BM1

Bioquímica e Metabolismo

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro 8

TESTES QUALITATIVOS PARA HIDRATOS DE CARBONO

INTRODUÇÃO

Os hidratos de carbono (glícidos) são uma classe de substâncias orgânicas

encontradas, virtualmente, em todos os seres vivos. No início do estudo destas

substâncias, verificou-se que apresentavam a fórmula geral (CH2O)n (com n

representando um número inteiro), ou seja, parecia tratar-se de moléculas formadas

por carbono "hidratado", daí o seu nome. Mais tarde, verificou-se que nem sempre

estes compostos respeitam a fórmula geral. São compostos bastante abundantes na

natureza, sendo sintetizados pelas plantas durante a fotossíntese, apresentando como

funções principais o facto de serem fontes primárias de energia para a maioria dos

organismos vivos e um importante componente estrutural para várias formas de vida

(p.e., a celulose é um constituinte maioritário na parede celular vegetal).

Nomenclatura

Os hidratos de carbono apresentam uma massa molecular que pode ir de 100 até

vários milhões de Dalton 1). Um grande grupo de hidratos de carbono de baixa massa

molecular denomina-se "açúcares". Os açúcares são identificados pelo sufixo "-ose"

(glucose, sacarose...). Os açúcares contendo entre 3 e 7 átomos de carbono são

denominados monossacáridos. Estes podem ser agrupados em sub-classes de acordo

com o número de átomos de carbono que os compõem: trioses (3C), tetroses (4C),

pentoses (5C), hexoses (6C) e heptoses (7C). Como apresentam um grupo aldeído (R-

CHO) ou cetona (R-CO-R), podem ser divididos em sub-classes, denominadas aldoses

e cetoses, respectivamente. Os monossacáridos podem sofrer complexação

(polimerização), sendo libertada uma molécula de água (desidratação) por cada

dois monossacáridos que se ligam. Ao processo inverso de quebra das ligações

glicosídicas, com libertação de monossacáridos e consumo de moléculas de água,

denomina-se hidrólise. Da polimerização de monossacáridos resulta uma grande

variedade de moléculas, que são classificadas segundo o seu tamanho. Polímeros de

açúcares constituídos por 2 a 10 monossacáridos são classificados de oligossacáridos

1) Um Dalton é igual a 1,663 x 10-24 g = N-1g, com N representando o número de Avogadro.

1



("oligo"= alguns, pequenos). Este grupo inclui os dissacáridos como, por exemplo, a

sacarose que é produto da combinação de glucose e frutose e a lactose que contem

glucose e galactose. Quando um grande número de monossacáridos polimeriza,

formando macromoléculas de elevada massa molecular, são denominadas

polissacáridos ("poli" = muitos). Entre os polissacáridos mais conhecidos, contam-se

o amido, a celulose (nas plantas e microrganismos), e o glicogénio (nos animais e nos

microrganismos). A fórmula geral para os polissacáridos é (C6H10O5)n, com n

tomando distintos valores, que vão, por exemplo, de várias centenas (amido), até

milhares (celulose). Estes três polissacáridos são polímeros de glucose. Existem

também polímeros de sacarose (dextrano) e frutose (inulina). Certos polímeros são

utilizados como compostos de reserva de energia (amido e glicogénio) ou como

material estrutural (celulose e quitina - constituinte do esqueleto exterior dos insectos

e crustáceos).

Estudo laboratorial dos hidratos de carbono

Os hidratos de carbono podem ser identificados por reacções colorimétricas

com reagentes específicos. Esses testes podem ser utilizados para determinar o tipo

de hidrato de carbono existente numa solução, assim como a sua quantidade (análise

qualitativa e quantitativa do composto). A maioria dos processos requer a adição de

um reagente à solução contendo hidratos de carbono, seguida de aquecimento num

banho de água quente. É melhor realizar o mesmo teste para todos os hidratos de

carbono colocando-os no banho de água ao mesmo tempo, de forma a poder fazer-se

uma comparação directa do comportamento desses hidratos de carbono relativamente

a esse teste.

