Vol. 29 No . 3 Mayo-Junio de 1985 REV . SOC o QUIM . ME )

REVISION BIBLIOGRAFICA

BIOSINTESIS DE LA VINCRISTINA y DE LA VINE3LASTINA E N CA THARANTHUS ROSEUS 1

ROMERO CASTILLO PRIMITIVO*, M. ROBERT +, J . REYES** y VICTOR M. LOYOLA VARGAS* .

* Deptos. de Bioquímica Vegetal y **Farmacia y Productos Naturales, DEPg., Facultad de Química, UNAM, 04510, México, D.F. + Centro de Investigación Cie nt ífica de Yucatán .

I Con el patrocin i o económico del CONACyT dona ti vo PCCBNA -020845 .

RESUMEN

Las biosíntesis se los alca loid es diamétricos vinb lastina (VBL) y vincristina (VCR) provienen de la conden sación de la triptamina con la secologanina , las cua les producen la es­trictosidina , que es el intermediario clave de la biosíntesis de los alca loides indólicos. La condensac ión posterior de la cata rantina con la vindolina que son dos alca loides mono­méricos, da 3'3' -dehidrovinblas tina que es el intermediario clave de los alcaloides diméricos, dand o finalmente la VBL y la VCR . Se hace un aná lisis de las enzimas conocidas de la vía y de sus implicaciones biológicas.

SUMMARY The biosy nthesis of the dimeric alkaloids. vinb last ine

(VBL) and vincristine (VCR), takes pla ce when triptamine condenses with secologan ine, yielding stri ctosidine, a key intermediary in the sy nthesis of indolic alkaloids . The sub­seq uent condensation of catarantine and vindo line , both monomeric alkaloids, to produ ce 3',4 ' -dehydrovinblastine is the limiting step in order to obtain VBL and VCR . A de­tail ed analysis of the known enzymes of thi s pathway and its biological implications is done.

INTRODUCCION

Catharanthus roseus es una planta que co ntiene cas i to­dos los tipos de alcaloides derivados de l ind ol, y que ha sido estudiada ampliamente en los últimos 25 años . La impor­tanc ia de es tos alca loides radica en que son usados en forma amp li a en el tratamiento de varios cá nce res ya sea so los o combinados con otros fárm acos an ti ca ncer ígenos. La vin ­crist ina (VCR) y la vinblastina (VBL) difieren lige ramente en su es tructura. El grupo metilo del átu mo de la vindo­lina en la VI3L es substi tuido po r un grupo formilo en la VCR : pero ti enen diferencias profund as en su tox icidad. do­sis y actividad clínica (I , 2). En algunos casos, la VCR y la VBL posee n una activ id ad equiva lente (leucemia P-1 534 y asc itos S-180) y en o tros neoplasmas (sarcoma os teogén ico Ki dway, linfosarcoma Mecca. leucem ias P388. AK R y

B82 A), la VCR ha demostrado un mejor efec to citotóxico. mientras que la VBL ha sido más efec ti va que la VCR en el carcinoma asc ítico de Eh rI ich. en él tumor ase ít ien de Freund , en el carcinosarcoma Walker 256 y en elme!Jnoma BI6 (3).

La dosis y la toxicidad clínica tant o de I ~ VCR como de la VBL tambié;¡ son diferentes . La n e uro toxicid~d es el principal problema encontrado en el uso clínico de 1;] VCR , mientra s que la mielosupresión es el factor lillli tante con la VBL (4,5).

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Figura 1 . Biosíntesis de los aminoácidos aromaticos . EP. eritrosa ·4 · fosfato : PEP, fosfoenolp iruvato: DAHP, 7 -f osfo -2 -ceto ·3-deoxiarabi ­no-heptonato : DHQ, 5-dehldroQu inato: DHS , 5 -dehidroshikimato : SHK, shikimato; SHKP, shikimato · 5 · fosfato : 3 fosfo ·5-e nolpiruv i l sh ikimato : CHA, corismato : PP . prefenato : FP, fenilpiruvato: HFP, hidroxifenil p ir uvato . AN , antranilato . PRA , f os forribosil antranila· to; CPOP, carboxifeni l am ino+deoxi · ribulosa -5 -fosfato ; INGP , in do l · 3-gllcerol fosfato. I ,DAHP sin t asa : 2, DHQ sintasa; 3 , DHQ dehidra · tasa; 4, shikimato deshidrogenasa ; S, shikimato cinasa ; 6, PEPS sin ­tasa ; 7, corismato sintasa ; 8 , corismato mutasa ; 9 , prefenato dehid ra­tasa; 10 , 12 aminotra n sferasas ¡nespecificas ; 11 , prefenato deshidro­genasa; 13, antran ilato sintasa; 14 , antrani lato fosforribosiltransfe ­rasa ;

