BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS ÀS …

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E NATURAIS

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS ÀS FOLHAS DA AXONOPUS

LEPTOSTACHYUS (POACEAE)

BACHARELADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

EMANUEL VICTOR DOS SANTOS NUNES

Rondonópolis, MT – 2020

ii

BIOPROSPECÇÃO DE FUNGOS ENDOFÍTICOS ASSOCIADOS ÀS FOLHAS DA AXONOPUS LEPTOSTACHYUS (POACEAE)

por

Emanuel Victor dos Santos Nunes

Monografia apresentada à Universidade Federal de Mato Grosso como parte dos requisitos do Curso de Graduação em Ciências Biológicas para obtenção do título de Bacharel em Biologia.

Orientador: Profº. Dr. Helder Lopes Teles

Rondonópolis, Mato Grosso – Brasil

2020

iii

Universidade Federal de Mato Grosso

Instituto de Ciências Exatas e Naturais

Bacharelado em Biologia

A comissão examinadora abaixo assinada aprova o trabalho de

curso

BIOPROSPECÇÃO DO FUNGO ENDOFÍTICO P90 MAGNAPORTHALES, ASSOCIADO À FOLHAS DA AXONOPUS

LEPTOSTACHYUS (POACEAE)

Trabalho de conclusão de

curso elaborado por Emanuel

Victor dos Santos Nunes

como requisito parcial para

obtenção do grau de Bacharel

em Biologia

Comissão Examinadora

_________________________________________ Prof. Dr. Helder Lopes Teles

UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso

____________________________________________

Profa. Dra. Helen Cristina Favero Lisboa

UFMT – Universidade Federal de Mato Grosso

_______________________________________

Profa. Dra. Cristina Alves Lacerda

UFMA – Universidade Federal do Maranhão

Rondonópolis, março de 2020

iv

DEDICATÓRIA

Dedico este trabalho em memória da minha avó, Dona Helena Flora. Pessoa de

quem herdei os melhores traços da minha natureza, sua esplendida e generosa

disposição em vida é um perpétuo legado para os seus filhos e netos.

v

AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha mãe Silvana. A sua força de caráter, senso de justiça, ética de

trabalho e compaixão são características que vou passar a vida tentando o meu melhor

para emular. Sua ambição em me ensinar a ler e a conhecer o mundo desde criança me

ajudou em ser quem sou hoje, e a senhora será sempre a minha inspiração.

Agradeço ao meu tio Márcio, que sempre foi o exemplo do homem que quero

ser. O senhor será sempre o meu compasso moral, e sempre vou querer usufruir do

privilégio supremo que é buscar os seus conselhos.

Agradeço ao meu irmão Vinícius e ao meu primo Paulo, homens cujo intelecto

me inspiram imensamente. Sou forçado a praticar a minha humildade sempre que estou

perto de vocês com suas mentes maravilhosas, e me orgulho de conseguir acompanhar a

nossa frequente roda de conversa.

Agradeço ao meu orientador, prof. Helder por aceitar como aluno e me orientar

ao longo desses últimos anos. O tempo não passa quando estou recebendo uma aula do

senhor, que toma toda oportunidade que tem de fazer com que a mais simples conversa

se transforme em uma valiosa lição. Agradeço a paciência com os meus muitos erros e

atrasos, e as longas horas investidas no meu trabalho de forma a me ajudar com a

temida redação científica. Espero mostrar um dia que essas horas investidas valeram a

pena. Agradeço as muitas portas abertas para mim. Espero conseguir absorver um pouco

de sua ética de trabalho e grande paixão pelo que faz, porque o senhor é um exemplo do

profissional que eu quero ser.

Agradeço ao prof. Ian, que me recebeu como um pai um seu laboratório. Sua

preocupação, até mesmo no que diz respeito aos meus problemas particulares, me

comoveu imensamente. Espero justificar a fé que o senhor depositou em mim, e espero

absorver muito do seu conhecimento nos anos que estão por vir. Sinto que tenho muito

o que aprender com o senhor e evoluir pessoal e profissionalmente.

Agradeço à prof. Helen e prof. Cristina pela disponibilidade em participar da

comissão avaliadora, dividindo seus conhecimentos e me ajudando a melhorar o meu

trabalho.

vi

Agradeço à prof. Letícia pelas lições sobre ensaios microbiológicos. Sua cortesia

e paciência para sanar minhas muitas dúvidas nesses últimos anos foram estupendas.

Agradeço à prof. Illana e à prof. Letícia Lotufo por realizar os meus ensaios de

atividade biológica dos meus extratos e frações. Vocês contribuíram imensamente com

este trabalho.

Agradeço ao meu amigo Ricardo, que me ensinou muitos caminhos das pedras

ao longo desse trabalho. Sua indústria e natureza prática são muito admirados por mim,

e sou muito grato ao seu apoio e ensinamentos.

Agradeço aos meus colegas de laboratório do NUPEC, Diego Henrique, Poliana,

Camila e Maria. Eu não poderia pedir por melhor companhia, e sou muito grato à sua

paciência com meus erros e dedicação ao vosso trabalho.

Agradeço aos meus colegas de laboratório do NuBBE, os doutorandos Marcus

Vinicius, Juvenal Henrique e Natália. Vocês me ajudaram imensamente na minha curta

temporada em Araraquara, e acredito ter evoluído muito só de interagir com

profissionais tão competentes e apaixonados pelo que fazem. Vocês são uma inspiração

para mim.

Agradeço ao meu amigo do peito, Paulo Henrique. Que montanha russa de

emoções nós passamos. Você me viu no fundo do poço e me ajudou a ficar em pé, e

disso eu nunca vou esquecer. Graças ao seu apoio, pude deixar os dias mais sombrios da

minha vida para trás. Sou muito grato às nossas conversas e todos os momentos. Levo

da Biologia um amigo para a vida inteira, não tenho dúvidas disso.

Agradeço aos meus amigos Melkzedek, Pedro, Renata, Letícia, Ana Carolina,

Rafael, Luís Felipe, Lucas Fernando, Iefferson, Victória e Jhéssica. Vocês fizeram esse

período como aluno de graduação ser muito agradável. Tive muita sorte de ser da

mesma geração de pessoas tão notáveis, e vou levar para toda a vida os bons momentos

que tive interagindo com vocês.

Agradeço a todos que trabalharam comigo, me apoiaram e me ensinaram. Todo

e qualquer meta que eu venha a alcançar será devido ao fato de eu estar me apoiando no

ombro de gigantes.

vii

SÚMARIO

RESUMO ........................................................................................................................ ix

ABSTRACT ..................................................................................................................... x

LISTA DE TABELAS .................................................................................................... xi

LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... xii

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURA ..................................................................... xiv

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 16

2 OBJETIVOS ................................................................................................................ 17

2.1 Objetivo geral ........................................................................................................... 17

2.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 17

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 18

3.1 Química dos Produtos Naturais ................................................................................ 18

3.2 Fungos endofíticos .................................................................................................... 19

3.3 Ecologia dos fungos endófiticos ............................................................................... 20

3.4 Fungos endofíticos como fonte de novos compostos bioativos ............................... 20

3.5 A gramínea Axonopus leptostachyus ........................................................................ 25

3.6 Fungos da Ordem Magnaporthales ........................................................................... 26

4 MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................ 28

4.1 Descrição dos materiais utilizados ........................................................................... 28

4.1.1 Meios de cultura .................................................................................................... 28

4.1.2 Reagentes ............................................................................................................... 28

4.1.3 Adsorventes cromatográficos ................................................................................ 28

4.2 Equipamentos ........................................................................................................... 28

4.2.1 Cultivo dos endófitos e obtenção do extrato ......................................................... 28

4.2.2 Cromatógrafos ....................................................................................................... 29

4.2.3 Ressonância Magnética Nuclear ............................................................................ 29

4.3 Métodos .................................................................................................................... 29

4.3.1 Coleta do material vegetal ..................................................................................... 29

4.3.2 Isolamento e purificação dos endófitos ................................................................. 29

4.3.3 Classificação dos endófitos ................................................................................... 30

4.3.4 Triagem biológica: atividade antibacteriana através de Antibiose ........................ 30

viii

4.3.5 Método de seleção do endófito bioativo ................................................................ 31

4.3.6 Cultivo do microrganismo P90 Magnaporthales sp. ............................................. 32

4.3.7 Obtenção do extrato bruto ..................................................................................... 32

4.3.8 Isolamento dos metabólitos ................................................................................... 33

4.3.8.1 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) .............................. 33

4.3.8.2 Cromatografia em Coluna Aberta (CCA) ........................................................... 33

4.3.8.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ........................................... 34

4.3.9 Ensaios de atividade biológica das frações purificadas ......................................... 34

4.3.9.1 Triagem de atividade antibacteriana ................................................................... 34

4.3.9.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ................................. 35

4.3.9.3 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)............................. 36

4.3.9.4 Experimento de redução de biofilme .................................................................. 36

4.3.9.5 Análise de citotoxicidade ................................................................................... 37

4.3.10 Elucidação estrutural das substâncias por espectrometria de Ressonância

Magnética Nuclear (RMN) ............................................................................................. 37

