Fungos Filamentosos: Bolores A segunda parte da saga laboratorial (segundo os meus apontamentos...)

Vamos agora debruçar-nos sobre os bolores. Quanto ao material passamos a ter fios unicamente; estão um pouco dobrados nas pontas para facilitar as transferências de micélios. A técnica usada é a típica mas vamos trabalhar com meios em rampa pois assim evita-se em muito a disseminação de esporos. Vamos aprender a fazer tranferência da cultura: aqui não se usa a tradicional técnica de isolamento pois os fungos filamentosos têm muitos esporos e para transferir o bolor basta apenas tocar em 2 ou 3 pontos no meio sólido. No caso particular dos Zigomycetes ( do filo Zigomycota, são aqueles que têm hifas cenocíticas e têm reprodução por esporangiósporos além de outras coisas), eles espalham muito bem em meio sólido e por isso, devido a terem micélio aéreo abundante pode chegar tocar apenas num ponto central da placa. Quanto ao modo de proceder: pega-se num fio e esteriliza-se; abre-se o meio em rampa e arrefece-se o fio na parede do tubo; escolhe-se uma zona nem jovem nem velha, ou seja, entre o centro e a periferia da cultura (indicado razoavelmente a vermelho na figura); arranca-se

delicadamente um pouco de micélio, abre-se a placa de destino e tocar em 2 pontos fechando depois a placa; se o meio de destino for em rampa, enterra-se mesmo um pouco o micélio no primeiro ponto e pica-se com o fio no segundo! Os fungos vão depois a incubar a 22-25ºC e o tempo de incubação pode demorar até 7 dias; alguns crescem bastante rápido (em 24-48 horas) e estão em bom estado para ser analisados. A sua análise requer um avaliação quer macro quer microscópica periódica para estudar a morfogénese, pois os caracteres das hifas jovens vão-se alterando e a hifa envelhece. Devemos apanhar todas as fases desta maturação. Vamos começar por fazer um estudo macroscópico, analisando o tipo de colónias que temos. Podemos ter colónias limitadas ou não e quanto ao seu aspecto é de salientar se são: - pulverulentas (tipicamente dos zigomycetes) - algodoada - aveludada

- se tem coloração (hifas negras ou hialinas, p.e.) - colónias limtadas ou se invadem a placa toda - visíveis esporângios a olho nu - de verso liso ou rugoso - coradas no verso( e se a cor difunde) Alguns aspectos de colónias: Mucor sp./ Aspergillus sp e Rhizopus stolonifer respectivamente. (só a título de exemplo pois é dificil encontrar o aspecto macroscópico para cada espécie).

Agora vamos para a parte microscópica, que sem dúvida é mais importante que a primeira (mas não esquecer que a primeira pode ser muito bem orientativa para a identificação). Existem várias técnicas de observação de micélios de bolores e uma delas é a Suspensão em azul de lactofenol. Consiste em suspender o micélio retirado de uma cultura numa gota do reagente que está em cima de uma lâmina. O reagente usa-se em preparações semipermanentes que podem durar até um mês, o que permite uma observação prolongada durante várias semanas. Contém na sua fórmula glicerina que impede a secagem da preparação, azul de algodão que apesar de corar as paredes do fungo não é um corante propriamente dito (fikei com essa ideia), o fenol que é um fungicida e protege a preparação e o ácido láctico usado como clarificante. Modo de proceder: arrancar com fio esterilizado um pedaço de micélio da “boazona”, como no esquema acima (empurra-se com o fio contra o vidro para ajudar a cortar o micélio) e colocamos o micélio sobre a gota. Com outro fio esterilizado e arrefecido estica-se