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BIOSINTESIS DE LOS ALCALOIDES MONOMERICOS El triptofano es el precursor biosintético de todos estos

alcaloides, pero excepto para los alcaloides más simples, es raro que sea la única fuente de carbono. Frecuentemente varios de los carbonos son suministrados por otra fuente, tal como un monoterpeno. Es la diversidad de estructuras re· sultan tes de este proceso lo que ha sido responsable en par­te del gran interés en la biosíntesis de los alcaloides indóli­cos durante los últimos 15 años.

La biosíntesis de l triptofano ctiverge de los precursores de la fenilalanina y de la tirosina en la conversión de coris­mato a antranilato (6). Estos precursores provienen a su vez de la eritrosa-4-fosfato y del fosfoenolpiruvato . La vía bio­sintética desde la eri trosa -4- fosfato y el fosfoenolpiruvato hasta la formación del triptofano se muestra en la figura 1.

El paso inicial en la biosíntesis de los alcaloides es la con­densación en tre la triptamina y la secologanina , previo a es­te paso el triptofano es dcscarboxilado por medio oe la trip­tofano descarboxiJasa para dar la triptamina. La triptofano descarbox ilasa es la primera enzima que canaliza el metabo­lito primario L-triptofano hacia la síntesis de los metaboli­tos secudar ios. Es ta enzima ha sido extra ída a part ir de C. roseaus y ha sido purificada (7.8). Los datos obtenidos por el grupo de Berlín (8) indican que se trata de una pro­teína con un peso molecular de 11 5,000 daltones con dos subunioades oe 54000 daltones de peso molecular cada una y con una Km para triptofano de 75 mM. La actividad de esta enz ima parece ser uno de los factores que regulan la

bios íntesis de los alcaloioes en C. roseus (9, l O). En estud ios recientes se ha oemostrado que en la biosín­

tesis de los alca loides, la porción de ll1 onoterpeno proviene del glucós ido seco-iridoide secologanina (1) ( 1 1, 12) el cual a su vez proviene de la via derivativa del ciclopentanoide logan ina (2 1 ( 13 l, a partir de los lílOn oterpenos acícl ieos ge­raniol (3) y nerol (4) (14-16).

OOu

(1) (2) (3) R· CH20H. R,.H

(4) R· H. R,· CH20H

Las enz im as que catalizan la biosíntesis de la secologani­na son : a 1 la geranil-nero l hioroxilasa, b) la geraniol-nerol oxiderreductasa y el la S-adenosil-L-metionina ; ácido logá­nieo Illeti l-transfer<tsa . hgura 2.

A) Geraniol-nerol hidroxilasa . Esta enzima hid roxila tan­to al geran iol COIllO al nerol para oar sus derivados 10-hidro­x ilados. Es u na oxigenasa del grupo citocromo P 4 S o. La elec· troforesis en geles de acril:imioa de esta en¡ima Illuestra dos bandas. una con un peso molecular oc 63 .000 e1altones y la otra oc 78 .000 oaltones . En donde la handa más ligera pu­e1ier;) ser el proollctll de degradación protcol íti ca dc la ele

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BIOSINTESIS DE ESTRICTOSIDINA

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Figura 2. Biosíntesis de estrictosidina. a, Geraniol nerol · hidoxilas~ ; b, geraniol -nerol oxidorreduc ta .. ; c. 5-adenosil-L-metaionina : ácido 10 -gánico metll transferasa; d. triptofano descarboxilasa; e. f. estrictosi­dina sintetasa.

78.000 daltones . Su actividad es estimulada por flavín mo­nonucleótido (FMN), sugiriendo que es una flavoproteina . El espectro visible confirmó el ca rácter de navoprote ína de la enzima (17).

