BOLETIM TÉCNICO N° 58 ISSN 0100-3054 JULHO/98

VARIABILIDADE GENÉTICA DA ALFAFA

MARCADORES AGROMORFOLOGICOS E MOLECULARES

Maria Lúcia Crochemore1

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ- LONDRINA-PR

1Engª Agrª PhD, Pesquisadora da Área de Propagação Vegetal. IAPAR. Caixa Postal 481. 86001-970. Londrina - PR.

INSTITUTO AGRONÔMICO DO PARANÁ

VINCULADO À SECRETARIA DE ESTADO DA AGRICULTURA E DO ABASTECIMENTO Rod. Celso Garcia Cid, km 375 - Caixa Postal 481 Fone: (043) 376-2000

Fax:(043)376-2101-86001-970- LONDRINA-PR-BRASIL

Visite o site do IAPAR: http://www.pr.gov.br/iapar

DIRETORIA EXECUTIVA

Florindo Dalberto

PRODUÇÃO

Arte-final e capa: Tadeu Kioshy Sakiyama Coordenação Gráfica: Jentaro Lauro Fukahori Impresso na Área de Reproduções Gráficas Tiragem: 750 exemplares Todos os direitos reservados ao Instituto Agronômico do Paraná. É permitida a reprodução parcial, desde que citada a fonte. É proibida a reprodução total desta obra.

C937v Crochemore, Maria Lúcia Variabilidade genética da alfafa: marcadores

agromorfológicos e moleculares / Maria Lúcia Crochemore. Londrina: IAPAR, 1998.

59p. Ilust. (IAPAR. Boletim Técnico, 58)

1. Alfafa-Genética. 2. Leguminosas forrageiras. I. Instituto Agronômico do Paraná, Londrina, PR. II. Título. III. Série.

CDD 633.31 AGRIS F30 1953

SUMÁRIO

Pág.

APRESENTAÇÃO .................................................................................... 5

RESUMO .................................................................................................. 7

ABSTRACT............................................................................................... 7

INTRODUÇÃO.......................................................................................... 9

ORIGEM E DISTRIBUIÇÃO DO GÊNERO Medicago ............................... 11

GÊNERO Med/cago - TAXONOMIA................................. ....................... 11

A PLOIDIA E O SISTEMA DE REPRODUÇÃO ......................................... 13

O COMPLEXO M. sativa - ESPÉCIES ...................................................... 14

Medicago sativa L,(M. sativa ssp. sativa L& L.).................................. 17

Medicago falcata L. (M. sativa ssp. falcata Arcangeli) .......................... 17

Medicago glomerata Balb .................................................................... 18

Medicago glutinosa M. B. (M. sativa ssp. glutinosa)............................ 19

Medicago prostrata Jacq...................................................................... 19

O COMPLEXO Medicago sativa - SUBESPÉCIES HÍBRIDAS .................. 19

Medicago sativa ssp. X hemicycla Grossh. (2n=16,32)....................... 20

Medicago sativa ssp. X var/a Martin (2n=16,32) ................................. 20

Medicago sativa ssp. X tunetana Murbeck (2n=32) ............................ 21

Medicago sativa ssp. X polychroa Grossh. (2n=32) ............................ 21

EVOLUÇÃO DO COMPLEXO M. sativa-falcata ........................................ 21

PROPAGAÇÃO E EVOLUÇÃO DAS ALFAFAS CULTIVADAS................. 23

REGIÕES DE CULTIVO...................................................................... 24

A CARACTERIZAÇÃO E AS ESTRUTURAÇÕES .................................... 25

CARACTERES MORFOLÓGICOS E AGRONÓMICOS....................... 27

COR DAS FLORES ..................................................................... 28

COMPORTAMENTO INVERNAL ................................................. 29

PORTE DA PLANTA.................................................................... 30

SISTEMA RADICULAR E O CARÁTER RIZOMATOSO............... 31

HASTES, ENTRENÓS E ÉPOCA DE FLORAÇÃO ..................... 32

RELAÇÃO FOLHA/HASTE.......................................................... 34

CLASSIFICAÇÕES OBTIDAS POR CARACTERES

AGROMORFOLÓGICOS......................................................................... 34

POPULAÇÕES NÃO-RESISTENTES AO FRIO.................................. 35

POPULAÇÕES MAIS OU MENOS TOLERANTES AO FRIO.............. 36

POPULAÇÕES DO TURQUESTÃO ................................................... 37

POPULAÇÕES COM FLORES MATIZADAS...................................... 37

POPULAÇÕES COM FLORES AMARELAS....................................... 38

OS MARCADORES NEUTROS E AS CLASSIFICAÇÕES....................... 40

MARCADORES DO TIPO PROTEICO ............................................... 40

MARCADORES RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH

POLYMORPHISM).............................................................................. 42

MARCADORES RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC

DNA)................................................................................................... 43

CONCLUSÃO .......................................................................................... 48

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 49

AGRADECIMENTOS............................................................................... 59

APRESENTAÇÃO

A alfafa é uma leguminosa forrageira cujo cultivo desperta vários interesses como a fixação simbiótica do nitrogênio na fitomassa, promove, graças ao seu forte sistema radicular, a mobilização de nutrientes das camadas mais profundas do solo, boas qualidades nutricionais para os animais e alta produtividade,'mesmo em condições de seca, apresentando múltiplas utilizações: cobertura verde, pastagem, forragem verde, feno, silagem, extração de proteínas e xantofilas, produção de fibras para a indústria papeleira, etc.

A grande variabilidade genética que apresenta lhe permite adaptação aos mais contrastantes climas, desde os mais quentes aos mais frios e a inúmeros tipos de solos, com exceção dos muito ácidos ou muito úmidos.

Sua utilização no Brasil restringe-se às regiões sul, sudeste e centro-oeste onde existem alguns programas de pesquisa e desenvolvimento visando explorar e valorizar mais o potencial dessa leguminosa.

O estudo da variabilidade genética da alfafa, baseado na utilização de caracteres morfológicos e agronômicos é uma contribuição importante para o conhecimento da espécie. Recentemente, com o desenvolvimento de marcadores moleculares, baseados nas diferenças polimórficas entre moléculas de DNA, livres de efeitos ambientais, abriu-se oportunidade ímpar de melhor caracterizar a divergência genética existente.

O presente trabalho traz atualizações e informações úteis aos interessados na cultura da alfafa, que desejem ampliar seus conhecimentos agronômicos e científicos

Carlos Roberto Riede Coordenador da Área de Melhoramento e Genética Vegetal

5

RESUMO

Esta revisão trata da caracterização da variabilidade genética de Medicago saúva L. É abordada a taxonomia do gênero Medicago, a evolução e diversificação do complexo Medicago sativa-falcata. São também abordados os marcadores agromorfológicos e moleculares utilizados nas caracterizações e classificações de populações de alfafa perene tetraplóide.

ABSTRACT

This review presents the genetic variation of perennial alfalfa {Medicago sativa L.), the taxonomy of the Medicago gemjs, the evolution and diversity of the Medicago sativa-falcata complex. The review describes the morphological, agronomic and moleculares markers used in the caracterisation of the tetraploid perennial alfalfa populations.

INTRODUÇÃO

Cultivada em quase todas as latitudes, a alfafa cobre aproximadamente 33 milhões de hectares e encontra seu maior desenvolvimento em regiões temperadas quentes: Estados Unidos (9 a 10 milhões de hectares), Europa, América do Sul, Ásia, Austrália, Japão, Nova Zelândia. Ela é também encontrada na África e no Canadá (2 milhões de hectares).

Essa planta forrageira tem grande valor na alimentação dos animais seja como feno, silagem, pellets desidratados para bovinos e ovinos, seja incorporado nos alimentos compostos para monogástricos ou ainda, em pastoreio, sobretudo na Argentina e na Austrália. Ainda que, atualmente, seu papel volta a ser mais importante, a cultura da alfafa regrediu muito na Europa Ocidental nas últimas décadas em razão do desenvolvimento do trinômio milho-azevém-soja na produção leiteira. A alfafa, freqüentemente associada a

gramíneas, é cultivada atualmente em 1.200.000 ha na Itália, 600.000 ha na

França, 350.000 ha na Espanha e 200.000 ha na Grécia. Mais da metade das variedades e populações de alfafa cultivadas são

originárias do intercruzamento entre Medicago sativa ssp. saúva e Medicago sativa ssp. falcata. Devido à alogamia e à estrutura autotetraplóide das formas cultivadas deste complexo de subespécies, uma grande diversidade genética é encontrada entre populações originárias de diferentes regiões geográficas e também no interior destas populações. Os recursos genéticos disponíveis atualmente compreendem, por um lado, as variedades inscritas nos catálogos oficiais e, por outro, as populações selvagens, ecótipos e populações regionais onde se encontra a maior amplitude de variabilidade genética. A erosão da

9

diversidade genética, encontrada essencialmente nas plantas cultivadas, leva a procurar nas populações selvagens ou nas populações subespontâneas uma fonte de variabilidade suplementar, que poderá ser salvaguardada e posteriormente explorada em melhoramento genético. Assim, é indispensável ter-se a maior amplitude possível de variação genética da espécie estudada.

Esta diversidade genética pode ser avaliada com a ajuda de vários tipos de caracteres neutros ou selecionados. Em uma população, a diversidade dos caracteres neutros é o resultado da deriva genética, da migração e de mutações. Por outro lado, a variabilidade de uma população relativa aos caracteres selecionados depende não somente destes eventos genéticos mas também da influência do ambiente e do homem. Desde que a seleção seja forte, ela pode mascarar a estruturação das populações. A descrição da variabilidade genética através de marcadores neutros como as isoenzimas, ainda que estas não sejam amplamente utilizadas em alfafa, permitiu classificações de algumas populações do complexo Medicago sativa-falcata. Por outro lado, análises diretas de fragmentos de DNA através das técnicas de RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ainda são muito limitadas em número e amplitude na alfafa perene.

Este trabalho inicia com uma revisão sobre a taxonomia do gênero Medicago, apresentando a seguir a evolução e a diversificação do complexo Medicago sativa-falcata. Aborda também os diferentes marcadores utilizados nas caracterizações e classificações da alfafa perene tetraplóide.

10

ORIGEM E DISTRIBUIÇÃO DO GÊNERO Medicago

O gênero Medicago tem como centro de origem o Oriente-Médio (Quiros & Bauchan, 1988) e teria se diferenciado durante a era terciária (Lesins & Lesins, 1979). As formas mais antigas, perenes e preferencialmente alógamas teriam como centro de origem a costa norte do Mediterrâneo. No Mioceno, o fechamento intermitente do estreito de Gibraltar ligado à formação de montanhas (Alpes, Pirineus, Apeninos etc.) teria transformado momentaneamente a Bacia Mediterrânea em um deserto quente. A criação deste novo habitat favoreceu a diferenciação de espécies anuais colonizadoras, de sementes dormentes e de ciclo vegetativo curto, a partir das espécies perenes preexistentes. Ao mesmo tempo em que as espécies se tornavam anuais, o caráter autógamo teria aparecido como uma estratégia reprodutiva essencial devido ao isolamento geográfico e da falta de polinizadores nos novos hábitat colonizados. A abertura final do estreito de Gibraltar conduziu numerosas espécies à extinção. Como estas espécies anuais surgiram após o fim deste processo geológico, seu estudo não pode contribuir efetivamente para a compreensão da origem do gênero (Quiros & Bauchan, 1988).

A distribuição do gênero teria em seguida progredido em direção da Espanha e Ilhas Canárias a Oeste, da China a Leste, da Sibéria ao Norte e da Península Arábica ao Sul.

GÊNERO Medicago - TAXONOMIA

O gênero Medicago pertence à ordem das Leguminosales, super família das Leguminosas, família Fabacea.