1

tanto quanto possível o micélio. Nos fungos com aspecto aveludado, para levarmos micélio, muitas das vezes temos de levar agár e a lamela não assenta – pressiona-se um pouco e aquece-se um pouco para fundir os restinhos de agár. Depois de colocada a lamela proceder à observação a 10 e 40x. Na aula nesta altura fizemos algumas observações ao M.O. para treinar a técnica. Alguns dos aspectos que vimos foram ( devo ter imagens mais à frente na descrição das espécies): - hifas, quer septadas quer asseptadas; - rizóides e esporangiósporos (sacos, estruturas fechadas) - conidiósporos (coroa tipo aspergillus) - hifas em desenvolvimento - hifa preta, com conidiogénse blástica; fragmentação - esporos verdes dentro de saquinhos - etc. Vamos passar à fase mais importante que é organizar e distinguir os nossos bolores. Começamos pela divisão dos Zygomicetes, que são os fungos considerados mais primitivos e têm um crescimento rápido. Ao microscópio vemos que têm hifas cenocíticas de elevado diâmetro (imagem ao lado). Interessa-nos a ordem Mucorales e os géneros desta ordem caracterizam-se por produzirem esporangiósporos em esporângios fechados. Estes esporângios vão aparecer no terminal de hifas que se designam de esporangióforos e que partem da hifa fértil (imagem abaixo). Vamos ver as hifas num estado jovem em

que é possível ver o esporângio ainda fechado e uma segunda fase já mais envelhecida do fungo em que apenas vemos a columela (que suporta os esporângio; esquematicamente no esporangióforo do meio do esquema). Nalguns géneros pode aparecer um pequeno colarinho na zona da columela. Portanto, o aspecto do fungo é diferente sendo jovem ou sendo velho. Dentro então desta ordem temos os géneros Mucor, Rhizopus, Absidia e Syncephalastrum, pelo que vamos ter de os

distinguir. A primeira coisa que nos servimos para isso é a morfologia do esporângio; tentamos descobrir um que seja morfologicamente exclusivo ( como o Syncephalastrum que tem meroesporângios, ou seja à volta da columela parece que tem pétalas de flores; os outros géneros são redondinhos). Assim é de destacar que o Syncephalastrum tem então meroesporângios, que são uma

espécie de sacos cilíndricos com distribuição radial sobre a columela (como se de pétalas de flores se tratasse) e contendo dentro de si entre cerca de 5-10

merosporângiósporos orientados em fila (figuras ao lado, sendo a mais da direita os esporos já libertos).

2

Ouro aspecto a considerar é a morfologia dos esporângióforos ( aquela hifa abaixo da columela e que se liga à outra hifa vegetativa, ou seja, a hifa que suporta o esporângio). Este pode ou não ser ramificado e

geralmente não é no Rhyzopus e Absidia (mas pode pontualmente aparecer; imagem ao lado) e é no género mucor e syncephalastrum ( já por si se distinguém do esporângio!!). Outro aspecto de diferenciação é o tipo de rizóides que podem aparecer nos géneros Absidia e Rhyzopus. Neste último os rizóides aparecem na base dos esporóforos como se vê na imagem ao lado; na Absidia a disposição

nca coincide com a base o esporóforo como ilustrado nesta imagem ao lado. Temos também de ter em

dos rizóides é irregular e nu

conta form

e com colarinho, uma dilatação do

Género Esporângio Esporangióforo Rizóides Columela Outros

a a da columela principalmente quando o fungo já é velho; a mior parte são redondas (Mucor e Rhyzopus) e pode no mucor aparecer um colarinho e

que não aparece no Rhyzopus; a columela em guarda-chuva não é exclusiva do Rhizopus mas neste aparece bem e grande (abaixo). A Absidia destaca-se aqui por ter além de uma

columela em forma triangular esporângióforo em forma de cálice e que se denomina de apófise, como retratado abaixo. Visto estas diferenças entre géneros vamos sistematizar as coisas:

ABSIDIA

colarinho

columela

Apófise

Mucor Redondo ramificado ausente Red ho ondo/colarin - hizopus redondo ramificado na base Guarda-chuva

Absidia redondo Pouco ramific. irregular T Apófise riang/colarinhoSynceph. Mero (pétalas) - - redonda Columela

com zonas de inserção

R N

Há mais algumas observações a fazer:

3

- no rhizopus, os rizóides estão na base dos esporangióforos, que podem estar em grupo ou ser apenas um a emergir dos rizóides; a columela toma a forma de guarda-chuva após ocorrer desintegração do esporângio e o esporos que de lá saem não são lisos; são rugosos ou estriados (pelo que é de tentar ver esses pormenores a 40x); a visualização dos esporangióforos pode ser feita a olho nu; a cultura inicialmente é branca mas depois fica acizentada.