MATERIAL E REAGENTES

- Tubos de ensaio de 18 x 150 mm

- Buretas de 50 ml

- Funis de vidro

- Pipetas de vidro de 1, 2, 5 e 10 ml

- Placa de aquecimento(electrica)

- Pipetas automáticas, 1-5 mL (+ pontas)

- Copos de vidro de 250 ml

Ácido sulfúrico concentrado

1-pentanol



Soluções a 1% de glucose, frutose,

xilose, arabinose, lactose, sacarose,

glicogénio e amido:

Solução de tiossulfato 0,1 N:

Reagente de Molisch:

Reagente de Bial:

Reagente de Seliwanoff:

Reagente de Benedict:

Dissolver 1 g de cada um dos hidratos

de carbono em 100 ml de água (a

quente para o amido e glicogénio).

Dissolver 2,5 g de tiossulfato de sódio

em 100 ml de água.Guardar a 4°C.

Solução a 5% (p/v) de - naftol em

etanol 95% (50 g de -naftol em um

litro de etanol 95%). Guardar numa

garrafa de vidro escuro.

Dissolver 3 g de orcinol em um litro de

ácido clorídrico (HCl) concentrado;

adicionar, em seguida, 2 a 3 ml de

FeCl3.6H2O a 10% (p/v) (10 g de

FeCl3 em um litro de água). Guardar

numa garrafa de vidro escuro.

Dissolver 0,5 g de resorcinol em 1 l de

ácido clorídrico diluído (uma parte de

HCl concentrado, diluído em duas

partes de água - por exemplo, 333 ml

de HCl são diluídos até 1 l com água).

Guardar numa garrafa de vidro escuro.

Dissolver 173 g de citrato de sódio di-

-hidratado e 100 g de carbonato de

sódio anidro em 600 ml de água, a

quente. Filtrar, para uma proveta de 1

litro, e acertar com água a 850 ml.

Adicionar, devagar e em agitação, uma

segunda solução, preparada

dissolvendo 17,3 g de sulfato de cobre

(CuSO4.5H2O) em 150 ml de água.

Diluir a mistura até perfazer 1 l.



Reagente de Barfoed:

Solução de iodo-iodeto de potássio:

(I2 5 mM em KI 3%)

Dissolver 13,3 g de acetato de cobre

monohidratado, em 200 ml de água,

filtrar, se necessário, e adicionar 1,8 ml

de ácido acético glacial.

Dissolver 0,3 g de KI em 10 ml de água

destilada e adicionar 1,27 mg de iodo

re-sublimado.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

A. Testes baseados na produção de furfural ou derivados de furfural

Quando um monossacárido é tratado com uma solução concentrada de ácido

ocorre a sua desidratação. No caso de ser um dissacárido, trissacárido ou

polissacárido, ocorre primeiro a hidrólise das ligações glicosídicas e os

monossacáridos resultantes sofrem, em seguida, desidratação.

Se o monossacárido for uma pentose, o produto da desidratação é o furfural; se

for uma hexose, forma-se um derivado do furfural, denominado hidroximetilfurfural:

Se no meio ácido onde ocorreu a formação de furfural ou hidroximetilfurfural se

encontrarem naftol, resorcinol ou orcinol (compostos fenólicos), formar-se-ão produtos

de condensação corados.

3 H O2CalorHO

OH

CH OH2 Ácido concentrado

Pentose

CO

HHOH C2

Hidroximetilfurfural

O

CO

H

O

Furfural

3 H O2

+

+

O

OH

CalorHOOH

CH OH2

Ácido concentrado

Hexose

O

OH



Teste de Molisch

É o teste mais geral para hidratos de carbono. A adição de ácido sulfúrico

concentrado hidrolisa ligações glicosídicas, formando-se monossacáridos, os quais são

então desidratados em furfural e hidroximetilfurfural. Estes produtos combinam-se

com o -naftol, formando um complexo de cor púrpura. O teste não é absolutamente

específico para hidratos de carbono

a) - Numere tubos de ensaio de 1 a 10.

b) - No tubo 1 pipete 2 ml de água. Nos tubos 2 a 9, pipete 2 ml das soluções de

glucose, xilose, arabinose, frutose, lactose, sacarose, glicogénio e amido (todas a

1%) e ao tubo 10 adicione 2 ml da solução de constituição a determinar (amostra).