A sistemática e a filogênese do gênero Medicago resultam dos trabalhos de vários autores ao longo da história: Linnaeus, Urban, Taubert, Ascherson & Graebner, Trabut, Hegi, Synskaya (Villax, 1963). No entanto, foi somente a

11

amarela, violeta ou mesclada de amarelo e violeta (yariegated). As vagens são retas, em forma de foice ou em espiral, sem espinhos. As nervuras são proeminentes. As vagens são membranosas e há uma fraca divisão (ou ausência completa) entre as sementes (Lesins & Lesins, 1979).

A PLOIDIA E O SISTEMA DE REPRODUÇÃO

O número cromossômico de base do gênero é oito, exceção feita a algumas espécies anuais: M. constricta, M. praecox, M. polymorpha, M. rigidula e M. murex que têm um número de base de sete cromossomos (Lesins & Lesins, 1979; Quiros & Bauchan, 1988).

Três níveis de ploidia são encontrados nas diferentes espécies do gênero: diplóide (2x=l 6), tetraplóide (4x=32) e hexaplóide (6x=48) mas, a maioria das espécies são diplóides. É possível que a base da evolução do gênero tenha sido a diploidia e que as espécies tetraplóides tenham saído de uma não-redução de gametas, o que originou indivíduos bastante vigorosos e heterozigotos aptos a colonizar outros habitats e expandir assim a zona geográfica do gênero (Quiros & Bauchan, 1988).

Algumas espécies perenes como M. sativa, M. falcata, M. prostrata, M. papillosa ou M. arbórea podem apresentar níveis de ploidia diferentes de 2x/4x/6x, pouco ou nada interferíeis (Lesins & Lesins, 1979).

As espécies anuais de Medicago são autógamas graças à autofecundação de suas flores. As perenes são alógamas com diferentes níveis de auto-incompatibilidade. Às vezes é possível ocorrer a autofecundação em algumas perenes alógamas, mas normalmente as plantas têm necessidade de insetos para a polinização e fecundação. Devido a sua alogamia, estas plantas são fortemente polimorfas (Quiros & Bauchan, 1988).

A existência de formas diplóides e tetraplóides em M. sativa e M. falcata, assim como em outras espécies, sugere que a duplicação cromossômica

13

tenha ocorrido independentemente em cada espécie. As formas híbridas entre os dois níveis de ploidia podem ser devido à duplicação de híbridos diplóides, à hibridação de gametas 2n saídos de um genitor diplóide com gametas normais 2n saídos de outro genitor tetraplóide, ou mesmo, à união rara de dois gametas provenientes de dois pais diplóides (Stanford et ai, 1972).

O COMPLEXO M. sativa - ESPÉCIES

Das 55 espécies de Medicago descritas por Lesins & Lesins (1979) somente uma dezena é cultivada (Tabela 1). A maioria é encontrada nas pastagens ou beiras de estradas, notadamente mediterrâneas (Prosperi et al., 1995).

As espécies perenes cultivadas, exceto M. arbórea e M. lupulina, pertencem à seção Falcago, subseção Falcatae: falcata, sativa, glomerata, glutinosa eprostrata. Existem inúmeras possibilidades de intercruzamento entre as formas diplóides e/ou tetraplóides destas espécies, que Lesins & Lesins (1979) descrevem como um complexo de espécies, denominado em sentido amplo, complexo Medicago sativa. Todas as espécies deste complexo podem se hibridar com M. sativa mas, acima da metade dos ecótipos de alfafa cultivados atualmente são originários do intercruzamento de formas perenes tetraplóides alógamas de M. sativa com M. falcata (Lesins & Lesins, 1979).

Dentro deste complexo, alguns autores dão uma classificação em espécies (Lesins & Lesins, 1979), outros em subespécies (Tutin, 1978; Gunn et al., 1978; Quiros & Bauchan, 1988). A classificação em subespécies é justificada pois não existem barreiras de hibridação. A única barreira para a troca de genes entre as espécies do complexo M. sativa é a ploidia, mastesta barreira pode ser suplantada pela produção de gametas diplóides não reduzidos (Quiros & Bauchan, 1988). Assim, Lesins & Lesins (1979) admitem a classificação em subespécies no que diz respeito à hereditariedade de caracteres, à fertilidade e 14

15

à sobrevida dos descendentes em condições experimentais. Diferenças morfológicas sutis resultantes de recombinações genéticas

foram utilizadas para identificar novas espécies ou subespécies. Considerando a grande variabilidade entre as espécies como M. sativa, M. faicata e M glutinosa, pode-se dizer que com a recombinação de caracteres parentais, inúmeros tipos de híbridos são produzidos (Quiros & Bauchan, 1988).

Gunn et ai. (1978) declaram nove subespécies do complexo M. sativa: sativa (2n=16=32); praefalcata (2n=16,32); caerulea (2n=16,32); glomerata (2n=16), X varia (2n=16, 32), ambigua (2n=l 6); hemicycla (2n=16, 32), faicata (2n=16, 32) e viscosa (2n=32). Quiros & Bauchan (1988), em uma revisão bibliográfica baseada essencialmente sobre a classificação de Lesins & Lesins (1979) declaram oito subespécies no complexo M. sativa: sativa (2n=32), coerulea (2n=16), falcata (2n=16, 32), X varia (2n-32), X hemicycla (2n= 16), polychroa (2n=32), X tunetana (2n=32), e glutinosa (2n=32). M. glomerata (2n=16) e M. prós trata (2n=16, 32) pertencem a outro complexo fechado. Para eles a praefalcata descrita por Gunn et al. (1978) seria a subespécie glutinosa.

Evidências citológicas e genéticas baseadas em grande número de populações diplóides_e tetraplóides de M. sativa e M. faicata mostram que elas têm um ancestral comum recente. Esta evidência justifica a interpretação de Gunn et al. (1978) de M. falcata como sendo M. sativa ssp. falcata. De modo semelhante, estudos citológicos com M. glutinosa e M. sativa autorizam a denominação M. sativa ssp. glutinosa (Quiros & Bauchan, 1988). Para estes autores existem três principais subespécies dentro do complexo: sativa, falcata, X varia e uma menos diversificada, a glutinosa. Todas estas subespécies sofreram forte evolução genética no tempo e no espaço, devido a uma grande diversificação proporcionada pela seleção natural e pelo homem.

A seguir é dada uma descrição das espécies que compõem o complexo M. sativa, segundo a classificação de Lesins & Lesins (1979) e de Quiros & 16

Bauchan(1988).

Medicago sativa L. (M. sativa ssp. sativa L. & L.)

A forma diplóide é denominada M. sativa ssp. coerulea, já M. sativa ssp. sativa é a forma tetraplóide. Esta subespécie é caracterizada por possuir flores violetas ou azuis, uma raiz pivotante, um porte ereto, vagens espiraladas. Ela é pouco dormente e tem uma tolerância variável ao frio.

A distribuição das duas formas, diplóides e tetraplóides, inclui os arredores do Mediterrâneo, o Oriente Próximo e o Oriente Médio, o Cáucaso, o sul e o centro da Ásia tom uma concentração nas montanhas e vales da Armênia, Anatólia, Irã, Afeganistão, Ásia Central, Jamm e Cachemir.

O centro de origem de M. sativa é o Oriente Próximo, Ásia Menor, Transcáucaso, Irã e as zonas altas do Turquemenistão (Michaud et al., 1988). O centro geográfico mais mencionado é o Irã. Estas regiões são caracterizadas por invernos frios e verões secos e quentes, onde os solos são bem drenados e de pH quase neutro. Estas regiões seriam o centro de origem de algumas populações que constituem toda ou parte da base de algumas variedades europeias. Alguns autores acrescentam um segundo centro, a Ásia Central (Synskaya, 1950; Bolton et al, 1972; Michaud et al, 1$88), caracterizada por clima seco e invernos amenos, de onde seriam originárias as alfafas resistentes a algumas doenças e insetos, apresentando bom crescimento em condições de seca.

Medicago falcata L. (M. sativa ssp. falcata Arcangeli)

Tem flores amarelas, porte prostrado, raízes fasciculadas, vagens retas ou em forma de foice, as vezes enroladas em uma espiral. É resistente ao frio e é caracterizada por uma remarcável dormência invernal. Ocorrem formas diplóides e tetraplóides que possuem características bioquímicas e morfológicas

17

variáveis. Considerando esta variabilidade, as formas diplóides têm recebido diferentes denominações de espécie ou subespécie: borelis, românica, altíssima, glandulosa, quasifalcata, difalcata, tenderensis e erecta.

M.falcata tem como centro de origem as regiões de estepes florestais da Ásia e da Europa, estando distribuída em zonas de climas comparáveis que vão da Europa do Norte à Sibéria (Synskaya, 1950; Bolton et ai., 1972; Small& Jomphe, 1988; Michaud et al., 1988). uma espécie normalmente espontânea. Ela é freqüente nas regiões de estepes desde a costa norte do Mediterrâneo (Bulgária, Grécia, França) até o norte da Rússia (Prosperi et al, 1995).

As formas diplóides estão distribuídas nas regiões que vão do oeste da Alemanha a leste da Sibéria e da costa sul do Mar Negro até o norte de Leningrado. Crescem de modo predominante na Europa do Norte (Small & Brookes, 1984). É uma das espécies mais adaptadas à regiões frias e aos verões secos (Quiros & Bauchan, 1988; Prosperi et ai, 1995). Ainda que as formas tetraplóides de M.falcata sejam mais freqüentes que as diplóides nas regiões de origem (Gunn et al., 1978; Lesins & Lesins, 1979), parece que elas não são tão amplamente distribuídas quanto as diplóides. M.falcata foi introduzida na Alemanha e no norte da França no século XVI (Synskaya, 1950).

Medicago glomerata Balb.

Esta espécie é caracterizada por flores de cor amarela brilhante e por vagens espiraladas cobertas de pêlos glandulares. Formas diplóides foram encontradas no sul da Europa, nos Alpes e na África do Norte. Na África do Norte, formas tetraplátdes foram também encontradas. A classificação como

M. saúva ssp. glomerata dada por Gunn et al. (1978) não se justifica devido à fraca fertilidade entre as duas subespécies (Quiros & Bauchan, 1988). 18

Medicago glutinosa M. B. (M. sativa ssp. glutinosa)

Esta é uma espécie tetraplóide caracterizada por uma corola de cor amarela brilhante a creme. As vagens são espiraladas e cobertas de pêlos glandulares. Ela é adaptada às regiões úmidas sub-alpinas do Cáucaso.

Segundo uma primeira hipótese, a ssp. glutinosa teria seus ancestrais diplóides. Entretanto, estas formas ou não existem mais ou ainda não foram encontradas. Duas outras hipóteses sugerem que a ssp. glutinosa seja o resultado da hibridação de M. glomerata e M. sativa ssp. falcata ou que ela seja originária da hibridação de M. sativa e M. falcata. Esta última hipótese é pouco provável devido aos pêlos glandulares que cobrem as vagens da subespécie glutinosa (Lesins & Lesins, 1979).

Medicago prostrata Jacq.

Formas diplóides e tetraplóides existem. Elas são caracterizadas por possuírem flores amarelas e vagens espiraladas. As vagens são similares àquelas da subespécie coerulea mas as flores se assemelham àquelas da subespécie falcata. Esta espécie é originária de regiões costeiras secas e rochosas. Ela esta distribuída do leste da Áustria e da Itália, ao longo da costa leste Adriática até a Grécia (Lesins & Lesins, 1979).

O COMPLEXO M. sativa - SUBESPÉCIES HÍBRIDAS

Devido ao grande polimorfismo que é encontrado na coloração da flor e no número de espirais de suas vagens, estas subespécies são consideradas como híbridos de M. sativa (subespécies sativa, coerulea, falcata, glutinosa) e M. glomerata (Lesins, 1968).