- no syncephalastrum, além de sabermos que tipicamente tem os merosporângios, na columela há umas espécies de picozinhos que correspondem às zonas de inserção dos merosporângios.

Algumas imagens tipicas para cada género: - Mucor:

- Rhizopus:

4

- Absidia:

Foi mencionado o género Rhizomucor mas não demos grande importância. Agora que já vimos as principais diferenças entre os géneros desta ordem vamos tentar diferenciar espécies dentro de dois dos géneros: Mucor e Rhizopus. Mucor plumbeus vs Mucor racemosus - a columela do plumbeus vê-se bastante bem e não é lisinha: tem zonas apicais proeminentes

caracteristicas e um colarinho; o racemosus tem columela lisinha; - o plumbeus tem esporângios e esporos com espinhos; - o racemosus tem clamidósporos intercalares fáceis de ver, que se parecem com artroconídeos; são

quandrangulares com a parede espessa e aparecem em grande quantidade;

- no oryzae existe uma estrutura que é uma “rotunda” de hifas (noz

- Syncephalastrum:

(não tenho imagens comparativas desta parte – recorrer aos esquemas) Rhizopus stolonifer / R. oryzae

), uma espécie de dilatação da perpendiculares e tem rizóides pequeninos; tem também o

-

qual partem hifas em direcçõesesporâmngio mais pequenino; o stolonifer não tem noz e tem rizóides mais grossos e maiores.

(ver pelos esquemas fornecidos)

5

N uraud e abrimos uma placa no anfiteatro ( que afinal não deu quase nada). ngos que se reproduzem por fialoconídeos (contêm portanto fiálides). Aconsdisti

esta aula seguinte, fizemos repicagens das placas para meios de Sabo

Agora vamos falar de fupresentam micélio septado ao contrário dos da última aula e têm hifas mais estreitas. Vamos assim

iderar dois importantes géneros: Aspergillus e Penicillium. Temos de os saber distinguir bem e a nção baseia-se no conidióforo, que no Aspergillus, é dilatado na sua parte terminal e forma uma

v emos perante um Penicillium mas p quena dilatação. Aspergillus

Apresenta então um conidióforo a partir da célula pé e este termina numa vesícula globosa onde assentam as fiálides ou métulas conforme a espécie é unisseriada ou bisseriada respectivamente, ou seja, se é uni tem apenas uma camada de células (fiálides) e se é bisseriada tem uma camada de células (métulas) logo após a vesícula e nestas assentam as fiálides (imagem legendada). Depois é possível ver ligadas às fiálides, cadeias de

s 3 espécies a .

eiro torno das

pé, 2/3 da parte

as

Outra diferença é o conidióforo

esícula – cabeça grande; quando não se forma essa vesícula estarode o monoverticilado ter uma pe

fialoconídeos e que dão o típico aspecto aspergilar e não são ramificados. Dentro deste género (que está noutra divisão) temoconsiderar: A.fumigatus, niger e flavusExistem vários critérios para proceder á sua separação e identificação. O primé a disposição das fiálides emvesículas: o fumigatus tem o cabelo emou seja, as fiálides só ocupam

terminal da vesícula; no niger, a disposição é radial e tem um aspecto de sol típico(coloração acastanhada); o flavus aparece desorganizado, como se estivesse despenteado, ou seja, aparecemfiálides em todas as direcções (imagem fumigatus-niger-flavus):

conídeo

fiálide

métula

vesícula

6

que no niger e flavus abre directamente na vesícula mas no fumigatus há uma dilatação visível nas fotos, chamada de conidióforo em moca; outro pormenor é que o conidióforo

do fumigatus é bem mais curtinho que o dos outros(imagem ao lado), ao contrário do conidióforo do niger que é muito comprido; no A. flavus o tamanho é variável. Um outro aspecto é que a parede do conidióforo pode ser lisa ou rugosa e salienta-se aqui o A. flavus como sendo o único destes a ter a parede rugosa, ou seja, tem um conidióforo rugoso ou espinhoso, sendo visíveis uns pontinhos a 40x; no entanto a presença de um elevado nº. de esporos dificulta a visualização. Outro aspecto que diferencia as espécies é que o A. fumigatus bisseriado. O flave dificil pela descrição quflavu orgevidenciada o quese chegar a uma c

então, como diz o nome, esporos negros e portanto a periferiver melhor basta retirarmos ao meio de suspensão o coranttorna um pouco dificil fazer uma diferenci da dadevidamente ilustrado:

Aspergillus

A. fumigatus

é unisseriado enquanto que o niger é us é naquela base de que pode ser uni ou bi distinguir a métula da fiálide. Já se reparou e nem sempre é fácil distinguir niger de anização dos esporos nem sempre é bem se aconselha que vejam mais que um para onclusão. Há o pormenor de o A. niger ter a das cadeias de conídeos é negra e para se e (azul de algodão). Porque eu sei que se s 3 espécies faz-se um resumo a seguir

o Fiálides Esporos

torna-se

s, pois a

ação níti

Disposição das fiálides Conidiófor2/3 da vesicular Curto/em moca/liso

radial Tamanho variTermina na vesíc

desorganizado Comprido/termivesícula/espinh

Fumigatus Unisseriado hialinos ável ula/liso

Bisseriado negros

na na oso

Uni/Bi hialinos

Niger

Flavus

A. fumigatus

7

8

A. niger

A. flavus

As visualizações que fizemos ao M.O. de Aspergillus tiveram como objectivo ver as vesículas e s fialoconídeos além dos caracteres já mencionados quando possível. Numa das observações tinhamos m A. flavus jovem e então só poderíamos ver vesículas sem fiálides e algumas vesículas com fiálides as sem conídeos; n ópio tinhamos um A. niger maduro onde podíamos ver nitidamente as étulas e as fiálides.

Outro género alvo das nossas visualizações e cuja identificação de espécie não nos é exigida é o enicillium.

As visualizações que fizemos ao M.O. de Aspergillus tiveram como objectivo ver as vesículas e s fialoconídeos além dos caracteres já mencionados quando possível. Numa das observações tinhamos m A. flavus jovem e então só poderíamos ver vesículas sem fiálides e algumas vesículas com fiálides as sem conídeos; n ópio tinhamos um A. niger maduro onde podíamos ver nitidamente as étulas e as fiálides.

Outro género alvo das nossas visualizações e cuja identificação de espécie não nos é exigida é o enicillium.

Algumas imagens depreparações de Aspergillusdas aulas:em 1 temos um A.fumigatus; a fig.2 mostrauma vesícula muito escurasendo de flavus ou niger(assim pela desorganizaçãoparece flavus); o mesmo sepassa com a fig. 3, que podeser flavus ou niger; a fig. 4aponta mais para um nigerpela disposição radial maisou menos organizada.

Fig.1

Fig.2

Fig.3

Fig.4

Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3

Magníficas figuras da aula: 1 – Syncephalastrum, só para se ver as semelhanças e diferenças;2 – A. Niger ou flavus, notar as métulas, portanto provavelmente niger ; 3-A. Flavus ou niger,não dando para distinguir muito bem só com esta estrutura.

oouumm outro microscoutro microscmm PP

9

10

No entanto foi salientado o critério pelo qual se faz a diferenciação dos Penicilliuns e que se trata do grau de ramificação do conidióforo. No esquema ao lado temos um conidióforo simples com fiálides (a) e depois temos respectivamente em (b)(c)(d), conidióforos uni, bi e

triverticilados. com não

será preciso saber. Seguem-se imagens de alguns exemplos de ramific B é C é

ão. foi e lium seja, ação uma . O

da ramificação ajuda bastante no que respeita a saber os pontos de ramificação. Prosseguindo o nosso estudo dos bolores, mais uma técnica de visualização de bolores foi ensinada: a técnica da fita adesiva. Esta técnica tem a vantagem de

r as ste em

usar fita cola para

seja, vai contaminar a

deve usar quando a contaminação da

Ficamos então esta ideia e mais

ação: a imagem A é simples, amonoverticilada e abiverticilada, com dois pontos de ramificaç A imagem Dcolhida na aulamostra um Penicilbiverticilado, ou tem uma ramificno conidióforo e outra nas métulasesquema

preservar melhoestruturas e consi D

B

C

A

arrancar na cola um pouco de micélio e colocar na lâmina. É uma técnica séptica, ou

