Fungos Filamentosos: Bolores A segunda parte da saga laboratorial (segundo os meus apontamentos...) Vamos agora debruar-nos sobre os bolores. Quanto ao material passamos a ter fios unicamente; esto um pouco dobrados nas pontas para facilitar as transferncias de miclios. A tcnica usada a tpica mas vamos trabalhar com meios em rampa pois assim evita-se em muito a disseminao de esporos. Vamos aprender a fazer tranferncia da cultura: aqui no se usa a tradicional tcnica de isolamento pois os fungos filamentosos tm muitos esporos e para transferir o bolor basta apenas tocar em 2 ou 3 pontos no meio slido. No caso particular dos Zigomycetes ( do filo Zigomycota, so aqueles que tm hifas cenocticas e tm reproduo por esporangisporos alm de outras coisas), eles espalham muito bem em meio slido e por isso, devido a terem miclio areo abundante pode chegar tocar apenas num ponto central da placa. Quanto ao modo de proceder: pega-se num fio e esteriliza-se; abre-se o meio em rampa e arrefece-se o fio na parede do tubo; escolhe-se uma zona nem jovem nem velha, ou seja, entre o centro e a periferia da cultura (indicado razoavelmente a vermelho na figura); arranca-se delicadamente um pouco de miclio, abre-se a placa de destino e tocar em 2 pontos fechando depois a placa; se o meio de destino for em rampa, enterra-se mesmo um pouco o miclio no primeiro ponto e pica-se com o fio no segundo! Os fungos vo depois a incubar a 22-25C e o tempo de incubao pode demorar at 7 dias; alguns crescem bastante rpido (em 24-48 horas) e esto em bom estado para ser analisados. A sua anlise requer um avaliao quer macro quer microscpica peridica para estudar a morfognese, pois os caracteres das hifas jovens vo-se alterando e a hifa envelhece. Devemos apanhar todas as fases desta maturao. Vamos comear por fazer um estudo macroscpico, analisando o tipo de colnias que temos. Podemos ter colnias limitadas ou no e quanto ao seu aspecto de salientar se so: - pulverulentas (tipicamente dos zigomycetes) - algodoada - aveludada - se tem colorao (hifas negras ou hialinas, p.e.) - colnias limtadas ou se invadem a placa toda - visveis esporngios a olho nu - de verso liso ou rugoso - coradas no verso( e se a cor difunde) Alguns aspectos de colnias: Mucor sp./ Aspergillus sp e Rhizopus stolonifer respectivamente. (s a ttulo de exemplo pois dificil encontrar o aspecto macroscpico para cada espcie).

Agora vamos para a parte microscpica, que sem dvida mais importante que a primeira (mas no esquecer que a primeira pode ser muito bem orientativa para a identificao). Existem vrias tcnicas de observao de miclios de bolores e uma delas a Suspenso em azul de lactofenol. Consiste em suspender o miclio retirado de uma cultura numa gota do reagente que est em cima de uma lmina. O reagente usa-se em preparaes semipermanentes que podem durar at um ms, o que permite uma observao prolongada durante vrias semanas. Contm na sua frmula glicerina que impede a secagem da preparao, azul de algodo que apesar de corar as paredes do fungo no um corante propriamente dito (fikei com essa ideia), o fenol que um fungicida e protege a preparao e o cido lctico usado como clarificante. Modo de proceder: arrancar com fio esterilizado um pedao de miclio da boazona, como no esquema acima (empurra-se com o fio contra o vidro para ajudar a cortar o miclio) e colocamos o miclio sobre a gota. Com outro fio esterilizado e arrefecido estica-se 1

