Biotecnologia revista

Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38 1

2 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 38

Colaboraram nesta edição:

BIOTECNOLOGIACiência & Desenvolvimento

KL3 Publicações

FundadorHenrique da Silva Castro

Direção Geral e EdiçãoAna Lúcia de Almeida

Diretor de ArteHenrique Castro Fº

Projeto GráficoAgência de Comunicação IRIS

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Portalwww.biotecnologia.com.br

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Os artigos assinados são deinteira responsabilidade

de seus autores.

ISSN 1414-6347Nota: A Revista Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, éindexada na AGROBASE ( base de dados da Agricultura Brasileira)BINAGRI- Biblioteca Nacional de Agricultura- MAPA- Ministério daAgricultura, Pecuária e Abastecimento. no Agris ( InternationalInformation System for the Agricultural Sciences and Technology)da FAO e atende a obrigatoriedade do Depósito Legal na BibliotecaNacional do Rio de Janeiro - Fundação Biblioteca Nacional.

Aline Oliboni de AzambujaBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Diouneia Lisiane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Emerson Luís Nunes CostaEngenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS)Gabriela Cristina AllesBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Jaime Vargas de OliveiraEngenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade/Entomologia (UFPEL),Laura Massochin Nunes PintoBióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Leila Lucia FritzBióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Lidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologia Vegetal(CIRAD-Montpellier).Marcus HübnerBiólogo (FURG) e Mestre em Biologia: Diversidade e Manejode Vida Silvestre (UNISINOS).Maria Helena Ribeiro RecheBióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Neiva KnaakBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Raquel Castilhos-FortesBióloga (UNISINOS) e Mestre em Microbiologia Agrícola e doAmbiente (UFRGS)Rogério SchünemannBiólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).Vilmar MachadoBiólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor em Genética eBiologia Molecular (UFRGS)


Conselho Científico

Dr. Aluízio Borém - Genética e Melhoramento VegetalDr. Ivan Rud de Moraes - Saúde - Toxicologia;Dr. João de Deus Medeiros - Embriologia Vegetal;Dra. Lidia Mariana Fiuza - Microbiologia e Entomologia Agrícola;Dr. Maçao Tadano - Agricultura;Dr. Naftale Katz - Saúde;Dr. Pedro Jurberg - Ciências;Dr. Sérgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Genética de Microorganismos;Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental.

Conselho Brasileiro de Fitossanidade - CobrafiDr. Luís Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia

Fundação Dalmo Catauli GiacomettiDr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Genética;Dr. José Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biológico;Dra. Marisa de Goes - Recursos Genéticos

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPENDr. José Roberto Rogero

Sociedade Brasileira de Biotecnologia - SBBiotecDr. Luiz Antonio Barreto de Castro - EMBRAPADr. Diógenes Santiago Santos - UFRGSDr. José Luiz Lima Filho - UFPEDra. Elba P. S. Bon - UFRJ

Edição Especial - Ecotoxicologia de Bacillus thuringiensis, organizada e coordenada pela Dra. LídiaMariana Fiuza, Professora Titular e Coordenadora Executiva do Programa de Pós-Graduação emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre da Universidade do Vale do Rio dos Sinos; Bolsista deProdutividade em Pesquisa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico,Consultora Técnica do Instituto Rio Grandense do Arroz.

bactéria Bacillus thuringiensis (Bt) tem o ca-risma mundial dos microbiologistas e entomo-logistas. Esse entomopatógeno ubíquo é ím-par no potencial biotecnológico aplicado no

controle biológico nas áreas agrícolas, florestais, desaúde animal e humana. Nessas áreas, o microrganis-mo pode ser utilizado como biopesticida formulado,registrado e comercializado ou seus genes podem seradaptados e incorporados no genoma das plantas pormeio da engenharia genética, atualmente denomina-das plantas-Bt. Nos estudos dessa bactéria há coope-rações multidisciplinares que permitem as análises dabiologia, toxicologia e ecologia microbiana, as quaissão tratadas nessa edição. O objetivo dessa publica-ção é apresentar o estado da arte sobre o entomopa-tógeno B. thuringiensis, com dados bibliográficos eresultados de pesquisa obtidos pelo grupo de pesqui-sa CNPq/UNISINOS: Manejo e Toxicologia em Agroe-cossistemas, onde atuam estudantes de Graduação ePós-Graduação da Biologia da UNISINOS, além de pro-fessores e pesquisadores colaboradores do IRGA, UFR-GS, UFPEL, UFSM, UCS, FIOCRUZ, EMBRAPA, CIRAD-Montpellier, Universidade de Otawa e Universidadede Nebraska.

PESQUISAPESQUISAPESQUISAPESQUISAPESQUISAARTRÓPODES E BACTÉRIAS ENTOMOPATOGÊNICOS 04ECOLOGIA DE BACILLUS ENTOMOPATOGÊNICOS 14

TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS 24MECANISMO DE AÇÃO DE BACILLUS THURINGIENSIS 32

TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS AGRÍCOLAS 36TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS AOS INSETOS SOCIAIS 40

TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS ÀS PRAGAS URBANAS E VETORES 44INTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSIS E O CONTROLE DE FITOPATÓGENOS 48

TOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSIS EM ORGANISMOS NÃO-ALVO 54PRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS: REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃO 58

PLANTAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAM TOXINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRAS 62EVOLUÇÃO E MANEJO DA RESISTÊNCIA DE INSETOS 68

EDIÇÃO 38 - 2009/2010

Carta ao Leitor

Dra. Lidia Mariana Fiuza

[email protected] [email protected]


Pesquisa

ARTRÓPODES E BACTÉRIASENTOMOPATOGÊNICOS

Emerson Luís Nunes CostaEngenheiro Agrônomo (UFRGS) eMestre e Doutor em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS)

Pesquisa

ntre os artrópodes, os insetos são a maio-ria das espécies animais e têm importâncianas mais diversas áreas. Na agricultura,podem ser úteis ou nocivos, atuando namanutenção do equilíbrio das populaçõescomo inimigos naturais, na polinização, na

decomposição da matéria orgânica do solo e comopragas das culturas. Nesse trabalho são apresen-tadas algumas informações sobre a classe Insec-ta, destacando-se os insetos de importância agrí-cola, com a caracterização de ordens e subordense exemplos de famílias e espécies de insetos-pra-ga, vetores de fitopatógenos, predadores e para-sitóides. Também constam dados sobre as bacté-rias que atuam como agentes microbianos aplica-dos no controle biológico de insetos.

1.1 A Classe Insecta

A classe Insecta, com 29 ordens, pertence àsuperclasse Hexapoda e ao filo Arthropoda. En-tre os aspectos que caracterizam a maioria dosrepresentantes da classe Insecta estão: corpo di-vidido em três porções (cabeça, tórax e abdome),cabeça com um par de antenas, olhos compos-tos, peças bucais expostas (ectognatos), tórax comtrês segmentos, três pares de pernas, nenhum,um ou dois pares de asas, e abdome com 6 a 11segmentos.

Durante o desenvolvimento, os insetos so-frem metamorfose, por meio de muda do tegu-mento (ecdise). Insetos hemimetábolos são aque-les que sofrem metamorfose chamada incomple-ta, passando pelas fases de ovo, ninfa e adulto.Nesse caso os indivíduos jovens são muito seme-lhantes aos adultos, mas apresentam o sistemareprodutivo imaturo e, no caso de insetos alados,nota-se o desenvolvimento das asas, observando-se a presença de tecas alares. Insetos holometá-bolos têm metamorfose completa, passando pe-las fases de ovo, larva, pupa e adulto. Nesse caso,os indivíduos jovens são bem diferentes dos adul-tos, como ocorre com as borboletas e moscas,onde inclusive há mudança no aparelho bucal.Os besouros também têm metamorfose comple-ta, com larvas morfologicamente diferentes dosadultos, mas normalmente o tipo de aparelhobucal se mantém.

A classe Insecta representa 70% das espéciesanimais, e encontra-se distribuída nos mais dife-rentes ambientes, onde os insetos, com aspectospositivos ou negativos, destacam-se como orga-nismos de importância, como na indústria têxtil(o bicho da seda), na alimentação (o mel produ-zido pela abelha), na saúde humana (moscas, mos-

quitos, percevejos e outros insetos transmissoresde agentes patogênicos), na veterinária (insetostransmissores de moléstias em animais) e na agri-cultura.

1.2 Importância dosinsetos na agricultura

Na agricultura, a ocorrência de insetos tam-bém tem seus aspectos positivos e negativos.

Sob o aspecto negativo estão os insetos quese alimentam de plantas e causam danos econô-micos a diversas culturas agrícolas. Os insetos-praga, pelo hábito de alimentarem-se de vege-tais, são chamados de fitófagos. Dependendo daestrutura vegetal da qual se alimentam, tambémrecebem denominações específicas. Assim, os quese alimentam de frutos são os carpófagos; de ra-ízes, rizófagos; de folhas, filófagos; de madeira,xilófagos; sugadores de seiva são fitossucsívoros.

Além dos danos causados de forma direta,pela alimentação, alguns insetos causam danosindiretos às culturas, atuando como vetores defitopatógenos (Tabela 1). Também há insetos queestão associados à ocorrência de moléstias, devi-do a injúrias que causam nos tecidos vegetais peloshábitos alimentares ou de postura, favorecendo apenetração de patógenos. Como exemplos po-dem ser citados o minador-dos-citros (Phylloc-nistis citrela), que favorece a ocorrência do can-cro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonasaxonopodis pv. citri, o tripes Thrips tabaci asso-ciado à ocorrência do fungo Alternaria porri, cau-sador da mancha púrpura em alho e cebola, e asmoscas-das-frutas, cujos hábitos de postura, ali-mentação e desenvolvimento facilitam a ocorrên-cia de patógenos causadores de podridões emfrutos, como o fungo Monilinia fructicola, causa-dor da podridão parda em frutos de pêssego. In-setos sugadores que excretam substâncias açuca-radas estão associados à ocorrência de fumagina,caracterizada pelas estruturas fuliginosas do fun-go Capnodium sp.

Sob o aspecto positivo estão os insetos poli-nizadores, muitos deles essenciais para a forma-ção de frutos e conseqüentemente de sementes;os insetos subterrâneos que atuam na decompo-sição da matéria orgânica e em outras caracterís-ticas desejáveis nos solos destinados à produçãoagrícola e, ainda, os inimigos naturais, que se ali-mentam de outros insetos, muitas vezes manten-do as populações de pragas em níveis que nãocausam dano econômico e sem necessidade deadoção de outros métodos de controle.

Entre os inimigos naturais, na classe Insecta,

espécies predadoras ocorrem em 22 ordens, en-quanto cinco ordens têm representantes parasí-ticos (Berti Filho & Ciociola, 2002).

Os predadores, durante seu ciclo evolutivo,podem consumir diversas presas. Normalmentesão mais generalistas, pois atacam diferentes es-pécies, que podem pertencer a diferentes famíli-as ou ordens, incluindo insetos-praga ou não.Na Tabela 2 são apresentados alguns insetos pre-dadores e suas presas.

Os parasitóides são em geral mais específi-cos, ou seja, especializados a determinados hos-pedeiros. Assim, normalmente são mais restritosà espécie, família ou ordem. Tais inimigos natu-rais dependem de apenas um hospedeiro paracompletar seu ciclo de desenvolvimento, e dife-renciam-se dos parasitas porque causam a mor-te do hospedeiro e os adultos têm vida livre.Atacam em geral as formas jovens dos insetos-praga, inclusive ovos. Quando ocorrem em pos-turas, controlam a praga antes dessa causar da-nos às culturas. Na Tabela 3 são apresentadosalguns insetos parasitóides e seus hospedeiros.

De acordo com Berti Filho & Ciociola (2002),o impacto de predadores é mais difícil de avaliardo que o de parasitóides, pois estes podem serobservados em seus hospedeiros, enquanto ospredadores dificilmente deixam sinais de ataque,principalmente quando consomem toda a pre-sa. Ao contrário dos predadores, os parasitóidestêm alta capacidade de encontrar seus hospe-deiros, inclusive quando a densidade populaci-onal de fitófagos é baixa (Shepard et al., 1987 e1995).

1.3 Ordens, subordens e famíliasde insetos de importância agrícola

Dentre as 29 ordens da classe Insecta, novedestacam-se pela importância agrícola de seusrepresentantes: Coleoptera, Diptera, Hemiptera,Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Neuropte-ra, Orthoptera e Thysanoptera. O Quadro 1 apre-senta informações sobre características gerais,famílias e espécies das principais ordens e su-bordens de insetos de importância agrícola.

Nesse contexto, as plantas de arroz (Orysasativa L.) são hospedeiros para um grande nú-mero de insetos-praga e a ação desses artrópo-des é um dos principais fatores que afetam aorizicultura, pois as perdas variam entre 10 e35% da produção. No entanto, são poucos osinsetos que podem ser considerados pragas, poismuitos deles são inimigos naturais que estãoassociados ao controle biológico dos insetos-pra-

Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) eMestre em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre(UNISINOS).

Leila Lucia FritzBióloga (UNISINOS) eMestranda em Biologia:Diversidade e Manejo deVida Silvestre (UNISINOS).

Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).


Figura 1. Abundância de insetos e inimigos naturais em lavouras de arrozirrigado, RS

ga. Fritz et al. (2008) analisaram a abundância de in-setos-praga e inimigos naturais presentes em áreasde arroz irrigado em Cachoeirinha (RS). Foram quan-tificados 1015 indivíduos subdivididos em 10 ordensde insetos e 2 ordens de aracnídeos (Figura 1). Osdípteros apresentaram maior abundância dentre osinsetos (51,92%), seguido de Hemiptera (14%), Hy-menoptera (8,87%), Collembola (8,18%), Coleoptera(3,05%), Orthoptera (2,56%), Odonata (1,28%), Pso-coptera (0,98%), Lepidoptera (0,69%) e Dermaptera(0,1%). Acredita-se que as larvas de mosquitos vêmdesenvolvendo resistência aos inseticidas que são uti-lizados frequentemente em lavouras orizícolas, tor-nando-se conseqüentemente abundantes nesses agro-ecossistemas (Victor & Reuben, 2000).

Entre os insetos, Coleoptera é a ordem dos be-souros ou cascudos. Há inúmeras espécies de cole-ópteros fitófagos, sendo que em muitos casos, tantoas larvas quanto os adultos alimentam-se de plantas.Nessa ordem, há insetos-praga de diferentes hábitos:filófagos, rizófagos, xilófagos, carpófagos, entre ou-tros. Há também várias espécies que atacam produ-tos armazenados. Entre as famílias, destaca-se Curcu-lionidae, dos gorgulhos ou bicudos, que é a maiorfamília do mundo, com cerca de 50.000 espécies des-critas, sendo a maioria das espécies fitófagas, e aslarvas geralmente desenvolvem-se no interior de par-tes vegetais, como brocas.

Na ordem Coleoptera também há insetos que sãoinimigos naturais, pois atuam no controle biológicocomo predadores de outros insetos. Nesse caso des-tacam-se as famílias Carabidae e Coccinellidae (joani-nhas), onde a maioria das espécies, tanto na fase delarva como de adulto, são predadoras de insetos-pra-ga.

Em Diptera, a ordem das moscas e mosquitos,também há insetos-praga e inimigos naturais. Entreos insetos fitófagos destaca-se a família Tephritidae,das moscas-das-frutas. Entre os inimigos naturais des-tacam-se as famílias Syrphidae, com espécies cujaslarvas são predadoras, e Tachinidae, com espéciesque desenvolvem-se como parasitóides.

A ordem Hemiptera é composta por insetos dehábito sugador. Anteriormente, Hemiptera era a or-dem apenas dos percevejos. Atualmente, inclui tam-bém cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilí-deos e moscas-brancas, que pertenciam à ordem Ho-moptera, atualmente não mais considerada como or-dem em Insecta.

Além dos danos diretos causados pelos insetosfitófagos da ordem Hemiptera, que sugam líquidosde diferentes partes vegetais, também há os danosindiretos, principalmente relacionados à transmissãode fitopatógenos.

Em Hemiptera, inimigos naturais ocorrem ape-nas na subordem dos percevejos (Heteroptera), ondeem algumas famílias há espécies predadoras de inse-tos (sugam hemolinfa). No entanto, tais famílias nãosão exclusivas de espécies entomófagas. Em Reduvii-dae há também espécies hematófagas (os barbeiros)e em outras, como Pentatomidae, há um grande nú-mero de espécies fitófagas. Em Hymenoptera estãoas abelhas, vespas, vespinhas e formigas. Nessa or-dem há diversas espécies que atuam como poliniza-dores. Entre os fitófagos destaca-se a família Formici-dae, que inclui as formigas-cortadeiras. Mas é no con-trole biológico que a ordem Hymenoptera destaca-se, pela grande quantidade de famílias e espécies deparasitóides. Entre os predadores, destaca-se a famí-lia Vespidae.

Na ordem Isoptera estão os cupins, com espéciesconsideradas pragas de diversas culturas, como pas-tagens, cana-de-açúcar e florestais.

Em Lepidoptera, a ordem das mariposas e bor-boletas, estão espécies de insetos-praga com diferen-tes hábitos alimentares, como filófagos, xilófagos, car-

pófagos, rizófagos, minadores de folhas, espéciesque atacam produtos armazenados, entre outras.No entanto, os danos dos lepidópteros às cultu-ras são causados quase que exclusivamente pelasformas jovens, conhecidas como lagartas.

Entre as famílias de Lepidoptera destaca-seNoctuidae, que inclui diversas espécies que cau-sam danos a culturas de grande importância eco-nômica. Em Noctuidae estão a lagarta-da-soja (An-ticarsia gemmatalis) e Spodoptera frugiperda, umapraga polífaga conhecida como lagarta-militar, la-garta-do-cartucho-do-milho ou lagarta-da-folha-do-arroz.

A ordem Neuroptera é composta por insetospredadores, com destaque para a família Chryso-pidae, cujas larvas são conhecidas como bicho-lixeiro, pois carregam os restos mortais das pre-sas aderidos ao corpo.

Em Orthoptera, ordem dos gafanhotos, gri-los, esperanças e grilotalpas, as espécies de inse-tos-praga são normalmente polífagas, com desta-que para as famílias Acrididae, do gafanhoto-cri-oulo e Gryllotalpidae, dos grilotalpas ou cachor-rinhos-da-terra.

Na ordem Thysanoptera estão os insetos co-nhecidos como tripes ou trips, sendo a maioriadas espécies fitófagas e algumas associadas à trans-missão de viroses de plantas.A ordem Araneae conta com mais de 38.834 es-pécies, incluídas em 3.694 gêneros e 109 famíliasno mundo (Platnick, 2008). Elas estão distribuí-das em agroecossistemas terrestres e são conside-radas um dos mais abundantes grupos de inver-tebrados predadores, além de possuírem a vanta-gem de não danificar as plantas e controlaremeventuais explosões populacionais de insetos, li-mitando o canibalismo e territoriedade. No en-tanto, os pesticidas não seletivos têm sido consi-derados um risco para as espécies de aranhasbenéficas. Fritz et al. (2008) analisaram as popula-ções de aranhas em lavouras orízicolas orgânicase convencionais (com aplicação de inseticida),coletadas de 3 regiões produtoras de arroz irriga-do do RS. Nesses agroecossistemas foram coleta-das 1148 aranhas, entre jovens e adultos, haven-do maior abundância em lavouras orgânicas (765)que diferiram significativamente das lavouras comaplicações de inseticidas (383). Das 12 famíliasregistradas predominaram Araneidae e Tetragna-thidae que foram fortemente afetadas pelos inse-ticidas, reduzindo em até 80% da população (Fi-gura 2).

1.4 Bactérias Entomopatogênicas

As toxinas bacterianas com atividade insetici-

da potencialmente aplicadas no controle de inse-tos-praga das plantas cultivadas e vetores de do-enças animais e humanas foram casualmente des-cobertas no final do século XIX, através das inves-tigações das doenças que ocorriam nas criaçõesde abelhas melíferas (Apis mellifera) e do bicho-da-seda (Bombyx mori).

A documentação da taxonomia geral bacteri-ana efetuada por Breed et al. (1957) e o levanta-mento de espécies de bactérias relacionadas cominsetos hospedeiros descrito por Steinhaus (1947),podem ser considerados trabalhos pioneiros e fun-damentais à taxonomia de bactérias que causamdoenças em insetos. A taxonomia bacteriana mo-derna baseia-se em critérios morfológicos, fisioló-gicos, sorológicos e genéticos.

Atualmente são conhecidas inúmeras espéci-es de bactérias associadas a insetos, porém pou-cas apresentam as características desejáveis à apli-cação no controle biológico de pragas, sendo naclassificação das bactérias entomopatogênicas, oscritérios de Falcon (1971) os mais viáveis por agru-parem as bactérias em apenas duas categorias: es-porulantes e não-esporulantes. Entre essas cate-gorias destacam-se com maior importância à pa-tologia de insetos as espécies das famílias Bacilla-ceae e Enterobacteriaceae.

As bactérias esporulantes apresentam uma ca-racterística de persistência, as quais podem se man-ter em condições ambientais adversas através deestruturas de resistência denominadas endóspo-ros. Esta característica dessa categoria de bactériasvem sendo considerada um pré-requisito à pro-dução de agentes microbianos em escala comer-cial.

Como característica de bactérias entomopato-gênicas potencialmente aplicadas no controle mi-crobiano de insetos, destacam-se as espécies queapresentam alta virulência, elevada capacidade in-vasora e produção de toxinas, causando toxemiasnos insetos alvo. Com essas características, na ca-tegoria de bactérias esporulantes destacam-se comogêneros de maior importância: Bacillus e Clostri-dium.

1.4.1. Gênero Bacillus

Bacillus spp., em geral aeróbicas ou facultati-vamente anaeróbicas, encontram-se em substra-tos variáveis devido ao complexo enzimático pro-duzido pelas células em forma de bastonetes, po-dendo essas se apresentarem individuais ou emcadeias. Esse gênero apresenta uma grande varia-ção entre as espécies, porém as características en-tomopatogênicas associadas à formação de endós-


Figura 2. Araneofauna em sistema de cultivo orgânico e convencional dearroz irrigado, RS

Figura 3. Bacillus thuringiensisem microscopia eletrônica detransmissão

poros e a produção de toxinas e enzimas deter-minam as seguintes espécies como promissorasao controle de insetos prejudiciais:

A. Bacillus thuringiensisEste microrganismo foi descoberto em 1902

por Ishiwata no Japão, através da criação massalde Bombix mori. Em 1911, B. thuringiensis foinovamente isolado por Berliner a partir de larvasde Ephestia kuehniella, na cidade de Thüringe,na Alemanha, de onde é originário seu atualnome. Os primeiros ensaios utilizando B. thurin-giensis foram realizados na Europa entre os anosde 1920 e 1930, no controle de Ostrinia nubila-lis, lepidóptero da família Pyralidae. Nos EstadosUnidos e na Europa, entre os anos de 1930 e1940, numerosos testes foram realizados contraoutras espécies de lepidópteros. Atualmente, nocaso do controle biológico, B. thuringiensis é omicrorganismo mais utilizado em nível mundial .

Para os microbiologistas, B. thuringiensis (Fi-gura 3) é uma bactéria gram-positiva, esporulan-te, aeróbica ou facultativamente anaeróbica, na-turalmente encontrado no solo. As espécies thu-ringiensis, cereus e anthracis do gênero Bacillusapresentam um grau de parentesco tão elevado,que muitas vezes dificulta, se não impossibilita,diferenciá-las através de provas bioquímicas e bac-teriológicas mais simples. Durante muito tempo,as duas primeiras espécies foram consideradascomo sendo uma única. O principal critério utili-zado para a distinção entre essas bactérias é aprodução de corpos de inclusões paraesporaisdurante o processo de esporulação do B. thurin-giensis.

No controle microbiano dos insetos, o ento-mopatógeno Bacillus thuringiensis (Bt) ofereceas melhores alternativas como bioinseticida, mos-trando-se também um bom candidato à obten-ção de formulações comerciais, bem como à en-genharia genética de plantas.

B. Bacillus cereusB. cereus pode ser considerado como pató-

geno facultativo, devido ao seu hábito saprofíti-co e à adaptação à vida parasítica das linhagensentomopatogênicas, sendo atualmente ainda uti-lizado como opcional no controle de alguns le-pidópteros, coleópteros e himenópteros quandoo B. thuringiensis mostra-se ineficaz.

O ingrediente ativo responsável pela viru-lência dessa bactéria corresponde a ação enzi-mática da lecitinase, descrita por Heimpel (1954,1955). Em 1989, Rahmet-Alla & Rowley descre-veram que a fosfolipase C de B. cereus estariarelacionada a sua atividade entomopatogênica.Essa bactéria caracteriza-se por apresentar célu-las em forma de bastonetes com esporos cen-trais, não-cristalíferas e ausência de esporângioestendido. Alguns autores mencionam que alémda lecitinase que levou certas linhagens a vidaparasítica, o endósporo dessa bactéria contémproteína tóxica de baixa atividade específica, es-truturalmente semelhante ao cristal de B. thurin-giensis.

Diversos estudos do modo de ação B. cereusmencionam que essa espécie não tolera meio al-calino e a enzima para ser ativa exige um pHentre 6,6 e 7,4, tornando essa bactéria específicaa insetos cujo conteúdo intestinal encontra-se nafaixa neutra, quando então são provocadas alte-rações no epitélio do intestino médio das larvassensíveis, sendo os sintomas patológicos variá-veis em função do modo de infecção por essepatógeno.

C. Bacillus larvae

Essa bactéria apresenta esporos centrais outerminais que variam de elípticos a cilíndricos numesporângio distinto, sem corpo de inclusão para-esporal (cristal). Quando os esporos de B. larvaesão ingeridos pelas larvas e pupas das abelhas,causam a doença americana das abelhas ou pú-trida dos berçários.

D. Bacillus alveiEssa espécie caracteriza-se por apresentar es-

poros centrais ou sub-terminais que variam deelípticos a cilíndricos. Essa espécie causa doençaeuropéia das crias das abelhas.

E. Bacillus popilliae e Bacillus lentimorbusEssas espécies são patógenos obrigatórios,

crescem pouco em meio de cultura, e têm comocaracterísticas esporos elípticos a cilíndricos, emesporângio nítido num bastonete. B. popilliae cau-sa a doença leitosa do tipo A e B. lentimorbuscausa a doença leitosa tipo B, ambas em larvasde escarabeídeos. As características de resistênciados esporos ao calor, à dessecação e à radiação,além da sua longevidade em larvas mortas e par-tículas de solo, tornam essas bactérias agentespromissores no controle de larvas de Popillia ja-ponica e Amphimallon mojalis (na Europa e Aus-trália), além de Eutheola humilis, Stenocrates spp.e Migdolus morretesi (no Brasil).

O mecanismo de ação é semelhante em am-bas às espécies, cujas bactérias atuam por inges-tão, passando do trato digestivo à hemolinfa, mul-tiplicando-se, esporulando, causando a septice-mia e morte dos insetos.

F. Bacillus sphaericusTrata-se de uma espécie que apresenta espo-

ros esféricos em posição terminal num esporân-gio distendido. Certas cepas dessa espécie pro-duzem inclusões cristalinas (ou cristais), compos-tas por dois peptídeos de 42 e 51 kDa que repre-sentam a toxina binária, com ação inseticida. Hácepas que sintetizam proteínas inseticidas de100kDa.

Essa bactéria é cosmopolita, tendo sido iso-lada de solo, água e do seu hospedeiro natural(pernilongos mortos). As cepas foram classifica-das por sorotipos conforme o antígeno flagelar,totalizando atualmente cerca de 50 sorotipos, en-tre os quais 7 contêm cepas ativas contra larvasde dípteros e as cepas mais tóxicas apresentam

como particularidade inclusões paraesporais crista-linas. Existem mais de 300 cepas de B. sphaericuscatalogadas pelo Instituto Pasteur (Paris, França),sendo 50% dessas tóxicas às larvas de dípteros.

1.4.2 Gênero Clostridium

O gênero Clostridium compreende cerca de 100espécies distribuídas em 19 grupos de acordo coma homologia de ARN16s. As células são em formade bastonetes, geralmente Gram-positivas, com en-dósporos ovais ou esféricos que as deformam. Asespécies desse gênero são estritamente anaeróbias,havendo algumas que toleram a presença de oxi-gênio livre, porém não formam esporos. Essas bac-térias são encontradas naturalmente no solo, sedi-mentos marinhos, restos animais e vegetais, assimcomo na flora intestinal de vertebrados e inverte-brados, como os insetos.

Os efeitos entomopatogênicos de C. brevifas-ciens e C. malacosomae foram observados em lar-vas de Malacosoma pluviale, havendo a germina-ção dos esporos na luz intestinal e o rápido cresci-mento vegetativo, o qual causa a morte em poucosdias, sem haver invasão na cavidade do corpo doinseto. Alguns autores citam que C. bifermentansmalaysia sintetiza uma proteína tóxica às larvas deAedes aegypti, Culex pipiens e Anopheles stephensi,a qual apresenta elevada similaridade as delta-en-dotoxinas sintetizadas pelo entomopatógeno B. thu-ringiensis.


ORDEM COLEOPTERA – besourosCaracterísticas gerais

• Asas anteriores do tipo élitros (consistência coriácea ou córnea) e posteriores membranosas;• Aparelho bucal mastigador;• Metamorfose completa : Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);• Mais de 300.000 espécies descritas.

Subordem AdephagaCaracterísticas gerais

• Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal divido pelas cavidades coxais do terceiro par depernas;

• Em geral, predadores.Principal família de importância agrícola

• Carabidae: adultos e larvas predadores (Ver Tabela 2)

Subordem PolyphagaCaracterísticas gerais

• Porção ventral do segmento abdominal (urosternito) basal não divido pelas cavidades coxais do terceiropar de pernas;

• Maioria das famílias de Coleoptera.Principais famílias de importância agrícola

• Anobiidae: Lasioderma serricorne – besouro-do-fumo• Bostrichidae: Rhyzopertha dominica - besourinho-do-trigo• Buprestidae: Colobogaster cyanitarsis – broca-da-figueira• Bruchidae: Acanthoscelides obtectus – caruncho-do-feijão• Cerambycidae: Oncideres impluviata - serrador-da-acácia-negra• Chrysomelidae: Diabrotica speciosa – vaquinha ou brasileirinho• Coccinellidae: joaninhas – larvas e adultos predadores (Ver Tabela 2)

Epilachna cacica – joaninha-das-cucurbitáceas (fitófaga)• Curculionidae: Anthonomus grandis – bicudo-do-algodoeiro

Oryzophagus oryzae – gorgulho-aquático (adulto), bicheira-da-raiz-do-arroz (larva) Sitophilus zeamais – gorgulho-do-milho• Elateridae: Conoderus scalaris - larva-arame• Meloidae: Epicauta atomaria – burrinho• Scarabaeidae: Euetheola humilis – cascudo-preto-do-arroz• Scolytidae: Hypothenemus hampei – broca-do-café• Tenebrionidae: Tribolium castaneum - besouro-do-milho

Observação: As outras duas subordens (Archostemata e Myxophaga) têm pouco mais de 50 espécies descritas.

ORDEM DIPTERA – moscas e mosquitosCaracterísticas gerais

• Asas anteriores membranosas;• Asas posteriores modificadas em halteres ou balancins;• Aparelho bucal sugador labial;• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto).

Subordem Nematocera – mosquitos, pernilongos e borrachudosCaracterística geral• Antenas mais longas que o tórax.Principal família de importância agrícola

• Cecidomyiidae: Jatrophobia brasiliensis – mosca-das-galhas-da-folha-da-mandioca Stenodiplosis sorghicola – mosca-do-sorgo

Subordem Brachycera – moscasCaracterística geral

• Antenas curtas, com arista ou estilo no último segmento.Principais famílias de importância agrícola

• Agromyzidae: Liriomyza trifolii - mosca-minadora• Syrphidae: larvas predadoras (Ver Tabela 2)

Quadro 1. Caracterização das principais ordens e subordens de insetos de importância agrícola, comexemplos de famílias e espécies


• Tachinidae: parasitóides (Ver Tabela 3)• Tephritidae: moscas-das-frutas - Ceratitis capitata – mosca-do-mediterrâneo

Anastrepha fraterculus – mosca-sul-americana Anastrepha grandis - mosca-das-cucurbitáceas

ORDEM HEMIPTERA - percevejos, cigarras, cigarrinhas, pulgões, cochonilhas, psilídeos e moscas-brancasCaracterísticas gerais

• aparelho bucal sugador labial (rostro);• ápteros ou com dois pares de asas, membranosas ou com o anterior total ou parcialmente mais resistente que

o posterior;• metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto ou ovo, ninfa, “pupário”, adulto)

Subordem Sternorrhyncha - cochonilhas, pulgões, moscas brancas e psilídeosCaracterísticas gerais

• rostro emergindo entre as pernas anteriores;• antenas longas ou curtas;• ápteros ou alados (membranosas ou anteriores tégminas);• ninfas e/ou adultos podem viver aderidos às plantas.

Principais famílias de importância agrícola• Aleyrodidae: moscas-brancas - Aleurothrixus floccosus Bemisia tabaci• Aphididae: Aphis gossypii – pulgão-do-algodoeiro Myzus persicae - pulgão-verde Toxoptera citricida - pulgão-preto-dos-citros• Phylloxeridae: Daktulosphaira vitifoliae - filoxera-da-videira• Psyllidae: Diaphorina citri - psilídeo-dos-citros• Coccidae: Coccus viridis - cochonilha-verde Saissetia coffeae - cochonilha-parda• Diaspididae: Chrysomphalus ficus – cabeça-de-prego Lepidosaphis beckii - escama-vírgula Pinnaspis aspidistrae - escama-farinha• Margarodidae: Eurhizococcus brasiliensis – pérola-da-terra Icerya purchasi – cochonilha-australiana• Pseudococcidae: Planococcus citri – cochonilha-branca Pseudococcus maritimus - cochonilha-branca

Subordem Auchenorrhyncha – cigarras e cigarrinhasCaracterísticas gerais

• rostro emergindo da parte inferior da cabeça;• antenas setáceas curtas;• asas membranosas ou anteriores tégminas;• ninfas e adultos de vida livre.