cultura e por isso só se

cultura não constitui problema (para fazer confrimações no final de um estudo operandis da técnica é o seguinte: (funciona muito melhor em placas ddesaconselhado para o exame) corta-se um pedaço de fita-cola sem tocar com ofica baça e dificulta a observação; numa lâmina colocar azul de lactofenol; tocar, com a fita cola na cultura de uma placa e tranpor a fita para a lâmina( se usaremem tubo, usa-se um fio que vai lá dentro com a fita colada e toca na cultura; c , outro fio cola-se na lâmina; em ambos os casos coloca-se uma lamela e uma gotse acharem necessário. Quanto a aspectos macroscópicos, apesar de não termos dado muita imatenção de alguns. Os Aspergillus não ocupam inteiramente a placa e porrugosidade; o niger tem um aspecto aveludado com algum micélio aéreo (parecepequeninas); flavus tem uma aspecto semelhante mas mais ao branco ou amarelo;amarelinho; o niger é bastante escuro devido à coloração dos esporos. O peapresenta uma rugosidade por trás. Nestas imagens temos o aspecto em placa

esquerda para a direita A. fumigatus, nigerbaixo é uma cultura de Penicillium. As imaspecto com que contactamos nas aulas e da

ogénse, ou seja, o criténão misturar os dois t

a parte de Micologia do livro do Prof. João Carlos especialmente d a fotocópia com os esquemas e exem

os por falar na conidiogénese do tipo taloártrico

por exemplo).O modus o que em tubos e é s dedos pois senão ela com a ajuda dos dedos, os dedos desinfecta!); á fora com a ajuda de a de azul de lactofenol

portância, tomamos a trás apresentam uma cabecinhas de fósforo o fumigatus também é nnicillium é branco e de respectivamente da

e flavus e a imagem de agens são diferentes do s descrições.

Vimos na aula seguinte outros tipos de coniditaxonomia, mas o tipo de reprodução sexuada e por isso que leiampara perceber o que foi visto na aula; usem Começam

rio passou a ser, não a ipos de critérios. Sugiro a reprodução assexuada plos dados pela prof. holoártrica gerando-se so que está presente no conidiogése blástica é a mais nada menos do s (daí o nome de ontece noutros fungos emulação (a partir dos plo). tálica solitária

também nosso conhecido pois é nadque a gemulação das levedurablastoconídeos) e que também acfilamentosos mas não se chama de gartroconídeos do Geotrichum por exemOutro tipo de conidiogénese é a que é

dela é a formação de caso dos clamidósporos cesso como produção de tinhas (dermatófito) –

e que éartroconídeos, que provêm da fragmentação de uma zona terminal das hifas (caTrychosporon e no Geotrichum candidum – formação na imagem). O tipo de

holotálica também e um exemplo endósporos nos zygomicetes como o no mucor; vamos ver na aula este pro

aleureoconídeos em que há uma dilatação da hifa num agente causadro de

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Microsporum gypseum (imagem). De notar o aspecto fusiforme na extremidade na hifa e dando um macroconídeo septado. Passando para a conidiogénse blástica, mencionamos já que se trata da gemulação, ela no entanto pode aparecer em diferentes arranjos: podem aparecer como cadeias acrópetas, basípetas, etc... Temos então dentro da blástica, a holoblástica e a enteroblástica. Na holoblástica geram-se cadeias acrópetas em que um conídeo gera outro de tal forma que o mais distante da célula conidiogénica é o mais

lástico

novo (Cladosporium (fungo negro=dematiáceo)– que aparece com os conídeos parecendo um galho de uma árvore – imagem ), neste processo há uma forma específica em que parece que os conídeos se geram a

partir de um poro de um outro, gerando assim poroconídeos; isso é o exemplo típico de uma Alternaria spp (dematiáceo).