tanto quanto possvel o miclio. Nos fungos com aspecto aveludado, para levarmos miclio, muitas das vezes temos de levar agr e a lamela no assenta pressiona-se um pouco e aquece-se um pouco para fundir os restinhos de agr. Depois de colocada a lamela proceder observao a 10 e 40x. Na aula nesta altura fizemos algumas observaes ao M.O. para treinar a tcnica. Alguns dos aspectos que vimos foram ( devo ter imagens mais frente na descrio das espcies): - hifas, quer septadas quer asseptadas; - rizides e esporangisporos (sacos, estruturas fechadas) - conidisporos (coroa tipo aspergillus) - hifas em desenvolvimento - hifa preta, com conidiognse blstica; fragmentao - esporos verdes dentro de saquinhos - etc. Vamos passar fase mais importante que organizar e distinguir os nossos bolores. Comeamos pela diviso dos Zygomicetes, que so os fungos considerados mais primitivos e tm um crescimento rpido. Ao microscpio vemos que tm hifas cenocticas de elevado dimetro (imagem ao lado). Interessa-nos a ordem Mucorales e os gneros desta ordem caracterizam-se por produzirem esporangisporos em esporngios fechados. Estes esporngios vo aparecer no terminal de hifas que se designam de esporangiforos e que partem da hifa frtil (imagem abaixo). Vamos ver as hifas num estado jovem em que possvel ver o esporngio ainda fechado e uma segunda fase j mais envelhecida do fungo em que apenas vemos a columela (que suporta os esporngio; esquematicamente no esporangiforo do meio do esquema). Nalguns gneros pode aparecer um pequeno colarinho na zona da columela. Portanto, o aspecto do fungo diferente sendo jovem ou sendo velho. Dentro ento desta ordem temos os gneros Mucor, Rhizopus, Absidia e Syncephalastrum, pelo que vamos ter de os distinguir. A primeira coisa que nos servimos para isso a morfologia do esporngio; tentamos descobrir um que seja morfologicamente exclusivo ( como o Syncephalastrum que tem meroesporngios, ou seja volta da columela parece que tem ptalas de flores; os outros gneros so redondinhos). Assim de destacar que o Syncephalastrum tem ento meroesporngios, que so uma espcie de sacos cilndricos com distribuio radial sobre a columela (como se de ptalas de flores se tratasse) e contendo dentro de si entre cerca de 5-10 merosporngisporos orientados em fila (figuras ao lado, sendo a mais da direita os esporos j libertos).

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Ouro aspecto a considerar a morfologia dos esporngiforos ( aquela hifa abaixo da columela e que se liga outra hifa vegetativa, ou seja, a hifa que suporta o esporngio). Este pode ou no ser ramificado e geralmente no no Rhyzopus e Absidia (mas pode pontualmente aparecer; imagem ao lado) e no gnero mucor e syncephalastrum ( j por si se distingum do esporngio!!). Outro aspecto de diferenciao o tipo de rizides que podem aparecer nos gneros Absidia e Rhyzopus. Neste ltimo os rizides aparecem na base dos esporforos como se v na imagem ao lado; na Absidia a disposio dos rizides irregular e nunca coincide com a base o esporforo como ilustrado nesta imagem ao lado. Temos tambm de ter em conta a forma da columela principalmente quando o fungo j velho; a mior parte so redondas (Mucor e Rhyzopus) e pode no mucor aparecer um colarinho e

ABSIDIA que no aparece no Rhyzopus; a columela em guarda-chuva colarinho no exclusiva do Rhizopus mas neste aparece bem e grande (abaixo). A Absidia destaca-se aqui por ter alm de uma columela em forma triangular e com colarinho, uma dilatao do esporngiforo em forma de clice e que se denomina de apfise, como retratado abaixo. Visto estas diferenas entre gneros vamos sistematizar as coisas: columela

Apfise

Gnero Mucor Rhizopus Absidia Synceph.