19

Medicago sativa ssp. X hemicycla Grossh. (2n=16,32)

Ela apresenta uma corola de cor mesclada de 8-10 mm de comprimento. Suas vagens são em forma de foice, raramente espiralada com um lúmen aberto. Estas vagens têm 5-7 mm de comprimento, não são glandulares, são lisas ou ligeiramente pubescentes. É nativa do Cáucaso (Gunn et al, 1978) e é possível que seja o resultado do cruzamento entre a subespécie falcata e a subespécie coerulea pois a variabilidade encontrada em híbridos artificiais destas duas subespécies corresponde completamente à subespécie X hemicycla (Lesins & Lesins, 1979).

Medicago sativa ssp. X varia Martin (2n=16,32)

A hibridação entre M. sativa ssp. sativa e M. sativa ssp. falcata resultou em alfafas muito vigorosas de flores de cor mesclada, que permitiram a grande expansão desta cultura na Europa do Norte e na América do Norte (Bolton et al., 1972).

Estes híbridos se caracterizam por apresentar cor de flor que varia do amarelo claro ao verde escuro passando por todas as tonalidades (do amarelo ao violeta e ao marrom) e pela forma das vagens, mais espiraladas que aquelas de M. falcata (Stebler, 1896). Segundo o mesmo autor, esta alfafa é espontânea na Alemanha e no norte da França. Entretanto, para Mayer et al. (1951) ela é encontrada em toda a França, e mais abundantemente no vale do Rhône até Provence.

Estas populações têm características intermediárias entre as duas espécies parentais o que torna difícil sua classificação. As vagens não glandulares são em forma de foice a espiralada (1,5 espirais) com um lúmen aberto fazendo um diâmetro de 7 a 12 mm e 5-12 mm de comprimento. Elas são caracterizadas pela pilosidade, de densa à fraca (Gunn et al., 1978).

20

Medicago sativa ssp. X tunetana Murbeck (2n=32)

A forma tetraplóide de M. sativa ssp. tunetana poderia ser originária de híbridos tetraploidizados entre as formas diplóides de M. sativa ssp. coerulea e M. glomerata (Quiros & Bauchan, 1988). Para Lesins & Lesins (1979), M. glomerata é um dos progenitores da subespécie. X tunetana.

Medicago sativa ssp. X polychroa Grossh (2n=32)

Esta subespécie está descrita como tetraplóide originária do cruzamento entre as subespécies sativa e glutinosa, considerando que a variabilidade encontrada na hibridação artificial entre estas duas subespécies corresponde completamente à subespécie polychroa.

As subespécies tetraplóides do complexo são diferenciadas de suas variantes diplóides por possuírem flores, vagens e sementes de tamanho maior. Estas subespécies selvagens têm grande potencial como fonte de resistência a doenças, predadores e ao estresse ambiental (Quiros & Bauchan, 1988). Populações tetraplóides são superiores às diplóides pelo tamanho de suas folhas, pelo vigor e pela produção de forragem. Além disso, elas são mais resistentes ao estresse e mais precoces na maturidade (Dunbier et al., 1975; Arbi et al., 1979; Bingham et al., 1994).

EVOLUÇÃO DO COMPLEXO M. sativa-falcata

Formas diplóides de M. glomerata teriam colonizado vastos territórios em direção leste até o Cáucaso, onde teriam provavelmente servido como ancestrais às formas diplóides do complexo. Através de um isolamento espacial

21

durante a era terciária (Parathethys, que conectava o Mar Negro e o Mar Cáspiano) duas populações ancestrais foram separadas: coerulea Qfalcata (Quiros & Bauchan, 1988).

Ao sul, as populações coerulea perderam os carotenóides e as populações falcata perderam as antocianinas de suas flores, após uma pressão de seleção exercida pela competição entre polinizadores nas novas terras isoladas. No norte, as populações da subespécie falcata adquiriram vagens retilíneas devido à seleção natural. Este caráter pode ter sido favorecido pela estepe, tipo de vegetação predominante nessa região. De fato, as vagens espiraladas se dispersam mais facilmente em ambientes abertos e menos facilmente em regiões de estepes.

Esses processos de diferenciação, ou seja, o isolamento geográfico e a possibilidade de uma transição do nível diplóide ao tetraplóide pela não redução de gametas, são provavelmente os mecanismos que permitem explicar a evolução do complexo M. saúva. Um esquema possível da evolução segundoLesins & Lesins (1979) é apresentado na Figura 1.

22

PROPAGAÇÃO E EVOLUÇÃO DAS ALFAFAS CULTIVADAS

Estima-se que desde 4.000 anos a.C. a alfafa era cultivada nos arredores do Mediterrâneo Ocidental (Bolton, 1962). Ela é encontrada em todo Oriente Médio no primeiro milênio a.C, sendo introduzida na Grécia, Mesopotâmia pelos medas 500 anos a.C. No século II a.C, ela chega na Itália e se propaga em todo o Império Romano, sobretudo na Espanha, norte da África e França. Com a invasão dos bárbaros e a queda do Império Romano (fim do século IV) seu cultivo desaparece no sul da Europa. É possível que a alfafa tenha sido reintroduzida do Oriente na Espanha e na França, via África do Norte a favor das conquistas árabes nos séculos VII e VIII. Mas, na França, seu cultivo somente se efetivou em torno dos anos 1550 (Michaud et al., 1988). Sua presença na Holanda e na Bélgica é reportada em 1565, na Inglaterra em 1650, na Alemanha e Áustria em 1750, na Suécia em 1770 e na Rússia durante o século XVIII.

Na Alemanha e no norte da França, a hibridação da subespécie sativa com a subespécie falcata permitiu enorme evolução da alfafa cultivada. Este híbrido se propagou em todo centro e norte da Europa, permitindo que a alfafa se afastasse de seu habitat seco e quente para regiões mais frias (Lesins & Lesins, 1979).

Durante o século XVI, com a colonização da América do Sul e da América Central pelos espanhóis, a alfafa foi introduzida no México e no Peru. A partir do Peru, ela chegou ao Chile, à Argentina e ao Uruguai, aproximadamente em 1775. Sua introdução na América do Norte ocorreu mais ou menos na metade do século XIX por duas vias: 1) no sul, ela veio do Chile para a Califórnia e do México para o Colorado; 2) nas latitudes mais nórdicas ela veio do norte da Europa (Michaud et al., 1988).

A subespécie sativa é relativamente rara no estado selvagem, exceto na 23

Península Ibérica onde encontram-se os "mielgas", ecótipos selvagens, rizomatosos e de porte rasteiro. Entretanto, pode, eventualmente, ser encontrada como planta isolada em acostamentos de estradas e em algumas pequenas áreas cultivadas (Delgado-Enguita, 1989, Prosperi et al., 1995). Em outras regiões mediterrâneas (sul da França, Itália, Grécia e África do Norte) encontram-se, sobretudo, os híbridos naturais entre sativa e falcata. A subespécie falcata, ao contrário, é quase unicamente espontânea. As mais importantes características levadas por esta subespécie aos tipos cultivados são a forte dormência no inverno, a resistência à seca (não confundir com aptidão para crescer em condições secas) e às doenças e o porte rasteiro ou rizomatoso (Michaud et al., 1988).

REGIÕES DE CULTIVO

Atualmente, no hemisfério norte, o cultivo da alfafa está concentrado nos Estados Unidos, Canadá, Itália, França, China e sul da Rússia e, no hemisfério sul, na Argentina, Chile, África do Sul, Austrália e Nova Zelândia. Os Estados Unidos, Rússia e Argentina totalizam 70% da superfície total mundial consagrada a alfafa (estimada em 33 milhões de hectares). A França, a Itália, o Canadá e a China possuem 17% da superfície total (Michaud et al., 1988).

Na América do Sul, a grande concentração de alfafa está na região centro-norte da Argentina, em cultivo puro e associados a gramíneas. Em torno de 4,9 milhões de ha são cultivados na região pampeana que representa mais de 90% da superfície com alfafa na Argentina (Hijano & Bacigalup, 1995). Existe, no entanto, uma substancial produção no Chile, Bolívia, Colômbia, Equador, Peru e Uruguai. No Brasil, a área total cultivada é de 26.000 ha principalmente nos estados do sul e em São Paulo (Michaud et al., 1988). Aproximadamente 80% desta área encontra-se no Rio Grande do Sul e atribui-se aos colonizadores alemães e italianos a sua introdução, por volta de 1850 24

(Saibro, 1985). Apenas uma população foi introduzida e se adaptou muito bem no sul e continua sendo cultivada: a alfafa Crioula (Oliveira et al., 1993). Esta população tem superado as cultivares introduzidas em trabalhos de avaliação, muito.embora em outros estados do Brasil, esta população não mostre a superioridade marcante que ocorre no sul do País (Paim, 1994). Com o objetivo de definir cultivares mais adaptadas, a rede nacional de avaliação de cultivares de alfafa (RENACAL) vem avaliando novas introduções nas regiões sul, sudeste e centro-oeste.

A CARACTERIZAÇÃO E AS ESTRUTURAÇÕES

O conhecimento da diversidade genética, indispensável a todo esquema de melhoramento genético, pressupõe a medida de caracteres que revelem esta diversidade e permitam a estruturação das populações. Em uma primeira aproximação, pode-se considerar que quanto mais as populações se assemelham através destes caracteres, mais seus parentescos são próximos.

Os caracteres podem ser de natureza morfológica, cromossômica, bioquímica, fisiológica etc. Caracteres que definam o contexto ecológico, geográfico e geológico onde se encontram as populações (Darlu & Tassy, 1993) podem servir de chave de interpretação (isolamento, seleção natural). Assim, o conhecimento da origem geográfica das populações pode contribuir para a interpretação da diversidade observada. É provável que ecótipos geograficamente próximos tenham mais chance de serem estreitamente aparentados que populações que estejam mais afastadas (Dudley & Davis, 1966; Lefort-Buson et al., 1988). Divergências e concordâncias podem ser obtidas para esses diferentes caracteres. A utilização de um ou de outro vai depender do nível do estudo ou da classificação desejada: evolução, taxonomia, gestão e/ou exploração da variabilidade genética (Lefort-Buson & De Vienne, 1985).

25

A diversidade genética pode ser apreciada com a ajuda de caracteres neutros ou selecionados. Em uma população, a diversidade dos caracteres neutros é o resultado da deriva genética, da migração e da mutação (Hamrick & Godt, 1989). A variabilidade de uma população, com base em caracteres selecionados, no entanto, é submetida não somente a esses eventos genéticos mas também à influência do ambiente. Quando a seleção natural é forte, ela pode mascarar a deriva, a migração ou ainda a mutação. Portanto, esses marcadores não permitem compreender o funcionamento das populações. Daí o interesse de se utilizar marcadores neutros.

Os caracteres neutros são aqueles que não são submetidos à pressão de seleção do ambiente. Esta propriedade lhes confere um grande poder discriminante, amplamente utilizável em estudos de variabilidade genética, sistemática e taxonomia. Estes caracteres são as proteínas (isoenzimas, proteínas de reserva e proteínas desnaturadas) e as seqüências de DNA. Suas avaliações são realizadas através de técnicas bioquímicas e de biologia molecular. Os primeiros são medidos por eletroforese unidimensional e bidimensional no caso de proteínas desnaturadas. Os segmentos de DNA são analisados pelas técnicas RFLP (Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição), sondas-satélites e RAPD (Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) entre outras. Alguns caracteres morfológicos podem ser neutros em relação ao ambiente.

