BIOTECNOLOGIA_01

7/25/2019 BIOTECNOLOGIA_01

1/63

Programa de EducaoContinuada a Distncia

Curso deBiotecnologia

Aluno:

EAD - Educao a DistnciaParceria entre Portal Educao e Sites Associados


2/63

2Este material deve ser utilizado apenas como parmetro de estudo deste Programa. Os crditos deste contedo so dados aos seus respectivos autores

Curso deBiotecnologia

MDULO I

Ateno:O material deste mdulo est disponvel apenas como parmetro de estudos paraeste Programa de Educao Continuada. proibida qualquer forma de comercializao domesmo. Os crditos do contedo aqui contido so dados aos seus respectivos autoresdescritos nas Referncias Bibliogrficas.


3/63



4/63


Sumrio

Mdulo I

Histria da biotecnologia e reviso de gentica

1. Introduo

1.1. Definio e histria

2. Reviso de gentica

2.1. Estrutura do DNA

2.2. Replicao do DNA

2.3. Mecanismos de replicao do DNA2.4. Transcrio

2.4.1. Estrutura do RNA

2.4.2. RNA como molcula mensageira

2.5. Transcrio do DNA

2.5.1. Mecanismos envolvidos na transcrio gnica

2.5.1.1. Transcrio em procariotos

2.5.1.1.2. Iniciao da transcrio2.5.1.1.3. Elongao da transcrio

2.5.1.1.4. Terminao da transcrio

2.5.1.2. Transcrio em eucariotos

2.6. Traduo

2.6.1. Cdigo gentico

2.7. Sntese proteica

2.7.1. Ribossomos2.7.2. Iniciao da traduo em procariotos

2.7.3. Alongamento da sntese proteica em procariotos

2.7.4. Traduo em eucariotos

2.7.4.1. Iniciao da traduo em eucariotos

2.8. Processamento proteico

2.9. Regulao da transcrio

2.9.1. Regulao da transcrio em procariotos


5/63


2.9.1. Regulao em procariotos: o modelo do Operon Lac

2.9.2. Regulao gnica em eucariotos

2.9.2.1. Sequncias de dominncia CIS

2.9.2.2. Promotores e seus elementos proximais

2.9.2.3. Elementos CIS que agem a distncia

2.9.2.4. Mecanismos para ao a distncia dos intensificadores e dos silenciadores

2.9.2.5. Regulao dos fatores de transcrio

2.9.2.6. Estrutura das protenas reguladoras

Mdulo II3. Tecnologia do DNA recombinante

3.1. Isolamento de genes

3.1.1. Extrao de DNA

3.1.2. Enzimas de restrio

3.1.3. Ligao enzimtica

3.1.4. Diferena estrutural entre genes eucariotos e procariotos

3.1.5. Obteno do inserto

3.1.5.1. Construo de bibliotecas genmicas e de bibliotecas de CDNA

3.1.5.2. Produo sinttica de genes

3.1.5.3. Reao em cadeia pela polimerase - PCR

3.1.5.3.1. Adaptadores

3.2. Vetores de clonagem

3.2.1. Plasmdeos

3.2.2. Bacterifagos

3.2.3. Cosmdeos

3.2.4. BAC e YAC

3.2.5. Vetores de expresso

3.3. Transformao da clula hospedeira

3.4. Amplificao do DNA recombinante

3.5. Seleo de clones transformados com o DNA hbrido

3.5.1. Seleo por hibridizao de DNA

3.5.2. Busca por atividade imunolgica


6/63


3.5.3. Busca por atividade proteica

3.6. Confirmao do inserto

Mdulo III

Expresso gnica em organismos procariotos e eucariotos

4. Introduo

4.1. Vetores de expresso

4.2. Sequncias promotoras

4.2.1. Isolamento de sequncias promotoras

4.2.1.1. Seleo de sequncias promotoras pelo plasmdeo PBR3164.2.1.2. Seleo de promotores pelo plasmdeo PKO1

4.2.2. Promotores induzveis

4.3. Integrao do DNA no cromossomo da clula hospedeira

4.4. Eficincia de traduo

4.5. Estabilidade de protenas

4.5.1. Espcie hospedeira

4.5.2. Aumento da estabilidade proteica pela modificao da sua estrutura4.6. Protenas de fuso

4.7. Aumento da secreo de protenas recombinantes

4.8. Expresso em sistemas eucariotos

4.8.1. Sistemas de expresso eucariotos

4.8.1.1. Expresso em saccharomyces cerevisiae

4.8.1.1.2. Vetores de expresso de s. Cerevisiae

4.8.1.1.3. Expresso direta em s. Cerevisiae4.8.1.1.4. Secreo de protenas heterlogas por s. Cerevisiae

4.8.1.2. Pichia pastoris

4.8.1.3. Fungos filamentosos

4.8.1.4. Baculovrus

4.8.1.4.1. Problemas derivados da expresso em Baculovrus

4.8.1.5. Sistemas de expresso em clulas de mamferos


7/63


Mdulo IV

Aplicaes da biotecnologia

5. Introduo

5.1. Projetos genoma

5.2. Terapia gnica

5.3. Novas vacinas

5.4. Novos produtos

5.5. Novos kits de diagnstico

5.6. Seleo assistida com testes de DNA e clonagem

5.7. Animais transgnicos5.7.1. Animais resistentes a doenas

5.7.2. Animais transgnicos como biorreatores

5.7.3. Animais transgnicos e as caractersticas de interesse econmico

5.7.4. Animais transgnicos na pesquisa biomdica e de xenotransplante

5.8. Alimentos geneticamente modificados

5.9. Biorremediao

Mdulo V

Introduo bioinformtica

6. Introduo

6.1. Banco de dados

6.1.1. Bancos de dados pblicos

6.2. Alinhamento de sequncias

6.3. A bioinformtica e os projetos genoma e transcriptoma

6.4. Base calling

6.5. Mascaramento de vetores

6.6. Agrupamento de sequncias

6.7. Anotao gnica

6.7.1. Blast

6.8. A bioinformtica e a anlise da estrutura proteica

6.8.1. Anlise da estrutura primria de protenas

6.8.2. Anlise da estrutura secundria


8/63


6.8.3. Modelagem molecular

6.9. Mapeamento de epitopos

6.10. Mtodos em filogenia molecular

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS


9/63


MDULO I

Histria da biotecnologia e reviso de gentica

1. Introduo

1.1 Definio e histria

O termo biotecnologia pode ser definido como a aplicao de princpios

cientficos e tecnolgicos no processamento de materiais por agentes biolgicosvisando produo de servios e mercadorias. Dentro desta viso ampla, a

biotecnologia tradicional uma tecnologia utilizada desde os primeiros profissionais

que empregaram micro-organismos em processos fermentativos para a gerao de

iogurtes e cervejas, por exemplo.

No incio da dcada de 70, a biotecnologia tradicional era uma disciplina

confinada a departamentos de engenharia qumica e a programas de microbiologia.

Em 1971, o termo biotecnologia foi criado pelo engenheiro hngaro Karl Ereky.Este pesquisador utilizou o termo para descrever seu experimento que visava

produo em larga escala de sunos alimentados com beterrabas cultivadas com

micro-organismos. Karl ento definiu biotecnologia como todas as linhas de pesquisa

que envolvem a gerao de produtos a partir de matrias-primas que receberam a

adio de materiais vivos. Contudo, esta terminologia permaneceu bastante

ambgua entre os cientistas e somente em 1961 o termo foi ento associado com o

estudo da produo industrial de bens e servios por procedimentos que utilizamorganismos, sistemas ou processos biolgicos. Isto se deve ao microbiologista

sueco Carl Gren Hedn, que sugeriu a mudana de ttulo de um jornal de

publicao cientfica na rea de microbiologia aplicada e fermentao industrial,

intitulado de Jornal de Microbiologia e Engenharia Bioqumica e Tecnologia para

Biotecnologia e Bioengenharia.

A biotecnologia tradicional foca trs aspectos principais: (I) preparao da

matria-prima a ser utilizada como fonte para os micro-organismos; (II) o processo


10/63


de fermentao do material em biorreatores, obtendo-se a biotransformao e

produo do material desejado; e (III) a purificao do produto final. A obteno de

um determinado produto em escalas industriais o objetivo principal da

biotecnologia. Ento, muitas pesquisas foram realizadas visando melhorar e

aperfeioar os trs aspectos envolvidos no desenvolvimento da tecnologia. Com esta

finalidade foram realizados vrios investimentos em desenhos de novos biorreatores

e no controle e monitoramento dos processos fermentativos. Apesar de ter-se obtido

um aumento de produo significativo, a otimizao do processo de

biotransformao ainda permanecia aqum do desejado.

As linhagens de micro-organismos capazes de sintetizar os produtos deinteresse o faziam em nveis subtimos para uma escala industrial. Mutaes

aleatrias induzidas por mutgenos qumicos e radiao ultravioleta algumas vezes

eram capazes de aumentar os nveis de produo. Contudo, esse alcance

frequentemente limitado. Normalmente a induo de mutaes afeta no s a

caracterstica desejada, como outras importantes para o metabolismo celular. Por

exemplo, mesmo que o micro-organismo produza em maiores quantidades o produto

desejado, a mutao pode afetar uma funo biolgica fundamental, resultando emum crescimento bacteriano mais lento.

Alm deste efeito indesejado, o processo de gerar linhagens demorado e

h a necessidade de selecionar e testar muitas descendentes at que se chegue

amostra esperada, aumentado os custos. Outra desvantagem que essa mutao

s capaz de aumentar a produo de um bem de interesse que o micro-organismo

j seja capaz de produzir. Assim, h a necessidade de pesquisas com diversos

outros micro-organismos para descobrir quais protenas eles expressam.A revoluo da biotecnologia tradicional veio com o desenvolvimento da

tecnologia do DNA recombinante, o que envolve um conhecimento multidisciplinar

(Fig. 1). Alm da sabedoria de microbiologistas e engenheiros qumicos, a nvel

industrial, a tecnologia do DNA recombinante programou as descobertas advindas

da biologia molecular e gentica. Esta unio passou ento a ser denominada

biotecnologia molecular.