Esporngio Redondo redondo redondo Mero (ptalas)

Esporangiforo ramificado N ramificado Pouco ramific. -

Rizides ausente na base irregular -

Columela Redondo/colarinho Guarda-chuva Triang/colarinho redonda

Outros Apfise Columela com zonas de insero

H mais algumas observaes a fazer: 3

-

no rhizopus, os rizides esto na base dos esporangiforos, que podem estar em grupo ou ser apenas um a emergir dos rizides; a columela toma a forma de guarda-chuva aps ocorrer desintegrao do esporngio e o esporos que de l saem no so lisos; so rugosos ou estriados (pelo que de tentar ver esses pormenores a 40x); a visualizao dos esporangiforos pode ser feita a olho nu; a cultura inicialmente branca mas depois fica acizentada. - no syncephalastrum, alm de sabermos que tipicamente tem os merosporngios, na columela h umas espcies de picozinhos que correspondem s zonas de insero dos merosporngios. Algumas imagens tipicas para cada gnero: - Mucor:

-

Rhizopus:

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-

Absidia:

- Syncephalastrum:

Foi mencionado o gnero Rhizomucor mas no demos grande importncia. Agora que j vimos as principais diferenas entre os gneros desta ordem vamos tentar diferenciar espcies dentro de dois dos gneros: Mucor e Rhizopus. Mucor plumbeus vs Mucor racemosus - a columela do plumbeus v-se bastante bem e no lisinha: tem zonas apicais proeminentes caracteristicas e um colarinho; o racemosus tem columela lisinha; - o plumbeus tem esporngios e esporos com espinhos; - o racemosus tem clamidsporos intercalares fceis de ver, que se parecem com artrocondeos; so quandrangulares com a parede espessa e aparecem em grande quantidade; (no tenho imagens comparativas desta parte recorrer aos esquemas) Rhizopus stolonifer / R. oryzae - no oryzae existe uma estrutura que uma rotunda de hifas (noz), uma espcie de dilatao da qual partem hifas em direces perpendiculares e tem rizides pequeninos; tem tambm o espormngio mais pequenino; - o stolonifer no tem noz e tem rizides mais grossos e maiores. (ver pelos esquemas fornecidos)

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Nesta aula seguinte, fizemos repicagens das placas para meios de Sabouraud e abrimos uma placa no anfiteatro ( que afinal no deu quase nada). Agora vamos falar de fungos que se reproduzem por fialocondeos (contm portanto filides). Apresentam miclio septado ao contrrio dos da ltima aula e tm hifas mais estreitas. Vamos assim considerar dois importantes gneros: Aspergillus e Penicillium. Temos de os saber distinguir bem e a distino baseia-se no conidiforo, que no Aspergillus, dilatado na sua parte terminal e forma uma vescula cabea grande; quando no se forma essa vescula estaremos perante um Penicillium mas pode o monoverticilado ter uma pequena dilatao. Aspergillus Apresenta ento um conidiforo a partir da clula p e este termina numa vescula globosa onde assentam as filides ou condeo mtulas conforme a espcie unisseriada ou bisseriada respectivamente, ou seja, se filide uni tem apenas uma camada de clulas (filides) e se bisseriada tem uma mtula camada de clulas (mtulas) logo aps a vescula e nestas assentam as filides (imagem legendada). Depois possvel vescula ver ligadas s filides, cadeias de fialocondeos e que do o tpico aspecto aspergilar e no so ramificados. Dentro deste gnero (que est noutra diviso) temos 3 espcies a considerar: A.fumigatus, niger e flavus. Existem vrios critrios para proceder sua separao e identificao. O primeiro a disposio das filides em torno das vesculas: o fumigatus tem o cabelo em p, ou seja, as filides s ocupam 2/3 da parte terminal da vescula; no niger, a disposio radial e tem um aspecto de sol tpico(colorao acastanhada); o flavus aparece desorganizado, como se estivesse despenteado, ou seja, aparecem as filides em todas as direces (imagem fumigatus-niger-flavus):

