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BRADICININA SOBRE A ATIVIDADE Na -ATPásica DE …livros01.livrosgratis.com.br/cp093397.pdf · stimulatory effect of BK, via B2 receptor, is mediated by activation of PI-PLCβ/PKC;

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Text of BRADICININA SOBRE A ATIVIDADE Na -ATPásica DE …livros01.livrosgratis.com.br/cp093397.pdf ·...

  • JANANA DRIA LBANO SOARES

    PROSTAGLANDINA E2 MEDEIA O EFEITO DE

    BRADICININA SOBRE A ATIVIDADE

    Na+-ATPsica DE TBULO PROXIMAL

    TESE SUBMETIDA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE

    JANEIRO VISANDO A OBTENO DO GRAU DE

    DOUTOR EM CINCIAS

    Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Cincias da Sade Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho 2008

  • Livros Grtis

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    Milhares de livros grtis para download.

  • ii

    Janana Dria Lbano Soares

    PROSTAGLANDINA E2 MEDEIA O EFEITO DE BRADICININA SOBRE A

    ATIVIDADE Na+-ATPsica DE TBULO PROXIMAL.

    Tese de Doutorado submetida ao Programa

    de Ps-graduao em Cincias Biolgicas, Instituto

    de Biofsica Carlos Chagas Filho, da Universidade

    Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos

    requisitos necessrios obteno do ttulo de

    Doutor em Cincias Biolgicas (Fisiologia).

    Orientador: Prof. Dr. Celso Caruso Neves

    Rio de Janeiro

    jun/2008

  • iii

    Lbano-Soares, Janana Dria

    Prostaglandina E2 medeia o efeito de bradicinina sobre a atividade

    Na+ - ATPsica de tbulo proximal./ Janana Dria Lbano Soares.

    Rio de Janeiro: UFRJ / IBCCF, 2008.

    xiii, 134 f. : il. ; 29,7 cm.

    Orientador: Prof. Dr. Celso Caruso Neves

    Tese (doutorado) UFRJ/IBCCF, Programa de Ps-

    Graduao em Cincias Biolgicas, Fisiologia, 2008.

    Referncias bibliogrficas: f. 96-125

    1. Na+-ATPase. 2. Receptor B2 de bradicinina. 3. Tbulos renais proximais. 4. Fosfolipases A2. 5. Sistema calicrena-cinina. 6. Transduo de sinal. 7. Animal. 8. Fisiologia Tese. I. Caruso-Neves, Celso. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, IBCCF, Programa de Ps-Graduao em Cincias Biolgicas, Fisiologia. III. Ttulo.

  • iv

  • v

    Ao meu orientador, Celso,

    ao meu tio Jackson (in memorian),

    minha me Ivany, minha irm Luanda

    e ao meu amor Daniel.

    Pela importncia que cada um de vocs tm na minha vida.

    Com todo carinho e gratido.

  • vi

    AGRADECIMENTOS

    A Deus, pai de infinito amor e sabedoria, e aos queridos amigos protetores

    espirituais. Agradeo sinceramente pela vida, pela proteo diria e pela

    oportunidade de concluir mais uma etapa.

    Ao meu tio Jackson (in memorian). Neste momento voc no est presente,

    fisicamente, para que eu possa lhe dizer o quanto voc importante na minha vida.

    Mas quero lhe agradecer mais uma vez por todo o apoio na poca do meu

    nascimento, pelo carinho ao me fazer dormir, por vibrar a cada novidade com seu

    olhar confiante que sempre representava a certeza que tudo daria certo. Voc vive

    nas lembranas que ficam dos bons momentos, na saudade tambm do que no

    vivemos juntos e na esperana do reencontro algum dia. Que continue acesa a

    chama de suas esperanas e objetivos! Que brilhe a sua luz! Saudades, muitas!

    minha me, pessoa mais importante na minha vida! s olhar nos seus olhos

    para perceber a luz que emana do seu ser. Querida, guerreira, companheira,

    dedicada, protetora, meu pai, minha ME. Impossvel te definir com palavras.

    Agradeo pela oportunidade de ser sua filha, pelo carinho, pelo amor e pelo

    incentivo sempre. Desde o primeiro instante voc acreditou que nenhuma dificuldade

    seria empecilho para as nossas vidas e nunca se desanimou. Esta conquista

    tambm sua! Te amo!

    minha irm Luanda. Amiga que se preocupa comigo e torce pelas minhas

    conquistas. Mesmo com o seu jeito calado consegue demonstrar todo o carinho e

    amor. Obrigada pela preocupao comigo. Te amo, Lu! Confie sempre em voc e

    no desista de seus ideais! O nosso sucesso depende muito de ns mesmos!

    Ao meu amigo, companheiro e querido marido Daniel. Muito obrigada por estar

    comigo nesta etapa da minha vida. Nossa unio fundamental, meu amor! Que bom

    que reencontrei voc, uma pessoa especial, que est ao meu lado quando estou

    triste e me alegra mais ainda quando estou feliz. Que tenta me entender at quando

    estou insuportvel. Obrigada por fazer meus dias mais alegres, por cuidar de mim

    com amor, carinho e respeito. Depois de voc os outros so os outros e s! Qui, te

    amo!

  • vii

    Ao meu amigo e orientador, Celso. Grande idealizador deste projeto e de todos os

    outros muitos! Muito mais que competente orientador, um exemplo. Mas no um

    simples exemplo, um verdadeiro exemplo de dignidade, carter, humildade e

    determinao. Todos precisam conhecer o ser humano fantstico que voc !

    Sempre pronto a ajudar em todas as questes, com um corao enorme, e sempre

    preocupado com a minha formao. Mesmo quando a distncia era grande voc

    estava sempre presente. Obrigada pela dedicao! Obrigada por ser meu amigo,

    incentivador, por indicar o caminho e a direo certa, para que possamos crescer.

    Por acreditar, muitas vezes mais que eu, em mim e no meu potencial. um orgulho

    ter voc como amigo e orientador! um desafio conseguir retribuir TUDO o que

    voc fez por mim. Voc me ensinou muito alm da Cincia, mas lies de vida.

    Obrigada sinceramente por tudo mesmo!

    professora Vnia pela reviso dedicada e atenciosa desta tese. Muito obrigada

    pelo carinho!

    minha madrinha e tia Yvone, meu padrinho e tio Jefferson, tia Nilda, Priscila, tia

    Lcia e minha nova v Maria, muchinho. Vocs so uma verdadeira famlia.

    Obrigada por vibrarem pelas minhas conquistas e pelas preces. Querer poder!

    Amo muito todos vocs!

    Aloa, baixinha inteligente e divertida! Que me ajudou desde quando eu entrei no

    lab, desde o incio nos primeiros seminrios, quando eu tinha dvidas sobre os

    artigos. Obrigada por tudo que voc me ensinou, pelo incentivo, pela ajuda e

    amizade. Aloinha, amiga, valeu mesmo!

    Mira, minha amiga! Muito obrigada pela fora, pelo carinho e pela ajuda! Valeu

    pelo companheirismo, amizade e apoio. E tambm pelos momentos de

    descontrao, fabrimar, rs!

    Aos meus amigos, La, Marcelo, Luiza, Simone, Z, Betinha, Ana Paula e Giany,

    que sempre esto presentes nas minhas conquistas. Obrigada pelos momentos de

    descontrao, pelo carinho e apoio sempre!

  • viii

    Ana Accia, companheira de salinha sempre alegre e tranqila. Voc muito

    competente e merece mesmo tudo de melhor !!

    Sharon, pela amizade recente e pelo apoio, sempre dedicada e pronta pra ajudar.

    Obrigada Sharon!

    professora Elaine, ao Helder e ao Eugnio, com quem eu participei na fase inicial

    deste projeto, obrigada!

    Ao Victor pela dica importante, rs e pelas brincadeiras. Fala pelos cotovelos! Valeu

    Vitinho!

    Ao Shan pela ajuda, pela alegria e pelos momentos de descontrao.

    Sandrinha pela ajuda, principalmente nos detalhes de ltima hora.

    A todos os amigos do laboratrio de Bioqumica Renal, que eu no mencionei, mas

    nem por isso so menos importantes. Muito obrigada!

  • ix

    RESUMO

    PROSTAGLANDINA E2 MEDEIA O EFEITO DE BRADICININA SOBRE A ATIVIDADE Na+-ATPsica DE TBULO PROXIMAL Janana Dria Lbano Soares Orientador: Celso Caruso Neves Resumo da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Ps-graduao em Cincias Biolgicas, Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas (Fisiologia).

    Bradicinina, o principal peptdio do sistema calicrena-cinina, desempenha um

    papel importante no balano eletroltico, assim como na regulao da presso

    arterial. J foi descrito que este peptdio modula a atividade da Na+-ATPase

    presente em membrana basolateral de tbulo proximal renal de maneira bifsica. O

    efeito estimulatrio mediado pelo receptor B1. O efeito inibitrio mediado pelo

    receptor B2 e apresenta duas fases: em tempos curtos ocorre estmulo da atividade

    enzimtica e em tempos longos ocorre a inibio. Neste trabalho foram estudados

    os mecanismos moleculares envolvidos na ao de BK, via receptor B2, sobre a

    modulao da atividade Na+-ATPsica de tbulo proximal. Foi observado que: 1) a

    ativao da via PI-PLCb/PKC est envolvida na fase estimulatria do efeito de BK,

    via B2, sobre a atividade Na+-ATPsica; 2) a ativao prvia da via PI-PLCb/PKC

    necessria para que ocorra a ativao da PLA2; 3) a PLA2 envolvida pertence a

    famlia iPLA2 e est associada a membrana basolateral; 4) o efeito inibitrio de BK

    depende de AA e COX; 5) a inibio da Na+-ATPase por BK modulada por PGE2,

    via AMPc/PKA; 6) PGE2 capaz de modular a iPLA2, indicando um processo de

    retroalimentao positiva, tambm mediado pela via AMPc/PKA, sustentando o

    efeito final de inibio da reabsoro de sdio no tbulo proximal por BK. Esses

    resultados demonstram que BK, atravs do mesmo receptor, capaz de ativar vias

    de sinalizao interdependentes, com efeitos opostos e a integrao destes sinais

    converge em um evento final: a regulao da reabsoro de sdio.

    Palavras-chave: bradicinina, transporte de sdio, sinalizao celular, receptores, tbulo proximal Rio de Janeiro Jun/2008

  • x

    ABSTRACT

    PROSTAGLANDIN E2-MEDIATED BRADYKININ EFFECT ON THE PROXIMAL TUBULE Na+-ATPase ACTIVITY Janana Dria Lbano Soares Orientador: Celso Caruso Neves Abstract da Tese de Doutorado submetida ao Programa de Ps-graduao em Cincias Biolgicas, Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho, da Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como parte dos requisitos necessrios obteno do ttulo de Doutor em Cincias Biolgicas (Fisiologia).

    Bradykinin, the principal peptide of the kallikrein-kinin system, plays na

    important role in electrolyte balance as well as blood pressure regulation. It has been

    already described that BK modulates the Na+-ATPase from basolateral membrane of

    kidney proximal tubule cells, in a biphasic manner. A stimulatory effect is mediated

    by B1 receptor. An inhibitory effect, mediated by B2 receptor, has two phases: short

    incubation times stimulate the enzyme activity and long incubation times inhibit it. In

    this work was evaluated the molecular mechanisms involved in B2-mediated

    modulation of proximal tubule Na+-ATPase by BK. It was observed that: 1) the

    stimulatory effect of BK, via B2 receptor, is mediated by activation of PI-PLC/PKC;

    2) prior activation of the PI-PLC/PKC pathway is required to activate the PLA2; 3) a

    membrane-associated, Ca2+-independent PLA2 isoform is involved in the effect of

    BK; 4) the inhibitory effect of BK depends on the metabolism of AA by COX; 5) PGE2

    mediates the inhibitory effect of BK on Na+-ATPase activity through cAMP/PKA

    pathway; 6) PGE2 enhances iPLA2 activity, an important positive feedback, also

    mediated by cAMP/PKA pathway, that could be responsable to sustain the final

    inhibitory effect of BK on sodium reabsorption proximal tubule. These results reveal

    that BK, throught the same receptor, is able to start an interdependent signaling

    pathway, with opposite effects and the different pathways activated in this process

    converge to a final common event: sodium reabsorption regulation.