Principais famílias de importância agrícola• Cicadidae: Quesada gigas – cigarra-do-cafeeiro• Cercopidae: Deois flavopicta - cigarrinha-das-pastagens Mahanarva fimbriolata – cigarrinha-da-raiz-da-cana-de-açúcar Mahanarva posticata – cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcar Notozulia entreriana - cigarrinha-das-pastagens• Cicadellidae: Dalbulus maidis – cigarrinha-do-milho Empoasca kraemeri - cigarrinha-verde-do-feijoeiro

Subordem Heteroptera – percevejosCaracterísticas gerais

• rostro articulado;• asas anteriores do tipo hemiélitro.

Principais famílias de importância agrícola• Cydnidae: Scaptocoris castanea - percevejo-castanho• Coreidae: Diactor bilineatus - percevejo-do-maracujá Phthia picta – percevejo-do-tomate• Pentatomidae: Nezara viridula – percevejo-verde-da-soja Oebalus poecilus - percevejo-do-grão-do-arroz Tibraca limbativentris – percevejo-do-colmo-do-arroz• Reduviidae : predadores (Ver Tabela 2)


ORDEM HYMENOPTERA – abelhas, formigas, vespas, vespinhasCaracterísticas gerais

• Asas membranosas;• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto)

Subordem Apocrita – abelhas, formigas, marimbondos, vespinhasCaracterística geral

• Abdome livre ou pedunculadoPrincipais famílias de importância agrícola

• Apidae: abelhas - Trigona spinipes - abelha-irapuá (fitófaga)• Formicidae: Atta spp. - saúvas Acromyrmex spp. - quenquéns• Vespidae: predadores (ver Tabela 2)

Observação: Famílias de hymenópteros parasitóides (ver Tabela 3)

Subordem Symphita Característica geral• Abdome séssil

Família de importância agrícola• Siricidae: Sirex noctilio - vespa-da-madeira

ORDEM ISOPTERA – cupinsCaracterísticas gerais

• Aparelho bucal mastigador;• Antenas moniliformes;• Asas presentes nas formas reprodutivas, membranosas, ambos os pares iguais;• Asas com sutura basal, que se rompe após a revoada, destacando as asas do corpo;• Metamorfose completa: holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);• Espécies sociais, formando castas: sexuados alados (formam novos cupinzeiros), sexuados ápteros (rei e

rainha) e estéreis (operários e soldados);• Fontanela: onde localiza-se glândula com função de defesa dos cupins superiores.

Principal família de importância agrícola• Termitidae: Cornitermes cumulans Nasutitermes globiceps

ORDEM LEPIDOPTERA – borboletas e mariposasCaracterísticas gerais• Asas membranosas cobertas por escamas• Aparelho bucal sugador maxilar (espiritromba ou probóscida)• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva (=lagarta), pupa (=crisálida), adulto)

Subordem GlossataCaracterística geral

• Espiritromba formada pelas gáleas maxilaresPrincipais famílias de importância agrícola

• Crambidae: Azochis gripusalis – broca-da-figueira Diatraea saccharalis - broca-da-cana-de-açúcar• Gelechiidae: Phthorimaea operculella – traça-da-batata Sitotroga cerealella - traça-dos-cereais• Noctuidae: Agrotis ipsilon – lagarta-rosca Alabama argillacea - curuquerê-do-algodoeiro Anticarsia gemmatalis – lagarta-da-soja Helicoverpa zea - lagarta-da-espiga-do-milho Mocis latipes – lagarta-dos-capinzais Spodoptera frugiperda – lagarta-do-cartucho-do-milho, lagarta-da-folha-do-arroz Pseudaletia sequax – lagarta-do-trigo• Pieridae: Ascia monuste orseis - curuquerê-da-couve• Pyralidae: Elasmopalpus lignosellus – lagarta-elasmo Plodia interpunctella – traça-indiana• Sphingidae: Erinnyis ello – mandarová-da-mandioca

Manduca sexta - mandarová-do-fumo• Tortricidae: Cydia pomonella – traça-da-maçã Grapholita molesta – mariposa-oriental

Observação: Cada uma das outras três subordens (Aglossata, Heterobathmiina e Zeugloptera) tem apenas umafamília. Como característica geral dessas subordens, as gáleas maxilares não formam espiritromba (probóscida).


ORDEM NEUROPTERACaracterísticas gerais

• Asas membranosas com sistema variado de nervuras ;• Metamorfose completa: Holometábolos (ovo, larva, pupa, adulto);• Larvas predadoras.

Principal família de importância agrícola• Chrysopidae – predadores (ver Tabela 2)

ORDEM ORTHOPTERA – gafanhotos, grilos, esperanças e grilotalpasCaracterísticas gerais

• Terceiro par de pernas saltatorial;• Antenas filiformes ou setáceas;• Aparelho bucal mastigador;• Asas com par anterior do tipo tégmina e posterior membranosa;• Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo, ninfa, adulto).

Subordem Caelifera - gafanhotosCaracterísticas gerais

• Antenas curtas;• Tímpanos, quando presentes, localizados no primeiro segmento do abdome.

Principal família de importância agrícola• Acrididae: Rhammatocerus schistocercoides – gafanhoto-crioulo

Subordem Ensifera - esperanças, grilos e grilotalpasCaracterísticas gerais

• Antenas longas;• Tímpanos, quando presentes, localizados nas tíbias anteriores.

Principal família de importância agrícola• Gryllotalpidae – Neocurtilla hexadactyla – grilotalpa ou cachorrinho-da-terra

ORDEM THYSANOPTERA - tripes ou tripsCaracterísticas gerais

• Aparelho bucal sugador labial triqueta (raspador-sugador);• Antenas filiformes ou moniliformes;• Asas franjadas;• Metamorfose incompleta: Hemimetábolos (ovo-ninfa-ninfa imóvel-adulto).

Subordem Tubulifera Característica geral• Último segmento abdominal em forma de tubo.

Subordem Terebrantia Característica geral• Último segmento abdominal arredondado ou cônico.

Principal família de importância agrícola• Thripidae: Frankliniella schultzei Thrips palmi Thrips tabaci

Croft, 1990; Heinrichs, 1994; Gallo et al., 2002; Heinrichs & Barrion, 2004; Lucho, 2004.


Tabela 1: Alguns insetos vetores de fitopatógenos

INSETOS VETORES

Acrogonia citrina (Hem.:Cicadellidae)Aphis gossypii (Hem.:Aphididae)

Bemisia tabaci (Hem.:Aleyrodidae)Cerotoma arcuata(Col.:Chrysomelidae)Dalbulus maidis(Hem.:Cicadellidae)

Diabrotica speciosa (Col.:Chrysomelidae)Diaphorina citri (Hem.:Psyllidae)Dilobopterus costalimai(Hem.:Cicadellidae)Frankliniellaoccidentalis(Thy.: Thripidae)Frankliniella schultzei(Thy.:Thripidae)Hypocryphalus mangiferae(Col.: Scolytidae)Myzus persicae (Hem.:Aphididae)

Myndus crudus(Hem.:Cixiidae)Oncometopia facialis (Hem.:Cicadellidae)Planococcus ficus (Hem.:Pseudococcidae)Pseudococcuslongispinus(Hem.:Pseudococcidae)Rhopalosiphum maidis(Hem.:Aphididae)

Thrips palmi(Thy.: Thripidae)Toxoptera citricidus(Hem.:Aphididae)

PATÓGENOS

Bactéria - Xylella fastidiosa

Cucumber mosaic virus (CMV)Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P)Passion fruit woodiness virus (PWV)

Bean golden mosaic virus (BGMV)

Bean rugose mosaic virus (BRMV)

FitoplasmaMaize rayado fino virus (MRFV)Spiroplasma kunkeliiBean rugose mosaic virus (BRMV)

Bactéria - Candidatus liberibacter spp.


Tospovírus

Tospovírus

Fungo: Ceratocystis fimbriata

Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P)Passion fruit woodiness virus (PWV)Potato leafroll virus (PLRV)Potato virus Y (PVY)Soybean mosaic virus (SMV)Phytoplasma palmae


Grapevine leafroll-associated virus(GLRaV)Grapevine leafroll-associated virus(GLRaV)

Soybean mosaic virus (SMV)Sugarcane mosaic virus (SCMV)

TospovírusCitrus tristeza virus (CTV)Papaya ringspot virus – type P (PRSV-P)Passion fruit woodiness virus (PWV)

DOENÇAS

Clorose variegada dos citros (CVC)

Mosaico da bananeiraMosaico do mamoeiroEndurecimento dos frutos

Mosaico dourado do feijoeiro

Mosaico rugoso da soja

Enfezamento vermelho do milhoRisca do milhoEnfezamento pálidoMosaico rugoso da soja

Greening ou Huanglongbing (HLB)


Vira-cabeça

Vira-cabeça

Seca da mangueira

Mosaico do mamoeiroEndurecimento dos frutosEnrolamento da folha da batateiraMosaico do pimentãoMosaico comum da sojaAmarelecimento letal


Enrolamento da folha

Enrolamento da folha

Mosaico comum da sojaMosaico comum

Vira-cabeçaTristeza dos citrosMosaico do mamoeiroEndurecimento dos frutos

CULTURAS

Citros

BananeiraMamoeiroMaracujazeiro

Feijoeiro

Feijoeiro e soja

MilhoMilhoMilhoFeijoeiro e soja

Citros

Citros

Fumo, tomate e outras solanáceas

Fumo, tomate e outras solanáceas

Mangueira

MamoeiroMaracujazeiroBatataSolanáceasSojaCoqueiro

Citros

Videira

Videira

SojaMilho, sorgo, cana-de-açúcar

Fumo, tomate e outras solanáceasCitrosMamoeiroMaracujazeiro

ORDENS E FAMÍLIAS PREDADORES PRESASColeoptera Carabidae Callida scutellaris lagartas

Calosoma granulatum lagartasLebia concina lagartas

Coccinellidae (joaninhas) Azya luteipes cochonilhasEriopis connexa pulgõesCycloneda sanguinea pulgõesPentilia egena cochonilhasRodolia cardinalis cochonilhas

Dermaptera Forficulidae (tesourinhas) Doru luteipes lagartas e ovosDiptera Syrphidae Pseudodoros clavatus pulgões

Salpingogaster nigra ninfas de cigarrinhasHemiptera Anthocoridae Orius insidiosus lagartas, ovos, tripes, pulgões Lygaeidae Geocoris sp. lagartas e ovos Nabidae Nabis sp. lagartas e ovos Pentatomidae Podisus nigrispinus lagartas e ovos Reduviidae Zelus sp. lagartas, coleópterosHymenoptera Vespidae Polistes sp. lagartas

Polybia sp. lagartasNeuroptera Chrysopidae Chrysopa sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas

Chrysoperla sp. pulgões, cochonilhas, moscas-brancas

Tabela 2: Alguns insetos predadores e suas presas

Kimati et al., 1997; Gallo et al., 2002; Oliveira et al., 2003.

Gallo et al., 2002; Silva et al., 2002; De Bortoli et al., 2008.


ORDENS E FAMÍLIAS

Hymenoptera Aphelinidae

Bethylidae

Braconidae

Chalcididae

Encyrtidae

Eulophidae

Ibaliidae

Ichneumonidae

Scelionidae

Trichogrammatidae

Diptera Tachinidae

PARASITÓIDES

Aphelinus mali

Encarsia (Prospaltella) berlesei

Vespa-de-uganda Prorops nasuta

Apanteles sp.

Aphidius sp.

Apanteles subandinus

Chelonus insularis

Colastes letifer

Cotesia flavipes

Diachasmimorpha longicaudata

Hypomicrogaster hypsipylae

Brachymeria pseudoovata

Ageniaspis citricola

Proacrias coffeae

Tetrastichus giffardianus

Ibalia leucospoides

Campoletis flavicincta

Coccygomimus tomyris

Microcharops bimaculata

Telenomus podisi

Trissolcus basalis

Trissolcus urichi

Trichogramma galloi

Trichogramma pretiosum

Archytas incertus

Archytas lopesi

Archytas pseudodaemon

Hemisturmia sp.

Lespesia affinis

Trichopoda nitens

Xanthozona melanopyga

HOSPEDEIROS

Pulgão-lanígero Eriosomalanigerum(Hem.: Aphididae)Cochonilha-branca Pseudaulacaspispentagona (Hem.: Diaspididae)Broca-do-café Hypothenemus hampei(Col.: Scolytidae)Mandarová-do-fumo Manduca sexta(Lep.: Sphingidae)Pulgão-verdeMyzus persicae (Hem.:Aphididae)Pulgão-do-algodoeiroAphis gossypii(Hem.:Aphididae)Pulgão-da-espigaSitobion avenae(Hem.:Aphididae)Traça-da-batataPhthorimaeaoperculella(Lep.: Gelechiidae)Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodopterafrugiperda(Lep.: Noctuidae)Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.:Lyonetiidae)Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.:Crambidae)Mosca-do-mediterrâneo Ceratitis capitata(Dip.: Tephritidae)Broca-do-cedroHypsipyla grandella(Lep.:Pyralidae)Traça-dos-cachos Cryptoblabesgnidiella(Lep.: Pyralidae)Minador-dos-citros Phyllocnistiscitrella(Lep.: Gracillariidae)Bicho-mineiro Leucoptera coffeella(Lep.:Lyonetiidae)Mosca-do-mediterrâneo Ceratitiscapitata(Dip.: Tephritidae)Vespa-da-madeira Sirex noctilio(Hym.:Siricidae)Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodopterafrugiperda(Lep.: Noctuidae)Lagarta-cachorrinho Eupseudosomaaberrans (Lep.: Arctiidae)Lagarta-mede-palmo Sabulodes caberatacaberata (Lep.: Geometridae)Lagarta-da-soja Anticarsiagemmatalis(Lep.: Noctuidae)Percevejo-marrom Euschistus heros(Hem.:Pentatomidae)Percevejo-do-colmoTibracalimbativentris(Hem.: Pentatomidae)Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula(Hem.: Pentatomidae)Percevejo-do-colmoTibracalimbativentris(Hem.: Pentatomidae)Broca-da-cana Diatraea saccharalis(Lep.:Crambidae)Broca-pequena-do-fruto Neoleucinodeselegantalis(Lep.: Crambidae)Lagarta-da-espiga-do-milho Helicoverpazea(Lep.: Noctuidae)

Lagarta-do-cartucho-do-milho Spodopterafrugiperda(Lep.: Noctuidae)Lagarta-das-folhas Rolepa unimoda(Lep.:Lymantriidae)Lagarta-cachorrinho Eupseudosomaaberrans (Lep.: ArctiidaeMariposa-violácea Sarsina violascens(Lep.:Lymantriidae)Lagarta urticante Lonomiacircumstans(Lep.: Saturniidae)Lagarta-cachorrinho Eupseudosomaaberrans (Lep.: Arctiidae)Percevejo-verde-da-soja Nezara viridula(Hem.: Pentatomidae)Lagarta-das-palmeiras Brassolissophorae(Lep.: Nymphalidae)

CULTURAS

Macieira e outras rosáceas

Pessegueiro, amoreira e outrasfrutíferasCafeeiro

Fumo

Diversas culturas, como assolanáceasDiversas culturas, como algodão,solanáceas e cucurbitáceasDiversas culturas, como trigo,aveia, cevadaBatata

Diversas culturas, como milho,arroz, algodoeiroCafeeiro

Cana-de-açúcar, milho e outrasPoaceae (gramíneas)Frutíferas diversas

Cedro, mogno e outras espéciesflorestaisVideira

Citros

Cafeeiro

Frutíferas diversas

Pinus

Diversas culturas, como milho,arroz, algodoeiroEucalipto

Eucalipto

Soja e outras Fabaceae(leguminosas)Soja

Arroz

Diversas culturas, como soja emamoeiroArroz

Cana-de-açúcar, milho e outrasPoaceae (gramíneas)Tomateiro e outras solanáceas

Milho, sorgo e outras Poaceae(gramíneas)

Diversas culturas, como milho,arroz, algodoeiroIpê

Eucalipto

Eucalipto

Cafeeiro

Eucalipto

Diversas culturas, como soja emamoeiroCoqueiro, dendezeiro e outraspalmeiras

Tabela 3: Alguns insetos parasitóides e seus respectivos hospedeiros

Sampaio et al., 2001; Gallo et al., 2002; Rodrigues et al., 2004; Pratissoli et al., 2005; Carvalho, 2005; Maciel et al., 2007.


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Pesquisa

ECOLOGIA DE BACILLUSENTOMOPATOGÊNICOSPesquisa

studos ecológicos visando à conservação de Bacillus spp.em ecossistemas aquáticos e terrestres justificam-se pelaaplicação de algumas espécies no controle biológico deinsetos. Apesar desses microrganismos apresentaremsemelhanças quanto à biologia e modo de ação, eles

diferem entre si por características particulares de cada espécie.Os aspectos relacionados à distribuição geográfica, habitatpreferencial, interações com a microbiota local, fatores queafetam crescimento, esporulação e atividade inseticida dosentomopatógenos servem como parâmetros às análises deimpacto ambiental, especialmente em agroecossistemasorizícolas. Esse conjunto de elementos fornece subsídios queauxiliam na seleção de isolados com potencial inseticida eampliam a escassa literatura sobre o papel ecológico dessesmicrorganismos no ambiente.

1.1 Biologia e ecologiade Bacillus spp.

Atualmente são conhecidas inúmeras espécies de bactérias associadas ainsetos. Porém poucas apresentam as características desejáveis à aplicação docontrole biológico de insetos-praga das plantas cultivadas (Fiuza, 2001). No

entanto, o crescente interesse pela utilização debioinseticidas para o controle de populações de in-setos prejudiciais, levou o homem a pesquisar maisprofundamente as bactérias (Habib & Andrade,1998). Entre as bactérias entomopatogênicas, o gê-nero Bacillus apresenta especial importância nocontrole biológico de pragas, destacando-se o Ba-cillus sphaericus e o Bacillus thuringiensis (Priest,1992, 2000; Rabinovitch, 2000; Brighenti et al., 2005;Capalbo et al., 2005; Crickmore et al., 2008; De Melo,2008).

Embora seja reconhecido que B. thuringiensis éum patógeno de insetos, a ecologia dessa bactériaainda é pouco conhecida (Jensen et al., 2003). Eleé um microrganismo ubíquo do solo, mas é tam-bém encontrado nos demais ambientes terrestres,aquáticos e também em insetos mortos, produtosarmazenados, plantas e detritos (Meadows et al.,

1992; Meadows, 1993; Bernhard et al., 1997, Hossain et al., 1997; Forsyth &Logan, 2000; Hongyu et al., 2000; Maeda et al., 2000; Sneath, 2001; Martinez &Caballero, 2002; Silva et al., 2002; Uribe et al., 2003; Wang et al., 2003). Detoda forma, ele habita mais comumente o solo e a superfície das folhas (For-syth & Logan, 2000). No solo, o número de células varia de 102 a 104 Unida-des Formadoras de Colônias (UFC) por grama de solo, enquanto em plantas,esse número varia de 0 a 100 UFC cm-2 (Damgaard, 2000).

De acordo com Meadows (1993) existem quatro possíveis explicações paraa presença de B. thuringiensis no solo: a primeira considera que B. thuringi-ensis raramente desenvolve-se no solo, mas é depositado nesse substrato porfolhas, insetos, entre outros. A segunda hipótese assume que esse microrga-nismo pode ser patógeno de insetos do solo que apresentem reduzida impor-tância econômica, com os quais poucos estudos foram realizados. A terceirahipótese pressupõe que B. thuringiensis pode desenvolver-se no solo quandoexistem nutrientes suficientes, obtidos de resíduos orgânicos em decomposi-ção. Enquanto a última teoria afirma a existência de afinidade de B. thuringi-ensis e Bacillus cereus, com o qual B. thuringiensis pode trocar material gené-tico, possibilitando sua permanência no ambiente.

Além de B. thuringiensis e B. cereus, existem as espécies: B. mycoides, B.pseudomycoides, B. anthracis e B. weihenstephanensis (Hansen, et al., 2003;

Aline Oliboni de AzambujaBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).

Gabriela Cristina AllesBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutorandaem Biologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).

Leila Lucia FritzBióloga (UNISINOS) e Mestranda em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).

Maria Helena Ribeiro RecheBióloga (UPF) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).

Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutoraem Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologiaVegetal (CIRAD-Montpellier).


Hu et al., 2004). As espécies, B. ce-reus e B. thuringiensis são fenotipi-camente e geneticamente muito simi-lares entre si, havendo dificuldade nadistinção entre as duas espécies (Le-cadet et al., 1999; Shisa et al., 2002).No entanto, B. cereus é consideradopatógeno facultativo devido ao seuhábito saprofítico no solo e parasitade linhagens de insetos, possuindouma proteína tóxica de baixa ativida-de específica (Habib & Andrade,1998). Esta espécie não produz inclu-sões paraesporais inseticidas atuandoatravés de ação enzimática (Guttmann& Ellar, 2000; Shisa et al., 2002). Mui-tas cepas de B. cereus são considera-das patógenas oportunistas de mamí-

feros, causando intoxicações alimen-tares seguidas de vômitos e diarréias,dificultando o seu emprego no con-trole de insetos-praga (Hansen & Hen-driksen, 2001).

As informações sobre o destinodas toxinas de B. thuringiensis no solosão limitadas, embora alguns traba-lhos mostrem que elas unem-se a áci-dos húmicos e suplementos orgâni-cos ou partículas do solo, que as pro-tegem da degradação sem perder suaatividade inseticida (Polanczyk & Al-ves, 2003). De modo geral, as bacté-rias entomopatogênicas permanecemno solo por meses ou anos após asua liberação. B. thuringiensis é ca-paz de permanecer viável por maisde três anos após liberado (Fuxa,1992). A sensibilidade dos esporosdesse entomopatógeno à radiaçãosolar e à dessecação está associadacom os plasmídeos, ocorrendo trocasna composição química da coberturados esporos, reduzindo sua tolerân-cia aos fatores físicos do ambiente.Nas folhas, a limitação dos esporospode ocorrer pelo tipo de folha e seusexudados, os quais contém inibido-res da germinação de esporos (Yá-nez & Cabriales, 2000).

Considerando a hipótese de queos esporos do B. thuringiensis encon-tram-se no ambiente como resultadoda morte do inseto alvo, espera-se quea distribuição dessa bactéria ocorraaleatoriamente, e que os isolados deum mesmo lugar sejam similares (Fiu-za, 2001). No entanto, os isolados deB. thuringiensis têm sido encontradosem todos os tipos de solos e regiõesdo mundo, incluindo tundra ártica, es-

tepe, regiões temperadas e tropicais,savanas e desertos quentes. Sua abran-gência foi relatada em áreas da Es-candinávia a Nova Zelândia e da Is-lândia a Cadeias Montanhosas. No en-tanto, ele é raramente encontrado emareias de praias e camadas de soloabaixo de 10 cm de profundidade(Landén et al., 1994; Chilcott & Ellar,1998).

B. thuringiensis tem sido freqüen-temente isolado de florestas, áreas ur-banas, campos e principalmente delavouras agrícolas (Martin, 1994; Fiu-za, 2001).

Em um levantamento do Banco deBactérias Entomopotagonênicas daMicrobiologia da UNISINOS (BBE-MU), foram analisadas 278 amostrasde solo, oriundas de 29 municípios,de cinco regiões produtoras de arrozirrigado do RS. Foram isoladas 674amostras de bactérias esporulantes, amaioria pertencente ao Litoral Norte(41%), seguido do Litoral Sul (21%),da Campanha (14,4%), da DepressãoCentral (14%) e da Fronteira Oeste(10%) (Figura 1).

Dessas, 31,1% correspondem a B.thuringiensis; 6% a B. cereus; 4% a B.sphaericus e 58,9% equivalem a ou-tras espécies de Bacillus (Fritz et al.,2007). Outras pesquisas em solos deáreas de arroz irrigado revelam aampla ocorrência de Bacillus no RS.Em 2006, Azambuja estudou a fre-qüência de isolados de Bacillus spp.durante o período que compreendeo ciclo do cultivo do arroz irrigadono sistema convencional e obteve 245colônias de bactérias esporulantes,onde 143 pertenciam ao gênero Ba-

Figura 1. Bactérias esporulantesprovenientes de amostras de soloem regiões produtoras de arrozirrigado do RS

Figura 2. Freqüência de Bacillus spp. nos diferentes sistemas de cultivo e fases da cultura do arroz irrigado no RS; (C)pousio, (SCC) sistema de cultivo convencional, (SCG) sistema de cultivo pré-germinado, (SCD) sistema de cultivo direto


cillus, entre as quais foram identifica-das 26,6% como B. thuringiensis; 4,2%como B. sphaericus e 69,2% foramagrupadas como outras espécies deBacillus.

Silva et al. (2002) reforçam a pre-dominância de B. thuringiensis (9,1%)em solos de todas as regiões brasilei-ras se comparado a B. sphaericus(5,1%), com exceção da região Sul dopaís que B. sphaericus (10,1%) foimais freqüente que B. thuringiensis(4,6%). No entanto, em solos agríco-las de diferentes áreas da Argentina afreqüência de B. sphaericus foi maior(2,1%) em relação à de B. thuringi-ensis (1,6%) conforme os dados deDias et al. (1999).

Como foi verificada nas diversaspesquisas, a freqüência de B. thurin-giensis em vários locais e as diferen-ças encontradas podem ser atribuídasa inúmeros fatores, incluindo varia-ções geográficas, climáticas, ativida-de agrícola, tipo de solo e método deisolamento. Contudo, Martin (1984)discute que B. thuringiensis não pos-sui um habitat natural bem definido,pois esse entomopatógeno é caracte-rizado como um microrganismo sa-profítico, sem exigências nutricionaisrestritas, podendo adaptar-se a dife-rentes condições ambientais.

Diante disso, ainda que os ento-mopatógenos apresentados possuamsemelhanças quanto à biologia emodo de ação, eles diferem entre sipor características particulares de cadaespécie. Estudos ecológicos facilitam

a compreensão dessas bactérias noambiente, suas relações patógeno/hospedeiro e a estrutura de popula-ções, permitindo conhecer o compor-tamento de microrganismos naturaise novos isolados, sejam eles modifi-cados geneticamente ou introduzidosatravés de programa de controle mi-crobiano (Sosa-Gómez et al., 1998).Ainda assim, as bactérias entomopa-togênicas do gênero Bacillus sãomatéria-prima à industrialização deinseticidas bacterianos. Seus efeitossobre as larvas são tão pronunciadosque as indústrias de inseticidas con-vencionais buscam ampliar suas utili-zações com o objetivo de controlaras pragas da agricultura e vetores deagentes etiológicos de doenças huma-nas e vegetais.

1.2 Bacillus spp. em amostrasde solos de agroecossistemas

O crescente aumento de áreas agrí-colas vem causando diversos efeitosambientais, como a mudança micro-biana do solo que é mediada por di-versos processos e funções (Motavalliet al., 2004). Em agroecossistemas, asmudanças significativas e perceptíveisna comunidade microbiana do soloestão relacionadas com as condiçõesambientais, sendo conseqüência prin-cipalmente do uso das práticas demanejo desse ambiente (Atlas et al.,1991). Práticas agrícolas, tais comotipo de manejo do solo, rotação deculturas, aplicação de agrotóxicos e

uso de maquinários interferem namicrobiota terrestre, afetando a qua-lidade do solo, modificando as pro-priedades físicas, químicas e biológi-cas (Valarini et al., 2002; Andréa &Hollweg, 2004). Dessa forma, ocor-rem variações no número de indiví-duos ou na dinâmica bioquímica na-tural da comunidade de microrganis-mos. Porém, pouco é conhecido so-bre a distribuição desses microrganis-mos terrestres e a maneira com queeles respondem as mudanças de ma-nejo na terra (Buckley & Schmidt,2003).

Diversas populações de bactériasformadoras de endósporos ocorremem áreas agrícolas e podem contri-buir diretamente ou indiretamente naprodutividade das culturas (Gardener,2004). As bactérias gram-positivas for-mam uma parte importante da micro-biota de solo, o qual constitui o prin-cipal ambiente natural que abrigabactérias do gênero Bacillus (Ibarraet al., 2003; Mohamed et al., 2007).Muitas espécies desse gênero são con-sideradas de importância prática (Cac-camo et al., 2001), já que espécies deBacillus são utilizadas para a síntesede uma grande variedade de produ-tos médicos, agrícolas, farmacêuticosentre outros (Mohamed et al., 2007).

No entanto, as transformações mi-crobianas ocorrem devido às diferen-tes populações que habitam o solo, eas suas distintas reações químicas po-dem ser alteradas sempre que o ecos-sistema sofrer algum tipo de interfe-

Figura 3. Abundância de Bacillus thuringiensis em relação aos distintos tratamentos fitossanitários e período de irriga-ção do arroz no RS; (C) área controle, (H) área somente com herbicidas, (H+I) área com herbicidas e inseticida, (H+F)área com herbicidas e fungicida


rência. Assim, na aplicação de diver-sos tipos de manejo, podem existirdiferentes disponibilidades de subs-tratos que determinarão o favoreci-mento ou a inibição do estabeleci-mento dos diferentes grupos micro-bianos (Castro & Prado, 1993).

Fritz (2007) analisou a abundân-cia de bactérias entomopatogênicaspertencentes ao gênero Bacillus ob-tidas de 36 amostras de solo coleta-das de diferentes sistemas de cultivode arroz irrigado: sistema de cultivoconvencional (SCC), sistema de culti-vo pré-germinado (SCG) e sistema decultivo direto (SCD) e de uma áreade pousio (sem cultivo) por aproxi-madamente 12 anos (C). Foram sele-cionadas 336 colônias pertencentes aogênero Bacillus spp., onde foramidentificadas, 35,42% como B. thurin-giensis, 16,96% como B. cereus, 9,52%

como B. sphaericus e 38,10% comoBacillus sp. Todavia, não houve di-ferença significativa na freqüênciade Bacillus spp. entre os sistemasde plantio (p>0,05), embora as fa-ses da cultura tenham influencia-do a abundância das espécies(P<0,01). A irrigação revelou-secapaz de favorecer a variação naabundância de Bacillus spp., prin-cipalmente no caso de B. sphaeri-cus, uma vez que representou71,4% do total de isolados encon-trados durante a referida etapa dacultura (Figura 2).

O fato dos solos agrícolas so-frerem mudanças nas suas propri-edades físicas e químicas pela in-trodução da cultura contribui paraa diversidade de bactérias em fun-ção da aeração, profundidade emelhor distribuição ao longo das

camadas (Kennedy, 1999).Pfüller et al. (2000) analisaram a

freqüência de microrganismos utili-zando diferentes sistemas de plan-tio, e em seus estudos a populaçãomicrobiana não diferiu significativa-mente, embora tenha ocorrido umamaior variação no SCC. No entanto,Garbeva et al. (2003) compararam adiversidade de Bacillus em solosagrícolas, e observaram maior nú-mero de esporos em solos que apre-sentavam cultivos, em tempo redu-zido em comparação aos cultivadosem longo prazo.

De acordo com Buckley & Tho-mas (2003), uma possível explica-ção para que as comunidades mi-crobianas em campos abandonadosde cultivo continuem a apresentarfreqüências semelhantes com cam-pos atualmente cultivados, se deveao fato de que as comunidades mi-crobianas do solo respondem às ca-racterísticas do ambiente, que reque-rem longos períodos de tempo pararecuperação dos efeitos antrópicos.

Em geral, os microrganismos res-pondem de diversas formas à apli-cação de pesticidas em seu hábitat,podendo ocorrer principalmente se-leção de populações resistentes. Essaseleção pode ser em função de suascaracterísticas fisiológicas e morfo-lógicas. Com o passar do tempo, adiversidade microbiana entra emequilíbrio, porém passa a ser com-posta por um menor número de es-pécies, mantendo-se por meses ouanos, atingindo o clímax a semelhan-ça da fase original (Borges et al.,2004). Por outro lado, alguns auto-res relatam que a diminuição dasbactérias pode estar relacionada coma sensibilidade aos herbicidas, re-sultando na eliminação de algumasespécies. (Wardle & Parkinson,1990).

Nesse sentido, Azambuja (2006)avaliou a influencia do cultivo con-vencional de arroz irrigado sobre aabundância de bacilos entomopato-gênicos, em quatro áreas tratadascom distintos produtos fitossanitári-os e a fase de irrigação da cultura,concluindo que não houve diferen-ça significativa entre os parâmetrosavaliados separadamente sobre aabundância de B. thuringiensis e B.sphaericus. No entanto, a interaçãoentre os fatores apresentou signifi-

Figura 4. Freqüencia de Bacillus spp. em amostras de água do Canal deIrrigação das 5 regiões produtoras de arroz do RS: Litoral Norte-LN, Campa-nha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS

Figura 5. Freqüencia de Bacillus spp. Isolados em amostras de água dasParcelas de cultivo de arroz, das 5 regiões produtora do RS: Litoral Norte-LN,Campanha-CA, Fronteira Oeste-FO, Depressão Central- DC e Litoral Sul- LS


cativa diferença para B. thuringien-sis. Antes da irrigação, o microrganis-mo foi mais freqüente na área tratadasomente com os herbicidas, contudoquando o arroz foi inundado a abun-dância foi mais pronunciada nesseperíodo de irrigação e no tratamentocom herbicidas/fungicida (Figura 3).

Os solos de arroz irrigado são pre-dominantemente ácidos, quandoocorre à inundação, o pH é elevadonaturalmente, próximo à neutralida-de pelo processo de redução. Em fun-ção dessa nova condição, a disponi-bilidade de nutrientes atinge níveisestáveis durante um período de 4 a 6semanas após a inundação (IRGA,2005).

As mudanças climáticas interferemde diferentes formas numa série deorganismos, que conseqüentemente,afetam outros e o conjunto destas mu-danças pode prejudicar o meio ambi-ente físico. Sendo assim, os micror-ganismos estão entre os seres maissensíveis as variações ambientais, poisformam grandes populações, possu-em crescimento rápido, facilidade dedispersão e reduzido tempo de gera-ções, constituindo-se em potenciaisindicadores biológicos para o estudode impactos das mudanças climáticasglobais (Ghini, 2008).