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 38

5.1 Seleção e obtenção do extrato bruto do endófito ...................................................... 38

5.2 Classificação do fungo.............................................................................................. 38

5.3 Estudo químico do fungo P90 Magnaporthales sp. .................................................. 38

5.3.1 Fracionamento cromatográfico e purificação ........................................................ 38

5.3.2 Caracterização da substância L1 (tr 16’) ............................................................... 39

5.3.3 Caracterização da substância F51-80 (tr 17’) ........................................................ 41

5.3.4 Caracterização da substância F16-30 (tr 30’) ........................................................ 42

5.3.5 Caracterização da substância F6-15 (tr 42’) .......................................................... 44

5.4 Ensaios de atividade biológica das frações purificadas ............................................ 46

5.4.1 Ensaios de triagem inicial de atividade antibacteriana .......................................... 46

5.4.2 Experimento de redução de biofilme ..................................................................... 48

5.4.3 Análise de citotoxicidade....................................................................................... 49

6 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 52

7 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 53

ix

RESUMO

Fungos endofíticos colonizam tecidos de órgãos de plantas saudáveis, e são

reconhecidos como novas fontes de produtos naturais. Seus metabólitos especiais

possuem potencial uso no setor do agronegócio, indústria alimentícia e farmacêutica,

com diversas atividades biológicas, como antimicrobiana, citotóxica, entre outras. Neste

trabalho, foi selecionado para a investigação química e avaliação do potencial bioativo

de seus metabólitos, o fungo endofítico P90 Magnaporthales sp., isolado de folhas da

gramínea pantaneira Axonopus leptostachyus. O endófito foi cultivado em 50 placas de

petri com BDA e incubado por 15 dias em temperatura ambiente. O meio de cultura e

micélio foram cortados aleatoriamente, transferidos para um frasco erlenmeyer e

extraídos com AcOEt em mesa giratória orbital por 24h. O material foi filtrado em

pressão reduzida e seco, obtendo o extrato bruto. O extrato foi fracionado em escala

preparativa por cromatografia de adsorção em fase normal (sílica gel), com fase móvel

metanol:clorofórmio:hexano (1:4:5). As frações resultantes foram avaliadas para a

detecção de atividade antibacteriana em ensaios de Concentração Inibitória Mínima,

Concentração Bactericida Mínima e redução de biofilme, e atividade citotóxica frente a

linhagens de carcinomas humanos. O fracionamento em Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência resultou no isolamento de 4 substâncias com melhor grau de pureza, onde

duas demonstraram citotoxicidade frente à linhagem de carcinoma colorretal humano,

uma das quais também apresentou atividade antibacteriana frente a linhagem de

Enterococcus faecium. As substâncias foram posteriormente submetidas às análises

espectroscópicas de Ressonância Magnética Nuclear para a elucidação estrutural.

Palavras-chave: bioatividade; fungos endofíticos; Axonopus leptostachyus.

x

ABSTRACT

Endophytic fungi colonize healthy plant organs, and are acknowledged as new sources

of natural products. Its special metabolites have potential use in the farming, food and

drug industries, with biological activities, such as antimicrobial, cytotoxic, among

others. In this work, were selected for the chemical investigation and evaluation of

potential bioactivity of its metabolites, the endophytic fungus P90 Magnaporthales sp.,

isolated from the leaves of the Pantanal grass Axonopus leptostachyus. The endophyte

was cultivated in 50 petri dishes with PDA and incubated for 15 days at room

temperature. The culture medium and mycelium were randomly cut, transferred to an

erlenlenmeyer flask and extracted with EtOAc in shaking incubator for 24h. The

material was filtered in low pressure and dried, resulting in a crude extract. The extract

was fractionated in preparative scale by adsorption chromatography in normal phase

(silica gel) with mobile phase methanol:chloroform:hexane (1:4:5). The resulting

fractions were evaluated for detection of antibacterial activity with Minimal Inhibitory

Concentration, Minimal Bactericidal Concentration, and biofilm reduction assays, and

cytotoxic activity facing human carcinoma strains. The HPLC fractionation resulted in

the isolation of 4 substances with superior purity grade, two of them demonstrating

activity facing human colorectal cancer strain, one of which also showed antibacterial

activity against the bacterial strain Enterococcus faecium. The substances were

subsequently submitted to Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy analysis for

structural elucidation.

Keywords: bioactivity; endophytic fungi; Axonopus leptostachyus.

xi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Proposta para a semiquantificação da atividade antimicrobiana apresentada

pelos fungos endofíticos. _______________________________________________ 32

Tabela 2 – Atividade antibacteriana das frações “F16-30” e “L1” a 512 µg/mL. ____ 47

Tabela 3 – Resultado da CIM e CBM da fração “L1” (substância tr 16’ majoritaria). 47

Tabela 4 – Capacidade de redução do biofilme formado por Staphylococcus epidermidis

ATCC 35984. ________________________________________________________ 48

Tabela 5 – Inibição do crescimento celular (%) dos extratos e frações em linhagem de

carcinoma de colorretal humano (HCT116), com as concentrações de 5 g/mL e 50

g/mL (média ± SEM) (n=3) ____________________________________________ 50

xii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Espécie vegetal Axonopus leptostachyus (Flüggé) Hitchc. ____________ 25

Figura 2 – Interpretação para as medições de halos de inibição e crescimento micelial no

___________________________________________________________________ 31

Figura 3 – Fracionamento do extrato do fungo P90 Magnaporthales sp. por

Cromatografia em Coluna Aberta_________________________________________ 33

Figura 4 – Organograma do fracionamento do extrato bruto AcOEt do fungo P90

Magnaporthales. ______________________________________________________ 39

Figura 5 – Cromatograma da fração “L1” em CLAE analítica. Grad. exp. MeOH:H2O

(5:100)-(100:0) 40’, em 250 nm. Destaque para a banda simétrica no tr 16’. _______ 39

Figura 6 – Espectro de RMN 1H (600 MHz/CD3OD) da substância tr 16’ (L1) de P90,

obtido com 0,7 mg em tubo de 3 mm. _____________________________________ 40

Figura 7 – Ampliação ( 8,7 – 7,2) do espectro de RMN 1H (600 MHz/CD3OD) da

substância tr 16’ (L1) de P90. ____________________________________________ 40

Figura 8 – Espectro de RMN 13 C (150 MHz/CD3OD) da substância tr 16’ (L1) de P90,

obtido com 0,7 mg em tubo de 3 mm. _____________________________________ 40

Figura 9 – Cromatograma da fração “F51-80” em CLAE analítica. Grad. exp.

MeOH:H2O (5:100)-(100:0) 40’, em 250 nm. Destaque para a banda simétrica no tr 17’

___________________________________________________________________ 41

Figura 10 – Espectro de RMN 1H (600 MHz/CD3OD) da substância tr 17’ (F51-80) de

P90, c/ supressão de solvente CD3OD em 4,887 e 4,183, obtido com 4,0 mg em tubo

de 3 mm. ____________________________________________________________ 41

Figura 11 – Espectro de RMN 13 C (150 MHz/CD3OD) da substância tr 17’ (F51-80) de

P90, obtido com 4,0 mg em tubo de 3 mm. _________________________________ 42


MeOH:H2O (5:100)-(100:0) 40’ em 272 nm. Destaque para a banda simétrica no tr 30’.

___________________________________________________________________ 42



Figura 14– Ampliação ( 3,7 – 1,9) do espectro de RMN 1H (600 MHz/CD3OD) da

substância tr 30’ (F16-30) de P90. ________________________________________ 43

../../../../Downloads/TCC%20-%20Victor%202020%20(D)%20(Leitura%20Helder).doc#_Toc34657132




xiii



Figura 16 – Cromatograma da fração “6-15” em CLAE analítica. Grad. exp.

MeOH:H2O (5:100)-(100:0) 40’ em 273nm. Destaque para a banda simétrica no tr 42’