Outra diferena o conidiforo que no niger e flavus abre directamente na vescula mas no fumigatus h uma dilatao visvel nas fotos, chamada de conidiforo em moca; outro pormenor que o conidiforo 6

do fumigatus bem mais curtinho que o dos outros(imagem ao lado), ao contrrio do conidiforo do niger que muito comprido; no A. flavus o tamanho varivel. Um outro aspecto que a parede do conidiforo pode ser lisa ou rugosa e salienta-se aqui o A. flavus como sendo o nico destes a ter a parede rugosa, ou seja, tem um conidiforo rugoso ou espinhoso, sendo visveis uns pontinhos a 40x; no entanto a presena de um elevado n. de esporos dificulta a visualizao. Outro aspecto que diferencia as espcies que o A. fumigatus unisseriado enquanto que o niger bisseriado. O flavus naquela base de que pode ser uni ou bi e torna-se dificil distinguir a mtula da filide. J se reparou pela descrio que nem sempre fcil distinguir niger de flavus, pois a organizao dos esporos nem sempre bem A. fumigatus evidenciada o que se aconselha que vejam mais que um para se chegar a uma concluso. H o pormenor de o A. niger ter ento, como diz o nome, esporos negros e portanto a periferia das cadeias de condeos negra e para se ver melhor basta retirarmos ao meio de suspenso o corante (azul de algodo). Porque eu sei que se torna um pouco dificil fazer uma diferenciao ntida das 3 espcies faz-se um resumo a seguir devidamente ilustrado: Aspergillus Disposio das filides 2/3 da vesicular Fumigatus radial Niger Flavus desorganizado Conidiforo Curto/em moca/liso Tamanho varivel Termina na vescula/liso Comprido/termina na vescula/espinhoso Filides Unisseriado Bisseriado Uni/Bi Esporos hialinos negros hialinos

A. fumigatus

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A. niger

A. flavus

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Fig.2

Fig.4

Fig.1

Fig.3

Algumas imagens de preparaes de Aspergillus das aulas:em 1 temos um A. fumigatus; a fig.2 mostra uma vescula muito escura sendo de flavus ou niger (assim pela desorganizao parece flavus); o mesmo se passa com a fig. 3, que pode ser flavus ou niger; a fig. 4 aponta mais para um niger pela disposio radial mais ou menos organizada.

Fig. 1

Fig. 2

Fig. 3

Magnficas figuras da aula: 1 Syncephalastrum, s para se ver as semelhanas e diferenas; 2 A. Niger ou flavus, notar as mtulas, portanto provavelmente niger ; 3-A. Flavus ou niger, no dando para distinguir muito bem s com esta estrutura. As visualizaes que fizemos ao M.O. de Aspergillus tiveram como objectivo ver as vesculas e os fialocondeos alm dos caracteres j mencionados quando possvel. Numa das observaes tinhamos um A. flavus jovem e ento s poderamos ver vesculas sem filides e algumas vesculas com filides mas sem condeos; noutro microscpio tinhamos um A. niger maduro onde podamos ver nitidamente as mtulas e as filides. Outro gnero alvo das nossas visualizaes e cuja identificao de espcie no nos exigida o Penicillium. 9

No entanto foi salientado o critrio pelo qual se faz a diferenciao dos Penicilliuns e que se trata do grau de ramificao do conidiforo. No esquema ao lado temos um conidiforo simples com filides (a) e depois temos respectivamente em (b)(c)(d), conidiforos uni, bi e triverticilados. Ficamos ento com esta ideia e mais no ser preciso saber. Seguem-se imagens de alguns exemplos de ramificao: a imagem A simples, a B monoverticilada e a C biverticilada, com dois C pontos de ramificao. A imagem D foi colhida na aula e mostra um Penicillium biverticilado, ou seja, tem uma ramificao no conidiforo e uma A outra nas mtulas. O esquema da ramificao ajuda bastante no que respeita B a saber os pontos de ramificao. Prosseguindo o nosso estudo dos bolores, mais uma tcnica de visualizao de bolores foi ensinada: a tcnica da fita adesiva. Esta tcnica tem a vantagem de preservar melhor as estruturas e consiste em usar fita cola para arrancar na cola um pouco de miclio e colocar na lmina. uma tcnica sptica, ou seja, vai contaminar a cultura e por isso s se deve usar quando a contaminao da 10

