. 2005.

HINSINGER, P.; PLASSARDT, C.; TANG, C. J. B. Origins of root-meidated pH changes in the rhizosphere and their responses to environmentalm constraints. Plant and Soil, vol. 248. p. 43-59. Mai. 2003.

IBGE. Aquisição domiciliar de hortaliças e distribuição por região geográfica, 2002-2003. Pesquisa de Orçamentos Familiares (POF). Disponível em: <http://www.ibge.gov.br>. Acesso em 13 mai. 2012.

IBGE. Indicadores de desenvolvimento sustentável. Estudos e Pesquisa, Informação Geográfica 7. Brasil, 2010.

IBGE. Produção Agrícola Municipal (PAM), 2005, Rio de Janeiro, IBGE. Disponível em: <www.sidra.ibge.gov.br>. Acesso em 13 mai. 2012.

JACQUES, R.J.S. Characterization of a polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading microbial consortium from a petrochemical sludge landfarming site. Bioremediation Journal, Philadelphia,v.11, n.1, p.1-11. Jan. 2007.

JAIME, P.C.; MACHADO F. M. S.; WESTPHAL M.F.; MONTEIRO C.A. Educação a Saúde Pública. Revista de Saúde pública. v.41, n.1, p.154-7, Ago. 2007.

JUNQUEIRA, N. T. V.; TEIXEIRA, R. V. R.; ANJOS, J. R. N.; VERAS, M. C. M.; NASCIMENTO, A. C.; SHARMA, R. D. Controle das principais doenças do maracujazeiro no cerrado. Comunicado técnico. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Cerrados, n.8, p.1-5. Out. 2000.

28

KEIFER, M.; MAHURIN, R. Chronic neurological effects of pesticides overexposure. Occup Med. vol. 12. p. 291-304. Jun. 1997.

LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia industrial. Editora Edgar Blucher Ltda , vol. 3, n 1.p. 48-55. Nov. 2001.

LOOS, M. A. Indicator media for microorganisms degrading chlorinated pesticides. Journal of Microbiology , Canadian, v. 21, p. 104-107. Jun. 1975.

LUNDBERG, I.; HOGBERG, M.; MICHEISEN, H.; NISSE, G. Effects of long term organophosphate exposure on neurological symptoms, vibration sense and tremor among South African farmer workers. Occup. Environ. Med. vol. 3. p. 343-350. Mai.1997.

MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J. Hábitats microbianos, ciclos de nutrients e interações com plantas e animais. Microbiologia de Brock. Trad. C.M. Kyan. 10 ed., USA: Prentice Hall, 2004. (Tradução de: Brock biology of microorganisms) Cap. 20. CD-ROM.

MADDEN, J.M. Microbial pathogens in fresh produce: the regulatory perspective. Journal of Food Protection, Ames, vol. 55, n. 10, p.821-823. Out. 1992.

MARILLEY, L.; ARAGNO, M. Phylogenetic diversity of bacterial communities differing in degree of proximity of Lolium perenne and Trifolium repens roots. Applied Soil Ecology, v. 13, p. 127-136. Jul. 1999.

MARTINS, A. Biorremediação. III Fórum de Estudos Contábeis, Faculdades Integradas Claretianas. Rio Claro, SP. Disponível em: <www.ceset.unicamp.br/lte/artigos/3fec2401>. Acesso em: 20 ago. 2010.

MELO, L. H. Importância Das Frutas E Hortaliças Na Promoção Da Saúde. 2009. Disponivel em <http://www.artigonal.com/nutricao-artigos/importancia-das-frutas-e-hortalicas-na-promocao-da-saude-1551323.html.> Acesso em: 12 de mai. 2012

MELO, P. C. T.; VILELA, N. J. Importância da cadeia produtiva brasileira de hortaliças. Palestra apresenta pelo 1º autor na 13ª Reunião Ordinária da Câmara Setorial da Cadeia Produtiva de Hortaliças / MAPA Brasília, DF - 2007.

MONTEIRO, C.A.; MONDINI, L.; COSTA. R.B.L. Mudanças na composição e adequação nutricional da dieta familiar nas áreas metropolitanas do Brasil. Revista de Saúde Pública, v.34, n.2, p.51-58. Mar. 2000.