A influência de fatores climáticosna ocorrência de B. thuringiensis eB. sphaericus, em solos de orizicultu-ra irrigada, foi avaliada por Azambu-ja (2006) e a autora sugere que a pre-dominância dos entomopatógenos foimais acentuada no período de verãocom valores médios de temperaturado ar de 26 oC, umidade relativa de66 % e temperatura do solo de 24,7

oC, contudo, essas diferenças não fo-ram submetidas à análise estatística.Todavia, a temperatura é um impor-tante fator de influência alterando aeficiência de bioinseticidas a base deBacillus entomopatogênicos. Baixase altas temperaturas reduzem a ativi-dade larvicida, indicando a necessi-dade de estudos potenciais devido aogrande número de insetos vetores emclimas tropicais (Consoli et al., 1995).Em agroecossistemas, a variação dadiversidade microbiana ao longo dasestações do ano ainda não é bemcompreendida, já que em cada esta-ção parece ocorrer uma comunidademicrobiana dominante acompanhadade outras pouco abundantes. Essas va-riações estão diretamente ligadas aoregime hídrico, ao clima da região, aestrutura e manejo do solo e ao teore a qualidade dos resíduos vegetaisaportados (Torsvisk & Ovreas, 2002).

Os solos representam um ecossis-tema complexo e as variações nos ní-veis de pH, compostos inorgânicos ematéria orgânica podem representarum fator limitante na colonização, es-tabelecimento e esporulação de mi-crorganismos residentes (Melo & Aze-vedo, 1998). Diante desse fato, mui-tas pesquisas procuram elucidar quaisos componentes minerais são mais fa-voráveis ou limitantes do crescimen-to microbiano no solo. Além disso,determinadas concentrações de umdado elemento podem apresentarefeitos adversos para um mesmo mi-crorganismo. Alguns autores descre-vem que a presença de cálcio favore-ce o crescimento, esporulação e aprodução da delta-endotoxina de B.thuringiensis no solo, mas em eleva-

das concentrações inibe os três pro-cessos (Sikdar et al., 1991; Içgen etal., 2002; Polanczyk, 2004). Poroutro lado, há divergências quantoà presença de magnésio, sendo im-portante na biossíntese do cristalprotéico ou limitante do crescimen-to (Içgen et al., 2002; Polanczyk2004) . Também há relatos na lite-ratura de que a adição de fosfatoorgânico (3 a 100 mM) não influ-encia na biossíntese do cristal, ape-sar de reduzir o crescimento decélulas e esporos (Içgen et al.,2002), porém Azambuja (2006) ob-servou que B. thuringiensis foi fa-vorecido pelas quantidades de po-tássio no solo.

Em relação ao pH, alguns auto-res mencionam que a acidez do solofavorece a adsorção da toxina deB. thuringiensis pela fração argilo-sa do mesmo protegendo da bio-degradação por microrganismoscompetidores que têm sua ativida-de inibida nessa condição. Os va-lores acima de 5,2 favorecem o cres-cimento da bactéria, mas quando opH não é controlado próximo àneutralidade ocorre à baixa produ-ção da toxina (West et al., 1985; Si-kdar et al., 1991; Tapp & Stotzky,1998). Sabe-se que a disponibilida-de de nutrientes minerais, pH neu-tro e umidade dos solos favorecema germinação de B. thuringiensisrepresentando importantes fatoresnos níveis de crescimento do mi-crorganismo (West et al., 1985).Contudo, os níveis ótimos de me-tais para o crescimento de B. thu-ringiensis e produção da delta-en-dotoxina são variáveis e ainda nãoforam claramente demonstrados,conforme discutem alguns autores(Sikdar et al., 1991; Içgen et al.,2002).

B. sphaericus, tem ação mosqui-tocida, especialmente para larvas deCulex pipiens, sendo potencializa-da após crescimento em meio decultura com os elementos mineraisKH

2PO

4, MgSO

4, MnSO

4, Fe

2(SO

4)3,

ZnSO4, CaCl

2 e pH 7,2 conforme

estudos realizados por Kaflon et al.,(1983). Nos estudos de Azambuja(2006), o índice de B. sphaericusnão foi afetado pelas propriedadesfísico-químicas dos solos avaliadosde arroz irrigado. Os resultadosanteriores dos referidos autores

Figura 6. Ocorrência de espécies de Bacillus isoladas de amostras de águadurante o ciclo da cultura 2001/02 de arroz irrigado do Rio Grande do Sul


podem possivelmente ser explica-das por Silva et al. (1999) e Alles(2008) que relacionam às diferen-tes origens do entomopatógeno,como solos e águas, a utilização dealgumas cepas em estudos ecológi-cos pela resistência a diferentes con-dições de estresse.

Na tentativa de caracterizar ce-pas com atividade inseticida e veri-ficar a influência do cultivo conven-cional sobre os Bacillus entomopa-togênicos, Azambuja (2006) obtevea distribuição de isolados de B. thu-ringiensis com genes cry4, (ativida-de inseticida a dípteros) em cepasprovenientes de solos de todos ostratamentos fitossanitários, excetoda área tratada com herbicidas/in-seticida, sendo igualmente distribu-ídas entre os períodos de irrigação.Como justificativa deste dado pode-se ressaltar que as áreas inundadasde cultivo de arroz são habitats fa-voráveis à criação de mosquitos, de-vido à presença de elevada matériaorgânica e resíduos poluentes pro-venientes das fontes utilizadas (Ba-tista-Filho et al., 1998).

1.3 Bacillus spp. emecossistemas aquáticos

Entre as bactérias melhor adap-tadas à vida no solo e na água, es-tão àquelas pertencentes ao gêneroBacillus. O gênero Bacillus é feno-tipicamente heterogêneo, commembros exibindo um amplo con-junto de requerimentos nutricionais,condições de crescimento, diversi-dade metabólica e na composiçãobase do DNA. O conhecimento daecologia de espécies de Bacillus nosolo e na água ainda não é comple-to (Vilain et al., 2006).

Espécies de Bacillus foram refe-ridas por sua capacidade metabóli-ca distinta (Fernandes et al., 2007;Fu et al., 2007; Fisher & Hollibaugh,2008), no Mono Lake, um lago hi-persalino, alcalino do leste da Cali-fórnia, onde existem processos deoxidação e redução de selênio e ar-sênio em presença de fontes de car-bono dissolvido. Em lavouras de ar-roz no Rio Grande do Sul, (RS),Mattos et al. (2007), avaliaram o im-pacto do uso do inseticida carbo-sulfano sobre os microrganismos dosolo, o risco de contaminação do

solo, da água e do sedimento, e adegradação microbiana. Os resulta-dos apontaram espécies do gêneroBacillus entre os grupos Gram-po-sitivos dos consórcios de bactérias,com maior capacidade metabólicaem degradar o carbosulfano.

Relacionando diferentes ambien-tes aquáticos, com a viabilidade dosesporos de B. sphaericus, Youstenet al. (1995) destacam que na águadoce a fração de esporos viáveis émaior do que no mar. Pouco se sabesobre quais fatores ambientais sãomais importantes para a perda deviabilidade dos esporos dessa bac-téria. Fatores como a temperaturade crescimento, pH, aeração, pre-sença de minerais e certos compos-tos carbonados e nitrogenados afe-tam a formação dos endósporos(Sneath, 2001). Nesse sentido, Alles(2008) avaliou o crescimento decepas de B. sphaericus, frente a pes-ticidas químicos, compostos orgâ-nicos e metais pesados, obtendouma expressiva heterogeneidadeentre as estirpes e uma resistênciaao metal Cádmio, considerando taiscaracterísticas fenotípicas importan-tes para o controle e manejo bioló-gico, dependendo do local onde oagente de biocontrole será aplica-do.

Contudo, sabe-se que as formu-lações comerciais de B. sphaericussão mais resistentes a habitats po-luídos e a sua reciclagem é favore-cida em certas condições, mas comestreito número de hospedeiros emrelação à B. thuringiensis israelen-sis (Singh e Gill, 1988; Thanabalu etal., 1991 e 1993; Nielsen-Leroux eCharles, 1992; Nicolas et al., 1993;Consoli et al, 1995; Charles et al.,1996; Silva-Filho e Regis, 2003;Schwartz et al., 2001; Silva-Filho ePeixoto, 1997).

Em estudos de diversidade bac-teriana em orizicultura no RS, Re-che & Fiuza (2005) e Fritz et al.(2007) isolaram e identificaram es-pécies de Bacillus em águas de irri-gação e em amostras de águas deáreas orizícolas do RS. Nessas pes-quisas, B. thuringiensis, B. sphaeri-cus, B. cereus e Bacillus sp. foramidentificados em amostras de águacoletadas nos Canais de Irrigação enos Canais de Drenagem das lavou-ras orizícolas do RS. As coletas fo-

ram realizadas durante o ciclo dacultura do arroz, 2001/02, em 5 re-giões produtoras de arroz do RS: De-pressão Central- DC, Fronteira Oes-te- FO, Campanha- CA, Litoral Nor-te- LN e Litoral Sul- LS (Figuras 4 e5).

Os resultados apresentados nasFiguras 4 e 5, referem-se à abun-dância de Bacillus spp. nas regiõesorizícolas estudadas e nos dois tra-tamentos, Canal de Irrigação e Par-celas de cultivo de Arroz. Caracte-rísticas adaptativas a vários ambien-tes e sob condições adversas de tem-peratura, pH e salinidade, lhes sãoconferidas por sua capacidade depermanecer em latência devido aformação de esporos. As variaçõesde temperatura entre as regiões e adisponibilidade de recursos, podeminfluenciar as diferenças de abun-dância na distribuição das espécies(Ricackanov, 2003).

As parcelas de cultivo apresen-taram maior abundância de colôni-as bacterianas (Figura 5) quandocomparadas com as águas de irri-gação da lavoura (Figura 4). Águasde lavoura de arroz recebem trata-mentos fitossanitários e Bacillusparecem ter afinidade com ambien-tes que receberam agroquímicos,transformando-os em fontes de car-bono para a sua produção de ener-gia. Além disso, o ambiente de la-voura alterna inundação e drena-gem, o que favorece o desenvolvi-mento de bactérias esporulantes (Li-esack, 2001).

Os resultados de pesquisa quan-to aos isolados de Bacillus em águasde lavouras orizícolas durante o ci-clo da cultura, expressaram a pre-sença de B. thuringiensis em 39,7%das amostras de água analisadas. Emsegundo lugar, Bacillus sp., 35,8%,seguidos de B. cereus, 14,6% e B.sphaericus, 9,9% (Figura 6).

B. thuringiensis foi encontradoem maior freqüência nas águas decultivo de arroz (Figura 6). A pre-sença de Bacillus sp. é mencionadapor Martiny et al. (2005), como umdos grupo bacterianos mais comunsem sistemas de distribuição de águapotável. Em estudos após desinfec-ção com cloro, em sistemas de águapotável, Szabo et al. (2007), encon-traram esporos de bactérias do gê-nero Bacillus, aderidos nas depres-


sões da tubulação de ferro corroído.Os autores concluíram que esses es-poros são capazes de persistir porlongos períodos de tempo em pre-sença de altos níveis de cloro. Essemicrorganismo pode desenvolver-seem águas ricas em nutrientes libera-dos pela decomposição de resíduosorgânicos, assim como foi citado parao solo, por Polanczyk & Alves (2003).Esses autores também levantaram ahipótese dessa bactéria ter algum tipode relação simbiótica com plantas, oque explicaria a produção de toxinastão específicas e eficientes.

B. sphaericus é muito comum ede distribuição cosmopolita, sendoprincipalmente isolada do solo em sis-temas aquáticos ou mesmo de larvasde pernilongos mortos, seu hospedei-ro natural (Singer, 1981; Priest et al.,1997; Alves, 1998; Wirth et al., 2001;Partridge e Berry, 2002; Wei et al.,2006).

B. cereus, de acordo Vilain et al.(2006), é uma bactéria de solo quepode ocorrer na rizosfera das plantase algumas estirpes produzem antibi-óticos capazes de inibir o desenvol-vimento de doenças fúngicas na ri-zosfera; Galvão et al. (2006), em aná-lises microbiológicas de água de cul-tivo de mexilhões, detectaram B. ce-reus em 6,7% das amostras. Rowan etal. (2003) referem-se a B. cereus,como um grupo heterogêneo de bac-térias Gram-positivas, que devido asua habilidade em formar esporos, to-lera melhor ambientes hostis do queoutros entomopatógenos bacterianosnão esporulantes. B. cereus é um pa-tógeno humano oportunista, que estápresente no solo e na água, podendoproliferar em uma gama de ambien-tes incluindo matérias-primas e ali-mentos processados (From et al.,2005; Tourasse et al., 2006).

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Pesquisa

Pesquisa

TOXINAS DE BACILLUSTHURINGIENSIS

Laura Massochin Nunes Pinto

Bióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda

em Biologia: Diversidade e Manejo de Vida

Silvestre (UNISINOS).

Diouneia Lisiane Berlitz

Bióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:

Diversidade e Manejo de Vida Silvestre

(UNISINOS).

Raquel Castilhos-Fortes

Bióloga (UNISINOS) e Mestre em

Microbiologia Agrícola e do Ambiente

(UFRGS)

Lidia Mariana Fiuza

Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em

Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),

Doutora em Ciências Agronômicas

(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em

biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).

toxicidade de B. thuringi-ensis está relacionada à sín-tese das proteínas Cry queatuam especificamente nointestino médio dos insetos,as quais são codificadas por

genes cry. Essas proteínas têm atividadeinseticida a diferentes ordens de insetos-praga, de acordo com a presença dos ge-nes cry, nas cepas bacterianas. Além des-sas proteínas, o entomopatógeno produzoutros tipos de toxinas, como exotoxinas,proteínas Vip, endotoxinas, entre outras.Sendo assim, esse artigo apresenta a atualclassificação dos genes cry, as ordens deinsetos-alvo das proteínas Cry e outros fa-tores de toxicidade da bactéria.

1.1 Proteínas Cry

Juntamente com a esporulação, B. thu-ringiensis libera inclusões cristalinas para-esporais que podem conter uma ou maisproteínas inseticidas, denominadas Cry, asquais são codificadas por genes tambémdenominados cry. Estas proteínas apresen-tam peso molecular entre 40 e 140kDa etornam-se tóxicas a insetos, após sua in-gestão e solubilização, no intestino médiodas larvas (Bravo, 1997).

Estudos sobre a seleção de B. thurin-giensis têm identificado diferentes cepasdesta bactéria, as quais mostram ação so-bre diversas ordens de insetos, como Lepi-doptera, Coleoptera, Diptera, Hymenopte-ra, Homoptera, Hemiptera, Isoptera, Or-thoptera, Siphonaptera, Thisanoptera eMallophaga (Feitelson et al., 1992; Maagdet al., 2001; Cavados et al., 2001; Castilhos-Fortes et al., 2002; Pinto et al., 2003; Ma-agd et al., 2003), além de nematóides (Mar-roquim et al., 2000).

Assim, sabe-se que diversos grupos deinsetos são suscetíveis aos cristais tóxicosde B. thuringiensis e que uma espécie deinseto pode ser afetada por mais de umacepa da bactéria, pois estas freqüentemen-te produzem diferentes proteínas insetici-das. Isso significa que um cristal protéicopode ser tóxico a uma grande variedadede insetos, principalmente lepidópteros.Além disso, as proteínas Cry de B. thurin-giensis podem ter seu efeito alterado deacordo com a radiação solar, temperaturae pH (Nishiitsutsuji-Uwo et al., 1977; Ro-

sas-García et al., 2008).A busca por novos genes cry, que sin-

tetizem novas proteínas Cry, com diferen-tes efeitos inseticidas tem sido uma dasgrandes metas na pesquisa com B. thurin-giensis, desde os primeiros trabalhos pu-blicados sobre a manipulação genética deB. thuringiensis (Schnepf & Whiteley, 1981).

As toxinas Cry têm sido classificadas deacordo com sua homologia na seqüênciade aminoácidos (Figura 1), na qual a de-nominação “Cry” apresenta quatro ranqueshierárquicos de números e letras (maiús-culas e minúsculas), como por exemplo,Cry3Aa2. As proteínas Cry (Tabela 1) comcerca de 45% de homologia em sua seqüên-cia são colocadas no primeiro ranque equando apresentam 78 e 95% de identida-de, constituem o segundo e terceiro ran-que, respectivamente.

Cinco blocos de seqüências são comunsa maioria das proteínas Cry. Quando seanalisa o tamanho destas proteínas tambémfica evidente sua diversidade entre as dife-rentes protoxinas. A extensão C-terminal,encontrada nas proteínas mais longas, nãofaz parte da toxina ativa, pois é digeridapelas proteases no intestino dos insetos,mas pode ter ação na formação do cristal(Schnepf et al., 1998).

A estrutura tridimensional das formasativas das toxinas Cry1 (Grochulski et al.,1995), Cry2 e Cry3 (Li et al.,1991), quandoanalisadas em cristalografia de raio X, mos-traram-se muito similares, cada uma apre-sentando três domínios. As inclusões cris-talíferas ingeridas por larvas susceptíveisdissolvem-se no intestino dos insetos e asprotoxinas inativas são solubilizadas e cli-vadas na longa região C-terminal, por pro-teases intestinais, originando fragmentos re-sistentes a proteases com cerca de 60 kDa(Maagd et al., 2003).

O domínio I, N-terminal, consiste em setealfa-hélices e participa na inserção da mem-brana intestinal e formação do poro. O do-mínio II, ou beta-prisma, apresenta trêsfolhas dobradas simétricas, formando asbeta-folha. O domínio III C-terminal con-siste em duas beta-folha antiparalelas. Es-tes dois domínios estão envolvidos no re-conhecimento dos receptores e ligação,além do domínio III também ter sido asso-ciado à formação de poros (Maagd et al.,2001).


Figura 1. Dendograma de proteínas Cryde Bacillus thuringiensis (Fonte http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt. Acesso em 19/11/2008).


Tabela 1. Classificação e caracterização das proteínas Cry de Bacillus thuringiensis.


L- Lepidoptera; C- Coleoptera; D- Diptera; H- Hymenoptera; N- Nematoda; Le- leucócitos cancerosos humanos.


Figura 2. Dendograma das proteínas Vip sintetizadas por Bacillus thuringiensis(Fonte: http://www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt)

Atualmente, existem 428 proteínas Crydescritas, que estão classificadas em 55 clas-ses Cry (Tabela 1). O autor Crickmore man-tém um site na internet, o qual reúne asinformações sobre todas as toxinas Cry jápublicadas, além de permitir o acesso àscaracterísticas moleculares de cada uma.Estes dados são atualizados periodicamen-te e podem ser acessados no endereço:http: / /www.l i fesci . susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt.

Este número tem crescido regularmen-te, pois a descoberta de novos genes im-plica na obtenção de novas toxinas quepossam ter maior especificidade ou toxici-dade. Dentre os grupos de genes cry maisestudados, destacam-se cry1, cry2, e cry9,os quais já foram descritos com amplo es-

pectro inseticida aos lepidópteros.Dentre estes grupos, os genes cry1 são

os mais freqüentes na natureza, represen-tando mais de 43% dos genes cry caracteri-zados e freqüentemente as bactérias quepossuem genes deste grupo codificam pro-toxinas entre 130 e 140kDa, que são arma-zenados em cristais bipiramidais (Hofte &Whiteley, 1989; Rosas-García et al., 2008;Thammasittirong & Tipvadee, 2008).

O dendograma da Figura 1 mostra osgrupos de proteínas Cry, que são classifi-cados de acordo com a similaridade entrea seqüência de genes que codificam as re-feridas toxinas bacterianas.

De acordo com Crickmore et al. (1998),o primeiro domínio apresenta em torno de45% de similaridade entre si, ao passo que

o segundo domínio mostra-se entre 45 e 75%similares e o terceiro domínio a partir de 75%de similaridade, quando se trata da seqüênciade aminoácidos.

Carlson et al. (1994) relatam que B. thu-ringiensis apresenta em seu genoma de 2,4 a5,7 milhões de pares de bases, e a maioria dosisolados apresentam elementos extra cromos-sômicos lineares ou circulares. Os genes cryestão localizados em plasmídios e muitos iso-lados de B. thuringiensis possuem diversos ge-nes cry responsáveis pela síntese de diferen-tes proteínas inseticidas (Lereclus et al., 1993).Durante seu desenvolvimento, B. thuringien-sis passa por duas fases, a fase vegetativa e aestacionária, semelhantes ao desenvolvimentode Bacillus subtilis.

A primeira fase caracteriza-se pelo cresci-mento exponencial das células de B. thuringi-ensis, momento em que há grande disponibili-dade de nutrientes no meio. A fase estacioná-ria ocorre quando o meio se torna hostil e abactéria adapta-se à diminuição de nutrientesatravés de mecanismos genéticos. A expres-são dos genes cry de B. thuringiensis geral-mente ocorre na fase estacionária da célula,acumulando seu produto na célula mãe, naforma de uma inclusão cristalífera, a qual éliberada no meio ao final da esporulação (Le-reclus et al., 2000). Esta inclusão pode repre-sentar cerca de 25% do peso seco de células jáesporuladas (Agaisse & Lereclus, 1995). Essesautores relatam que apesar da expressão dosgenes cry estarem estreitamente relacionadaao evento da esporulação, existem genes cryque são expressos independentemente da es-porulação.

A quantidade de proteína produzida poruma célula de B. thuringiensis não está direta-mente relacionada com o número de cópiasde genes cry, pois a capacidade de produçãode proteína pela célula, mesmo com apenasuma cópia de um determinado gene cry, podeser elevada. Por exemplo, a cepa B. thuringi-ensis kurstaki HD73, possui apenas uma cópiade gene cry1, mas sintetiza cristais bipirami-dais em quantidades semelhantes àquelas pro-duzidas por cepas que apresentam três ou qua-tro diferentes genes cry1. Desta forma, a sínte-se protéica atinge um limite máximo, com cer-to número de cópias de genes cry na célula eacima deste não há acréscimo na produção detoxinas (Agaisse & Lereclus, 1995).

As toxinas Cry são as mais proeminentesde uma série de fatores que permitem o desen-volvimento de sua virulência à morte ou enfra-quecimento dos insetos. Esses dados sugeremque muitas estirpes de B. thuringiensis podemser consideradas como patógenos oportunistasde insetos. Seria de grande importância umacompreensão mais profunda das verdadeirasfunções ecológicas de B. thuringiensis, tantopara melhorar a confiabilidade da avaliação dosriscos e para o desenvolvimento de métodoseficientes de isolamento de estirpes de B. thu-ringiensis, contendo genes cry ativos.

1.2 Proteínas Vip

As proteínas VIP foram descritas por Estru-


Tabela 2. Proteínas Vip com efeito tóxico a diferentes insetos

ch et al. (1996) e recebem essa denomina-ção por serem produzidas na fase vegetati-va de crescimento de B. thuringiensis. Suaconcentração também permanece alta an-tes e depois da fase de esporulação.

Vários estudos foram realizados apóssua descoberta visando a caracterização,identificação de novos tipos, ação insetici-da e também produção de plantas com ca-pacidade de expressá-las. Estes estudos, po-rém, são incipientes quando comparadoscom as endotoxinas.

A localização dos genes responsáveispor sua produção ainda não foi determina-da, embora existam vários conjuntos deprimers que podem ser utilizados para iden-tificá-las como vip1 e vip2 (Rice, 1999; Fanget al., 2007; Selvapandiyan et al., 2001 )vip3A (Rice, 1999), vip3Aa (Seifinejad et al.,2008), vip5 e vip6 (Loguercio et al., 2002).

A Figura 2 apresenta um dendogramacom as proteínas Vip, já identificadas e ca-talogadas, no site: http://w w w . l i f e s c i . s u s x . a c . u k / h o m e /Neil_Crickmore/Bt. Esse dendograma mos-tra primeiramente dois grandes agrupamen-tos de proteínas onde são encontradas se-qüências genéticas semelhantes entre si,

subdivididos em cinco grupos menores, deacordo com essa seqüência genética. Per-cebe-se, claramente que esses cinco gru-pos similares são formados por proteínasda mesma classe, ou seja, Vip1, Vip2 e Vip3. A diferença entre a seqüência de genesque codificam essas proteínas é que definesua classificação, como Vip1Aa, Vip1Ab, en-tre outras.

De acordo com Rang et al. (2005), asproteínas Vip2 exibem entre 21 e 22% desimilaridade com a proteína Vip3Ba1, en-quanto as proteínas da classe Vip1 são en-tre 8 e 22% similares à Vip3Ba1.

Segundo Fang (2007) estas proteínasrepresentam uma das maiores descobertasde toxinas com capacidade inseticida, sen-do extremamente relevante a ausência desimilaridade nas seqüências de aminoáci-dos destas proteínas com as seqüências deaminoácidos das endotoxinas, especialmen-te, em termos de manejo e evolução daresistência.

De acordo com o dendograma da Fi-gura 2, estas proteínas são classificadas emtrês subfamílias diferentes (Crickmore et al.,2005), sendo que ocorrem em torno de 15%das cepas de B. thuringiensis avaliadas por

Estruch (1996) e 23% das cepas avaliadaspor Rice (1999). As subfamílias Vip1 e Vip2(Tabela 2) são componentes de uma pro-teína binária com atividade inseticida con-tra Diabrotica virgifera e D. longicornis(Han et al., 1999; Warren, 1997). As prote-ínas Vip 3 são ativas contra lepidópteros(Tabela 2), como Spodoptera frugiperda eHelicoverpa zea. Seu modo de ação estárelacionado à formação de poros na mem-brana do epitélio do intestino médio (Yuet al., 1997; Loguercio et al., 2002; Lee etal., 2003). Ao mesmo tempo que a Vip 3apresentou toxicidade sobre lepidópterose não mostrou efeitos sobre insetos não-alvo (Whitehouse, 2007).

Devido a sua atividade inseticida rela-cionada a Heliothis zea, as proteínas Vip3A estão sendo expressas em plantas dealgodão, conferindo resistência ao inseto.Nesse sentido, Bommireddy et al. (2007),avaliaram plantas de algodão modificadassomente com a proteína Vip 3A, ou com acombinação de Vip 3A e Cry 1Ab (Vip Cot)nos lepidópteros H. zea e H. virescens. Con-siderando o comportamento das lagartas,os resultados desses autores mostram quehouve maior índice de infestação em plan-tas não modificadas em relação às demais(Vip 3A e Vip Cot).

O conjunto desses dados demonstraque às proteínas Vip são promissoras nocontrole de insetos-praga, uma vez que pos-suem diferenças estruturais em relação àsdemais proteínas de B. thuringiensis, o quepode retardar o processo de resistência naspopulações de insetos.

1.3 Demais fatores de virulênciade B. thuringiensis

Além das proteínas Cry e Vip, os isola-dos de B. thuringiensis podem sintetizarproteínas denominadas Cyt, que possuematividade citolítica in vitro e especificidadein vivo aos dípteros (Höfte & Whitheley,1989; De Maagd et al., 2003). De acordocom esses autores fazem parte desse gru-po as proteínas Cyt1Ca e Cyt2Aa e seumodo de ação também pode estar relacio-nado a um sinergismo com outras toxinasproduzidas pelos isolados.

O entomopatógeno também produzoutros fatores de virulência, como as β-exotoxinas, α-exotoxinas, hemolisinas, en-terotoxinas, quitinases e fosfolipases (Höf-te & Whiteley, 1989; De Maagd et al., 2001).Esses autores declaram desconhecida aexata contribuição de cada fator na viru-lência da bactéria, sendo uma dificuldadedeterminar o espectro tóxico de um isola-do que sintetiza mais de uma proteína. Issoporque, quando os fragmentos tóxicos vãose ligar aos receptores da membrana dointestino médio do inseto, ocorre uma com-petição pelos sítios de ligação, que podeinterferir na toxicidade do isolado.

Guttmann & Ellar (2000) identificaramisolados de B. thuringiensis com a presen-ça de hemolisinas, quitinases e lecitinases,


sendo eles: Bt kurstaki, Bt israelensis, Btfukuokaensis Bt kyushuensis, Bt darmasta-diensis, Bt thompsoni, Bt tolworthii e Bt os-trinae. Já as subespécies Bt galleriae, Bt ai-zawai e Bt wuhanensis apresentaram so-mente hemolisina e quitinase.

Os mesmos autores também relatam apresença do gene que codifica a enteroto-xina, uma toxina produzida por diferentescepas de B. thuringiensis, com peso mole-cular em torno de 45kDa, e que pode sertóxica a vertebrados, uma vez que é análo-ga à toxina produzida por B. cereus. Con-siderando a análise de 13 isolados de B.thuringiensis avaliados, 9 foram positivospara o gene entS que codifica a enterotoxi-na. No mesmo sentido, Rivera et al. (2000)avaliaram 74 isolados do entomopatógeno,em relação a presença dos genes bce, hbl enhe para a enterotoxina. Os seus resulta-dos mostram que o gene nhe foi o maisfreqüente, seguido de hbl e bce mostrandoassim, uma pequena diferença na distribui-ção desses genes entre B. thuringiensis eB .cereus.

Outros dados de pesquisa sobre ente-rotoxina (Ngamwongsatit et al., 2008), re-velaram a presença dos genes hbl, nhe, cytKe entFM em 205 isolados de B. thuringien-sis e 411 isolados de B. cereus. Os dadosdesses autores mostram que, em 149 isola-dos de B. thuringiensis todos os genes ocor-reram simultaneamente, sendo os genes nhee entFM aqueles de menor freqüência. Es-ses autores relatam a importância desseconhecimento uma vez que a enterotoxina

pode causar intoxicação alimentar, quan-do relacionada ao patógeno B. cereus.

Em relação à β-exotoxina, também cha-mada thuringiensina, é uma proteína compeso molecular de 0,7 kDa (Gohar & Per-chat 2001), insespecífica, termoestável,identificada por inibir a síntese de rRNA(Mackedonski & Hadjilov, 1972) e prejudi-car a formação do fuso mitótico, dentreoutros efeitos observados em ensaios in vi-tro com Alium cepa (Sharma & Sahu, 1977).Por ser inespecífica e tóxica a vertebrados,a thuringiensina é avaliada em testes labo-ratoriais, utilizando roedores como cobai-as.

Os dados de Ohba et al. (1981) mos-tram que, de 740 isolados de B. thuringi-ensis avaliados quanto a presença da β-exo-toxina, 28 produziram essa toxina. Alémdesses, dois isolados da espécie B. subtilis,um isolado de B. natto e dois isolados daespécie B. megaterium também foram pro-dutores da thuringiensina.

Nesse sentido, Hernandéz et al. (2003)revelam que 79% dos isolados de B. thu-ringiensis thuringiensis são produtores des-sa toxina, seguidos de 20% para B. thurin-giensis kenyae, 13% para B. thuringiensiskurstaki, contrastando com 0% de produ-ção para B. thuringiensis aizawai.

Na Tabela 3 constam dados sobre a pro-dução da β-exotoxina pelas diferentes su-bespécies de B. thuringiensis.

A thuringiensina também apresenta ati-vidade inseticida a diferentes espécies deinsetos-praga, como demonstra o trabalho

de Barreto et al. (1999) utilizando S. frugiper-da em seus ensaios de toxicidade. Porém, de-vido as suas propriedades não específicas aosinsetos, ou seja, pode também afetar organis-mos não-alvo, os isolados bacterianos que sãoprodutores dessa toxina não podem ser co-mercializados para serem utilizados na agri-cultura visando o controle de insetos-praga.

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Tabela 3. Subespécies de Bacillus thuringiensis produtores da βββββ-exotoxina


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Pesquisa

Pesquisa

MECANISMO DE AÇÃODE BACILLUS THURINGIENSIS

Lidia Mariana Fiuza

Engenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),

Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em

biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).

estudo do modo de ação dasproteínas Cry de B. thuringi-ensis será abordado revelan-do a especificidade dessas to-

xinas através da detecção de receptorespresentes no sistema digestivo dos in-setos-alvo. O tema trata do modo deação completo de B. thuringiensis, des-de a ingestão do entomopatógeno até amorte do inseto. O processo de análisede receptores nos tecidos dos insetos édescrito detalhadamente, envolvendodiferentes abordagens metodológicas dedetecção de sítios de ligação das prote-ínas inseticidas e uma discussão comdados de diversos autores que desen-volvem pesquisas nessa área.

1.1 Modo de ação das proteínasCry de B. thuringiensis

As análises do modo de ação dasproteínas Cry de B. thuringiensis visamesclarecer os mecanismos pelos quaisestas proteínas exercem seu efeito en-tomopatogênico e elucidar a especifici-dade das diferentes toxinas (Endo eNishiitsutsuji-Uwo, 1980; Höfte e Whi-teley, 1989; Gill et at., 1992; Schnepf etal., 1998; Fiuza, 2004). Considerando oconjunto de informações atualmente dis-poníveis sobre as fases entre a ingestãodos cristais e a morte das larvas dos in-setos suscetíveis às proteínas Cry de B.thuringiensis, descreve-se como fases domecanismo de ação:

(i) Inicia pela solubilização dos cris-tais em pH alcalino no intestinomédio dos insetos, liberando asprotoxinas de 130-140 kDa paraCry1 e 70 kDa para Cry2. Essaetapa é determinante à especifi-cidade do isolado de B. thurin-giensis à espécie alvo, tanto pelaalcalinidade do sistema digesti-vo quanto pela composição doscristais de B. thuringiensis.

(ii) Protoxinas são ativadas pelasenzimas digestivas, formandofragmentos tóxicos de 60-65 kDa.Nessa etapa tanto a composiçãoproteolítica quanto a estruturaprotéica do cristal são importan-tes.