D

cultura no constitui problema (para fazer confrimaes no final de um estudo por exemplo).O modus operandis da tcnica o seguinte: (funciona muito melhor em placas do que em tubos e desaconselhado para o exame) corta-se um pedao de fita-cola sem tocar com os dedos pois seno ela fica baa e dificulta a observao; numa lmina colocar azul de lactofenol; tocar, com a ajuda dos dedos, com a fita cola na cultura de uma placa e tranpor a fita para a lmina( se usarem os dedos desinfecta!); em tubo, usa-se um fio que vai l dentro com a fita colada e toca na cultura; c fora, com a ajuda de outro fio cola-se na lmina; em ambos os casos coloca-se uma lamela e uma gota de azul de lactofenol se acharem necessrio. Quanto a aspectos macroscpicos, apesar de no termos dado muita importncia, tomamos a ateno de alguns. Os Aspergillus no ocupam inteiramente a placa e por trs apresentam uma rugosidade; o niger tem um aspecto aveludado com algum miclio areo (parece cabecinhas de fsforo pequeninas); flavus tem uma aspecto semelhante mas mais ao branco ou amarelo; o fumigatus tambm amarelinho; o niger bastante escuro devido colorao dos esporos. O pennicillium branco e apresenta uma rugosidade por trs. Nestas imagens temos o aspecto em placa de respectivamente da

esquerda para a direita A. fumigatus, niger e flavus e a imagem de baixo uma cultura de Penicillium. As imagens so diferentes do aspecto com que contactamos nas aulas e das descries.

Vimos na aula seguinte outros tipos de conidiognse, ou seja, o critrio passou a ser, no a taxonomia, mas o tipo de reproduo sexuada e por isso no misturar os dois tipos de critrios. Sugiro que leiam a parte de Micologia do livro do Prof. Joo Carlos especialmente da reproduo assexuada para perceber o que foi visto na aula; usem a fotocpia com os esquemas e exemplos dados pela prof. Comeamos por falar na conidiognese do tipo talortrico e que holortrica gerando-se artrocondeos, que provm da fragmentao de uma zona terminal das hifas (caso que est presente no Trychosporon e no Geotrichum candidum formao na imagem). O tipo de conidiogse blstica tambm nosso conhecido pois nada mais nada menos do que a gemulao das leveduras (da o nome de blastocondeos) e que tambm acontece noutros fungos filamentosos mas no se chama de gemulao (a partir dos artrocondeos do Geotrichum por exemplo). Outro tipo de conidiognese a tlica solitria que holotlica tambm e um exemplo dela a formao de endsporos nos zygomicetes como o caso dos clamidsporos no mucor; vamos ver na aula este processo como produo de aleureocondeos em que h uma dilatao da hifa num agente causadro de tinhas (dermatfito) 11

Microsporum gypseum (imagem). De notar o aspecto fusiforme na extremidade na hifa e dando um macrocondeo septado. Passando para a conidiognse blstica, mencionamos j que se trata da gemulao, ela no entanto pode aparecer em diferentes arranjos: podem aparecer como cadeias acrpetas, baspetas, etc... Temos ento dentro da blstica, a holoblstica e a enteroblstica. Na holoblstica geram-se cadeias acrpetas em que um condeo gera outro de tal forma que o mais distante da clula conidiognica o mais novo (Cladosporium (fungo negro=dematiceo) que aparece com os condeos parecendo um galho de uma rvore imagem ), neste processo h uma forma especfica em que parece que os condeos se geram a partir de um poro de um outro, gerando assim porocondeos; isso o exemplo tpico de uma Alternaria spp (dematiceo).