11/63


BiotecnologiaBiotecnologia

MolecularMolecularBiologiaBiologia

CelularCelular

MicrobiologiaMicrobiologia GenGenticatica

BioquBioqumicamicaEngenhariaEngenharia

QuQumicamica

BiologiaBiologia

MolecularMolecular

BiotecnologiaBiotecnologia

MolecularMolecularBiologiaBiologia

CelularCelular

MicrobiologiaMicrobiologia GenGenticatica

BioquBioqumicamicaEngenhariaEngenharia

QuQumicamica

BiologiaBiologia

MolecularMolecular

Figura 1: Conhecimento multidisciplinar envolvido com a biotecnologia molecular.

O aprimoramento da biotecnologia tradicional em biotecnologia molecular se

deveu a avanos em conhecimentos de diversas reas, como a engenharia qumica,a bioqumica, a biologia molecular, a gentica, a microbiologia e a biologia celular. A

biotecnologia molecular abriu a perspectiva de mudanas rpidas. Atualmente, as

novas tcnicas permitem uma alta produo e a criao de novas fbricas biolgicas

em menor tempo, de forma mais eficiente e com menor custo. A expectativa de

resultados promissores, com a capacidade de sintetizar importantes produtos

comerciais, um campo fascinante.

Apesar de a biotecnologia molecular ser uma cincia multidisciplinar, agentica uma disciplina fundamental e que merece um grande destaque entre as

outras. Ela to importante para o desenvolvimento da biotecnologia que alguns

autores de livros mais recentes chegam at mesmo definir biotecnologia como tudo

da gentica que se aplica comercialmente. Por isso, este curso ser iniciado com

uma reviso bsica de gentica.


12/63


2. Reviso de gentica

2.1 Estrutura do DNA

Muitas descobertas na rea de gentica foram sendo feitas e acumuladas

para responder a uma pergunta inicial: como ocorria a transmisso da informao

gentica entre as geraes e como esta era armazenada. Para a biotecnologia, a

mesma pergunta pode ser feita de outra forma: como o conhecimento da informao

gentica pode ser aplicado para a gerao de bens comerciais. Nos anos de 1950

as dados a respeito deste assunto eram:1. Os genes so os fatores hereditrios associados a caractersticas

fenotpicas; contudo, sua natureza fsica no era conhecida;

2. A teoria de que um gene corresponde a uma enzima sugeria que eles

codificavam a informao necessria para a sntese proteica;

3. Sabia-se que os genes faziam parte dos cromossomos;

4. Os cromossomos eram constitudos por DNA e protenas;

5. Em 1958, experimentos com a bactria Streptococcus pneumoniaefeitos por Frederick Griffth e Oswald Avery, demonstraram que expressava um

fentipo diferente da linhagem selvagem aps capturarem DNA derivado de outra

amostra. Estes pesquisadores ento apontaram que o DNA era o material gentico.

Em 1953, James Watson e Francis Crick postularam o modelo da estrutura

do DNA. Embora no se conhecesse ao certo como era esta estrutura, os elementos

bsicos constituintes da molcula de DNA eram conhecidos. Estudos de DNA

purificado e parcialmente fragmentado mostraram que esta molcula composta porquatro estruturas bsicas, os nucleotdeos. Estas quatro subunidades so idnticas

em estrutura, diferindo apenas em sua composio de bases. Cada nucleotdeo

contm um grupo fosfato, um acar (a desoxirribose) e uma base nitrogenada.

Estas podem ser de quatro tipos diferentes: adenina (A), guanina (G),

citosina (C) e timina (T) (Fig. 2). Adenina e guanina so similares em sua estrutura e

so conhecidas como as bases purnicas. O mesmo ocorre com as bases citosina e


13/63


timina, que so as pirimidinas. Na ausncia do grupo fosfato, o acar associado

base nitrogenada denominado nucleosdeo.

Figura 2: Estrutura qumica das quatro bases nitrogenadas.

Os nomes completos dos nucleotdeos so: desoxiadenosina 5 monofosfato(desoxiadenilato, dAMP), desoxiguanosina 5 monofosfato (dGMP), desoxitimidina 5

monofosfato (dTMP) e desoxicitidina 5' monofosfato (dCMP). Contudo, por

convenincias as bases so denominadas simplesmente pelas abreviaes A, G, T

e C, respectivamente. Aps a descoberta de que o DNA desempenha um papel

central na hereditariedade, cientistas ento passaram a pesquisar e a propor

modelos sobre a estrutura desta molcula. No decorrer de sua histria, dois

Deoxiadenilato (dAMP) Deoxiguanilato (dGMP)

Deoxitimidilato (dTMP) Deoxicitidilato (dCMP)

Deoxiadenilato(dAMP) Deoxiguanilato (dGMP)


Deoxiadenilato(dAMP) Deoxiguanilato (dGMP)



14/63


experimentos so reconhecidos como cruciais para o estabelecimento da estrutura

aceita atualmente.

Rosalina Franklin e Maurice Wilkins realizaram uma difrao de raios-X da

estrutura do DNA. Os resultados destes experimentos sugeriram que o DNA uma

molcula longa e fina composta por duas fitas similares que correm ao longo da

molcula de maneira paralela outra. Os dados ainda demonstraram que a

molcula helicoidal. Outro experimento trouxe dados complementares aos obtidos

por Franklin e Wilkins. Aps anos de pesquisa com DNA de diferentes micro-

organismos, Erwin Chargaff juntou suas informaes e fez hipteses a respeito da

quantidade em que os componentes do DNA esto presentes na estrutura:I. A quantidade total de nucleotdeos compostos por pirimidinas (T + C)

sempre equivale aos daqueles compostos por purinas (A + G);

II. A quantidade de T sempre equivale quantidade de A, sendo que o

mesmo se faz verdadeiro para a proporo entre C e G. Por outro lado, a quantidade

de A + T no necessariamente igual de G + C. Esta variao caracterstica de

cada micro-organismos que esteja sendo utilizado como modelo experimental.

Em 1953, Watson e Crick analisaram estes dois experimentos prvios ejuntaram as informaes por eles geradas. Ento, estes pesquisadores propuseram

o modelo da dupla hlice de DNA (Fig. 3). Neste, cada fita que a compe formada

por uma cadeia de nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister. A figura tambm

demonstra que o empilhamento dos pares de bases na dupla hlice resulta na

formao de dois sulcos na sequncia ose-fosfato: o sulco maior e o sulco menor.


15/63


Figura 3: Modelo da dupla hlice do DNA.

A figura um modelo simplificado da estrutura helicoidal do DNA, mostrando

o sulco maior e o sulco menor. A cuidadosa anlise entre as propores de bases na

molcula de DNA feita por Chargaff foi a base da hiptese gerada por Watson e

Crick para explicar como as duas fitas que correm paralelamente uma a outra so

mantidas juntas. Esta unio se d por meio de pontes de hidrognio entre pares de

bases. Uma regra foi estabelecida para que estas interaes ocorram: cada par de

bases composto por uma purina e por uma pirimidina. Ainda considerando o

experimento de Chargaff, foi proposto que o pareamento se dava de G com C e de A

com T. Estas ligaes entre as pontes de hidrognio esto representadas na Fig. 4.

A Fig. 4 ainda demonstra que as fitas que compem a dupla hlice correm

em direes opostas: uma se inicia no grupo fostato (5) e termina no grupo OH (3).

Sulco maior

Sulco menor

Sulco maior

Sulco menor


16/63


A outra fita, por sua vez, corre no sentido inverso, de 3 para 5. Por esta

caracterstica afirma-se que o pareamento entre as fitas de DNA antiparalelo.

Figura 4: Dupla hlice do DNA em forma plana.

Cada fita formada pela unio de nucleotdeos, sendo que a dupla hlice

constituda pela unio entre duas fitas de DNA que se orientam em sentidos

opostos: uma corre no sentido 3 - 5 e a outra, de 5 - 3. Para o pareamento de

bases, cada par contm uma base purnica (adenina A ou guanina G), e uma

base pirimidnica (timina T ou citosina C) ligadas por ponte de hidrognio. As

setas amplificam e demonstram com mais detalhes como ocorre o pareamento entre

as bases. Basicamente, adenina e timina se pareiam pela formao de duas pontes

de hidrognio; j a citosina e guanina se ligam por trs pontes de hidrognio. As

pontes de hidrognio esto representadas por trs barras em azul. (Figura

modificada de Griffiths et al., 2002).

As relaes entre as bases durante o pareamento demonstraram que T se

pareia somente com A e C somente com G. Outros tipos de pareamento no

ocorrem naturalmente no DNA. Para explicar este achado, Watson e Crick

Adenina

Guanina

Citosina

Timina

Adenina

Guanina

Citosina

Timina


17/63


demonstraram que este pareamento restrito permite a formao mais eficiente de

pontes de hidrognio entre as bases, o que implica na relao tima para a

manuteno da estabilidade da molcula de DNA. Alm disso, G e C so unidas por

trs pontes de hidrognio, enquanto a relao entre A e T envolve a formao de

somente duas pontes. Assim, genomas que apresentem um alto contedo de GC em

sua constituio so mais estveis que aqueles onde h maior proporo de AT.

Estas observaes tm implicaes diretas em muitas tcnicas utilizadas

rotineiramente em procedimentos biotecnolgicos.