    Key-words: bradykinin, sodium transport, cellular signaling, receptors, proximal tubule. Rio de Janeiro Jun/2008

  • xi

    SUMRIO

    1 INTRODUO _____________________________________________________ 1

    1.1 Funo renal _________________________________________________________2

    1.2 (Na++K+)ATPase ______________________________________________________5

    1.3 Na+-ATPase __________________________________________________________8

    1.4 Mecanismos de regulao do volume extracelular_________________________12

    1.5 Sistema Calicrena-Cinina _____________________________________________17 1.5.1 Receptores e vias de sinalizao de cininas _____________________________ 25

    1.5.1.1 Fosfolipase C/Protena cinase C (PLC/PKC) _______________________ 31

    1.5.1.2 Fosfolipase A2 (PLA2)___________________________________________ 35

    1.5.1.3 Prostaglandina E2 (PGE2) _______________________________________ 37

    1.6 Resultados anteriores ________________________________________________43

    2 OBJETIVOS ______________________________________________________ 47

    3 MATERIAIS E MTODOS ___________________________________________ 48

    3.1 Materiais ___________________________________________________________48

    3.2 Preparao de membrana basolateral ___________________________________49

    3.3 Medida da atividade ATPsica _________________________________________51

    3.4 Medida da atividade de PLC ___________________________________________51

    3.5 Medida da atividade de PLA2___________________________________________52

    3.6 Anlise eletrofortica e Western Blotting ________________________________52

    3.7 Ensaio de ligao de [35S]GTPgS _______________________________________53

    3.8 Medida da atividade de protena cinase A ________________________________54

    3.9 Anlise estatstica ___________________________________________________54

    4 RESULTADOS ____________________________________________________ 55

    4.1 Efeito estimulatrio de BK sobre a atividade Na+-ATPsica _________________55

    4.2 Caracterizao do tipo de PLA2 envolvida no efeito de BK __________________59

    4.3 Interdependncia entre as fases estimulatria e inibitria, moduladas por BK via receptor B2 ____________________________________________________________64

    4.4 Papel dos produtos de PLA2 no efeito inibitrio de BK _____________________64

    4.5 Via de sinalizao envolvida no efeito de PGE2 ___________________________68

    4.6 Modulao de PLA2 por PGE2 __________________________________________72

    5 DISCUSSO______________________________________________________ 81

    REFERNCIAS _____________________________________________________ 96

    APNDICE - ARTIGO PUBLICADO DURANTE O DOUTORADO____________________ 126

  • xii

    LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Mecanismos de transporte atravs das clulas epiteliais de tbulos proximais de mamferos ________________________________________________________________4 FIGURA 2. (Na++K+)ATPase__________________________________________________6 FIGURA 3. Interao entre o sistema calicrena-cinina plasmtico e sistema renina-angiotensina. _____________________________________________________________16 FIGURA 4. Representao esquemtica do sistema calicrena-cinina_________________18 FIGURA 5. Receptores de bradicinina _________________________________________27 FIGURA 6. Isoformas de PLC e PKC __________________________________________33 FIGURA 7. Metabolismo do AA via COX _______________________________________39 FIGURA 8. Expresso da ciclooxigenase, prostanide sintase e receptores prostanides no rim _____________________________________________________________________40 FIGURA 9. Curso temporal do efeito de BK, via B2, sobre a atividade Na

    +-ATPsica _____45 FIGURA 10. Mecanismo de ao de BK sobre a Na+-ATPase, via receptores B1 e B2 ____46 FIGURA 11. Efeito de HOE140 (antagonista de receptor B2) sobre a atividade Na

    +-ATPsica modulada por BK. _________________________________________________________56 FIGURA 12. Efeito de U73122 (inibidor de PI-PLCb) sobre a modulao da atividade Na+-ATPsica por BK. _________________________________________________________57 FIGURA 13. Curso temporal do efeito de BK sobre a atividade de PLC. _______________58 FIGURA 14. Efeito de PACOCF3 e BEL (inibidores de iPLA2) sobre a modulao da atividade Na+-ATPsica por BK. ______________________________________________60 FIGURA 15. Deteco de iPLA2 em MBL de tbulo proximal ________________________61 FIGURA 16. Efeito de PACOCF3 e BEL (inibidores de iPLA2) sobre a modulao da atividade da PLA2 por BK. ___________________________________________________62 FIGURA 17. Efeito de HOE 140 (antagonista de receptor B2) e GDPbS (inibidor de protena G) sobre a modulao da atividade da PLA2 por BK. ______________________________63 FIGURA 18. Modulao do efeito de BK sobre atividade de PLA2 por U73122 (inibidor de PI-PLCb). __________________________________________________________________65 FIGURA 19. Modulao do efeito de BK sobre atividade de PLA2 por calfostina C e PMA (inibidor e ativador de PKC, respectivamente).___________________________________66 FIGURA 20. Efeito de AA sobre a modulao da atividade Na+-ATPsica por BK. _______67 FIGURA 21. Efeito de AA e BK sobre a atividade Na+-ATPsica na presena de inibidores de COX _________________________________________________________________69 FIGURA 22. Efeito de GDPbs sobre a modulao da atividade Na+-ATPsica por PGE2.__70 FIGURA 23: Efeito de PGE2 na ligao de [

    35S]GTPgS MBL. ______________________71 FIGURA 24: Efeito de CTX sobre a modulao da atividade Na+-ATPsica por BK ou PGE2.________________________________________________________________________73 FIGURA 25: Efeito de FSK sobre a modulao da atividade Na+-ATPsica por BK. ______74 FIGURA 26: Efeito do inibidor de PKA sobre a modulao da atividade Na+-ATPsica por BK ou PGE2. ________________________________________________________________75 FIGURA 27: Curso temporal do efeito de BK sobre a atividade de PKA. _______________76 FIGURA 28: Curso temporal do efeito de PGE2 sobre a atividade de PLA2. ____________77 FIGURA 29: Efeito dos inibidores de iPLA2 (PACOCF3 10

    -6M e BEL 10-6M) na modulao da atividade de PLA2 por PGE2._________________________________________________79 FIGURA 30: Efeito de PGE2, CTX, AMPc e FSK na modulao da atividade de PLA2. ____80 FIGURA 31. Modelo proposto para o mecanismo molecular envolvido na modulao da atividade Na+-ATPsica por bradicinina ________________________________________95

  • xiii

    LISTA DE TABELAS

    TABELA 1. Concentraes normais dos principais constituintes dos espaos extra e

    intracelular. _______________________________________________________________1

    TABELA 2. Diferenas entre a Na+-ATPase e a (Na++K+)ATPase _____________________9

  • xiv

    LISTA DE ABREVIATURAS

    AA= cido araquidnico

    AC = adenilato ciclase

    APP = aminopeptidase P

    APM = aminopeptidase M

    ATP = adenosina trifosfato

    BEL = bromoenol lactona

    BK= bradicinina

    COX = ciclooxigenase

    CPN = carboxipeptidase N

    CPM = carboxipeptidase M

    CTX = toxina da clera

    DABK = des-Arg9-BK

    DAG = diacilglicerol

    DALBK = des-Arg9-[Leu8]-BK

    ECA = enzima conversora de angiotensinas

    EP = receptor prostanide E

    FSK = forscolina

    HMWK = cininognio de alto peso molecular

    IP3 = inositol trifosfato

    iPKA = peptdio inibidor de PKA (Thr-Thr-Tyr-Ala-Asp-Phe-Ile-Ala-Ser-Gly-Arg-Trh-

    Gly-Arg-Arg-Asn-Ala-Ile-His-Asp)

    LMWK = cininognio de baixo peso molecular

    MBL = membrana basolateral

    NEP = endopeptidase neutra

    PACOCF3 = palmitoil trifluorometil cetona

    PC = fosfatidilcolina

    PKC = protena cinase C

    PKA = protena cinase A

    PGD2 = prostaglandina D2

    PGDS = prostaglandina D sintase

    PGE2 = prostaglandina E2

    PGES = prostaglandina E sintase

  • xv

    PGF2a = prostaglandina F2a

    PGFS = prostaglandina F sintase

    PGI2 = prostaciclina

    PGIS = prostaciclina sintase

    PLA2 = fosfolipase A2

    PLC = fosfolipase C

    SDS = dodecil sulfato de sdio

    SKK = sistema calicrena cinina

    TXA2 = tromboxano A2

    TXS = tromboxano sintase

    VEC = volume extracelular

  • 1 INTRODUO

    O rim um dos principais rgos envolvidos na manuteno da homeostase

    do organismo. Uma de suas principais funes regular o volume do fluido

    extracelular, mantendo-o dentro dos limites fisiolgicos, apesar das variaes dirias

    da ingesto de sal e gua que ocorrem em um indivduo normal (MELLO-AIRES,

    2008).

    Os meios intra e extracelulares possuem composies diferentes. Em relao

    distribuio de sdio e potssio nos compartimentos intra e extracelulares, nota-se

    que o fluido extracelular rico em sdio e o intracelular em potssio (TABELA 1).

    Isto se deve, principalmente, baixa permeabilidade das membranas celulares ao

    on sdio e atividade da (Na++K+)ATPase, que mantm alta a concentrao

    extracelular de sdio (FRAILLE & DOUCET, 2001)

    TABELA 1. Concentraes normais dos principais constituintes dos espaos extra e intracelular (retirado de SELDIN & GIEBISCH, 1992).

    Constituintes Plasma gua (plasma) Espao intracelular

    mmol/L mEq/L mmol/L mEq/L mEq/L Ctions Na+ 142 142 151 151 10 K+ 4 4 4,3 4,3 160 Ca+2 1,2 2,5 1,3 2,4 0,0001 Mg+2 0,5 1 0,5 1,1 18,5 Outros 1,8 3,5 1,9 3,7 Total ctions 149,5 153 159 162,7 188,5 nions Cl- 103,5 103,5 110 110 2 HCO3

    - 24 24 25,6 25,6 8 PO4

    -3 1 2 1,1 2,1 37,5 Protena 1 16 1,1 17 55 Outros 6 7,5 8 86 Total nions 135,5 153 162,7 188,5

    Por ser o ction mais abundante no meio extracelular, o sdio de grande

    importncia na determinao do volume desse compartimento. A regulao do

  • 2

    volume relacionada primariamente com a modificao no balano de sdio, isto ,

    a relao entre sua ingesto e excreo. Assim, uma dieta rica em sdio promove

    aumento do volume do fluido extracelular e, conseqentemente maior excreo de

    sdio. Ao contrrio, uma dieta com baixo teor de sdio acarreta queda de volume e

    da excreo de sdio (BIE et al., 2004). Diferentes sistemas hormonais so

    acionados em resposta s variaes de volume e deflagram vias de sinalizao que

    culminam na modulao da excreo renal de sdio e gua (ABASSI et al., 2004).

    1.1 Funo renal

    O rim humano contm em torno de um milho de pequenas unidades

    funcionais denominadas nfrons. Os principais constituintes do nfron so: o

    glomrulo, onde ocorrem os processos de ultrafiltrao de aproximadamente 180L

    de plasma por dia, e os tbulos renais, onde ocorrem os processos de reabsoro

    e/ou secreo de solutos e gua. O plasma que chega ao rim atravs da artria

    renal filtrado pelos capilares glomerulares. A composio do fluido filtrado

    semelhante do plasma, porm com poucas protenas e macromolculas, j que a

    barreira de filtrao glomerular restringe a filtrao de molculas com base no

    tamanho e na carga eltrica (CAMICI, 2005). Aps o processo de filtrao, o filtrado

    glomerular sofre alteraes na sua composio e volume, atravs dos processos de

    reabsoro e secreo ao longo dos tbulos renais. No nfron, uma substncia pode

    ser reabsorvida ou secretada pelas vias transcelular ou paracelular. Em estados

    euvolmicos cerca de 70% do fluido filtrado so reabsorvidos no tbulo proximal,

    aproximadamente 25% na ala de Henle, 4% no tbulo distal e 2-3% no ducto

    coletor (MELLO-AIRES, 2008).