c) - Junte 2 gotas de reagente de Molisch a cada tubo, agitando devagar.

d) - Adicione 2,5 ml de ácido sulfúrico concentrado a cada um dos tubos, tendo o

cuidado de inclinar o tubo, de forma ao ácido escorrer lentamente pela parede

deste. Como o ácido sulfúrico tem uma densidade superior à da água, irá formar-

-se uma camada de ácido no fundo do tubo. Cuidadosamente, endireite o tubo.

e) - Uma cor púrpura na interface entre o ácido e a solução aquosa é indicadora de

teste positivo para os hidratos de carbono.

f) - Registe os resultados na tabela apresentada na última página do protocolo.

Hidrato deCarbono

produto de condensação(púrpura)

OH

CO

HHOH C2


- naftol

O

CO

H

O

Furfural

+



Teste de Bial

Quando as pentoses são aquecidas na presença de ácido clorídrico concentrado,

ocorre desidratação parcial formando-se furfural o qual, por sua vez, condensa com

orcinol na presença de iões férricos, para dar produtos de cor azul-esverdeada. Por

outro lado, sob as mesmas condições, o aquecimento prolongado de hexoses

promove a formação de hidroximetilfurfural que, reagindo com o orcinol, produz um

complexo amarelo-acastanhado. Esta diferença na coloração permite distinguir a

presença destes açúcares. De referir também que no processo de formação do

complexo corado as hexoses reagem mais lentamente que as pentoses.

O teste de Bial não é absolutamente específico para pentoses, dado que outros

compostos, como as trioses, ácidos urónicos e certas heptoses, assim como ácidos

nucleicos produzem também produtos de cor azul ou verde.

a) - Marque tubos de 1 a 10.

b) – Adicione, separadamente para os tubos 2 a 10, 1 ml de soluções de glucose,

xilose, arabinose, frutose, lactose, sacarose, glicogénio, amido e de amostra. Ao

tubo 1, adicione 1 ml de água destilada.

c) - Adicione, em seguida, 1,5 ml de Reagente de Bial.

d) – Num banho de água a ferver, aqueça os tubos durante 5 minutos. Deixe arrefecer

ao ar. Note a coloração formada.

Pentoses produto de condensação (azul-verde)orcinol

Furfural

CH3

OHHOC

O

H

O

Hexoses produto de condensação (amarelo-acastanhado)orcinol

CH3

OHHOC

O

H

HOH C2


O



e) - Se a coloração não for nítida, dilua com 5 ml de água destilada e adicione 1 ml de

álcool amílico (1-pentanol), agitando a seguir. Como o produto de condensação é

solúvel no álcool amílico, vai concentrar-se na camada superior (álcool), após a

separação de fases.

f) - Registe os resultados na tabela apresentada no final do protocolo. Uma cor

amarelo-acastanhada é indicadora de um teste positivo para hexoses e uma cor

azul indica teste positivo para pentoses.

Teste de Seliwanoff

A desidratação das ceto-hexoses (p.e. frutose) com ácido clorídrico, a quente,

ocorre mais rapidamente do que a desidratação das correspondentes aldo-hexoses. A

ceto-hexose, quando aquecida na presença de ácido clorídrico, perde 3 moléculas de

água, formando hidroximetilfurfural, que, na presença de resorcinol, forma um

produto de condensação de cor vermelha. Assim, no mesmo intervalo de tempo,

enquanto as ceto-hexoses reagem com o resorcinol para dar um produto de

condensação de cor vermelha clara, as aldo-hexoses originam produtos rosa pálido.

Como o teste de Seliwanoff reflete a diferença nas velocidades da reacção de

desidratação, deve evitar-se o aquecimento prolongado das amostras. O teste é útil

para distinguir a frutose (ceto-hexose) da glucose, manose e galactose (aldo-hexoses),

sendo a intensidade da cor formada proporcional à concentração de ceto-hexose.

a) - Numere tubos de 1 a 10.

b) - Adicione, separadamente para os tubos 2 a 10, 0,5 ml de solução de glucose,

xilose, arabinose, frutose, lactose, sacarose, glicogénio, amido, e amostra. No

último tubo 1 coloque 0,5 ml de água.