Os caracteres morfológicos e agronômicos, apesar de sua sensibilidade às condições do meio, são os mais utilizados nas classificações. Embora estes caracteres não sejam "poderosos" para estudos genéticos, eles são fundamentais quando estudos da adaptação das populações a diferentes ambientes são desejados. A adaptação significa a evolução da estrutura da população em função do valor seletivo de seus constituintes (Birouk, 1987). A avaliação agronômica não tem nenhum valor universal e somente pode ser considerada se ela for realizada nas condições ecológicas do projeto de

melhoramento de plantas (Lourd et al., 1984). A gestão dos recursos genéticos 26

não deve visar somente marcadores neutros mas igualmente analisar a diversidade adaptativa das populações (tolerância ao estresse, capacidade de crescimento etc.) (Charmet et al., 1993).

CARACTERES MORFOLÓGICOS E AGRONÔMICOS

A maioria dos trabalhos que visam uma estruturação da alfafa perene cultivada estão baseados na caracterização morfológica e agronômica das populações (Mayer et al., 1951; Demarly, 1957;Villax, 1963; Yamada & Suzuki, 1972; Barnes et al., 1977). É desta forma que foram estudadas e estruturadas as populações mielgas e outras alfafas cultivadas na Espanha (Delgado-Enguita, 1989), populações do Marrocos (Small & Brookes, 1984; Birouk, 1987; Birouk et al., 1989; Birouk, 1993;Rumbaugh et al., 1988), as alfafas norte-africanas e da Arábia (Smith et al., 1991),) as alfafas não dormentes da índia e do Oriente-Médio (Warburton & Smith, 1993), algumas populações do complexo M. sativa na França (Julier et al., 1995, 1996). Mas as populações naturais francesas foram descritas sobretudo por Mayer et al. (1951), Demarly (1957) eClavier (1964).

Os recursos genéticos da alfafa são constituídos, por uma parte, pelas variedades inscritas nos catálogos oficiais e, por outra parte, pelas populações selvagens, ecótipos e populações regionais onde encontra-se a maior gama de diversidade.

Os diferentes sistemas de classificação dos ecótipos e das variedades de alfafa são baseados sobre numerosos caracteres morfológicos (cor da flor, forma de vagens e de sementes, sistema radicular etc), agronômicos e fisiológicos (dormência invernal, precocidade de floração, porte, rebrote após o corte, resistência à doenças e a predadores, qualidade de forragem etc.) e sobre a origem geográfica do material. A seguir são apresentados os caracteres

agromorfológicos mais utilizados. 27

COR DAS FLORES

A cor da flor do gênero Medicago é amarela mais ou menos intensa, exceção feita a M. sativa e M. daghestanica que têm flores violetas (Lesins & Lesins, 1979). A cor amarela é produzida pela presença de pigmentos flavonóides e carotenóides e a coloração violeta devido à presença de pigmentos antociânicos (Demarly, 1954; Lesins & Lesins, 1979).

O cruzamento da subespécie sativa (flores violetas) com a subespécie falcata (flores amarelas) produz plantas com flores matizadas, que vão do verde, verde-amarelo ao azul e que tornam difícil a classificação fenotípica dos descendentes (Mayer et al., 1951; Barnes, 1966; Lesins & Lesins, 1979). O matiz da flor é uma das características da presença da subespécie falcata na população. A tonalidade vai depender do conteúdo de pigmentos presentes e estes mudam com a idade da planta (Lesins & Lesins, 1979; Barnes et al., 1972). Durante a abertura da flor, a tonalidade

violeta do botão pode passar a violeta 28

Fig. 2 - Flores da alfafa perene:

a) M. sativa ssp. falcata; b) M. sativa ssp. sativa; c) no destaque, flores mati zadas resultantes do cruza mento entre as subespécies sativa (flor violeta) e falcata (flor amarela).

azulado e mesmo a azul esverdeado quando a flor já está bem aberta (Demarly, 1954). Isto deve-se a modificação no nível de flavonóides, pois foi constatado que o conteúdo de carotenóides tanto em plantas jovens como em plantas mais velhas é o mesmo. Quanto às antocianinas, pode-se eventualmente encontrar um aumento do violeta nas flores murchas (Lesins & Lesins, 1979).

O matizado da flor nas alfafas norte-européias é tradicionalmente descrito. Os tipos flamengos (flemish) como a variedade Europa, assim como alguns tipos mediterrâneos como Romagnola, Provence e Ampurdan, podem apresentar este matizado em diferentes proporções e ele esta praticamente ausente nos mielgas (Delgado-Enguita, 1989).

COMPORTAMENTO INVERNAL

As populações e variedades de alfafa têm comportamentos invernais variáveis. A resistência ao frio é caracterizada pela faculdade da planta paralisar seu crescimento sob regime de dias curtos (Demarly, 1957). A diminuição do crescimento da alfafa em dias curtos é característica das variedades dormentes no inverno. A elongação dos entrenós é reduzida (Christian, 1977).

Os tipos mediterrâneos mais próximos da subespécie saúva, como as populações de Provence (sul da França), Itália, Espanha, Argentina e Peru. apresentam a característica fisiológica de serem pouco sensíveis ao fotoperíodo. Elas têm bom crescimento invernal e as

Fig. 3 - Rebrote no inverno. a) Tipos nórdicos (flemish); b) Tipos mediterrâneos.

29

conseqüências do frio são bastante marcantes nas folhas e no colo da planta. Por outro lado, as variedades que têm uma forte introgressão da subespécie falcata entram em estado de repouso assim que termina o outono e resistem mais aos desgastes do inverno (Heinrichs et al. 1960; Heinrichs & Morley. 1960).

PORTE DA PLANTA

É, em parte, condicionado ao ambiente e também pela seleção induzida pelos métodos de cultivo. A pastagem e o pisoteio produzem um porte mais prostrado e resultam provavelmente de uma evolução genética das populações. O porte ereto foi nitidamente selecionado na domesticação. Como o modo de colheita clássico tem sido

Fig. 4 - Porte da planta,: a) M. saiiva ssp. saiiva, M. saliva ssp. falcata; b) M. sativa ssp. sativa; c) M. sativa ssp. falcata (ecótipos selvagens da subespécie sativa também apresentam este porte prostado).

30

o corte e a fenação, um porte prostrado é encontrado na maioria das alfafas selvagens (Small & Brookes, 1984). Assim, tanto os ecótipos selvagens da subespécie sativa como os falcata selvagens têm o porte prostrado (Delgado-Enguita. 1989).

Existe uma forte correlação entre a altura, o porte e a resistência das plantas ao frio. As plantas mais baixas, de porte mais prostrado ou rasteiras são mais resistentes ao frio (Larson & Smith, 1963; Smith, 1962). Isto deve-se à presença da subespécie falcata entre os progenitores.

SISTEMA RADICULAR E O CARÁTER RIZOMATOSO

As raízes da alfafa são compostas de uma raiz principal e de numerosas raízes secun-dárias. Na subes-pécie sativa, a raiz principal é robusta e pivo-

tante, com maior F i g . 5 - S i s t e m a r a d i c u l a r . s u b e s p é c i e f a l c a t a a p r e s e n t a r a i z f a s c i c u l a d a e subespécie sat iva apresenta r a i z p ivotante .

desenvolvimento

que aquele das raízes secundarias. Na subespécie falcata. as raízes são fasciculadas e mais superficiais. Não existe uma dominância remarcada da raiz principal. Nas variedades cultivadas encontra-se uma proporção variável de plantas com raízes pivotantes (Mayer et al., 1951; Villax. 1963; Heinrichs, i963;DelPozo. 1983).

Ainda que o sistema fasciculado de algumas alfafas seja ò resultado de

31

uma tendência da planta ramificar-se horizontalmente, esta ramificação se restringe à parte superior da coroa. Segundo Heinrichs (1963), existem dois tipos de sistema radicular nas alfafas que se ramificam horizontalmente: o sistema radicular rizomatoso e o sistema radicular rasteiro. A diferença entre os dois tipos não é muito nítida.

Nas alfafas rizomatosas, as hastes originárias da raiz principal se afastam lateralmente da coroa e emergem do solo como hastes vegetativas e depois reprodutivas. Estas hastes enterradas são os rizomas. As plantas rizomatosas têm uma expansão em largura e seu número de hastes é mais elevado por unidade de área.

As alfafas rasteiras resultam do aparecimento de brotos em intervalos regulares sobre as raízes horizontais. Têm expansão subterrânea e produzem rebrotes adventícios nas raízes laterais (Rodrigues & Smith, 1989). Entretanto, a dormência e o fraco rebrote após o corte são as características da maioria das alfafas rasteiras. Plantas rasteiras ou rizomatosas são encontradas mais freqüentemente em M. sativa ssp. falcata (Heinrichs, 1963). Vários trabalhos foram realizados para transferir esta característica (rasteiro) às populações não-dormentes nas regiões onde estas são mais adaptadas (Daday, 1962; Edye & Haydock, 1967), mas este caráter se transmite mal nas descendências originadas de cruzamentos entre fontes rasteiras e não-rasteiras e sua expressão é muito lenta (Daday, 1962; Heinrichs, 1963). Sobre este assunto (Prosperi, inf. pes.) mostraram que há um efeito materno remarcável sobre a hereditariedade do caráter e uma forte dominância do tipo ereto sobre o rasteiro.

HASTES, ENTRENÓS E ÉPOCA DE FLORAÇÃO

A haste é o resultado da atividade meristemática do ápice. Ela é definida longitudinalmente pelos nós e entrenós e lateralmente pelas folhas, ramificações 32

axilares e flores. O desenvolvimento da flor em alfafa é obtido pela transição do crescimento vegetativo em crescimento reprodutivo de alguns brotos. Esta transição, na primavera se produz no 10-14 nó da haste e no verão, no 6-10 nó. Esta transição é reconhecida por uma protuberância do tecido meristemático na axila do primórdio foliar mais próximo do ápice. O crescimento do ápice da haste é normalmente indeterminado e o ápice continua a diferenciar os órgãos vegetativos e florais (Barnes.e/a/., 1972).

Diferenças entre as variedades para o número de entrenós e comprimento da haste principal no início da floração foram mostradas por Shendan & McRee (1968). A posição da primeira inflorescência varia segundo o genótipo e o comprimento do dia (Christian, 1977). Em um estudo com 9 clones dormentes, a posição sobre o 14 ou 15 nó está associada a dias longos ao passo que em regime de dias curtos, a primeira inflorescência aparece no 10 nó.

Fig. 6 - Aspecto das hastes de uma população de M. sativa ssp. sativa em plena floração.

Canal (1993) mostrou que existe uma grande variabilidade genética dentro do complexo M. sativa-falcata no que diz respeito a capacidade das plantas de manterem o crescimento das hastes sob baixas temperaturas no outono. O grupo denominado "não-dormentes" se distingue dos outros genótipos estudados pela capacidade das hastes crescerem em comprimento durante o outono e inverno, enquanto que os "dormentes" crescem menos durante o inverno.

Existe ampla variabilidade genotípica de alfafa para a sensibilidade ao fotoperiodismo e à temperatura (McLaughlin & Christie, 1980; Fick et ai,

33

1988). Temperaturas elevadas provocam crescimento mais rápido e floração mais precoce. Elas aumentam o número de inflorescências mas diminuem o número de flores por inflorescência (Guy et al.t 1971). Para McLaughlin & Christie (1980), no Canadá, os genótipos com bom rendimento em temperaturas mais elevadas seriam do tipo precoce, mas produziriam poucas hastes. Ao contrário, aqueles que se comportariam melhor em baixas temperaturas seriam mais tardios e produziriam mais hastes.

RELAÇÃO FOLHA/HASTE

O valor alimentar da alfafa é primeiramente determinado por sua morfologia e em particular pela relação folha/haste. As folhas contêm mais proteínas e menos fibras que as hastes (Titgemeyer et ai., 1992) e são mais digestíveis. A diminuição da qualidade da forragem observada a medida que se aproxima a maturidade está principalmente associada à diminuição da relação folha/haste e ao aumento do teor em fibras das hastes (Sheaffer et ai., 1988). Para uma dada variedade, o estado fenológico de desenvolvimento no momento da colheita da forragem é um fator fundamental na determinação da produção, da digestibilidade e da concentração de proteínas (Lenssen et ai., 1991).