CladosporiumAlternaria Como tambm consta na fotocpia dada pela prof, h ainda mais duas formas da conidionnese blstica do tipo holoblstico: a simpodial, em que h formao de uma espcie de ziguezague durante o processo de formao dos condeos (parece um cacho e podem aparecer s vezes algumas cicatrizes de condeos produzidos) e o caso prtico a Drechslera spp, tambm dematiceo; a regressiva em que h formao de uma estrutura que parece uma flor e por vezes visvel uma estrutura em taco de golfe na formao de um nico condeo; a partir do taco de golfe parece que cresce para baixo e da este nome; neste caso temos o Trychotecium (no

Drechslera sp.

Trychotheciumsp. richothecium dematiceo). Agora virando-os para o tipo de conidiognese blstica enteroblstica (aquela em que h um rebento para sair um condeo (eu associo ideia de vermos uma gota a formar-se na ponta de uma bureta)) h 3 tipos interessantes. Um deles o tipo fialdico que acontece no Penicillium e no aspergillus e noutros fungos de importncia clnica como o Fusarium spp (no dematiceo). e a Phialophora spp. Nestes temos presena de filides que so difceis de observar; s vezes aparecem umas agulhinhas mas 12

no vemos nenhum condeo mas devemos procurar para ver os microcondeos; no Fusarium temos macrocondeos com forma tpica de banana; na Phialophora (dematiceo),como um fungo pequenino, deve ver-se a 40x e de olhos bem arregalados filides tpicas e condeos, parecendo uma jarra com

Fusarium spp. Microcondeos Macrocondeos flores.

Phialophora sp

Temos depois a enteroblstica do tipo aneldico, com a formao de anelocondeos. semelhante filide mas neste caso, a estrutura conideognica o anelforo; visualmente parecido com o penicillium, contendo agrupamentos semelhantes. Pdemos no ver os anelforos pois eles perdem o contedo mas tm tipicamente uma base truncada; no esporo aparece uma cicatriz e de cada vez que um condeo se solta fica um anel no anelforo. Aparecem algumas cadeias por vezes; o gnero representativo o Scopulariopsis sp (no dematiceo) Esto nas imagens abaixo.

Das preparaes que vimos algumas so fragmentos de miclio em azul de lactofenol e outras so fitas adesivas, que preservam melhor os arranjos naturais, apesar de uma das suas limitaes que por vezes podemos nem chegar a conseguir colher as estruturas perfeitas ou pretendidas dos fungos. Uma outra tcnica concebida para preservar as estruturas naturais dos fungos ao M.O. a tcnica da cultura em lmina demonstrada na aula; cultivamos cultura num quadradinho e depois 13

temos de procurar em 10x nos bordos para encontrarmoa mais facilmente as estruturas. Assim de forma resumida temos uma placa esterilizada com papel de filtro, um suportezinho de vidro (B) uma lmina e uma lamela. Com a ajuda de uma pina flamejada colocamos a lmina em cima desse suporte e coloca-se a lamela pousada em cima da lmina; corta-se um quadradinho de meio com um bisturi flamejado com cerca de 1 cm de lado(A) e vai para a lmina (C); pode semear-se mais que uma vez por lmina quando temos o meio na lmina e assim podemos ter culturas para observao com estados de maturao diferentes; a inoculao do meio feita nos bordos do meio (ns usamos um fungo negro); aps isto colocamos a lamela em cima do agr (D). O fungo cresce por baixo primeiro e depois forma-se o miclio areo que sai para fora do meio e cresce entre a lmina e a lamela. O papel de filtro humedecido para manter o teor de humidade necessrio e pode adicionar-se glicerina que humectante; marca-se a placa e coloca-se a data incuba-se depois a 25C sem inverter. Aps a incubao fazemos a preparao colocando uma gota de azul de lactofenol e retiramos a nossa lamela com uma pina da placa de petri, destacamos o bloco de agar, deixamos secar e colocamos a lamela em cima da gota; com a lmina da cultura, limpamos com papel no seu verso e na zona de crescimento vaise colocar azul de lactofenol e uma lamela por cima! Ficamos assim com duas preparaes para observar: uma com a lamela da cultura e outra com a lmina! Uma das coisas que se fizeram na aula foi repicar culturas de Bacal para termos depois fungos para identificar. Ficamos assim com culturas em rampa para proceder identificao e ao olhar para uma rampa devemos ter ateno ao verso e ao pigmento; a observao ao microscpio que vai confirmar as suspeitas. Numa segunda fase temos de ler as colnias: verso se tem cor, se esta difunde para o meio e depois de frente, se tem cor, a textura, o relevo, etc. Quando temos 3 Aspergillus isto pode auxiliar a classificao pois podemos recorrer a chaves dicotmicas em tabelas para nos guiarmos (exemplo de tabela para aspergillus abarcando tambm aspectos microscpicos). Consistently Observed Morphological Characters of Reference Isolates clav pen vers terr cand niger ochr flav amst nid fum colored mycelia exudate colored reverse soluble pigment sclerotia\cleistothecia Hlle cells rough stipe colored stipe globose pyriform + (+) (+) + + + + (+) + vesicle (+) + (+) + + + + + (+) + + + + + + (+) + + + (+) + + + + + + Legend clav=Aspergillus clavatus, pen=Aspergillus penicilliodes, vers=Aspergillus versicolor, terr=Aspergillus terreus, cand=Aspergillus candidus, niger=Aspergillus niger, ochr=Aspergillus ochraceus, flav=Aspergillus 14