29

MOREIRA, J. C. Avaliação integrada do impacto do uso de agrotóxicos sobre a saúde humana em uma comunidade agrícola de Nova Friburgo, RJ. Ciência e Saúde Coletiva, Rio de Janeiro,.vol 2. p. 299-311. Ago. 2004

ODUMERU, J. A. Assessment of the microbiological quality of ready-to-use vegetables for the health-care food services. Journal of Food Protection, Ames, v. 60, v.8, p. 954-960, 1997.

OLIVEIRA, S. J. J.; MEYER, A.; MOREIRA, J. C. Cholinesterase activities determination in frozen blood samples: An improvement to the occupational monitoring in developing countries. Human & Environ Toxicology; vol. 15. p.173-177. Set. 2000

ORNELLAS, L. H. Técnica Dietética: seleção e preparo de alimentos. Atheuneu Editora. 7ª ed. São Paulo:, 2001.

REGITANO, J. B.; BONFLEUR, E. J. Pesticides residues in the environment: processes. II Simpósio Internacional sobre Gerenciamento de Resíduos Agropecuários e Agroindustriais – II SIGERA 15 a 17 de março de 2011 - Foz do Iguaçu, PR. Volume I – Palestras.

RODRIGUES, N. R.; ANDRIETTA, M. G. S. Biodegradação do diclosulam por bactérias isoladas de solos cultivados com soja. Universidade Estadual de Campinas. Planta Daninha, Viçosa-MG, v. 28, n. 2, p. 393-400, 2010 SAMBROOK, J.; TRITSCH, E. F.; MANIATS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.

SANTOS, A. S. R.; Biodiversidade, Bioprospecção, Conhecimento tradicional e futuro da .vida. Centro de Computação da Unicamp. Disponivel em <http://www.ccuec.unicamp.br/revista/infotec/artigos/silveira.html> Acesso em 14 mar. 2011.

SILVA, M. A.; SOUZA, R.; SOUZA, R. R. Biodegradação de resíduos agrícolas como alternativa à redução de riscos ambientais no semi-árido sergipano. Cidade Universitária “Prof. José Aloísio de Campos”, Av. Marechal Rondon, S/N, São Cristóvão – SE, Brasil, 2002.

SILVA, T. M.; STETS, M. I. Degradation of 2,4-D herbicide by microorganisms isolated from brazilian contaminated soil. Braz. J. Microbiol. vol.38 no.3 p. 522-525. Jul. 2006. SINGER, A. C.; CROWLEY, D. E.; THOMPSON, I. P. Secondary plant metabolites in phytoremediation and biotransformation. Trends in Biotechnology, v. 21, n. 3, p. 123-130, 2003.

30

SMALLA, K.; WIELAND, G.; BUCHNER, A.; ZOCK, A.; PARZY, J.; KAISER, S.; ROSKOT, N.; HEUER, H.; BERG, G. Bulk and rhizosphere soil bacterial communities studied by denaturing gradient gel electrophoresis: plant-dependent enrichment and seasonal shifts revealed. Applied and Environmental Microbiology, v. 67, n. 10, p. 4742-4751, Out. 2001.

TADEO, J. L.; SÁNCHEZ, B. C.; BEATRIZ, A. B.; LORENA, G. L. Analysis of pesticide residues in juice and beverages. Critical Rev. Analytical Chem;. v 34. p. 121-131. Jan. 2004.

TRIGUEIRO, M. G. S. Bioprospecção; uma nova fronteira da sociedade, 2009. Disponivel em: <http://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=Bioprospec%C3%A7%C3%A3o%3B%20uma%20nova%20fronteira%20da%20sociedade%2C&source=web&cd=1&ved=0CFAQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.sbsociologia.com.br%2Fportal%2Findex.php%3Foption%3Dcom_docman%26task%3Ddoc_download%26gid%3D3001%26Itemid%3D171&ei=1b3vT9dh59brAZvXrKsG&usg=AFQjCNG32ajZRhjI3frSCC3eyA_smho-gw&cad=rja>. Acesso em 18 de abr. 2012.

VALLA, V. V. Procurando compreender a fala das classes populares. Saúde e Educação. vol 5. p. 38-46, 2000.