___________________________________________________________________ 44


P90, c/ supressão de solvente CD3OD em 4,887 e 3,301, obtido com 4,1 mg em tubo

de 3 mm. ____________________________________________________________ 44


substância tr 42’ (F6-15) de P90. _________________________________________ 45


substância tr 42’ (F6-15) de P90. _________________________________________ 45



Figura 21 – Quantidade de biofilme da S. epidermidis ATCC 35984 depois de tratado

com as frações “L1” e “F16-30” a 512 µg/mL. A linhagem 12.228 é o controle positivo,

e a linhagem 35.984 é o controle negativo. _________________________________ 49

Figura 22 – Inibição do crescimento celular (%) dos extratos e frações em linhagem de


g/mL (média ± SEM) (n=3). ___________________________________________ 50

xiv

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURA

: Deslocamento químico

13C: Carbono isótopo 13

1H: Hidrogênio isótopo 1

AcOEt: Acetato de Etila

ATCC: American Type Culture Collection

BDA: Batata-Dextrose-Ágar

CBM: Concentração Bactericida Mínima

CCA: Cromatografia em Coluna Aberta

CCDC: Cromatografia em Camada Delgada Comparativa

CIM: Concentração Inibitória Mínima

CLAE: Cromatografia Líquida de Alta eficiência

CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute

COSY: Correlated Spectroscopy

DAD: Detector de Arranjo de Diodos

DMSO: Dimetilsulfóxido

DNA: Ácido Desoxirribonucleico

HMBC: Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

HPLC: High Performace Liquid Chromatography

HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence

Hz: Hertz

ICBS: Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde

LEMiMo: Laboratório de Epidemiologia e Microbiologia Molecular

MeOH: Metanol

MHCA: Müller Hinton Cátion Ajustado

MTT: brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NUPEC: Núcleo de Pesquisas em Conservação e Produção no Cerrado

ppm: Partes por milhão

RMN: Ressonância Magnética Nuclear

rpm: Rotações por minuto

RPMI: Roswell Park Memorial Institute

xv

SEM: Standard Error of the Mean

UFLC: Ultra Fast Liquid Chromatography

UFMT: Universidade Federal de Mato Grosso

USP: Universidade de São Paulo

UV: Ultra-Violeta

16

1 INTRODUÇÃO

Endófitos são microrganismos que vivem dentro de plantas saudáveis, principalmente

nos caules, folhas e raízes (JALGAONWALA et. al., 2011), promovendo uma interação

mutualística com seu hospedeiro. Entre os diferentes grupos de organismos endófitos estão os

fungos, que recentemente estão sendo vistos como excelente fonte de metabólitos especiais

com potencial uso econômico na agricultura, na indústria alimentícia, na indústria

farmacêutica, entre outros setores (NISA et. al., 2015). Na área da saúde humana os

microrganismos vêm historicamente contribuindo com a produção de potentes antibióticos,

como griseofulvinas, rifamicinas, citocalasinas, penicilinas, cefalosporinas, entre outros.

O Brasil, devido a sua biodiversidade e história etnobotânica, apresenta grande

potencial na pesquisa com endófitos (CALDERANI et. al., 2016), e nesse contexto, o

presente trabalho objetivou identificar substâncias produzidas por fungos endofíticos

associados às folhas de Axonopus leptostachyus, gramínea do pantanal, com ênfase ao

endófito P90 Magnaporthales sp. Desta forma, com base no histórico dos fungos para a

produção de compostos bioativos, foram utilizadas técnicas cromatográficas e

espectroscópicas para isolar e identificar metabólitos com potencial bioatividade.

O trabalho se justifica em virtude de as infecções bacterianas oportunistas serem

reconhecidas como as maiores complicações em pacientes imunocomprometidos por

quimioterapia, transplantes de órgãos, dentre outros casos, podendo ser fatais devida a

fragilidade do sistema de defesa. Muitas bactérias são responsáveis por infecções

nosocomiais, como a Staphylococcus aureus, Sphingomonas paucimobilis, Stenotrophomonas

maltophilia, Pseudomonas aeruginosa, entre outras. Uma complicação adicional reside no

fato que somente algumas drogas antibacterianas eficientes estão disponíveis para o

tratamento de infeções sistêmicas desta natureza, estimulando a pesquisa por novos

antibióticos (GERBERDING, 1998; SÁNCHEZ, 2015).

Foram realizados a coleta de folhas jovens e adultas da Axonopus leptostachyus, o

isolamento e classificação dos endófitos, e a triagem biológica para a detecção de atividade

antimicrobiana (NUNES; NEPONUCENO; TELES, et al., 2019). As espécies de fungos que

apresentaram resultados promissores na inibição de bactérias patogênicas em humanos foram

selecionadas para a investigação química de seus metabólitos especiais, utilizando técnicas

cromatográficas e espectrométricas para isolar, purificar, e elucidar as estruturas dos

metabólitos.

17

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

• Isolar, caracterizar e avaliar a atividade biológica dos metabólitos especiais produzidos por

fungos endofíticos associados às folhas de Axonopus leptostachyus.

2.2 Objetivos específicos

• Isolar e purificar os metabólitos especiais a partir do extrato bruto produzido pelo fungo

endofítico P90 Magnaporthales sp., para a obtenção das substâncias possivelmente

responsáveis pelas atividades antibacterianas detectadas nos ensaios de antibiose;

• Utilizar técnicas espectroscópicas para elucidar as estruturas dos metabólitos especiais

isolados e purificados;

• Avaliar o potencial antibacteriano de frações e substâncias purificadas.

• Avaliar a atividade citotóxica de frações frente a linhagens de carcinomas humanos.

18

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Química dos Produtos Naturais

Há pouco mais de 200 anos, um aprendiz de farmacêutico de apenas 21 anos, Friedrich

Sertürner, isolou o primeiro composto puro farmacologicamente ativo de uma planta. O

composto chamado morfina foi extraído do exsudato da incisão na cápsula da papoula da

planta Papaver somniferum. Esse feito iniciou uma era onde compostos das plantas poderiam

ser purificados, estudados e administrados em dosagens que não variariam com a fonte ou

idade do material (LI; VEDERAS, 2009).

Os produtos naturais possuem diversidade química e estrutural inigualável a qualquer

acervo de moléculas sintéticas, e continuam a inspirar novas descobertas nas áreas da

química, biologia e medicina. Por serem aperfeiçoados como moléculas bioativas durante sua

história evolutiva, até hoje são as melhores fontes de fármacos na indústria (NEWMAN;

CRAGG, 2016). A história da medicina é cheia de exemplos sobre como a descoberta de um

produto natural gerou profundos avanços na biologia e inspirou novos medicamentos e

tratamentos.

Alexander Fleming, Ernst Chain e Sir Howard Florey, ganharam em 1945 os prêmios

Nobel da Fisiologia ou Medicina pela descoberta da Penicilina, e Selman Waksman ganhou

em 1952 pela descoberta da estreptomicina. Pode-se dizer que esses prêmios viriam a

anunciar a chamada “Era de Ouro” dos produtos naturais na descoberta de novos fármacos,

que marcou as décadas de 1950 e 1960 (SHEN, 2015). Até 1990, cerca de 80% dos

medicamentos eram de produtos naturais, ou análogos inspirados por estes. Antibióticos

(penicilina, tetraciclina, eritromicina), antiparasitários (avermectina), anti-malárica (quinina,

artemisinina), agentes controladores de lipídeos (lovastatina e análogos), imunossupressores

para transplante de órgãos (ciclosporina, rampamicina) e anticancerígenos (taxol,

doxorrubicina) revolucionaram a medicina (LI; VEDERAS, 2009).

Desde o final do século XX, no entanto, muitas empresas farmacêuticas

enfraqueceram ou abandonaram seus programas de produtos naturais, em parte devido a

incríveis avanços nos métodos de rastreio de alta capacidade (High-Throughput Screening –

HTS) e de síntese combinatória, criando vasto acervo de moléculas sintéticas. Em

comparação, os acervos de produtos naturais geralmente consistiam em extratos e frações

parcialmente purificadas, em adição a compostos puros, e eram percebidos como

incompatíveis às demandas da indústria na época. Essa falta de ênfase em produtos naturais

na procura por novos fármacos está correlacionada com uma redução como um todo na

19

descoberta e queda substancial na aprovação de novos medicamentos originados de produtos

naturais (LI; VEDERAS, 2009).

O prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2015, dado a William Campbell e

Satoshi Omura pela descoberta do produto natural microbiano (avermectina), cujos derivados

ivermectina reduziram drasticamente a incidência de oncocercose (também conhecido como

“cegueira dos rios”) e filariose linfática (também conhecida como “elefantíase”), e para

Youyou Tu pela descoberta do produto natural de plantas artemisinina, um fármaco que

reduziu significativamente a taxa de mortalidade para pacientes com malária, trouxe grande

orgulho e otimismo para a comunidade de produtos naturais em todo o mundo (SHEN, 2015).

Associado a essa nova descoberta, e com os avanços recentes na genômica microbiana,

biologia sintética, bioinformática e tecnologias analíticas, o futuro parece brilhante para a

prospecção de produtos naturais para vários fins.

Neste contexto, o estudo químico/biológico dos produtos naturais na descoberta de

novos candidatos a fármacos se mantém em posição de destaque, endossado pelo excepcional

histórico de plantas e microrganismos na produção de moléculas bioativas.

3.2 Fungos endofíticos

Endófitos são aqueles microrganismos que habitam o interior de plantas,

especialmente folhas, caules e raízes, sem danos aparentes ao hospedeiro, e exercem um papel

onde ambos podem ser beneficiados. Desde o início da década de 1980, estudos relatam a

importância de fungos endofíticos para a planta hospedeira, mais especificamente

demonstrado que a presença desses microrganismos pode resultar na diminuição da predação

da planta por insetos herbívoros (AZEVEDO et al., 2001).

Diferentes grupos de organismos como fungos, bactérias, actinomicetos e

micoplasmas podem ocorrer como espécies endófitas (BANDARA et al., 2006). Além disso,

quase todas as classes de plantas vasculares e gramíneas examinadas até hoje são hospedeiras

de fungos endofíticos (JALGAONWALA et al., 2011).

A existência destes endófitos é conhecida por centenas de anos, e a pesquisa

especificamente em fungos endofíticos também tem uma longa história, onde sua diversidade

entre as plantas é consideravelmente grande, sendo estimado que cada planta hospeda pelo

menos um ou dois endófitos principais (VERMA et al., 2007).