A evolução desta relação no decorrer do rebrote está ligada à dinâmica de crescimento que é condicionada pela temperatura e irradiação. As baixas temperaturas têm tendência de limitar mais fortemente o crescimento das hastes que o crescimento das folhas (Lemaire & Allirand, 1993). Assim, no outono, a relação folha/haste é mais elevada que durante o verão e primavera.

CLASSIFICAÇÕES OBTIDAS POR CARACTERES AGROMORFOLÓGICOS

As classificações normalmente se apoiam na ampla estruturação dada por Villax (1963), que, baseando-se na cor da flor, resistência ao frio, rebrote 34

após o corte e porte da planta, entre outros caracteres, classificou as populações de alfafa (variedades cultivadas e ecótipos selvagens) em cinco grupos, discutidos a seguir.

POPULAÇÕES NÃO-RESISTENTES AO FRIO

Compreendem os ecótipos distribuídos na região meridional. Estas variedades não têm um período de repouso após o corte e rebrotam sempre rapidamente. No outono, após o último corte, elas rebrotam imediatamente e fornecem um bom rendimento no inverno. Elas têm um porte ereto e as flores são uniformemente violetas. Este grupo compreende as variedades: 1) de origem africana; 2) de origem indiana; 3) de origem peruana - Estas variedades são bastante pubescentes, mas existem também tipos glabros. Elas contêm somente genitores subespécie saúva. Assemelham-se mais às introduções espanholas originais do que àquelas do Chile, introduzidas também pelos espanhóis.

Além do contínuo crescimento invernal (não-dormentes), fraca tolerância ao frio e baixa perenidade são também observadas nas populações de origem peruana, indiana, de regiões de oásis do Iraque ou do Marrocos (Yamada & Suzuki, 1972; Prosperi et ai, 1994a). Uma melhor aptidão ao rebrote no outono das populações mediterrâneas em relação aos tipos nórdicos-europeus e selvagens é mostrada por Julier et ai. (1995).

Alfafas indianas e africanas são consideradas as principais fontes de diversidade não-dormentes (Barneseíí//., 1977). Para Smith et ai. (1990), estes materiais descendem de um número limitado de introduções do Oriente-Médio e da índia. As populações do norte da índia são mais tolerantes ao frio e mais produtivas do que aquelas do oeste, geralmente semelhantes às populações do Oriente-Médio (Warbuton & Smith, 1993). As populações do

35

oeste e do sul da Arábia são fenotipicamente diferentes; as do sul mostram um rebrote mais rápido após o corte. Estes autores diferenciaram seis grupos de material não-dormente nos materiais norte- africanos, arábicos e indianos que são: 1) as populações do nordeste da África (que incluem os vales irrigados do Egito e do Sudão); 2) aquelas do oeste da Arábia Saudita; 3) aquelas do centro e do leste da Arábia Saudita, de Bahrein e do sul do Iraque; 4) aquelas do sul da Arábia (regiões de baixa altitude entre o Yemen e Oman); 5) aquelas do noroeste da índia (regiões de baixa altitude que incluem o Rajasthan) e 6) aquelas do oeste da índia.

Avaliações agromorfológicas realizadas por Smith et ai. (1991) com ecótipos provenientes do norte da África e da Península Arábica, e com algumas populações ou variedades norte-americanas cuja base genética é africana, mostraram uma grande divergência principalmente eíltre as variedades americanas e as populações do sul da Arábia, o que sugere que somente uma pequena amplitude da variabilidade da alfafa do Oriente-Médio é utilizada em seleção na América do Norte. Alfafas originárias de regiões subtropicais do sul da Arábia são interessantes para o melhoramento em regiões mais quentes (Smith et ai., 1995).

POPULAÇÕES MAIS OU MENOS TOLERANTES AO FRIO

Estas variedades originárias do sul da Europa são caracterizadas por possuírem um porte ereto ou semi-ereto, flores violetas com diferentes tonalidades. As raízes são pivotantes. Estas variedades rebrotam rapidamente. Se o inverno é ameno, elas podem se desenvolver durante todo o ano. Neste grupo podem ser classificadas algumas variedades da Espanha (Yamada & Suzuki, 1972; Delgado-Enguita, 1989), de Provence (sul da França), da Itália, da Hungria, da România, do Chile, da Argentina e da África do Sul.

36

POPULAÇÕES DO TURQUESTÃO

Estas variedades se distinguem pelo seu pequeno tamanho e seu porte mais prostrado. Suas flores são violetas. Elas exigem um período de repouso após o corte de outono e ficam por muito tempo em estado de roseta. Alguns ecótipos são mais tolerantes ao frio que outros. Após um estudo com ecótipos do Turquestão introduzidos nos Estados-Unidos, Barnes et ai. (1977) concluem que eles são cultivados no sul da Rússia, no Irã, no Afeganistão e na Turquia e acrescentam que eles têm uma fraca produção sementeira, são sensíveis às doenças foliares mas, são resistentes a vários insetos e doenças radiculares.

POPULAÇÕES COM FLORES MATIZADAS

São os híbridos entre a subespécie saúva e a subespécie falcata originárias de diversos ambientes. São ecótipos mais tardios na floração; mais de 50% dos indivíduos ficam em estado de roseta durante o inverno (Mayer, 1949), citado por Villax (1963). A proporção de tipos característicos de dias curtos aumenta à medida que se vai em direção norte. Estes híbridos são freqüentes no norte da Europa e da América; são ecótipos com forte.dormência invernal, produtivos e perenes (Yamada & Suzuki, 1972; Prosperi et ai, 1994b).

Neste grupo encontram-se as populações francesas que são classificadas em três tipos, segundo as proporções de saúva e de falcata, estimadas de acordo com os caracteres morfológicos (matizado das flores, forma das vagens e das sementes, grossura das hastes, porte e sistema radicular) e fisiológicos (precocidade na floração, crescimento invernal e resistência ao frio) (Mayer et a/., 1951): 1) alfafas de Provence - na região mediterrânea; 2) alfafas do oeste - alfafas de Poitou e alfafas de Marais de Vendée que se diferenciaram pelo seu sistema radicular. Rebischung (1954) e Demarly (1957)

37

identificaram 3 subgrupos no oeste da França: alfafa de Poitou, alfaia de Marais

de Luçon (Marais Sud, Marais Poitevin) e alfafa de Marais de Challans (Marais

Nord). 3) alfafas do norte - alfafas de hastes altas, população Flamande e um tipo de

alfafa d'Ormelong que se diferenciam pelo seu sistema radicular. As alfafas de Provence em razão de sua semi-dormência e da baixa taxa

de flores matizadas seriam preferencialmente classificadas no grupo 'Variedades mais ou menos resistentes ao frio" seguindo o raciocínio de Villax.

POPULAÇÕEvS COM FLORES AMARELAS

Todas as populações que pertencem a este grupo são da subespécie falcata e a maioria é selvagem. Elas são conhecidas pela sua extrema tolerância ao frio, seu porte rasteiro e sua resistência a algumas doenças foliares (Barnes £/«/., 1977).

As populações cultivadas (subespécie saúva) são facilmente distinguíveis das selvagens da subespécie saliva e subespécie falcata pelo porte ereto, rebrote rápido após o corte, altura elevada e superior rendimento. Somente a cor das flores permitiu distinguir as populações selvagens saúva da Espanha ("mielga") de flores violetas das populaçõesfalcata de flores amarelas (Julier et ai., 1995). Para Delgado-Enguita (1989), os "mielgas" deveriam ser incluídos no grupo de alfafas rizomatosas. Elas são dormentes no inverno, têm um porte prostrado, hastes finas, uma forte relação folha/haste, tolerantes às viroses, alto teor em sementes duras e tolerância ao estresse hídrico e aos solos calcáreos.

Barnes et ai. (1977) descrevem nove fontes diferentes de variabilidade genética introduzidas nos Estados Unidos entre 1850 e 1947 e utilizam como critérios a origem geográfica, a dormência e o matizado da flor. Para eles, 38

representam a maior parte da diversidade genética das variedades cultivadas atualmente. Por ordem decrescente de resistência ao frio, elas são: M.falcata, Ladak, M. varia, do Turquestão, Flamengas, Chilenas. Peruanas, Indianas e Africanas. Observa-se efetivamente que esta classificação recobre aquela de Villax (1963). M.falcata corresponde ao grupo "variedades de flores amarelas". Ladak é uma fonte particular, originária do Cachemir, do norte da índia, muito utilizada na América do Norte: As flores amarelas e a dormência invernal sugerem que a subespécie falcata é o componente maior na sua ascendência

Fig. 7 - Vagens de Medicago saíiva. Vagens retas e em forma de foice de M. sativa ssp. falcata e vagens espiraladas de M. sativa ssp. sativa.

genética. M. varia corresponde ao grupo "variedades matizadas" de Villax, que incluem também as Flamengas. As fontes do Chile, Peru, índia e África correspondem ao tipo mediterrâneo, variedades não dormentes, não tolerantes ao frio.

Estas classificações, realizadas em condições climáticas diferentes, trazem informações específicas. No entanto, elas são concordantes no que diz respeito

39

ao valor discriminante de alguns caracteres como: dormência, tolerância ao frio, longevidade e cor da flor.

OS MARCADORES NEUTROS E AS CLASSIFICAÇÕES

Entre os marcadores neutros, serão descritos aqueles do tipo proteico e os do polimorfismo de fragmentos de DNA (RFLP e RAPD) ainda que os marcadores moleculares não tenham sido, até o momento, largamente estudados no complexo M. sativa-falcata.

MARCADORES DO TIPO PROTÉICO

Os métodos bioquímicos, como a análise de proteínas e de isoenzimas, foram amplamente utilizados no estudo do polimorfismo de várias espécies. Entretanto, a principal limitação destas técnicas é o limitado polimorfismo que elas são capazes de detectar entre populações próximas. Numerosos estudos do polimorfismo enzimático mostram que para alguns lócus, as populações parecem bastante polimorfas (caso das esterases e peroxidases), enquanto que para outros, elas parecem muito homogêneas ou pouco variáveis (Pernès &Lourd, 1984).

As isoenzimas foram os primeiros marcadores bioquímicos utilizados em estudos de genética de populações (Hedrick et ai., 1976; Lefort-Buson et ai., 1988). No entanto, a neutralidade das isoenzimas frente aos efeitos da seleção do meio ambiente tem sido questionada, pois frequentemente encontram-se associações entre variação morfológica e variação isoenzimática devido a ligações entre genes (Lefort-Buson et ai, 1988) e, sobretudo, devido a correlações entre freqüência de alguns alelos e dados climáticos como foi mostrado por Lumaret (1984) em Dactyle. Mas, para Chaulet (1995), na

maioria dos casos nenhuma correlação existe entre os dados enzimáticos e os 40

parâmetros morfológicos. Os primeiros estudos de proteínas com algumas espécies de Medicago

foram realizados por Przybylska & Hurich (1971), depois outros estudos se seguiram com algumas espécies anuais e/ou perenes (Bingham & Yet, 1971; Damerval, 1983;Quiros, 1980,1982,1983). Marcadores protéicos permitiram igualmente a identificação de diferentes híbridos: M. sativa - M.falcata (Miller et ai., 1972), M. sativa - M. glutinosa (Mariani et ai., 1978). Por outro lado, eles foram também utilizados em estudos de filogenia. Mariani et ai. (1978) mostraram a existência de um ancestral comum entre M. sativa e M. glutinosa. Quiros (1983) pesquisou ancestrais de variedades de alfafa do complexo M. sativa-falcata. De Vienne (1978), em um estudo sobre a variabilidade de várias famílias tetraplóides de M. sativa, mostrou que a análise enzimática do pólen discrimina melhor as famílias aparentadas que os marcadores biométricos. O determinismo genético de sistemas enzimáticos de M. sativa ssp. coerulea e M. sativa ssp. sativa foi estudado por Brunel (1982).