    No tbulo proximal ocorre a reabsoro de gua e quase todos os diversos

    solutos, como bicarbonato, fosfato, glicose e aminocidos. E neste segmento

  • 3

    acontece a secreo de hidrognio e ons orgnicos, alm de NH3 e creatinina. A

    reabsoro de sdio pelo tbulo proximal ocorre, em sua maior parte, pela via

    transcelular e depende do gradiente eletroqumico gerado pela (Na++K+)ATPase,

    localizada na membrana basolateral (FIGURA 1). Esta enzima hidrolisa uma

    molcula de ATP para promover a extruso de trs ons sdio e entrada de dois ons

    potssio na clula. Alm da (Na++K+)ATPase, uma segunda bomba de sdio, a Na+-

    ATPase, foi descrita na membrana basolateral (WHITTEMBURY & PROVERBIO,

    1970). O gradiente gerado por estes transportadores ativos primrios usado por

    co-transportadores localizados na membrana luminal responsveis pela entrada de

    sdio. Estes transportadores acoplam reabsoro luminal de Na+ a reabsoro de

    glicose, aminocidos, fosfato e nions orgnicos (simporte) ou secreo de prton

    (antiporte) (HEDIGER et al., 2004). Desta forma, o funcionamento acoplado dos

    transportadores luminais e basolaterais determinam a reabsoro transcelular de

    sdio.

    As membranas luminais e basolaterais das clulas do tbulo proximal contm

    protenas importantes para o transporte de fluido via transcelular, so canais de

    gua denominados aquaporinas (AQP). Estudos realizados com ratos knock-out

    para AQP1 demonstraram a importncia desta protena na reabsoro de fluido no

    tbulo proximal (SCHNERMANN et al., 1998). A deleo de AQP1 resultou numa

    reduo em mais de 50% na permeabilidade a gua e na reabsoro de fluido neste

    segmento. Este fato uma grande evidncia que o transporte transcelular o

    principal nas clulas do tbulo proximal.

  • 4

    Na+Transporte ativo primrioTransporte ativo primrio

    Transporte ativo secundrioTransporte ativo secundrio

    Transporte passivo (difusoTransporte passivo (difuso)

    Transporte ativo primrioTransporte ativo primrio

    Transporte ativo secundrioTransporte ativo secundrio

    Transporte passivo (difusoTransporte passivo (difuso)

    Fluido intersticial

    via via parapara

    celularcelular

    Fluido intersticial

    via via parapara

    celularcelular

    Fluido intersticial

    H+

    capilar

    peritubular

    clula tubular

    ncleoLuztubular

    Na+

    Glicoseaa

    Na+

    H2O

    Cl-

    viaviatranscelulartranscelular

    Luztubular

    Na+

    Glicoseaa

    Na+

    H2O

    Cl-

    viaviatranscelulartranscelular

    FIGURA 1. Mecanismos de transporte atravs das clulas epiteliais de tbulos proximais de mamferos (adaptado de MARIEB, 2001).

  • 5

    1.2 (Na++K+)ATPase

    Em 1957, a (Na++K+)ATPase foi identificada por SKOU, que observou em

    frao microssomal de nervos de pata de caranguejo a presena de uma atividade

    hidroltica de ATP estimulada por concentraes de sdio e potssio encontradas

    normalmente nos fluidos intra e extracelulares, respectivamente. A (Na++K+)ATPase

    responsvel pela reabsoro de grande massa de sdio e considerada um potente

    transdutor energtico que aproveita a energia metablica para gerar gradiente

    eletroqumico e permitir transporte de solutos transcelular (FRAILLE & DOUCET,

    2001).

    A (Na++K+)ATPase composta de duas cadeias polipeptdicas principais, as

    subunidades a e b (BLANCO & MERCER, 1998). Alm dessas subunidades foi

    identificada uma terceira subunidade denominada g, expressa no rim, que no

    fundamental para a atividade da (Na++K+)ATPase (FRAILLE & DOUCET, 2001).

    No rim, a isoforma a1b1 corresponde a 90% do total da enzima expressa nesse

    tecido (JORGENSEN & PEDERSEN, 2001).

    A (Na++K+)ATPase pertence classe das P-ATPases, as quais formam um

    intermedirio fosforilado do tipo acil-fosfato durante seu ciclo cataltico. Os dois

    estados conformacionais (E1 e E2) so caracterizados pelas diferentes afinidades por

    sdio, potssio, ATP e pela acessibilidade aos stios catinicos nos lados intra e

    extracelulares da membrana. E1 apresenta alta afinidade para o sdio e ATP, e

    baixa para o potssio. Ambos os stios de ligao de ctions esto acessveis pelo

    lado intracelular. Em E2 ocorre o inverso, os stios de ligao de ctions esto

    acessveis pelo lado extracelular e apresenta baixa afinidade para sdio e alta para

    potssio. Durante o seu ciclo cataltico, a (Na++K+)ATPase passa por diferentes

    conformaes: E1, E1-P, E2-P e E2 (FIGURA 2A). Em E1, ATP, Mg2+ e Na+ se ligam

  • 6

    A

    B

    FIGURA 2. (Na++K+)ATPase (A) Ciclo cataltico da (Na++K+)ATPase. Este modelo mostra a transio entre os

    estados conformacionais principais da (Na++K+)ATPase (E1, E1-P, E2-P e E2), os stios de ligao aos ctions e o stio de ao do inibidor ouabana. (A, B e C: vide texto). (B) Estrutura da subunidade alfa da (Na++K+)ATPase e localizao dos aminocidos fosforilados por diferentes cinases (adaptado de FRAILLE & DOUCET, 2001)

  • 7

    pelo lado intracelular, permitindo a fosforilao de E1 (E1-P) e a ocluso do Na+ (A).

    Aps a liberao de ADP, ocorre a transio de E1-P a E2-P, promovendo a

    liberao do Na+ no meio extracelular e a ligao do K+ pelo lado extracelular (B).

    Em seguida ocorre a defosforilao de E2-P e a ocluso de K+ (C). A reverso

    espontnea em E1 libera K+ no meio intracelular, completando o ciclo cataltico. Esta

    enzima conhecidamente inibida por glicosdeos digitlicos, como a ouabana, que

    em E2 se liga ao domnio extracelular, diminuindo sua afinidade pelo K+. Assim, a

    ouabana impede a defosforilao da enzima, bem como a mudana conformacional

    para E1 (FRAILLE & DOUCET, 2001) (FIGURA 2A)

    A sinalizao hormonal da (Na++K+)ATPase ao longo do nfron ocorre por

    diversos mecanismos. A subunidade cataltica a apresenta stios de fosforilao

    para os diferentes tipos de protenas cinases, sendo alvo para a modulao de

    hormnios envolvidos na regulao do volume extracelular (FIGURA 2B). A

    fosforilao por protena cinase A (PKA) pode estar associada com o estmulo da

    atividade enzimtica, como demonstrado em clulas epiteliais renais (MORDASINI

    et al., 2005; KIROYTCHEVA et al., 1999). Enquanto que a fosforilao por protena

    cinase C (PKC) pode levar tanto ao estmulo quanto inibio da atividade

    enzimtica, desencadeando diferentes efeitos fisiolgicos dependendo da isoforma

    da cinase envolvida e do stio de fosforilao (BERTUCCIO et al., 2007;

    KHUNDIMIRI et al., 2005; DURAN et al., 2004). Alm disso, algumas respostas

    como internalizao da enzima ou aumento da afinidade aparente por Na+ podem

    ser observadas quando ocorre fosforilao por PKC (CHIBALIN et al., 1999;

    FRRAILLE et al., 2000). A ativao enzimtica pode depender tambm da

    fosforilao por tirosina cinases (TK), como observado em clulas epiteliais de

    tbulo proximal (NARKAR et al., 2002; FRRAILLE et al., 1999).

  • 8

    1.3 Na+-ATPase

    Esta enzima foi inicialmente mostrada em fatias de crtex de rim de rato

    onde, mesmo na presena de ouabana foi observado o transporte de Na+

    acompanhado por Cl- e gua. Alm disso, foi mostrado que este transporte

    alternativo era inibido por cido etacrnico e furosemida, sugerindo a presena de

    uma segunda bomba de sdio (WHITTEMBURY & PROVERBIO, 1970).

    Posteriormente, em frao microssomal de crtex de rim de rato, foi determinada

    uma atividade ATPsica insensvel ouabana 10 mM e estimulada por Na+, sendo

    denominada Na+-ATPase (PROVERBIO et al., 1975).

    Vrios dados sustentam a existncia de duas ATPases estimuladas por Na+:

    a insensibilidade da Na+-ATPase a ouabana e a sua independncia de K+

    (PROVERBIO et al., 1991, MARN et al., 1985); a sensibilidade da Na+-ATPase a

    furosemida e ao cido etacrnico (PROVERBIO et al., 1991; 1986); a diferena na

    razo SDS/protena para a atividade tima da Na+-ATPase, bem como a

    insensibilidade ao tratamento com tripsina (PROVERBIO et al., 1986) e a modulao

    da sua atividade por variaes no volume (PROVERBIO et al., 1991; DI CAMPO et

    al., 1991; ARENSTEIN, et al., 1995). A TABELA 2 resume as principais diferenas

    entre a Na+-ATPase e (Na++K+)ATPase.

    Em 1985, MARN e colaboradores mostraram que a Na+-ATPase est

    localizada na membrana basolateral do tbulo proximal. Essa localizao

    semelhante em diferentes espcies animais (CARUSO-NEVES et al., 1998a, 1998b,

    1999b, 2004; MORETTI et al., 1991; PROVERBIO et al., 1991). Como a

    (Na++K+)ATPase e a Na+-ATPase tm distribuio paralela e a atividade da Na+-

    ATPase cerca de 10 vezes menor que a da (Na++K+)ATPase, o isolamento da Na+-

    ATPase se torna difcil. Em nosso laboratrio observou-se atravs de

  • 9

    imunoprecipitao da (Na++K+)ATPase com anticorpo contra a subunidade a1, que a

    atividade desta enzima medida no sobrenadante praticamente abolida, embora

    aproximadamente 90% da atividade Na+-ATPsica seja mantida (DE SOUZA et al.,

    2007).

    TABELA 2. Diferenas entre a Na+-ATPase e a (Na++K+)ATPase (adaptado de DEL CASTILLO et al., 1982).

    ATIVIDADE Na+-ATPase ATIVIDADE (Na++K+)ATPase

    Requer Mg+2 Requer Mg+2

    No requer K+ Requer K+

    Estimulada por Na+ Estimulada por Na+

    Hidrolisa somente ATP Hidrolisa preferencialmente ATP

    Insensvel a ouabana 100% inibida por 1mM ouabana

    Km Na (mM) 8,0 Km

    Na (mM) 14,0

    Totalmente inibida por 1,5 mM cido

    etacrnico, 2 mM furosemida e

    0,75mM triflocin

    Inibida 63% por 1,5 mM cido

    etacrnico, 10% por 2 mM furosemida e

    insensvel ao triflocin

    Tambm foi demonstrado que a Na+- ATPase forma intermedirio fosforilado

    (E-P) sensvel a hidroxilamina durante seu ciclo cataltico, assim como a

    (Na++K+)ATPase. Entretanto, a formao deste intermedirio insensvel ao K+ e

    inibida pela furosemida. O peso molecular do E-P formado (estimulado por Na+ e

    insensvel ao K+) determinado por eletroforese em gel cido foi 100 kDa (DE SOUZA

    et al., 2007) O mesmo peso molecular foi observado para Na+-ATPases j clonadas

    em organismos inferiores, como Tetraselmis viridis, Exiguobacterium aurantiacum e

    Trypanosoma cruzi (POPOVA et al., 1998; SUZUKI, et al., 2005; IIZUMI et al., 2006).