Recentemente, os fungos endofíticos vem sendo observados como uma prolífica fonte

de metabólitos especiais com várias atividades biológicas, com destaque para a

antimicrobiana, além de receber atenção nos últimos 30 anos devido sua capacidade de

20

proteger as plantas de insetos predadores e organismos fitopatógenos (JALGAONWALA et

al., 2011).

3.3 Ecologia dos fungos endófiticos

Os botânicos foram os que mais estudaram as interações entre os fungos endofíticos e

as plantas que os hospedam. Estudos desde o início dos anos 1980 indicam que endófitos não

são específicos aos seus hospedeiros (COHEN, 2006), onde uma única espécie de endófito

pode ser capaz de se associar a uma grande variedade de vegetais. Além disso, fungos da

mesma espécie podem produzir substâncias diferentes, dependendo de qual parte da planta ele

foi isolado (CARROLL; PETRINI, 1983; WEARN et al. 2012).

Isso indica que organismos endófitos da mesma espécie que são isolados de plantas de

diferentes famílias e classes possuem condições ecológicas e geográficas totalmente distintas

(PETRINI et al., 1986). A relação planta-endófito não é necessariamente simbiótica. Uma

hipótese bem aceita de Schulz (et al., 2002) postula que a interação entre os dois organismos é

caracterizada por um equilíbrio sintonizado por milhões de anos de evolução entre a

virulência do fungo e as defesas da planta.

Devido aos endófitos serem possivelmente patógenos latentes, eles podem ser

influenciados por certos fatores ambientais intrínsecos para expressar características que

levam à patogenicidade (ARNOLD, 2005). Por exemplo, o endófito Epichloe festucaeis

possui genes que, ao serem ativados por stress nutricional, pode transformar sua associação

mutualística com seu hospedeiro Lolium perene e se tornar um patógeno (EATON et al.,

2011).

A sintonia criada nessa interação planta-endófito é tamanha, que em 2008, Moricca e

Ragazzi (2008) demonstraram que ela é controlada pelos genes dos dois organismos e

modulada pelo ambiente em que se encontram. Essa coevolução dos mecanismos bioquímicos

tem como consequência a biossíntese concomitante de substâncias entre planta e endófitos,

tornando endófitos isolados de plantas medicinais uma provável fonte com alto rendimento de

metabolismos biologicamente ativos (WEBER et al., 2004).

3.4 Fungos endofíticos como fonte de novos compostos bioativos

Fungos endófitos são capazes de sintetizar compostos bioativos que são usados pelas

plantas para defesa frente a patógenos, e alguns desses compostos se mostraram úteis para a

descoberta de novos fármacos. Estudos recentes relataram centenas de produtos naturais

produzidos por esses microrganismos, incluindo alcaloides, terpenoides, flavonoides e

21

esteroides (NAIR; PADMAVATHY, 2014). A maioria desses compostos é conhecida pelas

suas funções antibióticas, imunossupressoras, anticâncer, agentes de controle biológico, entre

outras atividades.

Como exemplos da grande contribuição dos fungos endofíticos em fornecer moléculas

bioativas, temos o Paclitaxel, comercialmente conhecido como Taxol (ROWINSKY;

DONEHOMER, 1995) (1). Medicamento usado para tratar o câncer de mama, de ovários e de

pulmão, sendo essa substância isolada pela primeira vez das folhas da planta Taxus brevifolia,

uma conífera da América do Norte. No entanto, hoje em dia se sabe de muitos endófitos que

também são capazes de a sintetizar; o fungo Metarhizium anisopliae, isolado da planta Taxus

chinensis, produz taxol em abundância quando cultivado in vitro. Colletotrichum

gloeosporioides, isolado de folhas da planta medicinal Justicia gendarussa, também produz

taxol (KUSARI et al., 2012).

Huperzine A (Hup-A) (2), um alcaloide licopódio, foi originalmente isolada da planta

Huperzia serrata, e atraiu grande atenção pelo seu papel na inibição de acetilcolinesterase,

com uso promissor no combate ao mal de Alzheimer. Cerca de 120 linhagens de fungos

endofíticos foram isolados da H. serrata, e 9 dessas linhagens produziram Hup-A. Dois novos

agentes anti-tuberculose, as benzopiranonas diaporteona A (3) e B (4), foram isoladas do

fungo endofítico Diaporthe sp. P133, isolada das folhas do vegetal Pandanus maryllifolius

(MA; GANG, 2004).

22

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

Brefeldina A (5) é uma lactona macrociclica sintetizada do palmitato pelo fungo

endofítico Cladosporium sp. da planta Quercus variabilis, que inibe a secreção de proteína

nas células, e é um poderoso agente antiviral (KUSARI et al., 2012). Nove metabólitos

bioativos foram isolados do endófito Alternaria alternata, associado à espécie Maytenus

hookeriand, e foram caracterizados por RMN como alternariol (6), éter alternariol

monometílico (7), 5’-epialtenueno (8), altenueno (9), uridina (10), adenosina (11), ACTG

toxina-E (12), ergosta-7,24(28)-dien-3-ol (13), e ergosta-4,6,8,22-retraen-3-ona (14) do

extrato desse fungo, a maioria sendo substâncias inéditas (NAIR; PADMAVATHY).

23

(6)

(7)

(8)

(9)

(10)

(11)

(12)

24

(13)

(14)

(15)

Endófitos que residem em gramíneas são conhecidos pela sua capacidade de produzir

alcaloides pirrolizidínicos, que exibem efeitos tóxicos frente a invertebrados e vertebrados

herbívoros, possivelmente envolvendo a proteção da grama hospedeira (SCHARDL;

SELOSSE, 2007). Substâncias comumente associadas à reação da planta frente a ação de

herbívoros já foram relatadas como metabólitos produzidos por fungos endofíticos, como o

resveratrol (15), encontrado em fungos endofíticos do gênero Acremonium (HATCH; HAILE,

2012).

25

3.5 A gramínea Axonopus leptostachyus

Esta espécie vegetal é conhecida popularmente como capim imperial, pasto imperial

ou palha branca (Figura 1), de ampla ocorrência na América do Sul. O gênero Axonopus é em

grande parte Neotropical, distribuído do sul dos Estados Unidos até a região central da

Argentina. Brasil, Venezuela e Colômbia são os países onde mais espécies estão concentradas

(ZULOAGA et al., 2007), ocorrendo em maior parte em florestas secas e úmidas, áreas

degradadas, relvados, e campos cultivados (BLACK, 1963). O centro de diversidade do

gênero, e talvez sua origem, se encontra na parte central do Brasil (HICKENBICK et al.,

1975).

Muitas espécies do gênero, como Axonopus leptostachyus, A. compressus, A.

fissifolius, A. scoparius, A. purpussi, e A. suffultus possuem importância econômica, com

extenso uso como alimento de gado (LÓPEZ; MORRONE, 2012). A identificação de espécies

desse gênero, no entanto, muitas vezes esbarra na sua complicada taxonomia. Segundo

Giraldo-Cañas (2012), isso faz com que seja difícil determinar claramente alguns exemplares,

com muitos botânicos utilizando determinações taxonômicas equivocadas e confundindo

espécies de Axonopus entre si, e às vezes com espécies de outros gêneros, como Digitaria e

Paspalum. Há grande uniformidade de caracteres morfológicos, uma vez que existem apenas

diferenças interespecíficas, tanto nos órgãos vegetativos quanto nas espigas.

Figura 1 – Espécie vegetal Axonopus leptostachyus (Flüggé) Hitchc.

26

Na literatura não foram encontrados estudos químicos sobre os metabólitos produzidos

por essa espécie vegetal. Todavia, Gubiani, (et al., 2019) isolaram as substâncias ácido (E)-5-

hidroxi-3-metil-pent-2-enóico (16), Koninginin D (17) e Giluterrina (18) de fungos

endofíticos associados às raízes da A. leptostachyus. A Giluterrina apresentou atividade

citotóxica seletiva frente as culturas de carcinomas de rins e próstata.

(16)

(17)

(18)

3.6 Fungos da Ordem Magnaporthales

A Ordem Magnaporthales pertencente à classe Sordiariomycetes e ao Filo

Ascomycota. Contém patógenos importantes presentes em cereais e gramíneas, como

exemplo o fungo patógeno de arroz Pyricularia oryzae (Magnaporthe oryzae), o patógeno de

cereais Gaeumannomyces graminis, o patógeno que afeta o caule do arroz Nakataea oryzae

(Magnaporthe salvinii) e o patógeno de gramíneas forrageiras Magnaporthiopsis poae

(CANNON, 1994; THONGKANTHA et al., 2009). De acordo com Zhang (et al., 2016),

foram descritas por volta de 200 espécies de Magnaporthales, sendo aproximadamente 50%

delas patógenas de monocotiledôneas domesticadas e selvagens.

Avanços recentes no sequenciamento de genes, transcriptomas e genomas de fungos

dessa Ordem resultaram em filogenias robustas, que correspondem com a patogenicidade,

27

ecologia e biologia dessas espécies. No entanto, as filogenias entram em conflito com certos

conceitos genéricos tradicionais baseados na morfologia. Magnaporthe e Gaeumannomyces,

por exemplo, mostraram ser polifiléticos. A revisão desse táxon foi assunto em publicações

recentes (LUO; ZHANG, 2013; KLAUBAUF et al., 2014; LUO et al., 2015), evidenciando

que a identificação de indivíduos dessa ordem a nível de gênero deve se utilizar de

ferramentas providas pela Biologia Molecular para se adequar ao preconizado pela literatura

taxonômica atual.