Esta reductasa transfiere electrones al ferricianuro . y al 2, 6-diclo rofenolind ofenol , así como al citocromo C. No es inhibida por aet inomicina A, e1icumarol, superóxido e1ismu­tasa o catarantina, pero si es inhibida por NAOP+ y por p-cloromercuribenzoato. Es altamente específica para la hi­droxilación ele los metilos C-I O del geranio l y del nerol y su acción es dependiente del NAOH y no hidroliza los pirofos­fatos . Esta enzima se localiza en las vacuolas o provacuolas.

B) Geraniol-nerol oxidorreductasa . Cataliza la conversión del ge raniol a gerania l y del nerol a neral, en la presencia de NAO+ o NADP+ y la reacc ión reve rsa cuando se utiliza el NAOH o el NAOPH. Esta oxidación puede estar involucra­da en la biosíntesis, quizás como un intermediario entre el 10- hidroxigeraniol (o el nero!) y el ácido logánico.

C) S-adenosil-L-metionina : áeido logánico metiltransfe­rasa . Esta enzima convierte al ácido logánico y al ácido se­cologá nico a loga nina o secologanina (sus metilésteres) y ha sielo parcialmente purificada por Baxter en 1972 y Coscia en 197 1 (J 8, 19).

La conelen sación de la triptamina y de la secologanina producen e10s alcaloides diasteroisoméricos (5,6), los cuales se encuentran en la naturaleza, pero sólo uno de ellos actúa como precursor biogénico de los alcaloides representativos de los tipos Corinante, Iboga y Aspidosperma.

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Estudios recien tes en que se llevaron a cabo convcrs-ionc s de la es tri ctosidina y dcl vincósido a alcaloidcs del tipo he· teroyohimbina (~O . 21), indica ron c1aramcnte que la es tric­tosidina es el precursor de los alcaloides 3-Q - Corinante bajo las condiciones fi siológicas normalcs de la plant a. Por esto se ha asumid o que la es tri ctosidin a es el compues to clavc en la intrinca da vía metabólica qlle lleva a los alca loides in dó­licos con diferentes est ru c turas.

La enzima que sinte tiza la es trictosidina a partir de la triptamina y la secologa nina es la es trictosidina sintetasa (a), figura 3. Esta enLim a ha sido obtenida a partir de extractos li bres de cé lulas de C. roseous por precipitación con su lfato de amonio. redisolviendo en buffer a pH 7.6 Y tratándola con dc x tran re cubiert o con ca rbón (22) .

La enz ima pura es menos cs tab le, perdiendo la mitad de su ac ti vidad en una sc mana a 4°C. Tiene un amplio intcrva­lo de pH óptim o. entre 5 y 7.5. Y va lores de Km de 0.46 mM para la secologa nin a y 0.83 mM para la triptamin a. El peso molecular ob tenido por filtra ción cn ge l fue de 38,000 dal­tones. Su ac tivi dad no es inhibida por los reac tivos que se unen a los grupos su lnlidrilo. ni por ninguno de los alca loi­des de ri vados de la es tri ctos idi na lo que sugie re que no hay regulación por retroa limentación (23).

El complejo de la ajma licina sintetasa. la cual convierte a la secologanin a y a la tri ptamina primero en aj malicina y después en difercn tcs alca loides, fu e es tudiada por Seo tt y Lee en 1975 ( 7::4) El pH óptim o del com plejo es 6.5 y acc pt a un amplio núm cro de triptaminas substitu ídas co­mo substratos ; los inhibidores fucro n metales de tran sición

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Figura 3 . Bios lntesis de la ajmalicina y sus isómeros a partir de la es ­trictosidina, a EstrlctoSldlna slntetasa : b, {1 glucosldasa .

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y la D-glucono lactona . El sis tema parcce co nsisti r. al menos dc la estrictosidina s intetas~ (a). de l~t3 -glu cosiuasa (o) y de una reduc t as~ depcnuicnte uc necleó tidos dc piridina (c) (2 5 ) (Figu ra 3).