    Alm disso, a concentrao de Na+ que promove metade do estmulo mximo (K0.5)

  • 10

    da Na+-ATPase diferente da observada para a (Na++K+)ATPase (DE SOUZA et al.,

    2007).

    Estas observaes indicam que as duas enzimas so entidades proticas

    distintas e nos leva a propor que esta segunda bomba de sdio seja responsvel

    pela regulao fina da reabsoro renal de sdio.

    Alm das diferenas cinticas foi observado que a Na+-ATPase apresenta um

    padro de modulao diferente da (Na++K+)ATPase. Observou-se que compostos

    que modulam a excreo renal de Na+, como adenosina (CARUSO-NEVES et al.,

    1997), angiotensina II (AngII) (RANGEL et al., 1999), Ang(1-7) (CARUSO-NEVES et

    al., 2000a), urodilatina (CARUSO-NEVES et al., 2004) e bradicinina CARUSO-

    NEVES et al., 1999a), tambm modulam a atividade Na+-ATPsica sem modificarem

    a atividade (Na++K+)ATPsica em tbulo proximal de rim de porco. Esses dados

    foram obtidos utilizando como modelo experimental membranas basolaterais

    isoladas, o que nos leva a propor que a modulao da (Na++K+)ATPase seja

    dependente da integridade celular, sendo mediada por componentes do

    citoesqueleto e no somente por elementos constitutivos de membrana. Por outro

    lado, possvel propor que a regulao da Na+-ATPase possa envolver

    microdomnios de membrana como os rafts e cavolas, como tem sido proposto

    para outras enzimas e em outros modelos (TORTELOTE et al., 2004; ALONSO &

    MILLN, 2001)

    Os microdomnios especializados da membrana plasmtica possuem grande

    importncia na fisiologia e fisiopatologia renal. J foi observado que uma disfuno

    em microdomnios ricos em caveolina e colesterol est diretamente relacionada com

    a induo e manuteno de fases isqumicas na falncia renal aguda experimental

    (ZAGER et al., 2002). Alm disso, existem evidncias que os rafts lipdicos, bem

  • 11

    como as cavolas, participam ativamente na regulao da sinalizao e trfego de

    receptores metabotrpicos (CHINI & PARENTI, 2004). Dados revelam a co-

    localizao destes receptores e de moduladores da sinalizao, como adenilato

    ciclase e xido ntrico sintase endotelial, em microdomnios de membrana (INSEL et

    al., 2005) Assim, seria possvel supor que a presena destes microdomnios em

    membrana basolateral das clulas de tbulo proximal permitiria o desencadeamento

    de vias de sinalizao responsveis pelo controle fino da reabsoro de sdio.

    A atividade Na+-ATPsica modulada por diferentes protenas cinases, como

    PKC, PKA e PKG. Apesar de ainda no serem conhecidos seus possveis stios de

    fosforilao, j foi demonstrado que ocorre a fosforilao de uma protena presente

    em membrana basolateral isolada de tbulo proximal por PKC. Esta protena

    apresenta aproximandamente 100kDa (massa molecular sugerida para a Na+-

    ATPase) (RANGEL et al., 2001). Atravs da ativao de PKC ocorre o aumento da

    atividade enzimtica estimulada por Ang-II e Ang(1-7), ambos efeitos mediados via

    receptor AT1. (LARA et al., 2008; RANGEL et al., 2002, 2005). Tambm foi

    demonstrado que a ativao da via AMPc/PKA modula a atividade enzimtica

    independente e tambm na presena de agonistas como Ang-II e Ang(1-7) (DE

    SOUZA, et al., 2004; CARUSO-NEVES et al., 2000b). Por outro lado, a atividade

    enzimtica inibida na presena de urodilatina e peptdio atrial natriurtico, bem

    como por Ang(1-7) via AT2, atravs de uma via dependente de ativao de PKG

    (CARUSO-NEVES et al., 2004, LARA et al., 2006). Desta forma, observa-se que

    compostos natriurticos inibem a atividade Na+-ATPsica de tbulo proximal e

    compostos antinatriurticos a estimulam.

  • 12

    1.4 Mecanismos de regulao do volume extracelular

    A regulao de volume do fluido extracelular (VEC) est relacionada

    primariamente com modificaes na relao entre a ingesto e a excreo renal de

    sdio (balano de sdio). Alteraes no ritmo de filtrao glomerular (RFG) e/ou na

    reabsoro de Na+ ao longo dos diferentes segmentos do nfron podem modificar a

    excreo renal de Na+ (ABASSI et al., 2004; EVANS et al., 2005; BIE et al., 2004).

    Assim, um aumento da excreo de Na+ pode ser conseqncia da diminuio da

    reabsoro de Na+ e/ou da diminuio do RFG.

    As modificaes do VEC levam a variaes na excreo renal de sdio

    atravs de mecanismos aferentes que detectam o VEC e mecanismos eferentes que

    efetuam as modificaes na reabsoro renal de sdio.

    Os diversos sensores de volume envolvidos na regulao do VEC esto

    localizados nas grandes veias e trios, na aorta, seio carotdeo e aparelho

    justaglomerular (MELLO-AIRES, 2008). So chamados de barorreceptores os

    sensores que respondem ao estiramento induzido por presso nas paredes dos

    vasos nos quais esto localizados.

    Como as veias so vasos de alta distensibilidade e capacitncia, pequenas

    variaes na presso venosa so detectadas por receptores nervosos localizados

    em suas paredes, levando a grandes modificaes no seu dimetro (THRASHER,

    2005). Os barorreceptores enviam sinal para o tronco cerebral via fibras aferentes do

    nervo vago e a atividade desses sensores modula a atividade simptica e a

    secreo de hormnio antidiurtico (MELLO-AIRES, 2008).

    Os barorreceptores localizados no seio carotdeo e na aorta detectam

    modificaes na presso arterial e enviam informaes ao sistema nervoso central,

    resultando em uma alterao do controle da inervao simptica sobre a resistncia

    vascular perifrica e renal (THRASHER, 2006; JULIEN et al., 2003) Os

  • 13

    barorreceptores presentes no aparelho justaglomerular, especificamente na arterola

    aferente renal igualmente respondem s mudanas de presso (ABASSI et al.,

    2004).

    As alteraes no VEC so detectadas por esses sensores descritos que, uma

    vez ativados, deflagram uma srie de respostas que modulam a reabsoro renal de

    Na+, ao longo do nfron.

    Por exemplo, quando ocorre um aumento no volume de sangue circulante, os

    sensores vasculares respondem enviando sinal ao tronco cerebral, diminuindo tanto

    a produo de hormnio antidurtico pelo hipotlamo como a atividade simptica.

    Assim, esses dois efeitos diminuem a reabsoro renal de gua e Na+,

    respectivamente. Alm disso, quando os trios so distendidos ocorre a liberao do

    peptdio atrial natriurtico, que provoca vasodilatao, natriurese e diurese. Nos rins

    ocorre a liberao de outro peptdio natriurtico (urodilatina). Alm disso, ocorre

    diminuio da secreo de renina, diminuindo a produo de AngII e

    conseqentemente reduzindo os nveis de aldosterona. Devido a diminuio da

    atividade simptica ocorre dilatao das arterolas, principalmente da aferente, ento

    o RFG aumenta, com elevao da carga filtrada de Na+. Como AngII estimula a

    reabsoro de Na+ e os nveis deste peptdios esto reduzidos, bem como os nveis

    de aldosterona, a reabsoro de Na+ pelo tbulo proximal e ducto coletor diminui,

    aumentando a excreo renal de Na+ e gua para que ocorra a restaurao da

    euvolemia (ABASSI et al., 2004; MELLO-AIRES, 2008).

    Na contrao de volume ocorre aumento da atividade dos nervos simpticos,

    estmulo da secreo de hormnio antidiurtico pela hipfise posterior e inibio da

    secreo de peptdio atrial natriurtico, bem como de urodilatina. Em resposta a uma

    diminuio da presso de perfuso renal ocorre aumento na liberao de renina

  • 14

    pelos rins. O aumento de renina leva ao aumento de AngII, bem como de

    aldosterona pelo crtex adrenal. AngII possui um papel importante na regulao do

    VEC atravs de seus efeitos: vasoconstrio renal e perifrica e estmulo da

    reabsoro tubular renal de sdio. Ento, a seqncia de eventos oposta: o RFG

    diminui, diminuindo assim a carga filtrada de sdio e a reabsoro de sdio pelo

    tbulo proximal e ducto coletor aumenta. Como os nveis de ADH esto elevados, a

    reabsoro de gua aumentada no ducto coletor. Assim, ocorre reduo da

    excreo de gua e sdio, restaurando a euvolemia (ABASSI et al., 2004, MELLO-

    AIRES, 2008).

    De maneira geral, se h um aumento do volume, ocorre aumento na sntese

    de substncias natriurticas e diurticas, tais como bradicinina, adrenomedulina,

    peptdio atrial natriurtico (ANP), peptdio natriurtico do tipo C (CNP), peptdio

    natriurtico do tipo B (BNP) e urodilatina, que atuam diminuindo a reabsoro renal

    de sdio e conseqentemente diminuindo o VEC. Quando ocorre uma reduo no

    fluido, observa-se a produo de substncias antidiurticas e antinatriurticas (como

    por exemplo, Ang II e endotelina) que atuam de forma contrria.

    Entre os sistemas peptdicos envolvidos na modulao da excreo renal de

    Na+ pode-se destacar o sistema calicrena-cinina (SKK). Tem sido observado que o

    SKK capaz de modular diversas funes renais: fluxo plasmtico renal, ritmo de

    filtrao glomerular, natriurese e diurese (KATORI & MAJIMA, 2006; CHAO &

    CHAO, 2005; LORTIE et al., 1992; PLANTE et al., 1992; COYNE & MORRISON,

    1991). Parte do efeito do SKK na excreo renal de Na+ mediado por ao direta

    de cininas no transporte tubular de Na+ (KATORI & MAJIMA, 2006; MARGOLIUS,

    1995). O SKK est diretamente relacionado com o sistema renina angiotensina

    (SRA) (SOUZA DOS SANTOS et al., 2001) atravs da enzima conversora de

  • 15

    angiotensina (ECA), tambm conhecida como cininase II. Esta enzima converte Ang

    I em Ang II e promove a degradao de cininas (SCHMAIER, 2002) (FIGURA 3).

    A modulao dos mecanismos de transporte de sdio fundamental para a

    manuteno do volume extracelular, assim os transportadores ativos primrios

    apresentam grande importncia como possveis alvos regulatrios, uma vez que

    criam gradientes eletroqumicos utilizados pelos transportadores secundrios. Desse

    modo, nosso grupo tem sugerido que a Na+-ATPase seja o alvo para ao de

    substncias capazes de modular a excreo renal de Na+, tendo uma participao

    direta e fundamental na regulao do volume extracelular atravs do ajuste fino da

    excreo renal deste on.

  • 16

    FIGURA 3. Interao entre o sistema calicrena-cinina plasmtico e sistema renina-angiotensina.