A descoberta da estrutura do DNA causou grande impacto na gentica e em

outras reas da biologia. Isto se deve a duas razes principais. Primeiramente, aprpria relao entre os componentes na estrutura sugere como o material gentico

duplicado ou replicado. Com a restrio imposta pelo pareamento especfico de

bases, provavelmente a fita molde expe suas bases que determinam qual

nucleotdeo deve ser incorporado nova molcula filha. Em segundo lugar, como a

informao gentica est contida no DNA, a sequncia de nucleotdeos ento

poderia ditar de alguma forma a sequncia de aminocidos que formariam uma

protena especfica. Assim, um tipo de cdigo gentico estaria representado nasequncia nucleotdica do DNA, que seria ento traduzida para uma diferente

linguagem que compe as protenas, os aminocidos.

2.2 Replicao do DNA

A transmisso precisa da informao gentica um processo essencial para

a manuteno da vida e de sua integridade. Portanto, h a necessidade de que umprocedimento extremamente especfico tenha sido desenvolvido durante a evoluo.

Para desvend-lo, inicialmente foram propostos modelos da replicao do DNA

baseados na complementaridade de bases. A fidelidade entre o pareamento

especfico de bases permitiria ento que a fita molde fizesse uma rplica antiparalela

(Fig. 5).


18/63


Figura 5: O modelo da replicao do DNA proposto por Watson e Crick

As fitas parentais so desnaturadas, permitindo que as bases dos

nucleotdeos sejam expostas. A formao das fitas filhas se deve especificidade de

bases impostas pelas fitas parentais. Ao final do processo so geradas duas fitas

filhas de sequncias complementares das fitas parentais utilizadas como molde. O

modelo de replicao do DNA proposto por Watson e Crick baseado na

especificidade de bases no explica, contudo, de que maneira a molcula de DNA

parental pode ser relacionada s molculas filhas. H trs possibilidades distintas:

semiconservativa, conservativa e dispersiva.

Na replicao semiconservativa, cada dplex formado por uma fita

parental e por outra fita filha recm sintetizada. Na conservativa, a replicao produz

Fita

parental

Fita

parental

Fita

filhaFita

parental

Fita

parental

Fita

filha


19/63


dois dplex: um formado por duas fitas molde e outro por duas fitas filhas. A terceira

hiptese, a replicao dispersiva, cada dplex formada por fragmentos de dupla

fita contendo apenas segmentos de DNA parental e, na mesma molcula, h

tambm fragmentos de dupla fita contendo apenas segmentos recm-sintetizados.

Para discriminar entre as hipteses sugeridas como modelo para a

replicao do DNA, Matthew Meselson e Franklin Stahl realizaram um elegante

experimento em 1958. Estes pesquisadores analisaram vrias geraes de culturas

bacterianas que tiveram como fonte de nitrognio duas molculas que apresentam

densidades diferentes, o N15 e o N14. Inicialmente, as culturas foram supridas

somente com N15, os quais foram incorporados s bases nitrogenadas que estavamsendo formadas durante a replicao do DNA.

Aps a diviso celular de algumas geraes, as mesmas clulas bacterianas

foram cultivadas em meio contendo somente o N14. O padro de replicao foi

diferenciado aps a separao do DNA em gradiente de cloreto de csio (Fig. 6). O

resultado obtido aps a centrifugao demonstrou a presena de uma banda

intermediria entre os dois nitrognios na primeira gerao com N14, e uma

intermediria e outra correspondente a somente o N14

. Este experimento confirmouque a replicao do DNA semiconservativa. Os mesmos resultados foram obtidos

em experimentos posteriores, validando ento o modelo.


20/63


Figura 6: Padro de bandas esperado aps a replicao semiconservativa, conservativa ou

dispersiva do DNA em cloreto de csio.

Dupla fita em vermelho representa fitas compostas somente por N15; as duas

fitas azuis seriam compostas por somente N14. Aps a primeira seta da esquerda

so representadas a primeira e a segunda gerao de clulas crescidas em meio

contendo somente N14. O padro de bandas da legenda se refere ao obtido aps a

centrifugao em cloreto de csio. (Figura modificada de Griffiths et al., 2002).

Diversos modelos experimentais foram propostos para explicar como a estrutura

do DNA. O modelo da dupla hlice explicou bem alguns processos envolvidos com a

Semiconservativa

Conservativa

Dispersiva

+

+

+

+

+

+

+

++

Uma banda

N15N14

Duas bandas

N15N15 e N14N14

Uma banda

N15N14

Uma banda intermediria

N15N14 e N14N14

Duas bandas

N15N14 e N14N14

Duas bandas

N15N15 e N14N14

Semiconservativa

Conservativa

Dispersiva

+

+

+

+

+

+

+

++

Uma banda

N15N14

Duas bandas

N15N15 e N14N14

Uma banda

N15N14

Uma banda intermediria

N15N14 e N14N14

Duas bandas

N15N14 e N14N14

Duas bandas

N15N15 e N14N14


21/63


estrutura do DNA e o mesmo ainda aceito atualmente. Aps se chegar a este

modelo, os cientistas ento passaram a outros processos envolvendo a molcula,

como a replicao.

2.3 Mecanismos de Replicao do DNA

No perodo de 1950, o cientista Arthur Kornberg identificou e purificou uma

das enzimas envolvidas na replicao do DNA, a DNA polimerase I. Esta enzima

tem trs atividades:

I. Atividade de polimerase, catalisando o crescimento da cadeia nadireo 5- 3;

II. Atividade exonuclesica 3- 5, removendo o pareamento de bases

incorretas;

III. Atividade exonuclesica 5 - 3, que degrada o DNA dupla fita.

Outras duas DNAP foram descobertas posteriormente. Postula-se que a

DNAP II esteja envolvida no reparo de DNA; contudo, ainda no h uma funo

especfica atribuda a esta enzima. A DNAP III atua na replicao do DNA,juntamente com a DNAP I. A DNAP III completa a replicao do DNA fita simples,

isto , se j existir um pequeno fragmento de DNA dupla fita. Este oligonucleotdeo

conhecido como primer.

O ponto especfico da sequncia de DNA no qual a replicao se inicia

denominado origem de replicao. Em Escherichia coli, h uma origem de

replicao. Uma vez iniciada, a replicao prossegue de forma bidirecional. Para que

se inicie o processo, h a ligao da protena DNA A e, em seguida, h adesnaturao do DNA.

Em eucariotos, a replicao mais complexa. Experimentos com molculas

de DNA marcadas demonstraram a existncia de inmeras regies de replicao

dentro de um nico brao cromossomal. Estima-se que haja cerca de 400 origens de

replicao distribudas entre os 17 cromossomos de levedura e 10.000 para

humanos. Alm disso, a replicao em eucariotos um processo altamente


22/63


coordenado dentro de um mesmo cromossomo e em todo o conjunto celular destas

estruturas.

Em presena de nucleotdeos trifosfatos, a DNAP polimeriza uma nova

molcula de DNA dupla fita. Contudo, este procedimento de extenso da fita

dependente da prvia existncia de um pequeno oligonucleotdeo de

aproximadamente 30 pb. Este primer pode ser sintetizado tanto por uma RNA

polimerase (RNAP) como pela enzima denominada primase. Portanto, somente aps

a sntese do primer complementar a uma determinada sequncia de DNA, haver a

extenso da cadeia pela DNAP.

A sntese de novas cadeias pela DNAP ocorre na direo 5- 3. Pelanatureza antiparalela da fita de DNA a enzima se move sobre a fita molde na direo

3 - 5. A sntese de uma nova fita, designada leading contnua. Por outro lado, a

desnaturao do DNA tambm expe outra fita molde que corre no sentido 5- 3, a

lagging. Ento, a forquilha de replicao ponto em que as duas fitas de DNA se

separam para permitir a replicao de cada fita tem de seguir no sentido contrrio

da outra fita para que a polimerizao seja de 5- 3.

Para que a replicao ocorra ao mesmo tempo nas duas fitas, apolimerizao na lagging realizada em pequenos segmentos descontnuos.

Inicialmente, um primer de RNA sintetizado de forma complementar ao DNA. Em

seguida, ocorre ento a polimerizao e elongao da fita de DNA pela DNAP. Estes

fragmentos de DNA foram identificados pela primeira vez por Reiji Okazaki e, por

isso, so denominados fragmentos de Okazaki. A atividade exonuclesica no

sentido 5- 3 da DNAP I remove os primers de RNA e preenche esta sequncia

com um segmento fita simples de DNA. Estes so ento selados pela enzima DNAligase, que catalisa a ligao do fosfato 5 a um grupo 3 OH adjacente. Esta ligao

ocorre assim que a forquilha expe a fita lagging e prossegue at que o fragmento

precedente seja alcanado.

Para que a replicao seja simultnea entre as duas fitas do DNA foi

proposto um modelo que est demonstrado na Fig. 7. A fita lagging sofre uma volta

sobre o complexo enzimtico responsvel pela replicao do DNA. Esta volta

permite que a DNAP III sintetize ambas as fitas filhas. Depois de percorridos


23/63


aproximadamente 1.000 pb, o fragmento dupla fita de DNA da fita lagging

liberado pela DNAP III, permitindo que uma nova volta seja formada sobre a

molcula de DNA.

Figura 7: Modelo proposto para a replicao do filamento descontnuo.

Este modelo possibilita que a holoenzima de DNAP III sintetize ambos os

filamentos filhos. A replicao do DNA envolve um complexo enzimtico. Alm da

DNAP e da primase, h outras enzimas envolvidas, como as helicases. Estas so

essenciais para o incio da replicao do DNA, pois so as responsveis por romper

as pontes de hidrognio que mantm as duas fitas de DNA unidas. Esta fita simples


24/63


estabilizada pela ligao da protena SSB, que se liga fita simples de DNA e,

com isso, retarda a formao do dplex.