28

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Descrição dos materiais utilizados

4.1.1 Meios de cultura

O cultivo do endófito foi realizado com o meio de cultura Batata Dextrose Agar

(Acumedia®). O caldo Müller Hinton Cátion-Ajustado (HiMedia®) foi utilizado nos ensaios

de atividade antibacteriana. Para cultura de carcinoma colorretal humano, foi utilizado meio

RPMI 1640 (ThermoFischer Scientific), suplementado com 20% de soro bovino.

4.1.2 Reagentes

Foi utilizado água destilada no preparo dos meios de cultura; acetato de etila 99,5%

(QUEMIS®) no processo de extração a partir da maceração do bolo micelar. Para verificar a

seletividade da separação de substâncias por CCDC e CCA foram utilizados: metanol 99,5%;

éter etílico 99,5%; hexano 99,5%; clorofórmio 99,5%; diclorometano 99,5%, e acetato de etila

99,5%, todos da marca QUEMIS®. Nas leituras em CLAE foi utilizado álcool metílico de

grau-HPLC (99,8%) QUEMIS®. Para a Ressonância Magnética Nuclear foi utilizado o

solvente deuterado CH3OH-d4 da Cambridge Isotope Laboratories. Para solubilização de

amostras durante os ensaios biológicos, foram utilizados dimetil sulfóxido 99,5% (Synth) e

MTT (Sigma-Aldrich Chemical Co.).

4.1.3 Adsorventes cromatográficos

Foram utilizadas cromatoplacas de sílica de fase normal AL SIL G/UV254

(Whatman®), 20x20 cm em experimentos de Cromatografia em Camada Delgada

Comparativa (CCDC). As manchas foram visualizadas em câmara de UV nos comprimentos

de onda 254 e 365 nm. Para cromatografia em coluna aberta (CCA) foi utilizado o adsorvente

sílica de fase normal (40-63 µm, 230-400 mesh) SiliaFlash® F60 (SILICYCLE UltraPure

SILICA GELS).

4.2 Equipamentos

4.2.1 Cultivo dos endófitos e obtenção do extrato

A autoclave de 30 L (PHENIX®, modelo AV-30) foi utilizada para a esterilização dos

meios de cultura e demais materiais. O plaqueamento e inoculação dos endófitos em meio de

cultura foi realizada em capela de fluxo laminar (marca FILTRACOM®, modelo microflow

675 AC). Na estufa da marca Nova Ética, sucedeu a etapa de cultivo dos microrganismos.

29

Para a extração e solubilização do extrato bruto foi utilizado o aparelho de ultrassom

(UNIQUE®, modelo USC-1400, 40kHz). Para a concentração das amostras utilizou-se

rotaevaporador (marca Fisatom®, modelo 801), em conjunto com bomba a vácuo (marca

PRISMATEC®, modelo 132B), banho termostático (marca Fisatom®, modelo 550) e

circulador refrigerado (marca Ética®, modelo 521). A pesagem das massas dos extratos e

frações foi feita em uma balança analítica (marca SHIMADZU, modelo AUY220).

4.2.2 Cromatógrafos

Os cromatógrafos utilizados foram o Prominence UFLC modelo LC-20AD do

fabricante Shimadzu com o detector DAD operando de 200 a 450 nm, e Prominence HPLC

modelo LC-6A do fabricante Shimadzu com o detector Ultravioleta-Visível.

4.2.3 Ressonância Magnética Nuclear

A técnica de espectroscopia de RMN foi realizada em equipamento Bruker Avance

600, operando com uma crio-sonda em 600 MHz para o núcleo de 1H e a 150 MHz para o

núcleo de 13C. Os experimentos foram analisados utilizando os softwares TopSpin e

MestReNova.

4.3 Métodos

4.3.1 Coleta do material vegetal

As folhas da gramínea “Axonopus leptostachyus”, espécie existente no

Cerrado/Pantanal de Mato Grosso, foram coletadas no município de Poconé, em abril de 2012

para o isolamento de fungos endofíticos. O exemplar da espécie está depositado no Herbário

da UFMT sob o número 40.492. Etapa realizada pelo grupo do Prof. Dr. Marcos Antônio

Soares – ICBS/UFMT.

4.3.2 Isolamento e purificação dos endófitos

Para o isolamento dos fungos endofíticos as folhas foram submetidas à desinfestação

superficial através da imersão em água de torneira com detergente neutro (1%), agitação

orbital a 150 rpm por cinco minutos, e enxague com água destilada. Em seguida foram

imersas sequencialmente em álcool 70% por um minuto, hipoclorito de sódio 2,5% por três

minutos, álcool 70% por trinta segundos e enxaguadas três vezes em água destilada

esterilizada. O excesso de humidade foi retirado com papel de filtro estéril. As folhas foram

30

cortadas em 1 cm2 e colocadas em uma placa de Petri contendo o meio BDA. O crescimento

fúngico foi acompanhado durante 15 dias e o micélio emergente foi transferido para uma nova

placa de Petri, contendo BDA. Foram isoladas 48 linhagens, preservadas em BDA e

armazenadas no Laboratório de Bioprospecção no Núcleo de Pesquisas do Cerrado (NUPEC).

Etapa realizada pelo grupo do Prof. Dr. Marcos Antônio Soares – ICBS/UFMT.

4.3.3 Classificação dos endófitos

As linhagens puras foram classificadas no Instituto de Biociências da Universidade

Federal de Mato Grosso, sob a responsabilidade do Prof. Dr. Marcos Antônio Soares.

Os fungos endofíticos foram agrupados em morfotipos seguindo a metodologia

empregada por Lacap (2003). Para confirmação do agrupamento, observaram-se

características microscópicas através de lâminas permanentes obtidas do microcultivo (Kern;

Blevins, 1999). A extração de DNA de um representante de cada grupo morfológico foi

realizada com o kit Axygen (Bioscience USA) de acordo com recomendações do fabricante.

A classificação molecular foi realizada pelo sequenciamento parcial dos genes 26S rDNA

(domínio D1/D2), ITS (espaçador interno transcrito) e β-tubulina. Os fragmentos

amplificados foram purificados e sequenciados. Em seguida, a sequência obtida foi

comparada com o banco de dados GenBank através da ferramenta nBLAST

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os morfotipos isolados de Axonopus leptostachyus

encontram-se depositados no GenBank com o código KJ439111KJ439180.

4.3.4 Triagem biológica: atividade antibacteriana através de Antibiose

Quarenta e oito linhagens de fungos endofíticos se demonstraram viáveis após a

preservação, sendo então reativadas em meio BDA, em placas de Petri, e cultivadas a 37ºC

por sete a quinze dias, em duplicata. Após crescimento, os micélios (junto com o BDA) foram

perfurados com furador cilíndrico (8 mm ), e transferidos individualmente ao centro de

outra placa de Petri com BDA, com a face do micélio voltado para cima, e conduzidos para

estufa a 37ºC até que os fungos crescessem aproximadamente 30 mm de diâmetro.

Simultaneamente ao crescimento dos endófitos, foram preparados ágar Müller-Hinton,

inoculadas as bactérias (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922,

Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 e Enterococcus

faecalis ATCC 29212), e cultivadas a 37ºC por 24 horas. Após esse período, as colônias

foram coletadas e transferidas em água destilada estéril para padronizar as suspensões,

31

seguindo a escala de 1,0 de MacFarland. As suspensões ajustadas foram semeadas (100 L)

com swab estéril nas placas de Petri contendo os fungos endofíticos, refrigeradas a 4oC por 4

horas, e levadas à estufa microbiológica a 37 oC, sendo medido o halo de inibição (mm) ao

redor dos endófitos, após 24 horas (PONTES; ESCHER, 2014).

DI: Diâmetro do halo de inibição

DM: Diâmetro do crescimento Micelar

EI: Evolução da inibição (EI= DI – DM)

Figura 2 – Interpretação para as medições de halos de inibição e crescimento micelial no

bioensaio.

4.3.5 Método de seleção do endófito bioativo

Com base nos dados de inibição apresentados pelos endófitos, foi proposto pelo grupo

de pesquisa (NUNES, NEPONUCENO, TELES et al., 2019) uma semiquantificação que

categorize a atividade antimicrobiana, baseando-se na classificação proposta por Matsuura

(2004).

Formula proposta para o cálculo e obtenção da semiquantificação da atividade

antimicrobiana:

X% = [(DI x 100) / DM] – 100

Sendo:

Limite final da placa

de Petri

Zona de crescimento micelar

Fronteira do halo de inibição

DI

DM EI EI

Bloco de Gelose

(Micélio + meio

BDA)

Diâmetro de 8

mm

Zona de crescimento dos

patógenos

(Bactérias e Candidas)

Zona de inibição

32

X%: porcentagem de evolução da área de inibição;

DI: Diâmetro do halo de inibição;

DM: Diâmetro do crescimento micelar;

Tabela 1 – Proposta para a semiquantificação da atividade antimicrobiana apresentada pelos

fungos endofíticos.