Estes marcadores também foram amplamente utilizados em estudos de diversidade genética. As avaliações realizadas por isoenzimas sugerem que os genótipos Africanos, Chilenos e Flamengos têm tanto M. sativa ssp. sativa como M. sativa ssp. falcata entre seus genitores (Quiros, 1983).

Em um estudo com 20 populações tradicionais de alfafa do Marrocos, de cinco origens geográficas diferentes, Birouk & Dattée (1989) mostraram que a variedade Europe é diferente de um grupo de materiais mediterrâneos (africanas, Moapa, Provence e populações marroquinas) e se aproxima de dois ecótipos espanhóis do tipo "mielga". As variedades Moapa e as africanas se diferenciam das populações marroquinas, Birouk (1993) estudou o polimorfismo enzimático de três sistemas (-amilase, leucina-amido-peptidase e peroxidase) correspondendo a cinco locus. Ele mostrou que dois grupos correspondiam a dois pools gênicos diferentes. O primeiro, composto por populações de Demnate e o outro por populações provenientes de oásis e de

montanhas. Aumentando o número de locus estudado para mais três outros 41

sistemas (fosfoglucomutase, fosfoglucoisomerase e isocitrato desidrogenase), ele pode comparar estas populações com outras originárias sobretudo da África do Norte e concluir que as populações de Demnate seriam mais aparentadas às origens européias e que as populações de montanha e oásis seriam mais representativas do tipo africana.

A análise de 60 variedades de diversas origens através de isoenzimas mostrou uma boa estruturação, exceto algumas variedades do tipo Flamenga e Chilena que revelaram possuir somente progenitores da ssp. sativa e a presença de alelos característicos de M. sativa ssp. falcata em algumas alfafas africanas (Barnes et ai, 1977). Estes resultados podem parecer surpreendentes pois M. sativa ssp. falcata é conhecida como uma subespécie originária do norte.

MARCADORES RFLP {RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM)

A técnica RFLP (Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição) se resume em duas etapas principais: a digestão do DNA por uma enzima endonuclease que reconhece as seqüências específicas de DNA (sítio de restrição) seguida de uma hibridização com a ajuda de uma sonda marcada. O polimorfismo é definido pela dupla enzima-sonda. Este polimorfismo pode ser devido a mutações pontuais, adições, deleções ou recombinações de fragmentos de DNA terminando seja na perda de um sítio de restrição seja na criação de um novo sítio de restrição (Soller & Beckman, 1983; Beckman & Soller, 1986; Thormann & Osborn, 1992).

Os RFLPs são utilizados na construção de mapas genômicos, na pesquisa de grupos de ligação, no desenvolvimento de árvores filogenéticas e na etiquetagem cromossômica. Estes marcadores têm a vantagem de serem co-dominantes e muito polimorfos. Ainda que estes marcadores foram por muito tempo considerados como marcadores neutros, hoje sabe-se que eles podem 42

igualmente marcar caracteres agronômicos que podem ser selecionados. Entretanto, a técnica RFLP é laboriosa e por muito tempo exigiu a utilização de material radioativo. A marcação com sondas "frias" é relativamente recente.

Em alfafa, esta técnica foi sobretudo utilizada na construção de mapas genéticos de diplóides: a partir de populações segregantes em Fl obtidas pela hibridação entre M. sativa ssp. quasifalcata e M. sativa ssp. coerulea (Kiss et ai, 1993), entre M. sativa ssp. sativa e M. sativa ssp. coerulea (Brummer et ai., 1993), a partir de uma população diplóide retrocruzada originárias de genitores não aparentados (Echt et ai., 1993).

Esta técnica tem servido, igualmente, aos estudos de variabilidade genética. Brummer et ai. (1991) mostraram em populações diplóides de M sativa ssp. falcata e ssp. coerulea e em algumas variedades tetraplóides da ssp. sativa (Florida 77, Apollo, Spredor2), que a variabilidade intra-populações era superior à variabilidade interpopulações.

Sobre os nove germoplasmas introduzidos nos Estados Unidos, descritos por Barnes et ai. (1977), Kidwell et ai (1994) estudaram a diversidade genética no interior e entre as populações. As análises mostraram um forte polimorfismo no interior dos ecótipos, entretanto muito pouco polimorfismo foi encontrado entre os ecótipos. Ainda que os indivíduos de M. falcata e dos Peruanos tenham formado grupos distintos, os genótipos dos outros materiais não foram claramente distinguidos.

MARCADORES RAPD {RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA)

Os marcadores RAPD foram propostos por Welsh & McClelland (1990) e Williams et ai. (1990). Eles são derivados da técnica PCR - Polymerase Chain Reaction (Mullis et ai., 1986; Saiki et ai., 1988) e são amplamente utilizados no estudo do polimorfismo do genoma (Caetano-Anollés et ai., 1991; Thormann & Osborn, 1992). O fundamento do RAPD é a amplificação de

43

fragmentos de DNA de 100 a 2000 pb utilizando-se primers de pequeno tamanho (8 a 10 nucleotídeos), de seqüência aleatória e uma DNA polimerase de origem bacteriana (Taq).

O principal inconveniente dos marcadores RAPD reside no fato de tratar-se de marcadores dominantes que não mostram o estado heterozigoto: os indivíduos contendo duas cópias de um dado alelo não são distinguíveis daqueles que contenham somente uma cópia do alelo (Williams et ai., 1990; Michelmore et ai, 1991).

Em razão dos limites da técnica RAPD, quando um grande número de indivíduos deve ser examinado, análises RAPD sobre DNA reagrupado (mistura de DNA de vários indivíduos) foram utilizados (Michelmore et ai, 1991; Yu & Pauis, 1993c). Para Sweeney & Danneberger (1994), os produtos amplificados obtidos áepools de DNA não refletem a diversidade no interior das populações. De fato, níveis elevados de variabilidade genética são encontrados no interior de populações de espécies alógamas, perenes, amplamente difundidas e com alta taxa de fecundidade (Lovelles & Hamrick, 1984).

No género Medicago, marcadores RAPD foram utilizados para a construção de mapas genômicos de diplóides (Echt et ai, 1991; Echt et ai., 1993; Kiss et ai., 1993), em análise da variabilidade genética de espécies diplóides anuais (Brummer et ai., 1995; Bonina ai, 1996) e na caracterização de espécies lenhosas (Chebbi et ai., 1995). A utilização destes marcadores em tetraplóides é mais rara. Eles são encontrados na marcação de genes (Yu & Pauis, 1993a), na construção de mapa genômico (Yu & Pauis, 1993b), na avaliação das relações genéticas entre algumas populações cultivadas (Yu & Pauis, 1993 c) e no estudo da variabilidade genética de algumas populações selvagens e cultivadas (Crochemore et ai., 1996).

No que concerne a variabilidade genética de populações tetraplóides

do complexo M. sativa, poucos trabalhos foram publicados até a presente 44

Fig. 8 - Ilustração do perfil eletroforético do DNA amplificado pela técnica RAPD de 30 indivíduos da variedade Sabre

45

Fig. 9 - Percentagem de plântulas de algumas variedades de alfafa perene (Medicago sativa L.) apresentando diferentes marcadores RAPD 46

data. Yu & Pauis (1993c) trabalharam com três variedades (Du Puits, Peace, Anik) e quatro populações em seleção (VO, V3. PO, P3), utilizando misturas de DNA de 5 a 7 plantas. Dos 100 primers testados. 25 mostraram bandas polimórficas intra e inter populações. Cada primer gerou de uma a 12 bandas. O tamanho dos fragmentos amplificados variaram de 300 pb a 3500 pb. As distâncias entre as populações mostraram que .Anik (100% falcatd) é muito diferente de Du Puits e de Peace ou VO que têm sativa e falcata na sua composição genética.

Crochemore et ai. (1996) avaliaram, através da técnica RAPD, a variabilidade genética de 26 populações selvagens e cultivadas originárias de diferentes regiões geográficas, tipos nórdicos e mediterrâneos. A análise do polimorfismo efetuada sobre 737 indivíduos provenientes daquelas populações, através de quatro primers revelaram uma forte variabilidade intrapopulação que representa mais de 50% da variação total. As subespécies foram facilmente caracterizadas e a origem geográfica das populações fracamente detectada. Estes caracteres neutros mostraram que populações com forte introgressão da subespécies falcata têm uma variação intra mais forte. Estes autores declaram que o método RAPD é eficiente na distinção e estruturação dos recursos genéticos da alfafa perene.

47

CONCLUSÃO

Existe enorme reservatório de diversidade genética disponível em alfafa perene tetraplóide, onde uma forte variação intra e interpopulações é obser-vada. As prospecções, portanto, devem também abranger a variabilidade que existe no interior das populações. Ecótipos oriundos do sul da Europa (Espanha, França, Itália), de origem africana, indiana, chilena e peruana, de porte ereto, de contínuo crescimento invernal (não dormentes), de bom rendimento, que rebrotam rapidamente após o corte constituem-se em importante fonte de recurso genético para a seleção, melhoramento e desenvolvimento da alfafa no Brasil.

48

BIROUK, A. et ai. Evaluation agronomique et adaptation de populations marocairies de luzerne {Medicago saúva L.). Agronomie, 9:363-376,1989. BOLTON, J.L. Alfalfa botany,

cultivation and utilisation. London, LeonardHill, 1962. 474p. BOLTON, J.L.; GOPLEN B.P.,

BAENZIGER H. World distribution and historical developments. In: HANSON. C.H. ed. Alfalfa science and technology. Madison, ASA, 1972. (Agronomy, 15)

BONNIN, I. et ai. High levei of polymorphism and spatial structure in a selfing plant species, Medicago truncatula (Leguminosae), using RAPD markers. Amer. J. Bot, 83:843-855,1972. BRUMMER,

E.C.; BOUTON, J.H. Plant traits associated with grazing-tolerant alfalfa. Agron. J., 83:996-1000,1991.

BRUMMER, E.C.; BOUTON, J.H.; KOCHERT, G. Development of an RFLP map in diploid alfalfa. Theor. Appl. genet., 86:329-332, 1993. BRUMMER, E.C.; BOUTON, J.H.; KOCHERT, G.

Analysis of annual Medicago species using RAPD markers. Genome, 38:365- 367, 1995. '

BRUNEL, D. Mise en évidence de 4 locus enzymatiques chez Ia luzerne {Medicago sativa L.) di- et tétraploide. Agronomie, 2:133- 148, 1982. CAETANO-ANOLLES, G.; BASSAM, B.J.;

GRESSHOFF, P.M. DNA amplifícation fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant. Mol. Biol. Rep., 9:294-307, 1991. CANAL, A. Etude de

Ia variabilité génétique chez Ia luzerne {Medicago sativa L.) pour Ia repousse d'été et Ia repousse d'automne. Saragosse, Institut Méditerranéen de Saragosse (Espagne), 1993. 92p. (Mémoire de Master) CHARMET, G.;

BALFOURIER, F.; RAVEL, C. Isozyme polymorphism and geographic differentiatio» in a collection of French perennial ryegrass populations. Genetic Resources and Crop Evolution, 40: 77-89,1993. CHAULET, E.M. Diversité

génétique de populations naturelles de luzernes annuelles {Medicagosp.) d'Algérie une espèce modele:

50

M. truncatula Gaertn. Montpellier, Ecole Nationale Supérieure Agronomique de Montpellier, 1995. 127p. (Thèse Doe.) CHEBBI,

H. et ai. Caractérisation morphologique et moléculaire des espèces ligneuses du. genre Medicago. Fourrages, 142: 191-206, 1995. CHRISTIAN, K.R. Effects of the environment on the

growth of alfalfa. Adv. Agron., v. 29:183-227, 1977. CLAVIER, C. Le

potentiel de Ia luzerne "Provence". Ann. Amélior. Plant, 14: 271-294, 1964. CROCHEMORE, M.L. et ai.