Como também consta na fotocópia dada pela prof, há ainda mais duas formas da conidionénese blástica do tipo holob

: a simpodial, em que há formação de uma espécie de ziguezague durante o processo de formação dos conídeos (parece um cacho e podem aparecer às vezes algumas cicatrizes de

conídeos produzidos) e o caso prático é a Drechslera spp, também o; a regressiva em que há formação de uma estrutura que a flor e por vezes visível uma estrutura em taco de golfe na de um único conídeo; a partir do taco de golfe parece que

cresce para baixo e daí este nome; neste caso temos o Trychotecium (não

dematiáceo). Agora virando-os para o tipo de

Cladosporium

dema áceparece umform ão

ti

aç

Alternaria

Drechslera sp.

richothecium sp. Trychothecium

conidiogénese blástica enteroblástica (aquela em que há um à ideia de vermos uma gota a formar-se na ponta de uma

é o tipo fialídicorebento para sair um conídeo (eu associobureta)) há 3 tipos interessantes. Um deles que acontece no Penicillium e no aspergillus

omo o Fusarium spp (não dematiáceo). e a Phialophora spp. Nestes temos presença de fiálides que são difíceis de observar; às vezes aparecem umas agulhinhas mas e noutros fungos de importância clínica c

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não vemos nenhum conídeo mas devemos procurar para ver os microconídeos; no Fusarium temos a de banana; na Phialoph

Temos depois a enteroblástica do tipo anelídsemelhante à fiálide mas neste caso, a estrutura conideocom o penicillium, contendo agrupamentos semelhantes. Po conteúdo mas têm tipicamente uma base truncada; no eum conídeo se solta fica um anel no anelóforo. Apa

Das preparações que vimos algumfragmentos de micélio em azul de lactofenol e outras

são fitas adesivas, que preservam melhor os arranjos naturais, apesar

macroconídeos com forma típic ora (dematiáceo),como é um fungo pequenino, deve ver-se a 40x e de olhos bem ar

as são

de uma das suas limitações é que por vezes podemos nem chegar a conseguir colher as estruturas perfeitas ou pretendidas dos fungos. Uma outra técnica concebida para preservar as estruturas naturais dos fungos ao M.O. é a técnica da cultura em lâmina demonstrada na aula; cultivamos cultura num quadradinho e depois

regalados fiálides típicas e conídeos, parecendo uma jarra com

flores.

Fusarium spp. Microconídeos Macroconídeos

Phialophora sp

ico, com a formação de aneloconídeos. È génica é o anelóforo; visualmente é parecido demos não ver os anelóforos pois eles perdem sporo aparece uma cicatriz e de cada vez que

recem algumas cadeias por vezes; o género representativo é o Scopulariopsis sp (não dematiáceo) Estão nas imagens abaixo.

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samos um fungo negro); após isto colocamos a lamela em cimarimeiro e depois forma-se o micélio aéreo que sai para fora do me

te e procurar em 10x nos bordos para encontrarmoa mos d

desse suporte e coloca-se a lamela pousada em cima da lâmina; corta-se um quadradinho de meio com um bisturi flamejado com cerca de 1 cm de lado(A) e vai para a lâmina (C); pode semear-se mais que

de maturação diferentes; a inoculação do meio é feita nos bordos do meio (nós

do agár (D). O fungo cresce por baixo io e cresce entre a lâmina e a lamela.

papel de filtro é humedecido para manter o teor de humidade necessário e pode adicionar-se glicerina ue é humectante; marca-se a placa e coloca-se a data – incuba-se depois a 25ºC sem inverter. Após a cubação fazemos a preparação colocando uma gota de azul de lactofenol e retiramos a nossa lamela

om uma pinça da placa de petri, destacamos o bloco de agar, deixamos secar e colocamos a lamela em ima da gota; com a lâmina da cultura, limpamos com papel no seu verso e na zona de crescimento vai-e colocar azul de lactofenol e uma lamela por cima! Ficamos assim com duas preparações para bservar: uma com a lamela da cultura e outra com a lâmina!