El paso en/.imático inicial incluyc la aeciún de una t3-glll ­cosidasa (b) I~ cual hidruli La al glu cósido alcaloidal dc la es­trictosidina (5) para dar una aglicona ine stable (7 ) la cual Se abre para dar un aldehido (8 ) (26) , con un a configu rac ión 3-Q (S)). Es te compuesto altam cnt e reac tivo (8 ) sufre una transfo rmación pos terior para dar la catenamina (1 2) Cll mu precursor de los ~1c~luidcs aj malicina . 19-e piajlllalicin a y te­trahidroa lstoni na . figu ra 3.

La est ri ctosid in a es hiuroli la ua por la t3-glucus id asa uo te­nida de la a lmendr~1 dulce o por tr~t~mie nt u ácido que ua vallesiachu tam ina (27 ). In ientras quc bajo I ~s condiciune s dadas en un C\ trac to li ore dc cé lL: las . el aldchid o 4.21-de hi­drocorinanateim (1 0 ) es el intcrmediario crucial: es to indi­ca que ex isten cn/ im as cspecífi cas in vo lu cradas cn la sc ­cuencia metabú li c<I desde la es tri c tosid~la hasta la ca tenami· na . Como ya se mencionó la primera en/.i ma que actlla so­bre la es tri ctosid in <J en la vía de sín tcsis para produ cir aj ma­licina es la t3.glu cu5 ida sa. Por mcdio de cromatografía de fil ­tración en ge l del <;ob renadante de 37.000 g de las se millas de C. roseous se deterl11i naron cuatro isoenLillla s de la 13-0-glu cosidasa uti li /.andu p-nitrofc nil -t3-glu cos idasa co mo sus­trato (2 8 ). Dos de es ta s hi dro lasas también fucroll ob teni­das a partir de culti vos de tejidos. Una de ell as ticn e un peso molecular dc 50.000 d¡¡ lt ones , el cual cs similar a un a dc las ob tenidas de planta

En un sistema li bre dc cé lulas de C. roseous el complcjo de la t3 -glucosidasa Cll llv iert e a la triptamin a y a la sccologa ­nina, así como a la g.e isosc hi sin a en ajmali cin a ( 13), lo que sugiere que la gc isosc hisina puede tener alguna fun ción en la bios íntesis dc la éljllla li cin a.

Para clarificar la prcsencia C0 l110 intermediar io de la ge isoschisina (X) . la cual ha sido ya apoyada por ex peri ­mcn tos in vivo (29.30 ) .. e in vitro (24 ), se lleva ron a cabo es tu dios de incorporaci(i n de una I11 clcla dc (2 · 14 C)-trip ta­mina y (aril -3 H)- gcisosc hi sin a en la ajmalicina en un siste­ma li brc de cé lulas (3 1 ). Los datos demos traron c1arame nt c el carác ter intermed iari o de la ge isoschi sina en la bios íntes is de la aj mali cina y dc la tetrahidroa lstonin a. aun que no se formaron ca ntidades signifi ca tivas de 19-epiajl11a licin a en es­tas incubaciones. La ge isoschisina no es convertida cn ajma­licina en au se ncia dc la s cn/illlas. La baja incurpora ción de la eH)-geisllsc hi sin<l en la aj nw li e ina as í CO Ill O Sll baja abu ndancia en la planta sugie ren qllc sielllprc se cnCllcntro un ida a la en/ima y también que es rápidamcn te conve rtida en o tros alcalll idcs .

BIOSINTESIS DE LOS ALCALOIDES DIMERICOS r\ paltil dc la aJlll~licilla se forma la cataran tina (16) quc

es un élkaloldc del til)ti Ibog.a el cual. Ju nt o Clln sus dcr iva ­dos cn la forma intefllH:diaria cu rre spond icnte al N-('I\id(),

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puede acoplarse con la vindolina (I 7) o sus derivados para dar los sistemas bisindol r~queridos para la biosíntesis de los alcaloides diméricos , figura 4. En condiciones apropiadas (32) se obtienen rendimientos altos de análogos de la VBL (600/0) proveyendo por lo tanto una ruta eficiente a partir de la catarantina (16) y de la vindolina (17).