Frutose(cetohexose)

produto de condensação (vermelho)resorcinol

OH

HO

CO

H

HOH C2


O



c) - A cada tubo adicione 2 ml de reagente de Seliwanoff.

d) - Coloque os tubos num copo de água a ferver, durante 6 minutos, observando a

mudança de cor no intervalo de 1 a 6 minutos.

e) - Registe numa tabela quais das amostras dão resultados positivos, e o intervalo de

tempo requerido para obtenção de resultados positivos, em cada um dos tubos.

Um vermelho intenso indica um teste positivo para ceto-hexoses. A cor torna-se

mais intensa à medida que se aquece, mas após um aquecimento prolongado, as

aldo-hexoses também reagirão com o reagente de Seliwanoff, produzindo uma

cor rosa pálida. O teste também é positivo com a sacarose porque sofre hidrólise

em glucose e frutose, reagindo em seguida os monossacáridos com o ácido e com

o resorcinol.

B. Testes baseados nas propriedades redutoras dos açúcares

Hidratos de carbono com grupos aldeído ou cetona livres ou o grupo hidroxilo

livre resultante do hemiacetal ou hemicetal, comportam-se como compostos redutores.

Em soluções com pH suficientemente elevado, podem reduzir agentes oxidantes

fracos, tais como iões Cu2+, CN- e Ag+. Por exemplo, os iões Cu2+ reagem com a

glucose, formando um precipitado corado de óxido cuproso. A cor do precipitado

poderá variar de verde ou amarelo a castanho avermelhado, dependendo do tipo e da

concentração do açúcar redutor presente.

Polímeros de glúcidos redutores, como, por exemplo, o amido, que é um

polímero de glucose, perdem o seu poder redutor devido à natureza das ligações. Dito

de outra forma, os grupos com características redutoras pertencentes aos

monossacáridos constituintes do amido, estão envolvidos nas ligações que originam o

polissacárido, perdendo, por isso, as suas propriedades redutoras.

glucose + Cu(OH) Cu O + H O + glucose oxidada22 2

Calor

compostocorado



Teste de Benedict

Os monossacáridos e dissacáridos que possuem um grupo aldeído livre ou

potencialmente livre são oxidados por certos agentes oxidantes, tais como iões Cu2+,

que, sendo reduzidos a Cu+, precipitam na forma de Cu2O (que apresenta cor

vermelha). O teor de açúcar presente pode ser grosseiramente estimado através da

percentagem de precipitado e da intensidade da cor. O reagente de Benedict é uma

solução alcalina de sulfato de cobre, carbonato de sódio e citrato de sódio. O citrato de

sódio existente no reagente forma um complexo solúvel com os iões Cu2+, evitando a

sua precipitação sob a forma de Cu(OH)2 (de cor azul) ou de CuO (de cor preta). Os

açúcares redutores, mono- e dissacáridos, dão em geral testes de Benedict

positivos. Todavia, este teste não é específico para glúcidos redutores. Compostos tais

como ácido fosfórico, fenóis, fenil-hidrazina, pirogalhol e ácido úrico reagem, também,

positivamente neste teste.

a) - Prepare um conjunto de tubos numerados de 1 a 10.

b) - Adicione, separadamente para os tubos 2 a 10, 0,5 ml de soluções de glicose,

xilose, frutose, arabinose, lactose, sacarose, glicogénio, amido e amostra. Ao tubo

1, adicione 0,5 ml de água.

c) - Adicione 2,5 ml de reagente de Benedict a cada um dos tubos.

d) - Mergulhe os tubos em água a ferver, durante 5 minutos. Evite aquecimento

prolongado. Permita, em seguida, o seu arrefecimento ao ar.

e) - Observe a cor da solução e note se formou precipitado. Utilize o sinal + para

indicar uma pequena formação de precipitado, ++ para uma moderada formação

de precipitado e +++ para a formação de uma grande quantidade de precipitado.