    A calicrena plasmtica converte pro-renina em renina, que converte angiotensinognio em angiotensina I. ECA (enzima conversora de angiotensina) converte o peptdio inativo angiotensina I em angiotensina II, peptdio com ao vasoconstrictora. Ao mesmo tempo ECA degrada BK em BK(1-7) ou BK(1-5). Carboxipeptidase converte AngI ou AngII em Ang(1-7), um peptdio com ao vasodilatadora. Ang(1-7) estimula a formao de NO e PGI2, que potencializam o efeito de BK. A calicrena gera BK a partir do cininognio e libera HKa (cininognio livre de cinina), que apresenta propriedades anti-proliferativas e anti-angiognicas. BK estimula formao de NO e PGI2, contrabalanando os efeitos de AngII (adaptado de SCHMAIER, 2002)

    Sistema calicrena-cinina Sistema renina-angiotensina

    Cininognio

    BRADICININA

    ANGIOTENSINA II

    calicrena

    HKa

    vasodilatao

    extracelular

    intracelular

    NO, PGI2

    vasodilatao

    Ang(1-7)

    ECA

    BK(1-7)BK(1-5)

    Angiotensina I

    Angiotensinognioprorenina

    renina

    carboxipeptidase

    carboxipeptidase

    vasoconstrio

    Sistema calicrena-cinina Sistema renina-angiotensina

    Cininognio

    BRADICININA

    ANGIOTENSINA II

    calicrena

    HKa

    vasodilatao

    extracelular

    intracelular

    NO, PGI2

    vasodilatao

    Ang(1-7)

    ECA

    BK(1-7)BK(1-5)

    Angiotensina I

    Angiotensinognioprorenina

    renina

    carboxipeptidase

    carboxipeptidase

    vasoconstrio

  • 17

    1.5 Sistema Calicrena-Cinina

    O SKK compreende uma complexa rede de enzimas e peptdios bioativos que

    atuam de maneira parcrina e autcrina. Este sistema composto por enzimas de

    sntese, serina proteases, denominadas calicrenas plasmtica e tecidual; que

    liberam cininas a partir de seus substratos (cininognios de alto e baixo peso

    molecular, HMWK e LMWK) (FIGURA 4). As cininas exercem suas aes atravs da

    ligao a receptores especficos, sendo mediadores importantes em diversos efeitos

    biolgicos, incluindo homeostase cardiovascular, inflamao e dor (COSTA-NETO et

    al., 2008; MOREAU et al., 2005; CHAO & CHAO, 2005; MARCEAU & REGOLI,

    2004; KATORI & MAJIMA, 2003; COUTURE et al., 2001).

    O HMWK, uma a-globulina, circula no plasma como uma glicoprotena de 88

    a 120kDa, composta de seis domnios. Este cininognio o substrato da calcrena

    plasmtica enquanto o LMWK o principal substrato da calicrena tecidual. O

    LMWK, uma b-globulina, apresenta massa molecular entre 50 e 68kDa (MOREAU et

    al., 2005).

    Os cininognios podem ser hidroxilados na terceira prolina da seqncia de

    BK, levando a formao de cininas hidroxiladas (CAMPBELL, 2001). As cininas

    hidroxiladas apresentam atividade biolgica similar das cininas no hidroxiladas e

    ambas j foram identificadas tanto no plasma quanto na urina de humanos

    (DUNCAN et al., 2000).

    J foi demonstrada, em ratos, a existncia de dois tipos de cininognios de

    baixo peso molecular: T-I e T-II cininognio, que podem ser formados pela ao de

    excesso de tripsina (ENJYOJI et al., 1988).

  • 18

    FIGURA 4. Representao esquemtica do sistema calicrena-cinina.

    CPM (carboxipeptidase M), CPN (carboxipeptidase N), AM (aminopeptidase), HMWK (cininognio de alto peso molecular), LMWK (cininognio de baixo peso molecular), ECA (enzima conversora de angiotensina), NEP (endopeptidase neutra) (adaptado de MARCEAU & REGOLI, 2004).

  • 19

    Alm disso, foi isolada uma cinina: T-cinina (Ile-Ser-BK) aps o tratamento de

    plasma de ratos com tripsina (FURUTO-KATO et al., 1985). Em 1987, SAKAMOTO

    et al. observaram que T-cinina e Met-T-cinina so liberadas a partir de T-cininognio

    por uma proteinase cida em tecido granulomatoso de ratos sob inflamao

    induzida. Entretanto, ainda so necessrios maiores estudos para verificar a

    funcionalidade e a existncia desta cinina em humanos.

    O primeiro trabalho que evidenciou a existncia das calicrenas foi publicado

    em 1909 por ABELOUS & BARDIER. Utilizando cachorros anestesiados como

    modelo, foi observada hipotenso aps a injeo intravenosa de uma frao de urina

    humana insolvel em lcool. As substncias hipotensoras foram isoladas e

    denominadas urohipotensinas. Inicialmente acreditava-se que essas substncias

    eram originadas no pncreas, por isso o termo calicrena (do grego kallikreas).

    Atualmente sabe-se que as calicrenas plasmtica e tecidual so as duas mais

    potentes cininogenases conhecidas e possuem caractersticas bioqumicas,

    imunolgicas e funcionais diferentes (LUNDWALL & BRATTSAND, 2008;

    SCHMAIER, 2008; PAMPALAKIS & SOTIROPOULOU, 2007; MOREAU et al., 2005).

    A calicrena plasmtica, uma serina protease, ativada por um sistema em

    cascata (cascata proteoltica) (PAMPALAKIS & SOTIROPOULOU, 2007). Esta

    enzima est presente no plasma na sua forma inativa, pr-calicrena (uma a-

    globulina), e isto permite que bradicinina (BK) no seja constantemente liberada. A

    pr-calicrena plasmtica circula no plasma como um complexo, heterodmero,

    ligada ao HMWK no domnio 6, numa estequiometria 1:1. Entre 80 e 90% da pr-

    calicrena est normalmente complexada ao HMWK (SCHMAIER, 2008; MOREAU et

    al., 2005).

  • 20

    A cascata de formao de cininas est em equilbrio no plasma mesmo na

    ausncia de fatores exgenos. Porm, o contato do plasma com uma superfcie

    carregada negativamente, como as endotoxinas (lipossacardeos), leva a ativao

    do fator de coagulao sangunea XII a XIIa. Ento a pr-calicrena diretamente

    ativada a calicrena pelo fator XIIa e a calicrena resultante gera BK a partir do

    HMWK (FIGURA 4) (SCHMAIER, 2008; MOREAU et al., 2005; ROJKJAER &

    SCHAIMER, 1999) A calicrena plasmtica cliva o HMWK primeiramente na ligao

    Arg389-Ser390 e em seguida na ligao Lys380-Arg381, liberando o nonapeptdio BK

    (MOREAU et al., 2005)

    A calicrena tecidual sintetizada como uma proenzima (procalicrena), sendo

    posteriormente hidrolisada gerando a forma ativa. Esta serina protease uma

    glicoprotena amplamente distribuda (clulas do pncreas, glndulas salivar,

    sudorpara e lacrimal, no sistema nervoso central, no rim, dentre outros locais)

    (KATORI & MAJIMA, 2006; MAHABEER & BHOOLA, 2000), que converte calidina

    (Lys-BK) a partir do LMWK, clivando as ligaes Met379-Lys380 e Arg389-Ser390

    (FOGAA et al., 2004, MAHABEER & BHOOLA, 2000)

    As cininas compem um grupo de peptdios de 9 a 11 aminocidos, as

    principais so: bradicinina (BK), (Arg1-Pro2-Pro3-Gly4-Phe5-Ser6-Pro7-Phe8-Arg9),

    calidina (Lys-bradicinina) e seus metablitos ativos, des-Arg9-cininas.

    A bradicinina foi isolada em 1949 por ROCHA-E-SILVA et al.. Foram

    investigados os efeitos farmacolgicos do veneno de Bothrops jararaca em leo de

    porco-da-ndia e observaram que a incubao do veneno com uma frao de plasma

    resultou na liberao de uma substncia com ao vasodilatadora potente, a qual

    apresentava atividade contrtil em msculo liso. Devido ao movimento contrtil lento

    a substncia foi chamada de bradicinina (do grego, brady-lento, kinin-movimento).

  • 21

    Uma vez liberada, BK rapidamente inativada por cininases encontradas nos

    tecidos e fluidos biolgicos. Quando BK infundida pela artria renal no possvel

    detect-la na urina, devido presena de cininases ao longo do nfron,

    principalmente no tbulo proximal e ducto coletor medular (KATORI & MAJIMA,

    2006).

    Quatro metalopeptidases so responsveis pelo metabolismo de BK. So

    elas: enzima conversora de angiotensina (ECA), aminopeptidase P (APP),

    endopeptidase neutra 24.11 (NEP) e carboxipeptidases M e N (CPM e CPN). Essas

    peptidases so zinco metalopeptidases, ou seja, todas requerem zinco em seus

    stios catalticos para hidrolisar seus substratos. So glicoprotenas, tetrmeros, e

    exceto a CPN, esto associadas membrana (MOREAU et al., 2005). Os produtos

    de clivagem das cininas so biologicamente inativos, com exceo dos metablitos

    des-Arg9-BK (DABK) e des-Arg10-Lys-BK (CAMPBELL, 2000)

    H duas classes principais de cininases descritas: cininases I e II (KATORI &

    MAJIMA, 2003) As cininases I so divididas em CPN e CPM. As CPN so

    sintetizadas no fgado e a mais importante enzima metabolizadora de cininas no

    plasma humano (SKIDGEL & ERDS, 2007; MOREAU et al., 2005). As CPM esto

    presentes em diversos tecidos, incluindo o rim, pulmo, placenta, alm do endotlio

    vascular e j foi observado seu ancoramento membrana celular de clulas

    epiteliais renais e pulmonares (MOREAU et al., 2005; SKIDGEL & TAN, 1992;

    PALMIERI et al., 1986). Estas enzimas clivam BK e Lys-BK na poro carboxi-

    terminal, especificamente na ligao Phe8-Arg9. Estas metalopeptidases

    transformam agonistas de B2 em seus des-Arg-metablitos, que so ativos e

    estimulam receptores B1 (MOREAU et al., 2005; GABRA et al., 2003; SANGSREE et

    al., 2003; BLAIS et al., 2000).

  • 22

    A ECA e a NEP compem o grupo das cininases II. A ECA a principal

    cininase no rim podendo ser encontrada no glomrulo e ao longo do tbulo proximal

    (KATORI & MAJIMA, 2006; IKEMOTO et al, 1990; MARCHETTI et al., 1987). A NEP

    j foi demonstrada nos tbulos renais, no epitlio intestinal, no sistema nervoso

    central, alm de diversos outros tecidos (KATORI & MAJIMA, 2006; ROQUES et al.,

    1993; DENDORFER et al., 1997). No plasma, diferente da ECA, a NEP no tem um

    papel significativo no metabolismo das cininas (DCARIE et al., 1996).

    A ECA uma dipeptidil carboxipeptidase dependente de Zn2+, que regula a

    atividade dos peptdios vasoativos: AngI e BK (TURNER & HOOPER, 2002) Esta

    enzima catalisa a converso do peptdio inativo AngI a AngII, um potente

    vasopressor. Como cininase, ECA inativa BK removendo o dipeptdio Phe8-Arg9 da

    poro carboxi-terminal e em seguida Phe5-Ser6, transformando BK em BK(1-7) e

    em seguida a BK(1-5) (MOREAU et al, 2005; GABRA et al., 2003). ECA tambm

    metaboliza DABK a BK(1-5). Os efeitos antihipertensivos dos inibidores da ECA

    podem ser atribudos (alm da inibio da converso de AngI a AngII) a inibio da

    degradao de BK, portanto ao aumento nos nveis de BK.

    A NEP inativa BK por remover seqencialmente o dipeptdio Phe8-Arg9 e o

    tripeptdio Phe5-Ser6-Pro7, gerando o metablito inativo BK(1-4). Esta enzima

    tambm cliva DABK na ligao Gly4-Phe5, igualmente gerando BK(1-4).