ESI"Clos idino

Vlndoli no (T,po Aspido spermo)

(17)

COmpl ejO glucosldoso , +------

Oeglucosilestr ictosidlnO

(12 ) Co lenomlno

(20 ,2 1- Oideh idr oojmoliClno)

Anh Idrovinblost ino

Vl nOloSl lno

Figura 4 . Bloslntesl. de la vinblastina .

1 t cofenommo : reducloso I NA OPH I H+

H'

CH302C ~

AJmolicino

(T,po corynonthe)

r rOr1'~ ~:~

Co loronl ino (T,po Ibogo)

(16)

M.

(13)

Los ex tractos lib res de cé lulas de C. roseus también han sido u tilizados para estudiar la form ac ión de la 3 '4'·deh idro· vinblastina y de la leurosina a partir de la ca tarantina y vino do lina. Se ha establecido que la 3'4'· deh idrovin blastina es un precu rso r de los alcaloides de l grupo de la VBL (33.34) .

La formación de VBL. leurosina y ca tarina a part ir de 3' 4' ·dehidrovinblastina (18) ya ha sid o de mos trada , pero la incorporac ión sign ificat iva de (18) en la VCR (22) no,

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por lo que se han propuesto va rias rutas indirectas para su síntesis. Una de éstas, involucra una N·demetilación inicial y una formulación subsecuente a partir de la oxidación/des­composición de las aminas aromáticas terciarias por medio de las peroxidasas (35).

Una propuesta interesante para la síntesis de la VBL se muestra en la figura 5 . Los modelos moleculares muestran que la hidroxiperoxindoleina (19) está orientada idealmente hacia la conversión de (20) el cual puede represen tar un pre­cursor inmediato de la VBL.

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(20)

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(21) R· C H~

(22) : R' CHO

Figura 5 . Vla bloslntétiea propuesta para la síntesis d e la vinbtastina y de la vlneristina a partir del óxido (25) .

Stua rt ha demost rado que la in corporación directa de las 3' 4' ·dehidrovinblastina en Icu ros ina , ca tarina y VLB es al­ta . Sin embargo, después de 50 horas de incubación. só lo una cantidad insign ifican te se transfo rmó en VeR (36) .

La incubación de la leurosina marcada en un ex trac to li­bre de cé lulas produce un 120 / 0 de i" . lrporac ión en la ca· tarina (23), mientras que en un experimento de con trol. só· lo se nota una conve rsión del 10/0. Esto sugiere fue rt emen ­te que (24) es ve rdaderamente un producto natural y no un ar tefactu (37).

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En resumen, las incorporaciones significativas de (I 8) en la V BL, leurosina y ca tarina apoyan fue r temente la teor ía

de que es en realidad el intermedia rio clave en la biosíntesis de los alcaloides d iméricos del tipo de la VBL

La vía hipoté t ica propuesta po r Scott (38) para la bio· síntesis de los alcalo ides de tipo ¡boga , Aspidospe rma y Es·

tric nos permanece sin probar ya que las pruebas de la pre· sencia de cualquier alcaloide indólico más allá del tipo Cori· nante en las células cult ivadas todavía no son rigurosas (39).

Observaciones recien tes (40,41) muestran que la síntesis de los alcaloides del tipo Aspidosperma e Iboga , los cuales aparecen más ta rde en la vía biosíntetica , pudieron llevarse a cabo después de que la formació n de los a lcaloides Cori· nante ha alca nzado un máximo de produ cc ión .

CONCLUSIONES

El conocimiento de la biosíntesis qu e da los alcaloides diméricos V BL y VCR es de suma importancia debido al in · terés farmacológico que tienen en el tratamie nto de varios cánceres , y al objet ivo actual de incrementar la producción

de estos compuestos en las plantas de C. roseus u obtenerlos de los cultivos de tejidos vegetales (CTV). Hasta la fecha es· to no se ha logrado debido a que aún no se conoce n toda s las enzimas de la vía y tampoco se sabe con exactitud cua les so n las enzimas que regulan la síntes is de los alcaloides di· méricos.

Estudios con esta finalidad se están rea liza nd o en nu es· tro labo ratorio tanto en la planta como en los CTV ya que es de suma importancia incrementar la producción de es tos alca lo ides para hacerlos en un momento dado más accesi· bies para su producción en gran esca la (42-46).

BI BLlOG RAFIA

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