Uma mudança da cor da solução não é indicativa de reacção positiva. Um

resultado positivo manifesta-se pela formação de precipitado. A cor do

precipitado poderá variar com o tamanho das partículas formadas: pequenas

partículas produzidas por uma reacção rápida apresentam uma cor verde,

enquanto que partículas grandes formadas por uma reacção lenta apresentam

uma cor vermelha. Considerando a glucose, uma solução azul límpida é

indicadora de teste negativo, um precipitado verde é indicador de pequenas



quantidades de glucose em solução, um precipitado amarelo evidencia a

existência de 10 g de glucose por litro e um precipitado vermelho indica uma

concentração de 20 g por litro de solução.

f) - Registe os resultados na tabela apresentada no final do protocolo.

Teste de Barfoed

O reagente de Barfoed, que contém acetato de cobre em ácido acético diluído, é

utilizado para distinguir os monossacáridos redutores dos dissacáridos redutores.

Este teste difere do teste de Benedict no facto da reacção de oxidação-redução ser

realizada em meio acídico (pH 4,5), em vez de alcalino. A este pH, os dissacáridos não

reduzem os iões Cu2+ a Cu2O, enquanto que os monossacáridos reduzem os iões

Cu2+, quando aquecidos durante 2 minutos num banho de água fervente. O

aquecimento prolongado de dissacáridos conduz a um certo grau de redução, devido

à formação de monossacáridos por hidrólise dos dissacáridos. Por esta razão, é

essencial que todos os açúcares sejam tratados exactamente da mesma maneira e que

se anote o tempo decorrido até o aparecimento de um precipitado. Dentro do mesmo

intervalo de tempo (2 minutos), somente os monossacáridos reduzirão o ião cobre do

reagente. O tempo de reacção é determinado pela velocidade de formação do ião

cuproso.

Ao realizar este teste, devem utilizar-se concentrações aproximadamente iguais

dos glúcidos, porque uma solução mais concentrada de um dissacárido reduzirá os

iões cobre mais rapidamente do que uma solução diluída de um monossacárido. O

precipitado do óxido cuproso formado é menos denso do que no teste de Benedict e,

por isso, convém esperar que deposite. De referir, também, que o óxido cuproso,

neste teste, apresenta cor de tijolo, enquanto que no teste de Benedict é laranja-

acastanhado, devido ao pH ácido do reagente de Barfoed.

a) - Prepare um conjunto de tubos numerados de 1 a 10.

b) - Adicione, separadamente para os tubos 2 a 10, 0,5 ml de soluções dos glúcidos

glicose, xilose, frutose, arabinose, lactose, sacarose, glicogénio, amido e amostra.

Ao tubo 1, adicione 0,5 ml de água.

c) - Adicione 2,5 ml de reagente de Barfoed a cada tubo.



d) - Coloque os tubos num banho de água a ferver e inicie imediatamente a contagem

de um período de tempo de 2 minutos. Em seguida, deixe arrefecer ao ar. O

tempo é crítico, já que o reagente de Barfoed reage tanto com mono- como com

dissacáridos, mas mais rapidamente com os monossacáridos. Um aquecimento

mais prolongado conduz à hidrólise de dissacáridos, apresentando o teste

resultado positivo.

e) - Examine a quantidade de precipitado nos tubos. Uma mudança da cor da solução

ou uma pequena quantidade de precipitado não constitui teste positivo. Uma cor

avermelhada do precipitado indica teste positivo para monossacáridos. De referir

que a cor do precipitado é vermelho-tijolo, diferente da cor castanho-alaranjado

do precipitado obtido no teste de Benedict. Registe os resultados na tabela

apresentada no final do protocolo.

C. Teste de iodo

Os polissacáridos apresentam uma cor característica, quando tratados com uma

solução de iodo, na forma de KI. O amido pode ser especificamente detectado, em

virtude da sua habilidade de formar um complexo azul escuro com o iodo. Esse

complexo consiste numa disposição linear de aglomerados de átomos de iodo (iões

pentaiodeto, I5-) entre as cavidades helicoidais da amilose. A amilose existe na forma

de uma cadeia helicoidal, contendo seis resíduos glicosídicos por volta. É requerido

um comprimento de cadeia mínimo de seis voltas da hélice (36 grupos glicosídicos)

para se formar o complexo com o iodo. Polissacáridos ramificados, com hélices

interrompidas (p.e. amilopectina) formam complexos corados menos intensos,

enquanto que polissacáridos fortemente ramificados (p.e. glicogénio), com pequenos

segmentos helicoidais e impedidos de formar hélices maiores, originam complexos

corados de uma cor castanho-avermelhada pálida. O iodo forma, assim, complexos

corados com os polissacáridos, produzindo uma cor azul na presença do amido,

enquanto que na presença de glicogénio e de amido parcialmente hidrolisado a cor

que se desenvolve é vermelho-acastanhada.