Ambas as DNAP I e III possuem atividade exonuclesica 3 - 5, o que

permite verificar e editar bases inseridas erroneamente ou mal pareadas. Esta

atividade fundamental para a manuteno da fidelidade da informao gentica.

Mutantes deficientes nesta atividade apresentam maior taxa de mutao.

Muitos questionamentos foram feitos aps a descoberta da estrutura e de

outros processos que envolvem o DNA. Entre eles, o que realmente intrigava e

fascinava os pesquisadores era a descoberta de como a informao gentica

presente em sequncias de DNA so transmitidas at a sntese de protenas. Oprimeiro passo para atingir este objetivo foi entender o processo de transcrio.

2.4 Transcrio

Aps a descoberta do DNA, os pesquisadores ento queriam entender como

a informao gentica contida nesta sequncia de bases era traduzida em protenas.

A primeira especulao poderia ser que esta transferncia era realizada diretamentedo DNA em protenas. Contudo, a unio da gentica e da citologia permitiu elucidar

muitos fatos. A observao de que o material gentico em clulas eucariotas se

encontrava no ncleo e as protenas no citoplasma demonstravam a necessidade de

uma molcula intermediria. Posteriormente, o processo foi elucidado e o

intermedirio nesta transferncia de informaes o RNA.

2.4.1 Estrutura do RNA

A estrutura bsica do RNA bem semelhante a do DNA. Ambos so

formados por uma cadeia constituda pela unio de nucleotdeos por meio de

ligaes fosfodisteres. Apesar da semelhana, o RNA apresenta algumas

diferenas estruturais se comparado ao DNA:

I. A primeira diferena est na composio dos nucleotdeos. No DNA,

eles podem ser compostos por quatro bases distintas: adenina, citosina, guanina e


25/63


timina. No RNA, trs bases nitrogenadas so as mesmas daquelas encontradas no

DNA: adenina, citosina e guanina. Contudo, ao invs da timina, a base denominada

uracila compe um dos tipos de nucleotdeos de RNA. Apesar desta diferena, a

uracila forma pontes de hidrognio com a adenina, assim como o faz a timina.

II. A segunda diferena ainda est relacionada com o tipo de acar que

compe o nucleotdeo. O acar que compe o DNA a desoxirribose e no RNA a

ribose. A nica diferena entre estes acares a presena ou a ausncia de um

tomo de oxignio na posio do carbono 2, como demonstrado na Fig. 8;

Figura 8: Diferena estrutural entre ribose e desoxirribose.

III. Por fim, o RNA constitudo por uma fita simples e no por uma fita

dupla como o DNA. Consequentemente, o RNA no forma a estrutura de dupla

hlice observada no DNA. Pelo contrrio, a fita simples permite que haja diversas

combinaes no pareamento de bases. Assim, a estrutura tridimensional do RNA

pode formar diferentes complexos, que so apresentados sob variados aspectos.

Esta caracterstica importante sobre o ponto de vista tecnolgico, pois a fita

simples interfere negativamente com muitos processos de interesse biotecnolgico.

Um exemplo a dificuldade em produzir em larga escala protenas de interesse

farmacutico quando o RNA assume uma conformao inadequada.

O conhecimento da estrutura dos cidos nucleicos foi o primeiro passo para

as pesquisas subsequentes. Apesar do DNA e RNA apresentarem algumas

diferenas em sua estrutura, o que se observa a grande semelhana quanto a sua

constituio. A partir disso, foi sugerido pelos cientistas que o RNA pudesse ser

Ribose DeoxirriboseRibose Deoxirribose


26/63


ento a molcula intermediria na transferncia da informao gentica contida no

DNA em protenas. Ento, estudos foram dirigidos neste sentido para elucidar o

papel do RNA na expresso de protenas.

2.4.2 RNA como Molcula Mensageira

Para verificar se o RNA poderia funcionar como mensageiros elegantes

estudos genticos foram realizados. Inicialmente, precursores de RNA marcados

radioativamente foram capturados por clulas em cultura. A localizao deste

material a ser utilizado na sntese de molculas de RNA foi ento observada duranteum curto intervalo de tempo por autorradiografia. Aps receberem precursores

marcados, em um primeiro momento este material se encontrava no ncleo. Aps

certo tempo, o material tambm pde ser visualizado no citoplasma (Fig. 9).

Portanto, aparentemente o RNA sintetizado no ncleo e, em seguida, segue para o

citoplasma.

Figura 9: Sntese de RNA.

O uso de precursores de RNA pr-marcados demonstrou que o RNA

sintetizado no ncleo e, em seguida, segue para o citoplasma. O experimento inicial

com os precursores pr-marcados foi ainda reforado com estudos realizados por

Elliot Volkin e Lawrence Astrachan em 1957. O modelo experimental adotado por

estes pesquisadores partiu de estudos de infeco da bactria E. colicom o fago T2.

Este fago capaz de inserir seu material gentico no cromossomo desta bactria

Ncleo

citoplasma

Ncleo

citoplasma

Ncleo

citoplasma


27/63


(profago) e utilizar a maquinaria da clula infectada para a produo de suas

prprias protenas.

Os pesquisadores ento compararam a sequncia do RNA sintetizado aps

a infeco da E. coli com o DNA do fago inserido no genoma da bactria e

descreveram a grande similaridade entre os dois. Assim, foi possvel concluir que o

RNA sintetizado a partir do DNA e que, de alguma maneira, o mensageiro

utilizado na sntese proteica.

Vale ressaltar que os transcritos podem ter diferentes funes. Alguns RNA

tm funo estrutural. O RNA ribossmico (RNAr) um dos constituintes dos

ribossomos. O RNA transportador (RNAt) tem funo de molcula carreadora,transportando os aminocidos. O RNAm, por fim, a molcula intermediria que

serve como molde para a sntese proteica.

As semelhanas entre a estrutura do DNA e do RNA foram ento os pontos

que os pesquisadores tiveram como hiptese de que o RNA pudesse ser o

mensageiro para a sntese proteica. Aps obterem esta confirmao pelos

experimentos com precursores marcados, o passo seguinte entender o mecanismo

da cpia fiel do DNA em RNA.

2.5 Transcrio do DNA

O processo em que a sequncia de DNA copiada em um RNA mensageiro

(RNAm) denominado transcrio. Apesar de ter sido elucidado o papel que

desempenha na transferncia da informao, outra dvida a ser respondida foi:

como se d a cpia do DNA em um RNAm? Ao analisar a similaridade estruturalentre o RNA e o DNA e j se tendo conhecimento a respeito da replicao do DNA,

sugeriu-se ento que a transcrio se baseia tambm na complementaridade de

bases. Esta suposio foi posteriormente confirmada pela sntese in vitro de RNA

utilizando uma molcula de DNA como molde.

O experimento foi analisado a partir da correlao de bases entre o DNA e o

transcrito. Observou-se que a proporo de bases (A + U)/(C + G) do RNAm

transcrito similar proporo (A + T)/(C +G) referente ao DNA molde utilizado.


28/63


Portanto, a hiptese de que o RNA era sintetizado a partir do DNA por meio da

especificidade do pareamento de bases era um bom modelo experimental.

A complementaridade de bases entre DNA e RNA ainda pde ser

comprovada em estudos de hibridizao. Inicialmente, a dupla fita de DNA

desnaturada e uma regio complementar a uma determinada sequncia ento

estudada. Para isto, as molculas que se deseja estudar, no caso o RNA, so postas

em soluo s fitas de DNA. A molcula de RNA neste tipo de experimento

denominada sonda. Esta mistura ento submetida a condies que permitem a

renaturao das fitas hbridas.

Como o dplex de DNA tem densidade diferente daquele formado porDNA/RNA, estes hbridos podem ser separados por ultracentrifugao em cloreto de

csio. Aps a realizao deste experimento foi possvel observar a presena da

banda correspondente formao do hbrido DNA/RNA. Este resultado confirma

ento a complementaridade de bases entre DNA e RNA, pois a formao de hbridos

ocorre somente quando h uma grande regio com similaridade de bases.

O estudo de complementaridade de bases ainda permitiu elucidar outro

aspecto da transcrio: se o RNAm ou no transcrito a partir das duas fitas deDNA. As duas fitas constituintes do dplex de DNA apresentam diferentes

propores das bases purinas e pirimidinas. Considerando este fato, Mamur e

colaboradores, em estudos com o fago SP8 de Bacillus subtilis, foram capazes de

manter as duas fitas de DNA desnaturadas e ento verificar a quais fitas o RNAm se

hibridizava. Os cientistas verificaram que o transcrito se hibridizava a somente uma

das fitas. Devido a esta revelao, a transcrio dita assimtrica.

Os estudos iniciais sobre a transcrio esclareceram, portanto, que a sntesede RNA se d de maneira assimtrica e que a base para a sua realizao a

especificidade de pareamento de bases. O passo seguinte foram ento estudos que

permitiram desvendar como ocorre o mecanismo da transcrio de genes.

2.5.1 Mecanismos Envolvidos na Transcrio Gnica

2.5.1.1 Transcrio em Procariotos


29/63


Para a sntese da molcula de RNAm necessria a ao da enzima RNA

polimerase (RNAP). Na maioria dos procariotos, a RNAP transcreve todos os tipos

de RNA e constituda por cinco subunidades diferentes. Ela possui duas

subunidades alfa, duas subunidades beta diferentes ( e ) e um fator sigma.

Quando constituda por todas estas subunidades, a enzima denominada como

holoenzima; esta necessria para o reconhecimento do stio adequado onde a

transcrio deve iniciar. Entretanto, o fator sigma pode se dissociar do complexo

aps o incio da transcrio. O complexo sem o fator sigma ento denominado

cerne da enzima. Aps o reconhecimento da sequncia a ser transcrita e aps oincio do processo, o cerne capaz de finalizar a transcrio. Didaticamente, a

transcrio pode ser dividida em trs estgios distintos: incio, elongao e

terminao.