(iii) Toxinas reconhecem receptoresespecíficos às microvilosidadesdas células epiteliais do intesti-no médio das larvas suscetíveisàs quais elas se ligam. Os estu-dos realizados com BBMV (BrushBorder Membrane Vesicles) iso-ladas de larvas de lepidópterosmostram que a ligação de forteafinidade entre a toxina e o re-ceptor é reconhecido como umfator importante na determinaçãodo espectro inseticida das prote-ínas Cry (Fiuza et al., 1996). Da-dos de pesquisa mostram que háuma correlação positiva entre aligação, in vitro, da toxina noreceptor intestinal e a toxicida-de, in vivo. Por outro lado, ou-tros estudos descrevem que oreconhecimento do receptor énecessário, mas não é suficientepara provocar a toxicidade, su-gerindo a existência de outrosfatores relacionados ao modo deação das proteínas Cry. Em 1994,Knight et al., isolaram de BBMVde larvas de Manduca sexta


Figura 1. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, revelados nos tecidos delarvas de lepidópteros, com fosfatase alcalina e peroxidase (Fiuza, 1995)

(Lep., Sphingidae) uma amino-peptidase N implicada na inte-ração da toxina Cry1Ac. Os mo-delos de receptores atualmen-te descritos mostram que uminseto pode apresentar, emquantidade variável, diversasclasses de receptores que po-dem ser reconhecidos por di-ferentes toxinas. Dados de pes-quisa revelam que estes mode-los podem explicar a especifi-cidade das toxinas de B. thu-ringiensis.

(iv) Após o reconhecimento do re-ceptor, a toxina induz a forma-ção de poros na membrana ce-lular do epitélio intestinal. Aformação dos poros na mem-brana celular provoca o dese-quilíbrio iônico entre o cito-plasma e a o meio externo àcélula. As análises histopatoló-gicas realizadas após a intoxi-cação dos insetos mostram adestruição das microvilosida-des, hipertrofia das células epi-teliais, vacuolização do cito-plasma e lyse celular, levandoo inseto a paralisia e morte.

Na seleção das proteínas insetici-das, sintetizadas por essa bactéria, asanálises in vitro dos receptores mem-branares podem viabilizar uma rápidadeterminação do espectro de ação dasproteínas Cry contra as espécies alvo,sendo em seguida efetuada a avalia-ção da toxicidade in vivo, apenas paraos isolados pré-selecionados como ati-vos in vitro. Sendo assim, o presentetrabalho trata de diferentes métodosde análise de receptores de proteínasde B. thuringiensis em formas imatu-ras de lepidópteros.

1.2 Análise de receptores emcortes histológicos de insetos

1.2.1 Tecidos dos insetosAs larvas de insetos podem ser

obtidas de coletas a campo, as quaisdevem passar por um período de qua-renta em condições controladas, ouoriundas de criação massal de insetosmantida em laboratório, em condiçõescontroladas de temperatura, umidaderelativa e fotofase, as quais podemvariar de acordo com a espécie do in-seto. Os tubos digestivos dos insetossão dissecados e fixados 24 h, em Bou-in Hollande Sublimé a 10%, lavadospor 12 h em água destilada e desidra-tados em séries crescentes de etanol,70 a 100% (Brandtzaeg, 1982). Em se-guida os tecidos são impregnados em

banhos mistos (etanol/tolueno/pa-raplasto) e incluídos em paraplasto100% a 58oC. Os cortes longitudi-nais ou transversais, de 7 a 10 µmde espessura, preparados com mi-crótomo LKB, são montados em lâ-minas de vidro, tanadas com poly-l-lysina a 10%, e conservadas a 4oCpara posterior análise de recepto-res em cortes histológicos.

1.2.2 Proteínas CryAs cepas de B. thuringiensis po-

dem ser cultivadas em meio usualglicosado por aproximadamente 5dias, conforme o método de Mahi-llon & Delcour (1984). Após a lisebacteriana devem ser centrifugadase lavadas com tampão fosfato, pH6. Os cristais são separados dos es-poros e das células bacterianas emgradiente de renografina ou saca-rose por ultra centrifugação, con-forme metodologia descrita porSharpe et al. (1975). As bandas, con-tendo os cristais puros, são lavadase diluídas em água milli-Q esterili-zada, contendo phenylmethylsul-fonyl (PMSF).

As proteínas Cry são solubiliza-das em tampão fosfato, pH 10. EssepH deve ser ajustado a 8,6 por diá-lise contra o tampão 20 mM Tris eas proteínas Cry são ativadas porbovine pancreatic trypsin (Type I),sendo a reação inativada com tryp-sin inhibitor (Type II). A pureza ea integridade das proteínas pode seravaliada por eletroforese em gel depoliacrilamida a 10%, SDS-PAGE(Laemmli, 1970). A concentração

pode ser determinada pelo método Bra-dford (1976), usando a bovine serum al-bumin (BSA) como proteína padrão.

1.2.3 Proteínas biotiniladasAs proteínas Cry podem ser biotini-

ladas, conforme o método descrito porBayer & Wilcheck (1990), onde a incor-poração da biotina na parte N-terminalda proteína é feita usando o BNHS (bi-otinyl-N-hydroxysuccinimide) em tam-pão de bicarbonato de sódio, pH 9. Oproduto da reação deve ser purificadoem sephadex G-25 (Sigma) e as fraçõesbiotiniladas identificadas por dot-blot,onde se utiliza membrana de nitrocelu-lose, o conjugado de estreptavidina-fos-fatase-alcalina diluída no tampão TST(Tris-Saline-Triton, pH 7;6) e o substra-to de revelação (BCIP e NBT em tam-pão Tris; pH 9,5). A concentração dasproteínas Cry biotiniladas pode ser de-terminada pelo método Bradford (1976),usando a BSA como proteína padrão. Apureza e a integridade das proteínasmarcadas pode ser avaliada em western-blot, usando membrana de nitrocelulo-se (Sigma) e o tampão Towbin, pH 8,3com 10% etanol. As membranas podemser reveladas usando a mesma técnicadescrita no dot-blot.

1.2.4 AnticorposAs proteínas Cry são preparadas,

conforme descrito anteriormente napurificação, e depois são utilizadas naobtenção de anticorpos em pequenosanimais como: coelhos, ratos e camun-dongos, entre outros. O soro coletadodos animais é utilizado na obtenção dasimunoglobulinas (IgGs), as quais podem


Figura 2. Receptores de proteínas Cry biotiniladas, detectados nostecidos de larvas de lepidópteros com fluoresceína e observados emmicroscopia de varredura laser (Fiúza, 1995)

ser separadas em colunas de sepharoseprotein-A e as frações purificadas porafinidade incubando os IgGs e as mem-branas de nitrocelulose, contendo osantígenos previamente transferidos porwestern-blot conforme descrito porBurke et al. (1982). A especificidade esensibilidade dos anticorpos policlonaisé determinada pelo método de dot-blote ELISA - Enzyme-linked immunosor-bent assay.

1.2.5 Detecção in vitro de recepto-res

As análises in vitro dos receptoresde proteínas Cry de B. thuringiensis sãorealizada com cortes histológicos do sis-tema digestivo das larvas dos insetos emestudo. A detecção propriamente ditacorresponde a incubação dos tecidoscom as proteínas, previamente despa-rafinados e reidratados.

Nas análises com proteínas Cry bio-tiniladas, os cortes histológicos são in-cubados à temperatura ambiente, duran-te 1h, com as proteínas biotiniladas. Asproteínas não ligadas aos sítios recep-tores são removidas com TST, pH 7,6.

Na etapa posterior, os tecidos sãotratados com estreptavidina conjugadaa uma enzima (peroxidase ou fosfatasealcalina) ou fluorocromo (fluoresceínaou ficoeritrina), diluídos em tampão TST.O complexo da reação “proteína-recep-tor”, usando o conjugado com enzimaspode ser revelado com substrato DABpara peroxidase e BCIP/NBT para fos-fatase alcalina (Figura 1), sendo as sec-ções montadas com Pertex, entre lâmi-

na e lamínula de vidro.Nas revelações com fluorocromos,

com a fluoresceína (Figura 2), os corteshistológicos são montados com Mowiole conservados a 4°C para análise emmicroscopia óptica - MO ou microsco-pia de varredura Laser – MVL.

Nas análises imunohistoquímicas,com proteínas não marcadas (proteínasnativas), os receptores são reveladoscom o complexo anticorpo primário(AC

1, específico contra a proteína Cry)

e anticorpo secundário (AC2, dirigido

contra o AC1) conjugado a uma enzima

ou fluorocromo, os quais são reveladose montados de acordo com o métododescrito anteriormente. As testemunhassão preparadas pela omissão alternadade cada etapa da reação, a fim de elimi-nar a hipótese de reações falso-positi-vas. As amostras reveladas com enzimas,tipo peroxidase e fosfatase alcalina,podem ser avaliadas em microscopiaóptica. Para as análises onde são utili-zados os fluorocromos pode ser utiliza-da a microscopia de fluorescência con-vencional ou de varredura laser.

1.3 Considerações

As marcagens detectadas na regiãodas microvilosidades das células do epi-télio intestinal revelam a presença dereceptores membranares às proteínasCry, nas microvilosidades das célulasepiteliais do intestino médio das larvasdos insetos (Figuras 1 e 2).

No caso dos tecidos tratados comocontrole, representantes da omissão al-

ternada dos diferentes componentes dareação, pode-se observar a ausência decoloração nas microvilosidades das cé-lulas do epitélio intestinal dos insetosem estudo.

As imunodetecções e as detecçõesde proteínas Cry biotiniladas foram uti-lizadas por diversos autores, para reve-lação de receptores membranares intes-tinais, em larvas de diferentes espéciesde lepidópteros (Bravo et al., 1992a;Denolf et al., 1993a; Estada e Ferre, 1994;Fiuza, 1995), de dípteros (Ravoahangi-malala et al., 1993) e de coleópteros(Bravo et al. 1992b; Denolf et al., 1993b;Boets et al., 1994). Esses autores com-provaram que as ligações das proteínasCry nas microvilosidades do intestinomédio das larvas de insetos correspon-dem à existência de um receptor espe-cífico à referida proteína no inseto-alvo.

Considerando, os estudos dos recep-tores in vitro e as análises da toxicidadein vivo, pode-se inferir que os métodosde detecção de receptores membrana-res podem ser aplicados na seleção dasproteínas ativas contra insetos, haven-do uma correlação positiva entre as aná-lises in vitro e in vivo. Porém, para de-terminar a Concentração Letal Média(CL

50) de uma proteína Cry faz-se ne-

cessário o bioensaio uma vez que as li-gações das proteínas aos receptorespodem variar em concentração e afini-dade, como já descrito por diversos au-tores, para diferentes espécies de inse-tos (Denolf et al., 1993a; Van Rie et al.,1990; Fiuza et al., 1996; Lee et al., 1996;Hua et al., 2001). Também há estudosdemonstrando que as proteínas Cry tó-xicas aos insetos correspondem àque-las que se ligam de forma irreversívelaos receptores das células epiteliais dosinsetos alvo (Liang et al., 1995).

No controle biológico de insetos, aespécie Bacillus thuringiensis ofereceas melhores alternativas à produção debiopesticidas e à engenharia genética deplantas. Sendo assim, é fundamentalavaliar o espectro de ação e a especifi-cidade das proteínas potencialmenteinseticidas e, nesse contexto, Fiuza(2004) menciona que a análise in vitrodos receptores membranas pode serconsiderada uma ferramenta indispen-sável face ao grande número de isola-dos, cepas e proteínas de B. thuringi-ensis já identificados, que representamum potencial no manejo de insetos-pra-ga.

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Pesquisa

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TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSISÀS PRAGAS AGRÍCOLAS

controle microbiano de inse-tos tem sido considerado ummétodo de controle seguroaos humanos e ao meio am-biente, sendo assim nesse tra-

balho são apresentados dados de toxi-cidade de B. thuringiensis a insetos-praga, especialmente aos lepidópterose coleópteros pragas de importânciaagrícola. Os trabalhos de pesquisa en-fatizam os métodos de ensaios toxico-lógicos em laboratório e campo, utili-zando o entomopatógeno B. thuringi-ensis e as formas imaturas das espéci-es-alvo.

1.1 Os insetos-praga

Entre os insetos-praga para os quaistêm sido desenvolvidos estudos e apli-cações de controle com B. thuringien-sis estão os lepidópteros, Spodopterafrugiperda e Anticarsia gemmatalis, eo coleóptero Oryzophagus oryzae, osquais serão apresentados como mode-lo de estudos de toxicidade com B. thu-ringiensis.

A lagarta militar, S. frugiperda, ata-

ca e causa danos a várias culturas deimportância econômica, como: sorgo,milho, arroz, alfafa, cana-de-açúcar e al-godoeiro (Cruz et al., 1999; Gallo et al.,2002), ao passo que, a lagarta da soja A.gemmatalis é praga-chave para essa cul-tura e também tem importância paraculturas como amendoim, feijão e alfa-fa (Gallo et al., 2002). Já o gorgulho aqu-ático, O. oryzae, cujas larvas são conhe-cidas como bicheira-da-raiz-do-arroz, éo principal inseto-praga da cultura doarroz irrigado no sul do Brasil (Martinset al., 2004) e, por isso, é também umdos mais estudados pelas instituições depesquisa dessa região (Costa, 2003).

As lagartas de S. frugiperda e A. gem-matalis podem ser criadas em laborató-rio, desde que respeitados determina-dos padrões de temperatura, umidaderelativa e fotoperíodo (28ºC, 70%U.R.,12h de fotoperíodo). O ciclo evolutivodesses insetos, em laboratório, ocorreem torno de 30 dias, desde a fase deovo até a emergência do adulto. Os adul-tos são mantidos em gaiolas de acrílicocom alimentação a base de glicose aquo-sa (10%), onde acasalam e realizam apostura. Os ovos são retirados diaria-mente e acondicionados junto à dietaartificial, sendo dieta de Poitout para S.frugiperda e dieta de Greene para A.gemmatalis. As lagartas desenvolvem-se nessa dieta até a formação da pupa,que então são separadas em macho oufêmea até emergir o adulto, finalizandoo ciclo.

No caso de O. oryzae, por se tratarde uma larva aquática, que se alimentadas raízes das plantas de arroz, não édescrito nenhum método de criação efi-ciente desse inseto, em laboratório. Por-tanto, quando realizados os bioensaios,esses insetos são coletados diretamentede áreas de plantio de arroz infestadas,trazidos ao laboratório para então se-

Diouneia Lisiane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).


Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).

Neiva KnaakBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutorandaem Biologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).

Rogério SchünemannBiólogo (UNISINOS) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).

Jaime Vargas de OliveiraEngenheiro Agrônomo (UFSM), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade/Entomologia(UFPEL),

Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutoraem Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologiaVegetal (CIRAD-Montpellier).


rem utilizados nos ensaios biológicos.

1.2 Bioensaiosde B. thuringiensis

com os insetos-praga

Para determinar a atividade insetici-da de isolados bacterianos, os bioensai-os podem ser classificados como preli-minares ou seletivos. A utilização desuspensão de células e esporos bacteri-anos é uma forma de identificar isola-dos ativos cujas propriedades mostrameficiência no controle de insetos-praga.

Bioensaios também são utilizadospara determinar a Concentração LetalMédia (CL

50), ou seja, a quantidade de

entomopatógeno que deve ser utilizadapara controlar a metade da populaçãodo inseto. Para esses, são usados os iso-lados que causaram um eficiente índicede mortalidade nos testes preliminares.Nesta análise são utilizadas suspensõescontendo células e esporos ou a prote-ína purificada, dosados em diferentesconcentrações. Os ensaios de toxicida-de são importantes também, pois reve-lam injurias e detrimento morfológico,além de determinar em quanto tempoocorre a morte do inseto, Tempo LetalMédio (TL

50). Esses dados são então ana-

lisados para que, quando aplicado emlavouras, o bioinseticida seja eficienteno controle dos insetos-alvo.

Os ensaios utilizando as lagartas deS. frugiperda e A. gemmatalis podemser realizados em mini-placas de acríli-co, contendo dieta artificial, onde é apli-cada a quantidade de inóculo pré-de-terminada para uma lagarta por placa(Figura 1A). A quantidade de insetospode variar entre 20 e 50 e o número derepetições entre três e cinco. No caso

do coleóptero O. oryzae, os testes podemser realizados em tubos de ensaio con-tendo uma planta de arroz, água e a sus-pensão bacteriana, com 5 larvas do inse-to por tubo (Figura 1B). Todos os bioen-saios utilizam placas ou tubos controle,contendo os insetos e sem adição dos tra-tamentos. Os ensaios são acondicionadosem câmaras climatizadas nas mesmas con-dições de criação ou manutenção dos in-setos em laboratório, descritas anterior-mente. Os experimentos são avaliados atéo 7º dia após a aplicação dos tratamentose os dados são utilizados para o cálculoda mortalidade corrigida pela fórmula deAbbott (1970).

1.3 Controle de S. frugiperdacom B. thuringiensis

Apesar de inúmeras pesquisas envol-vendo esse lepidóptero e seu controle, hádificuldade em encontrar um isolado bac-teriano patogênico a essa espécie. Essaafirmação é comprovada no trabalho dePolanczyky et al. (2003) que, utilizando58 subespécies de B. thuringiensis em S.frugiperda demonstraram que apenas B.thuringiensis morrisoni apresentou 80%de mortalidade das lagartas. Também Sil-va et al. (2004), testaram 77 isolados sen-do que somente 4 foram ativos a espécie-alvo.

Recentemente, Berlitz & Fiúza (dadosnão publicados) testaram 132 isoladosonde apenas um apresentou alta toxici-dade ao inseto, com 100% de mortalida-de, quando utilizada a suspensão de cé-lulas e esporos bacterianos. Em outro tra-balho, Berlitz et al. (2003) testaram 24 iso-lados de B. thuringiensis provenientes dediversas regiões orizícolas do RS e obteveas maiores mortalidades entre 31,6 e 100%

com apenas cinco isolados, sendo que acepa com maior potencial inseticida foianalisada quanto ao perfil protéico con-firmando a presença de proteínas ativascontra lepidópteros. As reduzidas taxas demortalidade podem estar relacionadas adiferentes fatores, como por exemplo, omodo de ação das proteínas bacterianasno intestino do inseto, ou modificaçõesno sítio de ligação dessas toxinas na mem-brana intestinal. Além disso, cada isoladotem uma característica genética particu-lar, ou seja, essas toxinas são codificadaspor genes e esses têm uma determinadaespecificidade.

Em outro trabalho, Berlitz & Fiuza(2004) testaram B. thuringiensis aizawaiproveniente do produto formulado Xen-tari® mostrando que a suspensão celularapresentou CL

50 de 1,9x108 UFC/mL (Uni-

dade Formadora de Colônia/mL) reduzin-do em 56,7% o consumo alimentar daslagartas. Isso indica que a bactéria inibe aalimentação do inseto-praga, o que tam-bém está relacionado com a mortalidadedas lagartas.

Entretanto o fato de um isolado cau-sar mortalidade às lagartas não implicaque, quando purificadas as proteínas tó-xicas, essas serão ativas ao inseto. É o queocorreu na pesquisa de Berlitz (2006), que,quando utilizada a suspensão de célulase esporos bacterianos obtiveram 100% demortalidade, entretanto quando purifica-das as proteínas do isolado, essas causa-ram baixa mortalidade às lagartas apre-sentando CL

10 de 268µg/mL. Esse fato pode

estar relacionado ao conjunto de fatoresde virulência presentes na bactéria, ouentão a presença de outras toxinas como,por exemplo, proteína Vip, exotoxinas, he-molisinas, quitinases, entre outras, queestão presentes na suspensão bacteriana.

Figura 1. Bioensaios com lagartas de Spodoptera frugiperda (A) ou Anticarsia gemmatalis e larvas deOryzophagus oryzae (B)


A CL50 de proteínas Cry de B. thu-

ringiensis aizawai para lagartas de 3ºínstar de S. frugiperda foi determina-da por Lucho (2004). As proteínas Cryforam obtidas a partir de bioinsetici-da comercial (Xentari®), purificadasem gradiente de sacarose, solubiliza-das em tampão fosfato (pH 10) e ava-liadas em SDS-PAGE. Nos bioensaiosforam avaliadas seis concentrações deproteínas Cry (0,27 a 8,80 µg/mL) etestemunha (água destilada e esterili-zada), sendo aplicados 10 µL sobre asuperfície de folhas de milho acondi-cionadas em mini-placas de acrílico,contendo um inseto. Cada tratamen-to foi constituído de 30 lagartas e 3repetições, totalizando 630 insetos.

Os resultados obtidos por Lucho(2004) apontaram CL

50 de 2,22; 0,41 e

0,18 µg/mL para 2, 3 e 4 dias após aaplicação dos tratamentos, respecti-vamente, e revelaram que as proteí-nas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1C e Cry1Dsintetizadas por B. thuringiensis ai-zawai são altamente tóxicas à S. fru-giperda.

Para a mesma espécie, S. frugi-perda, os dados de Knaak et al. (2006)mostram que a toxicidade das prote-ínas Cry1Ab e Cry1Ac, sintetizadas porB.thuringiensis thuringiensis 407 (pH408) e B.thuringiensis kurstaki HD-73, respectivamente, revelaram umaCL

50 de 9,29 e 1,79 µg/cm2 às lagartas

de 1º instar.Nesse sentido, os dados de Lam-

bert et al. (1996) revelam que a pro-teína Cry1Ac é muito tóxica para He-liothis virescens, mas não mostra ne-nhuma atividade contra Helicoverpaarmigera. Os mesmos autores rela-tam que Cry1Ca exibe uma atividadeforte contra S. exigua e S. littoralis,mas não contra S. frugiperda. Peyron-net et al. (1997) utilizaram Cry1Aa emLymantria dispar causando uma des-polarização rápida e irreversível damembrana intestinal, mas Cry1Ab eCry1Ac eram inativas. Estes resulta-dos estão de acordo com Van Franke-nhyzen et al. (1991) que demonstra-ram um nível alto de toxicidade paraCry1Aa, mas nenhuma atividade àsoutras duas toxinas, confirmando as-sim a especificidade das proteínas Cryde B. thuringiensis aos lepidópteros.

Considerando os isolados brasi-leiros, Praça et al. (2004) selecionan-do cepas de B. thuringiensis efetivascontra lagartas de 2º ínstar de S. fru-giperda, compararam novas cepas aoB. thuringiensis kurstaki HD-1 (CL

50

de 0,285 µg/cm2), obtendo CL50 de

0,09 e 0,52 µg /cm2, para S234 e S997,respectivamente, que revelou a novacepa S234 como a mais tóxica à S.

frugiperda. Já nos estudos com proteí-nas Cry, Aranda et al. (1996) determina-ram que a CL

50 para S. frugiperda das

proteínas Cry1Ab e Cry1Ac foram supe-riores a 2 µg/cm2.

1.4 Controle de A. gemmataliscom B. thuringiensis

As análises de mortalidade de isola-dos de B. thuringiensis às lagartas de A.gemmatalis, realizados por Schünemann(2006), mostraram que entre os 158 iso-lados testados, 138 foram ativos e 20inativos. Entre os isolados patogênicos,39 deles causaram até 29% de mortali-dade, 93 entre 30 e 69% e 6 entre 70 e100%. Análises similares foram encon-trados por Bobrowski et al. (2001) como mesmo banco de bactérias.

Azambuja & Fiuza (2003) obtiveram37 e 50% de mortalidade corrigida con-tra a lagarta-da-soja utilizando dois iso-lados naturais de B. thuringiensis pro-venientes de regiões orizícolas do RS.Nas avaliações de patogenicidade reali-zados com isolados primitivos, Souza etal. (1999) e Silva et al. (2004), revelamgrandes índices de isolados patogêni-cos a mesma ordem de inseto. Por ou-tro lado, a ocorrência de isolados inati-vos a lepidópteros é bastante freqüen-te. As variações entre as concentraçõesde proteínas inseticidas presentes emcada suspensão bacteriana pode ser acausa dessas diferenças entre a ativida-de inseticida dos isolados.

A ausência de patogenicidade de iso-lados de B. thuringiensis pode estar re-lacionada à classe de proteínas sinteti-zadas pelo mesmo, a qual não apresen-ta especificidade ao inseto praga-alvo.Porém, Fiuza (2003) e Praça et al. (2004)destacam que o mesmo isolado bacteri-ano pode ter atividade inseticida sobreespécies da mesma ordem, ou até mes-mo a outras ordens de insetos.

Em muitos casos a diferença de to-xicidade das cepas de B. thuringiensispode estar relaciona ao próprio inseto,onde, por exemplo, a extensão da vari-ação genética de A. gemmatalis podeestar relacionada a transferência de ge-nes entre populações geográficas e otempo em que essas populações encon-tram-se separadas, onde o mecanismode isolamento reprodutivo se torna umabarreira efetiva (Sosa-Gómez, 2004).Sendo assim, os dados da suscetibilida-de de A. gemmatalis aos diferentes iso-lados de B. thuringiensis são importan-tes para um manejo local ou regionaldesse inseto-praga, pois em m trabalhosenvolvendo cepas de B. thuringiensiskurstaki, por exemplo, Mascarenhas etal. (1998) e Dias et al. (1999) encontra-ram diferentes índices de mortalidade

da mesma espécie.

1.5 Controle de O. oryzaecom B. thuringiensis

Para O. oryzae são relacionados pou-cos dados na literatura a respeito da açãode proteínas de B. thuringiensis. Por setratar de uma larva que se alimenta dasraízes da planta de arroz, portanto ficasubmersa, é difícil o acesso de bioinseti-cidas ao local. Os atuais métodos de con-trole dessa praga restringem-se aos inseti-cidas químicos que são utilizados basica-mente no tratamento de semente ou dis-tribuídos em cobertura na água de irriga-ção.

Na busca de métodos alternativos decontrole desse inseto, o entomopatógenoB. thuringiensis mostra-se promissor naobtenção de plantas transgênicas resisten-tes à praga-alvo. Nesse sentido, Pinto etal. (2003), selecionaram 6 isolados de B.thuringiensis com a presença de genesda classe cry 3 ou cry 7, que sintetizam asproteínas inseticidas à ordem dos coleóp-teros, e avaliaram sua atividade inseticidaà O. oryzae. Dentre os isolados testadospelos autores, dois causaram mortalidadecorrigida de 100%, três entre 59 e 67% eum em torno de 50%.

Esses dados foram utilizados por Ber-litz (2006) que selecionou um isolado coma presença do gene cry3 que causou 53%de mortalidade com a suspensão de célu-las e esporos bacterianos, onde as prote-ínas inseticidas foram purificadas, dosa-das e aplicadas nos bioensaios com osinsetos (Figura 1B). Os resultados dessapesquisa podem ser aplicados na utiliza-ção de genes cry, uma vez que causou amortalidade das larvas do coleóptero,quando utilizadas às proteínas purificadas,obtendo uma CL

50 de 5,4µg/mL. Em estu-

dos preliminares com essa espécie-alvo,Steffens et al. (2000) obtiveram 53,41% demortalidade às larvas do gorgulho aquáti-co com um isolado de B. thuringiensiscontendo genes cry 3, específicos a cole-ópteros. Considerando os dados mencio-nados, os resultados obtidos pelos dife-rentes autores confirmaram a predição daatividade inseticida de B. thuringiensispossivelmente devido à presença dos ge-nes cry3 e cry7, os quais codificam toxi-nas específicas a coleópteros (Ben-Dov etal., 1997).

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as interações com as plan-tas, as formigas e os cupinspodem se tornar pragas enesse caso faz-se necessárioo controle, onde os entomo-patógenos assumem um pa-

pel importante no controle biológico.Nesse contexto, alguns dados de pes-quisa sobre os ensaios de toxicidadede B. thuringiensis às formigas corta-deiras e aos cupins de montículo sãoapresentados nesse artigo.

1.1 Os insetos sociais

Nas sociedades de insetos, o siste-ma de castas possibilita uma divisãodo trabalho, permitindo a execução demúltiplas tarefas, nas quais indivíduosestéreis são responsáveis pela manu-tenção da colônia (obtenção de alimen-to, defesa e cuidados com a prole), eos reprodutores limitam-se a reprodu-ção. O Brasil está entre os países quecontemplam a maior diversidade de

Pesquisa

Pesquisa

TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSIS

AOS INSETOS SOCIAIS

insetos sociais do mundo.As formigas estão entre os orga-

nismos mais abundantes do planeta,somando, em conjunto, mais de 10%da massa de todos os organismos ter-restres, incluindo mamíferos de gran-de porte (Hölldobler e Wilson, 1990).De acordo com estes autores, em umhectare da Floresta Amazônica vivemmais de oito milhões de formigas.

As formigas cortadeiras são osprincipais herbívoros dos Neotrópi-cos. Abundantes nas suas numero-sas colônias desfolham a vegetação,sendo consideradas importantes pra-gas agrícolas no Brasil, com prejuí-zos estimados em milhões de reais.O gênero Acromyrmex representauma ameaça às plantas cultivadas.Esses insetos também se destacampor atacarem uma ampla variedadede vegetais, incluindo plantas orna-mentais, reflorestamento e pastagens.As diferentes espécies deste gêneroapresentam ampla distribuição geo-

Figura 1. Bioensaios com cepas de Bacillus thuringiensis e Nasutitermesehrhardti, em laboratório

Raquel de Castilhos-FortesBióloga (UNISINOS) e Mestre em MicrobiologiaAgrícola e do Ambiente (UFRGS)


Laura Massochin Nunes PintoBióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).

Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora emCiências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) ePós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).


gráfica no Rio Grande do Sul, eviden-ciando hábitos de forrageamento bas-tante diversos (Gusmão e Loeck, 1999).

Os cupins estão presentes pratica-mente em todos os ambientes terres-tres ou que sofreram alguma pertur-bação antrópica, alimentando-se basi-camente de celulose, obtida atravésdesta capacidade de ajustar-se a di-versos ecossistemas. Muitas espéciesdesempenham um papel ecológicosignificativo, reciclando nutrientesminerais no solo e participando na re-generação de ambientes devastados.Porém, várias outras espécies se des-tacam como os organismos mais da-ninhos à cultura agrícola e florestal(Berti-Filho, 1993). No Brasil, além dedificultarem seriamente os tratos cul-turais, os cupins de montículo são con-siderados importantes pragas de pas-tagens e culturas de arroz, milho, cana-de-açúcar, amendoim e eucalipto. Asprincipais espécies responsáveis porestes danos pertencem aos gênerosCornitermes, Syntermes, Heterotermes,Nasutitermes, entre outros.

O controle desses insetos vem sen-

do realizado basicamente com a apli-cação de inseticidas químicos, sendoum método alternativo as bactérias en-tomopatogênicas que podem ser iso-ladas naturalmente do corpo dessesinsetos, representando mais uma fer-ramenta de combate ao inseto-praga,sem prejudicar o meio ambiente.

1.2 B. thuringiensisisolados de insetos-sociais

Na análise da patogenicidade deB. thuringiensis sobre um determina-do inseto, o primeiro passo a ser ado-tado é a correlação da atividade dasproteínas Cry no inseto-alvo já descri-ta. Caso este efeito ainda não tenhasido avaliado, uma das alternativaspoderá ser por meio do isolamento domicrorganismo de indivíduos da es-pécie de inseto-alvo. Diversos traba-lhos são publicados anualmente des-crevendo o isolamento de novas ce-pas de B. thuringiensis de diferentessubstratos, inclusive dos próprios in-setos (Borm et al., 2002). Nesse senti-do, Azambuja et al. (2001) obtiveram,

a partir de 80 indivíduos de Acromyr-mex sp., 35 isolados do gênero Baci-llus, entre os quais 14 foram identifica-dos como B. thuringiesis. Através des-te estudo pode-se constatar a elevadaocorrência de B. thuringiensis associa-do a formigas cortadeiras.

Para tanto, os insetos devem ser co-letados com pinça e acondicionados emfrascos esterilizados a -18ºC até o mo-mento de sua utilização. O isolamentoé realizado através da maceração de10 insetos em solução salina, sendo que1mL desta suspensão é submetida apasteurização, em seguida a inocula-ção em Ágar Nutriente e incubaçãodurante 24h a 30°C.

As colônias obtidas devem ser en-tão inoculadas em meio seletivo (Peni-cilina G) e mantidas a 30°C e 180rpmdurante 24 horas. As amostras positi-vas devem ser avaliadas em microsco-pia de contraste de fase para identifi-cação das inclusões paraesporais, ca-racterísticas de B. thuringiensis.

Os isolados de B. thuringiensis,oriundos de A. lundi, que causarammortalidade ao referido inseto foramavaliados por PCR quanto a sua consti-tuição de genes cry conforme descritopor Pinto et al. (2003). Os autores iden-tificaram que sete dos nove isoladosque apresentaram toxicidade a A. lun-di amplificaram fragmentos de DNAcorrespondentes a pelo menos uma dasclasses de genes cry avaliadas, sendoelas cry1 e/ou cry9. Os genes cry2,cry3, cry7 e cry8, os quais tambémforam avaliados na pesquisa, não fo-ram detectados nas amostras testadas.Além disso, 22% dos isolados obtidosde A. lundi não amplificaram com ne-nhum dos primers avaliados, podendo

Figura 2. Representação esquemática dos bioensaios com Acromyrmexlundi e Bacillus thuringiensis

Figura 3. Patogenicidade de Bacillus thuringiensis à Nasutitermes ehrhardti, em ensaios de laboratório; B. thuringiensissooncheos (Bts); B.thuringiensis roskildiensis (Btr); B. thuringiensis yunnanensis (Bty); B. thuringiensis huazhongensis (Bth);B. thuringiensis braliliensis (Btb); B. thuringiensis colmeri (Btc) e B. thuringiensis kurstaki (Btk)


representar novos genes cry.

1.3 Bioensaios de B. thuringiensiscom insetos-sociais

Cupins e formigas sofrem ação de di-versos tipos de patógenos como: vírus,bactérias, fungos e nematóides, sendo adefesa contra os mesmos pouco conheci-da. A complexidade do comportamento ea biologia dificultam o controle destes in-setos (Leonardo, 1989; Diehl-Fleig, 1993).Portanto, técnicas de bioensaios eviden-ciando o efeito desses entomopatóge-nos sobre os insetos sociais, considera-dos pragas, são escassos. Nessa linha depesquisa, Castilhos-Fortes et al. (2002)avaliaram a patogenicidade de diferen-tes cepas de B. thuringiensis, sobre Na-sutitermes ehrhardti, onde foram utili-zadas suspensões contendo uma misturade células vegetativas, esporos e cristais.Porções de celulose (1cm2), utilizadascomo substrato alimentar, foram mergu-lhadas nas suspensões de B. thuringien-sis, as quais foram colocadas em placasde acrílico com seis compartimentos de5,5 cm de diâmetro. Em cada comparti-mento, contendo 1cm2 de celulose trata-da, foram colocados dez insetos (Figura1).