    A exopeptidase, prolina especfica, conhecida como aminopeptidase P, est

    presente em membrana celular de clulas epiteliais de tbulo proximal, bem como

    em clulas epiteliais intestinais e clulas endoteliais, alm disso sua atividade j foi

    mensurada em alguns tecidos como o rim e corao (ERSAHIN & SIMMONS, 1997;

    DCARIE et al., 1996; VANHOOF et al., 1992) Esta enzima cliva BK e DABK na

    poro amino-terminal, gerando peptdios inativos: BK-(2-9) e BK-(2-8),

  • 23

    respectivamente. Esta a principal via de degradao de DABK no plasma (BLAIS

    et al., 1999; DCARIE et al., 1996)

    Outras enzimas so capazes de clivar cininas, dentre elas a aminopeptidase

    M (presente no plasma), que cliva a lisina da poro amino-terminal, convertendo

    (Lys-BK) BK. Esta enzima tambm converte des-Arg10-Lys-BK a DABK, agonista

    de receptores B1

    Portanto, a atividade das cininases pode influenciar de forma significativa no

    efeito das cininas, que apesar de desempenharem suas funes por breves

    perodos, apresentam efeitos extremamente potentes.

    O rim expressa os componentes do SKK, que trabalha independentemente do

    SKK plasmtico. O SKK renal pode produzir concentraes locais de BK muito

    maiores que aquelas presentes no plasma. (SOUZA DOS SANTOS et al., 2001;

    CAMPBELL, 2000). Grandes quantidades de cininognio e calicrena so

    sintetizados pelo epitlio tubular e secretados na urina. J foi demonstrada a

    presena de RNA mensageiro de LMWK, o substrato preferencial da calicrena

    tecidual, em crtex e medula de rim humano (IWAI et al., 1988). A expresso gnica

    da calicrena renal modulada por alguns fatores, como por exemplo, a ingesto de

    sal. Uma dieta com alto sal regula a expresso de calicrena renal, assim como sua

    atividade enzimtica, em ratos neonatos e adultos (el-DAHR et al., 1996). A

    calicrena, localizada nas membranas luminais ou basolaterais, atua sobre o

    cininognio no fluido tubular ou no espao peritubular gerando as cininas, que so

    capazes de influenciar na funo renal. Mesmo que a meia-vida das cininas, tanto

    sistmicas como locais, sejam consideradas muito curtas (10 a 30 segundos),

    considera-se que o SKK contribua em processos regulatrios fisiolgicos em rim de

    mamferos. As cininas so produzidas continuamente e exercem efeitos na

  • 24

    resistncia da vasculatura, na excreo de gua e eletrlitos e sobre moduladores

    da funo renal (como o sistema renina angiotensina, eicosanides, NO,

    vasopressina e endotelina) (CHAO & CHAO, 2005; BAE et al., 2003; KATORI &

    MAJIMA, 2003; SCHMAIER, 2002; TORNEL et al., 2000; HIGAKI et al., 1999).

    No rim existem diversas vias de degradao de cininas limitando suas aes

    localmente. Desta forma, as cininas atuam de maneira autcrina ou parcrina no

    parnquima renal (KATORI & MAJIMA, 2003).

    Os principais efeitos renais das cininas, natriurese e diurese, esto

    relacionados com aumento do fluxo sanguneo renal e inibio da reabsoro de Na+

    e gua (HBERT et al., 2005). Observou-se em msculo liso de vias areas que BK

    capaz de modular a atividade da (Na++K+)ATPsica, promovendo estmulo via

    receptor B2 (DODSON & RHODEN, 2001).

    Atravs da ativao de seus receptores, as cininas desempenham um papel

    importante nos processos hemodinmicos e excretrios. Em 2003, foi proposto por

    KATORI & MAJIMA que este sistema trabalharia como uma vlvula de segurana

    para o acmulo excessivo de sdio no organismo. Assim, em indivduos normais, o

    SKK funcionaria como uma vlvula de segurana aberta, promovendo diurese e

    natriurese quando o sdio se acumulasse no organismo. Este acmulo pode ser

    proveniente do resultado do aumento da ingesto de sdio ou da liberao de

    aldosterona, provavelmente pela ao de angiotensina II. No caso de indivduos

    hipertensos (tanto pacientes hipertensos sensveis ao sal como ratos

    espontaneamente hipertensos, SHR) j foi observado atravs da medida do

    clearence de ltio que ocorre um aumento na reabsoro de sdio no tbulo

    proximal (CHIOLERO et al., 2000; BIOLLAZ et al., 1986). Este aumento poderia ser,

    pelo menos em parte, devido a expresso desregulada de transportadores de sdio

  • 25

    ou modificao nos efeito dos peptdios do SKK. Neste caso a vlvula de segurana

    estaria fechada e o sdio se acumularia no organismo, aumentando o volume

    extracelular e conseqentemente a presso arterial.

    Devido importncia das cininas no controle da presso sangunea e

    perfuso, o SKK presente no miocrdio, sistema vascular e no rim so os mais

    importantes. O efeito vasodilatador das cininas pode ser mediado por NO e

    prostaciclina (PGI2) (DENDORFER et al., 1999), enquanto o aumento na perfuso

    renal mediado primariamente por prostaglandinas.

    O SKK plasmtico est envolvido nos processos de hipotenso, coagulao

    sangunea e nas respostas inflamatrias. Sua ativao instantaneamente libera BK,

    que promove potente ao biolgica nas clulas adjacentes (KATORI & MAJIMA,

    2006; KATORI et al., 1989).

    1.5.1 Receptores e vias de sinalizao de cininas

    At o momento, duas classes de receptores de bradicinina (B1 e B2) foram

    identificadas, utilizando como ferramentas farmacolgicas diferentes agonistas e

    antagonistas. Ambos os receptores j foram clonados e pertencem famlia de

    receptores de sete domnios transmembranas acoplados protena G (MARCEAU &

    REGOLI, 2004; MARCEAU et al., 1998; CHAI et al., 1996; EGGERICKX et al.,

    1992).

    Atravs da ativao de seus receptores as cininas exercem efeitos biolgicos,

    incluindo vasodilatao, aumento da permeabilidade vascular, estmulo das

    terminaes nervosas sensoriais e simpticas e contrao de msculo liso. BK e

    Lys-BK so agonistas endgenos dos receptores B2, enquanto DABK e des-Arg10-

  • 26

    (Lys-BK) so agonistas dos receptores B1 (MARCEAU & REGOLI, 2004; FATHY et

    al., 2000; PRADO et al., 2002; QUITTERER et al., 1999; MARCEAU et al., 1998)

    O receptor B2 expresso constitutivamente nos tecidos e est presente em

    diferentes segmentos do nfron: tbulo proximal, poro espessa ascendente da

    ala de Henle e ducto coletor (ARDAILLOU et al., 1998; MARIN-CASTAO et al.,

    1996; FIGUEROA et al., 1995) (FIGURA 5A). A expresso do receptor B1 induzida

    durante injria tecidual e processos infecciosos e inflamatrios (MARCEAU et al.

    1998; CHAI et al., 1996). Embora o receptor B1 seja induzido em condies

    especficas, tem sido sugerido que estes receptores podem ser expressos em

    condies normais na vasculatura e no rim (NAKHOSTINE et al., 1993; LORTIE et

    al., 1992). Em condies patolgicas, o receptor B1 medeia as aes inflamatrias

    das cininas podendo ser ativado principalmente por DABK, cujos nveis esto

    aumentados durante a inflamao. O receptor B2 medeia diversas aes conhecidas

    das cininas, incluindo a regulao da presso sangunea sistmica, transporte de

    gua e eletrlitos, crescimento celular, permeabilidade capilar, atividade

    vasodilatadora em clulas endoteliais (MARCEAU & REGOLI, 2004; KATORI &

    MAJIMA, 2003; COUTURE et al., 2001; TORNEL et al., 2000; BHOOLA et al., 1992).

    Dados sugerem que a calicrena possa diretamente ativar o receptor B2 e inclusive

    induzir sua redistribuio na membrana plasmtica (HECQUET et al., 2002, 2000)

    Sobre a funcionalidade e os mecanismos de transduo de sinal relacionados

    ao subtipo B1 existem menos informaes descritas. A seqncia de aminocidos

    36% idntica a do receptor B2 (FATHY et al., 2000; MENKE et al., 1994). A

    coexistncia dos receptores B1 e B2 j foi detectada em clulas mesangiais de rato

    (BASCANDS et al., 1993).

  • 27

    A

    B Receptor B2 Receptor B1

    (ala extracelular entre os domnios transmembrana IV e V)

    FIGURA 5. Receptores de bradicinina.

    (A). Estrutura do receptor B2 humano. setas: cistenas em posio anloga as da seqncia do receptor B2 de rato. bolas pretas e pontilhadas: posio dos peptdios utilizados para gerar anticorpos (retirado de QUITTERER et al., 1999) (B). Comparao da sequncia de aminocidos, da ala entre os domnios transmembrana IV e V, dos receptores B1 e B2. setas: aminocidos fundamentais para ligao dos respectivos agonistas, aminocidos em quadrados: resduos crticos para ligao de BK a B2 (adaptado de FATHY et al., 2000).

  • 28

    J foi mostrado que a poro N-terminal de BK que se liga ao receptor B2

    adjacente a Cys277, na ala extracelular entre os domnios IV e V (FIGURA 5B)

    (HERZIG et al., 1996). Alm disso, a ligao de BK a este receptor diretamente

    dependente de dois resduos de aspartato, Asp268 e Asp286, localizados na mesma

    ala, que interagem com a poro N-terminal de BK (Arg1) (FIGURA 5B)

    (NOVOTNY et al., 1994). Lys-BK e des-Arg10-(Lys-BK) se ligam com muito mais

    afinidade aos receptores B1. Foi demonstrado que a poro N-terminal destes

    peptdios interage com o receptor B1 na ala extracelular entre os domnios IV e V,

    especificamente nos resduos Glu273 e Asp291 (FIGURA 5B) (FATHY et al., 2000).

    Ainda no est claro o mecanismo responsvel pela menor afinidade de BK ao

    receptor B1, mas a afinidade de BK por B2 est relacionada aos resduos Asp268 e

    Asp286 localizados na ala extracelular entre os domnios IV e V deste receptor.

    Um terceiro tipo de receptor de BK (receptor B3) tem sido identificado em

    clulas endoteliais de aorta bovina, na microvasculatura e em cultura de clulas de

    msculo liso traqueal de porco-da-ndia (FARMER et al., 1991; FIELD et al., 1992

    REGOLI et al., 1990)

    Vrios mecanismos de transduo de sinal tm sido descritos para as cininas

    em diferentes clulas. Dentre eles destaca-se a ativao de cascatas de fosfolipases

    A2, C e D (PLA2, PLC e PLD) as quais catalisam a clivagem de fosfolipdeos de

    membrana com subseqente liberao de prostaglandinas, xido ntrico, inositol

    fosfato e diacilglicerol (DAG). Estas vias de sinalizao podem levar mobilizao

    do clcio intracelular e ativao de diversas isoformas de protena cinase C (GABRA

    et al., 2003; MARCEAU et al., 1998).

    O receptor B1 est principalmente associado ativao de PLC, PLA2 e

    MAPK (protena cinase ativada por mitgeno) (MARCEAU et al., 1998).

  • 29

    Essencialmente a maioria das aes farmacolgicas das cininas depende dos

    receptores B2, que so acoplados a protenas Gq e Gi (KANG & LEEB-LUNDBERG,

    2002). A ativao de protenas Gaq est relacionada ao estmulo de PLCb e

    ativao de PKC por diacilglicerol (DAG) (GABRA et al., 2003; KATORI & MAJIMA,

    2003; DE WEERD & LEED-LUNDBERG, 1997;. A subunidade Gbg, dissociada aps

    ativao de Gi, tambm capaz de ativar PLCb (MORRIS & MALBON, 1999). O

    incio dessa via de sinalizao pode levar a proliferao celular atravs da ativao

    de diferentes cascatas da MAPK (LIEBMANN, 2001). Esta ativao pode envolver

    subunidades a ou bg de protenas G heterotrimricas, tirosinas cinases, molculas

    adaptadoras, protenas cinases e outras protenas (ZHANG & DONG, 2007; NODA

    et al., 2004; BLAUKAT et al., 2000)

    O aumento da liberao de Ca2+ intracelular, atravs da ativao do receptor

    B2, promove estmulo da NOS endotelial (xido ntrico sintase) e PLA2, causando

    vasodilatao em clulas endoteliais da vasculatura arterial. Os produtos liberados,

    NO e PGI2, atuam sobre clulas musculares lisas causando relaxamento e

    conseqentemente vasodilatao. J sobre a vasculatura venosa, BK causa

    vasoconstrico por ao direta sobre as clulas musculares lisas, tambm via

    aumento de Ca2+ intracelular (BHOOLA et al., 1992).