spathulate clavate uniseriate biseriate globose ellipsoidal smooth-walled rough-walled ascospores

+ + + + -

+ + + + + -

+ + + (+) + -

+ conidia + + -

(+) + + + -

+ + + -

+ + + -

+ + + + -

+ + + + (+) + +

+ + + + +

+ (+) + + (+) + (+) -

conidial heads

flavus, amst=Eurotium amstelodami, nid=Emericella nidulans, fum=Aspergillus fumigatus

Na aula tenho uma referncia ao facto de haver numa gelose sangue, num ps de ouvido, A. niger e fez-se depois uma repicagem dessa micose subcutnea (presena de uma serosidade). Mencionaram-se picndeos (aglomerados de hifas) e cabeas de fsforos que se designam de cormios. Procedemos assim s observaes do que exposemos anteriormente. Vamos resumir isso.

Gnero Geotrichum Microsporum Cladosporium Alternaria

Dematiceo no No dermatfito sim sim

Rep. assex Tlica tlica holoblstica holoblstica

Tipo de rep. holortrica holotlica acrpeta Acrpeta

observaes Artrocondeos; parece bactrias com cpsula aleureocondeos Tipo galho de rvore Porocondeos; com septos dentro 15

Drechslera Trichotecium Scopulariopsis Fusarium Phialophora

sim no no no sim

holoblstica holoblstica enteroblstica enteroblstica enteroblstica

Simpodial Regressiva Aneldica fialdica Fialdica

ziguezague Taco de golfe, cels bidivididas Parece negro Bananas; macro e micro Garrafa e aglomerados de condeos

ltima aula de micologia Antes de procedermos a qualquer reviso, viramo-nos para a observao de estruturas de reproduo sexuada e de agregados de hifas, coisas que no se fazem rotineiramente num laboratrio. Lmina Filo Estrutura Observaes Exemplo

1

Zygomicetes

Zigosporngio

Heterotlico

2

Zygomicetes

Zigosporngio

Homotlico

3

Zygomicetes

Zigosporngio

Com apndices (Absidia)

4

Ascomycetes

Peritcio

Negro (ascos+ Ascsporos)