O acondicionamento dos ensaios foifeito em estufa incubadora tipo B.O.D., a28O C, 70% de umidade relativa, no escu-ro. A mortalidade dos insetos foi avaliadadiariamente até o 7° dia após a instalaçãodos bioensaios, observando-se os cupinsmortos com sintomas característicos deintoxicação por B. thuringiensis.

Em 2003, Pinto et al. testaram o efei-to de B. thuringiensis em formigas cor-tadeiras, cujo método de bioensaio foidesenvolvido objetivando a sobrevivên-cia dos indivíduos por no mínimo setedias, tempo suficiente para a avaliaçãode bioensaios. Esse método foi constitu-

ído de uma dieta líquida composta depeptona bacteriológica, glicose e extra-to de levedura, com substituição perió-dica de 48 horas, previamente acondici-onada em pequenos frascos de polipro-pileno, acrescida de cinco indivíduos deAcromyrmex lundi (Figura 2).

Utilizando o referido método de bi-oensaio de B. thuringiensis comAcromyrmex lundi, pode-se obter 100%de sobrevivência das formigas por 180horas (7,5 dias), tempo suficiente para aavaliação dos bioensaios com o ento-mopatógeno.

1.4 Toxicidade de B. thuringiensisaos cupins e formigas cortadeiras

As referências de B. thuringiensiscontra isópteros são restritas, havendopoucos dados disponíveis, como os deCowie et al. (1989), que citam algumascepas de B. thuringiensis tóxicas a vári-as espécies de térmitas em condiçõeslaboratoriais. Khan et al. (1985), tambémressaltam a carência de trabalhos desen-volvidos visando testar B. thuringiensisem térmitas, embora tenham citado ostrabalhos de Smythe & Coppel (1965),os quais constataram que a solução comB. thuringiensis mostrou-se tóxica a trêsespécies de Reticulitermes, bem como aZootermopsis angusticollis. Khan et al.(1977) isolaram B. thuringiensis a partirde ninfas do isoptero Bifiditermes bee-soni infectadas, encontradas em campo.Nos testes de toxicidade contra Micro-cerotermes champion, a suspensão debactérias testada causou alta mortalida-de em condições laboratoriais.

Considerando a patogenicidade deB. thuringiensis para N. ehrhardti, Cas-tilhos-Fortes el al. (2002) testaram 57cepas desta bactéria, sendo que setemostraram-se mais efetivas: B. thuringi-ensis sooncheon (Bts) e B. thuringiensis

roskildiensis (Btr) com uma mortalidadede 100%; seguidos dos isolados B. thu-ringiensis yunnanensis (Bty) com 71,4%;B. thuringiensis huazhongensis (Bth)com 57,1%; B. thuringiensis brasiliensis(Btb) com 52,3%; B. thuringiensis col-meri (Btc) com 42,85% e B. thuringien-sis kurstaki (Btk) com 28,57% de morta-lidade ao 7o dia após a aplicação dos tra-tamentos, conforme resultados apresen-tados na Figura 3.

Para a determinação da CL50 de B.

thuringiensis os referidos autores utili-zaram os isolados B. thuringiensis soon-cheon e B. thuringiensis roskildiensis osquais causaram 100% de mortalidade nosensaios pré-seletivos. As CL

50 de B. thu-

ringiensis sooncheon observadas foram46,98x108, 66,19x106 e 5,14x105 esporos/ml, aos três, cinco e sete dias após ostratamentos, respectivamente. Para B.thuringiensis roskildiensis foram30,78x105, 48,40x106 e 16,80x104 espo-ros/ml aos três, cinco e sete dias, res-pectivamente.

A toxicidade de B. thuringiensis paraN. ehrhardti foi confirmada pelos auto-res através de observações microscópi-cas de cupins macerados aos três, cincoe sete dias após a aplicação dos trata-mentos. As estruturas de B. thuringien-sis formadas por células em forma debastonete, cadeias, esporos e inclusõesparaesporais podem ser observadas naFigura 4A para B. thuringiensis soon-cheon e na Figura 4B para B. thuringi-ensis roskildiensis.

A patogenicidade e o desenvolvimen-to de B. thuringiensis foram estudadospor Khan et al. (1985) nos isópteros Mi-crotermes championi e Bifiditermes be-esoni, que se mostraram suscetíveis àinfecção causada pela bactéria após aaplicação do formulado Thuricide-HP.De acordo com a análise histopatológi-ca, foi constatado que a ação de B. thu-

Figura 4. Isolados de Bacillus thuringiensis a partir da maceração de Nasutitermes ehrhardti infectados;A- Bacillus thuringiensis soocheon; B- Bacillus thuringiensis roskildiensis


ringiensis é mais rápida em M. champio-ni quando comparado a B. beesoni, sen-do o intestino médio do inseto invadidopela bactéria seis horas após a ingestão,a qual penetra a cavidade corporal, o te-cido adiposo e células hipodérmicas 20 a24 horas após a infecção. Em B. beesoni,a bactéria instalou-se próximo à membra-na peritrófica depois de 24 horas, atacouo epitélio e células regenerativas após 48horas e alcançou a membrana basal dointestino médio 72 horas após a infec-ção.

Nos estudos do efeito patogênico deB. thuringiensis contra A. lundi foramidentificados isolados ativos contra estaformiga cortadeira, sendo que o isoladoBt HA48 atingiu 100% de mortalidade (Pin-to et al., 2003).

1.5 Perspectivas

Em insetos sociais, aspectos comohábitos comportamentais devem ser con-siderados, uma vez que a eliminação deuma porção da colônia não é suficientepara a extinção. Os fragmentos restantestêm capacidade de recuperação e novainfestação, portanto há necessidade deeliminação da rainha das colônias (Mar-tins, 1998).

O uso de organoclorados é o métodomais utilizado para controlar populaçõesde cupins e formigas e embora, commenos freqüência, outros métodos podemser citados como o controle cultural, açãode predadores e aplicação de extratosvegetais (Wilcken e Raetano, 1995).

O controle biológico é uma alternati-va ao controle químico e vem ganhandodestaque em pesquisas de manejo depopulações de pragas. Os principais or-ganismos utilizados para o controle deformigas e cupins são microrganismospatogênicos, em especial fungos e nema-tóides, e até o momento poucas pesqui-sas foram realizadas em laboratório comB. thuringiensis.

As pesquisas têm publicado resulta-dos satisfatórios no controle de formigasutilizando os fungos Beauveria bassiana,Metarhizium anisopliae e Paecilomycesfarinosus (Loureiro e Monteiro, 2005),além do microsporídeo Thelohania sole-nopsae (Williams e Deshazo, 2004). Omesmo ocorre com cupins avaliados fren-te a fungos entomopatogênicos, como B.bassiana (Bao & Yendol, 1971) e M. aniso-pliae (Kramm & West 1981; Hänel 1981 e1982).

Diferentes estudos visam determinarquais os organismos patogênicos como fun-gos ou nematóides, que poderiam ser utili-zados contra os térmitas. Os resultados,geralmente, têm sido discrepantes. Outras

linhagens ou espécies de patógenos deve-riam ser testadas contra os térmitas subter-râneos, mas os testes de campo devem serprecedidos de estudos de laboratório paradeterminação da patogenicidade dos dife-rentes patógenos e linhagens. Isto pode aju-dar a avaliar o potencial do agente patogê-nico e fornecer a base para estimar as con-centrações requeridas em campo.

Fernandes (1994) relatou que os princi-pais problemas enfrentados na pesquisasobre controle biológico de cupins são acarência de conhecimentos biológicos, opequeno número de taxonomistas que tra-balha com isópteros e a falta de outros gru-pos trabalhando em conjunto neste assun-to.

Contudo, bactérias entomopatogênicaspodem ser consideradas agentes de contro-le biológico com potencial de patogenici-dade e surgem como uma alternativa efici-ente, ecológica e econômica para a soluçãodos danos causados por cupins e formigas.

1.6 Referências

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Pesquisa

Pesquisa

TOXICOLOGIA DE BACILLUS THURINGIENSISÀS PRAGAS URBANAS E VETORES

utilização de bactérias en-tomopatogênicas do gêne-ro Bacillus, como agente decontrole populacional depragas urbanas e vetores deagentes patogênicos, tem

relevância nas pesquisas nacionais e inter-nacionais. Sendo assim, esse trabalho tratado controle desses insetos, utilizando as es-pécies B. thuringiensis e B. sphaericus,onde se destacam as características das es-pécies do grupo Bacillus, sua ocorrência ealguns dados de autores que realizaram pes-quisas na área da saúde pública.

1.1 Bacillus spp. no controle devetores de doenças

1.1.1 Insetos vetores de doençasAlgumas espécies dos gêneros Anophe-

les, Aedes, Culex e Mansonia podem serimportantes vetores de patógenos huma-nos responsáveis por enfermidades comomalária, febre amarela, encefalite, denguee filariose. Estas doenças atingem um nú-mero significativo de pessoas em diversos

países da Ásia, África e Américas. O Culexquinquefasciatus é responsável pela trans-missão da Wuchereria bancrofti, agente eti-ológico da filariose bancroftiana no Brasil,além de ser um potencial vetor para o Ví-rus do Oeste do Nilo (VNO), originado naÁfrica, onde as aves são os hospedeiros ereservatórios naturais, podendo acometero homem, cavalos e outras espécies, cau-sando desde febre, dor de cabeça e mialgi-as até encefalite severa e meningite. Desde1999 ocorrem epidemias da doença nosEUA e, até o momento, já foram registra-dos mais de 19 mil casos de infectados commais de 750 óbitos (Centers for DiseaseControl and Prevention, 2006). Recente-mente, o vírus passou a circular no Caribee já foi isolado na Colômbia e em cavalosmortos na Argentina (Berrocal, 2006; Mo-rales, 2006). O Brasil tem um plano de vi-gilância para detectar a introdução do VNOno país, visto que o Cx. quinquefasciatus,potencial vetor, é abundante, além de umcontingente considerável de aves migrató-rias que ocorre no país por ser origináriode rotas das Américas e de países vizinhos,onde ocorre a circulação do vírus (Luna etal., 2003).

É importante ressaltar que há uma gran-de dificuldade do controle populacionaldestes mosquitos devido a suas caracterís-ticas biológicas como curto ciclo de vida,alta capacidade reprodutiva e de adapta-ção ao ambiente. O controle, através douso de inseticidas químicos tem apresenta-do problemas devido ao seu modo de açãonão específico, além da possibilidade derápida seleção de resistência de insetos aestes compostos. Por estas razões, a pro-cura por agentes mais seletivos aumentoue, com isso, a adoção de métodos de con-trole biológico cresceu (Centers for Disea-se Control and Prevention, 2006).

1.1.2 Bactérias entomopatogênicasA microflora bacteriana dos insetos,

confinada no intestino, é rica, diversa ecompreende bactérias Gram-positivas enegativas. Entre as bactérias Gram-positi-vas, algumas auxiliam na digestão dos ali-mentos, porém outras são patogênicas erecebem grande atenção dos pesquisado-

res devido ao seu potencial para o contro-le de pragas (Priest, 2000; Fiuza, 2001). Entreestes patógenos destacam-se as bactériasdo gênero Bacillus, com potencial biopes-ticida que representam cerca de 90% domercado mundial (Schnepf et al., 1998), sen-do amplamente utilizados como uma alter-nativa aos inseticidas químicos em termosde segurança a organismos não-alvo equando ocorre o desenvolvimento de re-sistência a inseticidas químicos (Rodrigo-Simón et al., 2006).

Duas espécies de bactérias entomopa-togênicas se destacam no controle biológi-co dos insetos vetores: B. sphaericus e B.thuringiensis israelensis. Estes microrganis-mos estão sendo comercializados há maisde uma década, pois produzem proteínasinseticidas que, ao serem ingeridas, são le-tais para as larvas dos mosquitos devido asua ação no trato digestivo. O Bti tem ativi-dade decrescente para os gêneros Aedes,Simulium, Culex e Mansonia, já o B. spha-ericus é particularmente eficiente para ocontrole de larvas de Cx. quinquefasciatuse produtos comerciais à base desta bacté-ria estão disponíveis no Brasil.

O principal fator tóxico do B. sphaeri-cus para larvas de Cx. quinquefasciatus é atoxina binária (Bin) contida em um cristalprotéico produzido durante a fase de es-porulação da bactéria. Após a ingestão destecristal pelas larvas, ocorre a sua solubiliza-ção em pH intestinal alcalino e a protoxinaliberada no lúmen é clivada por serinopro-teases para atingir a forma de toxina ativa.A toxina Bin ativa interage com receptoresespecíficos presentes na membrana apicaldas células do epitélio intestinal das larvas,principalmente nas regiões do ceco gástri-co e intestino posterior.

O B. sphaericus apresenta uma grandevantagem em relação ao Bti: a ótima per-sistência em criadouros ricos em matériaorgânica, típicos de larvas de Culex, alémde seus esporos sofrerem reciclagem noscadáveres das larvas, o que pode ampliarseu período de persistência nos criadouros(Nicolas et al., 1987; Skovmand & Baudu-in, 1997).

Populações de larvas de Culex podemapresentar resistência ao B. sphaericus após

Gabriela Cristina AllesBióloga (UNISINOS) e Mestre eDoutoranda em Biologia: Diversidade eManejo de Vida Silvestre (UNISINOS).

Marcus HübnerBiólogo (FURG) e Mestre em Biologia:Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).

Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia – Fitossanidade(UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) ePós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).


Mortalidade Corrigida (%)

Tratamentos B. germanica P. americana

B.t. sorovar colmeri 6,65 0,0B.t. sorovar yunnanensis 14,85 0,0B.t. sorovar huazhangiensis 15,00 0,0B.t. sorovar roskildiensis 16,65 0,0B.t. sorovar sooncheon 30,00 0,0

Tabela 1. Mortalidade corrigida de Blatella germanica ePeriplaneta americana, submetidas aos tratamentos comsorovares de Bacillus thuringiensis

serem submetidas à forte pressão de sele-ção, sob condições de laboratório (Amo-rim, 2007; Georghiou, 1992; Pei, 2002; Rod-charoen & Mulla, 1994) ou de campo(Mulla, 2003). Estes resultados apontampara a necessidade de racionalizar o usodo B. sphaericus, a fim de evitar a seleçãode populações resistentes.

A primeira população resistente obtidasob condições de laboratório, foi submeti-da à forte pressão de seleção e atingiu umnível de resistência da ordem de 100.000vezes, em relação à colônia susceptível(Georghiou, 1992). Em outro estudo reali-zado em laboratório, foram selecionadasduas colônias de Cx. quinquefasciatus, noBrasil e na China, que atingiram um altonível de resistência (>100.000) (Pei, 2002).Também foi demonstrado que é possívelselecionar a resistência ao B. sphaericuscepa IAB59, sob condições de laboratório,embora, esta seleção tenha ocorrido deforma mais lenta em relação ao B. sphaeri-cus 2362. O nível de resistência chegou amais de 40.000 vezes (Amorim, 2007). Emcampo, já foram detectadas populações comníveis de resistência variáveis na França(Chevillon, 2001), Índia (Rao, 1995), China(Yuan, 2000), Tunísia (Nielsen-Leroux,2002) e na Tailândia (Mulla, 2003). O pro-cesso de seleção da resistência em popula-ções de campo é modulado por diversosfatores que incluem o background genéti-co da população, bem como fatores ecoló-gicos e ambientais.

1.1.3 Controle integrado de vetoresO conceito do Manejo Integrado de

Vetores (MIV) surgiu como resultado deuma mudança de paradigma após o usointensivo de inseticidas químicos nas dé-cadas de 1940-60. Em outras palavras, oMIV é definido como uma combinação ra-cional de diversos métodos de controledisponíveis, objetivando manter a popula-ção de vetores em níveis aceitáveis e damaneira mais efetiva, econômica e segura,incluindo componentes biológicos, quími-cos, físicos e ambientais, visando interferiro mínimo possível no ecossistema. No MIV,várias ações são empregadas na tentativa

de englobar todas as causas do problema.No âmbito do controle de mosquitos, estasações podem incluir a melhoria da rede deesgoto e distribuição de água, eliminaçãofísica de criadouros, uso de barreiras físi-cas nas habitações, medidas de proteçãoindividual, uso de larvicidas específicos emcriadouros que não podem ser eliminados,além da conscientização e participação dacomunidade. Dentre estas ações, o uso debiolarvicidas apresenta vantagens, como aespecificidade para o inseto alvo e segu-rança para o meio ambiente (Georghiou etal., 1992).

O principal objetivo de estratégias decontrole integrado de vetores é reduzir adensidade populacional de mosquitos paraníveis em que a atividade é minimizada oua transmissão de doenças reduzidas ou in-terrompida com o mínimo de efeitos ambi-entais.

Idealmente, programas de controle in-tegrado devem incluir intervenções maiseficazes e ambientalmente compatíveis.Devido à sua eficácia e aparente especifi-cidade, tanto Bt israelensis quanto B. spha-ericus podem ser ideais para o programaintegrado de controle de pragas. (Lacey &Orr, 1994). A combinação de Bt israelensiscom outros agentes de controle biológicoresultou em um excelente controle e, emalguns casos, a supressão prolongada delarvas de mosquitos.

Mulligan & Schaefer (1982) relataramum controle inicial de larvas de Cx. tarsa-lis em uma das zonas úmidas em que otratamento com Bt israelensis foi seguidopor abatimento em longo prazo com lar-vas de insetos predadores. Do mesmomodo, Mulla et al. (1993) observaram queas populações de Cx. quinquefasciatus, Cx.stigmatosoma e Cx. tarsalis não se recupe-raram após o tratamento com Bt israelensisdevido a subsequentes predações de lar-vas por macroinvertebrados aquáticos euma redução na oviposição atrativa da pe-cuária local.

Regis & Nielsen-Leroux (2000) revisan-do estratégias de manejo de resistência B.sphaericus recomendaram o acompanha-mento da susceptibilidade das espécies-alvo

de B. sphaericus antes e durante o trata-mento, alternando o uso de B. sphaericuscom Bt israelensis. Zahiri et al. (2004) de-monstraram que utilizando suspensões demisturas contendo formulações comerciaisde Bt israelensis e B. sphaericus, não resul-tou em resistência em colônias de Cx. quin-quefasciatus, enquanto que somente sus-pensões de B. sphaericus gerou resistên-cia.

1.2 B. thuringiensisno controle de baratas

Segundo Wilson (1972), estudos com-parativos realizados entre famílias primiti-vas de térmitas e baratas revelaram a exis-tência de múltiplas características em co-mum que, segundo o autor, poderiam con-siderar os térmitas como baratas sociais,cujos diagramas de filogenia, não só refor-çam este parentesco, como também, rela-cionam a evolução da flora microbiana in-testinal entre as ordens Isoptera e Blatto-dea.

Nesse contexto, a partir do trabalho deCastilhos-Fortes et al. (2002), Hübner (2004)testou cinco isolados de B. thuringiensisem Blatella germanica e Periplaneta ame-ricana: B. thuringiensis yunnanensis, B.thuringiensis colmeri, B. thuringiensis hua-zhangiensis, B. thuringiensis sooncheon eB. thuringiensis roskildiensis, oriundos doInstituto Pasteur, Paris.

Para o estudo, adultos e ootecas de B.germanica e P. americana foram coleta-dos em estabelecimentos comerciais e re-sidenciais, no município de Gramado, RioGrande do Sul. Ambas as espécies perma-neceram em caixas de plástico (564 x 385x 371 mm e 400 x 270 x 362 mm), com asbordas superiores preenchidas com umamistura de água e talco neutro, para evitara fuga dos insetos. A umidade foi mantidaatravés de algodão umedecido, trocado acada 48 horas. Substratos de papelão cor-rugado foram utilizados para mimetizar seuhábitat natural. Na alimentação foi utiliza-da 0,5 g de ração animal moída Whiskas ,sendo os insetos mantidos em condiçõescontroladas (30ºC, 70% de U.R., 12h foto-fase).

Nos bioensaios, baratas adultas de am-bas as espécies foram agrupadas em caixasplásticas (262 x 177 x 85 mm), contendoplacas de Petri com algodão umedecido emágua destilada e outra contendo 0,5g deração animal moída e 1000µL das suspen-sões bacterianas a 1.1010 células/mL. Nastestemunhas, os isolados foram substituí-dos por água destilada esterilizada. Paracada isolado bacteriano e cada espécie fo-ram utilizados 30 insetos. A mortalidade foianalisada durante 7 dias após a aplicaçãodos tratamentos e corrigida pela fórmulade Abbott (Alves, 1998).

Os dados de patogenicidade, utilizan-do os cinco isolados de Bacillus thuringi-ensis, demonstraram uma baixa ação tóxi-ca sobre B. germanica (6,65% a 30% demortalidade), e uma inatividade (0% de

mortalidade) à P. americana, levando-se emconsideração que os índices de mortalidadecorrigida apresentados na Tabela 1.

Apesar de Wilson (1972) ter descrito umparentesco evolutivo entre as famílias primiti-vas de térmitas e baratas, inclusive quanto asua flora bacteriana, o presente estudo de-monstra que não há uma correlação da açãode B. thuringiensis sobre B. germanica e P.americana, pertencentes às famílias mais evo-luídas.

Cavados (2003) cita que o controle bioló-gico com bactérias entomopatogênicas temcomo principal vantagem a especificidade.Dependendo da composição de proteínas Cryno cristal bacteriano, os isolados podem apre-sentar um espectro de ação limitado às or-dens de insetos (Fiuza, 2001). Assim, os da-dos obtidos sugerem que as delta-endotoxi-nas produzidas pelos cinco isolados de B. thu-ringiensis testados não apresentam proteínasCry com ação tóxica para a ordem Blattodea,uma vez que causaram uma menor ação so-bre os insetos-alvo do trabalho de Hübner(2004).

Lambiase et al. (1996) mencionam umadiferenciação na localização dos sítios bacte-rianos em B. germanica e P. americana, oque poderia justificar o fato de ter-se obtidouma ação inseticida para a primeira espécie euma ausência de efeito para a segunda.

Também forma realizados ensaios de to-xicidade in vivo para verificar a ação de B.thuringiensis oswaldocruzi (H-38) e B. thu-ringiensis brasiliensis (H-39) contra Peripla-neta americana e Blatella germanica. Porém,nesses ensaios não houve ação patogênica dascepas avaliadas às duas espécies de baratasutilizadas nos bioensaios (Hübner, 2004).

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Pesquisa

INTERAÇÕES DE BACILLUS THURINGIENSISE O CONTROLE DE FITOPATÓGENOS

s tratamentos fitossanitáriosconstituem uma rotina noscultivos agrícolas, os quaisvisam o controle de plantasdaninhas, insetos e fitopató-genos. Como agentes do ma-

nejo integrado das culturas, os pesquisa-dores têm priorizado a aplicação de inimi-gos naturais (parasitóides e predadores),extratos vegetais e microrganismos. Nessecontexto, dados referentes às interaçõesdesses agentes de controle são apresenta-dos, com ênfase nas bactérias entomopa-togênicas da espécie B. thuringiensis. Con-siderando o controle biológico de fitopa-tógenos, a doença não é só a interação entrepatógeno e hospedeiro, mas o resultadoda interação entre patógeno, hospedeiro euma série de microrganismos não patogê-nicos que também repousam no sítio deinfecção. Esses agentes não patogênicos po-dem limitar ou aumentar a atividade do pa-

tógeno, ou a resistência do hospedeiro. Osucesso do biocontrole depende das pro-priedades antagonistas e dos mecanismosde ação do hiperparasita. Desse modo,nesse trabalho são apresentadas várias pes-quisas que relatam o efeito antagônico deB. thuringiensis aos fungos fitopatogênicos.

1.1 Interações de métodosde controle de insetos

O interesse por obter produtos agríco-las em sistemas sustentáveis estimula o es-tudo e o uso de estratégias do Manejo In-tegrado de Pragas (MIP) e do Manejo Eco-lógico de Pragas (MEP). Sendo assim, ex-tratos vegetais apropriadamente seleciona-dos e em concentrações adequadas podemser usados em associação com entomopa-tógenos obtendo-se efeitos aditivos ou si-nergéticos no controle (Saito & Luchini,1998).

Segundo os autores, o efeito estressordesses extratos sobre a praga pode deter-minar uma ação mais rápida do entomopa-tógeno e/ou um maior índice de mortali-dade. Assim essa associação pode ser posi-tiva ou benéfica quando o inseto-alvo temmecanismos comportamentais de defesacontra entomopatógenos, quando as con-dições ambientais não são favoráveis ou asquantidades de inóculo necessárias são ele-vadas.

Nesse sentido, Lucho (2004) estudou ainteração entre B. thuringiensis aizawai eextrato de folhas de Melia azedarach (ci-namomo) para o controle de lagartas deSpodoptera frugiperda, em laboratório. Napesquisa foram avaliados quatro tratamen-tos: extrato de folhas de M. azedarach; B.thuringiensis aizawai; mistura de B. thu-ringiensis aizawai e extrato de M. azeda-rach; controle (água destilada) sendo amortalidade das lagartas observada diaria-mente, até o sétimo dia após aplicação dostratamentos (DAT). O uso de B. thuringi-ensis, isoladamente ou em associação como extrato de M. azedarach mostrou-se letalno 1º DAT. Nas lagartas submetidas somenteao extrato, a mortalidade iniciou aos 2 DATe ao final do bioensaio, a mortalidade acu-mulada foi maior na associação do biopes-ticida e do inseticida botânico. Os percen-tuais de mortalidade de S. frugiperda ob-servados aos 7 DAT foram de 55, 70 e 90%para os tratamentos com extrato, B. thu-ringiensis aizawai e a associação de B. thu-ringiensis aizawai com extrato de M. aze-

Neiva KnaakBióloga (UNISINOS) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).


Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).


Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS), Doutora emCiências Agronômicas (ENSAM-Montpellier) ePós-Doutora em biotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).


darach, respectivamente. Assim, foi obser-vado um efeito sinérgico dos ingredientesativos de B. thuringiensis aizawai e extra-to de M. azedarach contra S. frugiperda,pois o resultado da associação foi superiorao uso dos bioinseticidas isoladamente.

Apesar disso, a interação de métodosde controle nem sempre apresenta o efeitodesejado sobre o inseto. Isso foi demons-trado por Berlitz (2006) que utilizou B. thu-ringiensis simultaneamente com o cinamo-mo, M. azedarach. As concentrações utili-zadas nesse trabalho não demonstrarameficiência, pois a mortalidade do lepidóp-tero S. frugiperda foi de, apenas 6% e paralarvas do coleóptero Oryzophagus oryzaefoi de 11%. Esse fato pode estar associadoa um possível efeito inibitório da bactériasobre o extrato vegetal ou vice-versa.

Em relação ao uso simultâneo de bio-inseticidas, Sabbour (2003) realizou ensai-os com extrato das folhas e óleo volátil deTaxodium distichum (L. Rich) e Boswellacarterri, em combinação com a bactéria B.thuringiensis e o fungo Beauveria bassia-na (Vuillemin, 1912), em pragas de produ-tos armazenados. Em seus resultados a com-binação dos entomopatógenos com as plan-tas, reduziu significativamente o valor daConcentração Letal Média (CL50), conformemostra a Tabela 1.

De acordo com Novan, (1992) a utili-zação de extratos vegetais reduz a alimen-tação do inseto através de seus aleloquími-cos, o que otimiza a atividade inseticida domicrorganismo, resultando em um maioríndice de mortalidade.

Já os autores Zhang et al. (2000) utili-zaram B. thuringiensis kurstaki em diferen-tes concentrações e suplementado com trip-sina de soja mostrando uma inibição nocrescimento larval de H. armigera (P<0,05).Em ensaios in vitro e in vivo, os autorescomentam que a degradação das toxinasde B. thuringiensis pode ser inibida pelatripsina da soja. Os dados sugerem que otempo de retenção das toxinas no intesti-no médio das larvas foi estendido, ocor-rendo também um sinergismo entre os cris-tais inseticidas da bactéria e os inibidoresde tripsina da soja.

No caso do uso interativo de B. thu-ringiensis com nematóides entomopatogê-nicos, Koppenhöfer e Kaya (1997) utiliza-

ram B. thuringiensis japonensis e nematói-des em larvas de Cyclocephala hirta e C.pasadenae (Coleoptera: Scarabaeidae) mos-trando que essa interação apresentou mai-or mortalidade que os tratamentos indivi-duais, viabiliando assim o uso integradodesses organismos.

B. thuringiensis também pode ser utili-zado em combinação com outros micror-ganismos para o controle de insetos-praga.Nesse sentido, Broderick et al. (2000), iden-tificaram um aumento de 35% da mortali-dade do lepidóptero Lymantria dispar (L.)quando usado B. thuringiensis e zitermici-na A de B. cereus, sendo que a zitermicinaé responsável pelo efeito sinergético dosmicrorganismos. Primeiramente porqueessa substância acumula-se em grandesquantidades nas culturas de B. cereus, se-gundo porque quando utilizada individu-almente não causa efeito sobre o inseto,somente em combinação com B. thuringi-ensis, aumentando a mortalidade de L. dis-par.

Os resultados de Wraight & Ramos(2005) também demonstram sinergismo de35,2; 33,8; e 21,1% quando utilizado simul-taneamente um produto comercial a basede B. thuringiensis e do fungo B. bassianaem Leptinotarsa decemlineata. Esses auto-res revelam que a interação pode ter sidoocasionada pela intoxicação causada peloentomopatógeno, inibindo a alimentaçãodo inseto, ocasionando uma situação deestresse, e efeitos fisiológicos, o que facili-tou a penetração do fungo no inseto. Efei-tos semelhantes também foram observadospor Ma et al. (2008), quando utilizada aproteína Cry 1Ac de B. thuringiensis comB. bassiana. Esses autores observaram efei-tos deletérios na mortalidade das larvas deOstrinia furnacalis (Lepidoptera: Crambi-dae), além de diminuição na formação depupas e na emergência dos insetos adul-tos.

Os autores Brousseau et al., (1998) tam-bém encontraram efeitos sinergéticos quan-do avaliada a combinação de B. thuringi-ensis kurstaki com destruxinas do fungo M.anisopliae para combater larvas de Choris-toneura fumiferana (Clemens, 1865) (Le-pidoptera: Tortricidae).

Outra forma de controle integrado foiavaliada por Petry et al. (2004) utilizando

B. thuringiensis e controle mecânico de es-pécies de Simulium, revelando 88,83% de ín-dice reducional médio de larvas dos mos-quitos. Já Andrade & Modolo (1991) testa-ram B. thuringiensis israelensis em misturacom o pesticida temephos contra A. aegypticausando 91 e 98% de mortalidade corrigida,diminuindo o tempo letal médio. O modode ação das proteínas de B. thuringiensis is-raelensis foi avaliada por Gómez et al. (2007)demonstrando que a presença da proteínaCyt1Aa aumenta a capacidade de ligação, namembrana intestinal do inseto, da proteínaCry11A. Isso porque a proteína Cyt depoisde solubilizada expõe regiões específicas namembrana, promovendo a ligação da prote-ína Cry e aumentando assim, sua atividadeinseticida.

Essas informações indicam que se tornacada vez mais importante as pesquisas nessaárea, uma vez que a aplicação de inseticidasquímicos resulta em grandes impactos nosagroecossistemas, pois atingem não somenteos inimigos naturais dos insetos, mas tam-bém contaminam o solo e os lençóis de águasubterrâneos.

1.2 Interações tri-tróficas

Para um melhor entendimento dos agro-ecossistemas, é importante estudar as rela-ções existentes entre as espécies e suas teiasalimentares, que constituem um complexo deinterações tróficas onde há interesse em in-terações tri-tróficas visando a utilização depatógenos, parasitóides e predadores, junta-mente com a planta hospedeira/inseticida.Essas relações podem ser devidamente utili-zadas nas práticas de manejo de insetos-pra-ga, uma vez que se torna importante a pre-servação de inimigos naturais dos insetos, quesão também os controladores das populaçõesda praga.

As interações tri-tróficas podem ser re-sultantes de dois efeitos: efeito direto da plan-ta sobre a biologia e o comportamento doinimigo natural, devido às substâncias quí-micas ou caracteres morfológicos da planta;ou efeito da planta sobre a praga alterandoseu comportamento, desenvolvimento, tama-nho, o que afeta também seu inimigo natu-ral. Essas interações são mais complexasquando há mais de uma espécie de inimigonatural envolvida. Nesse tipo de interação,

PlantasFolhas de T. distichum

Óleo volátil de T. distichum

Óleo volátil de B. carterri

InsetosPlodia interpeculataEphesia cautellaEphesia küehniellaPlodia interpeculataEphesia cautellaEphesia küehniellaPlodia interpeculataEphesia cautellaEphesia küehniella

B. thuringiensis716369676374677279

B. bassiana453520434334304638

Redução da CL50

(%)

Tabela 1. Aplicações simultâneas de entomopatógenos e extratos vegetias no controle de pragas de grãosarmazenados (adaptada de Sabbour, 2003)


as plantas são importantes “meios de co-municação”, pois ao serem atacadas por umherbívoro, liberam substâncias voláteis pe-las folhas, as quais orientam as fêmeas dosparasitóides a encontrarem as lagartas e de-positar seus ovos. Sendo assim, os odorestêm papel fundamental na organização dosindivíduos nos agroecossistemas (Vendra-min, 2002; Vilela &Palini, 2002).

As interações tri-tróficas podem serexemplificadas nas culturas da soja e domilho. A cultura é atacada pela largarta-da-soja, A. gemmatalis que é combatida atra-vés da aplicação de vírus, o Baculovirusanticarsia, e predada por Geocoris sp. Nocaso do milho, as lagartas de S. frugiperdapodem ser parasitadas por Trichogrammasp. e controladas através do entomopató-geno B. thuringiensis.