    Outros mecanismos de transduo de sinal desencadeados por bradicinina

    tm sido identificados em vrios modelos e tecidos, dentre eles a modulao de

    PLD, adenilato ciclase (AC) e transportadores inicos (LIEBMANN et al., 1995; VAN

    BLITTERSWIJK et al, 1991; CUTHBERT & MARGOLIUS, 1982). O prprio receptor

    B2 pode ser fosforilado a partir de um estmulo, um mecanismo que pode levar a

    desensibilizao do receptor (BLAUKAT et al., 1996). Outros mecanismos

    conhecidos podem modular a funo e afinidade do receptor B2. A desensibilizao

  • 30

    dos receptores B2 devido a internalizao tipicamente observada durante estmulo

    contnuo (ROSCHER et al., 1984; MUNOZ et al., 1993). A redistribuio, estmulo

    dependente, desses receptores em cavolas, assim como a endocitose em

    vesculas contendo caveolina podem estar envolvidas na internalizao desses

    receptores (HAASEMANN et al., 1998; DE WEERD & LEEB-LUNBERG, 1997).

    Diferenas na afinidade do receptor B2 tm sido mostradas em diversos tecidos e

    preparaes. Alguns estudos tm revelado que a afinidade do receptor pode

    depender do acoplamento da protena G, de fosforilao e da ocupao dos

    receptores. (PIZARD et al., 1998; BLAUKAT et al., 1996; LIEBMAN et al., 1990;

    LEEB-LUNDBERG & MATHIS, 1990)

    Estudos relatam a expresso gnica dos receptores B2 tecido-especfica

    durante o desenvolvimento, no incio do desenvolvimento mais de 10 vezes maior

    que em ratos adultos, sugerindo que as cininas atuam de forma importante na fase

    ps-natal. O rim e o sistema cardiovascular so os principais tecidos onde a

    expresso do receptor B2 maior durante o incio do desenvolvimento. (el-DAHR et

    al., 1997).

    No rim e em outros tecidos, a BK conhecida por estimular liberao de cido

    araquidnico (AA). Este produzido a partir de fosfolipdeos de membrana, via ao

    direta da PLA2 ou a partir da ao de uma lipase sobre o DAG, levando a formao

    de prostaglandinas (PG) (JENKINS et al., 2003; COHEN-LURIA et al., 1994;

    KENNEDY et al., 1997). A ativao de PLA2, induzida por BK, e a liberao de AA

    podem estar relacionadas ao acoplamento de B2 protena Gi, sensvel a toxina

    pertussis (NODA et al., 2004; RICUPERO et al., 1993; YANAGA et al., 1991)

    Alguns efeitos renais de BK podem ocorrer pela ativao de PKC e produo

    de PGE2 (RODRIGUEZ et al., 2004; KOPP et al., 2000). Em clulas do epitlio

  • 31

    tubular de coelhos, a sntese de PGE2 e ativao indireta de AMPc foi demonstrada

    aps tratamento com BK (WELSH et al., 1998). Entretanto, no ducto coletor, BK

    suprime a formao de AMPc, estimulada por ADH, via aumento da produo de

    PGE2 (COYNE & MORRISON, 1991).

    1.5.1.1 Fosfolipase C/Protena cinase C (PLC/PKC)

    O metabolismo de fosfoinositdeos tem um papel importante em diversas

    funes celulares. Em resposta a ativao de receptores por hormnios,

    neurotransmissores, fatores de crescimento e outras molculas, pode ocorrer a

    hidrlise do fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) por uma fosfolipase especfica (PI-

    PLC). Dependendo da isoforma desta enzima, o estmulo pode ser via subunidade a

    da protena Gq, ou pelas subunidades bg da protena Gi. A partir da hidrlise do

    PIP2, duas molculas com importantes funes como sinalizadores celulares so

    geradas: diacilglicerol (DAG) e IP3 (inositol 1,4,5-trisfosfato) (KATAN, 1998).

    O IP3 se difunde pelo citosol e se liga a receptores especficos no retculo

    endo/sarcoplasmtico, resultando na abertura de canais de Ca2+ e conseqente

    aumento do Ca2+ intracelular. Este aumento desencadeia uma srie de respostas de

    acordo com o tipo celular e condio especfica. Nas clulas musculares est

    relacionado com aumento da contrao, j no endotlio estimula a produo de NO

    que induz relaxamento vascular. Alm disso, o Ca2+ est tambm envolvido no

    trfego de vesculas e participa como modulador da atividade de diferentes enzimas

    como a calmodulina, PKC e PLA2.

    O DAG, que permanece na membrana plasmtica, pode ativar uma PKC.

    Esta enzima componente da famlia de serina/treonina fosfotransferases e est

    envolvida em diversas vias de sinalizao celular. Dentre as diferentes isoformas de

  • 32

    PKC j descritas em mamferos, pelo menos quatro delas so ativadas por DAG

    (CORBALN-GARCA & GMEZ-FERNNDEZ, 2006).

    Diversas isoformas de PLC foram identificadas e subdivididas em 4 classes,

    com base na estrutura e no mecanismo regulatrio de ativao: PLCb (1-4), PLCg

    (1,2), PLCd (1-4) e PLCe (1) (FIGURA 6A) As vrias isoformas de PLC so ativadas

    por diversos receptores e diferentes mecanismos (FUKAMI, 2002).

    Cada isoenzima composta de domnios conservados e domnios subtipo-

    especficos. A anlise desses domnios tem revelado especificidades em relao aos

    mecanismos de interao protena-protena e protena-lipdeo necessrios para

    ancoramento das enzimas na membrana plasmtica (WILLIAMS, 1999). A protena

    Gq estimula a atividade da PLC do tipo b (PLCb), enquanto a PLCg regulada por

    tirosina cinases (receptor e citoslicas). J a regulao da PLCd se d por

    mecanismos que envolvem clcio intracelular. A PLCe foi identificada como efetora

    da protena Ras e regulada por Ras de modo GTP-dependente (FUKAMI, 2002).

    Todas as isoformas de PLC apresentam os domnios catalticos X e Y, assim

    como diversos domnios regulatrios, dentre eles: domnios C2, EF-hand e PH

    (homologia plecstrina). Os domnios regulatrios subtipo-especficos contribuem

    para a diferenciao das isoformas e incluem: domnio de homologia a Src (SH) na

    PLCg e domnios de associao a Ras e fator trocador de Ras-GTPase-smile (Ras-

    GEF-like) na PLCe. As isoformas b apresentam domnios PH, EF-hand, C2, X e Y

    na poro N-terminal. Alm disso, possuem uma extenso C-terminal de

    aproximadamente 400 aminocidos, incluindo motifs de ligao PDZ (Ser/Treo)-X-

    (Val/Leu)-COOH. A PLCd1 apresenta domnio PH que compreende cerca de 100

    resduos de aminocidos e liga fortemente PIP2 e IP3 (FUKAMI, 2002).

    A

  • 33

    B

    FIGURA 6. Isoformas de PLC e PKC. (A) Domnios caractersticos das isoformas descritas de PLC. PH: homologia

    plecstrina; EF: mo EF; C2: ligao ao clcio; PDZ: associao protenas; SH: homologia Src; RasGEF: ligao protenas reguladoras de Ras; RA: ligao Ras; X e Y: domnios catalticos (retirado de FUKAMI, 2002); (B). Domnios caractersticos das diferentes isoformas de PKC. C1: domnio de ligao a DAG; C2: domnio de ligao a Ca2+; PB1: domnio de associao a protenas; S/T-kinase: domnio serina/treonina cinase (retirado de CORBALN-GARCIA & GMEZ-FERNNDES, 2006)

  • 34

    Apesar das PLCs serem descritas como enzimas principalmente citoslicas e

    serem translocadas para a membrana em resposta ativao de receptores, foi

    descrito que a PLCb3 se liga especificamente a fatores reguladores do trocador

    Na+/H+ (NHERFs), os quais apresentam dois domnios PDZ. Este relato indica que a

    PLCb pode ser translocada para a membrana e associar-se com molculas

    especficas (HWANG et al., 2000). Sabe-se que o domnio C2 de PLCb1 liga

    especificamente Gaq-GTP, seu ativador fisiolgico. Neste domnio C2, determinante

    da ligao de clcio, os resduos chave para ligao do clcio no so conservados,

    indicando que a ativao da enzima pode ser independente de clcio (WANG et al.,

    1999, REBECCHI & PENTYALA, 2000). Dados recentes (RANGEL et al., 2005)

    demonstraram a presena de PI-PLCb em preparao de membrana basolateral

    isolada de tbulo proximal de rim de porco.

    As isoformas de PKC esto envolvidas em eventos de transduo de sinal de

    diversas vias intracelulares, assim como tambm esto relacionadas a condies

    patolgicas. So expressas em diversos tipos celulares e at mesmo isoformas

    diferentes esto presente em um mesmo tipo celular (CORBALN-GARCA &

    GMEZ-FERNNDEZ, 2006). Elas so divididas em 3 classes, as convencionais ou

    clssicas (a, b e g), as novas (d, e h/L, q) e as atpicas (z e i/l), conforme ilustrado na

    FIGURA 6B, e diferem na sua estrutura primria e caractersticas bioqumicas (WAY

    et al., 2000; NEWTON, 1995).

    As diferentes isoformas de PKC possuem um domnio cinase C-terminal e

    geralmente dois domnios regulatrios N-terminal, C1 e C2, que so alvos de

    diferentes segundo-mensageiros. As convencionais e novas apresentam dois

    domnios C1 (C1A e C1B) e um domnio C2. Nas convencionais o domnio C2 est

    em seqncia com o domnio C1, o que as torna responsivas a Ca2+ e DAG. Nas

  • 35

    novas, o domnio C2 precede o domnio C1 e no responde a Ca2+, o que torna

    essas enzimas Ca2+-independentes, enquanto a sensibilidade a DAG mantida. J

    as atpicas no apresentam domnio C2 e tem somente um domnio C1, insensvel a

    DAG.

    Estruturalmente, a cinase dividida em dois subdomnios ou lobos: um

    pequeno lobo N-terminal (lobo N) composto de 5 folhas-b e uma a-hlice

    proeminente (hlice aC) e um grande lobo chamado de lobo C, predominantemente

    helicoidal. O domnio cataltico de todas as PKCs contm um stio de ligao a ATP

    e stios consenso para fosforilao. Esta poro interage com o substrato e realiza a

    transferncia de fosfato. Para se tornarem ativas, todas as isoformas requerem duas

    ou trs fosforilaes seqenciais do stio cataltico. Esses stios de fosforilao so

    conservados dentre os membros da famlia (CORBALN-GARCA & GMEZ-

    FERNNDEZ, 2006).

    Grande parte das isoformas de PKC est localizada no citosol e aps

    estmulo so translocadas para a membrana plasmtica, com posterior ativao

    (HALLER et al., 1994, 1998). Porm, j demonstraram PKC constitutivamente

    expressa na membrana plasmtica (CHAKRAVARTHY et al., 1994). Corroborando

    este fato, RANGEL et al. em 2002 detectaram a presena de PKC em membrana

    basolateral isolada de tbulo proximal de rim de porco, bem como mensuraram sua

    atividade.