VEIGA, M. M. Agrotóxicos: Eficiência econômica e injustiça socioambiental, 2007. Disponível em < redalyc.uaemex.mx/pdf/630/63012113.pdf>. Acesso em 03 de set. 2011.

VIEIRA, E. M.; PRADO, A. G. S. Estudo da adsorção/dessorção do ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4d) em solo na ausência e presença de matéria orgânica. Química Nova, vol. 22. p. 305-308. Nov. 1998.

WILSON. Biodiversidade, 1997. Disponível em < http://www.ccuec.unicamp.br/revista/infotec/artigos/silveira.html>. Acesso em 07 de jul. 2011 YANG, C. F.; LEE, C. M.; WANG, C. C. Isolation and physiological characterization of the pentachorolophenol degrading bacterium Sphingomonas chlorophenolica. Chemosphere, v. 62: p. 709-714, 2006.

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ANEXO I

Meios de cultura

1) Meio de cultura MEMB (Chong, 2005) 10 g Peptona 2 g K2HPO4 3,25 mg Azul de Metileno 40 mg Eosina B 300 mg Extrato de Levedura 300 mg 2,4-D 15 g Agar (para meio sólido) Misturar todos os reagentes, com exceção do 2,4-D, até que fique homogêneo. Completar o volume com água destilada para 1000 mL. Adicionar o 2,4-D. Autoclavar por 15 min. 2) Meio de cultura 2,4-D (Füschslin et al., 2003) 275 mg NH4Cl 75 mg MgSO4.7H2O 5 mg CaCl2.H2O 35 mg KCl 1,5 mg FeCl2 60 µg H3BO3 100 µg MnCl2.4H2O Fração autoclavável 120µg CoCl2.6H2O 70µg ZnCl2 25µg NiCl2.6H2O 15µg CuCl2.2H2O 25µg Na2MoO4.2H2O 5,2 mg EDTA.Na4(H2O)4 500 mg 2,4-D 100 mL Tampão fosfato (Na2HPO4.2H2O/KH2PO4 0,56 M pH 7,5) 0,05 mL Solução estoque de vitaminas 15 g Agar (para meio sólido)

Modo de preparo do meio de cultura 2,4-D: Misturar todos os reagentes da fração autoclavável até que fique homogêneo. Completar o volume com água destilada para 900 mL. Para o meio sólido adicionar o agar. Autoclavar por 15 min. Quando a fração autoclavável estiver com aproximadamente 60 ºC adicione por filtração (porosidade de 0,22 µm) o tampão fosfato, a solução estoque de vitaminas e o 2,4-D. A solução de vitaminas pode ser diluída no tampão fosfato para a filtragem e adição à base mineral do meio. O 2,4-D deve ser diluído em 2 mL de etanol e filtrado em um novo filtro para evitar a precipitação do mesmo. Deve ser realizada a homogenização do meio e sua distribuição. Reagentes do tampão fosfato (Na2HPO4.2H2O/KH2PO4 0,56 M pH 7,5): 850 mL Na2HPO4.2H2O 1 M 150 mL KH2PO4 1 M

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Modo de preparo do tampão fosfato: Misturar os reagentes até que fique homogêneo. Ajustar o volume para 1000 mL com água destilada. Reagentes da solução estoque de vitaminas: 100 mg Piridoxina-HCl 50 mg Tiamina-HCl 50 mg Riboflavina 50 mg Ácido nicotínico 50 mg Ácido D-Ca-pantotênico 50 mg Ácido p-amino benzóico 50 mg Ácido lipóico 50 mg Nicotinamida 50 mg Vitamina B12 20 mg Biotina 20 mg Ácido fólico Água destilada suficiente para completar o volume para 1000 mL de solução. Modo de preparo da solução estoque de vitaminas: Misturar todos os reagentes até que fique homogêneo. Ajustar o volume para 1000 mL com água destilada. Armazenar sob refrigeração (4 ºC). 3) Meio de cultura LB (Sambrook et al., 1989) 10 g Triptona 5 g Extrato de Levedura 10 g NaCl 15 g Agar (para meio sólido) Misturar todos os reagentes até que fique homogêneo. Completar o volume com água destilada para 1000 mL. Ajustar para pH 7,0 com NaOH. Autoclavar por 15 min.