De acordo com Ferry et al. (2004), osinsetos são causadores de perdas mundiaisentre 10 e 20% da produção agrícola. Comisso as pesquisas na área biotecnológicaestudam diferentes formas de induzir a re-sistência de uma planta a seu predador.Apesar disso as técnicas convencionais decontrole químico ainda são largamente uti-lizadas, sendo que o controle biológico en-contra algumas resistências, principalmen-te devido aos elevados custos aos produ-tores agrícolas.

Agrawal (2000) relata que as plantaspodem ser atrativas ou benéficas a algunsinimigos naturais de herbívoros, mas tam-bém podem ser tóxicas ou prejudiciais aesses. Assim, as interações tri-tróficas po-dem identificar esses mecanismos de modoa poder manipulá-los, o que irá ampliar ocontrole e reduzir o uso de inseticidas.

Os autores Ferry et al. (2004) identifi-caram diferentes estratégias de defesa dasplantas a seus predadores. Dentre essas,pode-se citar mecanismos de defesa endó-genos e moleculares, sinalização das plan-tas e a produção de substâncias voláteis.Em resposta, os insetos também desenvol-veram estratégias de defesa a esses com-postos, principalmente através da produ-ção de proteinases e de mecanismos espe-ciais de desintoxicação utilizando, porexemplo, citrocomo P450, monoxigenasese glutatione S-transferases.

Entretanto, a complexidade química dasplantas pode manipular seus fenótipos e,conseqüentemente de seus inimigos natu-rais (Wittstock e Gerhenzon, 2002). Ven-zon et al. (2001) relatam que, quando inse-rido uma quantidade de inimigos naturaisou removendo-se determinadas espécies deum agroecossistema, uma grande quanti-dade de interações indiretas pode ser es-perada. Essas interações podem ser positi-vas ou negativas ao controle biológico, de-vendo-se dar importância aos níveis de in-terações entre as espécies.

As interações tri-tróficas também podemser exemplificadas através do trabalho deDequech et al. (2005) que avaliaram lagar-tas de S. frugiperda parasitadas por Cam-poletis flavicincta e infectadas por B. thu-

ringiensis aizawai. Em seus resultados ouso conjunto dos componentes biológicoscitados, aumentou a mortalidade do inse-to-praga e diminuiu seu consumo de ali-mento.

Resultados semelhantes foram encon-trados por Moraes et al. (2004) que identi-ficaram a influência de silício em plantasde trigo, no pulgão-verde (Schizaphis gra-minum) e seus inimigos naturais. Os da-dos desses autores mostram que a aplica-ção de silício na cultura aumentou a resis-tência das plantas de trigo diminuindo apreferência alimentar do pulgão-verde, nãoafetando seus inimigos naturais.

Através desses trabalhos nota-se a im-portância de novas pesquisas visando iden-tificar relações tri-tróficas benéficas e efici-entes que podem ser utilizadas junto àspráticas de Manejo Integrado de Pragas.

1.3 Compatibilidade deprodutos fitossanitários com Bacillus

entomopatogênicos

O controle biológico ocorre natural-mente no ambiente através da ação de ini-migos naturais, mantendo em níveis relati-vamente baixos as populações de inúme-ras pragas (Lacey et al. 2001). As bactériasBacillus thuringiensis e B. sphaericus sãoentomopatógenos que desempenham opapel de agentes de controle microbianode pragas de importância agrícola e veto-res de agentes etiológicos de doenças hu-manas (De Maagd et al., 2003). Diante dis-so, a utilização e conservação desses mi-crorganismos, dentro de agroecossistemas,é uma das estratégias utilizadas no Manejointegrado de Pragas, já que são encontra-das naturalmente nesses ambientes. Assim,torna-se importante conhecer a ação dosprodutos fitossanitários, determinando a suaseletividade e compatibilidade sobre os en-tomopatógenos, com o objetivo de mini-mizar os impactos tanto no ambiente quantona microbiota residente (Batista-Filho et al.,2001).

A excessiva aplicação de defensivosagrícolas vem ocasionando uma série dedesequilíbrios ambientais, especialmentenas populações de entomopatogênos, ve-rificadas atráves da inibição do crescimen-to, esporulação, mutações genéticas, redu-ção da toxicidade a determinada praga,influenciando diretamente no estabeleci-mento e sobrevivência (Alves et al., 1998).No entanto, a ação dos agroquímicos so-bre os microrganismos pode variar em fun-ção da espécie e linhagem do microrganis-mo, como também da formulação químicae dosagens dos produtos (Batista-Filho etal., 2001). Contudo, alguns produtos apre-sentam seletividade aos entomopatógenos,podendo potencializar o seu efeito e con-tribuir para o controle do inseto-alvo (Benz,1971; Chen et al., 1974). Assim, a associa-ção de inseticidas químicos e biológicoscontribuem para minimizar os efeitos ne-gativos sobre os agroecossistemas (Chen

et al., 1974; Batista-Filho et al., 2001).Grande parte das reações dos pesticidas,

atualmente utilizadas no controle de pragas,é desconhecida devido à carência de infor-mações a respeito da compatibilidade dessesprodutos sobre entomopatógenos (Morris,1977). Para B. thuringiensis, majoritariamen-te os trabalhos realizados sobre interação sãoproveniente da década de 70, como reflexoda demasiada aplicação de inseticidas sintéti-cos orgânicos como hidrocarbonetos clorina-dos, oganofosforados, metilcarbamatos e pi-retróides (Casida e Quistad, 1998). Para B.sphaericus, quase a totalidade dos trabalhosse referem à toxicidade às larvas de dípteros,ressaltando a importância de estudos que vi-sam à proteção desse inimigo natural, atravésda compatibilidade com os pesticidas quími-cos.

Ainda na década de 70, Doughert et al.(1971) obtiveram respostas variadas na sensi-bilidade de B. thuringiensis thuringiensis emfunção dos diversos solventes utilizados paraos mesmos pesticidas. A presença de emulsi-ficantes e outros aditivos concentrados, utili-zados nas preparações, podem gerar proble-mas de compatibilidade com entomopatóge-nos devendo ser considerado na elaboraçãode novas formulações comerciais (Morris,1977). O mesmo autor testou a compatibili-dade de 27 pesticidas sobre a germinação ereplicação de B. thuringiensis kurstaki, con-cluindo que o grupo dos carbamatos foramos mais compatíveis, as piretrinas altamentebacteriostáticas e os produtos acefato, triclor-fon, metomil, carbaril, mexacarbato e PH 60-40 (derivado da uréia) podem ser utilizadosem conjunto com a bactéria.

Os trabalhos mais atuais nessa linha depesquisa avaliaram o efeito de diferentes con-centrações de defensivos agrícolas sobre mi-crorganismos entomopatogênicos. Especial-mente para B. thuringiensis, os dados mos-tram que tiametoxam, carbosulfan, diafentiu-ron, imidacloprid, acefato, utilizados nas con-centrações máximas, não apresentaram dife-rença significativa nas unidades formadorasda colônia - UFC (Batista-Filho et al., 2001;Batista-Filho et al., 2003; Almeida et al., 2003).Por outro lado, essas pesquisas revelam queendosulfan, monocrotofós, deltametrina e ci-proconazole + tiametoxam inibiram a forma-ção das colônias. Já, na concentração míni-ma, o diafentiuron foi sinérgico e o tiameto-xam e ciproconazole + tiametoxam não afe-taram B. thuringiensis. Utilizando ambas asconcentrações, o endosulfan, deltametrina eprofenofós + lufenuron inibiram as colôniasda bactéria e tiametoxam + cipermetrina fo-ram compatíveis.

Há poucas pesquisas que avaliam a com-patibilidade de bactérias entomopatogênicascom os pesticidas mais utilizados em diver-sas culturas, como por exemplo, o arroz irri-gado. No caso, Azambuja (2006) testou seisprodutos fitossanitários, comumente utiliza-dos na orizicultura irrigada, sobre as bactéri-as B. thuringiensis e B. sphaericus, em con-dições laboratoriais e observou que os herbi-cidas glifosato e propanil foram significativa-


mente antagônicos ao desenvolvimento de B.thuringiensis, e os mesmos produtos, inclu-indo o fungicida azoxistrobina, reduziram ocrescimento de B. sphaericus, afetando essemicrorganismo com mais intensidade. Entre-tanto, relatou uma provável compatibilidadedos herbicidas quincloraque e pirazosulfuron-etil e o inseticida fipronil para ambos ento-mopatógenos naturais do solo, propondo asua utilização em Programas de MIP.

Complementando os dados anteriores,Batista-Filho et al. (2001) verificaram que oinseticida fipronil apresentou um efeito sinér-gico aumentando a UFC de B. thuringiensis(Dipel®) quando utilizado na concentração mí-nima, mas não teve influência quando utili-zado na concentração máxima. Entretanto,Rohr (2005) mostrou que azoxistrobina, quin-cloraque e fipronil não apresentaram intera-ções significativas sobre os bioinseticida deB. thuringiensis kurstaki (Dipel®) e B. thu-ringiensis aizawai (Xentari®).

Os dados dos ensaios realizados in vitroexpõem ao máximo os microrganismos a açãodos produtos fitossanitários, podendo diferirdas condições de campo, onde outros fato-res interferem, diminuindo a intensidade dasreações. Nesse sentido, Alves et al. (1998) sa-lientam que a seletividade de um produtotestado in vitro pode ser confirmado em cam-po, mas o antagonismo apresentado em la-boratório nem sempre pode ser verificado nocampo.

Os dados referentes às interações entreentomopatógenos e pesticidas em condiçõesde campo são ainda mais reduzidos (Alves etal., 1998). Nesse enfoque, Azambuja (2006),em laboratório, concluiu que os agroquími-cos: fipronil, azoxistrobina, quincloraque, gli-fosato, propanil e pirazosulfuron-etil não in-terferiram na abundância de B. thuringiensisnem de B. sphaericus. Ressaltando esse pa-drão, Batista-Filho et al. (2001) estudaram acompatibilidade do tiametoxam e B. thurin-giensis (Dipel®), aplicados em lavouras defeijão, revelando que o inseticida não inter-feriu no potencial de inóculo do entomopa-tógeno, assim como in vitro, recomendandoa utilização do produto em conjunto com abactéria. Conforme foi verificado, no ambi-ente natural, os diversos fatores bióticos eabióticos atuam minimizando os possíveisimpactos sobre os Bacillus spp. da ação dire-ta dos produtos fitossanitários (Alves et al.,1998).

Em outro trabalho, Das et al. (2003) veri-ficaram a influência de dois inseticidas emdiversos microrganismos presentes nos solosde cultivo de arroz. Esses autores mencio-nam que forato e carborufam estimularam ocrescimento das populações de bactérias e asproporções de Bacillus sp. No entanto, o efei-to sinérgico de carbofuram foi mais pronun-ciado. Esse fato está relacionado à capacida-de de alguns microrganismos desse gêneroutilizarem o inseticida e degradarem seus pro-dutos para o seu próprio desenvolvimentono solo.

Como já mencionado, na literatura a res-peito de interações de microrganismos ento-

mopatogênicos e agroquímicos, em condi-ções de campo, é muito restrita e quase atotalidade dos trabalhos realizados dessanatureza se referem aos fungos entomopa-togênicos avaliados in vitro. A falta de pa-dronização na realização dos testes é umdos problemas desse tipo de estudo que,em muitos casos, não permite uma compa-ração efetiva entre os produtos (Alves etal., 1998).

Diante disso, os microrganismos ento-mopatogênicos que habitam naturalmenteos agroecossistemas devem ser preserva-dos através de técnicas culturais e princi-palmente na utilização de pesticidas com-patíveis não comprometendo o MIP (Almei-da et al., 2003).

1.4 Controle microbianode Fitopatógenos

1.4.1 Fungos Fitopatogênicos:Os fungos constituem um grupo de

organismos que se caracteriza por nuncaapresentarem tecido verdadeiro, por seremeucarióticos e aclorofilados. A maioria dasespécies fúngicas é saprofítica, mas algu-mas desenvolveram a capacidade de para-sitar plantas, causando a morte ou um re-tardamento do desenvolvimento do hos-pedeiro. Devido aos sistemas intensivos deprodução agrícola, o índice e a prevalên-cia de doenças têm aumentado significati-vamente, podendo, em alguns casos, cau-sar perda total da produção. Esse aumentode doenças em áreas agrícolas se deve prin-cipalmente ao desequilíbrio entre as dife-rentes populações microbianas do solo, dorizoplano, do fitoplano e endofíticas queinteragem com plantas, permitindo o esta-belecimento e o desenvolvimento dos fun-gos patogênicos (Esposito & Azevedo,2004).

Os autores relatam que para o fungopatogênico colonizar a planta hospedeira,inicialmente ele precisa quebrar o seu sis-tema de defesa. Para isso, produz enzimashidrolíticas (cutinases, celulases, ligninasese outras) que quebram a cutícula e a pare-de da celular hospedeira; toxinas que re-duzem ou inibem completamente a ativi-dade das células da planta a ser parasitadae/ou produzem substâncias específicas deplantas (hormônios) que quebram o equi-líbrio fisiológico da célula vegetal, causan-do distúrbios no crescimento e na diferen-ciação das células da planta (Esposito e Aze-vedo, 2004).

Em geral, os fungos patogênicos apre-sentam três estágios de colonização da plan-ta hospedeira. Esses estágios são caracteri-zados pela germinação do esporo na su-perfície dos tecidos da planta hospedeira,pelo reconhecimento da superfície, pelaformação de apressório e pela penetraçãonos tecidos vegetais. Estando no interiorda planta, o fungo pode colonizar os espa-ços intercelulares e/ou intracelulares deforma parasítica e, posteriormente, produ-zir estruturas reprodutivas que permitam a

sua disseminação (Esposito e Azevedo, 2004).

1.4.2 Efeitos de B. thuringiensisem fitopatógenos:

Alguns microrganismos, como bactérias,fungos e actinomicetos, produzem metabó-litos capazes de inibir o crescimento de ou-tros microrganismos. Estas substâncias sãodiferentes na sua estrutura e distribuição, serestringindo aos poucos compostos e estan-do presentes em apenas alguns microrganis-mos (Kennedy, 1999). Os produtos do meta-bolismo secundário microbiano são alvos depesquisas cada vez mais intensas na buscade substâncias bioativas, para atuação em di-versas áreas como a agricultura, veterináriae farmácia (Woodruff, 1980).

Grande parte dos microrganismos envol-vidos no controle biológico atua através deantibiose, onde ocorre a interação entre or-ganismos, um metabólito produzido por umdeles tem um efeito prejudicial sobre o ou-tro. A produção de metabólitos pode resul-tar na completa lise e dissolução da estrutu-ra celular e independe do contato físico en-tre os microrganismos (Bettiol & Ghini, 1995),dessa forma, a busca por microrganismosantagônicos a fungos fitopatogênicos temaumentado (Benitez et al., 2004). Diversasespécies de Bacillus são citadas como pro-dutoras de antibióticos, podendo secretar me-tabólitos comercialmente importantes, comoenzimas aminolíticas e enzimas proteolíticas(Bettiol & Ghini, 1995).

Bettiol (1988), em trabalho de seleçãode microrganismo antagônico a Pyriculariaoryzae, verificou que B. subtilis foi o maiseficiente em inibir o crescimento micelial dopatógeno, e constatando também que o an-tagonista apresenta boas características parauso como agente de controle biológico, pois,além de rápido desenvolvimento, tanto emmeio de cultura como na natureza, produ-zem endósporo e antibióticos, crescem emlarga faixa de temperatura e adaptam-se avárias condições ambientais.

O processo para que ocorra o antago-nismo exige a degradação da parede celularfúngica por hidrolases secretada por micror-ganismos. Como quitina e beta-1,3-glucanasão os principais componentes estruturais daparede celular fúngica, quitinases e glucana-ses podem ser importantes no controle bio-lógico desses microrganismos (Kulminskayaet al., 2001). Knaak et al. (2007) testaram ascepas e proteínas Cry1Ab e Cry1Ac sintetiza-das por Bacillus thuringiensis thuringiensis407 (pH 408) e B. thuringiensis kurstaki HD-73, respectivamente, sobre os fungos fitopa-togênicos Pyricularia grisea, Rhizoctonia so-lani, Fusarium oxysporum e F. solani. Veri-ficaram que as cepas B. thuringiensis, quesintetizam as proteínas Cry1Ab e Cry1Ac, re-duziram o crescimento micelial dos fungosR. solani, P. grisea, F. oxysporum e F. solanidurante o período avaliado, quando compa-rado aos controles. As duas cepas inibiram ocrescimento dos fitopatógenos testados atésete dias após a incubação, onde houve di-ferença significativa (P<0,05) entre os trata-


mentos bacterianos e os grupos controle.Na avaliação da ação das proteínas Cry1Abe Cry1Ac, sobre R. solani, P. grisea, F. oxys-porum e F. solani, não foi observada a for-mação do halo de inibição de crescimento.

Nos resultados obtidos para germina-ção dos conídios também não houve dife-rença significativa (P<0,05) entre o contro-le e os tratamentos com as proteínas Cry1Abe Cry1Ac sobre os fungos citados anterior-mente. Batista-Junior et al. (2002) testaramduas cepas: B. thuringiensis kurstaki HD1,produtor do cristal com atividade insetici-da e B. thuringiensis 407, mutante não pro-dutor do cristal protéico, contra os fitopa-tógenos F. solani, F. oxysporum e Colleto-trichum sp., concluindo que a ausência dosgenes produtores do cristal protéico nãointerferiram no poder de degradação domicélio pelos isolados de B. thuringiensisestudados.

O efeito inibitório das cepas de B. thu-ringiensis nas estirpes dos fungos fitopato-gênicos pode estar relacionado com a pro-dução de enzimas que podem ter ação con-tra a parede celular fúngica, já que algu-mas bactérias antagonistas de fungos fito-patogênicos produzem quitinases (Asaka eShoda, 1996; Mavingui e Heulin, 1994).Nesse contexto, Barboza-Corona et al.(1999) selecionaram e caracterizaram enzi-mas (quitinases) de B. thuringiensis nati-vos do México, concluindo que a ação si-nérgica entre quitinases e proteínas Crypodem ser aplicadas no controle biológicode fitopatógenos.

Diferentes tipos de fungos e bactériasproduzem uma grande variedade de enzi-mas degradantes (Mauch et al., 1988). Sen-do assim, B. thuringiensis é uma bactériaque secreta quitinases em meios de culturaquando cultivada em meio com sais e qui-tina (Barboza-Corona et al., 2003). Algunsestudos sugerem que as quitinases de B.thuringiensis possuem potencial biotecno-lógico contra fungos fitopatogênicos (Es-cudero-Abarca et al., 2001; Reyes-Ramírezet al., 2004).

La Vega et al. (2006) testaram à enzimaquitinase, purificada de B. thuringiensisaizawai, a qual produz 66 kDa quitinaseextracelular, nos fungos Fusarium sp. e S.rolfsii. Os fitopatógenos foram incubadoscom a enzima purificada por 120h, demons-trando que os valores de inibição do cres-cimento de S. rolfsii e Fusarium sp. foramsuperiores e estatisticamente diferentes docontrole (11 e 24%, respectivamente). Osmesmos autores não encontraram diferen-ças significativas no crescimento com aenzima purificada, em comparação com oextrato bruto enzimático. Melent’ev et al.(2001) testaram o extrato bruto e purifica-do de quitinase de Bacillus sp. e descobri-ram que a enzima purificada perdeu a suacapacidade de inibir o crescimento de Fu-sarium oxysporum e Helminthosporiumsativum. No entanto, há relatos de que al-gumas cepas bacterianas apresentam umarelação direta entre as suas habilidades para

reprimir o crescimento de fungos fitopato-gênicos e para produzir quitinases (Inbar eChet, 1991).

Resmuska e Pria (2007) avaliaram o efei-to dos agentes antagonistas B. thuringien-sis e Trichoderma sp. no crescimento mi-celial, sobre os fungos fitopatogênicos: Scle-rotium rolfsii, Diaporthe phaseolorum,Pythium aphanidermatum., Moniliniafructicola, Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoc-tonia solani. Verificaram que a bactéria B.thuringiensis mostrou-se eficiente no con-trole de M. fructicola, S. sclerotiorum, F.solani. e S. rolfsii, impedindo que o fungoS. sclerotiorum formasse escleródios. O fun-go Trichoderma sp., exerceu efeito no cres-cimento micelial do fungo S. rolfsii. B. thu-ringiensis mostrou-se mais eficiente queTrichoderma sp. no controle biológico dosfitopatógenos D. phaseolorum, P. aphani-dermatum, M. fructicola, S. sclerotiorum,R. solani e F. solani.

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Pesquisa

TOXICIDADE DE BACILLUS THURINGIENSISEM ORGANISMOS NÃO-ALVO

entomopatógeno B. thuringi-ensis tem elevada especifici-dade, porém para uma utili-zação segura são necessáriosensaios toxicológicos com di-ferentes organismos não-alvo,

sendo nesse trabalho apresentados dadosreferentes à toxicidade aos inimigos natu-rais, especialmente aos parasitóides e pre-dadores de insetos, assim como às aves eaos mamíferos.

1.1 Efeitos de B. thuringiensis sobrepredadores e parasitóides

Os inimigos naturais dos insetos sãode suma importância, pois, além de de-senvolverem seu papel ecológico de pre-dação ou parasitismo, podem ser associa-dos aos métodos alternativos de controlede pragas-alvo, através de criação massalem laboratórios (Gallo et al., 2002). O usode inseticidas pode causar danos diretos eindiretos ao controle biológico natural, aocausar a mortalidade de insetos benéficosou reduzir sua fonte alimentar pela morta-lidade de insetos-praga (Shepard et al.,1987; Wick & Freier, 2000; Berti Filho &Ciociola, 2002). Por isso, o uso de bioinse-ticidas que controlam as pragas com baixoimpacto sobre organismos benéficos deveser incentivado (Fragoso et al., 2001; De-grande et al., 2002).

Nesse sentido, Dequech et al. (2005)estudaram a interação entre o parasitóideCampoletis flavicincta e B. thuringiensisaizawai em lagartas de Spodoptera frugi-perda em condições de laboratório. Osautores avaliaram o consumo alimentar ea mortalidade de lagartas parasitadas, in-fectadas pela bactéria, e parasitadas e in-fectadas, além da biologia dos parasitói-des emergidos a partir de lagartas infecta-das e não infectadas pela bactéria. O me-nor consumo foliar e a maior taxa de mor-talidade foram observados em lagartas afe-tadas pelos dois agentes de controle bio-

lógico. No caso do parasitóide, não foramverificadas alterações nas características bi-ológicas dos seus descendentes emergidosde lagartas infectadas com B. thuringiensis.

Segundo Stevenson & Walters (1983),embora a toxicidade de inseticidas possaser avaliada em condições de laboratório,só é possível medir o efeito real do pestici-da em condições de campo, onde ocorremas situações naturais de abrigo, proteção,alternativas de escape, alimentação e sobre-vivência das espécies. Esses autores tam-bém destacam que as condições meteoro-lógicas, o comportamento e o ciclo de vidade cada espécie e a dose aplicada são fato-res que influenciam a toxicidade dos inse-ticidas.

Lucho (2004) avaliou a emergência deparasitóides em lagartas de S. frugiperdarecapturadas em arroz irrigado com e semtratamento de B. thuringiensis aizawai emcondições de telado e a campo. A emer-gência de parasitóides das famílias Braco-

nidae, Ichneumonidae e Tachinidae ocor-reu em lagartas recapturadas em plantas nãotratadas, mantidas em condições de telado.Das lagartas coletadas em áreas tratadas como bioinseticida, tanto em telado quanto acampo, não foi observada emergência deparasitóides.

Já Costa (2007), durante dois anos agrí-colas, avaliou o efeito de inseticidas sobreos inimigos naturais de insetos-praga, pormeio da quantificação de grupos taxonô-micos de inimigos naturais presentes antese após a aplicação de produtos químicos ebiológicos em lavoura de arroz irrigado.Nesse estudo foram avaliados seis tratamen-tos (quatro inseticidas químicos sintéticos,um inseticida à base de B. thuringiensis ai-zawai e testemunha sem inseticidas) e cin-co épocas de amostragem realizadas comrede de varredura do florescimento ao en-chimento de grãos (prévia e aos 2, 7, 14 e21 dias após a aplicação dos tratamentos -DAT). Entre os inimigos naturais coletadosforam considerados oito subgrupos: ara-nhas, micro-himenópteros, coleópteros,odonatos, dermápteros, neurópteros, díp-teros e hemípteros. No primeiro ano doestudo não foram observados efeitos signi-ficativos dos inseticidas sobre os inimigosnaturais. No segundo ano, o inseticida lam-bdacialotrina reduziu o total de inimigos na-turais coletados aos 2DAT. O número de

Andresa Patrícia Regert LuchoEngenheira Agrônoma (UFRGS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).


Emerson Luiz Nunes CostaEngenheiro Agrônomo (UFRGS) e Mestre e Doutor emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS)

Lidia Mariana FiuzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS), Doutora em CiênciasAgronômicas (ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).


coleópteros predadores, representados emsua maioria por Coccinellidade (“joani-nhas”), foi reduzido significativamente aos2DAT por lambdacialotrina, carbaril, mala-tiona e imidacloprido. Nos dois anos doestudo não foi observado efeito significati-vo de B. thuringiensis sobre o número deinimigos naturais coletados após a aplica-ção do bioinseticida.

Em outra pesquisa, Nascimento et al.(1998) avaliaram o efeito de B. thuringien-sis kurstaki sobre o predador de lagartas delepidópteros, Podisus nigrispinus, em labo-ratório. Em seus resultados, não foi obser-vada a presença de esporos ou células ve-getativas do entomopatógeno na hemolin-fa do predador, apenas no intestino médioe nas fezes. Os autores relatam que, em la-boratório, são utilizadas altas dosagens debiopesticida e oferecido apenas uma alter-nativa alimentar e que, em campo, o pre-dador tem alternativas de alimentação, nãodependendo somente de uma presa infec-tada.

Além dos produtos formulados a basede B. thuringiensis, atualmente as pesqui-sas na área biotecnológica visam a transfor-mação genética de plantas com os genescry de B. thuringiensis para conferir a re-sistência dessas plantas aos insetos-praga.Plantas de milho, algodão e batata transgê-nicos têm sido comercializados (Shelton etal. 2002), porém, os dados de O’Callaghanet al. (2005) revelam que não foram detec-tados efeitos dessas plantas em insetos be-néficos, como polinizadores e inimigos na-

turais.Nesse contexto, Romeis et al. (2008)

relatam que dados como a descrição dacultivar, as características moleculares doselementos genéticos inseridos na planta, anatureza e a estabilidade da expressão pro-téica, o espectro de ação das proteínas, acomposição de macro e micronutrientes eas características morfológicas e agronômi-cas da planta, são exigidos pelas autorida-des para a regulamentação dessas plantas.Os autores mostram que o milho modifica-do com o gene expressando a proteína Cry1Ab de B. thurigniensis, ativa a insetos daordem Lepidoptera, não afeta insetos deoutras ordens. Ou seja, as proteínas de B.thuringiensis são altamente específicas, nãoatingindo artrópodes não alvos.

Na revisão de Fontes et al.(2002) sãodiscutidos princípios e questões ecológicas,impacto ambiental e efeitos de plantas ge-neticamente modificadas no ambiente. Emrelação aos inimigos naturais, os autoresrelatam a existência de fatores importantesem relação às plantas, como o ciclo de vida(anual ou perene) que difere na composi-ção das comunidades de artrópodes asso-ciados a essas plantas. Dos 41 trabalhos ava-liados pelos autores, 20 foram conduzidosem laboratório e desses, 14 não mostraramefeito sobre inimigos naturais, quando uti-lizadas plantas modificadas e não modifi-cadas. No restante (6 trabalhos) não foramobservados efeitos em alguns inimigos na-turais. E em 14 de 21 trabalhos avaliadosem campo, os autores não mostraram dife-

rença na densidade de inimigos naturaisentre áreas com plantas-Bt e plantas nãotransgênicas. Porém, nos 7 casos restantesocorreu um decréscimo nessa densidade.

No trabalho de Chen et al. (2008) fo-ram avaliados os efeitos diretos e indire-tos da proteína Cry1Ac de B. thuringiensisque está presente em plantas transgênicasde milho e algodão, sobre o parasitóideda lagarta Plutella xilostella, Diadegmainsulare. Os autores utilizaram a plantatransgênica e a proteína proveniente deuma formulação líquida comercial (MC),em três tratamentos: a proteína purificada,o produto comercial e a planta transgêni-ca. Também avaliaram o efeito de insetici-das a base de spinosad, indoxacarb, lamb-da-cialotrina e cipermetrina. Em seus re-sultados, observaram que, mais de 90% daslagartas foram parasitadas após a ingestãodos tratamentos, indicando que esses nãoinfluenciam o parasitismo. Porém, o nú-mero de D. insulare emergidos das lagar-tas, diferiu entre o controle e o grupo tra-tado com a formulação comercial, mas nãodiferiu entre o controle e as lagartas trata-das com a planta expressando a proteínaCry 1Ac ou somente com a proteína puri-ficada.

Os autores citados também demons-traram que o parasitóide D. isulare foi al-tamente suscetível aos inseticidas comu-mente utilizados para o controle das la-gartas de P. xylostella, ocorrendo a mortedos mesmos após duas horas de contato.Sendo assim, os inseticidas usados afetamas populações do parasitóide e, conse-qüentemente aumentam as populações doinseto praga-alvo, no caso, P. xylostella.

Estudo semelhante foi realizado porTorres & Ruberson (2008) com a mesmaproteína expressa em plantas de algodão.Os resultados desse estudo mostraram quea proteína foi detectada em três níveis tró-ficos avaliados, porém, os insetos preda-dores e parasitas das lagartas de S. exiguanão foram afetados quando as lagartas for-ma alimentadas com algodão transgênico.

Um caso bem polêmico entre a comu-nidade científica, foi o trabalho de Losleyet al. (1999) que mostrou que o milho ge-neticamente modificado com a proteínaCry1Ab de B. thuringiensis, afetou severa-mente a população da borboleta monar-ca, Danaus plexippus. Em seu trabalho foicomparado a alimentação, o crescimentoe a mortalidade de lagartas que se alimen-tavam de plantas com pólen Bt, com pó-len de milho não modificado e plantas sempólen. O resultado apresentou sobrevivên-cia de 56% com milho-Bt e 100% de so-brevivência com pólen normal e sem pó-len.

Entretanto novas pesquisas foram rea-lizadas posteriormente como Stanley-Horn,et al. (2001) que avaliou 6 híbridos de B.thuringiensis em quatro cidades diferen-tes (EUA) divididos em duas etapas (naborda e na parte interna das lavouras) fren-te à D. plexippus. As conclusões dos auto-

Figura 1. Mortalidade de camundongos CF1 submetidos aos tratamentosintraperitoneais com Bacillus thuringiensis, ( Susp. = suspensão contendo célulase esporos; Sob. = sobrenadante da cultura; Prot. = proteína purificada; Test. =testemunha tratada somente com água; Número total de indivíduos = 15 portratamento)


res fornecem evidências de que a quanti-dade de pólen e a expressão de Cry1Ab nopólen predizem um impacto na alimenta-ção das lagartas da monarca, porém issoocorre em lagartas do 1º instar, sendo quenão ocorrem diferenças significativas da so-brevivência da monarca nas regiões commilho-Bt e milho não transgênico. Alémdisso, os autores identificaram a mortalida-de de lagartas poucas horas após a alimen-tação em áreas com milho não transgênicopulverizados com λ-cialotrina. A sobrevivên-cia e o crescimento foram afetados tambémem áreas próximas ao local. Entretanto pes-quisas devem continuar sendo realizadaspara entender o impacto do milho não trans-gênico sendo que é relativamente de baixatoxicidade a borboletas monarca.

Apesar desses dados o conhecimento arespeito da influência de novas tecnologiasseja para a produção de biopesticidas oupara a transgenia, ainda são carentes deinformação. Entretanto, os estudos realiza-dos até então indicam que efeitos nocivosem organismos não-alvo verificados em la-boratório são raramente detectados no am-biente, provavelmente porque a quantida-de de produto utilizada em laboratório ésuperior àquela utilizada e recomendada emcampo.

1.2 Efeitos deB. thuringiensis sobre aves

Um grupo de predadores de lagartas,os pássaros, também deve ser avaliado emrelação ao uso de biopesticidas ou plantasgeneticamente modificadas. Porém existempoucos dados na literatura a respeito desseassunto. Os autores Sopuck et al. (2002)relatam a utilização do produto comercialForay 48B a base de B. thuringiensis. kurs-taki, para o controle de Lymantria dispar eavaliaram a resposta de pássaros associa-dos ao sul da Ilha de Vancouver, no Cana-dá. Em seus resultados não observaram di-ferença na abundância relativa de pássarosnas áreas tratadas e não tratadas com o bi-opesticida, entre os anos de 1999 e 2000,indicando que o tratamento não influenciana presença dos mesmos.

Já Norton et al. (2001) avaliaram o efei-to secundário da mesma subespécie de B.thuringiensis citada acima porém proveni-ente do produto Thuricide, em aves da es-pécie Dendragapus canadensis. Os auto-res citam essa ave como um herbívoro pri-mário, porém os pintos, em suas primeirasduas semanas de vida, são essencialmenteinsetívoros. Lattner (1982) descreve a ali-mentação dessa ave como sendo cerca de64% de lagartas, seguido de gafanhotos(10%), formigas (7%) e outras variedadesde invertebrados e partes de plantas. O tra-balho de Norton et al. (2001) teve comoobjetivo avaliar os itens da dieta e o cresci-mento de D. canadensis em áreas tratadase não tratadas com B. thuringiensis kurs-taki. Os resultados indicam que o cresci-mento dos pintos foi afetado em relação às

duas áreas, ocorrendo uma redução de 30%no tamanho desses na área tratada com abactéria. Porém esses dados podem estarrelacionado ao fato de que, com a mortedas lagartas devido à ingestão do patóge-no, os pintos passaram a se alimentar prin-cipalmente de formigas e estas tem um bai-xo índice de proteínas em comparação comàs lagartas. Isso pode ser determinante parao decréscimo no tamanho dos pintos, umavez que a dieta alimentar teve seu teor deproteínas também reduzido.