Ausente: X < 17% (-)

Baixa: 17% X 67% (+)

Moderada: 68% X 133% (++)

Alta: > 134% (+++)

De acordo com a inibição de crescimento observada nos ensaios de antibiose frente às

bactécias patogênicas em humanos, foi selecionado para bioprospecção de seus metabólitos

especiais o fungo P90 Magnaporthales sp. devido ao halo de inibição exibido frente a E.

faecalis.

4.3.6 Cultivo do microrganismo P90 Magnaporthales sp.

O fungo selecionado foi cultivado em duas placas de Petri (12 cm ) em meio BDA

esterilizado em autoclave (120°C – 20’), e incubado por 15 dias em temperatura ambiente.

Em seguida, o meio e micélio foi cortado em blocos (8 mm), transferido para o centro de

cinquenta placas de Petri de mesmo tamanho (meio BDA, 20 mL por placa) e cultivado

novamente por 15 dias em temperatura ambiente.

4.3.7 Obtenção do extrato bruto

Após o período de crescimento do fungo, o meio de cultura e micélio foram cortados

aleatoriamente e transferidos para Erlenmeyers 500 mL contendo 20 mL de acetato de etila

(AcOEt) / placa de fungo, onde permaneceram por 24 horas em maceração usando mesa

giratória orbital (200 rpm, 35°C). A fase sobrenadante foi filtrada e seca em evaporador

rotatório para obter o extrato bruto AcOEt (BHARDWAJ, 2015). O mesmo procedimento foi

realizado sem microrganismo, inoculado para o controle negativo.

33

4.3.8 Isolamento dos metabólitos

Para o isolamento e purificação dos metabólitos produzidos pelo fungo P90 foram

abordadas diferentes técnicas cromatográficas, descritas abaixo.

4.3.8.1 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC)

Para as separações em camada delgada foi avaliada a capacidade de resolução das

manchas (substâncias) cromatográficas utilizando diferentes sistemas de eluentes, incluindo

misturas entre solventes como AcOEt, CH2Cl2, CHCl3 e Et2O, com diferentes proporções de

MeOH (maior capacidade de eluição) e Hexano (menor capacidade de eluição) em placas com

sílica de fase normal, como fase estacionária. As placas foram visualizadas em Câmara Escura

c/ Transluminador UV (254 e 365 nm) para averiguar a capacidade de eluição da fase móvel

(SHUSTERMAN, 1997).

4.3.8.2 Cromatografia em Coluna Aberta (CCA)

O extrato selecionado foi fracionado em coluna aberta de vidro (diâmetro da coluna:

3,5 cm, altura da fase estacionária: 15 cm), utilizando o sistema de solvente

MeOH:CHCl3:Hex (1:4:5) como fase móvel e sílica de fase normal como fase estacionária

(Figura 3), sendo as frações monitoradas por CCDC.

Figura 3 – Fracionamento do extrato do fungo P90 Magnaporthales sp. por

Cromatografia em Coluna Aberta

34

4.3.8.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

Concomitantemente aos testes em CCDC, o extrato foi preparado para analise em

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detector de Arranjo de Diodos (CLAE-DAD).

Para isso, foi solubilizado em solução hidrometanólica [MeOH:H2O (95:5)] à 10 mg/mL e

submetido ao processo de extração em fase sólida (clean-up) utilizando um cartucho “Sep-

Pak” (SPE) com 1g de sílica gel de fase reversa (C18), eluido com 1 mL. A amostra foi

analisada em sistema analítico padronizado nas seguintes condições:

a) Concentração: 10mg/mL (desconsiderando a retenção no cartucho SPE)

b) Faixa de comprimentos de onda: entre 200-400 nm

c) Coluna: sílica C18

d) Fluxo: 1mL x min-1

e) Volume de injeção: 20 µL

f) Método de gradiente exploratório (MeOH:H2O [5:95] – [100:0] 40’)

O mesmo método foi utilizado para analisar as frações resultantes da separação em

CCA. Aquelas consideradas mais promissoras, tendo em vista o perfil cromatográfico

(número de bandas, intensidade dos sinais, resolução e polaridade) e a quantidade de massa

obtida, foram encaminhadas para ensaios de atividade biológica.

4.3.9 Ensaios de atividade biológica das frações purificadas

Foi realizada a triagem para a atividade antibacteriana de 4 frações do extrato do fungo

P90 Magnaporthales frente às linhagens de bactérias Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Klebsiella

pneumoniae, Escherichia coli, Acinetobacter baumannii e Pseudomonas aeruginosa. O

resultado inicial guiou a execução de testes de Concentração Inibitória Mínima e

Concentração Bactericida Mínima. Ao mesmo tempo, as mesmas frações e frações similares

foram submetidas ao experimento de redução de biofilme frente à bactéria S. epidermidis, e

ensaio de atividade citotóxica frente à uma linhagem de carcinoma humano.

4.3.9.1 Triagem de atividade antibacteriana

As frações foram diluídas separadamente em DMSO para a preparação de uma

solução estoque 100 x concentrada (51,2 mg/mL). Posteriormente, a solução estoque foi

diluída 1:100 em caldo Müller Hinton Cátion Ajustado (MHCA). A partir disso, cada

35

composto foi testado a 512 μg/mL a 1% DMSO, ou na maior concentração em que foi

possível dissolver o composto sem que houvesse precipitação, de acordo com o preconizado

pelo CLSI (2017). A adição do inóculo foi realizada de acordo com CLSI (2015) para o

método de microdiluição em caldo.

Para o controle negativo e positivo, são adicionados caldo Müller Hinton Cátion

Ajustado 1% DMSO. No controle positivo foi adicionada bactéria sem o composto, para

observar seu crescimento em caldo Müller Hinton Cátion Ajustado 1% DMSO. No controle

negativo, foi utilizado o meio de cultura caldo Müller Hinton Cátion Ajustado 1% DMSO,

sem bactéria, para mostrar que não há contaminação do mesmo.

A incubação foi realizada a 37°C e a leitura visual dos resultados foi feita após 24h. A

ausência de crescimento bacteriano indicou um resultado positivo, evidenciando a atividade

antibiótica na concentração testada. Neste caso, a concentração inibitória mínima pode ser

512 μg/mL ou menos (≤ 512 μg/mL). Quando houve crescimento bacteriano, a triagem foi

considerada negativa, sem atividade antibacteriana na concentração testada. A triagem

negativa não exclui a possibilidade de o composto apresentar atividade antibacteriana em

concentrações maiores, por isso, o resultado é expresso como “> 512 μg/mL”. Os testes foram

realizados em duplicata. As frações que obtiveram resultado de triagem positivo (≤ 512

μg/mL) foram encaminhadas para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e

da concentração bactericida mínima (CBM). Etapa realizada no Laboratório de Epidemiologia

e Microbiologia Molecular (LEMiMo), USP – São Carlos, pelo grupo da Profa. Dra. Ilana L.

B. C. Camargo.

4.3.9.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

Para a determinação da CIM foram utilizadas todas as linhagens das espécies

bacterianas que se mostraram sensíveis à fração avaliada na etapa de triagem da atividade

antibacteriana. Cada fração foi diluída em DMSO para uma solução estoque 100x

concentrada, que posteriormente foi diluída 1:100 em caldo Müller Hinton Cátion Ajustado

(MHCA) segundo o CLSI (2013). A partir disso, cada fração foi testada em 512 μg/mL a 1%

DMSO, ou na maior concentração em que foi possível dissolver o composto sem que

houvesse precipitação. Dos poços do composto a 512 μg/mL partiram as diluições seriadas

(1:2) até a concentração de 0,06 μg/mL. A incubação foi feita a 37°C e a leitura visual dos

resultados após 24 horas, na qual se observou a menor concentração que o composto

conseguia inibir o crescimento do microrganismo. Para os controles negativo e positivo foram

adicionados caldo Müller Hinton Cátion Ajustado 1% DMSO. No controle positivo foi

36

adicionada bactéria sem o composto para observar seu crescimento em caldo Müller Hinton

Cátion Ajustado 1% DMSO. No controle negativo, há apenas o meio de cultura caldo Müller

Hinton Cátion Ajustado 1% DMSO, sem bactéria, para mostrar que não há contaminação do

mesmo. Os testes foram realizados em duplicata. Etapa realizada no Laboratório de

Epidemiologia e Microbiologia Molecular (LEMiMo), USP – São Carlos, pelo grupo da

Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo.

4.3.9.3 Determinação da Concentração Bactericida Mínima (CBM)

Após a leitura visual da CIM, inoculou-se 100 μL do conteúdo do poço equivalente a

CIM, em uma diluição acima e duas abaixo, em placa de MHCA-Ágar por técnica de

microgota, sem estriar. A placa foi incubada em estufa a 37°C por 24 horas, quando foi feita a

leitura visual para observar qual concentração não houve o crescimento bacteriano. Para a

diferenciação entre a atividade bactericida ou bacteriostática, os compostos que tiveram a

razão CBM/CIM menor ou igual a quatro foram considerados bactericidas, acima disso sendo

consideradas bacteriostáticas (PANKEY & SABATH, 2004). Etapa realizada no Laboratório

de Epidemiologia e Microbiologia Molecular (LEMiMo), USP – São Carlos, pelo grupo da

Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo.