2.5.1.1.2 Iniciao da Transcrio

Para iniciar a transcrio de um gene, a holoenzima da RNAP percorre oDNA e deve reconhecer o ponto onde a transcrio deve iniciar. Esta sequncia

denominada promotor. Sequncias promotoras de alguns genes de Escherichia coli

foram isoladas e identificadas. Estudos comparativos entre elas permitiram o

alinhamento de bases similares. O que se notou foi que, apesar de haver certa

variao de bases entre as sequncias, algumas so conservadas, o que gerou

ento uma sequncia consenso.

Alm disso, observou-se que h duas sequncias consenso descontnuas:uma a -35 e outra a -10. Estes nmeros se referem ao posicionamento da regio em

relao ao primeiro nucleotdeo a ser transcrito (denominado +1) (Fig. 9).

Sequncias que se localizam antes do nucleotdeo +1 recebem numeraes

negativas e so ditas como estando jusante ou upstream do stio de incio da

transcrio. Sequncias que se localizam depois do nucleotdeo +1 recebem

numeraes positivas e se diz que as mesmas esto downstream do stio de incio.


30/63


Para finalizar, estudos demonstraram que a RNAP reconhece a sequncia

promotora e interage com ambas as sequncias - 35 e - 10.

Figura 10: Sequncia promotora.

(A) o promotor antecede o stio de incio da transcrio e a sequncia

codificadora. (B) o alinhamento de sequncias promotoras diferentes isoladas de E.

coli demonstra que o promotor formado por duas regies de sequncias similares,

-35 e -10. A partir disso, (C) foi criada uma sequncia consenso para estas duas

regies. (Figura modificada de Griffiths et al., 2002).


31/63


A associao do fator sigma ao cerne da RNAP est ligada ao

reconhecimento especfico de um promotor. Assim, ele est diretamente relacionado

com a regulao gnica, permitindo que somente determinados genes de interesse

sejam expressos em um momento especfico. Inicialmente, a holoenzima reconhece

as regies -35 e -10. Este complexo denominado complexo promotor fechado.

Aps esta ligao, ocorre a separao de bases na regio -10. Quando a RNAP

causa esta desnaturao, este complexo denominado complexo promotor aberto.

At a formao do ltimo complexo, ainda necessria a ligao do fator sigma.

Aps a formao do complexo aberto, se inicia ento a elongao da transcrio

(Fig. 10).

Figura 10: Incio da transcrio.

A holoenzima da RNAP procura um stio promotor. Ao reconhec-lo, liga-se

fortemente e forma o complexo fechado. A enzima desnatura o DNA, formando o

holoenzima

promotor

Polimerase liga-se regio promotora,formando o complexo fechado

Polimerase desnatura o DNA, formando

o complexo aberto

Inicia-se a transcrio e o fator sigmase dissocia

holoenzima

promotorholoenzima

promotor

Polimerase liga-se regio promotora,formando o complexo fechado

Polimerase desnatura o DNA, formando

o complexo aberto

Inicia-se a transcrio e o fator sigmase dissocia


32/63


complexo aberto. A transcrio finalmente se inicia e o fator sigma liberado.

(Figura modificada de Griffiths et al., 2002).

2.5.1.1.3 Elongao da Transcrio

A continuidade da polimerizao da cadeia de RNA no requer o fator

sigma. Assim, o fator sigma se dissocia da enzima no incio da elongao da

transcrio. A sntese do RNAm ocorre sempre na direo 5' - 3'; ou seja, os

nucleotdeos so sempre adicionados na posio 3' do primeiro nucleotdeo. Como o

pareamento de nucleotdeos se d de maneira antiparalela, isto significa que oRNAm sintetizado a partir da fita molde de DNA a qual est orientada de 3 - 5. O

substrato para esta reao so os nucleotdeos trifosfatos. A energia necessria

para o processo deriva do rompimento do grupo trifosfato de alta energia. A

continuao da elongao dependente da manuteno da abertura entre as fitas

de DNA.

2.5.1.1.4 Terminao da Transcrio

A terminao da transcrio ocorre aps o reconhecimento de sinais, o que

resulta na liberao do DNA nascente e da enzima. Em E.coli, so descritos

principalmente dois tipos de sinais: a formao do grampo ou a terminao

dependente do fator rho. O primeiro mecanismo envolve uma terminao direta,

onde a sequncia terminadora de mais ou menos 40pb termina em uma sequncia

rica em GC seguida de seis ou mais nucleotdeos compostos por adenina em seufinal. As sequncias GC so capazes de se complementarem e formar uma estrutura

denominada hairpin loop. As sequncias de A ao final acrescentam U ao RNAm, o

que representa uma ligao mais fraca. Isto facilita a liberao da RNAP do

complexo de transcrio (Fig. 11).


33/63


Figura 11: Estrutura em grampo para a finalizao da transcrio.

A estrutura forma-se devido ao pareamento de bases complementares

dentro da prpria fita de RNAm. O segundo mecanismo dependente de uma

protena adicional, o fator rho. Esta protena um hexmero de seis subunidades

idnticas que se liga a um stio especfico do RNA, denominado rut. Aps a ligao

ao seu stio especfico, a protena rho se transloca, ou seja, se move, sobre o

RNAm, retirando-o da RNAP (Fig. 12).

(A) a sntese da fita de RNA prossegue e o stio rho transcrito, o que

permite que (B) a protena rho o reconhea e se ligue a ele. (C) a ligao desta

protena separa o RNA da RNAP aps se translocar ao longo da molcula de RNAm.

Figura 12: Modelo da

terminao da transcrio

pela ao da protena R.

Ribossomo

DNA

RNA polimerase

RNA

Stio rut

R

A

B

C

Ribossomo

DNA

RNA polimerase

RNA

Stio rut

R

A

B

C

Pareamento

de bases

Ala em

grampo

Resduos de uracila

Pareamento

de bases

Ala em

grampo

Resduos de uracila


34/63


(Figura modificada de Griffiths et al., 2002). A eficincia de ambos os processos

envolvidos na terminao da transcrio influenciada por outros elementos, tais

como sequncias prximas ou fatores proteicos. Contudo, os dois processos so

eficientes e acabam permitindo a liberao do RNAm do complexo enzimtico e do

DNA molde.

2.5.1.2 Transcrio em Eucariotos

A transcrio em eucariotos um processo similar ao de procariotos.

Entretanto, h alguns aspectos peculiares aos eucariotos e que so significativospara processos biotecnolgicos. A primeira diferena nos processos se refere

constituio e funo da RNAP. Enquanto uma nica representante desta enzima

em procariotos responsvel pela sntese de todos os tipos de molculas de RNA,

h trs enzimas diferentes em eucariotos. As RNAP de eucariotos ainda apresentam

funes distintas, como:

I- RNA polimerase I: sintetiza o RNA ribossmico (RNAr);

II- RNA polimerase II, responsvel pela sntese do RNAm;III- RNA polimerase III, que sintetiza RNA transportador (RNAt) e outros

RNAs e suas molculas.

Em relao constituio da enzima, algumas das subunidades

constituintes da RNAP so similares em procariotos e eucariotos. Entretanto, a dos

ltimos possui outras subunidades diferentes e so consideradas como

macromolculas mais complexas. Outra caracterstica distinta entre eucariotos e

procariotos que interfere na transcrio se refere estrutura do RNAm. Estadiferena estrutural se deve organizao gnica distinta de procariotos e de

eucariotos.

Em procariotos, o RNAm frequentemente apresenta mais de uma sequncia

codificadora de protenas diferentes e so denominados RNA policistrnicos. Isto

decorre da organizao gnica nestes organismos, onde genes relacionados

mesma funo se encontram organizados em um operon. Assim, facilita-se que

todos os genes relacionados com a mesma via metablica sejam expressos


35/63


simultaneamente. O RNAm de eucariotos, por sua vez, apresenta a sequncia

codificadora de somente uma determinada protena e chamado de RNA

monocistrnico (Fig. 13).

Figura 13: (A) RNAm monocistrnico e (B) RNAm policistrnico.

O RNAm de eucariotos ainda sofre diversos tipos de processamento no

observados em procariotos. Logo aps o incio da transcrio, um resduo deguanosina metilado adicionado poro 5 do transcrito. Esta modificao

conhecida como cap (Fig. 14). Posteriormente, resduos de adenosina so ento

adicionados poro 3 do RNAm de eucariotos. Esta cauda poliA constituda de

150 a 200 resduos (Fig. 15). Estes processamentos esto relacionados com o

aumento da estabilidade do RNAm, afetando assim a vida til dos mesmos.

A) RNA monocistrnico

B) RNA policistrnico

A) RNA monocistrnico

B) RNA policistrnico


36/63


Figura 14: adio da 7metilguanosina poro 5 do RNAm.

Esta modificao do transcrito primrio do RNAm conhecida como cap.

(laguna.fmedic.unam.mx).

Figura 15: Acrscimo da cauda de poli A a poro 3do RNAm.

O RNAm de eucariotos tambm submetido a outro tipo de processamento.

Estruturalmente, o gene de eucariotos constitudo por duas sequncias contguas

distintas: os exons, que representam segmentos codificadores, e os introns, que so

exon intron exon intron Exon AUUAAA

exon intron exon intron Exon AUUAAA

Stio de reconhecimento

AAAAAAA

Cauda de poliA

AA

AA

Cap

5 3

exon intron exon intron Exon AUUAAAexon intron exon intron Exon AUUAAA

exon intron exon intron Exon AUUAAAexon intron exon intron Exon AUUAAA

Stio de reconhecimento

AAAAAAA

Cauda de poliA

AA

AA

Cap

5 3


37/63


sequncias no codificadoras. Inicialmente, o transcrito primrio possui tanto exons

como introns. Entretanto, posteriormente h um processamento em que os introns

so removidos. Este processo denominado de splicing e uma importante

descoberta da gentica molecular.