1.3 Efeitos de B. thuringiensissobre mamíferos

Pequenos mamíferos, como ratos e ca-mundongos, também estão associados àsáreas agrícolas uma vez que esses animaispodem se alimentar dos grãos das culturas.Então também existem pesquisas que ava-liam o possível efeito do entomopatógenonesses mamíferos, sendo que a bactéria tam-bém pode produzir toxinas ativas a essesanimais.

Na área da saúde, os trabalhos de Pra-sad & Shethna (1975) sugerem que as pro-teínas de B. thuringiensis têm atividadeantitumoral em sarcoma Yoshida em ratos,além de acentuarem a resposta imune deovelhas. Yamashita et al. (2000), tambémdemonstram efeito citocida em células deleucemia, em ensaios in vitro.

Em relação a humanos, a revisão de Si-egel (2001) apresenta dados em que o pro-duto Thuricide (B. thuringiensis thuringi-ensis) foi ingerido (100mg) e inalado(100mg) por 18 pessoas, durante 5 dias, eesses não apresentaram nenhuma reaçãodecorrente do microrganismo. Além dessareportagem, o trabalho apresenta algunsdados sobre isolados de B. thuringiensis queforam re-isolados de queimaduras ou feri-das de pessoas, entretanto foi averiguadoque a água utilizada para a limpeza dessesferimentos estava contaminada. Além dis-so, o autor relata que o isolado pode sedesenvolver nesses locais feridos quando osistema imune não está respondendo deforma adequada ao ferimento, mas não cau-sa nenhuma reação.

Betz et al. (2000) relatam que B. thu-ringiensis kurstaki foi administrado em hu-manos voluntários durante 3 dias, na quan-tidade de 1000mg/pessoa ou 1x1010 espo-ros/mL, e não apresentaram sintomas detoxicidade, nem culturas de células bacteri-anas nas amostras de sangue avaliadas. Osautores relatam a presença das proteínas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac e Cry 2Aa no isoladotestado.

Diferentes autores relatam os resultadosde suas pesquisas com ratos tratados comB. thuringiensis. No caso de Bishop et al.(1999), a aplicação oral de 5.1010 esporos/dia de B. thuringiensis thuringiensis e B.thuringiensis israelensis, em ratos não mos-trou diferença significativa no peso corpo-ral dos animais tratados e não tratados. Nosdados de Siegel (2001), ratos foram trata-

dos via oral com 109 esporos/dia, por 730dias, também não apresentaram nenhumareação.

Também em ensaios toxicológicos, Ber-litz et al. (2006) avaliaram o efeito da sus-pensão de células e esporos de B. thuringi-ensis aizawai proveniente do produto co-mercial Xentari e B. thuringiensis thuringi-ensis (H1), em ratos Wistar. Os autores ava-liaram o conteúdo estomacal e as fezes emSDS-PAGE, onde os resultados sugerem queas proteínas são degradadas no estômagodos animais. Os estômagos foram avaliadosem estereomicroscópio (40x) não apresen-tando modificações superficiais, como pi-pocas vermelhas ou raias hemorrágicas, emrelação ao grupo controle. Os autores con-cluíram que as proteínas de B. thuringien-sis não afetam os ratos quando administra-das oralmente.

Em outra pesquisa, Berlitz (2006) ava-liou a suspensão e as proteínas purificadasde dois novos isolados bacterianos, em ca-mundongos CF1, via oral e intraperitoneal,divididos em grupos de 5 animais e três re-petições. Os dados dos tratamentos, via oral,não causaram mortalidade dos camundon-gos, porém nas administrações intraperito-neais os camundongos morreram a partirde 6horas após a aplicação dos tratamen-tos, quando aplicada a suspensão bacteria-na contendo células e esporos (Figura 1).

Apesar desses resultados, deve-se sali-entar que injeções intraperitoneais não sãouma via de acesso natural do entomopató-geno nos mamíferos. Essa mortalidade tam-bém não deve estar associada à thuringien-sina, uma proteína tóxica a vertebrados queé produzida pelo entomopatógeno, poisessa toxina está presente no sobrenadanteda cultura, e esse tratamento não causou amortalidade dos animais.

O tratamento via oral, não causou rea-ções nos camundongos. Nesse sentido, Betzet al. (2000) revelam que as proteínas Cry1,Cry2 e Cry3 são degradadas em 30 segun-dos após a ingestão, em ensaios in vitro,resultando em proteínas de 2 kDa. Também,os dados de Vasquez-Padrón et al. (2000) eMoreno-Fierros et al. (2000) revelaram quecamundongos Balb/c apresentaram eleva-da produção de anticorpos IgA, seguidosde IgG e IgM, após a administração oral,retal e intraperitoneal da proteína Cry1Ac,mostrando uma eficiente resposta imunedesses animais.

Como já comentado anteriormente, aspreocupações têm sido em torno dos efei-tos das plantas geneticamente modificadascom genes de B. thuringiensis em seus con-sumidores. Porém, Azevedo & Araújo (2003)mostram a ausência de efeitos tóxicos, mu-tagênicos, teratogênicos ou clastogênicosdessas plantas. Betz et al. (2000) tambémrelatam que as proteínas Cry de B. thurin-giensis não são tóxicas em contato direto,sendo que a exposição de animais não-alvoé extremamente baixa e a presença dessasproteínas nos tecidos vegetais também ocor-re em baixas concentrações. Romeis et al.


(2008) também comentam que os testes la-boratoriais utilizando essas plantas, são con-duzidos com elevadas concentrações daproteína purificada, muito acima daquelasconcentrações encontradas nos tecidos dasplantas.

Apesar desses dados, periodicamenteestão sendo lançados produtos comerciaisà base de B. thuringiensis e que, para che-garem ao mercado devem passar por dife-rentes análises para confirmar a não toxici-dade em organismos não-alvo. O mesmoocorre com as plantas geneticamente mo-dificadas que são testadas em diferentesorganismos para garantir a sua segurança.Nesse sentido, a Lei de Biossegurança nº11.105, estabelece as normas de segurançae os mecanismos de fiscalização de ativida-des que envolvam organismos geneticamen-te modificados e seus derivados.

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Pesquisa

PRODUTOS DE BACILLUS THURINGIENSIS:REGISTRO E COMERCIALIZAÇÃO

onsiderando os biopestici-das, aqui serão apresenta-dos aspectos básicos rela-cionados às avaliações to-xicológicas dos produtos

formulados à base de B. thuringien-sis, assim como os procedimentos re-lacionados ao registro desses produ-tos comerciais, os quais seguem a leibase dos agrotóxicos.

Atualmente aproximadamente 98%dos biopesticidas, utilizados na agri-cultura e na saúde, correspondem àsformulações de B. thuringiensis (Sch-nepf et al., 1998; Polanczyk, 2003).No início desse milênio as vendasdesses produtos foram de aproxima-damente US$ 2 milhões. Em algunspaíses, como no Brasil, o acesso a es-ses produtos ainda é limitado, pois oscustos das formulações são elevadose as multinacionais que os comerci-alizam não mantém uma distribuiçãoregular nas diferentes regiões do país.Além desses problemas soma-se abaixa persistência de alguns produ-tos e a falta de informações dos pro-dutores sobre o potencial e as vanta-gens dos biopesticidas.

No Brasil, a prospecção de ento-mopatógenos bacterianos é realizadaem laboratórios de pesquisa ligados àagricultura e saúde pública, como:Embrapa, Fiocruz, Universidades Pú-blicas e Privadas. Essas mesmas insti-tuições têm desenvolvido os produ-tos ou efetuado convênio com Em-presas Particulares. Os registros dosprodutos à base de B. thuringiensisseguem basicamente as mesmas re-

gras dos químicos sintéticos, cujosórgãos federais responsáveis pela ava-liação e registro são Ministério da Agri-cultura, Pecuária e Abastecimento(MAPA), Agência Nacional de Vigilân-cia Sanitária (ANVISA) e Instituto Bra-sileiro do Meio Ambiente e dos Re-cursos Naturais Renováveis (IBAMA),os quais prometem no atual contextopriorizar os biopesticidas em relaçãoaos agrotóxicos convencionais, facili-tando assim o registro dos produtoscomprovadamente menos agressivosaos organismos não-alvo e ao ambi-ente.

1.1 Legislação e Registrode produtos

A utilização de biopesticidas, as-sim como dos demais agrotóxicos ba-seia-se na relação “riscos x benefíci-os” que requer ensaios, os quais reve-lam a segurança ao homem e ao meioambiente. Sendo assim, a legislaçãodeve assegurar a sociedade que o bi-opesticida autorizado para comercia-lização e aplicação no controle bioló-gico foi adequadamente avaliadoquanto aos parâmetros agronômicos,saúde pública e meio ambiente (Mea-dows, 1993; Alves, 1998; Gallo et al.,2002).

O registro de produtos à base deB. thuringiensis segue a “Lei dos Agro-tóxicos”, cuja legislação básica é a Lein. 7.802 de 11 de julho de 1989, ondeos produtos são avaliados pelo Minis-tério da Agricultura e Ministério daSaúde quanto aos seguintes aspectos:

Lidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestreem Fitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).

Diounéia Liziane BerlitzBióloga (UNISINOS) e Mestre emBiologia: Diversidade e Manejo de VidaSilvestre (UNISINOS).


ProdutosDipelThuricideAgreeBacturEcotech ProBactospeineJavelinForayBiobitFoil/CondorDelfinCutlassLarvo BtNubilacidMVPBac-controlXenTariM-OneDi-TerraTridentNovodorM-One PlusFoil

EmpresasAbbottSandozMitsuiMilenia AgrociênciasBayerSolvaySandozNovo-NordiskNovo-NodiskEcogenSandozEcogenFermoneRadonjaMycogenAgricontrolAbbottMycogenAbbottSandozNovo NordiskMycogenEcogen

B. thuringiensis (Bt)Bt kurstakiBt kurstakiBt aizawaiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt kurstakiBt aizawaiBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionisBt san diego Bt tenebrionis (empacotadas)Bt (recombinante)

Insetos-alvolepidópteroslepidópteroslepidopteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroslepidópteroscoleópteroscoleópteroscoleópteroscoleópteroscoleópteroscoleópteros

Tabela 1. Produtos comerciais de Bacillus thuringiensis para controle de pragas agrícolas

pesquisas; experimentação; produção;embalagem e rotulagem; transporte; ar-mazenamento; comercialização; propa-ganda comercial; utilização; importação;exportação; destino final de resíduos eembalagens; registro; classificação; con-trole; inspeção e fiscalização de produ-tos.

A “Lei dos Agrotóxicos” foi regula-mentada pelos Decretos n. 98.816, de11 de janeiro de 1990 e Dec. 4.074 de04 de janeiro de 2002, sendo que atual-mente para registro de um biopesticidano Brasil estão envolvidos os seguintesministérios:

• MAPA: avaliação dos aspectosagronômicos.• ANVISA: avaliação da toxicolo-gia ao homem, incluindo as aná-lises de resíduos em alimentos.• IBAMA: avaliação das interaçõesdos agrotóxicos com o meio am-biente e seus componentes bióti-cos.

Ao Ministério da Agricultura com-petem basicamente as determinaçõessobre as pragas a serem controladas,assim como as dosagens e o númerode aplicações dos produtos, cujos da-dos podem ser consultados no Compên-dio de Defensivos Agrícolas (Andrei,

1999) e o seu complemento editado em2003.

O Ministério da Saúde baseia-se 26ensaios de exposição aguda em animaisde laboratório, cujos dados são extra-polados para o homem, estabelecendoassim 4 Classes Toxicológicas aos agro-tóxicos:

• Classe I - Extremamente tóxi-cos - rotulagem vermelha• Classe II – Altamente tóxico -rotulagem amarela• Classe III – Moderadamente tó-xico – rotulagem azul - Bt• Classe IV – Pouco tóxico – ro-tulagem verde - Bt

No caso das formulações de B. thu-ringiensis, essas se encontram predo-minantemente distribuídas entre as clas-ses III e IV, as quais se classificam comomoderadamente ou pouco tóxicas. Es-sas classes toxicológicas referem-se sem-pre a manipulação dos produtos pelosfabricantes, transportadores, aplicado-res e outros.

Também compete a ANVISA o esta-belecimento de “tolerância” que se re-fere aos limites máximos dos resíduos,os quais são avaliados em estudos deexposição subcrônica e crônica e da-dos desses resíduos nos produtos agrí-

colas. Junto ao MAPA são determina-dos os “períodos de carência” dos pro-dutos, que fazem referência ao interva-lo de segurança.

O Ministério do Meio Ambiente re-quer 20 ensaios ecotoxicológicos, 36estudos de características físico-quími-cas, 4 testes de metabolismo e degra-dação. Em seguida o produto é classifi-cado quanto ao seu potencial de peri-culosidade no meio ambiente:

• Classe I – Produto altamenteperigoso• Classe II – Produto muito peri-goso• Classe III – Produto perigoso -Bt• Classe IV – Produto pouco pe-rigoso - Bt

Como anteriormente, nesse caso osprodutos de B. thuringiensis se enqua-dram como perigosos ou pouco peri-gosos ao meio ambiente. Os dados quecompetem ao IBAMA envolvem os as-pectos: físico-químicos que revelam aidentidade da molécula do biopestici-da; ecotoxicológicos que englobam es-tudos com organismos não alvos (abe-lhas, minhocas, microcrustáceos, peixes,aves, microrganismos do solo e outros);comportamento no meio ambiente que


avalia a lixiviação, mobilidade nosolo e bioconcentração nas cadeiastróficas, entre outros.

Nos estudos toxicológicos dos bi-opesticidas podem ser avaliados so-mente o ingrediente ativo ou a for-mulação que se deseja registrar, po-dendo ambas as formas serem avali-adas simultaneamente. Após as aná-lises requeridas pela ANVISA e IBA-MA, é o MAPA quem registra a for-mulação do produto, publicando adecisão no Diário Oficial da União,com validade nacional e tempo in-determinado (Gallo et al.,2002).

1.2 Produtos comerciaisà base de B. thuringiensis

Entre os biopesticidas, a base deB. thuringiensis (Entwistle et al, 1993;Schnepf et al., 1998), apresentadosna Tabela 1, alguns se destacam nocontrole biológico de pragas agríco-las por serem utilizados há váriasdécadas, levando atualmente esseentomopatógeno a quase totalidadedo mercado dos pesticidas microbia-nos.

B. thuringiensis é um importanteagente de controle de insetos-praga,principalmente para lepidópteros ecoleópteros, porque seu ingredienteativo tóxico, representado por pro-teínas Cry, pode ser considerado ató-xico aos vertebrados e aos insetosnão-alvo (Siegel, 2001). Por outrolado, as formulações comerciais deB. thuringiensis apresentam uma es-tabilidade limitada a campo, além deapresentarem um período de aplica-ção crítico devido à redução da sus-cetibilidade com o desenvolvimentolarval dos insetos.

Para complementar e manter atu-alizadas essas informações recomen-da-se a revisão de alguns sites queindicados a seguir:

- www.andef.com.br (AssociaçãoNacional de Defesa)- www.epa.gov (EPA – Environ-mental Protection Agency)- www.anvisa.gov.br- www.ibama.gov.br- www.agricultura.gov.br- http: www. pesticide.net- http://pesticideinfo.org- http://foodchemicalnews.com- http://www.cnpma.embrapa.br

Quanto às formulações de B. thu-ringiensis israelensis e comercializa-

ção em escala mundial contra dípteros,especialmente os vetores de doençashumanas como Aedes aegypti, destacam-se os seguintes produtos (Thomas eEllar, 1983; Armstrong et al., 1985; Thi-ery et al., 1996; Andrade, 2008):

• Vectobac, Skeetal, Bactimos(Abbot)• Teknar (Sandoz)• Aquabac (Becker Microbials)• LarvX SG (Meridian PrecisionRealease Technologies)• Biotouch (Zohar Dalia)• Culinex (Culinex Gmbh)• Bacticide( Biotech InternationalLtd)• Bactivec (Labiofam)• Bt Horus SC (Bthek) (http://www.bthek.com.br)

Os mesmos autores também menci-onam algumas formulações comerciaisde B. sphaericus para o controle de lar-vas de Culex pipiens, como:

• Spherimos e Vectolex (Abbot)• Sphericide (Biotech Internatio-nal Ltda)• Spicbiomoss (Turicorin AlkaliChemicals and Fertilisers Ltda).

Apesar de haver um número signifi-cativo de produtos à base de B. thurin-giensis, ainda há um longo percursopara que sejam atingidas a maioria dasordens de insetos-praga de importân-cia agrícola e vetores de doenças hu-manas. Enquanto mais pesquisas vêmsendo desenvolvidas nessa área, devemser priorizados os biopesticidas já re-gistrados e comercializados para o con-trole de insetos a fim de reduzir a con-taminação ambiental causada pelos in-seticidas químicos.

1.3 Referências

ANDRADE, C.F.S. 2008. Controle Bioló-gico de Borrachudos – Dosagens deProdutos a Base de Bacillus thurin-giensis var. israelensis Artigos Téc-nicos - Unicamp, Instituto de Biolo-gia, Dep. de Zoologia, Campinas,2008. Site Ecologia Aplicada, 19p.Disponível em: http://w w w . i b . u n i c a m p . b r / p r o f s /eco_aplicada/. Acesso em: 04.12.08

ANDREI, E. Compêndio de defensivosagrícolas. 6 ed. São Paulo, Organi-zações Andrei. 1999. 672p.

ALVES, S.B. 1998. Controle microbianode insetos. 2 ª ed. Piracicaba, SP.

FEALQ, 1163 p.ARMSTRONG, J.L.; ROHRMANN, G.F.

& BEAUDREAU, G.S. 1985. Del-ta-endotoxinas of Bacillus thu-ringiensis subspecies israelen-sis. Journal Bacteriology 161:39-46.

ENTWISTLE P. F., CORY J.S., BAILEYM.J. & HIGGS S. 1993. Bacillusthuringiensis, an environmentalbiopesticide : theory and practi-ce. John Wiley & Sons, NewYork, USA, 311p.

GALLO, D. (in memoriam); NAKA-NO, O.; NETO, S.S.; CARVALHO,R.P.L.; BAPTISTA, G.C.; BERTIFILHO, E.; PARRA, J.R.P.; ZUCCHI,R.A. ; ALVES, S.B.; VENDRAMIM,J.D.; MARCHINI, L.C.; LOPES,J.R.S.; OMOTO, C. 2002. Entomo-logia Agrícola. Piracicaba, SP.FEALQ, 920 p.

MEADOWS, M.P. 1993. Bacillus thu-ringiensis in the Environment:Ecology and Risk Assessment. p.193-213. In.: ENTWISTLE P. (ed.).Bacillus thuringiensis, An Envi-ronmental Biopesticide : Theoryand Practice. John Wiley & Sons,New York, USA.

POLANCZYK, R.A.; MARTINELLI, S.;OMOTO, C.; ALVES, S.B. 2003.Bacillus thuringiensis no manejointegrado de pragas. Revista Bio-tecnologia Ciência e Desenvolvi-mento, 31: 18-27.

SCHNEPF, E.; CRICKMORE, N.; VAN-RIE, J; LERECLUS, D.; BAUM, J.;FEITELSON, J.; ZEIGLER, D.R. &DEAN, D.H. 1998. Bacillus thu-ringiensis and its Pesticidal Crys-tal Proteins. Microbiol. Mol. Biol.Rev., v. 62, p. 775-806.

SIEGEL, J. P. 2001. The mammaliansafety of Bacillus thuringiensisbased insecticides. J. Invertebr.Pathol. 77: 13-21.

THIERY, I., BACK, C.; BARBAZAN,Ph.; SINÈGRE, G. 1996. Applica-tions de Bacillus thuringiensis etde B. sphaericus dans la démous-tication et la lutte contre les vec-teurs de maladies tropicales.In :Annales de l’Institut Pasteur –Les bactéries pathogènesd´insectes et leurs applications,7 (4) : 247-260.

THOMAS, W. & ELLAR, D. 1983. Ba-cillus thuringiensis var. israelen-sis crystal delta-endotoxin: effectson insect and mammalian cells invitro and in vivo. Journal of CellScience 60:181-197.



Pesquisa

PLANTPLANTPLANTPLANTPLANTAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAMAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAMAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAMAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAMAS TRANSGÊNICAS QUE SINTETIZAMTTTTTOOOOOXINAS DE XINAS DE XINAS DE XINAS DE XINAS DE BACILLUS THURINGIENSIS BACILLUS THURINGIENSIS BACILLUS THURINGIENSIS BACILLUS THURINGIENSIS BACILLUS THURINGIENSIS E OUTRASE OUTRASE OUTRASE OUTRASE OUTRAS

o contexto das aplicaçõesbiotecnológicas do ento-mopatógeno B. thuringi-ensis, aqui se encontramdados bibliográficos sobrea transformação genéticade plantas, com genes de

B. thuringiensis e outros, que conferemresistência ou tolerância das plantas hos-pedeiras aos insetos-praga. As espécies ve-getais apresentam naturalmente uma re-sistência aos insetos fitófagos, diferenci-ando assim os grupos de pragas em fun-ção das plantas hospedeiras. A resistên-cia vegetal está baseada em vários meca-nismos de defesa, incluindo uma gamade metabólitos secundários nocivos pro-duzidos pelas plantas. A biotecnologia ve-getal, através do desenvolvimento de téc-nicas de biologia celular e molecular devegetais superiores oferece novas possi-bilidades ao melhoramento de plantas cul-tivadas, facilitando a obtenção de plantasresistentes ao ataque dos insetos. A trans-formação genética e a regeneração in vi-tro de plantas, somadas à disponibiliza-ção de genes de interesse agronômico,destinados a introdução em plantas, têmpermitido a geração de plantas transgêni-cas com características específicas, sem orompimento de combinações genéticas jáselecionadas pelos programas convenci-onais de melhoramento genético de plan-tas cultivadas. A transformação de plan-tas com genes de origem microbiana, ve-getal e animal, os quais codificam especi-ficamente toxinas com efeito inseticida,

vem sendo considerada uma alternativa re-levante junto aos métodos de controle deinsetos-praga das plantas de interesse eco-nômico, onde se destacam as plantas-Btresistentes a diversas ordens de insetos,principalmente aos lepidópteros e coleóp-teros.

1.1 Genes deB. thuringiensis em plantas

B. thuringiensis apresenta um geno-ma de 2,4 a 5,7 milhões de pares de ba-ses, com elementos extracromossômicoslineares ou circulares (Carlson et al., 1994).Os genes cry estão localizados em plas-mídios, sendo esses responsáveis pela sín-tese de diferentes proteínas inseticidas,cuja clonagem e caracterização dessesgenes em 1981 (Schnepf & Whiteley, 1981)revelou novas perspectivas de aplicaçãodo entomopatógeno. Entre essas se encon-tra a transgenia que permite introduzir osgenes de B. thuringiensis codificadores dastoxinas nos genomas dos vegetais, permi-tindo a expressão contínua das proteínasem todos os tecidos da planta e atingin-do, assim, apenas os insetos-praga que sealimentam dos tecidos (de Maagd et al.,1999). A primeira geração de plantas trans-gênicas resistentes a insetos foi desenvol-vida com o uso de genes codificadores deproteínas inseticidas de B. thuringiensis(Fischhoff, 1987; Vaeck et al., 1987).

Os genes cry de B. thuringiensis sãotalvez os exemplos mais conhecidos degenes exógenos para os quais tem sido

difícil obter um nível satis-fatório de expressão emplantas transgênicas (Diehnet al.,1996). A baixa expres-são dos genes de B. thurin-giensis em plantas tem sidoassociada à instabilidadedas moléculas de mRNA,uma característica ampla-mente observada da expres-são destes genes em plan-tas é o pouco ou nenhumacúmulo de mRNA mesmoquando sob controle depromotores fortes. Para tan-

to várias modificações têm sido testadaspara aumentar a eficiência de expressãodestes genes, como adaptar os códons pre-ferenciais de bactérias para códons prefe-renciais de plantas e/ou aumentar o con-teúdo de G/C nas seqüências codificantes(Perlak et al., 1991), retirada de sítios desplicing, modificações dos sinais de poli-adenilação dentro da região codificante(Koziel et al., 1993), inserção de íntronsna região 5’ da seqüência não traduzida(Jouanin et al., 1998) bem como a inser-ção de genes nativos em cloroplastos ini-cialmente restrita a tabaco (McBride et al.,1995).

Genes parcialmente ou totalmente sin-téticos têm sido construídos, nestes genesa seqüência de nucleotídeo é modificadasem a troca da seqüência de aminoácido,a expressão destes genes em plantas au-mentou significativamente (de menos de0,001% de proteína solúvel na folha paraaté 1%), sendo os genes totalmente sinté-ticos os mais eficientes em testes de cam-po (Jouanin et al., 1998).

Os estudos iniciais se basearam emplantas como tabaco e tomate (Barton etal., 1987; Fischhoff et al., 1987; Vaeck etal., 1987) devido às facilidades de trans-formação, cultivo em casa de vegetação ecrescimento rápido. Vários genes quimé-ricos contendo um gene promotor de ori-gem vegetal; a seqüência completa do genecry e uma região de poliadenilação foramintroduzidos em tabaco e tomate, porémnenhuma expressão foi detectada em ta-baco e níveis muito baixos foram obser-vados em tomate (Perlak et al., 2001).

A truncagem da seqüência codificadorado gene cry por eliminação da metade 3’desta seqüência aumentou a expressãopara níveis detectáveis de proteína e mRNA(Estruch et al., 1997). Os primeiros testesde campo com versões truncadas do genecry foram eficientes no controle de Heli-coverpa zea no caso do tomate (Perlak &Fischhoff, 1993), porém não no controlede Heliothis virescens no caso do algodão(Jenkins et al., 1991). Os resultados maisefetivos foram obtidos utilizando genes sin-téticos (Perlak et al., 1990; Perlak et al.,1991; Van der Salm et al., 1994).

Lidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre em Fitotecnia –Fitossanidade (UFRGS), Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora em biotecnologiaVegetal (CIRAD-Montpellier).

Laura Massochin Nunes PintoBióloga (PUCRS) e Mestre e Doutoranda emBiologia: Diversidade e Manejo de Vida Silvestre(UNISINOS).


Álamo

AlfafaAlgodão

AmendoimArroz

Batata

Berinjela

BrócolisCanola

Fumo

Milho

RepolhoSojaTomate

cry1Aacry3Aacry1Cacry1Abcry1Ac e cry2Abcry1F e cry1Ac

cry1Ab e Vip3Aacry1Accry1Accry1Aacry1Ab

cry1Ac

cry1Ab e cry1Ac

cry1Bcry1Ccry2Acry1Abcry1Abcry3Aa

cry1Abcry3Acry3Bcry1Ccry1Ac

cry1Accry1Aacry1Abcry1Ab e cpTIcry1Abcry1Accry1Ccry2A

cry1Abcry9ccry1Fcry1Accry3Bb1cry34Ab1 e cry35Ab1cry1Ab1 e cry3Bb1

cry1F + cry34Ab1 ecry35Ab1

cry3A e cry1Abcry1A e cry2Ab2cry1A + cry2Ab2 ecry3Bb1cry1Accry3Acry1Abcry1Accry1Abcry1Ac

Lymantria dispar (L.)Chrysomela tremulae F.Spodoptera litoralis (Boiusduval)Heliothis virescens, Helicoverpa zeaSpodoptera exigua, Pseudoplusia includens (Walker)Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Pectinophora gossypiella, Estigmeneacrea, Bucculatrix thurberiella, Pseudoplusia includens, Spodopteraexigua, Spodoptera frugiperda, Spodoptera ornithogalli, Ostrinianubilalis-lepidópterosElasmopalpus lignosellusChilo suppressalisCnaphalocrocis medinalis, Chilo suppressalis, Scirpophagaincertulas,Cnaphalocrocis medinalis, Herpitogramma licarisalis;Sesamia inferens, Naranga anescens, Mycalesis gotama, Parnaraguttata.Chilo suppressalis, Nilaparrata lugens, Scirpophaga incertulas

Chilo suppressalis, Scirpophaga incertulas, Ostrinia nubilialis,Cnaphalocrocis medinalisChilo suppressalisScirpophaga incertulas, Cnaphalocrocis medinalisScirpophaga incertulas,Cnaphalocrocis medinalisPhthorimaea operculella (Zeller)Heliothis armigera (Hübner)Leptinotarsa decemlineata

Leucinodes orbonalis GuenéeLeptinotarsa decemlineata (Say)Leptinotarsa decemlineataPlutella xylostella (L.)Thrichoplusia ni (Hübner), Spodoptera exigua (Hübner), Heliothisvirescens (Fabr.), Helicoverpa zea (Boddie)Plutella xylostellaManduca sexta (L.)Manduca sextaManduca sextaManduca sextaHeliothis virescens, Helicoverpa zea, Spodoptera littoralisSpodoptera littoralisHelicoverpa armigera, Heliothis virescens, Helicoverpa zea, SpodopteraexiguaOstrinia nubilalis (Hübner)Ostrinia nubilalisDiatraea grandilosella, Ostrinia nubilalisOstrinia nubilalisDiabrotica virgifera, Diabrotica barberiDiabrotica virgiferaOstrinia nubilalis, Diatraea grandiosella, Diatraea crambidoides,Diatraea saccharalis, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda,Elasmopalpus lignosellus, Diabrotica virgifera, Diabrotica barberiOstrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodopterafrugiperda, Elasmopalpus lignosellus, Diabrotica virgifera, Diabroticabarberi, Diatraea crambidoides, Diatraea grandiosella, Diatraeasaccharalis, Striacosta albicostaDiabrotica virgifera, Diabrotica barberi--

Ostrinia nubilalisDiabrotica virgifera, Diabrotica barberiPlutella xylostellaHeliothis virescens, Helicoverpa zea, Pseudoplusia includensHeliothis virescensHelicoverpa armigera

McCown et al. (1991)Cornu et al. (1996)Sthrizhov et al. (1996)Perlak et al. (1990)Adamczyk et al. (2001)EPA (2008)

EPA (2008)USDA (2008)Singsit et al. (1997)Breitler et al. (2004)Shu et al. (2000), Ye et al. (2003), Wunn et al.(1996), Datta et al. (1998), Ghareyazie et al.(1997), Alam et al. (1998), Wu et al. (1997),Husnain et al. (2002)Loc et al. (2002), Khanna e Raina (2002),Nayak et al. (1997), Han et al. (2007)Cheng et al. (1998), Ahmad etal. (2002), Tu et al. (2000)Breitler et al. (2000 e 2001)Tang et al. (2006)Maqbool et al. (1998), Chen et al. (2005)Peferoen et al. (1992), Rico et al. (1998)Chakrabarti et al. (2000)Adang et al. (1993), Perlak et al. (1993),Coombs et al. (2002)Kumar et al. (1998)Jelenkovic et al. (1998)Iannacone et al. (1997)Zhao et al. (2001)Stewart et al. (1996b)

Halfhill et al. (2001)Barton et al. (1987)Vaeck et al. (1987)Perlak et al. (1991)Williams et al. (1993)McBride et al. (1995)Strizhov et al. (1996)Selvapandiyan et al. (1998);Kota et al. (1999)Koziel et al. (1993)Jansem et al. (1997)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)

EPA (2008)

EPA (2008)EPA (2008)EPA (2008)

USDA (2008)USDA (2008)Bhattacharya et al. (2002)Stewart et al. (1996a)Fischolff et al. (1987)Mandaokar et al. (2000)

Plantas Genes Insetos-Alvo Referências

Tabela 1. Genes de B. thuringiensis utilizados na engenharia genética de plantas


Genes de B. thuringiensis codificado-res de proteínas Cry foram isolados e in-troduzidos em plantas agronomicamenteimportantes utilizando diferentes métodosde transformação genética como aquelesque empregam Agrobacterium, transfor-mação direta de protoplastos e bombar-deamento de partículas ou biobalística.No início dos anos 80, o primeiro genecry foi clonado e expresso em Escheri-chia coli (Schnepf & Whitley, 1981), sen-do no final dessa década produzida a pri-meira planta de tomate com genes de B.thuringiensis (Fischhoff, 1987). O milhoMaximizer™ da Novartis, o algodão Boll-gard™ e a batata Newleaf™ da Monsantoforam introduzidas no mercado norte-americano em 1995, sendo genericamen-te conhecidas como plantas-Bt (Jouaninet al.,1998). Atualmente, o milho-Bt é aplanta transgênica mais cultivada no mun-do, ocupando 15% da área global cultiva-da com transgênicos em países comoEUA, Canadá, Argentina, África do Sul,Espanha e França. O algodão-Bt ocupa osegundo lugar em áreas plantadas, repre-sentando aproximadamente 7% da áreacultivada com transgênicos (James, 2000).Além do milho, da batata, do tomate e doalgodão, outras plantas cultivadas expres-sam uma ou várias proteínas Cry para ocontrole de lepidópteros e coleópteros(Tabela 1) e outras plantas-Bt de espéci-es cultivadas estão em fase de desenvol-vimento em laboratórios ou em testes decampo (Oecd, 2001).

Atualmente estão registradas mais de300 seqüências de genes cry, indicandoque a próxima geração de plantas-Bt de-verá apresentar múltiplos genes cry, ofe-recendo aos produtores um maior espec-tro de proteção contra diferentes insetos-praga e reduzindo a probabilidade dosmesmos desenvolverem resistência.

As pesquisas também estão voltadaspara o incremento da expressão dos ge-nes de B. thuringiensis em plantas, naseleção de novas variantes de B. thurin-giensis mais ativas e/ou na modificaçãodas seqüências dos genes cry de maneiraa aumentar a produção de toxinas no in-terior das plantas. Nesse sentido, Schuleret al. (1998) relata que uma estratégia paraa maior efetividade tóxica das plantas-Btcontra insetos seria a introdução de ge-nes nativos de B. thringiensis no genomados cloroplastos, o que resulta num ele-vado nível de expressão. A natureza pro-cariótica dos plastídios vegetais permitea transcrição dos genes de B. thringiensise a tradução e processamento dos mR-NAs de forma mais eficiente. Nesse caso,alguns autores mencionam que o entraveestaria associado à transformação de clo-roplastos a qual se restringe apenas a al-gumas plantas-modelo, como por exem-plo tabaco e tomate (Jouanin et al., 1998;Kota et al., 1999).