Uma das coisas que se fizeram na aula foi repicar culturas de Bacal para termos depois fungos ara identificar. Ficamos assim com culturas em r der à identificação e ao olhar para ma rampa devemos ter atenção ao verso e ao pigmento

mais facilmente as estruturas. Assim de forma resumida temos uma placa esterilizada com papel de filtro, um suportezinho de vidro (B) uma lâmina e uma lamela. Com a ajuda de uma pinça flamejada colocamos a lâmina em cima

uma vez por lâmina quando temos o meio na lâmina e assim podemos ter culturas para observação com estados

upOqinccso p ampa para proceu ; a observação ao microscópio é que vai onfirmar as suspeitas. Numa segunda fase temos de ler as colónias: verso se tem cor, se esta difunde

Consistently Observed Morphological Characters of Reference Isolates

cpara o meio e depois de frente, se tem cor, a textura, o relevo, etc. Quando temos 3 Aspergillus isto pode auxiliar a classificação pois podemos recorrer a chaves dicotómicas em tabelas para nos guiarmos (exemplo de tabela para aspergillus abarcando também aspectos microscópicos).

end

- (+) + - - -

- - - - - + -

vesicle

cand=Aspergillus candidus,

niger=Aspergillus niger,

ochr=Asperg

clav pen vers terr cand niger ochr flav amst nid fum Leg

colored mycelia - - - (+) - - - - + - -

exudate - - + - - - - - - - -

colored reverse - + + + - + + - (+) + +

soluble pigment - (+) - - - - - - - - -

sclerotia\cleistothecia - - - - + - - + + + -

Hülle cells - - - - - - - - - + -

rough stipe - - - - -

colored stipe - - - -

globose - (+) (+)- (+) + + + (+) - -

+ + - - + + + + ochraceus,

flav=Aspergillus pyriform - + +

clav=Aspergillus clavatus,

pen=Aspergillus penicilliodes,

vers=Aspergillus versicolor,

terr=Aspergillus terreus,

illus

14

spathulate - + + - - - - - + + + flavus,

clavate + - - - - - - - - - (+)

conidial heads

un

amstelodami, nid=Emericella

iseriate + + - - (+) - - + + - +

biseriate - - + + + + + + - + -

+

(+)

+

(+)

-

fum=Aspergillus fumigatus

ue, num pús de ouvido, A. nça de uma serosidade). se designam de corémios.

esumir isso.

conidia

globose - + + + + + + + + +

ellipsoidal + + - - - - - - + -

smooth-walled + - (+) + + - + - (+) -

rough-walled - + + - - + - + + +

ascospores - - - - - - - - + +

Na aula tenho uma referência ao facto de haver numa gelose sang e fez-se depois uma repicagem dessa micose subcutânea (prese

Mencionaram-se picnídeos (aglomerados de hifas) e cabeças de fósforos que

Procedemos assim às observações do que exposemos anteriormente. Vamos r

amst=Eurotium

nidulans,

niger

Dematiáceo Rep. assex se açõesGénero Tipo de rep. ob rv Geotrichum não áli holoártrica rt on os

cápsT ca A roc íde ; parece

ula bactérias comosporum ató a otá a leu oc ídeos osporium si crópe o g ho ore

ternaria si ró o oní os om septos

Micr Não – derm fito tálic hol lic a re onClad m holoblástica a ta Tip al de árv

Al m holoblástica Ac peta P roc de ; cdentro

15

Drechslera sim holoblástica Simpodial ziguezague Trichotecium não holoblástica Regressiva Taco de golfe, ce´ls

bidivididas lariopsis nã ter lást Pa ce gro

sarium nã líd Ba na ma icro erados de

nte m laboratório. E utu O erv ões xe

Zygo s

Scopu o en ob ica Anelídica re neFu o enteroblástica fia ica na s; cro e m

Phialophora sim enteroblástica Fialídica Garrafa e aglomconídeos

Última aula de micologia Antes de procedermos a qualquer revisão, viramo-nos para a observação de estruturas de reprodução sexuada e de agregados de hifas, coisas que não se fazem rotineirame nuLâmina Filo str ra bs aç E mplo

1 micete Zigosporângio Heterotálico

2 Zygomicetes Zigosporângio Homotálico

3 Zygomicetes Zigosporângio Com apêndices (Absidia)

4 Ascomycetes Peritécio Negro (ascos+ Ascósporos)

5 Ascomycetes Cleistotécio ascos+Ascósporos globoso

16

6 Ascomycetes Ascos n ere us S. c visiae

7 - esclerócParecido com

otéege

ito cleist cio (só que v tativo)