5

Ascomycetes

Cleistotcio

ascos+Ascsporos globoso

16

6

Ascomycetes

Ascos nus

S. cerevisiae

7 8

-

esclercito Picndeo

Parecido com cleistotcio (s que vegetativo) Globoso; saem condeos

-

Outro assunto que abordamos foi a susceptibilidade aos antifngicos (para bolores e leveduras!). Os antibiogramas na micro so reprodutveis o que no acontece aqui na micologia e torna-se complicado testar essa susceptibilidade. Isto deve-se ao facto de haverem muitas formas de fungos, alguns pleomrficos e nos testes de difuso em placa, alguns frmacos tm dificuldade em difundir; dever-se-ia usar a mesma quantidade de inculo mas para fungos filamentosos difcil homogeneizar e por vezes difcil ter esporos; assim difcil ter sucesso usando mtodos de difuso em placa. Outro facto que se assim fosse, precisavamos de dois meios diferentes para testas as substncias: um deles sinttico para umas substncias e depois outro para os azis e os polienos pois estes exigem pHs mais elevados. Outro problema que por exemplo, apaesar de haver um halo de inibio existem microcolnias nesse halo o que dificulta a interpretao. Apesar disto tudo existem discos de antifngicos disponveis. H no enstanto um teste normalizado que um teste feito por macromtodo em meio lquido; colocamos um inculo padronizado e vemos depois a dliluio maior em que actua o frmaco (CMI) (isto bonito apesar de no ser vivel de fazer num hospital). Existem no entanto bons testes de sensibilidade fazendo uso de um meio especfico que o RPMI 1640 glutamizado e tamponado a pH 7 que d para todos os antifngicos. O mtodo tambm est permitido em micromtodo (usando aquelas placas de titulao tipo ELISA) a leitura feita comparativamente a um controlo positivo e um coontrolo negativo e vivel para leveduras. Para os bolores h a tentativa de normalizao pelo NCCLS (?) e h at um mtodo normalizado do tipo macromtodo, em que se vem os novelos de bolores que crescem ou no; a professora na aula mostrou um destes testes com um leo essencial, de camomila, que aps 3-7 dias de incubao gerou novelos em alguns tubos. Ao analisar vemos que na diluio 64 j h crescimento logo a CMI seria 32. apesar de sabermos que aos 32 j inibimos o fungo, no sabemos se por ele parar o seu metabolismo ou ser morto pela substancia. Para sabermos isso poderamos retirar 100 l para um Sabouraud e ver se cresca cultura; se com diluio 32 crescesse cultura e com diluio 16 no, ento a nossa CLM (concentrao letal mnima) sera 16. Portanto, interessa avaliar a capacidade fungisttica e fungicida da substncia. Apesar de tudo esta tcnica no completamente eficaz e no existe nenhum teste perfeitamente vivel. A Biomrieux lembrou-se de fazer um teste tipo API mas em vez de aucares, temos antifngicos a dferentes concentraes nos pocinhos ATB Fungus e que tem o problema de no se aproximar das normas em vigor. Temos uma parte da galeria com um antifngico e o resto com outros; inocula-se os primeiros 5 poos de 5- fluorocitosina (de concentrao 0,25 a 0,128)(?) com a nossa suspenso fngica e depois temos de a alcalinizar para semear os outros poos de poliis (concentrao 1/2/4/8) e os outros; Como alguns antifngicos s tm direito a 2 pocinhos com concentraes diferentes s d para avaliar se sensvel ou resistente e no sabemos CMI ou CML.; outra agravante que os antifngicos que mais se usam no constam na galeria!!Conforme ele cresce na mnima e na concentrao mxima podemos definir se sensvel, resistente, ou de sensibilidade intermdia, etc. Outro sistema que vimos foi o Fungiteste que tem a vantagem de no termos de fazer nenhum passo de alcalinizao e aproxima-se mais das normas em vigor, temos uma microgaleria e inoculamos 17

com 2 controlos positivos, 2 controlos negativos e depois vamos testar apenas se o fungo sensvel ou resistente a determinado antifngico. O teste colorimtrico e se h crescimento d uma colorao rosa e e no crescer fica rxo. No resto da aula, a partir de algumas rampas fizemos exames a fresco para tentar chegar sua identificao, mas no tenho quaiquer imagens e portanto acho que no vale a pena colocar. Se algo for necessrio actualizar estejam atentos ao site! Obrigado Tiago pelo material! Ztolas et al, 2003

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