1.2 Outros genes em plantas

Considerando outros genes de interes-se à engenharia genética de plantas, osinibidores de proteinases vegetais são po-lipeptídios ou proteínas que se encontramnaturalmente nas plantas e fazem partedo sistema de defesa das mesmas contraherbívoros. Nos insetos as proteinases sãoclassificadas em diferentes grupos, vari-ando conforme a ordem ou espécie, sen-do estas responsáveis pela digestão dosalimentos de onde são assimilados nutri-entes essenciais ao crescimento e ao de-senvolvimento dos mesmos.

Os inibidores de proteinases serínicase cisteínicas vêm sendo mencionadoscomo inibidores do crescimento e do de-senvolvimento de alguns insetos das or-dens lepidóptera e coleóptera, respecti-vamente. A atividade antimetabólica dosinibidores não foi bem elucidada, poden-do estes: inibirem as enzimas digestivasdiretamente; provocarem a hipersecreçãode enzimas no intestino provocando o es-gotamento dos aminoácidos essenciais;afetarem o balanço hídrico, as trocas e aregulação enzimática dos insetos (Schu-ler et al., 1998).

Inibidores de alfa-amilases podem serconsiderados um segundo inibidor de en-zimas, também utilizados na transforma-ção de plantas (Tabela 2). Ensaios reali-zados com Callosobruchus sp. e Bruchussp. mostram que esses inibidores, comoalfa-AI-Pv oriundo do feijão comum (Pha-seolus vulgaris), são glicoproteínas termo-estáveis que inibem alfa-amilases no in-testino médio desses coleópteros pragasde grãos armazenados, bloqueando assimo seu desenvolvimento larval (Schuler etal.,1998).

As lectinas são proteínas naturalmen-te produzidas por plantas, principalmen-te pelas leguminosas, como Glycine maxe Canavalia ensiformes, respectivamen-te. O modo de ação destas proteínas ve-getais não foi bem elucidado, mas algunsresultados de pesquisa sugerem que estasse ligam às células epiteliais do intestinodos insetos (Carlini & Grossi-de-Sá, 2002).

Dados de pesquisa mostram que vári-as lectinas identificadas têm efeito inseti-cida contra diversas ordens de insetos,principalmente coleópteros, hemípteros ehomópteros, porém algumas apresentamefeito tóxico para mamíferos, enfatizandoassim a necessidade de maiores investi-gações nessa área (Carlini & Grossi-de-Sá, 2002).

Alguns genes de quitinases, peroxida-ses e triptofano-descarboxilases vêm sen-do introduzidos em plantas visando prin-cipalmente à resistência a insetos da or-dem Homoptera (Schuler et al., 1998). Poroutro lado, os conhecimentos sobre osmecanismos de ação desses produtos sãorestritos devido à elevada complexidade

do sistema.No controle de pragas de importância

agrícola, observa-se que, a possibilidadede obtenção de plantas que sintetizam to-xinas letais aos insetos através da trans-formação vegetal com genes oriundos deoutras plantas, microrganismos e animais,abriu novas perspectivas ao Manejo Inte-grado de Pragas. Outro aspecto importantesão as novas alternativas de controle deinsetos de difícil acesso através dos méto-dos convencionais, seja pelo modo de vidasubterrâneo ou endofítico da praga alvo.

A utilização de plantas transgênicasresistentes permite o acúmulo do produ-to (toxina) entomotóxico nos tecidos ve-getais, afetando diretamente a espécie alvoquando a mesma se alimenta do tecidotransgênico, sem causar danos às espéci-es não alvo, representando assim um mé-todo alternativo para o controle de pra-gas das plantas cultivadas associado à pre-servação do meio ambiente.

1.3 Segurança dasplantas transgênicas

A liberação comercial das plantas ge-neticamente modificadas com genes cryde B. thuringiensis, relatada na publica-ção de Dunwell (1999), revela que os pro-dutores norte-americanos têm adotado asplantas transgênicas como um elementochave no aumento da produção vegetal.Esse marco histórico só chegou ao Brasilem 2005, através da regulamentação e li-beração do cultivo e comercialização dasplantas transgênicas. Para maior detalha-mento sobre esse assunto consultar os se-guintes sites:

- www.ctnbio.gov.br (Comissão Técni-ca Nacional de Biossegurança)- www.anbio.org.br (Associação Naci-onal de Biossegurança)

Os dados de revisão de Fontes et al.(2002) relatam a segurança, riscos ambi-entais e eficiência no controle de pragasatravés do emprego das plantas-Bt. Tam-bém os trabalhos de revisão de Bobro-wski et al. (2003) e Polanczyk et al. (2003)citam alguns benefícios do uso dessa tec-nologia, como:

• Diminuição dos efeitos ambientaissobre as toxinas;• Segurança na utilização;• Redução do uso de inseticidas quími-cos;• Eficiência no controle das pragas;• Proteção vegetal;• Preservação dos inimigos naturais;• Redução de doenças fúngicas.

1.4 Considerações e perspectivas

Os dados de pesquisa têm reveladoque certas espécies de insetos, principal-


GENES / PRODUTOS

CMe (cevada); CMTI (abóbora); MTI-2 (mostarda);PI-IV (soja); KTi3 e SKTI (soja); inibidor deproteinase I e II (tomate); SI (animal);α1AT(animal)Pot PI-I e Pot PT-II (batata); BPTI (pâncreasbovino);C-II (soja); CpTI (cowpea)

OC-1 (arroz)anti-quimiotripsina (Manduca sexta), anti-elastase(M. sexta), anti-tripsina (M. sexta)Inibidores de alfa-amilaseWMAI-1 (cereais)αAI-Pv (feijão)LectinasGNA (anêmona), p-lec (ervilha)

WGA (trigo), lectina (arroz), jacalinOutrosBCH – quitinase (feijão)Quitinase (Manduca sexta)Quitinase(tomate), Peroxidase(fumo)TDC (crisântemo)14K-CL (bifuncional) *

INSETOS-ALVO

Lepidoptera

Lepidoptera, Orthoptera

Coleoptera, Lepidoptera

Coleoptera, HomopteraHomoptera

LepidopteraColeoptera

Lepidoptera, Homoptera

Lepidoptera, Coleoptera

Lepidoptera, HomopteraLepidopteraLepidoptera, Homoptera, ColeopteraHomopteraLepidoptera, Coleoptera

PLANTAS TRANSFORMADAS / PRODUTOS

fumo, arabidopsis, batata, alfafa, beladona,tomate

petúnia, fumo, bétula, alface, arroz, batata,trevo brancocolza, álamo, batata, fumo, maçã, alface, arroz,morango, girassol, batata-doce, tomatecolza, álamo, fumoalgodão, fumo, alfafa

fumofeijão, ervilha, fumo

uva, colza, batata, arroz, batata-doce, cana-de-açúcar, girassol, fumo, tomatemilho

batatafumocolza, fumo, tomatefumofumo

* bifuncional: inibidor de proteinases serínicas e de alfa-amilases

mente lepidópteros, têm adquirido resis-tência às proteínas Cry de B. thuringien-sis, reforçando assim o compromisso dasfuturas pesquisas na identificação de no-vas toxinas inseticidas. Também são con-siderados importantes os estudos sobreexpressão gênica, espectro de ação e es-pecificidade das proteínas inseticidas, per-mitindo a disponibilização freqüente denovas versões gênicas mais eficazes, maisespecíficas e com vantagens ainda maio-res sobre as práticas convencionais decontrole de pragas. Ainda para evitar ouretardar o surgimento de resistência deinsetos às plantas transgênicas, recomen-da-se a adoção de técnicas de manejo ade-quadas, sendo algumas já relatadas porPeferoen (1997) há mais de uma década.

A aplicação integrada das plantastransgênicas na agricultura convencional,já ultrapassou a aceitação pública da tec-nologia dos transgênicos e atualmente re-presenta uma realidade no incremento daprodução de alimentos de origem vege-tal, com baixo custo e impacto ambiental.

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Tabela 2. Outros genes utilizados na obtenção de plantas transgênicas resistentes aos insetos (adaptado de Schuler et al., 1998)


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Pesquisa

EVOLEVOLEVOLEVOLEVOLUÇÃO E MANEJOUÇÃO E MANEJOUÇÃO E MANEJOUÇÃO E MANEJOUÇÃO E MANEJODDDDDA RESISTÊNCIA DE INSETA RESISTÊNCIA DE INSETA RESISTÊNCIA DE INSETA RESISTÊNCIA DE INSETA RESISTÊNCIA DE INSETOSOSOSOSOS

“O conhecimento nos permite contornar muitos problemas, mas muitas

vezes, apenas nos possibilita adiar o inevitável, transferindo para algum ponto futuro

os acontecimentos que buscamos com todo empenho evitar – Vilmar Machado”

ste artigo apresenta alguns aspec-tos relacionados à evolução e aomanejo da resistência do pontode vista da biologia evolutiva.Aqui são abordados os mecanis-mos biológicos envolvidos no

processo de adaptação dos insetos-pra-ga aos agentes de controle e, também,como o conhecimento destes se refletenas estratégias utilizadas para reduzir avelocidade de evolução da resistênciaàs plantas transgênicas.

1.1 Introdução

A resistência aos inseticidas é umfenômeno mundial e as estimativas atu-ais indicam que mais de 500 espéciesde artrópodes desenvolveram resistên-cia a um ou mais pesticidas (Georghiou& Lagunes-Tejeda, 1991). A resistênciatambém foi observada para uma varie-dade de produtos naturais e regulado-res do crescimento de insetos. Dentreo que aprendemos com a utilização deinseticidas químicos foi que a capaci-dade de resposta adaptativa dos inse-tos é quase inevitável e ocorre relativa-mente rápido. Para muitos esse fenô-meno parece ser surpreendente, masnão devemos esquecer que uma das ca-racterísticas mais relevantes dos orga-nismos vivos é sua capacidade de evo-luir continuamente.

O processo de evolução ocorre deforma “automática” - sem a influênciade forças externas ou de um agente di-recionador para compreender como asmudanças evolutivas acontecem, pre-cisamos analisar aspectos básicos da bi-ologia dos seres vivos os quais influen-

ciam a evolução da diversidade bioló-gica possibilitando a adaptação aos di-ferentes ambientes e também respostasespecíficas a pressões seletivas mais di-retas, como a predadores, parasitas oua agentes de controle desenvolvidospela espécie humana, como antibióti-cos ou inseticidas químicos.

Nossa relação com insetos-praga,bactérias e vírus, mesmo que pareça es-tranha para alguns, pode ser analisadacomo um processo de co-evolução.Nossas respostas, nesse processo, sãofrutos da aplicação do conhecimento ci-entífico enquanto o que observamos,através da evolução da resistência, nãoé. Indiferentes aos nossos esforços, po-pulações de insetos se reproduzem pas-sando de uma geração para outra asinformações genéticas. Esse processo dereprodução não é aleatório: em cadageração alguns indivíduos deixarão maisdescendentes que outros; o sucesso napassagem dos genes para as próximasgerações está associado à presença decaracterísticas genéticas que contribu-em para a reprodução e a sobrevivên-cia às condições ambientais vigentes.

A descrição acima pode ser simples,mas nos possibilita ter uma idéia geraldo processo de evolução da resistênciaaos antibióticos e inseticidas químicos.Para uma compreensão mais apuradado processo podemos fazer, no míni-mo, duas perguntas relevantes. Quaisas características importantes do mate-rial genético passado de uma geraçãopara outra no processo de evolução?Porque a sobrevivência e a reproduçãonão são aleatórias?

As respostas para estas perguntas

Vilmar MachadoBiólogo (UNISINOS) e Mestre e Doutor emGenética e Biologia Molecular (UFRGS)

Lidia Mariana FiúzaEngenheira Agrônoma (UPF), Mestre emFitotecnia – Fitossanidade (UFRGS),Doutora em Ciências Agronômicas(ENSAM-Montpellier) e Pós-Doutora embiotecnologia Vegetal (CIRAD-Montpellier).


nos permitirão compreender, em linhasgerais, a evolução da resistência aos in-seticidas e antibióticos, e também ana-lisar as possibilidades de evolução daresistência às plantas geneticamente mo-dificadas com genes de B. thuringien-sis, denominadas plantas-Bt. Além dis-so, ajudarão a compreender os proce-dimentos utilizados nas estratégias demanejo da evolução da resistência.

1.2 Diversidade genética naspopulações e evolução da resistência

A evolução de respostas adaptati-vas ocorre pelo efeito de seleção natu-ral sobre a variação genética existentenas populações. A aplicação repetidade inseticidas do mesmo grupo quími-co e modelo de ação favoreceram vari-antes genéticas específicas nas popula-ções alvos levando à substituição dosindivíduos susceptíveis pelos indivídu-os resistentes. O gene para resistênciaque aumenta em freqüência numa po-pulação pode se espalhar para outraspopulações através do fluxo gênico.

As diferenças genéticas entre os in-divíduos de uma população são consi-deradas a matéria prima da evolução,existindo uma relação entre valor adap-tativo médio de uma população e osníveis de variabilidade que ela apresen-ta. Segundo o teorema fundamental deFisher (1930), a taxa de mudança evo-lutiva é proporcional à diversidade ge-nética existente nas populações.

A diversidade genética é a base pararespostas às mudanças ambientais. Aimportância do estudo da variabilidadepode ser compreendida pela quantida-de de trabalhos sobre o tema, em espe-cial procurando identificar os fatoresenvolvidos na sua manutenção. Nos tra-balhos com populações naturais, a pre-ocupação com a existência da diversi-dade genética aparece de formas varia-das. Para programas de conservação emanejo da vida silvestre, um dos temascentrais é a manutenção da variabilida-de genética em ambientes fragmenta-dos, pois é consenso que a persistênciafutura das populações pode dependerda preservação de componentes espe-cíficos da diversidade genética (Gilpin& Sóule, 1986; Meffe & Carrol, 1997).Em programas de manejo e controle depragas e vetores, essa preocupação estáassociada, por um lado, à busca por li-nhagens de agentes de controle quesejam específicas a uma determinadapraga (Potting et al. 1997; Vink et al.,2003) e por outro, à identificação de

variantes resistentes aos agentes de con-trole nas espécies consideradas pragasou vetores de doenças (Ofuya & Cre-dland, 1995; Winder et al. 1997; Guiraoet al. 1997; Nicol et al. 1998; Szalanskiet al. 1999; 2000; Oliveira et al. 2001;Birungi & Munstermann, 2002). A im-portância e as implicações de existên-cia de variação genética nas populaçõesnaturais de pragas e vetores foram sali-entadas por Diehl & Bush (1984) emseu trabalho sobre “biotypes”. Segun-do os autores, o não reconhecimentodesse fator pode frustrar ou dificultarprogramas de manejo e controle bioló-gico de pragas. Para Newman et al.(1998), a diversidade genética nas po-pulações é um dos elementos que con-tribuem para reduzir a eficiência de pro-gramas de controle químico e/ou bio-lógico. Essa também é uma preocupa-ção considerada por programas envol-vidos no desenvolvimento de varieda-des de plantas resistentes a insetos-pra-ga (Sardesai, 2000; Heinrichs, 2001).

A importância da variabilidade ge-nética para programas de manejo e con-trole de pragas tem sido discutida pordécadas, mas seu estudo tornou-se pos-sível apenas com o desenvolvimento demarcadores baseados na análise deDNA. A aplicação desses marcadorestornou-se uma ferramenta importantepara o estudo da dinâmica e dos fato-res que influenciam populações natu-rais (Edwards, 1993; Smith & Wayne,1996; Schierwater & Desale, 1998). Es-tudos detalhados sobre a importânciada variabilidade genética em insetos-praga ou vetores são recentes e entreeles destacam-se: Winder et al. (1997);Guirao et al. (1997); Nicol et al. (1998);Szalanski et al. (1999); Downie (2000);Geurgas et al. (2000; 2002); Appleby &Credland (2003).

Estudos recentes têm registrado va-riação intra-específica na susceptibilida-de a agentes de controle químico e/oubiológico em várias espécies, como porexemplo, Microctonus aethiopoides,Schizaphis graminium e Spodopterafrugiperda. Em Microctonus aethiopoi-des (Hymenoptera: Braconidae), um pa-rasitóide utilizado em programas decontrole de biológico de pragas, foramidentificadas linhagens (biotipos) adap-tadas a hospedeiros diferentes, analisan-do-se a variação intra-específica no genepara Citocromo Oxidase I (Vink et al.,2003). Uma das dificuldades no contro-le de Schizaphis graminium (Hemipte-ra: Aphididae), uma das mais importan-tes pragas de cereais do mundo, é a

existência de linhagens diferentes aolongo da sua área de distribuição. Paraesse inseto estão sendo realizados es-tudos visando selecionar marcadoresmoleculares específicos para identificaras diferentes linhagens e, desta forma,melhorar as condições de controle uti-lizando agentes específicos para cadauma (Aikhionbare & Mayo, 2000; Lo-pes da Silva et al., 2004). Em Spodopte-ra frugiperda (Lepidoptera: Noctuide),uma praga de várias culturas importan-tes, lagartas coletadas em hospedeirosdiferentes apresentaram diferenças sig-nificativas na susceptibilidade a deter-minados inseticidas e a endotoxinas deB. thruringiensis (Adamczyk, et al.,1997).

Exemplos mais interessantes da di-versidade genética em insetos-pragaocorre em Bemisia tabaci, consideradapor muitos a principal praga agrícolado mundo, tendo sido registrada suaocorrência em mais de 600 espécies deplantas e, até o momento, são conheci-dos mais de 20 biotipos (Oliveira et al.,2001; Omondi el al., 2005; Carabali etal., 2005). No Brasil, esse inseto é co-nhecido como mosca-branca e os pre-juízos caudados decorrem da atividadede sucção de seiva, injeção de toxinase pela transmissão de vírus de plantas.A variabilidade genética intra-específi-ca e a diversidade de hospedeiros es-tão entre os grandes desafios para ocontrole desse inseto (Perring, 2001).

Os parágrafos acima reforçam a idéiade que é preciso levar em conta a di-versidade genética existentes nas po-pulações dos insetos-alvo em progra-mas de manejo e controle. Vários estu-dos demonstram que essa variabilidadetambém está presente nos mecanismosbiológicos que possibilitam a ação dastoxinas de B. thuringiensis.

A resistência às toxinas de B. thu-ringiensis pode envolver: a não ativa-ção da toxina, a imobilização da toxinana membrana peritrófica, sua incapaci-dade de ligar-se aos receptores da mem-brana, sua incapacidade de criar porosna membrana do epitélio e sua baixaeficiência pelo rápido reparo dos da-nos causados por ela às células afeta-das (Ferre & Van Rie, 2002; Griffitts &Aroian, 2005; Baxter et al. 2008).

O mecanismo mais comum envol-vendo a resistência às toxinas de B. thu-ringiensis é a redução na capacidadede ligação aos receptores nas microvi-losidades do intestino médio dos inse-tos (Ferre et al., 1991; 2003; Pigott &Ellar, 2007; Wang et al., 2007; Rodrigo-


Simón et al., 2008). Modificações nosgenes que codificam os receptores paraas proteínas Cry foram encontradas emvárias espécies. Mutações nos recepto-res para proteína Cry1A estão envolvi-das na resistência em Heliothis virescens(Gahan et al., 2001), Pectinophora gos-sypiella (Morin et al., 2003), Helicover-pa armigera (Xu et al., 2005; Luo et al,2006) e P. xylostella (Ballester et al.,1999). Em C. elegans foram identifica-dos quatro genes diferentes para resis-tência à toxina (Griffitts et al., 2005).Além disso, foram descritos mecanismosde resistência a B. thuringiensis envol-vendo genes diferentes em H. virescens,P. xylostella (Jurat-Fuentes & Adang,2006) e P. interpunctella (Herrero et al.,2001). Em H. virescens em cada 1000insetos 1,5 é portador do gene para re-sistência a B. thuringiensis (Gould etal., 1995; 1997).

As informações acima demonstramclaramente a presença de genes pararesistência às toxinas de B. thuringien-sis em populações de várias espéciesmesmo que em baixa freqüência. É pre-ciso destacar que até o momento nãofoi registrada nenhuma população na-tural resistente a essas toxinas. O que énecessário para que estes genes aumen-tem em freqüência nas populações na-turais? A resposta simples é: que as apli-cações das toxinas B. thuringiensis tor-nem-se numa pressão de seleção cons-tante e intensa.

1.3 Fluxo gênico

Estudos sobre a estrutura genéticade populações têm demonstrado, aolongo do tempo, que as espécies rara-mente são constituídas por populaçõesúnicas e panmíticas; pelo contrário, di-ferenças genéticas são encontradas en-tre as populações. Essas diferenças sãocomponentes importantes da diversida-de genética da espécie. Em geral, a tro-ca de genes ocorre com maior probabi-lidade entre populações próximas geo-graficamente do que entre populaçõesmais distantes, sendo influenciada pelaestrutura geográfica e espacial das po-pulações. Portanto, o estudo da estru-tura genética das populações é um com-ponente importante de programas demanejo e controle de pragas, pois po-dem fornecer informações sobre níveisde variabilidade genética, graus de di-ferenciação entre as populações e pa-drões de fluxo gênico. Além disso, podepossibilitar o monitoramento das mu-

danças na freqüência de genes es-pecíficos.

A caracterização genética das es-pécies alvo, ao longo de sua área dedistribuição, é um dos fatores quepodem contribuir para o sucesso deprogramas de controle biológico(Hoelmer & Kirk, 2005). O fluxogênico é um componente importan-te para as estratégias de manejo daevolução da resistência e seus efei-tos podem ter reflexos em pequenae grande escala.

Em pequena escala (populaçõeslocais) espera-se que ele contribuapara diluição da resistência levandoao cruzamento entre insetos resis-tentes e não resistentes. Sua intensi-dade tem efeitos na taxa de aumen-to da freqüência dos genes para re-sistência. A capacidade de dispersãode um inseto praga é relevante paradefinição do tamanho e distribuiçãodas áreas de refúgio, uma vez queestas são os locais para manutençãode indivíduos susceptíveis possibili-tando o fluxo de genes não-resisten-tes para grupos de indivíduos resis-tentes nas áreas de plantas-Bt (Va-cher et al., 2006).

Em grande escala, o fluxo gêni-co pode determinar a possibilidadedos genes para resistência se espa-lharem ao longo da área de distri-buição geográfica da espécie. Essefenômeno influencia a velocidadeem que uma adaptação que surgenuma população local pode se es-palhar.

Os possíveis impactos do fluxogênico na evolução da resistênciatorna fundamental dispor de estudosprecisos sobre a estrutura genéticadas populações de insetos-praga vi-sando estimar seu impacto em po-pulações locais e também em lon-gas distâncias. Especialmente nocaso de pragas com ampla área dedistribuição que atacam culturas di-ferentes.

Estudos de estrutura genética têmpotencial para responder questõesrelevantes para o manejo destas es-pécies, como por exemplo: os inse-tos que atacam plantas diferentes for-mam linhagens distintas? Qual o graude diferenciação genética entre aslinhagens? Quando as linhagensocorrem na mesma área, os cruza-mentos são aleatórios ou não? Quala capacidade de dispersão a longasdistâncias? A reprodução ocorre an-

tes ou depois da dispersão dos insetos?

1.4 Efeito de seleção eevolução da resistência

A seleção natural pode ser definidacomo diferenças na taxa de reprodu-ção e/ou sobrevivência entre indivídu-os com características distintas. De umamaneira mais simples, os indivíduoscom as melhores respostas aos proble-mas de sobrevivência e reproduçãodeixam mais genes para as próximasgerações. O efeito da seleção naturalsobre as populações aumenta a freqüên-cia dos alelos com resposta “positiva”,gerando uma mudança adaptativa. Deacordo com a hipótese da rainha ver-melha (Van Valen, 1973) é preciso evo-luir (adaptar-se) continuamente paranão ser “superado” pelos seus compe-tidores.

A capacidade de evoluir é uma ca-racterística dos organismos vivos, mes-mo que no processo ocorram extinçõesde muitas linhagens, mas a “vida” noplaneta Terra tem mantido sua capaci-dade de encontrar novos caminhos,reinventando a si mesma de diferentesmaneiras.

Nossa relação com os insetos-pragaé apenas parte do processo e, por mai-or que seja nosso empenho, não con-seguimos superá-las; até hoje apenasnos esforçamos para reduzir seu impac-to sobre nossa existência. Essa relaçãoiniciou quando inventamos a agricultu-ra e desde então estamos envolvidosnuma corrida ao armamento. Nossasarmas envolvem os diferentes métodosde controle, com destaque para a apli-cação em massa de produtos químicossintéticos após a segunda guerra mun-dial e, mais recentemente, o desenvol-vimento das plantas-Bt.

A crescente utilização de B. thurin-giensis como biopesticidas e a amplia-ção das áreas de plantio com plantas-Bt certamente aumentam a pressão deseleção desse agente sobre as popula-ções alvo.

O primeiro formulado comercial deB. thuringiensis surgiu na França, em1938 e sua introdução nos Estados Uni-dos ocorreu em 1950. Desde então essabactéria vem sendo utilizada amplamen-te para controle de pragas (Sayyed eWright, 2002). Em 1996, foram comer-cializados e plantados algodão-Bt emilho-Bt em milhares de hectares nosEstados Unidos (Gould, 1998). A partirde então, foram produzidas outras plan-


tas com genes B. thuringiensis, e a áreaplantada foi ampliada, estendendo-separa outros continentes. Em 2002 fo-ram plantados, no mundo, 14 milhõesde hectares apenas de algodão-Bt e mi-lho-Bt (James, 2002; Bourguet et al.,2005).

A expressão das toxinas de B. thu-ringiensis nas plantas transgênicas éconsiderada um dos maiores avançosno uso de biopesticidas. Segundo Ja-mes (2007), as lavouras de plantas-Btaumentaram anualmente, atingindo114,3 milhões de hectares no mundo,em 2007.

As informações disponíveis indicamclaramente que as condições para evo-lução da resistência contra as toxinasde B. thuringiensis existem, ou seja, aspopulações apresentam genes para re-sistência (mesmo que em freqüênciabaixa) e a pressão de seleção aumentaanualmente.

Cientes desta situação os profissio-nais da área de manejo e controle depragas colocaram em prática o que cha-mamos de manejo da resistência, istoé, um conjunto de procedimentos quetem por objetivo retardar ao máximo osurgimento de populações resistentesem campo.

1.5 Manejo da Evoluçãoda Resistência

Uma população se torna resistentequando a maioria dos insetos susceptí-veis ao método de controle utilizado foiremovida. A maior taxa de cruzamen-tos entre insetos portadores do genepara resistência tornará o controle maisdifícil a cada geração.

No intuito de eliminar ou retardar oaumento na freqüência dos genes pararesistência às toxinas de B. thuringien-sis em populações de insetos-alvo, fo-ram desenvolvidas várias estratégias demanejo da evolução da resistência. Afinalidade destas estratégias é reduzir apressão de seleção, diminuindo a velo-cidade de crescimento da população deinsetos resistentes.

A estratégia mais utilizada no ma-nejo da resistência é denominada dealtas doses/refúgio estruturado e fun-damenta-se em modelos teóricos e tes-tes experimentais realizados em peque-na escala (Georghiou & Taylor, 1977;1999; Gould, 1998; Peck et al., 1999;Caprio, 2001, Onstad et al., 2002; Liu &Tabashnik, 1997; Shelton et al., 2000;Wenes et al., 2006).

As premissas dessa estratégia são:(i) o gene para resistência ocorre em

freqüência baixa nas populações;(ii) as quantidades de toxinas de B.

thuringiensis produzidas pelas plantassão altas o suficiente para eliminaçãoda população os insetos homozigotosnão resistentes e os heterozigotos re-sistentes;

(iii) os indivíduos resistentes (homo-zigotos) que nascem nas áreas complantas-Bt cruzam aleatoriamente comos indivíduos não resistentes que nas-cem nas áreas dos refúgios.

No manejo da resistência, o refúgioé a área na qual não são cultivadas plan-tas-Bt e sua finalidade é manter na po-pulação indivíduos susceptíveis às to-xinas de B. thuringiensis, ou seja, aque-les que não possuem genes para a re-sistência. Sua contribuição é a produ-ção de insetos adultos susceptíveis àstoxinas de B. thuringiensis para cruza-rem com insetos homozigotos resisten-tes, “diluindo”, dessa forma, a resistên-cia na população. A dispersão para foradas áreas dos refúgios é necessária paraque os cruzamentos aconteçam.

As dimensões e a distribuição dasáreas de refúgio são definidas com baseem estudos teóricos e experimentos decampo podendo variar de acordo coma cultura ou praga em questão. A áreados refúgios para milho-Bt varia entre20 e 50%; simulações de computadorindicam que áreas menores podem ace-lerar a evolução da resistência. Para al-godão-Bt, por outro lado, recomenda-se que 5 a 20% da área de plantio sejadestinada ao refúgio (Technology UseGuide, 2007-2008).

São fatores relevantes na definiçãoda área de refúgio: a capacidade de dis-persão da praga, sua biologia reprodu-tiva e seus hábitos alimentares. A distri-buição dos refúgios também procurareduzir a possibilidade de cruzamentosentre indivíduos homozigotos para ogene da resistência (Peck et al., 1999;Caprio, 2001; Ives & Andow, 2002; Va-cher et al., 2006; Tyutyunov et al., 2007;2008; Hanur, 2008).

A expressão “doses altas” significaque as plantas vão produzir quantida-des das toxinas de B. thuringiensis su-ficientes para eliminar da população osindivíduos que possuem uma única có-pia do gene para resistência, ou seja,os heterozigotos. Por definição, “dosealta”, é aquela suficiente para matar maisdo que 95% dos insetos heterozigotos(Georghious & Taylor, 1977; Roush,

1994; Gould, 1998).Essa estratégia torna a resistên-

cia uma característica funcionalmen-te recessiva, uma vez que apenas osportadores de duas cópias do genesobrevivem às doses de toxina pro-duzida pelas plantas-Bt (Tabashnik& Croft, 1982). Nas áreas com plan-tas-Bt sobreviverão apenas os rarosportadores de duas cópias do genepara resistência, ou seja, os homo-zigotos recessivos. Os cruzamentosaleatórios entre os raros indivíduosresistentes nas áreas com plantas-Bt e os indivíduos não resistentesdos refúgios, produziria indivíduossusceptíveis que seriam eliminadosquando se alimentassem de plantas-Bt (Gould, 1998; Vacher et al., 2006).

Na teoria, a estratégia “altas do-ses/refúgios estruturados” funcionamuito bem, ou seja, dentro das pre-missas ela realmente reduz a veloci-dade de aumento na freqüência dogene para a resistência nas popula-ções aumentando, com isso, o tem-po de uso das plantas-Bt. O mundoreal, porém, tem diversas maneirasde se desviar das aceitações do mo-delo.

Estudos sobre o padrão de he-rança da resistência indicam queoutros mecanismos genéticos podemocorrer, como por exemplo, domi-nância e herança poligênica (Heckelet al., 2007). Além disso, os cruza-mentos podem não ocorrer aleato-riamente; para isso, basta que exis-tam diferenças na velocidade de de-senvolvimento entre indivíduos re-sistentes e susceptíveis. A assincro-nia no desenvolvimento pode de-terminar uma freqüência maior decruzamentos entre indivíduos resis-tentes, o que pode acelerar a evolu-ção da resistência (LIU et al., 2000;Medvinsky et al., 2007).

1.6 Considerações

A espécie humana, não tem mui-tas respostas para explicar como avida surgiu no planeta Terra, masao longo do tempo fez muitas des-cobertas sobre as forças envolvidasno processo de evolução da biodi-versidade e nas mudanças adaptati-vas nas diferentes linhagens de or-ganismos.

A evolução é um processo com-plexo, influenciado pela mutação,seleção natural, fluxo gênico, deri-


va genética e sistema de cruzamen-tos. As interações entre estes fatoressão complexas e de difícil compre-ensão. A construção de modelos parasimular o efeito destes fatores permi-te analisar parcialmente estas intera-ções. Atualmente em muitos casostemos respostas relativamente preci-sas de como as coisas aconteceram,por exemplo, sobre a evolução da re-sistência aos inseticidas e/ou antibió-ticos.

Podemos fazer muitas previsões,porém estas estão envolvidas nummundo de incertezas, determinadaspela presença do acaso ou das inte-rações que nossos modelos não po-dem estimar, pois são uma simplifi-cação do mundo real.

Muitos pesquisadores acreditamque o surgimento de linhagens resis-tentes a agentes de controle químicoe/ou biológico em populações natu-rais não é uma questão de “se” vaiacontecer, mas sim, “quando” iráocorrer. Estas preocupações são váli-das também para as plantas-Bt (Wri-ght et al., 1997; Gould, 1998; Tabash-nik & Carriére, 2004, Tabashnik et al.,2004 e 2008; Bourguet et al., 2005).

Quando analisamos um fenôme-no biológico do ponto de vista da te-oria da evolução, as unidades de tem-po devem ser pensadas em perspec-tivas diferentes; estas envolvem ge-rações que se sucedem ao longo dotempo. As unidades de tempo envol-vem períodos maiores do que aque-les que usamos para datar a históriada civilização, ou seja, 50 ou mesmo100 anos, podem ser pouco relevan-tes.

As constantes pesquisas por no-vas toxinas e/ou a produção de plan-tas com capacidade de expressar maisdo que uma toxina é um indicativode nossa consciência de que as plan-tas-Bt cultivadas atualmente podemser sucessos temporários.

No momento, nossa melhor alter-nativa é continuar aplicando as es-tratégias de manejo da evolução daresistência e aprimorar as pesquisaspor novos métodos para reduzir osimpactos das pragas sobre a produ-ção de alimentos.

Devemos ter em mente, porém,que essa relação evolutiva só poderáterminar com a extinção de um dosenvolvidos, mas dada à dinâmica doprocesso evolutivo, podemos afirmarque novas relações irão surgir.

1.7 Referências

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