Partitioning and distribution of RAPD variation in a set of populations of the Medicago sativa complex. Agronqmie, 16:421-432, 1960. DADAY, H. Breeding for creeping

root in lucerne {Medicago sativa L.). I. The initial response to selection. Aust. J. Agric. Res., 13:813-823, 1962. DAMERVAL, C. Comparaison de six espèces de

luzernes annuelles à 1'aide de caracteres biométriques et enzymatiques. Agronomie, 3:971-982, 1983. DARLU, P. ; TARLU, P. La reconstruetion

phylogénétique: concepts et méthodes. Paris, Masson, 1993. 245p. (Collection Biologie Théorique, v.7) DELGADO-ENGUITA, I. Estúdio de Ia

variabilidad de Ias mielgas aragonesas en áreas de precipitacion anuaUinferior a 600 mm. Madrid, Universidad Politécnica de Madrid, 1989. 168p. (PhD Thesis) DEL POZO, M. La alfalfa: su cultivo y aprovechamiento.

Madrid, Mundi Prensa, 1983. 380p. DEMARLY, Y. Etude de 1'hérédité de

Ia bigarrure de Ia fleur chez Ia luzerne. Ann. Amél. Plant., 1:5-20, 1954. DEMARLY, Y. Biologie

et exploitation de Ia luzerne. Ann. Amél. Plant, 3:247-272, 1957. DE VIENNE, D. Variabilité chez une

espèce tétraploide: analyse isoenzymatique et biométrique du pollen de quelques familles apparentées de luzerne. Ann. Amélior. Plantes, 28:289-307,1978.

51

DUNBIER, M.W. et ai. Performance of genetically comparable diploid and tetraploid alfalfa: agronomic and physiological parameters. Crop Sei., 15:211-214, 1975. DUDLEY, J.W.; DA

VIS, R.L. Preliminary groupings of plant introduetions of alfalfa (Medicago sativa, L.) for heterosis studies. Crop Sei., 6:597-600, 1966. ECHT, C.S.; ERDAHL, L.A.;

McCOY, T.J. Genetic segregation of random amplifíed polymorphic DNA in diploid cultivated alfalfa. Genome, 35:84-87,1991. ECHT, CS. et ai. Linkage mapping

in diploid alfalfa {Medicago sativa). Genome, 37:61-71, 1993. EDYE, L.A.; HAYDOCK, K.P.

Breeding creeping-rooted lucernne for the subtropies. Aust. J. Agric. Res., 18:891-901, 1967. FICK,

G.W.; HOLT, D.A.; LUGG, D.G. Environmental physiology and crop growth. In: HANSON, A.A. Alfalfa and alfalfa improvement. Madison, ASA, 1988. p. 163-194. (Agronomy, 29) GUNN, C. R.; SKROLA, W.H.; SPENCER, H.C.

Classification of Medicago sativa L. using legume characters and flower colors. Washington, U.S. Government Printing Office, 1978. 84p. (USDA-ARS, Tech. Buli. 1574) GUY, P.; BLONDON, F.;

DURAND, J. Action de Ia température et de Ia durée d'éclairemè*ht sur Ia croissance et Ia floraison de 2 types éloignés de luzerne cultivée, Medicago sativa L. Ann. Amélior Plant, 21:409-422, 1971. HAMRICK, J.L.; GODT, M.J.W.

Allozyme diversity in plant species. In: BROWN, A.H.D.; CLEGG, M.T.; KAHLER, A.L.; WEIR, B.S., eds. Plant population geneties, breeding, and genetic resources. Sunderland, MA-USA, Sinauer, 1989. p.43-63.

HEDRICK, P.W.; GINEVAN, M.E.; EWING, E.P.t Genetic polymorphism in heterogeneous environments. Ann. Rev. Ecol. Syst, 7:1-32, 1976. HEINRICHS, D.H. Creeping alfalfas. Adv.

Agron., 15:317-337, 1963.

52

HEINRICHS, D.H.; MORLEY, F.H.W. Inheritance of resistance to winter injury and its correlation with creeping-rootedness in alfalfa. Can. J. Plant Sei., 40:487-489, 1960. HEINRICHS, D.H.;

TROELSEN, J.E.; CLARK, K.W. Winter hardiness evaluation in alfalfa. Can. J. Plant Sei., 40:638-644, 1960. HEYN, C.C. The annual species of Medicago.

Scripta hierosolymitana. Jerusalém, Pub. of the Hebrew University, 1963. 154p. HIJANO, E.; BACIGALUP, D. El cultivo de Ia alfalfa

em Ia República Argentina. In: HIJANO, E.; NAVARRO, A., eds. La alfalfa em Ia Argentina. s.l., INTA. Subprograma Alfalfa, 1995. p. 12-18. IVANOV, A.I. History, origin and evolution of the

genus Medicago, subgenus Falcago. Buli. Appl. Bot. Genet. Select, 59:3-40, 1977.

JULIER, B. Traditional seed maintenance and origins of the French lucerne landraces. Euphytica, 92:353-357, 1996. JULIER, B. et ai

Genetic variability for morphology, growth and forage yield among perennial diploid and tetraploid populations {Medicago sativa L.). Agronomie, 15:295-304, 1995. KIDWELL,

K.K.; AUSTIN, D.F.; OSBORN, T.C. RFLP evaluation of nine Medicago accessions representing the original germplasm sources for North American alfalfa cultivars. Crop Sei., 34:230- 326, 1994. KISS, G.B. et ai. Construction of a basic genetic map for

alfalfa using RFLP, RAPD, isozyme and morphological markers. Mol. Gen. Genet., 238: 129-137, 1993. LARSON, K.L.; SMITH, D.

Association of various morphological characters and seed germination with the winter hardiness of alfalfa. Crop Sei., 3:234-237, 1963. LEFORT-BUSON, M.; DE

VIENNE, D. Distances génétiques: estimations et applications. Versailles, De Vienne/INRA, 1985. 184p.

53

LEFORT-BUSON, M; HEBERT, Y.; DAMERVAL, C. Les outils d'évaluation de Ia diversité génétique et phénotypique. Agronomie, 8:73-178,1988. LEMAIRE, G.; ALLIRAND, J.M. Relation entre

croissance et qualité de Ia luzerne: interaction génotype-mode d'exploitation. Fourrages, 134:183-198, 1993. LENSSEN, A.W. et ai. Basic

alfalfa germplasms differ in nutritive content of forage. Crop Sei., 31:293-296, 1991. LESINS, K.

Interspecific crosses involving alfalfa, Medicago glomerata x M. sativa with reference to M. prostrata. Can. J. Genet. Cytol., 10:536-544, 1968. LESINS, K.; GILLIES, C.B.

Taxonomy and cytogenetics of Medicago. In: HANSON, C.H., ed. Alfalfa science and technology. Madison, ASA, 1972. p. 53-85. (Agronomy, 15)

LESINS, K.; LESINS, I. Genus Medicago (Leguminosae): a taxogenetic study. TheHague, Junk,1979. 228p. LOURD, M.

et ai. Evaluation. In: GESTION des ressources génétiques des plantes. Paris, Manuel Lavoisier Tec et Doe, 1984. Tome 2 p.137-189. LOVELESS, M.D.; HAMRICK, J.L.

Ecological determinants of genetic structure in plant populations. Ann.Rev.Ecol.Syst., 15: 65- 95, 1984. LUMARET, R. Structure génétique d'un complexe

polyploide: Dactylis glomerata L. Languedoc, Université des Sciences et Techniques duLanguedoc, 1981. 168p. (Thèse Doe.) MARIANI,

A.; ARCIONI, S.; VERONESI, F. Cytological analysis and electrophoretic patterns of seed proteins in M. sativa, M. glutinosa and their hybrids. Genet. Agrar., 32:21-29, 1978.

MAYER, R. Les facteurs de Ia différenciation écotypique, leur importance pour le sélectionneur. In: Ass. fr.t Avancem. Sei. Congrès, 68., Clermont-Ferrand, 1949. p.133-134. MAYER, R.;

VINCENT, A.; ECOCHARD, R. Les populations françaises de luzerne: caractérisation - zones de culture - valeur culturale. Ann. Amélior. Plant., 2: 1-46, 1951.

54

MCLAUGHLIN, R.J.; CHRISTIE, B.R. Genetic variation for temperature reponse in alfalfa (Medicago sativa L.). Can. J. Plant Sei., 60:547-554, 1980. MICHAUD, R.; LEHMAN, W.F.;

RUMBAUGH, M.D. World distribution and historical development. In: HANSON, A.A., ed. Alfalfa and alfalfa improvement. Madison, ASA, 1988. p. 25- 91. (Agronomy, 29) MICHELMORE, R.W.; PARAN, L; KESSELI,

R.V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis: a A rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:9828-9832,1991. MILLER, M.K.; SCHONHORST,

M.H.; MCDANIEL, R.G. Identification of hybrids from alfalfa crosses by electrophoresis of single seed proteins. Crop Sei., 12:535-537, 1972. MULLIS, K.B. et

ai. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263-273, 1986. NÈGRE, R. Les luzernes du

Maroc. Cher, Travaux Inst. Sc. Cher, Serv. Bot. 1956. 116p. OLIVEIRA, P.R.D. DE; PAIM, N.R.;

CZERMAINSKI, A.B.C. Seleção para rendimento e qualidade da foragem em alfafa Crioula. Pesq.Agr.Bras., 28(9): 1039-1044, 1993. PAIM, N.R. Utilização e

melhoramento da alfafa. In: WORKSHOP SOBRE O POTENCIAL FORRAGEIRO DA ALFAFA (Medicago sativa L.) NOS TRÓPICOS, Juiz de Fora, 1994. p.141-147.

PERNÈS, J.; LOURD, M. Organisation des complexes d'espèces. In: GESTION des ressources génétiques des plantes. Manuel Lavoisier TecetDoc, 1984. Tome 2, p.7-106. PROSPERI, J.M. et ai.

Growth rythm and habit in lucerne genetic study of erect x prostrate hybrids. In: Eucarpia - Série Technique REUR36, 1994a. p.78-80. PROSPERI, J.M. et ai. Genetic

variation for growth rythms in lucerne, in two contrasted and cold mediterranean environments. In: Eucarpia. Série Technique REUR 36, 1994b. p.103-105.

55

PROSPERI, J.M. et ai. Les luzernes ou le genre Medicago. In: RESSOURCES génétiques des plantes fourragères et à gazon. Lavoisier, coed BRG INRA, 1995. 180p. PRZYBYLSKA, J;

HURICH, J. The use of basic and acid gel systems in disc electrophoretic studies of seed proteins of some Medicago species. Buli. Acad. Polon. Sei. Sect. Sei. Biol., 19:31- 36,1971. QUIROS, CF. Identification of alfalfa plants

by enzyme electrophoresis. Crop Sei., 20:262-264, 1980. QUIROS, CF.