4.3.9.4 Experimento de redução de biofilme

Foi avaliada a capacidade das frações na redução de biofilme formado por

Staphylococcus epidermidis ATCC 35984, uma linhagem conhecida por essa característica. Já

a linhagem de S. epidermidis ATCC 12228, não formadora de biofilme, foi utilizada no

ensaio como controle negativo. Todos as frações foram testadas na concentração de 512

µg/mL. As linhagens foram pré-cultivadas em 35 mL de caldo de infusão cérebro-coração

suplementado com 0,75% de glicose (m/V) a 37˚C. Alíquotas de 200 µL de suspensões

bacterianas foram incubadas em modo estático em microplacas de poliestireno de 96 poços de

fundo plano, a 37 ºC por 24 horas, para propiciar adesão bacteriana. Após a remoção das

células planctônicas, os poços foram lavados três vezes com tampão fosfato salino (PBS; pH

7,4), e as células foram posteriormente incubadas por mais 24 h, a 37 ºC, na presença de meio

recém preparado, para controle positivo e negativo, e meio recém preparado adicionado à

fração a 512 µg/mL nos poços com a linhagem formadora de biofilme. Posteriormente, as

células foram lavadas e submetidas a coloração com violeta de cristal (0,2% m/V) e

examinadas em leitor de microplacas a 600 nm, como descrito por Tendolkar (et al., 2004). A

comparação entre as linhagens S. epidermidis ATCC 12228 e S. epidermidis ATCC 35984 foi

37

feita com o teste t-Student bicaudal (p <0,05) para garantir que a formação do biofilme foi

bem-sucedida. A análise de variância unidirecional (ANOVA) foi utilizada para comparar os

valores de absorbância de S. epidermidis ATCC 35984 tratada e não tratada, sendo

considerada uma redução estatisticamente significativa quando p <0,05. O estudo foi

realizado em 12 réplicas. Etapa realizada no Laboratório de Epidemiologia e Microbiologia

Molecular (LEMiMo), USP – São Carlos, pelo grupo da Profa. Dra. Ilana L. B. C. Camargo.

4.3.9.5 Análise de citotoxicidade

A citotoxicidade das frações foram analisadas através do ensaio colorimétrico de MTT

[3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] para medir a atividade de enzimas

mitocondriais, com o monitoramento da formação de Formazan, de coloração púrpura a 570

nm, formado como produto de redução enzimática do MTT com coloração amarela. Foram

plaqueadas 6 x 103 células de HCT116 (linhagem de carcinoma colorretal humano) por poço,

em placas de 96 poços (3 x 104 células /mL em 200 μL de meio RPMI 1640). Após 24 horas,

as frações foram adicionadas em concentrações de 5 e 50 μg/mL, em duplicatas, e incubadas

por 72 horas. A doxorrubicina foi utilizada como controle positivo e dimetilsulfóxido

(DMSO) com controle negativo. Após 72 horas de incubação, o sobrenadante foi substituído

por meio de cultura contendo MTT (0,5 mg/mL). Após três horas, o sobrenadante foi

removido, a placa foi seca, o precipitado contendo azul de formazana de MTT foi dissolvido

em 150 μL de DMSO, e a absorbância foi medida a 570 nm (MOSMANN, 1983). Etapa

realizada no Laboratório de Farmacologia de Produtos Naturais Marinhos, dentro do

Departamento de Farmacologia da USP – São Paulo, pelo grupo da Profa. Dra. Leticia Veras

Costa Lotufo.

4.3.10 Elucidação estrutural das substâncias por espectrometria de Ressonância

Magnética Nuclear (RMN)

A determinação estrutural dos metabólitos isolados foi realizada através da técnica

espectrométrica de Ressonância Magnética Nuclear. As substâncias purificadas foram

solubilizadas em 200 µL de CD3OD, transferidas a tubos de RMN de 3 mm, e submetidas aos

experimentos de RMN 1H e 13C, em alto campo com experimentos uni e bidimensionais

(gCOSY, gHMBC, gHSQC, entre outros).

38

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Seleção e obtenção do extrato bruto do endófito

O fungo P90 Magnaporthales sp. foi selecionado para bioprospecção devido sua

inibição potencial frente a E. faecalis. O endófito apresentou EI (Evolução da Inibição) de 40

mm (266,66% de inibição), correspondendo a uma alta atividade antimicrobiana (NUNES;

NEPONUCENO; TELES, et al., 2019). Ao fim do processo de extração, este endófito

produziu 501,1 mg de extrato bruto AcOEt.

5.2 Classificação do fungo

A linhagem endofítica P90 Magnaporthales sp. encontra-se depositada no GenBank

com o código KJ439176.

5.3 Estudo químico do fungo P90 Magnaporthales sp.

5.3.1 Fracionamento cromatográfico e purificação

O esquema da Figura 4 demonstra o fracionamento cromatográfico do extrato bruto

(AcOEt) P90 Magnaporthales e o isolamento de substâncias através de CCA e CLAE. A

análise das frações reunidas e seu desenvolvimento cromatográfico permitiram a separação de

quatro substâncias com relativa pureza: tr16’, tr17’, tr30’ e tr42’. As substâncias foram

encaminhadas para experimentos de RMN para possível identificação estrutural.

39

Figura 4 – Organograma do fracionamento do extrato bruto AcOEt do fungo P90

Magnaporthales.

* L indica fração coletada durante o processo de limpeza da coluna

5.3.2 Caracterização da substância L1 (tr 16’)

A fração “L1” foi purificada em CLAE-DAD semipreparativo, resultando no

isolamento da substância tr 16’, que apresentou aparente grau de pureza e banda de alta

absortividade molar (Figura 5).

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min

-250

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

mAUExtract-250nm,4nm (1.00)

Figura 5 – Cromatograma da fração “L1” em CLAE analítica. Grad. exp. MeOH:H2O

(5:100)-(100:0) 40’, em 250 nm. Destaque para a banda simétrica no tr 16’.

A substância tr 16’ foi submetida aos experimentos de RMN unidimensional 1H

(Figura 6 e 7) e 13C (Figura 8) e bidimensional (HSQC), no entanto, os dados ainda estão

sendo trabalhados para a elucidação estrutural. O espectro apresenta um conjunto de sinais de

hidrogênios desblindados entre 8,7 a 7,5 ppm, caracterizando a presença de um sistema

aromático.

40

Figura 6 – Espectro de RMN 1H (600 MHz/CD3OD) da substância tr 16’ (L1) de P90,

obtido com 0,7 mg em tubo de 3 mm.


substância tr 16’ (L1) de P90.

Figura 8 – Espectro de RMN 13 C (150 MHz/CD3OD) da substância tr 16’ (L1) de P90,

obtido com 0,7 mg em tubo de 3 mm.

41

5.3.3 Caracterização da substância F51-80 (tr 17’)

A fração “F51-80” foi purificada em CLAE-DAD semi-preparativo, resultando no

isolamento da substância tr 17’, que apresentou aparente grau de pureza e banda de alta

absortividade molar (Figura 9).

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min

0

250

500

750

1000

1250



MeOH:H2O (5:100)-(100:0) 40’, em 250 nm. Destaque para a banda simétrica no tr 17’

A substância tr 17’ foi submetida aos experimentos de RMN 1H (Figura 10) e 13C

(Figura 11) e bidimensionais COSY, HSQC e HMBC, cujos dados ainda estão sendo

trabalhados para a elucidação estrutural. O espectro apresenta uma baixa relação sinal/ruido,

caracterizando a pureza da substância. O conjunto de sinais de hidrogênios desblindados

entre 8,7 a 7,5 ppm, também caracterizam um sistema aromático


P90, c/ supressão de solvente CD3OD em 4,887 e 4,183, obtido com 4,0 mg em tubo de 3

mm.

42


P90, obtido com 4,0 mg em tubo de 3 mm.


A fração “F16-30” foi purificada em CLAE-DAD semipreparativo, resultando no

isolamento da substância tr 30’ (Figura 12).

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min

-100

0

100

200

300

400

500

600

700mAU

Extract-272nm,4nm (1.00)


MeOH:H2O (5:100)-(100:0) 40’ em 272 nm. Destaque para a banda simétrica no tr 30’.

A substância tr 30’ apresentou em seu espectro de RMN 1H (Figura 13 e 14) dois

sinais em 6,3 e 5,2 ppm, característicos de hidrogênios em carbonos insaturados. O

espectro de RMN 13C (Figura 15) revelou um conjunto de sinais entre 150 a 118 ppm,

identificando os carbonos sp2. Os demais sinais ainda estão sendo trabalhados para a

elucidação estrutural.

43



Figura 14– Ampliação ( 3,7 – 1,9) do espectro de RMN 1H (600 MHz/CD3OD) da

substância tr 30’ (F16-30) de P90.



44


A fração “F6-15” foi purificada em CLAE-DAD semi-preparativo, resultando no

isolamento da substância tr 42’ (Figura 16).