a) – Anteriormente foi preparada uma solução de amido a 1%, misturando

vigorosamente 1 g de amido em cerca de 100 ml de água quente.



b) - Prepare 4 tubos e adicione respectivamente a cada um dos tubos 2,5 ml da solução

de amido, glicogénio, sacarose e amostra.

c) - Adicione uma gota de solução de iodo-iodeto a cada um dos tubos e agite em

vórtex.

d) - Registe a cor. Uma cor azul indica um teste positivo para o amido; uma cor

vermelho - acastanhada indica um teste positivo para o glicogénio e para a

dextrina (produto da clivagem de moléculas de amido). A cor obtida na

presença de amido é mais intensa do que a obtida na presença de glicogénio. A

cor vermelho-acastanhada obtida na presença deste último hidrato de carbono

é melhor observada por comparação com um tubo branco contendo água e uma

idêntica quantidade da solução de iodeto. Registe os resultados obtidos na

tabela apresentada no final do protocolo.

e) - Em seguida, ferva os tubos até verificar alteração de cor. Registe a cor. Deixe a

solução arrefecer até à temperatura ambiente. Volte a registar a cor.

f) - Adicione algumas gotas da solução de tiossulfato à solução fria contida em cada um

dos tubos e tome nota do resultado.

BIBLIOGRAFIA

a) - Ricardo,C.P. e Teixeira,A.N. (1983) Moléculas Biológicas, 3ª ed., pp. 27-85,

Didáctica Editora, Lisboa, Portugal.

b) - Plummer, D.T.(1978) Practical Biochemistry, 2ª ed, pp.161-192, McGraw-Hill

Company UK) Limited, London.

c) - Villela, G.G., Bacila,M. e Tastaldi, H.(1973) Técnicas e experimentos de Bioquímica,

pp. 129-149, Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.

d) - Stenesh, J. (1984), Experimental Biochemistry, pp. 237-245, Allyn and Bacon, Inc,

Boston.

e) - Murray,R.K., Granner,D.K., Mayes,P.A. and Rodwell,V.W. (1990) Harper's

Biochemistry, 22nd edition, pp. 124-133, Prentice-Hall International In., New

Jersey.



Teste de Molisch

todos os hidratos de carbono

Teste de Benedict

Precipitado laranja-acastanhado

Hidratos de carbono redutores Hidratos de carbono não redutores

Teste de Iodo

Teste de Barfoed

Dissacáridos redutoresPrecipitado cor de tijolo

Teste de Molish

Teste de Barfoed

Teste de Benedict

Teste de Iodo

+

-+

Solução azul Solução vermelho--acastanhada

SacaroseGlicogénio

Amido-

+ +

+ -

Monossacárido redutor Lactose, Maltose

Teste de Barfoed

Solução azul-esverdeada

Teste de Bial

+ -

PentoseRibose

Solução amarelo-acastanhadaHexose

Teste de Barfoed

Solução vermelha

Teste de Seliwanoff

+ -

FrutoseGlucose, Galactose



RESULTADOS:

1.Complete a tabela seguinte:

TESTES

Tubo

Hidratos

de carbono

Molisch

Bial

Seliwanoff

Benedict

Barfoed

Iodo

1 Branco

2 Glucose - - -

3 Xilose - - -

4 Arabinose - - -

5 Frutose - - -

6 Lactose - - -

7 Sacarose

8 Glicogénio

9 Amido

10 Amostra 1

+++, ++, + Reacção positiva (vários graus)

- Reacção negativa

2.Com base nos resultados anotados, classifique os hidratos de carbono utilizados.

3.Utilizando os resultados atrás anotados e o fluxograma de identificação de hidratos

de carbono apresentado na página anterior, determine os hidratos de carbono

constituintes da amostra.

Amostra 1 -

4.Explique porque é que a lactose é redutora e a sacarose não, sendo ambas

dissacáridos.

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