Tetrasomic segregation for multiple alleles in alfalfa. Genetics, 101: 117-127, 1982. QUIROS, CF. Alfalfa,

luzerne {Medicago sativa L.). In: TANKSLEY, S.D.; ORTON, T.J. Isozymes in plant genetics and breeding. Amsterdam, Elsevier, 1983 Part b, p.253-294. QUIROS,

CF. ; BAUCHMAN, G.R. The genus Medicago and the origin of the Medicago sativa complex. In: HANSON, A.A.; BARNES, D.K.; HILL Jr., R.R. eds. Alfalfa and alfalfa improvement. Madison, 1988. p.93-124. (Agronomy, 29)

REBISCHUNG, J. Les populations de luzerne de 1'ouest de Ia France. Extrait des Annales de 1'Université, Actes du 73e Congrès de 1'AFAS, Poitiers, 1954. 2ème série, n.5, p.l. RODRIGUES,

G.H.S.; SMITH, S.E. Evaluation of screening procedures for breeding creeping-rooted alfalfa. Crop Sei., 29:28- 230, 1989. RUMBAUGH, M.D.; GRAVES, W.L.;

MOHAMMAD, R.M. Variability in a collection of alfalfa germplasm from Morocco. Crop Sei., 28:605-609, 1988. SAIBRO, J.C Produção de

alfafa no Rio Grande do Sul. In: SIMPÓSIO SOBRE MANEJO DE PASTAGENS, 7., 1984, Piracicaba, SP. Anais... Piracicaba, FEALQ, 1985. p.61-106.

SAIKI, R.K. et ai. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a termostable DNA polymerase. Science, 239:487-491, 1988.

SHEAFFER, C.C; LACEFIELD, G.D.; MARBLE, V.L. Cutting schedules and stands. In: HANSON, A.A.; BARNES, D.K.; HILL,

56

R.R. Jr., eds. Alfalfa and alfalfa improvement. Madison, ASA, 1988. (Agronomy, 29) SHERIDAN, K.P.; MCKEE, G.W.

Varietal diffrences in intemode number and length in ten varieties of alfalfa. Crop Sci., 8:289-290, 1968. SMALL, E. A numerical analysis of major groupings in

Medicago employing traditionally used characters. Can. J. Bot., 59:1553- 1577,1981. SMALL, E.; BROOKES, B. Taxonomic

circumscription and identification in the Medicago sativa-falcata (alfalfa) continuum. Economic Botany, 38:83-96, 1984. SMALL, E.; JOMPHE, M.

A synopsis of the genus Medicago (Leguminosae). Can. J. Bot., 67:3260-3294, 1988. SMITH, S.E.;

AL-DOSS, A.; WARBURTON, M. Describing variation in very nondormant alfalfa germplasm-beyond 'African' and 'Indian'. In: REPORT OF THE THIRTY-SECOND NORTH AMERICAN ALFALFA IMPROVEMENT CONFERENCE, Washington, 1990. 22p. SMITH, S. E.; AL-DOSS, A.;

WARBURTON, M. Morphological and agronomic variation in north African and Arabian alfalfas. Crop Sci., 31:1159-1163, 1991. SMITH, S.E. Morphological and

agronomic affinities among middle eastern alfalfas - Accessions from Oman and Yemen. Crop Sci., 35:1188-1194,1995. SOLLER, M.; BECKMAN, J.S. Genetic

polymorphism in varietal identification and genetic improvement. Theor. Appl. Genet, 67:25-33, 1983. STANFORD, E.H.; CLEMENT, W.M.;

BINGHAM, E.T. Cytology and evolution of the Medicago sativa-falcata complex. In: HANSON, C.H., ed. Alfalfa science and technology. Madison, ASA, 1972. p.87-101. (Agronomy, 15) STEBLER, F.G. Les

meilleures plantes fourragères. Berne, 1986. 2ème partie. l00p.

57

SWEENEY, P.M.; DANNEBERGER, T.K. Random Amplified Polymorphic DNA in Perennial Ryegrass: a comparison of bulk samples vs. individuais. HortScience, 29:624-626, 1994.

SYNSKAYA, E.N. Die Luzerne, Medicago L. - E.M. Kulturnaja flora SSSR, 13: 1-217, 1950.

THORMANN, CE.; OSBORN T.C. Use of RAPD and RFLP markers for germplasm evaluation. In: Applications of RAPD Technology to plant breeding. Joint Plant Breeding Symposia Series, Minnesota, USA., 1992. p. 9-11.

TITGEMEYER, E.C.; BOURQUIN, L,.D.; FAHEY, G.C.Jr. Disappearance of cell wall monomeric components from fractions chemically isolated from alfalfa leaves and stems following in-situ ruminai digestion. J.Sci.Food Agric, 58:451-463, 1992.

TUTIN, T.G. Flora Europea. Cambridge, Cambridge University, 1978. v.12, 445 p.

TWAMLEY, B.E. Flower colour inheritance in diploid and tetraploid alfalfa. Can. J. Agric. Sci., 35:461-476, 1955.

VILLAX, E.J. La culture des plantes fourragères dans la région méditerranéenne occidentale. Rabat, INRA, 1963. 64lp.

WARBURTON, M.L.; SMITH, S.E. Regional diversity in nondormant alfalfas from índia and the Middle East. Crop Sci., 33:852-858, 1993.

WELSH, J.; MCCLELLAND, M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res., 18:7213-7218, 1990.

WILLIAMS, J.G.K. et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res., 18: 6531-6535,1990.

YAMADA, T.; SUZUKI, S. Classification of alfalfa cultivars by the clustering method based on quantitative characters: its significance in the introduetion and conservation of genetic resources. In: MATSUO, T., ed. Gene conservation.. v.5 p. 137-145, 1972.

YU, K.; PAULS, &.P. Rapid estimation of genetic relatedness among heterogeneous populations of alfalfa by random amplification of bulked genomic DNA samples. Theor. Appl. Genet., 86:788-794, 1993a.

58

YU, K.; PAULS, K.P. Segregation of random amplified polymorphic DNA markers and strategies for molecular mapping in tetraploid alfalfa. Genome, 36:844-851, 1993b. YU, K.; PAULS, K.P.

Identification of a RAPD marker associated with somatic embryogenesis in alfalfa. Plant Mol. Biol., 22:269- 277, 1993c.

AGRADECIMENTOS

A autora agradece ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico o apoio recebido para a condução deste trabalho.

59

BASES FÍSICAS DO IAPAR

ANTONINA Estação Agrometeorológica Cx. Postal 34 ■ CEP 83370000 APUCARANA Estação Agrometeorológica Fone: (043) 422-0022 BANDEIRANTES Estação Agrometeorológica Fone: (043)742-1123 BELA VISTA DO PARAÍSO Estação Agrometeorológica Patrim. S. Margarida ■ Av. Indianópolis, s/n Cx. Postal 285- C E P 86130-000 CAMBARÁ Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Rod. BR 369 - a 5 km de Cambará Cx. Postal 195- C E P 86390-000 Fone/Fax: (0431 732-1343 CAMPO M0URÃ0 Laboratório de Análise de Solos Av. João Bento,486 CEP87300030 Fone: (044)823-1172 CÂNDIDO DE ABREU Estação Agrometeorológica Fone: (043) 476-1222 CASCAVEL Laboratório de Análise de Solos R. Piquiri, s/n (junto à SEAB) Cx. Postal 1203 CEP 85809-030 Fone: (045) 223 0445 Estação Agrometeorológica Fone: (045) 223 3536 CERRO AZUL Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Rod. PR 92, km 82,5 (sentido Rio Branco/Cerro Azul) Cx. Postal 11 CEP83570000 CIANORTE Estação Agrometeorológica Fone: (044) 722-3420 CLEVELÂNDIA Estação Agrometeorológica Fone: 1046) 256-1761 FRANCISCO BELTRÃO Estação Agrometeorológica Fone: (046) 523-4888 GUARAPUAVA Estação Experimental Rod. Guarapuava (BR 277), km 356,4 Cx. Postal 344 ■ Fone: (0421 723-7273 Estação Agrometeorológica Fone: (042) 723-1422 GUARAQUEÇABA Estação Agrometeorológica Fazenda Caldeirão • Rod. BR 1 0 1 , km 110 Cx. Postal 47 • CEP 83390000 IBIPORÃ Est. Experimental e Est. Agrometeorológica BR 369, km 134, salda pi Jataizinho Cx. Postal 197 CEP 86200 000 FoneíFax: (043) 258-1506

JOAQUIM TÁVORA Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Rod. Joaquim TávorafGuapirama, a 2 km de J. Távora • Cx. Postal 60 • CEP86550000 Fone: (043) 762-1434 LAPA Est. Experimental e Est. Agrometeorológica BR 476 (sentido LapalSão Mateus do Sul), a 5,3 km do trevo principal de Lapa, Cx. Postal 131 CEP 83750-000 Fone/Fax: (041) 822-1457 LARANJEIRAS DO SUL Estação Agrometeorológica Fone: (042) 735-2658

LONDRINA (SEDE) Estação Experimental Laboratório de Apoio á Pesquisa Estação Agrometeorológica Laboratório de Análise de Solos Rod. Celso Garcia Cid, km 375 (PR 445) Cx. Postal 481 CEP 86001-970 Fone: (043) 376-2000 Fax:(043)376 2101 Email:iapar@pr.gov.br ou http:// www.pr.gov. br/iapar MARILÂNDIA DO SUL Estação Agrometeorológica Fone: (043) 464-1254 MORRETES Est. Experimental e Est. Agrometeorológica PR 408, km 64 Cx. Postal 11 CEP «3350-000 Fone/Fax: (041)462-1203 NOVA CANTU Estação Agrometeorológica Fone: (044) 927-1207 PALMAS Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Final da Rua Tertuliano B. de Andrade Cx. Postal 282 CEP 84670000 Fone/Fax: (046) 262-1401 PALOTINA Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Linha São Roque, km 8 Cx. Postal 69 CEP 85950-000 Fone: (044) 649-5614 PARANAVAÍ Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Rua Paulo A. da Costa, (ao lado do DER) Vila Ipê, Cx. Postal 564 CEP 87701-970 Fone: (044) 423 1157 Fax: (044) 423-1607

PATO BRANCO Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Rod. Pato Branco/Três Pinheiros, Bairro Bom Retiro, BR 373 a 12 km de Pato Branco Cx. Postal 510 CEP 85505-970 Fone: (046) 224-3381 Fax: (046) 2253183 E maihepbiapar@pr.gov.br

PINHAIS (Região Metropolitana de Curitiba) Pólo Regional de Pesquisa Laboratório de Apoio à Pesquisa Est. Experimental e Est. Agrometeorológica Estr. da Graciosa, km 18 - Pq. Castelo Branco Cx. Postal 2301 e 1493 • CEP 80001-970 Fone: (041) 358-6336 ■ Fax: (041) 358-6979 E-mail:scotti@pr.gov.br PLANALTO Estação Agrometeorológica Fone: (046) 555-1373

PONTA GROSSA Pólo Regional de Pesquisa Est. Experimental e Lab. de Análise de Solos Av. Pres. Kennedy, s/n, (Rod. do Café, km 104) Cx. Postal 129 CEP 84001-970 Fone/Fax: (042) 229-2829 E-mail:ppgiapar@pr.gov.br Fazenda Modelo Est. Experimental e Lab. de Apoio à Pesquisa Av. Euzébio de Queirós s/n Bairro Uvaranas, Cx. Postal 129, CEP 84001-970 fone/Fax: (042) 224-1433 E-mail:efmiapar@pr.gov.br Vila Velha Est. Experimental e Est Agrometeorológica BR 376 (Rod. do Café) km 89, Furnas, Cx. Postal 433 CEP 84001-970 Fone: (042) 229-3540 Fax: (042) 229-3074 QUEDAS DO IGUAÇU Estação Agrometeorológica Fone: (0461 523-4611 SÃO MIGUEL DO IGUAÇU Est. Agrometeorológica Fone: (045) 541-1396 TEIXEIRA SOARES (Irati) Est. Experimental e Est. Agrometeorológica BR 277, km 2421243 Cx. Postal 108 CEP 84500000 Fone: (042) 422-2574 E-mail:etsiapar@pr.gov.br TELÊMACO BORBA Estação Agrometeorológica Fone: (042) 271-9966 UMUARAMA Estação Agrometeorológica Fone: (044) 622-5533 XAMBRÊ Estação Experimental Cx. Postal 44, CEP 87535-570 Fone: (044) 688-1162