O splicing foi descoberto a partir de estudos com transcritos de DNA viral

de mamferos. Analisando a complementaridade de bases entre o material derivado

da integrao viral e de seus respectivos transcritos, observou-se que no havia

correspondncia fiel entre eles. Esta concluso se deve visualizao da estrutura

que se formou com a presena de alas no material gentico referente ao DNA.

Portanto, conclui-se que o transcrito final representava apenas determinadosseguimentos referentes ao material gentico do qual o RNAm se originou.

O mecanismo de splicing envolve duas reaes consecutivas de

transesterificaes. Estas reaes so catalisadas por um complexo

ribonucleoproteico, o qual constitudo por RNAs nucleares pequenos (snRNPs),

pelo transcrito primrio e pela associao de outros fatores proteicos. Este complexo

recebe a denominao de spliceossomo.

Uma caracterstica interessante do splicing que o mesmo RNAm podesofrer diferentes processamentos. Neste caso, ocorrem junes de exons diferentes

do mesmo RNAm ou mesmo entre exons derivados de diferentes RNAm. O

resultado final que os RNAm maduros so constitudos por sequncias diferentes,

o que consequentemente resultar na gerao de protenas distintas. Este processo

conhecido como splicing alternativo (Fig. 16). As diferentes protenas geradas por

este mecanismo so frequentemente utilizadas em diferentes tipos celulares, ou

mesmo em diferentes estgios de desenvolvimento.


38/63


Figura 16: Splicing alternativo.

Os exons so unidos de diferentes maneiras, o que proporciona a gerao

de protenas totalmente distintas. O processo de transcrio, onde o intermedirio

para a sntese proteica gerado, apenas um dos pontos de interesse

biotecnolgico: a expresso de protenas em larga escala. Portanto, o passo

seguinte gerao do RNAm o entender como ocorre a interpretao da

sequncia de nucleotdeos que compem o transcrito pela maquinaria celular, at a

sua biotransformao em um polipetdeo. Estudos posteriores vieram ento elucidarcomo ocorre este processo.

2.6 Traduo

O conhecimento de que os genes so sequncias de DNA e que o RNAm

a estrutura intermediria e mensageira da informao para a sntese proteica foi o

primeiro passo para a biotecnologia molecular. Para a sntese de protenas, surge

exon exon exon exon exon

exon exon exonexon

exon exon exon exon exon

exon exon exon exon exon exon

exon exon exon exon

exon exon exon

exon intron exon intron exon intron exon intron exon intron exon intr

5

Diferentes RNAm

exon exon exon exon exonexon exon exon exon exon

exon exon exonexonexon exon exonexon

exon exon exon exon exonexon exon exon exon exon

exon exon exon exon exon exonexon exon exon exon exon exon

exon exon exon exonexon exon exon exon

exon exon exonexon exon exon

exon intron exon intron exon intron exon intron exon intron exon intr

5

exon intron exon intron exon intron exon intron exon intron exon intr exon intron exon intron exon intron exon intron exon intron exon intr

5

Diferentes RNAm


39/63


ento uma primeira pergunta: se os genes so segmentos de DNA e se este

formado por uma sequncia de nucleotdeos compostos por somente quatro bases

distintas, como esta sequncia de bases determina a sequncia de uma protena?

Uma comparao simples para desvendar este dilema associar cada um dos

quatro nucleotdeos como se fossem letras do alfabeto. A combinao destas letras

formaria palavras; estas ento seriam os constituintes das protenas.

Para entender como se d a combinao das letras, o ponto de partida

conhecer a estrutura proteica. A estrutura primria de protena formada por

diferentes aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. Se o RNAm

constitudo por uma sequncia de nucleotdeos, as letras, os aminocidoscorresponderiam ento s palavras formadas por nucleotdeos. O conjunto de

palavras que os diferentes cdons especificam denominado cdigo gentico.

2.6.1 Cdigo Gentico

Outro dilema em relao traduo como as letras se combinam para

constituir as palavras. Portanto, se cada nucleotdeo representa um aminocido, aprotena seria composta por somente quatro aminocidos. Contudo, so conhecidos

20 aminocidos naturais. Por esta insuficincia, sups-se que um aminocido

representado no RNAm por uma combinao de nucleotdeos.

A combinao de nucleotdeos que representasse os aminocidos foi

teoricamente feita por anlises combinatrias. Assim, se o aminocido fosse

composto por duas das quatro bases que compem a sequncia do RNAm, seria

possvel ento 4

2

, o que daria um total de dezesseis aminocidos. Dezesseiscombinaes ainda seriam insuficientes para representar os 20 aminocidos

existentes. Se as letras fossem compostas de trs bases, ento as combinaes

possveis seriam 43, o que daria 64 aminocidos distintos. Esta combinao,

portanto, proveria mais que os 20 aminocidos naturais.

Assim, sups-se que um aminocido traduzido a partir de pelo menos trs

nucleotdeos. Esta trinca de nucleotdeos denominada cdon. Esta suposio foi

posteriormente confirmada em 1961 por Francis Crick e Sidney Brenner e


40/63


colaboradores em anlises de mutantes do fago T4. A partir da descoberta do

cdon, outras questes ainda intrigavam os pesquisadores. A combinao de trs

nucleotdeos que compe o cdon pode fornecer 64 combinaes diferentes;

contudo, h na natureza somente 20 aminocidos.

Se cada cdon representasse um aminocido distinto, ento haveria 44

combinaes extras que no teriam funo ou que simplesmente no codificariam

aminocidos? Esta suposio improvvel, pois mutaes de ponto, ou seja, que

alterem apenas um nico nucleotdeo, poderiam ento representar um dos cdons

que no codificariam aminocidos. Consequentemente, a sntese proteica seria

interrompida. Isto invivel sob o ponto de vista evolutivo, j que a interaoparasita-hospedeiro, por exemplo, demonstra que a natureza desenvolveu

mecanismos que permitissem a evoluo e a adaptao dos organismos frente s

diversas situaes.

Por outro lado, se todas as trincas codificam um aminocido, este pode ser

representado por mais de um cdon. Neste caso, mutaes de bases que compem

o cdon induziriam uma alterao de aminocidos, permitindo mesmo assim a

sntese proteica e possivelmente a gerao de variantes. Assim, Crick postulou queos aminocidos so codificados por um ou mais cdons diferentes. Esta hiptese foi

posteriormente confirmada por anlises bioqumicas e, por isso, o cdigo gentico

dito degenerado.

Estas descobertas iniciais a respeito do cdigo gentico geraram grande

entusiasmo no mundo cientfico. Com isso, muitas pesquisas foram realizadas com

o intuito de desvend-lo cada vez mais. Decifrar qual aminocido especificado por

cada cdon foi um dos feitos mais excitantes da gentica nos ltimos 50 anos. Istose deve descoberta inicial de como sintetizar um RNAm sinttico. Este fato

possibilitou a oportunidade de criar sequncias variadas de RNAm, o que permitiu

verificar quais aminocidos as diferentes combinaes especificavam.

O uso da matemtica nas anlises combinatrias permitiu deduzir a

frequncia de aminocidos obtidas a partir da sntese de RNAm realizadas com

misturas de diferentes propores fixas dos quatro nucleotdeos distintos. Em outras

palavras, se os cdons codificam diferentes aminocidos, espera-se que os


41/63


aminocidos gerados a partir desta mistura particular de nucleotdeos estejam a uma

taxa similar quela das possveis combinaes de cdons. Apesar da redundncia

do cdigo gentico, esta hiptese foi posteriormente comprovada em experimentos

subsequentes. Contudo, este experimento no permitia distinguir a sequncia

especfica de cada cdon em relao a um aminocido.

Para correlacionar a sequncia especfica do cdon relativo a um

determinado aminocido, foram utilizados mini RNAs sintticos. Inicialmente, foram

utilizadas sequncias especficas compostas por somente trs aminocidos. Assim,

por exemplo:

I. GUU: codifica valina;II. UUG codifica leucina;

III. UGU codifica cistena.

A produo destes mini RNAs possibilitou a sntese das 64 combinaes

possveis de cdons, o que demonstrou que certos aminocidos podem ser

codificados por uma nica trinca ou at mesmo por seis combinaes diferentes.

Portando, estes estudos comprovaram a degenerao do cdon.

O estudo com os mini RNAs ainda permitiu outra correlao entre as basesque compem o cdon e seu papel na degenerao do cdigo gentico. A terceira

base que compe o cdon a mais varivel; assim, mudanas nestas bases

frequentemente no alteram o aminocido codificado. Esta caracterstica

extremamente importante para a biotecnologia, pois previne mutaes espontneas

a que as culturas relacionadas com a produo de protenas de interesse esto

submetidas no alterem, necessariamente, as cadeias polipeptdicas.

As pesquisas com os mini RNAs, por fim, tambm demonstraram outroaspecto interessante do cdigo gentico. Apesar da sua redundncia, h alguns

cdons que no especificam nenhum aminocido e funcionam como pontos finais no

RNAm. Estas trincas so denominadas cdons de parada. A partir de experimentos

baseados na combinao de nucleotdeos em RNAs sintticos, foi possvel

estabelecer qual aminocido representado por cada trinca.

A Fig. 17 demonstra as possveis combinaes de trs nucleotdeos a partir

dos quatro existentes em RNA com os aminocidos que cada cdon codifica.


42/63


Figura 17: Cdigo gentico.