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 min

0

100

200

300

400

500

600


Figura 16 – Cromatograma da fração “6-15” em CLAE analítica. Grad. exp.

MeOH:H2O (5:100)-(100:0) 40’ em 273nm. Destaque para a banda simétrica no tr 42’

A substância tr 42’ foi submetida aos experimentos de RMN 1H (Figura 17 a 19) e

13C (Figura 20) e bidimensional HSQC, cujos dados ainda estão sendo trabalhados para a

elucidação estrutural. O espectro apresenta um conjunto de sinais entre 3,7 a 3,3 ppm com

integração desproporcional, caracterizando a presença de impurezas. Os sinais observados

entre 5,5 a 5,2 ppm revelam hidrogênios olefínicos, confirmados pelos carbonos entre

140 a 130 ppm.


P90, c/ supressão de solvente CD3OD em 4,887 e 3,301, obtido com 4,1 mg em tubo de

3 mm.

45





46



5.4 Ensaios de atividade biológica das frações purificadas

As frações mais promissoras foram encaminhadas para ensaios de atividade biológica.

Para os ensaios de atividade antibacteriana, foram encaminhadas as frações “F16-30” e “L1”,

devido a maior pureza e quantidade de massa obtida.

5.4.1 Ensaios de triagem inicial de atividade antibacteriana

Conforme demonstra a tabela 2, as frações apresentaram, em sua maior parte,

inatividade frente às linhagens de bactérias testadas. Apenas a fração “L1” apresentou

atividade frente à bactéria E. faecium ATCC 700221.

47

Tabela 2 – Atividade antibacteriana das frações “F16-30” e “L1” a 512 µg/mL.

Linhagens bacterianas

Resultado (µg/mL)

“F16-30” “L1”

S. epidermidis

ATCC 35984 - -

S. aureus

ATCC 25923 - -

E. faecalis

ATCC 29212 - -

E. faecium

ATCC 700221 - +

K. pneumoniae

ATCC 700603 - -

E. coli

ATCC 25922 - -

A. baumannii

ATCC 19606 - -

P. aeruginosa

ATCC 27853 - -

(-) Atividade ausente; (+) atividade presente na concentração testada.

Tabela 3 – Resultado da CIM e CBM da fração “L1” (substância tr 16’ majoritaria).

Linhagens bacterianas

CIM (µg/mL) CBM (µg/mL) CBM/CIM Atividade

E. faecium ATCC 700221 512 N.D. N.D. N.D.

(N.D.) Não definido.

Compostos com atividade antibacteriana são aqueles que obtiveram o valor ≤ 512.

Dessa forma, somente a fração “L1” mostrou atividade antibacteriana, frente à bactéria E.

faecium. A atividade antibacteriana apresentada pela fração “L1” não se repetiu em testes

subsequentes de CIM (Tabela 3), possivelmente devido a degradação do composto na solução

de estoque (DMSO), ou um resultado falso positivo no ensaio preliminar. Desta forma,

nenhuma das frações demonstrou atividade bacteriostática.

Apesar do endófito ter sido selecionado para bioprospecção devido a atividade

observada em triagem frente à E. faecalis, nenhuma das frações testadas apresentou atividade

frente essa bactéria em ensaios subsequentes. Possíveis motivos incluem: a atividade estar

48

presente em frações não testadas; metodologia diferente entre ensaios; endófito cultivado em

diferentes condições na etapa de triagem (cultivado junto à bactérias) e em maior escala (sem

a presença de bactérias); bioquímica do fungo desconhecida; atividade sinergética entre

substâncias; linhagens diferentes de bactérias E. faecalis entre os ensaios; concentração muito

baixa de substância nas frações testadas, entre outros (KUSARI et al., 2012).

5.4.2 Experimento de redução de biofilme

S. epidermidis ATCC 35984 é uma linhagem caracterizada pela sua facilidade para

formar biofilme, enquanto S. epidermidis ATCC 12228 não. A comparação da formação de

biofilme entre elas apresentou diferença significativa com p < 0,0001. A capacidade de

erradicação do biofilme formado pela S. epidermidis ATCC 35984 foi analisada para as

frações “F16-30” e “L1” a 512 µg/mL (Tabela 4) (Figura 21). Nenhum composto foi capaz de

erradicar significativamente o biofilme formado.

Tabela 4 – Capacidade de redução do biofilme formado por Staphylococcus epidermidis

ATCC 35984.

Fração % de redução a 512 μg/ml

“L1” (Substância tr 16’ majoritária) N.D.

“F16-30” (Substância tr 30’ majoritária) N.D.

49

Figura 21 – Quantidade de biofilme da S. epidermidis ATCC 35984 depois de tratado

com as frações “L1” e “F16-30” a 512 µg/mL. A linhagem 12.228 é o controle positivo, e

a linhagem 35.984 é o controle negativo.

As frações “F16-30” e “L1” não reduziram a formação de biofilme da S.

epidermidis, quando dissolvidas em DMSO a 512 µg/mL. Desta forma, utilizar as

frações em concentrações maiores apresenta-se inviável neste ensaio. Carneiro (et al.,

2011) descreveu que frações obtidas do extrato de Croton nepetaefolius foram

incapazes de reduzir a formação do biofilme de bactérias na concentração de 500

µg/mL, sendo classificadas como “não promissoras”.

5.4.3 Análise de citotoxicidade

Para a avaliação da citotoxicidade, todas as quatro frações foram testadas, onde “L1”,

composto majoritariamente pela substância tr 16’ e “F16-30”, composto majoritariamente

pela substância tr 30’, apresentaram inibição do crescimento celular superior a 75%, na

concentração de 50 g/mL em linhagem de carcinoma de colorretal humano (HCT116)

(Tabela 5; Figura 22).

50

Tabela 5 – Inibição do crescimento celular (%) dos extratos e frações em linhagem de

carcinoma de colorretal humano (HCT116), com as concentrações de 5 g/mL e 50 g/mL

(média ± SEM) (n=3)

Substâncias

Inibição de Crescimento Celular (%)

5 g/mL 50 g/mL

Média SEM Média SEM

F6-15 [Fração] 24,82 5,86 70,60 8,15

F16-30 [Fração] 29,48 6,48 93,07 4,51

F51-80 [Fração] 7,51 2,91 47,64 11,77

L1 [Fração] 0 8,55 85,72 6,59

Figura 22 – Inibição do crescimento celular (%) dos extratos e frações em linhagem de


g/mL (média ± SEM) (n=3).

Após 72h de incubação, as frações “F16-30” e “L1” apresentaram, em média, inibição

de crescimento celular de 93,07% e 85,72%, respectivamente, frente à linhagem de carcinoma

colorretal humano HCT116, quando testadas na concentração de 50 g/mL. Isso sugere que

as substâncias tr 30’ (majoritária em “F16-30”) e tr 16’ (majoritária em “L1”) podem ser as

responsáveis pelas atividades detectadas. Tragulpakseerojn (et al., 2017) conseguiu resultados

semelhantes (>IC75) em ensaio MTT de frações do extrato de folhas da planta Moringa

51

oleifera frente à mesma linhagem HCT116, classificando essas atividades como

“significativa”. Contudo, é necessário a realização de novos ensaios com as substâncias

purificadas para confirmar a atividade observada.

52

6 CONCLUSÕES

O fracionamento cromatográfico do extrato bruto do fungo P90 Magnaporthales

resultou na purificação de quatro substâncias. Todas apresentaram sinais com boa resolução

em experimentos de RMN, e estão em processo de elucidação e identificação estrutural.

As frações “L1” e “16-30”, compostas majoritariamente pelas substâncias tr 16’ e tr

30’ respectivamente, apresentaram resultados de atividade biológica promissores,

principalmente em ensaios de viabilidade celular frente a culturas de carcinoma colorretal

humano. Já as frações “6-15” e “51-80” não apresentaram atividades antibacteriana ou

citotóxica.

O ensaio para detecção de atividade antibacteriana dos endófitos isolados da gramínea

Axonopus leptostachyus, que apontou P90 Magnaporthales sp. uma linhagem promissora para

estudos de bioprospecção, também evidenciou outras linhagens endofíticas como potencial

produtoras de substâncias bioativas, justificando futuros trabalhos de prospecção de seus

metabólitos.

Um importante passo a ser dado para o seguimento deste trabalho está na identificação

da espécie do fungo endofítico. A taxonomia da ordem Magnaporthales demanda a utilização

de ferramentas da biologia molecular para descrições que se enquadram no que é preconizado

pela literatura atual, e a identificação da espécie pode levar a um processo de desreplicação

mais robusto.

Os objetivos desse trabalho foram alcançados. A investigação de produtos naturais de

fungos endofíticos é enormemente promissora, e conta com desafios únicos. Grupos de

pesquisa com perfil multidisciplinar, com foco nas áreas de química e de biologia, são

essenciais para desvendar as muitas incógnitas que ainda acercam esse tipo de microrganismo,

como os impactos causados pelas variáveis de cultivo (meio de cultura, tempo de incubação,

temperatura), tipo de extração, escolha do solvente orgânico, impacto de stress ambiental,

técnicas de co-cultura, mecanismos bioquímicos envolvidos na produção de metabólitos, entre

outras.

53

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