    1.5.1.2 Fosfolipase A2 (PLA2)

    A superfamlia da PLA2 consiste em um grande nmero de enzimas

    caracterizadas pela capacidade de catalisar especificamente a hidrlise da ligao

    ster, na posio sn-2 de um glicerofosfolipdeo, liberando cido araquidnico (AA) e

  • 36

    lisofosfolipdeos, ambos mediadores lipdicos. O AA um cido graxo poliinsaturado

    de 20 carbonos, presente primariamente nos fosfolipdeos de membranas celulares,

    alm de ser conhecidamente um precursor dos eicosanides (prostaglandinas e

    leucotrienos).

    Pelo menos 19 enzimas PLA2 foram identificadas e clonadas em mamferos.

    As PLA2 so classificadas em trs grupos principais de acordo com o requerimento

    de clcio para ativao: secretria (sPLA2), que requer concentraes milimolares de

    clcio; citoslica (cPLA2), que requer concentraes micromolares de clcio; e

    independente de Ca2+ (iPLA2), que no requer clcio (KUDO & MURAKAMI, 2002).

    Os produtos da hidrlise da reao da PLA2 tm grande importncia como

    segundos-mensageiros intracelulares e como precursores dos eicosanides. O cido

    araquidnico livre metabolizado por diversas vias, sendo uma delas pela

    ciclooxigenase (COX), iniciando ento a biossntese das prostaglandinas e dos

    tromboxanos, que so potentes mediadores das inflamaes e transdutores de

    sinais (AUSTIN & FUNK, 1999). O lisofosfolipdeo um importante membro da

    sinalizao celular, do remodelamento lipdico e agente capaz de aumentar a fluidez

    e a permeabilidade da membrana plasmtica (BROWN et al., 2003; MOOLENAAR et

    al., 1997; BALSINDE & DENNIS, 1997).

    A famlia das cPLA2 consiste de trs isoenzimas (cPLA2a, cPLA2b e cPLA2g)

    (KITA et al, 2006; MURAKAMI & KUDO, 2004; UNDERWOOD et al., 1998). A

    cPLA2a e a cPLA2b apresenta um domnio C2 N-terminal, o qual importante para a

    associao, dependente de clcio, com os fosfolipdeos da membrana. J a cPLA2g

    no apresenta o domnio C2, contendo no C-terminal um stio de isoprenilao pela

    qual se liga membrana. A cPLA2a desempenha funes importantes na clula,

    estando envolvida na proliferao celular (KITA et al, 2006).

  • 37

    A famlia das sPLA2 est presente em grnulos secretrios de clulas imunes

    e induzida em situaes de inflamao. Essas enzimas apresentam um stio

    cataltico conservado e depende de Ca2+ (SCHALOSKE & DENNIS, 2006).

    Pelo menos duas formas enzimaticamente ativas de iPLA2 j foram clonadas

    e identificadas em diversas espcies e em grande variedade de clulas, sendo

    classificada como grupo VI, subdividido em VIA e VIB (BALSINDE & BALBOA,

    2005). Apresentam entre 85 e 88 kDa, possuem uma seqncia consenso de lipase

    (GXSTG) e um possvel domnio de ligao de ATP. A iPLA2-VIA-1 uma protena

    de 85kDa, em cuja regio N-terminal, aps uma seqncia de anquirinas, ocorre um

    stio cataltico contendo a seqncia consenso da lipase (glicina-X-serina 465-X-

    glicina) no qual a serina 465 atua como o centro cataltico (WISTEAD et al., 2000). A

    iPLA2-VIA-2 uma isoforma com 88 kDa apresentando uma estrutura primria

    idntica iPLA2-VIA-1, com uma pequena diferena. A seqncia de anquirinas

    interrompida pela adio de 54 aminocidos sua estrutura. As duas isoformas so

    expressas em vrios tecidos e so ativadas na ausncia de clcio (YANG et al.,

    1999a). Dentre as funes atribudas a estas duas isoformas esto o

    remodelamento dos fosfolipdeos atravs de reaes de deacilao e a liberao de

    cido araquidnico (BALSINDE & BALBOA, 2005). Tambm foi proposto que a

    iPLA2 do grupo VI est envolvida no crescimento celular e apoptose (BALSINDE et

    al., 2006; WISTEAD et al., 2000).

    1.5.1.3 Prostaglandina E2 (PGE2)

    As trs principais vias enzimticas de metabolizao do cido araquidnico

    (AA) esto presentes no rim: a via da ciclooxigenase (COX), a via da lipooxigenase e

    a via do citocromo P-450. A via da COX medeia a formao de prostaglandinas e

  • 38

    tromboxanos, a via de lipooxigenase est envolvida na formao de mono-, di- e tri-

    cido hidroxieicosatetraenoico (HETEs), leucotrienos e lipoxinas e a via de citocromo

    P-450 promove a formao de cidos epoxieicosatrienoico (EETs), seus diis

    correspondentes (HETEs) e derivados monooxigenados de AA.

    A COX um conhecido alvo teraputico dos analgsicos, antipirticos e de

    drogas anti-inflamatrias no esteroidais. A via enzimtica da COX a principal via

    de metabolismo de AA no rim. O AA quando metabolizado pela COX (1 ou 2)

    convertido a PGG2 (prostaglandina G2), via atividade bis-oxigenase, e

    posteriormente este intermedirio prostanide instvel convertido a PGH2, pela

    atividade peroxidase da COX. PGH2 subseqentemente metabolizada por sintases

    especficas a prostanides biologicamente ativos e mais estveis (BOS et al., 2004)

    (FIGURA 7).

    A COX-1 constitutivamente expressa em diversos tipos celulares, no rim

    expressa abundantemente no ducto coletor, pouco expressa no tbulo proximal e

    na ala de Henle (FIGURA 8) (HAO & BREYER, 2008). A expresso de COX-2

    induzida e especfica em determinados tipos celulares. Nos rins de mamferos pode

    ser detectado altos nveis de COX-2, principalmente na regio da mcula densa e

    crtex renal (HAO & BREYER, 2008; BREYER & HARRIS, 2001).

    Uma terceira enzima COX (COX-3), semelhante a COX-1, foi relatada. O

    RNAm de COX-3 j foi demonstrado em crtex cerebral e corao.

    (CHANDRASEKHARAN et al., 2002).

    Uma vez PGH2 formada, ela pode ser convertida enzimaticamente por

    sintases especficas, PGIS, PGES, PGFS, TxS, PGDS, produzindo cinco

    prostanides, respectivamente PGI2 (prostaciclina), PGE2, PGF2, TXA2 (tromboxano

    A2) e PGD2 (FIGURA 7). Esses prostanides so abundantemente produzidos

  • 39

    FIGURA 7. Metabolismo do AA via COX.

    O AA metabolizado pela COX1 ou COX2 a PGG2 (prostaglandina G2) e depois a PGH2 (prostaglandina H2), por uma reao em duas etapas. PGH2 relativamente instvel, sendo convertida enzimaticamente, por sintases especficas (TxS, tromboxano sintase; PGE sintase; PGF sintase; PGD sintase e PGI sintase), gerando os cinco prostanides primrios (TxA2, PGE2, PGF2a, PGD2 e PGI2). Cada prostanide interage com membros distintos da subfamlia de receptores acoplados a protena G. PGI2 receptor IP, PGD2 receptor DP, PGF2a receptor FP, TxA2 receptor TP e PGE2 receptor EP. Esses receptores ativam diferentes vias de sinalizao. PGE2 interage com quatro distintos receptores EP, cada um acoplado a diferentes vias de sinalizao (retirado de BREYER & BREYER, 2001)

  • 40

    FIGURA 8. Expresso da ciclooxigenase, prostanide sintase e receptores prostanides no rim (retirado de HAO & BREYER, 2008)

  • 41

    no rim, onde atuam localmente via receptores especficos designados IP, EP, FP, TP

    e DP, respectivamente, e exercem efeitos regulatrios importantes na funo renal

    (BREYER & BREYER, 2001). Os receptores de prostaglandinas fazem parte da

    famlia de receptores acoplados a protena G, ou metabotrpicos, e cada

    prostanide interage com seus receptores especficos, ativando diferentes vias de

    sinalizao (HAO & BREYER, 2008).

    Pelo menos trs PGE sintases j foram identificadas: PGE sintase

    microssomal 1 e 2 (mPGES1 e mPGES2) e PGE sintase citoslica (cPGES)

    (TANIKAWA et al., 2002; TANIOKA et al., 2000; JAKOBSSON et al., 1999). A partir

    dos relatos da literatura, somente a mPGES1 parece ter sua expresso induzida por

    citocinas e estmulo inflamatrio, alm de apresentar atividade cataltica maior que

    as outras PGESs (LAZARUS et al., 2002; TANIKAWA et al., 2002; MURAKAMI et

    al., 2002; JAKOBSSON et al., 1999). A PGE2 um dos principais eicosanides

    formados no rim e tem papel importante sobre a modulao da excreo renal de

    gua e sdio (HAO & BREYER, 2008; BREYER & BREYER, 2000; BONVALET et

    al., 1987). Este prostanide tem atividade vasodilatadora e natriurtica e tambm

    interfere na ao do hormnio antidiurtico. O resultado final do estmulo da

    secreo de prostaglandinas no rim pode levar a vasodilatao, aumento na

    perfuso renal, natriurese e diurese (HAO & BREYER, 2008)

    Quatro subtipos de receptores especficos para PGE2 (EP, E-prostanide)

    foram clonados e caracterizados: EP1, EP2, EP3 e EP4. (BREYER & BREYER, 2000,

    2001; ABRAMOVITZ et al., 2000; NARUMIYA et al., 1999) A distribuio intrarenal

    dos receptores prostanides tem sido mapeada, os subtipos de receptores EP

    exibem expresso diferenciada ao longo do nfron, sugerindo efeitos distintos para

    cada subtipo no rim. Os receptores EP2 e EP4 esto relacionados ao aumento dos

  • 42

    nveis de AMPc intracelular, enquanto EP1 e EP3 ao aumento nos nveis de Ca2+ ou

    diminuio nos nveis de AMPc intracelular (BREYER & BREYER, 2001). A FIGURA

    8 mostra a localizao desses receptores, bem como das COXs e prostanides

    sintases ao longo do nfron.

    Os metablitos gerados a partir do AA pela ao da COX tm um papel

    importante no transporte de sal e gua ao longo do nfron, atuando de maneira

    autcrina e parcrina. Por exemplo, ocorre interao entre tbulo coletor renal e

    poro espessa ascendente da ala de Henle, envolvendo sntese de PGE2 nos

    tbulos coletores (SMITH, 1989).

    Estudos iniciais de microperfuso documentam que PGE2 presente na face

    basolateral de clulas do tbulo proximal podem entrar nestas clulas e serem

    secretadas ativamente para o lmen e, alm disso, inibidor de transporte de nion

    orgnico, bem como indomethacina e ouabana parcialmente inibem o acmulo de

    PGE2 nessas clulas, bem como sua secreo (IRISH, 1979). Outros estudos

    indicam que o transporte renal de prostaglandinas pode ocorrer via trocador de

    nion ou ction orgnico (KIMURA et al., 2002; BOUMENDIL-PODEVIN &

    PODEVIN, 1985).

    J foi clonada uma molcula que medeia o transporte de PGE2 em troca de

    lactato, seria um transportador de PG denominado PGT (SCHUSTER, 2002). PGT

    membro da famlia de protenas transportadoras de nion orgnico (OAT), que so

    protenas transmembrana com aproximadamente 100 aminocidos que exibem uma

    ampla distribuio tecidual no corao, crebro, fgado, msculo esqueltico, rim,

    ovario, entre outros (CHAN et al., 1998; LU et al.,1996; KANAI et al., 1995). A

    principal rota de excreo de PGE2 pelo sistema de secreo de nions orgnicos

    no tbulo proximal, onde a entrada pela membrana basolateral a etapa limitante,

  • 43

    sendo mediada pelo transportador de nion orgnico renal do tipo 1 (rOAT1) e

    rOAT3. Existe a hiptese que a prpria PGE2 possa abolir sua excreo pelo rOAT 1

    ou rOAT3 (SAUVANT et al., 2006). Outra famlia de transportadores, protena