Os experimentos iniciais com o objetivo de desvendar o cdigo gentico

foram realizados em organismos procariotos; entretanto, estudos posteriores

demonstraram que ele universal. Isto quer dizer que o cdigo gentico comum a

todos os organismos, desde os vrus e bactrias at organismos eucariotos e

multicelulares, como os humanos.

Mesmo sendo o cdigo gentico considerado universal, esta generalidade

apresenta excees. No DNA mitocondrial, por exemplo, dois cdons so traduzidos

diferentemente na mitocndria. Enquanto AUA representa geralmente isoleucina, na

mitocndria ele lido como metionina. Alm desse, UGA que normalmente

especifica um cdon de parada, na mitocndria ele codifica o triptofano. A

explicao para esta diferena est nas propriedades dos RNAt que esto

confinados ao sistema mitocondrial. Outras excees foram tambm observadas

quanto a determinados cdons de levedura e de alguns representados por alguns

protozorios.


43/63


Outra caracterstica do cdigo gentico que a leitura dos cdons no

ocorre de maneira sobreposta. Isto tem importncia sob o ponto de vista evolutivo e

biotecnolgico. Mutaes de ponto podem ou no alterar um aminocido da

protena; contudo, esta variante pode ainda ser funcional. Se a leitura se desse de

maneira sobreposta, uma mutao alteraria no s um aminocido, como tambm

toda a protena. Neste caso, a chance de uma mutao gerar uma protena

especfica e ativa seria extremamente baixa.

O conhecimento mais aprimorado a respeito das caractersticas do cdigo

gentico permitiu deduzir como o seu funcionamento. O passo seguinte e

essencial para a sua utilizao na biotecnologia a sntese de protenas.

2.7 Sntese Proteica

A sntese de protenas a partir de um RNAm dependente da ao conjunta

de diversas estruturas, como: ribossomos, RNAts e uma grande diversidade de

fatores proteicos.

2.7.1 Ribossomos

Os ribossomos constituem um complexo importantssimo para a traduo.

Ele constitudo por muitas molculas de RNAr diferentes associadas a mais de 50

protenas. Para a formao do ribossomo, este complexo se organiza em duas

subunidades distintas, a subunidade maior e a menor. A diferena entre as duas

subunidades, alm do tamanho relativo, se refere aos componentes que formamcada estrutura. A subunidade menor contm uma nica molcula de RNAr. No caso

da subunidade maior, esta formada por outro tipo de RNAr de alto coeficiente de

sedimentao (S) associado com outros RNAr de menor S. S a medida da

taxa de sedimentao aps a centrifugao de partculas postas em soluo.

O tipo de RNAr que compe cada subunidade difere entre procariotos e

eucariotos. Em procariotos, a subunidade maior denominada 50S e a menor, 30S.

A subunidade maior composta pelo RNAr 23S e por um menor, 5S. A subunidade


44/63


menor contm em sua composio somente o RNAr 16S. Ao se associarem, formam

o ribossomo completo, tambm conhecido como 70S.

Em eucariotos, as subunidades 60S e 40S se associam e formam o

ribossomo 80S. A subunidade maior formada pelo RNAr 28S associado a dois

outros RNAr menores, o 5,8S e o 5S. A subunidade menor, assim como em

procariotos, constituda por um nico tipo de RNAr. O que difere que em

eucariotos o RNAr que constitui esta subunidade o 18S.

Os ribossomos de procariotos e eucariotos diferem no s pelo tamanho das

molculas de RNAr e do complexo em si. Outros aspectos tambm so diferentes,

como a quantidade de protena que compe cada subunidade. Contudo, apesardesta diferena estrutural, um fato intrigante a grande similaridade estrutural e

funcional entre os ribossomos de todas as espcies (Fig. 18).

Figura 18: Estrutura dos ribossomos.

Cada ribossomo contm stios especficos que permitem a ligao de todos

os fatores associados sntese proteica, como o RNAm, os RNAt e os fatores

proteicos. Alm disso, a subunidade maior do ribossomo possui dois

compartimentos, o stio A e o stio P. O stio A o local de acesso do RNAt contendo

o aminocido a ser inserido na cadeia proteica. O stio P ocupado pelo RNAt que


45/63


carrega a cadeia polipeptdica que est sendo formada. Assim que a polimerizao

da cadeia polipeptdica prossegue e h a translocao do ribossomo, ou seja, esta

estrutura se move sobre um cdon, o RNAt que se encontra no stio P liberado do

complexo. Isto permite a transferncia do RNAt do stio A ao P. Para fins didticos, a

sntese proteica dividida em trs passos distintos: iniciao, alongamento e

trmino.

2.7.2 Iniciao da Traduo em Procariotos

Em procariotos, o primeiro passo da iniciao ocorre com o reconhecimentodo cdon de incio, que em E. coli pode serrepresentado tanto por AUG como por

GUG e UUG. Dentre eles, o mais representativo o AUG, sendo que os outros dois

so denominados cdons alternativos. Observa-se que a escolha de um ou outro

cdon varia com o gene em questo; contudo, sequncias que contenham cdons

de incio diferentes possuem taxas de traduo diferenciadas.

Antes de iniciar a traduo, as subunidades ribossmicas encontram-se

separadas. Para iniciar a sntese, a subunidade menor 30S se liga primeiramente aoRNAm. Esta ligao estimulada pelo fator proteico de iniciao IF3 e IF1. O fator

IF1 se liga somente ao complexo inicial, sendo que a sua localizao impede a

ligao da subunidade maior.

Um detalhe interessante como esta subunidade reconhece o cdon de

incio correto. Apesar de a maioria dos genes terem como cdon de incio o AUG,

que codifica uma metionina, a sequncia do RNAm possui outros representantes

desta mesma trinca, inclusive em locais a jusante do cdon de incio. Ento, comose d esse reconhecimento do correto cdon?

A questo do reconhecimento do verdadeiro cdon de incio foi respondida

aps estudos realizados por John Shine e Lynn Dalgarno. Estes pesquisadores

notaram que o verdadeiro cdon de incio era precedido por uma sequncia de

aproximadamente oito nucleotdeos, sendo complementar poro 3 final do RNAr

16S da subunidade menor do ribossomo. Em uma homenagem a estes

pesquisadores, esta sequncia foi denominada de Shine-Dalgarno. Este passo


46/63


fundamental para a sntese correta de uma determinada protena. O reconhecimento

do cdon de incio permite que a traduo ocorra na fase de leitura correta que

especifica a sequncia de aminocidos da protena.

O incio da traduo dependente da disponibilidade de RNAt carregados

com seu respectivo aminocido. A ligao do aminocido ao RNAt dependente da

ao especfica de enzimas denominadas aminoacil-sintetase. Assim que o

aminocido se liga ao RNAt, este complexo passa a ser denominado aminoacil-

RNAt. Posteriormente, esta estrutura pode reconhecer o cdon correspondente ao

aminocido que o RNAt carrega. Este procedimento se d por uma sequncia

presente no RNAt que complementar ao cdon, o anticdon.Ao cdon de incio adicionado o primeiro aminocido. Contudo, este uma

metionina transformada, a N-formilmetionina. Este aminocido se liga ao cdon de

incio auxiliado por outro fator proteico, o IF-2. Posteriormente, a subunidade maior

se liga a esta estrutura, formando ento o ribossomo completo. O interessante que

este aminocido inicial se liga inicialmente ao stio P, e no ao A como ocorre com

os aminocidos seguintes que sero incorporados cadeia proteica nascente. Os

fatores IF-3 e IF-2 so liberados durante o estgio de formao da estruturaribossomal (Fig. 19).

Figura 19: Iniciao da transcrio em procariotos.

A

B

C

A

B

C


47/63


(A) subunidade 30S se liga ao RNAm com o auxlio dos fatores IF1 e IF3; (B)

IF2 se liga ao RNAt ligado N-formilmetionina e controla a sua entrada no

ribossomo; (C) os fatores de iniciao so liberados e a subunidade maior se liga ao

complexo inicial, formando o ribossomo completo. (Figura modificada de Lewin,

2004).

2.7.3. Alongamento da Sntese Proteica em Procariotos

O alongamento da cadeia proteica dependente de trs fatores proteicos:

EF-Tu, Ef-Ts e EF-G. O EF-Tu medeia a entrada do RNAt contendo o aminocidocorrespondente ao cdon que se encontra no stio A do ribossomo, um processo

dependente de energia. Em seguida, h a ao do fator EF-Ts, responsvel pela

liberao do primeiro fator do ribossomo. Este fator ainda consegue regenerar a

energia gasta no processo com o fator EF-Tu. No passo da translocao, a cadeia

polipeptdica transferida ao RNAt carregado com aminocido e presente no stio A.

O ribossomo ento se move sobre o RNAm na direo 5 - 3 do mesmo. Este passo

mediado pelo fator de elongao EF-G. Assim, h a liberao do RNAt presente nostio P e que no se encontra mais carregado. Posteriormente, h a transferncia do

RNAt contendo a cadeia polipeptdica em formao do stio A para o P.

O trmino da sntese proteica ocorre quando o cdon seguinte ao processo

de translocao, presente no stio A, um cdon de parada. Estes cdons no so

reconhecidos por RNAt, mas sim por fatores proteicos que so designados pelas

abreviaes RF1, RF2 e RF3. A diferena entre estes fatores se deve ao

reconhecimento diferencial dos cdons de parada. O RF1 reconhece UAA e UAG; oRF-2, os cdons UAA e UGA. O RF-3 auxilia em processos de catlise envolvidos

com a terminao da cadeia. O fator de liberao ento se liga ao cdon no stio a e

o polipeptdeo ento liberado do stio P. A finalizao do processo se d com a

dissociao do ribossomo em suas subunidades maior e menor.