-

8 - Picníd soconídeos eo Globo ; saem -

Os antib as na m produ o acontece aqui ia e torna-se complicado testar essa susceptibilidade. Isto deve-se ao facto de haverem muitas formas de fungos, alguns pleomórficos e nos testes de difusão em placa, alguns fármacos têm dificuldade em difundir; dever-se-ia usar a mesma quantidade de inóculo mas para fungos filamentosos é difícil homogeneizar e por zes é or cil te ndo métodos de difusão em placa. Outro facto é que se assim fosse, precisavamos de dois meios diferentes para testas as substâncias: um deles sintético para umas substâncias e depois outro para os azóis e os polienos pois estes exigem pH’s mais elevados. Outro problema é que por exemplo, apaesar de haver um halo de inibição existem microcolónias nesse halo o que dificulta a interpretação. Apesar disto tudo existem discos de antifúngicos disponíveis. Há no enstanto um teste normalizado que é um teste feito por macrométodo em meio líquido; colocamos dr s de ão maior em que actua o fármaco (CMI) (isto é bonito apesar de não ser viável de fazer num hospital). Existem no entanto bons testes de sensibilidade fazendo uso de um meio específico que é o RPMI 1640 glutamizado e tamponado a pH 7 que dá para todos os antifúngicos. O método também está permitido em micrométodo (usando aquelas placas de titulação tipo ELISA) – a leitura é feita comparativamente a um controlo positivo e um coontrolo negativo – e é viável para leveduras

iogram icro são re tíveis o que nã na micolog

ve difícil ter esp os; assim é difí r sucesso usa

um inóculo pa onizado e vemo pois a dliluiç

rométodo, em ue se vêem os n los de bolores q de camom

etamente eficaz m teste tipo

Outro assunto que abordamos foi a susceptibilidade aos antifúngicos (para bolores e leveduras!).

. Para os bolores há a tentativa de normalização pelo NCCLS (?) e há até um método normalizado do tipo mac q ove ue crescem ou não; a professora na aula mostrou um destes testes com um óleo essencial, ila, que após 3-7 dias de incubação gerou novelos em alguns tubos. Ao analisar vemos que na diluição 64 já há crescimento logo a CMI seria 32. apesar de sabermos que aos 32 já inibimos o fungo, não sabemos se é por ele parar o seu metabolismo ou ser morto pela substancia. Para sabermos isso poderíamos retirar 100 µl para um Sabouraud e ver se crescía cultura; se com diluição 32 crescesse cultura e com diluição 16 não, então a nossa CLM (concentração letal mínima) sería 16. Portanto, interessa avaliar a capacidade fungistática e fungicida da substância. Apesar de tudo esta técnica não é compl e não existe nenhum teste perfeitamente viável. A Biomérieux lembrou-se de fazer u API mas em vez de açucares, temos antifúngicos a dferentes concentrações nos pocinhos – “ATB Fungus” – e que tem o problema de não se aproximar das normas em vigor. Temos uma parte da galeria com um antifúngico e o resto com outros; inocula-se os primeiros 5 poços de 5- fluorocitosina (de concentração 0,25 a 0,128)(?) com a nossa suspensão fúngica e depois temos de a alcalinizar para semear os outros poços de polióis (concentração 1/2/4/8) e os outros; Como alguns antifúngicos só têm direito a 2 pocinhos com concentrações diferentes só dá para avaliar se é sensível ou resistente e não sabemos CMI ou CML.; outra agravante é que os antifúngicos que mais se usam não constam na galeria!!Conforme ele cresce na mínima e na concentração máxima podemos definir se é sensível, resistente, ou de sensibilidade intermédia, etc. Outro sistema que vimos foi o Fungiteste que tem a vantagem de não termos de fazer nenhum passo de alcalinização e aproxima-se mais das normas em vigor, temos uma microgaleria e inoculamos

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com 2 controlos positivos, 2 controlos negativos e depois vamos testar apenas se o fungo é sensível ou resistente a determinado antifúngico. O teste é colorimétrico e se há crescimento dá uma coloração rosa e e não crescer fica rôxo. No resto da aula, a partir de algumas ramp es a fresco para tentar chegar à sua identificação, mas não tenho quaiquer imagens e portanto acho que não vale a pena colocar. Se algo for necessário actualizar estejam atentos ao site! Obrigado Tiago pelo material!

Zétolas et al, 2003

as fizemos exam

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