48/63


2.7.4 Traduo em Eucariotos

A traduo em eucariotos ocorre de maneira bastante similar de

procariotos. Entretanto, alguns detalhes desta etapa so diferentes, como as

diferenas quantitativas e qualitativas dos fatores proteicos. A etapa de maior

interesse para o desenvolvimento de procedimentos em biotecnologia o incio da

traduo de eucariotos.

2.7.4.1 Iniciao da Traduo em Eucariotos

Inicialmente, a primeira diferena do incio da traduo em eucariotos em

comparao de procariotos, alm de requererem diferentes e mais diversificados

fatores proteicos, se refere ao cdon de incio. Em eucariotos, a nica trinca

reconhecida com este propsito o AUG. Em relao ao reconhecimento do

verdadeiro cdon de incio presente no RNAm, este frequentemente o primeiro

AUG que se encontra logo aps ao CAP 5. A interao da subunidade menor com a

estrutura do CAP metilado presente em todos os RNAm de eucariotos requer umgrupo de protenas genericamente conhecidas como eIF4. Aps o reconhecimento

do CAP pelo eIF4F, qualquer estrutura secundria na regio 5 removida por uma

atividade de helicase. A subunidade menor realiza ento um escaneamento sobre o

RNAm, parando assim que encontra o primeiro AUG (Fig. 20).


49/63


Figura 20: Iniciao da traduo em eucariotos.

A figura apresenta a complexidade da transcrio em eucariotos em

comparao a procariotos. Muitos fatores de transcrio diferentes esto envolvidos

no processo. Apesar de o primeiro AUG ser o verdadeiro cdon de incio, foram

identificadas outras estruturas que facilitam seu reconhecimento. Assim como em

procariotos, h determinadas sequncias que se localizam na vizinhana do AUG,

denominadas sequncias de Kozak. Esta representada por uma sequncia

consenso: RNAm 5ACCAUGG 3. Apesar de este consenso ser importante, a

eficincia da traduo afetada pela adenina e pela guanina presentes antes e aps

o AUG, respectivamente.

Aps a montagem do complexo ribossomo-RNAm, h a adio da primeira

metionina ao cdon de incio. Contudo, ao cdon inicial, h a incorporao de uma

metionina sem a modificao por um grupo formil. O processo restante semelhante


50/63


ao de procariotos. Depois de finalizar o processo de traduo, a cadeia polipeptdica

ainda passa por outros processos de transformao. Assim, para obter uma protena

nativa, a cadeia polipeptdica obtida aps a traduo do RNAm submetida a uma

outra etapa, o processamento proteico.

2.8 Processamento Proteico

Aps a sntese da protena, esta ainda pode sofrer vrias transformaes.

Este processamento extremamente importante sob o ponto de vista biotecnolgico,

pois a partir deste passo final h a gerao de protenas funcionais. Vrios so ostipos de processamento que a protena pode sofrer o que tambm depender do tipo

celular em que a macromolcula est sendo expressa. Um exemplo de grande

aplicao na biotecnologia o endereamento proteico. Este processo pode ocorrer

tanto em procariotos como em eucariotos.

Para isso, algumas cadeias proteicas apresentam em sua poro N-terminal

uma sequncia de 15 a 25 aminocidos. Esta estrutura denominada peptdeo

sinal. Seu reconhecimento por fatores e receptores proteicos medeia o transporte eo acoplamento membrana celular. Para que a protena seja secretada, o peptdeo

sinal reconhecido pela maquinaria celular, mais especificamente uma peptidase.

Esta enzima cliva a cadeia polipeptdica, separando a protena de seu peptdeo sinal

e permitindo que a protena seja finalmente liberada da clula.

Aliado ao peptdeo sinal, a protena pode conter na sua poro C-terminal

uma sequncia conhecida como sinal de ancoramento. Assim, o peptdeo sinal

enderea a protena at a membrana celular. O sinal de ancoramento, ao contrriodo peptdeo sinal, no ser clivado. Por possuir caractersticas hidrofbicas

compatveis com a da membrana celular, permite que a protena permanea

ancorada membrana. Outros tipos de processamento extremamente importantes

para obter protenas funcionais so processamentos que certas protenas sofrem

quando so expressas em clulas eucariotas. Exemplos so sequncias que

sinalizam a glicosilao. Alm da importncia deste processo para gerar protenas

funcionais, este requerimento uma das preocupaes da indstria farmacutica. A


51/63


glicosilao essencial para a gerao de uma resposta imunolgica eficaz, por

exemplo.

2.9 Regulao da Transcrio

As clulas no expressam todas as protenas por perodos de tempo

indeterminados. O gasto de energia demasiadamente alto, prejudicando a

homeostase celular. Por isso, as clulas desenvolveram mecanismos que permitem

que a clula reconhea o momento em que genes relacionados a uma determinada

funo sejam expressos.

2.9.1 Regulao da Transcrio em Procariotos

A obteno de determinados produtos gnicos essencial para a

biotecnologia. Apesar de se ter o conhecimento de que a informao gentica que

determina estes produtos representada por uma sequncia de nucleotdeos e que

a combinao destes traduzida em uma protena, outro esclarecimento necessrio: como ocorre o controle da sntese proteica?

O controle da expresso gnica um passo fundamental para a manuteno

da homeostase celular. Um exemplo pode ser observado em bactrias quanto

expresso de determinados genes envolvidos com o metabolismo de acares. Os

acares constituem uma fonte de carbono essencial para a produo de energia.

Diversos tipos podem ser utilizados com este propsito, como lactose, glicose,

maltose, galactose e xilose. O metabolismo de cada acar dependente daproduo de diferentes enzimas. Se a clula sintetizar todas as enzimas, mesmo

que no haja necessidade, isto representa um gasto energtico desnecessrio e

invivel para o organismo. Portanto, o controle estrito da sntese de enzimas um

dos passos chaves para a viabilidade celular e manuteno de culturas responsvel

pela sntese de produtos biotecnolgicos.


52/63


2.9.1 Regulao em Procariotos: O Modelo do Operon Lac

A regulao da expresso gnica pode ser obtida pelo controle tanto da

transcrio como de processos subsequentes. Entretanto, normalmente este

controle feito a nvel transcricional, para que a clula evite gastos energticos e de

precursores. Dois passos chaves so fundamentais para a inibio da sntese de

protenas desnecessrias em determinado momento:

I. As clulas precisam ser capazes de inibir a transcrio de um

determinado gene ou de um grupo deles;

II. As clulas precisam reconhecer determinadas condies ambientaisna qual ela deva ativar ou reprimir a transcrio de genes.

O modelo clssico que esclareceu muitos dados a este respeito foi obtido

com estudos sobre o metabolismo da lactose em E. coli, em 1950. Franois Jacob e

Jacques Monod estudavam os mecanismos envolvidos com o metabolismo da

lactose. Os pesquisadores compararam os nveis de expresso proteica sob

condies fisiolgicas e aps a adio de lactose. Aps a adio desta molcula,

observou-se que havia um aumento de cerca de 1.000 vezes da expresso dealgumas protenas alm do que se observava sob condies fisiolgicas. Assim,

substncias que agem como a lactose foram genericamente denominadas indutores.

Jacob e Monod seguiram com outros experimentos. O objetivo destes

cientistas era o de responder como a bactria capaz de reconhecer

especificamente quando deve haver a expresso de uma determinada protena e

qual seria o papel dos indutores neste processo. Para que a bactria consiga se

adaptar frente a esta mudana no suplemento de lactose, duas enzimas sorequeridas: uma permease, responsvel pelo transporte da lactose para dentro da

clula, e a beta galactosidase, uma enzima que cliva a molcula de lactose em

galactose e glicose. Estas duas enzimas so codificadas por dois genes distintos e

contnuos, o lacZ e o lacY,respectivamente. Neste metabolismo, um terceiro gene, o

lacA, tambm est envolvido. Este ltimo codifica uma transacetilase; entretanto,

sua funo especfica ainda no est bem elucidada.


53/63


Uma hiptese que os pesquisadores levantaram com o intuito de explicar

como agem os indutores seria de que estas molculas ativavam um intermedirio da

beta galactosidase que estava previamente acumulada. Contudo, estudos

posteriores demonstraram que aps a adio do indutor havia a sntese de novas

molculas. Assim, se tornou claro que a clula dispe de mecanismos capazes de

ativar a expresso gnica.

Quando Jacob e Monod induziram o aumento da expresso da

galactosidase, eles tambm induziram a expresso da permease e da transacetilase.

Foram realizadas ento anlises de mutantes que confirmaram que estas protenas

so codificadas por genes diferentes. Portanto, os pesquisadores identificaram trsgenes distintos, cuja transcrio controlada de forma coordenada. Estudos

posteriores de mapeamento demonstraram que os genes estavam proximamente

ligados no cromossomo e que estes eram transcritos em um mesmo RNAm. A

transcrio deste RNAm policistrnico demonstrou, portanto, que a regulao da

transcrio um processo coordenado.

A anlise de mutantes permitiu ainda que muitos clones de fentipos

diferentes fossem analisados. Inicialmente, os pesquisadores isolaram um clonecujas clulas expressavam as trs enzimas envolvidas no metabolismo da lactose a

um nvel mximo. O mais intrigante era que isto ocorria tanto na presena ou mesmo

na ausncia de um indutor. Assim, isolou-se um mutante defectivo no na atividade

enzimtica, mas sim no controle da produo enzimtica. A expresso gnica deste

mutante foi definida como constitutiva. A mutao ocorreu em uma regio prxima

regio onde os genes destas protenas se encontravam; contudo, a alterao no

ocorria na sequncia codificadora destes genes. Assim, foi descoberto outro geneenvolvido na regulao da transcrio, o gene lacI.

A sequncia codificadora relativa ao gene lacI foi localizada no mapa

gentico a uma

Documents

BIOTECNOLOGIA_01